CZ171999A3 - Zařízení pro použití přívěsného štítku do ucha zvířete - Google Patents

Description

Dosavadní stav techniky

Protein známý jako RANTES byl původně klonován v Krenského laboratoři Stanford University School of Medicine (Schall T. J. a další, J. Immunol. 141 1018 - 1025 (1988)). Termín RANTES je odvozen z io názvu „Raised on activation, normal T-cell derived and secreted“ (podtržena jsou odpovídající písmena). Jeho exprese je indukovatelná stimulací antigenem nebo aktivací mutagenem T-buněk. Protein je členěm rodiny chemokinů (Schall T. J., Cytokine 3 165 - 183 (1991); Oppenheim, J. J., a další, Ann. Rev. Immunol. 9 617 - 48 (1991)).

is Poprvé byl čistý protein identifikován v roce 1992 v destičkách (Kameyoshi, a další, J. Exp. Med. 176 587 - 592 (1992)). Tento protein je látka silně přitahující eosinofily, CD4⁺CD45RO⁺ T-buňky a také monocyty. Délka její sekvence je 68 aminokyselin.

Nedávno byl klonován receptor pro RANTES (Gao, J. L., a další, 20 J. Exp. Med. 177 1421 - 7 (1993); Neote, K„ a další, Cell 72 415 - 25 (1993)) a bylo ukázáno, že se váže na chemokiny úměrně pořadí MIP1α > RANTES.

Předkládaný vynález poskytuje polypeptidy, které jsou antagonisty RANTES a/nebo MIP-1a.

I když byla věnována velká pozornost cytokinúm obecně a ve výše uvedených pracích zvláště RANTES a receptorům RANTES,

-2 dosud nebyly nikde popsáni výše uvedení antagonisté nebo možné použití takových antagonistů.

Podstata vynálezu

Podle předkládaného vynálezu se poskytuje polypeptid, který má podstatnou homologii aminokyselinové sekvence s peptidem RANTES a působí jako antagonista RANTES a/nebo MIP-1a v jednom nebo více následujících ohledech:

(a) chemotaxe buněk THP-1 jako odpověď na RANTES a/nebo 10 jako odpověď na MIP-1a;

(b) mobilizace iontů vápníku v buňkách THP-1 způsobená přítomností RANTES a/nebo přítomností MIP-1a; a (c) vazba RANTES a/nebo MIP-1a na receptory buněk THP-1.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro is další charakterizaci peptidu RANTES a jeho účinků - například při studii chemotaxe indukované peptidem RANTES, mobilizace iontů vápníku a vazby receptorů. Jsou také použitelné pro charakterizaci vazby peptidu RANTES na jeho receptory. Dále jsou použitelné pro studia MIP-1a z odpovídajících důvodů.

2o Navíc se předpokládá, že polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou použitelné při léčení různých onemocnění, jak bude diskutováno později.

Výhodný polypeptid podle předkládaného vynálezu působí jako antagonista RANTES a/nebo MIP-1a kvůli přítomností jedné nebo více 25 N-koncových aminokyselin (které nejsou přítomny v odpovídajících pozicích v peptidu RANTES a které proto mohou být pokládány jako dodatečné N-koncové aminokyseliny vzhledem k aminokyselinám, přítomným na N-konci peptidu RANTES). Těmito N-koncovými aminokyselinami jsou s výhodou přirozeně se vyskytující (L-)

- 3 aminokyseliny, (které mohou být zavedeny použitím technik rekombinantní DNA nebo technikami fúze peptidů). Mohou však být použity také aminokyseliny, které se v přírodě nevyskytují (například D-aminokyseliny). Ty mohou být zavedeny pomocí chemické syntézy.

Může jít pouze o jednu takovou dodatečnou aminokyselinu, a to například leucin nebo methionin. Takové polypeptidy je možno připravit pomocí vhodných technik, například použitím genového klonování, chemické syntézy apod. V jednom z provedení předkládaného vynálezu se připravují z většího polypeptidu, který 10 obsahuje požadovanou sekvenci a poté enzymatickým štěpením za vzniku polypeptidu s požadovanou sekvencí.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat více než jednu dodatečnou N-koncovou aminokyselinu, mohou například obsahovat až 5, až 10 nebo až 20 dodatečných is aminokyselin. V některých případech může být přítomno více než 20 N-koncových dodatečných aminokyselin.

Pro přípravu takových polypeptidů lze opět použít vhodných technik.

Nyní budou podrobněji diskutovány další aspekty předkládaného 2o vynálezu.

Nyní bylo autory vynálezu zjištěno, že v expresním systému E. coli, který měl exprimovat peptid RANTES ve formě odpovídající maturnímu lidskému peptidu RANTES (tj. s odstraněnou signální sekvencí), byl exprimován polypeptid, ve kterém byl přítomen 25 dodatečný N-koncový methionin (ten nebyl odštěpen od zbývající sekvence endogenními proteázami E. coli). Bylo překvapivě zjištěno, že přítomnost této dodatečné aminokyseliny podstatně změnila vlastnosti polypeptidu vzhledem k vlastnostem RANTES. Methionylovaný polypeptid (zde označovaný jako methionylovaný 3o RANTES nebo Met-RANTES) totiž při různých testech působí jako

-4 antagonists RANTES a MIP-1a a nebylo zjištěno, že by měl nějakou podstatnou aktivitu agonisty.

Předpokládalo by se, že v mnoha případech, kde se v E. coli vyskytuje koncová methionylace, bude pouze malý nebo žádný rozdíl ve vlastnostech polypeptidu nebo dojde pouze ke snížení úrovně jeho původní biologické aktivity. Zcela nečekané tedy bylo zjištění, že Nkoncová methionylace v případě předkládaného vynálezu má ve skutečnosti antagonistickou aktivitu.

Aby bylo možno určit, zda je tento efekt omezen na přítomnost N-koncového methioninu, byl vyroben další polypeptid, ve kterém Nkoncový methionin byl nahrazen N-koncovým leucinem. Bylo opět zjištěno, že působí jako antagonista RANTES, stejně jako tomu bylo u dalšího polypeptidu, ve kterém byl N-koncový methionin nahrazen Nkoncovým glutaminem.

Ve výhodném provedení má polypeptid podle předkládaného vynálezu sekvenci:

(i) MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (označovaný zde také jako „Met-RANTES“) (ii) LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (označovaný zde také jako „Leu-RANTES“) nebo (iii) QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S (označovaný zde také jako „Gln-RANTES“) nebo má sekvenci, která je s některou z výše uvedených sekvencí v podstatě homologní. Polypeptid může být v glykosylované nebo neglykosylované formě.

-5 Termín „v podstatě homologní“ zde má označovat sekvence aminokyselin, které mají s udanou sekvencí (v pořadí podle výhodnosti) sekvenční homologii 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % nebo 99 %. Tento termín může zahrnovat (ale není na ni 5 omezen) sekvenci aminokyselin s 1 - 20, 1 - 10 nebo 1 - 5 delecemi, inzercemi nebo substitucemi jednotlivých aminokyselin, vzhledem k udané sekvenci - za předpokladu, že výsledný polypeptid působí jako antagonista RANTES nebo MIP-1a.

Polypeptid může být v podstatě v čisté formě. Může být izolován io z přírodně se vyskytujících polypeptidů.

Je třeba uvést, že jak je v oboru dobře známo, určité aminokyseliny je možno nahradit jinými, aniž by došlo k podstatné změně ve vlastnosti polypeptidů. Takové možnosti jsou rovněž v rámci předkládaného vynálezu.

¹⁵ Λθ třeba také uvést, že je často možno provést delece nebo inzerce aminokyselin, které podstatně nezmění vlastnosti polypeptidů. Předkládaný vynález zahrnuje takové delece nebo inzerce (které například mohou být až do 10, 20 nebo 50 % z celkové délky sekvence antagonist^ uvedené výše). V rámci předkládaného 2o vynálezu jsou rovněž fúzní proteiny, ve kterých jsou polypeptidy podle předkládaného vynálezu připojeny k jiným skupinám. To je možno provádět například pro účely značení nebo pro lékařské účely.

Nyní bylo autory vynálezu ukázáno, že polypeptid podle předkládaného vynálezu může působit jako antagonista účinků 25 RANTES nebo MIP-1a při chemotaxi, mobilizaci vápníku a vazbě receptorú v buňkách THP-1 (monocytární buněčná linie). Tyto buňky jsou dostupné v ATCC (American Tissue Culture Collection) a slouží jako dobrý modelový systém pro studium RANTES, protože se u nich vyskytuje odezva na vápník a chemotaktické účinky způsobené so RANTES a MIP-1a, stejně jako jinými chemokiny, jako je MCP-1. Polypeptid může také působit v těchto buňkách jako antagonista

- 6 RANTES nebo ΜΙΡ-1α při chemotaxi, mobilizaci vápníku a vazbě na receptory. MIP-1a byl původně identifikován jako část makrofágové zánětlivé polypeptidové frakce, která se dělí na MIP-1a a -β (Obaru, K., a další, J. Biochem. 99:885 - 894 (1988), Sippel, P.F., a další, J.

Immunol. 142:1582 - 1590 (1989)). Vykazuje chemotaktickou aktivitu vzhledem k T-buňkám a monocytum. Bylo rovněž ukázáno, že je mocným inhibitorem proliferace kmenových buněk.

V závislosti na těchto pozorováních se předpokládá, že polypeptidy podle vynálezu naleznou použití při blokování účinků io RANTES a/nebo MIP-1a, a proto mohou nalézt použití v lékařství. Výhodným použitím polypeptidů podle předkládaného vynálezu je blokování účinků RANTES a/nebo MIP-1ct při doplňování a/nebo aktivaci prekurzorů zánětlivých buněk. Předkládaný vynález může proto být použitelný při léčení onemocnění jako je astma, alergická is rhinitida, atopická dermatitida, atheroma/atheroskleróza a revmatoidní artritida.

Navíc k výše uvedeným polypeptidům pokrývá předkládaný vynález tako sekvence DNA, které tyto polypeptidy kódují (které mohou být izolovány nebo jejich rekombinantní formy) vektory 2o obsahující takové sekvence a hostitelské buňky obsahující takové vektory, které jsou schopné exprese polypeptidů podle předkládaného vynálezu.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou být získávány expresí z prokaryotických nebo eukaryotických hostitelských buněk s 25 použitím vhodné kódující sekvence DNA. Vhodné metody se popisují v Sambrook a další, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, USA. Mohou být také vyrobeny kovalentní modifikací RANTES. To může být například provedeno methionylací RANTES na jeho N-konci.

- 7 Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje sekvenci nukleotidů kódující sekvence RANTES, klonované v E. coli, spolu se sekvencí aminokyselin, kterou tato nukleotidová sekvence kóduje.

Obr. 2 ukazuje mapu plazmidu pCBA-M.

Obr. 3 ukazuje mapu plazmidu pT7-7.

Obr. 4 ukazuje, že chemotaxi u buněk THP-1 mohou indukovat různé chemokiny.

Obr. 5 ukazuje, že Met-RANTES může inhibovat chemotaxi u THP-1 buněk, indukovanou MIP-1a a RANTES.

Obr. 6 ukazuje možnost indukce přítoku vápníku do THP-1 buněk různými chemokiny.

Obr. 7 ukazuje inhibici odezvy vápníku v buňkách THP-1 indukované RANTES polypeptidem Met-RANTES.

Obr. 8 ukazuje kompetitivní vazbu Met-RANTES a RANTES na receptory CCKR1.

Obr. 9 ukazuje antagonistický účinek Leu-RANTES na chemotaxi, indukovanou RANTES.

Obr. 10 ukazuje antagonistický účinek Gln-RANTES na chemotaxi, indukovanou RANTES.

Příklady provedení vynálezu (a) Klonování kódující sekvence lidského RANTES pomocí PCR

Lidský RANTES byl klonován z knihovny lidské kostní dřeně XGT11 cDNA (Clontech) pomocí PCR. Stručně, inzerty celkové cDNA v knihovně kostní dřeně byly nejprve amplifikovány s použitím primerů XGT11, které sousedily s klonovacím místem EcoRI v objemu reakce

- 8 100 μΙ, obsahující 2 μΙ zásobního fága (10⁶ pfu), 10 mM Tris-HCI pH 8,3, 50 mM KCI, 1,5 mM MgCI₂, 0,2 mM dNTPs, 2,5 jednotek Amplitaq™ (Perkin Elmer-Cetus) a 1 μΜ každého z primerů (XGT11PCR-1 (dopředný primer) 5'GATTGGTGGCGACGACTCCT a

XGT11PCR-2 (reverzní primer) 5'CAACTGGTAATGGTAGCGAC) během třiceti cyklů, vždy 95 °C dvě minuty, 55 °C 2 min a 72 °C 5 min v zařízení Techne PHC-2 thermal cycler. Jedna desetina reakční směsi byla potom vystavena druhé amplifikaci PCR ve 100 μΙ, nyní obsahujících 1 μΜ každého ze specifických primerů (RANTES-1 io 5 CCATGAAGGTCTCCGCGGCAC ve správném smyslu a RANTES-2 5 CCTAGCTCATCTCCAAAGAG v opačném smyslu), založených na publikované sekvenci RANTES (Schall T. J. a další, J. Immunol. 141 1018 - 1025 (1988) v průběhu třiceti cyklů vždy 95 °C 2 min, 55 °C 2 min a 72 °C 2 min. PCR produkty byly vizualizovány na 3 % agarózových gelech Nu-Sieve (FMC), obarvených 0,5 pg/ml ethidiumbromidu a pruhy, které se pohybovaly podle předpovězené velikosti RANTES cDNA (278 bp) byly čištěny na gelu standardními metodami (Sambrook J. a další, (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, USA). DNA vyčištěná na gelu byla potom zatupena postupným štěpením T4 polynukleotidkinázou (New England Biolabs) podle předpisu výrobce v celkovém objemu 50 μΙ po dobu jedné hodiny při 37 °C. Potom bylo přidáno 2,5 μΙ 2,5 mM dNTPs a 1 μΙ Klenowova fragmentu DNA polymerázy I (New England Biolabs) a inkubace pokračovala dalších

30 min při 37 °C. Reakční směs byla potom inaktivována teplem 30 min při 70 °C a potom jednou extrahována fenol/chloroformem (1 ; 1 obj.), nasyceným Tris-HCI pH 8,0. DNA byla vysrážena přídavkem 10 μΙ 3 M acetátu sodného pH 5,5, 1 μ! glykogenu (20 mg/ml) (Boehringer) a 250 μΙ ethanolu při - 20 °C. DNA byla oddělena centrifugací při 10 000 x g po dobu 20 min při 4 °C a promyta 70 % ethanolem. Konečný centrifugát byl resuspendován ve sterilní vodě na koncentraci 10 ng/μΙ.

- 9 PCR produkt se zatupenými konci (10 ng) byl ligován do 50 ng plazmidu pBluescript II SK (Stratagene), který byl štěpen EcoRV a alkalickou fosfatázou v objemu 20 pl s použitím 2 μΙ T4 DNA ligázy (400 000 jednotek/ml) (New England Biolabs) alespoň 16 hod při 15 °C. Produkty ligace byly zředěny na 100 μΙ 1 χ TE (10 mM Tris-HCI pH 8,0/1 mM EDTA) a extrahovány fenol/chloroformem, jak je popsáno výše. Ligační produkty byly vysráženy přídavkem 10 μΙ 3 M acetátu sodného pH 5,5, 1 μΙ glykogenu (20 mg/ml) (Boehringer) a 250 μΙ ethanolu při - 70 °C po dobu 15 min. DNA byla oddělena centrifugací jak je popsáno výše a resuspendována v 10 μΙ sterilní vody. 5 μΙ resuspendovaných produktů ligace bylo potom vneseno elektroporací do elektrokompetentních buněk E. coli kmen XL-1 blue (40 μΙ) s použitím zařízení Bio Rad Gene Pulser podle doporučení výrobce. Po elektroporací bylo přidáno 1 ml média LB a buňky rostly 1 hod při 37 °C. Potom byly vysety alikvoty 100 μΙ kultivačního média na plotny LB s obsahem 100 μg/ml ampicilinu a ponechány růst 16 hod při 37 °C. Jednotlivé kolonie bakterií byly potom odpíchnuty do 5 ml média LB s obsahem 100 μg/ml ampicilinu a ponechány růst přes noc při 37 °C. Potom byly připraveny preparáty DNA (miniprepy) vždy ze tří ml každé kultury s použitím systému Wizard™ mini-prep DNA purification system (Promega) podle doporučení výrobce. Alikvoty 3 μΙ DNA z miniprepů byly potom štěpeny restrikčními enzymy Hind\\\ a EcoRI (oba firmy New England Biolabs) podle návodu výrobce v reakčním objemu 15 μ|. Reakční produkty potom byly analyzovány na 1 % agarózových gelech s obsahem 0,5 μg/ml ethidiumbromidu. Preparáty DNA, které poskytly velikost inzertu přibližně 280 bp byly potom analyzovány sekvenováním s použitím primerů T3 a T7 a kitu Sequenase (USB) podle návodu výrobce.

Klonovací vektor pBluescript II SK byl připraven následujícím způsobem: 20 μg plazmidu, čištěného v gradientu CsCI bylo štěpeno v reakčním objemu 100 μΙ po dobu 2 hodin při 37 °C 200 jednotkami EcoRV (New England Bioiabs) podle doporučení výrobce. Po dvou

- 10 hodinách byl rozštěpený vektor vystaven působení 10 μΙ telecí žaludeční alkalické fosfatázy (20 jednotek/ml) (Boehringer) dalších 30 min při 37 °C. Tato reakční směs byla inaktivována zahříváním 15 min při 68 °C a potom jednou extrahována fenol/chloroformem (1 : 1 obj.), 5 nasyceným Tris-HCI pH 8,0. Plazmidová DNA byla vysrážena přídavkem 10 μΙ 3M acetátu sodného pH 5,5 a 250 μΙ ethanolu při - 20 °C. DNA byla oddělena centrifugací při 10 000 x g 20 min při 4 °C a promyta 70 % ethanolem. Konečný centrifugát byl resuspendován ve sterilní vodě v koncentraci 50 ng/ml.

io Sekvenování odhalilo, že všechny získané klony byly identické s publikovanou sekvencí, s výjimkou jediné změny báze v nukleotidu 22 v sekvenci PCR, která měla za následek změnu Arg na Pro v navrhované signální sekvenci propeptidu RANTES.

To je ilustrováno v obrázku 1, který ukazuje klonovanou kódující 15 sekvenci DNA spolu s odpovídající sekvencí aminokyselin.

(b) Příprava expresního vektoru methionylovaného RANTES (antaqonista polypeptidu RANTES)

Pomocí PCR byl získán konstrukt, obsahující gen prostředků pro 20 RANTES s použitím primerú 'TTAATTAATTAAATCGATTCATATG. TC C. C C A. TAT. TC C. TC G. G AC. AC-3' kde dva podtržené úseky jsou restrikční místa Cla1 a Nde1 (místo

Nde1 zahrnuje část iniciačního methioninového kodonu) a

5 '-TACT GAT AT AAATCTAGACTAGCTC ATCTC C AAAGAGTTG-3'

Tento fragment byl potom štěpen Cla1 na 5'konci a Xba1 na 3'konci. Plazmid pCba-M, ukázaný na obr. 2, byl potom štěpen Xba1/Sal1. Velký fragment byl potom štěpen Sall a Cla1. Potom byla provedena trojí ligace s použitím malého fragmentu Sal1/Xba1 z so prvního štěpení, Sal1/Cla1 fragmentu z druhého štěpení a fragmentu

- 11 PCR za vytvoření konstruktu podobného pCba-M, kde gen mTNF byl nahrazen genem pro sekrenovanou formu lidského RANTES, počínaje iniciačním methioninem (sekrenovaná forma lidského RANTES nezahrnuje prvních 23 aminokyselin sekvence, ukázané na obr. 1. 5 Zahrnuje zbývající aminokyseliny ukázané na obr. 1 a začíná aminokyselinami SPY...).

Tento fragment Nde1/Sal1 byl pak z tohoto vektoru odstraněn a vložen do t7 expresního plazmidu pT7-7, ukázaný na obr. 3. Tento fragment obsahuje požadovaný gen + 600 bp jiného materiálu, ale io pozdější experimenty (zde neuvedené) ukazují, že odstranění tohoto dalšího materiálu (sekvencí vektoru) nemělo žádný vliv na úroveň exprese.

Expresní vektor typu pT7 se diskutuje v Studier FW, Rosenberg AH a další, Meth Enzymol, 185, 60 - 89, (1990). Konstrukt byl potom 15 transformován do kmene E. coli BL21 (DE3) (F-ompT, hsd s_B (R_B', m_B’) obsahujícího gen LysS na plazmidu pACYC184 (Chang a Cohen, J. Bact, 134, 1141, 1978). Expresní vektor vyžaduje pro indukci T7 polymerázu, aby se uskutečnila exprese. T7 polymeráza je v buňkách indukována přídavkem IPTG (izopropylthiogalaktosid) do média.

(c) Ukázka, že Met-RANTES skutečně ukazuje antagonistické účinky (i) Test chemotaxe

Chemotaxe in vitro byla prováděna s použitím komůrek s 96 jamkami (Neuro Probe MB series, Cabin John, MD 20818, USA) podle 25 doporučení výrobce. Chemotaxe indukovaná CC chemokiny, RANTES, MIP-1a a MCP-1 byla testována s použitím lidské monocytární buněčné linie THP-1. V každé jamce horní komůrky bylo inkubováno 4 χ 10⁵ THP-1 buněk v 200 μΙ média RPMI 1640 (Gibco) s obsahem 2 % inaktivovaného fetálního telecího séra. Do dolní komůrky bylo 30 umístěno 370 μΙ média RPMI 1640 (bez FCS) obsahující chemoatraktant (tj. chemokin). Pro inhibici chemotaxe byla

- 12 koncentrakce chemoatraktantu udržována na konstantní úrovni 5 x EC50, již dříve určené pro každý chemokin, a v různých koncentracích byl přidáván Met-RANTES. Komůrky byly inkubovány jednu hodinu při 37 °C v atmosféře 5 % CO2. Z horní komůrky bylo odstraněno médium a nahrazeno PBS obsahujícím 20 mM EDTA a komůrky byly inkubovány 30 min při 4 °C. Z horních jamek bylo odstraněno PBS a jamky byly vytřeny dosucha. Jednotka byla 10 min při 1800 min’¹ centrifugována, aby byly sklizeny buňky ve spodní komůrce a supernatant byl odsát. Buňky ve spodní komůrce byly měřeny s použitím kitu Cell Titer 98™ Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, USA), který sleduje přeměnu tetrazolinové modři na její formazanový produkt Do každé jamky bylo přidáno 100 μΙ 10 % roztoku barviva v médiu RPMI 1640 a komůrka byla inkubována přes noc při 37 °C v atmosféře 5 % CO₂. Do každé jamky bylo potom přidáno 100 pl solubilizačního roztoku a absorbance byla odečítána po čtyřech hodinách při 590 nm na zařízení Thermomax microtitre plate reader (Molecular Devices, Palo Alto, CA).

Výsledky jsou ukázány v obrázcích 4 a 5.

(ii) Tok vápníku

Tok vápníku indukovaný chemokiny RANTES a MIP-1a byl měřen podle Tsien R. Y„ Pozzan T„ a Rink T. J., (1982) „Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new intracellularly trapped fluorescent indicator“, J. Cell Biology 94, ale s použitím látky Fura-2MM (Fluka) namísto Quin 2 jako fluorescenčního indikátoru. Buňky THP-1 byly sklízeny v koncentraci menší než 10⁶/ml, aby bylo zajištěno, že jsou v exponenciální fázi. Buňky byly resuspendovány v Krebs-Ringerově roztoku obsahujícím 0,2 % Fura-2/AM a 1 mg/ml PSA v koncentraci 10⁶/ml a inkubovány při 37 °C 30 minut v nepřítomnosti světla. Buňky byly sklizeny centrifugací, resuspendovány v Krebs-Ringerově roztoku

- 13 a uchovávány na ledu. Před použitím byly 1 ml alikvoty inkubovány dvě minuty při 37 °C. Za míchání byly k suspenzi buněk přidávány chemokiny. Pro studium inhibice polypeptidem Met-RANTES byly přidány k buňkám alikvoty antagonistů v různých koncentracích v 5 průběhů dvou minut inkubace při 37 °C. Výsledky jsou ukázány v obrázcích 6 a 7.

(iii) Test vazby na receptory

Kompetitivní test byl prováděn na 96 jamkových destičkách io multiscreen filter-plates (Millipore, MADV N6500), na které bylo předem působeno 2 hodiny pufrem 50 mM HEPES pH 7,2, obsahujícím 1 mM CaCI₂, 5 mM MgCI₂ a 0,5 % BSA (vazebný pufr). Test byl prováděn buď s buňkami THP-1 nebo buňkami COS, exprimujícími rekombinantní receptor CC-CKR1 (Neote, K., DiGregorio, Mak, J. Y„ is Horuk, R., a Schall, T. J., (1993) Molecular cloning, functional expression, and signalling characteristics of a C-C chemokine receptor, Cell 72 415 - 425; Gao, J. L, a další, J. Exp. Med. 177 14217 (1993)). Každá buňka obsahovala 10⁵ buněk v objemu 150 μΙ vazebného pufru obsahujícího 0,4 nM [l^12S]Mip-1a nebo 0,4 nM 2o [I ]RANTES (New England Nuclear, NEX 277) a různé koncentrace soutěžícího Met-RANTES. Testy byly prováděn triplikátech. Po 90 min inkubace při 4 °C byly buňky promyty 4 x 200 μΙ ledového vazebného pufru obsahujícího 0,5 M NaCI, který byl odstraněn odsátím. Filtry byly usušeny, bylo přidáno 3,5 ml scintilační kapaliny Ultima Gold 25 Scintillation fluid (Packard) a měření bylo prováděno na přístroji Beckman LS5000 counter. Výsledky jsou ukázány na obr. 8.

(d) Příprava Leu-RANTES (zde označovaného také jako L-RANTES) a demonstrace antagonismu

Expresní vektor L-RANTES byl připraven ve dvou krocích.

Nejdřív bylo použito PCR pro štěpení genu pro lidský RANTES v

- 14 prvním cysteinovém kodonu a vložení jedinečných štěpících míst na oba konce genu. Tento PCR produkt byl klonován do expresního vektoru pET23d (Novagen), založeného na T7 E. coli, s použitím štěpícího místa Sací, vloženého na 5'konci genu a místa BsmAl, navrženého pro získání překrývajících se úseků kompatibilních s Hindlll na 3'konci genu. Geny, kódující N-koncové varianty lidského RANTES byly pak vytvořeny vložením oligonukleotidů kódujících tito varianty bezprostředně za 5'konec kódující sekvence RANTES. Pro tento účel byl klon RANTES vložený v pET23d štěpen Sací, potom následovalo štěpení T4 DNA polymerázou pro odstranění 3'překrývajících se konců zanechaných Sací a poté druhé štěpení enzymem Ncol. Oligonukleotidy kódující peptidovou sekvenci MKKKWPRLSPYSSDTTP byly potom klonovány do štěpeného vektoru. Exprese konstruktu pET23d/L-RANTES probíhala tak, jak je popsáno pro konstrukt pT7-7.

pET23d/RANTES Ncol pET23d/RANTES Sacl/T4

5' C C TGC TTT 3'

3' GGTAC G ACG AAA 5'

Oligonukleotidy L-RANTES

5' CATGAAAAAAAAATGGCCAAGGCTGTCCCCGTACTCCTCC3' TTTTTTTTTACCGGTTCCGACAGGGGCATGAGGAGG-GACACCACCCCGTG

-CTGTGGTGGGGCAC

Konstrukt pET23d/L-RANTES je jeden z řady expresních vektorů, kterých může být použito pro vytváření RANTES s různými aminokyselinami v poloze 1. Tyto T7 expresní vektory kódují proteiny s N-terminálními sekvencemi MKKKWPR-X-RANTES. X může být

- 15 například jakákoliv z aminokyselin L, I, Q, E nebo G. Štěpení endoArg-C poskytne jiné proteiny X-RANTES.

+2 Μ Κ Κ Κ W Ρ R L S Ρ Υ s S D Τ Τ

CATGAAAAAA AAATGGCCAA GGCTGTCCCC GTACTCCTCC GACACCACCC

GTACTTTTTT TTTACCGGTT CCGACAGGGG CATGAGGAGG CTGTGGTGGG + 2PCCF Α Υ I A R Ρ L PRA Η I Κ

CGTGCTGCTT TGCCTACATT GCCCGCCCAC TGCCCCGTGC CCACATCAAG

GCACGACGAA ACGGATGTAA CGGGCGGGTG ACGGGGCACG GGTGTAGTTC + 2 Ε Υ F Υ TSG Κ C S Ν Ρ A V V F V 101GAGTATTTCT ACACCAGTGG CAAGTGCTCC AACCCAGCAG TCGTCTTTGT CTCATAAAGA TGTGGTCACC GTTCACGAGG TTGGGTCGTC AGCAGAAACA + 2 TRK Ν R Q V CAN PEK KWV

151CACCCGAAAG AACCGCCAAG TGTGTGCCAA CCCAGAGAAG AAATGGGTTC GTGGGCTTTC TTGGCGGTTC ACACACGGTT GGGTCTCTTC TTTACCCAAG + 2REYI NSL EMS*

HINDU I NOTI XHOI

201GGGAGTACAT CNACTCTTTG GAGATGAGCT AAAGCTTGCG GCCGCACTCG CCCTCATGTA GTTGAGAAAC CTCTACTCGA TTTCGAACGC CGGCGTGAGC

- 17Čištění Leu-RANTES bylo prováděno následujícím způsobem:

g buněčné pasty E. coli bylo suspendováno v 15 ml 50 mM pufru Tris-HCl pH 7,6, obsahujícího 1 mM dithiothreitolu, 5 mM benzamidinu-HCI, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoridu a DNázu (0,02 mg/ml). Buňky byly rozbity třemi průchody homogenizátorem French Pressure cell, přičemž po každé pasáži byla prováděna sonikace na ledu po dobu 1 min. Výsledný roztok byl centrifugován 60 min při 10 000 x g. Centrifugát byl rozpuštěn ve 2 ml 10 mM pufru Tris-HCl pH 8,0, obsahujícího 6 M guanidin-HCI a 1 mM dithiothreitolu. Roztok byl zahříván 60 min při 60 °C pro dosažení monomerizace, ochlazen na pokojovou teplotu a filtrován na gelové koloně Superdex-200 16/60, ekvilibrované ve stejném pufru. Frakce obsahující rekombinantní konstrukt RANTES (16 ml) byly renaturovány přikapáváním 384 ml 100 mM pufru Tris-HCl pH 8,0, obsahujícího 1 mM oxidovaného glutathionu a 0,1 mM redukovaného glutathionu a mícháním přes noc. Tento roztok byl dialyzován proti 50 mM pufru s acetátem sodným pH 4,5 a potom nanesen na kolonu HILoad SP26/10, ekvilibrovanou ve stejném pufru. Proteiny byly eluovány lineárním gradientem 0 - 2 M NaCl ve stejném pufru. Frakce, obsahující renaturovaný protein, byly dialyzovány proti 3x511% kyseliny octové a lyofilizovány.

Pro odstranění hexapeptidu KKKWPR z fúzovaného proteinu byl lyofilizovaný prášek rozpuštěn ve vodě a koncentrace nastavena na 1 mg/ml 50 mM Tris-HCl pufrem pH 8,0. Ke 2 ml tohoto roztoku bylo přidáno 20 pg Endoproteinázy Arg C (Boehringer Mannheim) a roztok byl inkubován 2 hod při 37 °C. Rozštěpený protein byl oddělen od výchozího materiálu HPLC na reverzní fázi s použitím kolony Nucleosil-C₈ (10 x 250 mm), ekvilibrované v 0,1 % kyselině trifluoroctové. Proteiny byly eluovány gradientem 22,5 - 45 %

- 18 acetonitrilu v 0,1 % kyselině trifluoroctové, lyofilizovány a skladovány při - 80 °C.

Antagonistické účinky na chemotaxi buněk THP-1, indukovanou RANTES byly testovány stejným způsobem jak bylo popsáno pro 5 protein Met-RANTES.

Výsledky jsou ukázány v obr. 9.

(e) Příprava Gln-RANTES (někdy označovaného jako Q-RANTES) a demonstrace antagonismu io Pro přípravu Gln-RANTES byl použit postup, popsaný v odst. (d).

Antagonistické účinky Gln-RANTES na chemotaxi buněk THP-1, indukovanou RANTES, byly testovány stejným způsobem, jak je popsáno pro protein Met-RANTES. Výsledky jsou ukázány na obr. 10.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Polypeptid, který má alespoň 40 % homologii sekvence aminokyselin s polypeptidem RANTES a který působí jako antagonista polypeptidů RANTES nebo MIP-1a v jednom nebo více z následujících hledisek:

   (a) chemotaxe buněk THP-1 jako odpověď na RANTES a/nebo jako odpověď na MIP-1a;

   (b) mobilizace iontů vápníku v buňkách THP-1 způsobená přítomností RANTES a/nebo přítomností MIP-1a; a (c) vazba RANTES na receptory buněk THP-1;

   přičemž polypeptid působí jako antagonista polypeptidů RANTES nebo MIP-1a díky přítomnosti alespoň jedné Nkoncové aminokyseliny.
2. 2. Polypeptid podle nároku 1, kde uvedená jedna nebo více Nkoncové aminokyseliny jsou N-koncové k sekvenci SPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S.
3. 3. Polypeptid podle některého z nároků 1 nebo 2, kde uvedené jedna nebo více N-koncových aminokyselin zahrnují nebo sestávají z methioninu, leucinu nebo glutaminu.
4. 4. Polypeptid podle nároku 3, kde uvedený methionin, leucin nebo glutamin je na N-konci polypeptidů.
5. 5. Polypeptid podle některého z předcházejících nároků, který má sekvencí:

   (i) MSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP

   5 AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, označovaný zde také jako „Met-RANTES“, (ii) LSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, označovaný zde také jako „Leu-RANTES“, io (iii) QSPYSSDT TPCCFAYIAR PLPRAHIKEY FYTSGKCSNP AVVFVTRKNR QVCANPEKKW VREYINSLEM S, označovaný zde také jako „Gln-RANTES“, nebo má sekvenci, která je s jakoukoliv z výše uvedených sekvencí homologní.
6. 6. Sekvence DNA nebo RNA, kódující polypeptid podle některého z předcházejících nároků.
7. 7. Vektor, vyznačující se tím, že obsahuje 2o sekvenci podle nároku 6.
8. 8. Hostitelská buňka, vyznačující se tím, ž e obsahuje vektor podle nároku 7.

   25
9. 9. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 5 pro použití při léčení nebo diagnóze onemocnění lidí nebo zvířat.
10. 10. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 5 pro použití při léčení onemocnění inhibicí nebo omezením zánětu, zprostředkovaném polypeptidy RANTES nebo MIP-1a.

    5
11. 11. Polypeptid podle nároku 10 pro použití při léčení astmatu, alergické rhinitidy, atopické dermatitidy, atheroma/atherosklerózy nebo revmatoidní artritidy.
12. 12. Způsob výroby polypeptidů podle některého z nároků 1 až 5, io vyznačující se tím, že zahrnuje vyvolání exprese uvedeného polypeptidů u hostitelské buňky podle nároku 8.
13. 13. Polypeptid v podstatě jak je popsaný výše s ohledem na is doprovázející příklady.