CZ177497A3 - Process for preparing products containing non-immunogenic factor viii - Google Patents

Process for preparing products containing non-immunogenic factor viii Download PDF

Info

Publication number
CZ177497A3
CZ177497A3 CZ971774A CZ177497A CZ177497A3 CZ 177497 A3 CZ177497 A3 CZ 177497A3 CZ 971774 A CZ971774 A CZ 971774A CZ 177497 A CZ177497 A CZ 177497A CZ 177497 A3 CZ177497 A3 CZ 177497A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
fviii
factor viii
plasma
freeze
solution
Prior art date
Application number
CZ971774A
Other languages
English (en)
Inventor
Enzo Dr Bucci
Ronald Dr Kotitschke
Dieter Dr Rudnick
Herbert Dr Dichtelmuller
Michael Dr Kloft
Wolfgang Loebnau
Gunter Ott
Original Assignee
Biotest Pharma Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7796648&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ177497(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biotest Pharma Gmbh filed Critical Biotest Pharma Gmbh
Publication of CZ177497A3 publication Critical patent/CZ177497A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Vynález se týká způsobu výroby produktu obsahujícího obzvlášf vysoce vyčištěný dvojnásobně vůči virům inaktiUt^í^ný faktor VIII (krev čisticí faktor VIII, zkráceně^ FVIIΓ”)- , z lidské krevní plasmy.
Dosavadní stav techniky
Ze stavu techniky jsou známy postupy k výrobě vysoce čistých, vůči virům inaktivovaných produktů FVIII, které se izolují z lidské krevní plasmy. Například evropský patentový spis číslo EP 0 367 840 popisuje výrobu produktu FVIII s použitím iontoměničů k čištění FVIII. K inaktivaci vůči virům se zpracovává roztok FVIII biologicky kompatibilními systémy organické rozpouštědlo/detergent. Německý patentový spis číslo DE 42 04 694 popisuje iontoměniče s různými význaky, kterých se používá k čištění FVIII. Evropský patentový, spis číslo EP 0 337 144 popisuje dělicí materiály k frakcionaci biopolymerů, kterých je možno použít při afinitní nebo iontoměničové chromatografii. Evropský patentový spis číslo EP 0 567448 popisuje kombinaci opatření chromatografického čištění, zpracování FVIII tensidy ve vodném roztoku a tepelného zpracování preparátů FVIII v pevném stavu. Tepelné zpracování používá horké páry v přítomnosti methanolu nebo etanolu za odvádění určitých hmotových poměrů. Světový patentový spis číslo WO 93/15105 popisuje vyýrobu FVIII z kryoprecipitátu za použití aniontoměníčů. Evropský patentový spis číslo EP 0 399 321 popisuje výrobu koncentrátu FVIII vysrážením FVIII polyethylenglykolem (PEG) v přítomnosti sacharosy (koncentrát FVIII 1,2 až 0,6 g/m). Patentový spis FBE 0 383 .645 popisuje výrobu koncentrátu FVIII oddělováním FVIII od Willebrandova faktoru. Evropský patentový Spis číslo EP 0 412 466 popisuje výrobu FVIII s vysokou specifickou aktivitou, který se přídavně pasterizuje. Americký patentový spis číslo 5, 099 022 popisuje zahřívání vymrazením vysušených koncentrátů sražené krve ke snížení infekčnosti případných virů. Světový patentový spis číslo WO 94/17 834 popisuje inaktivací virů zpracováním zdrojfe alkylfosfáty, současně nebo postupně při teplotách 55 až 67 *C po dobu 5 až 30 hodin. Evropský patentový spis číslo EP 0 18 561 popisuje přípravu srážecích faktorů ohřevem na teplotu 60 až 70 ’C v přítomnosti gycinu a sacharidového roztoku. Evropský patentový spis číslo EP 0 094 611 popisuje sloučeninu obohacenou FVIII k výrobě léčiva, která se ve vymrazením vysušeném stavu zahřívá na teplotu 60 až 125 *C, se specifickou aktivitou vyšší než 300 jednotek FVIII na gram proteinu.
V časopise Hemophilia World 1955, sv. 2, č. 3 jsou v příloze k tomuto Sešitu souhrnně uvedeny koncentráty FVIII a FIX, které jsou ve Spojených státech amerických v současné době na trhu pod názvem Clotting Factor Concetrates, USA 1995. Z této publikace jsou převzaty údaje v tabulce I o způsobech inaktivace virů, kterými se tyto produkty ošetřují a jsou doplněny o evropské produkty a výrobce.
Tabulka I
Koncentráty faktoru VIII (obchodní produkty 1995)
č . Oběh. název Výrobce Inaktivace viru Specif.aktivita bez koneč. ohs. albuminu
1 Haemate Behr ingswerke 60 ’G, lOh,tekut + stabilizátor . -- 1-2
2 Beriate P Behr ingswerke 60 ’C, lOh,tekut + stabilizátor . -- přibl.100
3 P.rofilate HAT ' Alpha SĎ;80 ’C,72(GT) 5-15
4 Koate Milles/Cutter SD 10-20
5 Octavi SD Plus Octapharm a SD;63 *C,lOh,tekut.— přibl.100 + stabi 1 i zátor
SD;100 ’C, 30 ínin -- přibl.100
Emoclot
Aima
Tabulka I (pokračování)
č. Obch. název
Výrobce Inaktivace viru Specif.aktivita bez konec. obs. albuminu
7 Haemoctin Biotest Pharama SDH SD;100 ’C, 30 min p ř i b1.100
8 Immunate Immuno AG 6Ό *C,10 h, pára -- 10-
9 Alpanate Alpha SD -- 20-30
10 Hemofil M Baxter SD >500 2-10
11 Monocláte Armour 60 *C,10 h, tekut 1 stabilizátor ,>500 2-10
12 Očtanativ Kabi SD >500 př ibl.20
SD = systém rozpouštědlo/detergent
GT = sušeno vymrazováním
Koncentráty FVIII uvedené ; v tabulce I bylý vyvinuty v po-
sledních deseti letech (Kasper C.K., Lusher J.M. a Transfusion Practices Commiťtee of the American Association of Blood Banks Recent evolution of clotting factor concentrates for hemophilia A and B. Transfusion 1993, 33, str. 422 až 4334). Nejdůležitějším cílem při vývoji těchto produktů bylo zlepšení jejich bezpečnosti z hlediska přenosu virů. Tohoto cíle bylo dosaženo zlepšením skrínování dárcovské krve a použitím nových technik k inaktivaci virů a vyčištění FVIII.
V konci 70. let a na začátku 80. let byly vyvinuty dva nejdůležitěší způsoby inaktivace virů pro koncentráty FVI1I. Jeden způsob spočívá v tepelném zpracování roztoku FVIII v přítomnosti stabilizátorů. Druhý způsob popisuje použití alkylfosfátů. V roce 1979 bylo v evropském patentovém spise číslo EP 0 018 561 popsáno zahřívání roztoku FVIII v přítomnosti cukrů (40 až 60 Z) a aminokyselin (1 až 2,5 mol/1). Zahřívání proteinů v roztocích v přítomnosti cukrů bylo rozšířeno přísadou solí obsahujících ionty vápníku. (EP 0 106 269). Metoda inaktivace virů v proteinových roztocích byla doplněna variantami uvedených zveřejnění, jako evropský patentový spis.číslo EP 0 035 204, kde byla teplota 60 *C rozšířena na až 75 *C a byla použita koncentrace cukrů 30 Z áž do nasycení, Zahřívání proteinových frakcí ve>stavu vysušeném -vymřazením, obsahujících FVIII, je popsáno v evropském patentovém spise číslo EP 0 171 506. Rozsah teplot je 60 až 125 ‘C. Zpracování plasmových frakcí obsahujících FVIII párou už bylo uvedeno shora.
Zpracování frakcí plasmy obsahující FVIII kombinací alkylfosfátu a detergentu je známo z evropského patentového spisu číslo EP 0 131 740. Tento postup se jako účinný osvědčil zejména při inaktivaci obalených virů (Horowitz M.S. a kol., Lancet 2, str, 186 až 189, 1988 , Horowitz B.t Cuřr, Stud. Hematol, Blood Transfus. 56, str. 83 až 96, 1989, Horowitz B, Transfusion 25, str. 616 až 522, 198.5). Tento způsob inaktivace virů (způsob Solvent-Detergent SD) není však v zásadě schopen inaktivovat viry bez obálky virů obsahující lipid.
Jelikož není možno vyloučit nebezpečí přenosu iniciátorů infekcí při výrobě léčiv z plasmy lidské krve skrínováním dárcovské plasmy, má bytí toto nebezpečí dále sníženo použitím postupů inaktivace virů. Směrnice k inaktivaci obalených virů sé stala obzvlášť potřebnou, když še v letech 1932/1933 v souvislosti s koncentrátem FVIII, zpracovaným metodou SD, objevily zprávy o přibližně 100 případech infekce hepatitis A (Lancet 340, str. 123, 1992, Lancet 341 str. 179 1933, Ann.Intern. Med. 1994, MMWR sv. 45, č. 2, str. 29 až 32 1996). Tytó případy hepatitidy A vedly k postupnému plánu německých úřadů (Pharm. Ind. 4, str. 71 až 72, 1993).
Vedle nebezpečí přenosu iniciátorů infekcí produkty FVIII je vznik inhibitorů FVIII (protilátek FVIII) ústředním problémém substituční terapie hemofilie A. Protilátky vznikají u 3 až 52 % pacientů s těžkou hemofilií A, které jsou vysvětlitelné radou proměnných (De Biasi R. a kol. ,Thřombosis Haemostasis
7.2, stř. 544 až 547, 1994, Ehrenforth S. a kol., Lancet 338, str. 594 až 598, 1992, Scharrer I. a kol., Blood.Coag Fibrinol '4,.stf. 753 až 758, 1993, McMillan V.W. a kol., Blood 71, str. 344 až 348, 1988). Takové proměnné sě týkají věku pacientů, četnosti ošetření a typu preparátu FVIII ( Addiego H.E. a kol. „Thřomb. Haemost·- 67, str 19 až —27, 1993 Burnouf F. a kol·.’,* Vox.Sang. 60, str. 8 až 15 1991, Peerlinck K. a kol., Thřomb. Haémost. 69, str. 115 až 118, 1993, Rodendaal F.Ř. a kol·., Blood, 81, str. 2180 až 2186, 1993, Sultán Y., Thřomb,. Haemost. 67, str. 60Ó až 602, 1992, Peerlinck K, a kol., Blood 81, str. 3332 až 3335, 1993, Guérois C, a kol. Thrombos Haemostas 73, str. 215 až 218, 1995).
Rozdíly v imunitní odezvě pacientů nebo jejich genetické předpoklady mohly incidenci inhibitorů ovlivnit. (Roberts HR, Blood Coag a Fibrinol 2 (1), str. 21 až 23, 1991, Hoyer L,
Brit. J. of Haematology 90, str. 498 až 501, 1995).
Dále sé ukázalo, že různé genové mutace FVIIÍ korelují ke vzniku protilátek (Schwáab Ř, a kol;, Thrombosis and Haemostasis 74,(6), stř. 1402 až 1406, 1995).
Proměnné, které ovlivňují incidenci inhibitoru FVIII jsou:
1. pacient: genetická vada, charakteristické imunologické reakce, imunitní stav,
2. ošetřování: produkt FVIII, počet exposic,
3. posouzení: dozor a citlivost dozorčích metod.
I když není v současné době jednoznačné přiřazení jediné příčiny pro vznik protilátek FVIII s inhibičními vlastnostmi, ukazují výsledky jednotlivých studií význam, který připadá preparátům FVIII při indukci inhibitorů FVIII (Vermylen I, a kol., Acta Clinica Belgica 46, str. 20, 1991),
Dříve často ošetřovaní pacienti hemofilie A (PTP = hernofiliaci s dřívější několikanásobnou transfusí) byli od května 1990 do září 1991 ošetřováni novým koncentrátem FVIII. Tento produkt byl vyčištěn chromatografií na skle a pasteurizován. Ze 47 pacientů, kteří byli ošetřováni výhradně tímto produktem, vyvinuli 4 vysoce titrovaný inhibitor (40, 90, 100 a 200 jednotek Bethesda (BU)). Další pacient (20BU) byl vpodstatě^ také ošetřován tímto produktem FVÍII. Používání tohoto produktu bylo na základě těchto nálezů ukončeno.
Výroba vysoce vyčištěného koncentrátu FVIII z velkých zásob plasmy se specifickou aktivitou 100 předpokládá, že musejí být splněny četné požadavky na výrobní postup pro takový koncentrát FVIII.
Působení opatření inaktivizujících viry na strukturu proteinů je jednou z ústředních otázek, obzvláště k problematice inhibitorů. Nejpodstatnější biologická funkce FVIII, jeho aktivita, měla vykazovat v koncentrátu FVIII, kterého bylo použito k ošetřování hemofilie, přibližně stejný poměr k proteinu FVIII, FVIII—Ag jako v mediu, plasmě, ze které je izolován.
Koncentrát FVIII, který se získává z plasmy po vyčištění, měl vedle FVIII obsahovat v podstatě ještě jeho přirozený nosný protein z Willehrandova faktoru (vWF). Jelikož cílem snah je vyčištění FVIII z plasmy, jeho oddělení od ostatních proteinů plasmy, mělo se použití proteinů plasmy jako stabilizátoru zabránit, jelikož předcházející snahy o vyčištění se stanou zbytečnými. Podle toho měl hemofilík dostat jen ten protein, který on potřeboval. Vyčištěný FVIII z plasmy sestává ze směsi polypeptidů s molekulovými hmotnostmi 80 až 210 kDa, které představují řadu podjednotek série heterodimérů (Kaufmann R, Transfusion Medicine Reviews 4, str. 235 až 246, 1992).
Úkolem vynálezu tedy je poskytnout nový způsob vyčištění a inaktivacě virů výchozích materiálů, které obsahují faktor VIII, v podstatě bez použití stabilizátorů'.
Podstata vynálezu
Způsob výroby produktů obsahující neimunogenní faktor VIII, vyznačují se tím,že (a) se podrobuje roztok obsahující faktor VIII zpracování sys*™**témem tri (n-butýl·} fosf át/detergent, (b) tepelně se zpracovává vymrazením vysušený produkt obsahujícího FVIII při teplotě 100 'C po dobu 15 až 120 minut, s výhodou 30 minut, přičemž vymrazením vysušený produkt, obsahující FVIII, vykazuje po tepelném zpracování zbytkovou vlhkost hmotnostně 0,3 až 1,8%.
Způsob výroby neimuónogenně působícího vysoce vyčištěného koncentrátu FVIII z lidské plasmy sestává z použití dvou různých způsobů inaktivacě virů. Tato dvojitá inaktivacě virů zahrnuje, jak shora uvedeno, zpracování roztoku FVIII systémem tri(n-butyl)fosfát (TNBP)/polyoxyethylenový derivát sorbitanového esteru (TweenR) (SD: systém šolvent/detergent = rozpouštědlo/detergent s výhodou hmotnostně 0,2 až 0,5 % TNBP/0,5 až 3 % TweenR a tepelné zpracování vymrazením vysušeného konečného produktu FVIII v konečném objemu při 100 *C podobu 30 minut, při konečné vlhkosti hmotnostně přibližně 0,3 až 1,8%. K tomu přistupují s výhodou kroky zbavující viru při výrobě.
Koncentrát FVIII, vyrobený podle vynálezu z lidské plasmy, je v dalším textu označován jako FVIII SDH (SDH = Solvent/ Detergent./Hitze). FVIII SDH še vyrábí s výhodou z kryoprecipitátu jakožto výchozího materiálu, který se získá ze zásoby plasmy známými metodami. V kryoprecipitátu jsou obsaženy téměř všechny plasmové proteiny, některé oproti plasmě v obohacené formě, zejména FVIII a fibrinogen.
- 8 Podle výhodného provedení zahrnuje způsob FVIII SDH následující výrobní operace:
(lj Oddělení fibrinogenu a případně odstranění ostatních srážecích činitelů komplexu PPSB probíhá například vysráže ním ethanólem a/nebo adsorpci na AÍ(0H)3.
(2) Inaktivace viru surové frakce FVIII probíhá s výhodou se systémem TNBP/ŤweenR80.
(3) Specifická sloupcová· chromatografie na iontoměničích _ k odstranění TNBP a TweehR80 i k oddělení zbylých plasmových proteinů.
(4) S výhodou dia-nebo utra-filtrace eluátu, nastavení elektrolytů na požadovanou koncentraci.
(5) Po sterilní filtraci následuje konečné plnění do skleněných lahví ponořených do tekutého dusíku (přibližně - 195 *C), čímž se roztok FVIII šokově zmrazí.
(6) Sušení výmrazováním zmrazeného roztoku FVIII probíhá ve vysokém vakuu a vede se až do zbytkové vlhkosti konečného produktu přibližně 0,3 až 1,8 %.
(7) Vymrazením vysušený produkt se zahřívá v autoklávu 30 minut na teplotu 100 'C.
Produkt vyrobený podle vynálezu nepůsobí imunogenně a je oproti výchozí plasmě obohacen například 104-násobně, obzvláště použitím chromatografického Čištění.
Kroky přípravy FVIII zbavující viru a Čištění z lidské plasmy 2a použití způsobu podle vynálezu k výrobě neimunogenně působícího koncentrátu FVIII jsou uvedeny v tabulce II. Pro jednotlivé relevantní obalené a neobalené viry jsou inaktivační míry pro každou výrobní operaci koncentrátu FVIII udány v logaritmech o základu 10.
Tabulka II
Zbavování viru a jeho inaktivace pro neimunogenně působící FVIII z plasmy (redukce viru:log 10) **
V irus Neutra- lizace K-ryopr ec i p Krok/zpracování A1(OH)3 tňbp . Tween Chroma- tógraf 100 *.c 30 min celkový redukční faktor
HIV-1 1, 3 0,4 L* >6,4 1,9 >6,6 >16,2
PSR 3,2 1,1 >6,8 1,1 >4,6 >16,8**
VSV 1,5 0,5 >4,7 0,6 >5,8 >11,9
BVDV 1,2 n. t. >6,8* 1,1 >6,6 >15,7
Sinb. n. t. * *’ 3,5 >4,5 1,0 n. t. >9,0
Pol io n: t. 5,0 n. t. 2,2 5,0 12,2
Parvo * a 1,3 0,5 .2,4 1,4 5,1
Reo 1,6 n. t. >6,0 >7,6
HAV 4,4 4 ,1 >5,3 >13,8
HCV;>4;5 loglO (šimpansí studie)
** hovězí parvovirus netestováno
Koncentrát FVIII, vyrobený způsobem podle vynálezu z lidské plasmy, obsahuje FVIH například v množství 10 OOO-krát obohaceném oproti plasmě. Prokazatelná koncentrace jednotlivých proteinů na 1000 ΓΕ FVIII SDH (IE - mezinárodní jednotky) je v tabulce III uvedená v porovnání s koncentrací proteinů vyskytující se v jednom litru plasmy.
Tabulka III
Koncentrace proteinů v plasmě a FVIII SDH (průměrně hodnoty)
Protein Koncentrace v plasmě (mg/l) - FVIII SDH (mg/1000 IE) Způsob
FVIII 0,1-0,2 0,1 - 0,2 1
Celk.množ.proteinu 65000 10 2
vWF 18 6 1
f ibrinogen ** * 3000 3,5 «•3· —
f ibronektin 30 0,3 3
albumin 44Ó00 0,03 3
lgG 12000 0,5 3
lgM 1400 0,2 3
lgA 2100 <0,01 3
= Elisa (Enzyme línked immunosorbent asšay) = Bradford (autor metody) (Bradford MM: Analytical
Biochemistry 72, str. 248 až 254, 1976) = RID (Radiální imunodifuse)
Z tohoto znázornění koncentračních údajů proteinů, prokazatelných v FVIII SDH, lze vyčíst, že například 96 X prokazatelného množství proteinu sestává z FVIÍI vWF a nikoli z koagulovatelných fibrinogenů. Fibrinogen se vyskytuje jako ne* srážlivý fibrinogen, tedy stanovení fibrinogenů podle Clause poskytuje záporný výsledek (Claus A., Acta Haemát 17, str. 237 až 246, 1957).
Metody používané k výrobě koncentrátů FVIII a k inaktivaci případně eliminaci virů^ nacházejících se v krevní plasmě, mají možná vliv na strukturu a biologické působení proteinů. Základním předpokladem pro použitelnost produktů FVIII jě, že se před použitím po přidání rozpouštědla - normálně je to voda vhodná pro klinické použití (aqua ad injectabila) - beze zbytku rozpustí. Denaturované proteiny jsou ve vodě v podstatě ne11 rozpustné. Struktura a biologická aktivita produktu FVIII, vyrobeného podle vynálezu, zůstává zachována, pokud je vyroben způsobem podle vynálezu, neboť pouze při těchto podmínkách se koncentrát FVIII i po ohřevu až 2 hodiny na 100 *C vodou aqua ád injectabilia beze zbytku rozpouští.
Rozhodujícím předpokladem pro to, aby byl FVIII SDH podle vynálezu schopen tříhodinového ohřevu na 100 *C bez denáturace a přesto byl beze zbytku ve vodě rozpustný a aniž se do vysušovacího pufru vymrazováním musí přidávat stabilizátor v podobě proteinů nebo cukrů, je šokové zmrazení roztoku FVIII v tekutém dusíku při teplotě - 195 *C před sušením vymrazováním. Koncentrát FVIII, vyrobený podle vynálezu, FVIII SDH s převapenlro ve své biologické struktuře a biologické aktivitě nemění a denaturace proteinů ohřevem nenastává.
K přezkoušení účinku výrobního postupu podle vynálezu na strukturu proteinů byla provedena řada fyzikálních a biologických testů (Kotitschke R. a kol., Hámostaseologíe 14, str. 100 až 103, 1994, Arrighi S. a kol., Thromb Haemost 74 (3), str. 868 až 873, 1995). Zejména se zkoušelo působení tepelného zpracování na proteiny za podmínek výrobního způsobu podle vynálezu, jelikož FVIII je jak známo extrémně stálý při skladování a citlivý na tepelné zpracování.
Obvykle vyžaduje tepelné zpracování roztoku FVIII stabilizaci FVIII přísadou určitých stabilizátorů. Tepelné zpracování FVIII ve stavu vysušeném vymrazováním bez patrné ztráty aktivity je dále známo pouze u produktů FVIII, jejichž specifická aktivita po výrobě Z plasmy je velmi nízká (například < 20), nebo kterým je nutno přidávat stabilizátory ve formě proteinů nebo cukrů (tabulka Γ).
Produkt FVIII SDH podle vynálezu lze s překvapením bez patrné ztráty aktivity přechovávat při teplotě 100 *C až dvě hodiny, pokud obsah zbytkové vlhkosti nepřesahuje přibližně
1,8 % a teplota zmrazení před sušením v.ymrázován ím je pod -195 *C.. Z uve.dených údajů vyplývá, že zahřátý a ne zahřátý produkt FVIII při zkouškách struktury a aktivity vykazoval identické výsledky (obr. 2 a tabulka IV).
Tabulka IV
Haemoctin (R) SDH:FVIIIC/FVIIIAg
Ošetření FVIHC (x10) FVIHAg (x10) FVIIIC/FVIÍlAg (/10)
K<70 0,98 1,66 5,9
AI(OH)3 0,79 1,38 5,7
TNBP/Tween 0.59 1,01 5,8
S.-Eluat 3,18 4.68 6,8
ZP (UF/DF) 5.79 8,55 6,8
GT 5.57 6.95 8
SDH 5,25 6,8 7,7
Kryo 1,29 1.3 9.9
AI(0H)3 0.99 1,01 9,8
TNBP/Tween 0,67 0.7 9.6
S.-Fluat 4,46 5 8,9
ZP (UF/DF) 6,31 6,45 9,7
GT 6.25 5,9 .1 10,5
SDH 5,55 5.7 9.7
Kryo 0,98 0.98; 10
AI(0H)3 0.81 0,73 11
TNBP/Tween 0,61 0,67 9,1
S.-Eluat 3.8 77 4.34 8,8
ZP (UF/DF) 1 6,2 6,38 9.7
GT 5.78 5,7 10,1
SDH 5,52 5,3 10,4
Vynález blíže objasňují připojené obrázky:
Seznam obrázků
Na obr.l je schematicky naznačena výroba FVIII SDH ve výhodném. provedení.
Na obr.2 je znázorněn poměr FVIIIV/FVIIIag v různých výrobních operacích tří šarží FVIII SDH.
Na obr.. 3 je seznam ošetřovacích center hemofilie. ...
Pro obr. 2 platí, že šarže (a) se odlišuje od šaží (b) a (c) zřetelně sníženým poměrem výchozího produktu výroby kryoFVIIIi Aby bylo možno znázornit v tomto grafu sloupce pro jednotlivé parametry v přibližně porovnatelné velikosti, byly jednotlivé parametry 10 x znásobeny nebo 10 x děleny. Poměr musí být v tomto znázornění dělen 10, aby se poznalo, že pro šarže (b) a (č) v každé výrobní operaci je tento poměr blízký jednotce =1,0. Kryo-šarže a vykazuje poměr přibližně 0,6, což je důkazem ztracené aktivity FVIII při výrobě á skladování této kryo-šarže. Výrobní postup k vysoce vyčištěnému koncentrátu FVIII zvedá poměr na 0,8, avšak nikoli na 1,0. Při této studii je však rozhodující porovnání poměru zahřátých a nezabřátých vzorků. Tyto poměry pro oba produkty jsou přibližně stejné a tím je potvrzena poměrně nepatrná ztráta aktivity způsobená tepelným zpracováním.
Účinek výrobního postupu na strukturu proteinů je přezkoušen pomocí rozdělení molekulové hmotnosti a pomocí elektrof ořéžy gelu SDS-pólyakrylamidu (PAGE). Dodatečně se nezahrátý produkt (FVIII SD) a zahřátý produkt (FVIII SDH) přezkušoval na vznik neoantigenů (R, Kotitschke s kol., Hámostaseologie 14, str. 100 až 103, 1994, S.Arighi a kol., Thromb Haemost 73 (3), str. 868 až 873, 1.995) . Výsledkem těchto zkoušek je identita FVIII SD a FVIII SDH, čímž je prokázáno, že v koncentrátu FVIII, vyrobeném podle vynálezu, zůstává struktura proteinů nezměněná.
Obr. 3 ukazuje sledování FVIII SDH při použití. Sledování se započalo v foče 1993 na sedmi sledovacích centrech pro hemofilii A. Do sledování bylo zahrnuto 51·pacientů s nejdelší dobou sledování 27 měsíců. V Maďarsku byli před rokem 1993 téměř všichni pacienti trpící hemofilii A ošetřování kryoprecipitátem a/nebo pouze koncentrátem FVIIÍ. Proto bylo možno přezkoušet incidenci inhibitoru na poměrně homogenní skupině pacientů po ošetření FVIII SDH a porovnat incidenci inhibitoru této skupiny (skupiny I) se skupinou v Německu (skupina II·), která byla v ošetřovacích centrech pro hemofilii A předem ošetřována různými koncentráty FVIIÍ. U žádného z 51 pacientů se inhibitor nevyskytl. Pacienti byli vyšetřováni v období 4 až 26 měsíců, převážná většina v období 12 měsíců. Maximální počet kumulativních ošetřovacích dnů obnášel 349. Ošetřovací den zaárnuje množství FVIII, kterého bylo použito k ošetření jedné příhody krvácení.
Odezvy, in vivo recovery a poločas se určovaly 1-hodinovým testěm FVIII a chromogenním substrátem (u 16 pacientů) - pro porovnání slouží tabulka V. Tyto údaje odpovídají údajům publikovaným různými autory v minulosti pro pd koncentráty FVIII (pd = plasma derived = vyrobených z plasmy).
Tabulka V
FVIÍI SĎH: Biologické poločasy a in vivo zotavení u 16 pacientů trpících hemofilii A
1-stupňóvý test chromogenní substrát
in vivo zotavení X 71 ± 15 77 ± 17
odezva (%) 1,6 + 0,4 1,7 ± 0,4
Poločas
13,0 + 2,8
12,7 ± 3,2
Vynález blíže objasňují, nijak však neomezují, následující příklady praktického provedení.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Výroba FVIII z plasmy člověka, který není imunogenní po substituci na pacientech. ..
Dárcovská plasma: Devět dílů dárcovy krve se přidá do jednoho dílu 3,8% stabilizačního natrinmcitrátového roztoku. Ihned po odběru se krev odstředí a dárci se znova infundují {plasmaferese) erytrocyty rozmělněné ve fyziologickém solném roztoku. Plasma se zmrazí nejpozději do 18 hodin.
Plasma se nechá roztát při teplotě + 2 *C až + 4 *Č.
Plasma od většího počtu dárců se smísí. Kryovysrážení (kryoprecipitát) se získá známým způsobem odstředěním.
Suspenduje se 1 kg kryoprecipitátu získaného z přibližně 100 1 plasmy ve 3 kg Směsi voda/ethanol (10 g ethanolu na 1 litr vody) obsahující 900 mezinárodních jednotek heparínu.
Hodnota pH suspense se nastaví za míchání 0,lM kyselinou octovou na 7,0. Směs se zahřeje na teplotu místnosti a míchá se 30 minut. Do takto získaného roztoku se přidá 108 g suspense 2% hydroxidu hlinitého na kilogram nasazeného kryo a míchá se 15 minut při teplotě místnosti. Přísadou 0,lM kyseliny octové se hodnota pH nastaví na 6,55 a téplota se sníží na 15 *C. Sraženina se odstředí a vyhodí.
K virové inaktivaci se zbytek zpracuje směsí tri-(n-butylfošfátu (TNBP) (hmotnostně 0,3%) a TweenuR80 (hmotnostně 1%). Na 1 kilogram roztoku FVIII se spotřebuje 10,52 g TweenuR a 3,16 ml TNBP. TweenR80 se rozředí 4 ml destilované vody. Hodnota pH se nastaví 1M roztokem hydroxidu sodného na 7,1 á roztok se předehřeje ňa teplotu 25 *C. Směs TNBP a Tween.uR80 se přidá za míchání v průběhu 15 minut. Roztok FVIII smíseňý se systémem TNBP/TweenR80 se míchá 13 hodin při teplotě přibližně 25 ’C. Roztok FVIII se pak podrobí chromatografií na iontoměni.ěovém gelu. Sloupec se vyváží před vnesením proteinového roztoku pufrera o hodnotě pH 6,95 sestávajícím z NaCI (0,12M), citrátu^sodného (0,01 M), glycinu (0,12 M) a chlori-du vápenatého (0,001M). Extinkce sloupcového eluátu se měří při 28.0 nm. Sterilizovaný roztok FVIII se nanese na vyvážený gel a dodatečně se promyje vyvažovacím pufrem až do dosažení UV-signálu základní čáry. K odstranění doprovodných proteinů se sloupec promyje pufrem zvýšené iontové síly sestávajícím z chloridu sodného (0,16M), z citrátu sodného (0,01 Μ), z glycinu (0,12M) a z chloridu vápenatého (0,001M) při hodnotě pH 6,95.
Eluování FVIII se provede následujícím elučním pufrěm: O,25M chloridu sodného, 0,01M citrátu sodného, 0,12M glycinu, 0,001M chloridu vápenatého při hodnotě pH 6,95. Chromatografický eluát obsahující FVIII se zkončentruje ultrafiltrací na přibližně polovinu objemu nasazeného eluátu a zředí se pufrem, sestávajícím z 0,0lM citrátu sodného, z 0,12M glycinu, z 0,001M chloridu vápenatého až na aktivitu FVIII roztoku přibližně 110 mezinárodních jednotek FVIII na mililitr. Roztok FVIII se sterilizuje a plní se do skleněných lahviček na 10 ml konečného obsahu (20 ml-skleněně lahvičky). Skleněné lahvičky, naplněné roztokem FVIII se ponoří do tekutého dusíku o teplotě -195 *C a nato se vysuší vymrazováním na zbytkovou vlhkost produktu FVIII 0,5X.
Lahvičky s vymrazením vysušeným produktem se umístí do autoklávu a 30 minut se udržují na teplotě .100.*C. Teplota se měří přístrojem Datatrace Micropack firmy Hero Instruments
Electronic Vertriebs GmbH, Německo. Hned pov.yjmutí lahviček z autoklávu se lahvičky přenesou do chladničky ( s teplotou přibližně + 4 ’C) k ochlazení. Aktivita FVIII zahřátého vzorku obnáší 95 X nezahřátého vzorku.
Příklad 2
Stejným způsobem jako podle příkladu 1 se vyrobí.a rozpustí 1 kg kryopřecipitátu. Zpracování kryoprecipitátu až do ultrafiltrace se provede stejně jako v příkladu 1. Ke zředění ? FVlII-zkoncentrovaného eluátového sloupcového chromatografického roztoku se použije pufru sestávajícího z 0,01M citrátu sodného, z 0,12M glycinu, z 0,01M chloridu vápenatého až do aktivity FVIII 50 mezinárodních jednotek FVIII na ml. Roztok FVIII se sterilizuje a plní se do skleněných lahviček po 10 ml konečného obsahu (20 ml-sklenené lahvičky). Zmrazení těchto lahviček i vysušení vymrazováním a tepelné zpracování se provádějí stejně jako podle příkladu 1.
Průmyslová využitelnost ... ,
Neimunogenní FVIII obsahující produkt pro výrobu léčiv

Claims (9)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob výroby produktů obsahujících neimunogenní faktor VIII,vyznačují se tím, že (a) se podrobuje roztok obsahující faktor VIII zpracování systémem tri(n-butyl)fosfát/detergent, (b) tepelně se zpracovává vymrazením vysušený produkt obsahujícího FVIII při teplotě 100 ’C po dobu 15 až 120 minut, s výhodou 30 minut, přičemž vymrazením vysušený produkt, obsahující FVIII, vykazuje po tepelném zpracování zbytkovou vlhkost hmotnostně 0,3 až 1,8 X. .
  2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačují Se tím, že se roztok, obsahující faktor VIII, před sušením vymrazováním šokově ochladí na teplotu pod -190 *G.
  3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačují se t í in, že se jako detergentu používá polyoxyethylenového derivátu sorbitanového esteru.
  4. 4. Způsob podle nároku 1 až 3, vyznačují se t í m, že se před stupněm (a) odstraňují fibrinogen a popřípadě další faktory srážlivosti komplexu PPSB vysrážením ethanolem a/nebo adsorpcí na hydroxidu hlinitém z roztoku obsahujícího FVIII.
  5. 5. Způsob podle nároku 1 až 4, vyznačují se t í m, žě se po stupni (a) odstraňují tri(n-butyl)fosfát a detergent ionexovou chromatografii z roztoku obsahujícího FVIII.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í se tím, že se roztok, obsahující FVIII jakožto eluát ionexové chromatografie diafiltruje a/nebo ultrafi 1truje.
  7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačují se tím, že se roztok, obsahující FVIII, po diafiítraci a/nebo ultra19 filtraci sterilizuje.
  8. 8. Způsob podle nároku 1 až 7, v y' z n a č u j í se tím, že se tepelné zpracování provádí v autoklávu.
  9. 9. Neimunogenní FVIII obsahující produkt připravitelný způsobem podle nároku 1 až 8.
CZ971774A 1996-06-11 1997-06-09 Process for preparing products containing non-immunogenic factor viii CZ177497A3 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19623293A DE19623293C2 (de) 1996-06-11 1996-06-11 Nicht-immunogene Faktor VIII-enthaltende Zusammensetzung und ein Verfahren zu ihrer Herstellung

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ177497A3 true CZ177497A3 (en) 1997-12-17

Family

ID=7796648

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ971774A CZ177497A3 (en) 1996-06-11 1997-06-09 Process for preparing products containing non-immunogenic factor viii

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP0812858B1 (cs)
AT (1) ATE340806T1 (cs)
CZ (1) CZ177497A3 (cs)
DE (2) DE19623293C2 (cs)
ES (1) ES2268718T3 (cs)
HU (1) HUP9700987A3 (cs)
PL (1) PL187886B1 (cs)
PT (1) PT812858E (cs)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2787465A1 (fr) 1998-12-21 2000-06-23 Transgene Sa Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes
ES2167180B1 (es) * 1999-10-27 2003-08-16 Lucea Jose Antonio Aznar Preparacion de concentrados terapeuticos de factor viii antigenico y aplicacion correspondiente.
EP4387993A1 (en) 2021-08-18 2024-06-26 Biotest AG Dry heat treatment of plasma-derived factor viii

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4456590B2 (en) * 1981-11-02 1989-05-30 Heat treatment of lyphilized blood clotting factor viii concentrate
EP0212040B1 (de) * 1985-08-05 1990-05-23 IMMUNO Aktiengesellschaft für chemisch-medizinische Produkte Verfahren zur Herstellung von Präparationen auf Basis von Blutgerinnungsfaktoren
ES2057191T5 (es) * 1989-01-13 2003-05-01 Mitsubishi Pharma Corp Metodo de produccion para una composicion que contiene proteinas.
AT399818B (de) * 1992-04-24 1995-07-25 Immuno Ag Verfahren zur herstellung einer hochgereinigten virussicheren faktor viii-präparation
CN1064552C (zh) * 1993-02-09 2001-04-18 奥克塔法马有限公司 失活无脂质被膜病毒的方法

Also Published As

Publication number Publication date
PL320450A1 (en) 1997-12-22
DE19623293C2 (de) 1998-10-22
HU9700987D0 (en) 1997-07-28
HUP9700987A2 (hu) 1998-03-02
ES2268718T3 (es) 2007-03-16
HUP9700987A3 (en) 1998-06-29
DE59712735D1 (de) 2006-11-09
ATE340806T1 (de) 2006-10-15
PL187886B1 (pl) 2004-10-29
EP0812858A1 (de) 1997-12-17
DE19623293A1 (de) 1997-12-18
PT812858E (pt) 2006-12-29
EP0812858B1 (de) 2006-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0378208B1 (en) Production method for protein-containing composition
CA2201714C (en) Method for isolation of highly pure von willebrand factor
US5099003A (en) Method of preparing a sterile plasma-protein solution containing fibrinogen and factor xiii
JP5662988B2 (ja) 可溶化血漿フラクションから蛋白質フィブリノーゲン、第ｘｉｉｉ因子および生物学的グルーを分離し、そして該蛋白質の凍結乾燥濃縮物を調製するための方法
ES2586698T3 (es) Proceso para la producción de fibrinógeno
CZ283633B6 (cs) Způsob průmyslové přípravy standardizovaného koncentrátu lidského von Willebrandova faktoru o velmi vysoké čistotě, vhodného pro terapeutické použití
EP0144709B1 (en) Heat treatment of plasma fractions
WO1992013495A1 (en) Fibrinogen based adhesive
AU2019208251B2 (en) Plasma-supplemented formulation
PL210616B1 (pl) Sposób rozdzielania i oczyszczania fibrynogenu i plazminogenu
CZ303932B6 (cs) Stabilní hemostaticky aktivní prípravek obsahující von Willebranduv faktor a zpusob jeho prípravy
JPH06505494A (ja) Ｉｘ因子の調製
CN114787185B (zh) 一种凝血因子ⅷ中间品的冻存方法
CA2252374C (en) A process for viral inactivation of lyophilized blood proteins
NO176234B (no) Fremgangsmåte for inaktivering av patogener i et biologisk eller et farmasöytisk materiale
CZ177497A3 (en) Process for preparing products containing non-immunogenic factor viii
Palmer et al. Development of a heat-treated factor VIII/von Willebrand factor concentrate prepared from heparinized plasma
CN114106145A (zh) 一种血源人凝血因子ⅷ/血管性血友病因子复合物生产工艺
RU2814332C1 (ru) Способ криоконсервации промежуточного продукта фактора viii свертывания крови
RU2445974C2 (ru) Способ получения концентрата фактора viii из плазмы крови человека
Sibinga Factor VIII in Regional Blood Banking Practice
EP4387993A1 (en) Dry heat treatment of plasma-derived factor viii
JP2681406C (cs)
HK1228805A1 (en) Plasma-supplemented formulation

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic