CZ2000105A3

CZ2000105A3 - Izolovaný polypeptid, fúzní protein, expresní vektor, kultivovaná buňka nesoucí zmíněný expresní vektor, způsob přípravy zmíněného polypeptidu, farmaceutický prostředek s obsahem zmíněného polypeptidu, protilátka, vazebný protein, izolovaný polynukleotid a oligonukleotidová sonda nebo primer

Info

Publication number: CZ2000105A3
Application number: CZ2000105A
Authority: CZ
Inventors: Paul O. Sheppard
Original assignee: Zymogenetics, Inc.
Priority date: 1998-07-17
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2000-06-14

Abstract

Molekuly polynukleotidů a polypeptidu, kódující zsig37, nový člen rodiny proteinů mající kolagenu podobnou doménu a globulámí doménu. Zmíněné polypeptidyjsou schopné dimerizace nebo oligomerizace a mohou být, stejnějako polynukleotidy, kteréje kódují, či oligonukleotidové sondy nebo priméry, odvozené od sekvence zmíněných polynukleotidů, použity projejich studium. Řešení se dále zabývá protilátkami a vazebnými proteiny, specificky vážícími zsig37, expresnímvektoremkódujícímzmíněný polypeptid, kultivovanou buňkou nesoucí zmíněný expresní vektor a exprimující vektoremkódovaný protein a farmaceutickým prostředkems obsahemzmíněného polypeptidu.

Description

Oblast techniky

Předmětem navrhovaného vynálezu jsou polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci vysoce homologickou s aminokyselinovou sekvencí proteinů specificky sekretovaných tukovými buňkami (adipocyty). Polypeptidy podle navrhovaného vynálezu jsou určeny k použití pro modulaci energetické homeostáze, pro studium tohoto fenoménu a pro prevenci a léčbu onemocnění spojených s nevyváženým energetickým metabolismem.

Dosavadní stav techniky

Energetická rovnováha (zahrnující energetický metabolismus, nutriční stav, ukládání tuků a podobně) je důležitým ukazatelem zdravotního stavu. Tato energetická homeostáze zahrnuje příjem potravy a metabolismus uhlovodíků a lipidů za účelem tvorby energie nezbytné pro funkce řízené vůlí i pro funkce na vůli nezávislé. Metabolismus proteinů může vést také k tvorbě energie, ale častěji je jeho důsledkem tvorba svalové hmoty nebo oprava poškozených svalů. Kromě jiného vede nerovnováha energetického metabolismu k nadbytečné nebo naopak nedostatečné tvorbě tukové tkáně.

Tvorba a ukládání tuku jsou ovlivněny inzulínem. Inzulín například stimuluje transport glukózy do buněk, kde je tato metabolizována na α-glycerolfosfát, který je používán při esterifikací mastných kyselin, což umožňuje jejich ukládání ve formě triglyceridů. Adipocyty (tukové buňky) navíc exprimují specifický transportní protein který zvyšuje transfer volných mastných kyselin do adipocytů. Adipocyty dále produkují do prostředí několik proteinů, které pravděpodobně ovlivňují homeostatickou kontrolu metabolismu glukózy a lipidů. Mezi tyto adipocyty sekretované proteiny patří adipsin, faktory komplementu C3 a B, tumor nekrotizující faktor α (TNF-α), produkt genu ob a Acrp30. Dále existují jisté důkazy předpokládající existenci inzulínem regulované sekreční dráhy u adipocytů. Scherer et al., J. Biol, Chem. 270 (45): 26746-9, 1995. Nadbytečná • fe • · · · fe · fe fefe · · · · · • fefe · · fefe · • fe fefe fefe fefe nebo naopak nedostatečná produkce zmíněných látek, která má částečně za následek nadbytečnou nebo naopak nedostatečnou tvorbu tukové tkáně, může vést k patologickým stavům přímo nebo nepřímo asociovaným s obezitou nebo anorexií.

Acrp30 je 247 aminokyselin dlouhý polypeptid, který je produkován výhradně adipocyty. Polypeptid Acrp30 je tvořen amino-koncovou signální sekvencí, 27 aminokyselin dlouhou vmezeřenou sekvencí, která nevykazuje homologii s žádným známým proteinem, dále 22 dokonalými Gly-Xaa-Pro nebo nedokonalými GlyXaa-Xaa repeticemi typickými pro kolagen a karboxy-koncovou globulární doménou (viz. Scherer et al., J. Biol. Chem. 270 (45): 26746-9, 1995 a mezinárodní patentová přihláška WO 96/39429). Acrp30 je lidský sérový protein, vyskytuje se v poměrně hojně a vykazuje strukturní podobnost (především v oblasti C-koncové globulární domény) s faktorem komplementu Clq a s proteinem z letního séra hibernujících živočichů Tamias sibiricus (Hib27). Exprese Acrp30 je během diferenciace adipocytu indukována více než stokrát. Předpokládáme, že Acrp30 lze použít pro ovlivňování energetické rovnováhy a pro identifikaci adipocytů v testovaných vzorcích.

Dalším sekretovaným proteinem, který je pravděpodobně produkován výhradně adipocyty, je apMl, popsaný například v Maeda et al., Biochem. Biophvs. Res. Comm. 221:286-9, 1996. 4517 pb velký klon obsahuje 244 aminokyselin dlouhý otevřený čtecí rámec a dlouhou 3' netranslatovanou oblast. Protein je tvořen signální sekvencí, amino-koncovou sekvencí nepodobnou sekvenci pro kolagen, dále 22 dokonalými Gly-Xaa-Pro nebo nedokonalými Gly-Xaa-Xaa repeticemi typickými pro kolagen a karboxy-koncovou oblastí vykazující homologii s kolagenem X, kolagenem VIII a proteinem komplementu Clq.

Faktor komplementu Clq je tvořen šesti kopiemi tří příbuzných polypeptidů (řetězce A, B a C), z nichž každý je dlouhý přibližně 225 aminokyselin a každý obsahuje amino-koncovou doménu typickou pro kolagen a karboxy-koncovou globulární doménu. Šest trojitě helikálních oblastí je tvořeno kolagenovými doménami šesti A, šesti B a šesti C řetězců. Clq je tudíž tvořen šesti globulárními hlavami spojenými s centrální vláknitou oblastí šesti kolagenu podobnými „stopkami“ (Sellar et al., Biochem. J. 274:481-90, 1991). Taková stavba proteinu je často popisována jako kytice růží. Acrp30 má podobnou strukturu kytice, ale je tvořen jen jedním typem polypeptidových řetězců.

Molekuly schopné modulovat energetickou homeostázi jsou vyhledávané především za účelem studia tohoto fenoménu a kvůli prevenci a léčbě energetické nerovnováhy. Dále jsou vyhledávané molekuly schopné modulovat sekreční dráhy • ·

χ. ι adipocytů, neboť mohou být použity pro nepřímou modulaci energetické homeostáze a dále jsou vhodným objektem dalšího výzkumu.

Navrhovaný vynález se zabývá takovými polypeptidy a jejich použitím ať již výše zmíněným způsobem, nebo i dalšími způsoby, zřejmými odborníkům na zde používané techniky.

Podstata vynálezu

Jedním z aspektů navrhovaného vynálezu je izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická s aminokyselinovou sekvencí aminokyselinových zbytků 26-281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina a kde zmíněná sekvence obsahuje karboxy-koncovou globulární část. V jednom z provedení vynálezu vykazuje polypeptid nejméně 90% identitu s aminokyselinami 26-281 SEQ ID NO:2. V dalším z provedení vynálezu vykazuje polypeptid nejméně 90% identitu s aminokyselinami 22-281 SEQ ID NO:2. V dalším z provedení vynálezu obsahuje polypeptid aminokyselinové zbytky 1-281 sekvence SEQ ID NO:2 nebo sekvence SEQ ID NO:44. V dalším z provedení vynálezu je polypeptid kovalentně vázán N-koncovou nebo C-koncovou částí k jednotce vybrané ze skupiny obsahující afinitní skupiny, toxiny, radionukleotidy, enzymy nebo fluorofory. V dalším, podobném provedení vynálezu je dále zavedeno mezi zmíněnou sekvenci aminokyselinových zbytků a zmíněnou afinitní skupinu místo pro proteolytické štěpení. V dalším z možných provedení vynálezu je navrhován izolovaný polypeptid vybraný ze skupiny obsahující: a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická s aminokyselinovou sekvencí aminokyselinových zbytků 99 až 140 SEQ ID NO:2; b) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická s aminokyselinovou sekvencí aminokyselinových zbytků 140 nebo 141 až 281 SEQ ID NO:2 a c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická s aminokyselinovou sekvencí aminokyselinových zbytků 99 až 281 SEQ ID NO:2.

V dalším z provedení je předmětem navrhovaného vynálezu fúzní protein, který je tvořen v zásadě dvěma částmi spojenými peptidovou vazbou, kdy zmíněná první část je tvořena polypeptidem, vybraným ze skupiny obsahující: a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická s aminokyselinovou sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2; b)

polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků odpovídající SEQ ID NO:2, a to počínaje aminokyselinou 1, 22 nebo 26 a konče aminokyselinou 281; c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků odpovídající SEQ ID NO:44, a to počínaje aminokyselinou 1, 22 nebo 26 a konče aminokyselinou 281; d) část polypeptidu zsig37 tak jak ukazují SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, obsahující kolagenu podobnou doménu, nebo část kolagenu podobné domény, dostatečnou aby byla schopna dimerizace nebo oligomerizace; e) část polypeptidu zsig37 tak jak ukazují SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, obsahující globulární doménu nebo aktivní místo globulární domény, nebo f) část polypeptidu zsig37 tak jak ukazují SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, obsahující kolagenu podobnou doménu a globulární doménu; a zmíněná druhá část proteinu obsahuje nějaký jiný polypeptid. V jednom z provedení navrhovaného vynálezu je první část proteinu vybrána ze skupiny obsahující ; a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, odpovídající sekvenci 99 až 140 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44; b) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, odpovídající sekvenci 140 nebo 141 až 281 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44 a c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, odpovídající sekvenci 99 až 281 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44.

V dalším z provedení je předmětem vynálezu fúzní protein obsahující sekreční signální sekvenci mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinám 1 až 21 nebo 1 až 25 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, kde je zmíněná sekreční signální sekvence operativně připojena k dalšímu polypeptidu.

V dalším z provedení vynálezu je předmětem vynálezu expresní vektor obsahující následující operativně spojené elementy: promotor transkripce, segment DNA kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2 a kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina; C-koncovou globulární část a terminátor transkripce. V dalším z provedení je obsažen DNA segment kódující polypeptid, který je nejméně z 90 % identický se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2. V dalším z provedení kóduje DNA segment polypeptid, který je nejméně z 90 % identický se sekvencí aminokyselinových zbytků 22 až 281 SEQ ID NO:2. V dalším z provedení kóduje DNA segment polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků odpovídající aminokyselinám 1 až 281 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44. V dalším z provedení kóduje DNA segment polypeptid, který má na svém N-konci nebo Ckonci kovalentně vázanou afinitní skupinu. V dalším z provedení vynálezu DNA • · β 9 · · 9 ·

999 9 9 9 9 9 9 · • · · 9 9 9 9 9 9 9 · 9 · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 segment dále kóduje sekreční signální sekvenci, operativně připojenou ke zmíněnému polypeptidu. V dalším z provedení vynálezu obsahuje sekreční signální sekvence aminokyselinové zbytky 1 až 21 nebo 1 až 25 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44.

V dalším z provedení je předmětem vynálezu kultivovaná buňka do které byl vnesen expresní vektor obsahující následující operativně spojené elementy: promotor transkripce, segment DNA kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2 a kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina; C-koncovou globulární část a terminátor transkripce, kde zmíněná buňka exprimuje zmíněný polypeptid kódovaný zmíněným DNA segmentem.

V dalším z provedení je předmětem vynálezu způsob přípravy polypeptidu zahrnující: kultivaci buněk do kterých byl vnesen expresní vektor obsahující následující operativně spojené elementy: promotor transkripce, segment DNA kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2 a kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina; C-koncovou globulární část a terminátor transkripce a kde zmíněná buňka exprimuje zmíněný polypeptid kódovaný zmíněným DNA segmentem; a izolaci zmíněného exprimovaného polypeptidu.

V dalším z provedení vynálezu je předmětem vynálezu farmaceutický prostředek obsahující polypeptid, kde zmíněný polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2 a kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina, C-koncovou globulární část a terminátor transkripce, v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Předmětem vynálezu je dále protilátka, která specificky rozpoznává epitop polypeptidu, kde zmíněný polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2 a kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo GlyXaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina; a C-koncovou globulární část.

Předmětem vynálezu je dále vazebný protein, který specificky váže epitop polypeptidu, kde zmíněný polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2 a kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo GlyXaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina; a C-koncovou globulární část.

Předmětem vynálezu je dále izolovaný polynukleotid kódující polypeptid, kde zmíněný polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2 a kde zmíněná sekvence obsahuje Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina, Ckoncovou globulární část. V jednom z provedení vynálezu je sekvence zmíněného polypeptidu nejméně z 90 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2. V dalším z provedení vynálezu je sekvence zmíněného polypeptidu nejméně z 90 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 22 až 281 SEQ ID NO;2. V dalším z provedení obsahuje polypeptid aminokyselinové zbytky 1 až 281 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44. V dalším z provedení vynálezu je zmíněný polynukleotid DNA.

Dále je předmětem vynálezu izolovaný polynukleotid vybraný ze skupiny obsahující a) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 465 a konče nukleotidem 688 SEQ ID NO:1, b) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 688 a konče nukleotidem 1016 SEQ ID NO.l, c) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 691 a konče nukleotidem 1016 SEQ ID NO.l, d) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 465 a konče nukleotidem 1016 SEQ ID NO:1, e) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 364 a konče nukleotidem 490 SEQ ID NO:43, f) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 490 a konče nukleotidem 912 SEQ ID NO;43, g) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 364 a konče nukleotidem 912 SEQ ID NO;43, h) sekvenci nukleotidů počínaje nukleotidem 364 a konče nukleotidem 490 SEQ ID NO:43, i) polynukleotid kódující polypeptid, kde sekvence aminokyselinových zbytků zmíněného polypeptidu je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 99, 140 nebo 141 až 281 SEQ ID NO:2, j) polynukleotid kódující polypeptid, kde sekvence aminokyselinových zbytků zmíněného polypeptidu je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 99 až 140 SEQ ID NO:2, k) nukleotidové sekvence komplementární k sekvencím a), b), c), d), e), f), g), h), i) nebo j) a 1) degenerované nukleotidové sekvence a), b), c), d), e), f), g), h), i), j) nebo k).

• · • · ·

Dále je předmětem vynálezu izolovaný polynukleotid kódující fúzní protein který je tvořen v zásadě dvěma částmi spojenými peptidovou vazbou, kdy zmíněná první část je tvořena polypeptidem, vybraným ze skupiny obsahující: a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická s aminokyselinovou sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2; b) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků odpovídající SEQ ID NO:2, a to počínaje aminokyselinou 1, 22 nebo 26 a konče aminokyselinou 281; c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků odpovídající SEQ ID NO:44, a to počínaje aminokyselinou 1, 22 nebo 26 a konče aminokyselinou 281; d) část polypeptidu zsig37 tak jak ukazují SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, obsahující kolagenu podobnou doménu, nebo část kolagenu podobné domény, dostatečnou aby byla schopna dimerizace nebo oligomerizace; e) část polypeptidu zsig37 tak jak ukazují SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, obsahující globulární doménu nebo aktivní místo globulární domény, nebo f) část polypeptidu zsig37 tak jak ukazují SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, obsahující kolagenu podobnou doménu a globulární doménu; a zmíněná druhá část proteinu obsahuje nějaký jiný polypeptid.

V dalším z provedení je předmětem vynálezu izolovaný polynukleotid kódující fúzní protein obsahující sekreční signální sekvenci mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinám 1 až 21 nebo 1 až 25 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, kde je zmíněná sekreční signální sekvence operativně připojena k dalšímu polypeptidu.

V dalším z provedení je předmětem vynálezu oligonukleotidová sonda nebo primer, jež obsahuje nejméně 14 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů polynukleotidu se sekvencí SEQ ID NO:23 nebo polynukleotidu komplementárního k SEQ ID NO:23.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Mnohočetné porovnání sekvencí zsig37 polypeptidu podle navrhovaného vynálezu; HUMUPST21 (Maeda et al., Biochem. Biophvs. Res. Comm. 221(2): 286-9, 1996); C1QA HUMAN (Sellar et al., Biochem. J, 274: 48190, 1991), Reid, Biochem. J. 179: 367-71 1979 a Reid et al., Biochem. J. 203: 559-69, 1982); HP25 TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 a Kondo & Kondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992); HP27_TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 a Kondo & Kondo, J, Biol.

• · •

• ·· φ e · φ · · φ φφφ · φφφ φφ · φ φφφφ φφφφ φφφ φφ φφ φφ φφ

Chem. 267: 473-8, 1992) a CERL_RAT (Wada & Ohtani, Brain. Res. Mol. Brain Res. 9: 71-7, 1991).

Obrázek 2: Matice znázorňující procento identity aminokyselinové sekvence při mnohočetném porovnání šesti výše zmíněných sekvencí (obr. 1).

Detailní popis vynálezu:

Než přistoupíme k detailnímu popisu podstaty vynálezu, mohlo by být užitečné v zájmu porozumění definovat následující termíny.

Termínem „afinitní skupina“ zde označujeme část peptidu, která je navázána k polypeptidu za účelem purifikace nebo detekce polypeptidu, nebo která obsahuje místa umožňující navázání polypeptidu k odpovídajícímu substrátu.V zásadě může být použit jako afinitní skupina kterýkoliv peptid nebo protein, proti kterému existuje protilátka nebo jiná specifická vazebná látka. Mezi afinitní skupiny patří například sekvence několika po sobě následujících histidinových zbytků (polyhisitidin), protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods in Enzymologv 198: 3, 1991), glutathion S transferáza (Smith and Johnson, Gene 67: 31, 1988), substance P, Flag™ peptid (Hopp et al.,

Biotechnology 6: 1204-1210, 1988; dostupné od Eastman Kodak Co., New Haven, CT), streptavidin vazebný peptid, nebo další antigenní epitopy nebo vazebné domény. Pro obecný přehled viz. Ford et al., Protein Expression and Purification 2.: 95-107, 1991. DNA kódující afinitní skupiny jsou komerčně běžně dostupné (např. Pharmacia Biotech, Piscataway NJ).

Termínem „alelická varianta“ je označována kterákoliv ze dvou nebo více alternativních forem genu, zaujímající stejný lokus na chromozómu. Alelické varianty vznikají přirozeně mutací a mohou mít za následek fenotypický polymorfismus v rámci populace. Genové mutace mohou být tiché (tj. nemají za následek změnu v kódovaném polypeptidu), nebo může mutovaný gen kódovat polypeptid s odlišnou aminokyselinovou sekvencí. Termínem alelická varianta je zde také označován protein kódovaný alelickou variantou genu.

Termíny „N-koncový nebo amino-koncový“ a „C-koncový nebo karboxy-koncový“ jsou zde používány pro určení pozice v rámci polypeptidu nebo proteinu. Tam kde to souvislosti umožňují, jsou tyto termíny používány spolu s odkazem na konkrétní sekvenci nebo část polypeptidu nebo proteinu, a to za účelem bližšího popisu vzdálenosti nebo relativní pozice. Například určitá sekvence umístěná na C-konci referenční sekvence proteinu je umístěna blíže k C-konci referenční sekvence, ale není nutně umístěna na C-konci celého proteinu.

• 99 9

99

• 9 · • 9 · • 9 ·

9 9

Termínem „pár komplement/anti-komplement“ jsou označovány neidentické jednotky, které tvoří za určitých podmínek nekovalentně asociovaný stabilní pár. Prototypem takového páru komplement/anti-komplement je například pár biotin a avidin (nebo streptavidin). Dalšími příklady mohou být páry receptor/ligand, protilátka/antigen (nebo hapten či epitop), pár komplementárních polynukleotidů a podobně. Pokud je žádoucí následující disociace páru komplement/antikomplement, má tento pár s výhodou vazebnou afinitu <10⁹ M'¹.

Termín „komplementární molekula polynukleotidu“ označuje molekulu polynukleotidu, která má komplementární sekvenci dusíkatých bází a opačnou orientaci vzhledem k původní sekvenci. Například k sekvenci 5' ATGCACGGG 3' je komplementární sekvence 5' CCCGTGCAT 3'.

Termín „přilehlá sekvence“ označuje polynukleotid, který obsahuje sekvenci identickou nebo komplementární k sekvenci jiného polynukleotidu. Přilehlé sekvence se také nazývají přesahující „overlap“, tj. „přesahují“ určitou polynukleotidovou sekvenci, a to buď v celé její délce, nebo alespoň částečně. Reprezentativním příkladem takové přilehlé sekvence k sekvenci 5'ATGGCTTAGCTT-3' jsou sekvence 5'-TAGCTTgagtct-3' a 3'-gtcgacTACCGA-5'. Termín „degenerovaná nukleotidová sekvence“ označuje nukleotidovou sekvenci, která obsahuje jeden nebo i více degenerovaných kodonů (v porovnání s původní molekulou polynukleotidu, která kóduje polypeptid). Degenerované kodony jsou tvořeny odlišnými triplety nukleotidů, ale kódují stejnou aminokyselinu (například GAU i GAC triplety shodně kódují aminokyselinu Asp).

Termínem „expresní vektor“ je zde označována molekula DNA, lineární nebo cyklická, která obsahuje část DNA kódující polypeptid, který je předmětem našeho zájmu, operativně připojenou k dalším segmentům DNA jež zajišťují transkripci zmíněné kódující části DNA. Mezi takové segmenty patří například promotor nebo terminaění sekvence, jeden nebo více počátků replikace (ori), dále může být obsažen jeden nebo více selekčních markérů, zesilovací sekvence, polyadenylační signál a podobně. Expresní vektory jsou obvykle odvozeny od plazmidové nebo virové DNA, nebo mohou obsahovat části obou.

Termín „izolovaný“ ve vztahu k polynukleotidu označuje polynukleotid, který byl vyjmut ze svého přirozeného genetického prostředí a tudíž neobsahuje žádné nadbytečné nebo nechtěné kódující sekvence a je ve formě vhodné pro použití pro produkci proteinu metodami genového inženýrství. Takové izolované molekuly jsou ty, které byly odděleny ze svého přirozeného prostředí a zahrnují cDNA a genomové klony. Izolované molekuly DNA podle vynálezu byly zbaveny všech ostatních genů, se kterými jsou běžně asociovány, ale mohou obsahovat přirozeně ·

444 4 • 4 4 4 ·

444 444 4· 44 se vyskytující 5' a 3' netranslatované oblasti, jakými jsou například promotory nebo terminátory. Identifikace takových asociovaných oblastí je odborníkům zřejmá (viz. například Dynan and Tijan, Nátuře 316: 774-78, 1985).

Termínem „izolovaný polypeptid“ nebo „izolovaný protein“ zde označujeme polypeptid nebo protein, který se nachází v podmínkách odlišných od svého přirozeného prostředí, tj. například izolovaný od krve nebo živočišné tkáně. Je s výhodou, pokud izolovaný polypeptid neobsahuje žádné další polypeptidy, zvláště pak další polypeptidy živočišného původu. S výhodou jsou polypeptidy ve vysoce purifikované formě, tj. v čistotě více než 95%, ještě raději pak více než 99%. Při použití v tomto kontextu nevylučuje termín „izolovaný“ přítomnost shodného polypeptidu v alternativní fyzikální formě, například ve formě dimeru nebo alternativně glykosylovaného nebo jinak derivatizovaného proteinu.

Termín „operativně spojený“ při popisu segmentů DNA označuje segmenty, které jsou uspořádány tak, že fungují ve vzájemné shodě a ve správném pořadí tak, aby zajistily požadovaný výsledek, např. transkripce začíná na promotoru, pokračuje přes kódující segment a je ukončena terminátorem.

Termínem „ortholog“ je označován polypeptid nebo protein získaný z jednoho druhu, který je funkční částí polypeptidu nebo proteinu z jiného druhu. Odlišnosti v sekvencích mezi orthology jsou výsledkem druhového rozrůznění.

„Paralogy“ jsou odlišné ale strukturně příbuzné proteiny pocházející z jednoho organismu. Předpokládá se, že se paralogy vyvinuly cestou duplikace genů. Vzájemnými paralogy jsou například a-globin, β-globin a myoglobin.

Termín „polynukleotid“ označuje jednořetězcový nebo dvouřetězcový polymer deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů čtený od 5'- ke 3'- konci. Mezi polynukleotidy patří RNA a DNA, které mohou být izolovány z přirozených zdrojů, mohou být syntetizovány in vitro, nebo mohou být připraveny kombinací přirozených a syntetických molekul. Velikost polynukleotidu se vyjadřuje v počtu párů baží (zkracováno pb), počtu nukleotidů (zkratka nt) nebo kilobazích (kb). Kde to souvislosti dovolí, mohou poslední dva údaje popisovat jak jednořetězcovou, tak i dvojřetězcovou molekulu. Je-li takto popisována dvojřetězcová molekula, je termín použit k vyjádření celkové délky molekuly a rozumí se, že je ekvivalentní termínu „počet párů baží“. Odborníkům je zřejmé, že se mohou oba řetězce dvojřetězcového polynukleotidu co do délky navzájem nepatrně lišit a že na koncích může jeden z řetězců přesahovat, což bývá výsledkem enzymatického štěpení. Všechny nukleotidy dvojřetězcového polynukleotidu tudíž nemusí tvořit páry. Takové přesahující konce většinou nejsou delší než 20 nt.

«·· fe • fe fefefe·

Termínem „polypeptid“ je označován polymer aminokyselinových zbytků, spojených navzájem peptidovou vazbou. Polypeptid může být přirozeného původu, nebo může být připraven synteticky. Polypeptidy obsahující méně než 10 aminokyselinových zbytků jsou obvykle nazývány „peptidy“.

Termínem „sonda a/nebo primer“ může být označována RNA a nebo DNA. DNA může být buď cDNA nebo genomová DNA. Polynukleotidové sondy nebo primery jsou jednořetězcové nebo dvojřetězcové molekuly DNA nebo RNA, obvykle se jedná o syntetické oligonukleotidy, ale mohou být připraveny i z cDNA klonů nebo genomových sekvencí či sekvencí k nim komplementárních. Analytické sondy jsou obvykle dlouhé nejméně 20 nukleotidů, ačkoliv někdy mohou být použity i kratší sondy (14-17 nukleotidů). PCR primery jsou dlouhé nejméně 5 nukleotidů, raději pak 15 nt a více, nejraději pak 20 až 30 nukleotidů. Krátké polynukleotidy mohou být použity v případě, kdy chceme analyzovat jen malou část genomu. V případě analýzy velkých genových celků mohou polynukleotidové sondy obsahovat celý exon nebo ještě větší část genomu. Sondy mohou být značeny tak aby mohly být snadno detekovatelné, například enzymem, biotinem nebo radionuklidem, fluoroforem, chemiluminiscenční látkou, paramagnetickými částicemi a podobně. Všechny zmíněné látky jsou komerčně dostupné a to z mnoha různých zdrojů, například Molecular Probes, lne.; Eugene, OR, Ammersham Corp., Arlington Heights, IL. Značení je prováděno v oboru běžně známými metodami.

Termínem „promotor“ je označována část genu obsahující DNA sekvenci, která umožňuje vazbu RNA polymerázy a iniciaci transkripce. Promotorové sekvence se nachází nejčastěji (ale ne vždy) na 5'- nekódujícím konci genu.

Termínem „receptor“ označujeme protein asociovaný s buňkou, který se váže s bioaktívní molekulou (tzv. ligandem) a zprostředkuje účinek ligandu na buňku. Membránově vázané receptory jsou charakterizovány multi-doménovou strukturou, která zahrnuje extracelulární ligand-vazebnou doménu a intracelulární efektorovou doménu, která je typicky součástí dráhy přenosu signálu. Vazbou ligandu k receptoru dochází ke konformaění změně receptoru, která má za následek interakci mezi efektorovou doménou receptoru a další molekulou (nebo molekulami) buňky. Tato interakce potom vede ve svém důsledku ke změně metabolismu buňky. Mezi metabolické pochody, které jsou spojeny s interakcí receptor-ligand, patří transkripce genu, fosforylace, defosforylace, zvýšení produkce cyklického AMP, mobilizace buněčných zásob vápenatých iontů, mobilizace membránových lipidů, buněčná adheze, hydrolýza lipidů na bázi inozitolu, hydrolýza fosfolipidů. Většina jaderných receptorů také vykazuje multi• · • 999

9» ·»·· < 9 · 9 9 9 9 9 • 99 99 9 9999 _w 999 9 999 99 9 • 9 9999 9999 • 99 999 ·· *· ·· * * doménovou strukturu zahrnující amino-koncovou transaktivační doménu, DNAvazebnou doménu a ligand-vazebnou doménu. Obecně dělíme receptory na membránově vázané, cytosolické a jaderné, monomerní (například receptor pro TSH, tj. hormon stimulující štítnou žlázu, nebo beta-adrenergní receptor) a multimerní (například PDGF receptor, receptor pro růstový hormon, IL-3 receptor, GM-CSF receptor, G-CSF receptor, receptor pro erythropoetin a IL-6 receptor). Termínem „sekreční signální sekvence“ zde označujeme DNA sekvenci kódující polypeptid (tzv. sekreční peptid), který je součástí většího polypeptidu a který směruje tento větší polypeptid odpovídající sekreční cestou ven z buňky ve které byl syntetizován. Zmíněný větší polypeptid je obvykle v některém místě sekreční dráhy štěpen a sekreční peptid je takto odstraněn.

Termínem „rozpustný receptor“ je zde označován polypeptid s funkcí receptorů, který není vázán na buněčnou membránu. Rozpustnými receptory jsou nejěastěji receptory vážící ligand, které postrádají transmembránovou a cytoplazmatickou doménu. Rozpustné receptory mohou navíc obsahovat například afinitní sekvenci, která usnadňuje purifikaci receptorů, nebo aminokyselinovou sekvenci umožňující přichycení polypeptidu k substrátu, nebo konstantní doménu imunoglobulinu. Mnoho povrchových buněčných receptorů má své přirozeně se vyskytující rozpustné protějšky, které vznikají proteolytickým štěpením nebo translací z alternativně sestříhané mRNA. O receptorů říkáme že postrádá transmembránové a intracelulární segmenty, pokud postrádá dostatečně velkou část těchto segmentů, tak aby již nebylo možné ukotvení receptorů v membráně nebo přenos signálu do buňky.

Termínem „varianta sestřihu“ označujeme alternativní formy RNA transkribované z jednoho genu. Varianty sestřihu vznikají přirozeně alternativním sestřihem míst uvnitř transkribované RNA molekuly a nebo méně často mezi odděleně transkribovanými molekulami RNA a výsledkem může být několik transkribovaných mRNA pocházejících z jednoho genu. Varianty sestřihu mohou kódovat polypeptidy s odlišnou aminokyselinovou sekvencí. Termín „varianta sestřihu“ je zde také používán pro označení proteinu kódovaného variantou sestřihu mRNA transkribovanou z genu.

Údaje o molekulové hmotnosti a délce polymerů, získané nepřesnými analytickými metodami (např. gelovou elektroforézou) jsou zde uváděny jen jako přibližné hodnoty. Pokud je taková hodnota vyjádřena jako „asi“ X nebo „přibližně“ X, jedná se o hodnotu určenou s přesností ±10 %, tj. X ±10 %.

Všechny publikace, které jsou zde citovány, jsou zde v celém svém rozsahu zahrnuty pouze jako literární odkaz.

·♦ ··· · • 0 «· • · · ·*·** «·* · · * · · · · « · * · · · · 9 # • » 9 « · ···· »·· ··« »0 0· ♦* >·

Navrhovaný vynález je zčásti založen na objevu nové DNA sekvence, kódující polypeptid, který vykazuje homologii s proteinem Acrp30 (tj, adipocyte complement related protein) (viz. například Scherer et al., J, Biol, Chem. 270 (45): 26746-9, 1995. Sekvence polypeptidu Acrp30 je zde uvedena pod číslem SEQ ID NO:3. Acrp30 je pravděpodobně vysoce příbuzný s lidským proteinem apMl (HUMPST21 na obrázcích 1 a 2). Nejmarkantnější odlišnosti byly pozorovány v oblasti sekreční sekvence.

Nová DNA sekvence kóduje polypeptid, který se skládá z amino-koncové signální sekvence, z přilehlé N-koncové oblasti jež nevykazuje žádnou homologii, z pozměněné kolagenové domény tvořené repeticemi Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-XaaPro a z karboxy-koncové globulární domény. Nová polynukleotidová sekvence také obsahuje dlouhou 3' nepřekládanou oblast. Obecná struktura polypeptidu popsaná výše je společná i Acrp30 i HUMUPST21; výjimku tvoří kolagenu podobná doména, která je u obou zmíněných proteinů delší než odpovídající oblast zsig37 polypeptidů. Také HUMPST21 sekvence je charakterizována dlouhou 3' nepřekládanou oblastí. Dále Acrp30 i všechny ostatní sekvence, porovnávané na obrázku 1 (s výjimkou CERL-RAT), sdílí konzervovaný cysteinový zbytek v pozici 187 sekvence polypeptidu zsig37 (viz. obr. 1 a SEQ ID NO:2). Další oblasti homologie, které se nacházejí v karboxy-koncových globulárních oblastech porovnávaných proteinů, jsou zde popsány jako vhodné primery pro vyhledávání dalších členů této rodiny proteinů. Acrp30 by byl například při hledání pomocí zmíněných primerů identifikován jako protein patřící do zmíněné rodiny. Polypeptidy zsig37 podle navrhovaného vynálezu také pravděpodobně obsahují místo pro N-glykosylaci (aminokyselina Asn93 SEQ ID NO:2).

Analýza tkáňové distribuce mRNA odpovídající této nové DNA s pomocí 30 nt sondy SEQ ID NO:4 prokázala, že exprese byla vyšší v srdci a placentě. Méně intenzivní signály byly pozorovány v ledvinné tkáni, vaječníku, nadledvinkách a v kosterním svalstvu a slabý signál poskytovala při Northern blot analýze většina ostatních tkání. Protein byl nazván polypeptid zsig37.

Nové zsig37 polypeptidy byly nejprve identifikovány dotazem na EST databázi. Porovnávány byly sekreční signální sekvence charakterizované startovací aminokyselinou methioninem proti směru transkripce, dále hydrofobní oblastí asi 13 aminokyselin dlouhou a specifickým místem pro proteolytické štěpení; tím byl výběr zúžen na sekretované proteiny. Polypeptidy odpovídající EST a splňující zmíněná kritéria byly dále porovnávány se známými sekvencemi za účelem identifikace sekretovaných proteinů vykazujících homologii se známými ligandy. Byla objevena jediná EST sekvence a bylo předpovězeno, že se jedná o • · · · · · · · • · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · · ·· ·· · · sekretovaný protein. Nový polypeptid, kódovaný plnou délkou cDNA umožňuje prokázání homologického vztahu s proteinem Acrp30 z adipocytů (SEQ ID NO:3) a s proteinem apMl, který je taktéž produkován adipocyty (HUMPST2_1 na obr. 1 a 2). O něco vzdálenější homologie byla prokázána v případě A řetězce proteinu komplementu C1Q, dvou faktorů pozorovaných u aktivujících hybernujících živočichů Eutamias sibiricus (HP25 TAMAS a HP27 TAMAS) a u krysího mozkového proteinu (CERL_RAT), viz. obr. 1 a 2.

Úplná sekvence polypeptidu zsig37 byla získána z jediného klonu, o kterém jsme předpokládali, že ho obsahuje, kde zmíněný klon byl získán z knihovny mozkových nádorových tkání. Mezi další knihovny, ve kterých by bylo možné takové klony hledat, patří například knihovny tkání srdečních, z placenty, vaječníků, nadledvinek, ledvin, kosterního svalstva, tukové tkáně a podobně. Nukleotidovou sekvenci N-konce EST znázorňuje SEQ ID NO:1 a z ní odvozenou aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2. Jak již bylo výše obecně popsáno, polypeptid zsig37 obsahuje signální sekvenci, která zahrnuje aminokyseliny 1 (Met) až 21 (Gly). Alternativní signální sekvence zahrnuje aminokyseliny 1 (Met) až 25 (Ser). Maturovaný polypeptid tudíž počíná aminokyselinou 22 (Leu) nebo 26 (Arg) a končí aminokyselinou 281 (Pro). N-konec maturovaného polypeptidu (aminokyseliny 22 (Leu) až 98 (Lys)) nevykazuje homologii s žádným známým proteinem. Mezi aminokyselinami 99 (Gly) a 140 (Arg) se nachází zkrácená kolagenová doména, která obsahuje jednu dokonalou Gly-Xaa-Pro a 13 nedokonalých Gly-Xaa-Xaa repetic. V porovnání s touto doménou Acrp30 obsahuje 22 dokonalých nebo nedokonalých repetic. Polypeptid zsig37 dále obsahuje karboxy-koncovou globulární doménu, která zahrnuje aminokyseliny 141 (Cys) až 281 (Pro). Zdá se, že polypeptidy zsig37, Acrp30 a HUMUPST2_1 jsou homologní v oblasti kolagenové domény a globulární domény, ale nikoliv v Nkoncové části maturovaného polypeptidu.

Předmětem navrhovaného vynálezu jsou také fragmenty polypeptidu zsig37. Mezi preferované fragmenty patří kolagenu podobná doména polypeptidu zsig37, která zahrnuje aminokyseliny 99 (Gly) až 140 (Arg) SEQ ID NO:2, část zsig37 polypeptidu obsahující kolagenu podobnou doménu nebo část kolagenu podobné domény, schopnou dimerizace nebo oligomerizace. Tyto fragmenty jsou zvlášť vhodné při studiu dimerizace nebo oligomerizace kolagenu nebo při přípravě fúzních proteinů, která bude podrobněji popsána dále v textu. Polynukleotidy kódující takové fragmenty jsou také předmětem navrhovaného vynálezu včetně skupiny zahrnující a) polynukleotidové molekuly obsahující sekvenci nukleotidů znázorněnou jako SEQ ID NO.l, a to počínaje nukleotidem 1, 171, 234, 246 nebo • · · ·

465 a konče nukleotidem 589; b) polynukleotidové molekuly kódující fragment polypeptidu zsig37, jehož aminokyselinová sekvence je nejméně z 80 % identická s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2 počínaje aminokyselinou 99 (Gly) a konče aminokyselinou 140 (Arg); c) molekuly komplementární k molekulám a) a b) a d) degenerované nukleotidové sekvence kódující fragment kolagenu podobné domény polypeptidu zsig37.

Mezi další preferované fragmenty patří globulární doména polypeptidů zsig37, odpovídající aminokyselinám 140 (Arg) nebo 141 (Cys) až 281 (Pro) SEQ ID NO:2, tj. úsek polypeptidu zsig37 obsahující globulární doménu nebo její aktivní část. Tyto fragmenty jsou zvláště vhodné pro studium nebo modulaci energetické rovnováhy nebo přenosu nervového vzruchu (neurotransmise), a to především v závislosti na dietě nebo stresu. Takové fragmenty mohou být také nositeli antimikrobiální aktivity. Polynukleotidy kódující takové fragmenty jsou ovšem také předmětem navrhovaného vynálezu, včetně skupiny zahrnující a) polynukleotidové molekuly obsahující sekvenci nukleotidů znázorněnou jako SEQ ID NO:1, a to počínaje nukleotidem 587 nebo 590 a konče nukleotidem 1016; b) polynukleotidové molekuly kódující fragment polypeptidu zsig37, jehož aminokyselinová sekvence je nejméně z 80 % identická s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2 počínaje aminokyselinou 141 (Cys) a konče aminokyselinou 281 (Pro); c) molekuly komplementární k molekulám a) a b) a d) degenerované nukleotidové sekvence kódující fragment polypeptidu zsig37 zahrnující jeho globulární doménu nebo její část.

Jiný fragment polypeptidu zsig37 podle vynálezu zahrnuje jak kolagenu podobnou doménu, tak i globulární doménu, tj. aminokyseliny 99 (Gly) až 281 (Pro) SEQ ID NO:2. Předmětem vynálezu jsou také polynukleotidy kódující zmíněné fragmenty, včetně skupiny zahrnující a) polynukleotidové molekuly obsahující sekvenci nukleotidů znázorněnou jako SEQ ID NO:1, a to počínaje nukleotidem 465 a konče nukleotidem 1016; b) polynukleotidové molekuly kódující fragment polypeptidu zsig37, jehož aminokyselinová sekvence je nejméně z 80 % identická s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2 počínaje aminokyselinou 99 (Gly) a konče aminokyselinou 281 (Pro); c) molekuly komplementární k molekulám a) a b) a d) degenerované nukleotidové sekvence kódující fragment polypeptidu zsig37 zahrnující jeho kolagenu podobnou doménu a globulární doménu.

Předmětem vynálezu jsou dále degenerované sondy odvozené od sekvencí polynukleotidů, popsaných výše. Předmětem vynálezu jsou také sondy odvozené od komplementů výše zmíněných polynukleotidů.

• · • · · · • · · · · · · • · · · · · · ··· · ··· · · · • ···· · · · · ·· ·· ·· ··

Předmětem vynálezu jsou také polynukleotidové molekuly (molekuly DNA a RNA), které kódují výše popsané polypeptidy zsig37. Odborníkům je jistě zřejmé, že vzhledem k tomu, že genetický kód je degenerovaný, může mezi sekvencemi zmíněných polynukleotidů existovat značná variabilita. SEQ ID NO:23 je degenerovaná DNA sekvence, která zahrnuje všechny DNA kódující zsig37 polypeptid podle SEQ ID NO;2. Odborníkům je jistě zřejmé, že SEQ ID NO;23 také určuje všechny možné RNA sekvence kódující SEQ ID NO:2, a to substitucí U (uracilu) za T (thymin). Tudíž jsou i polynukleotidy kódující polypeptidy zsig37 a obsahující nukleotidy 1 až 842 SEQ ID NO:23, stejně jako jejich RNA ekvivalenty, předmětem navrhovaného vynálezu. V tabulce 1 jsou uvedeny jednopísmenné kódy použité v SEQ ID NO:23 pro označení degenerovaných nukleotidů. Sloupec „rozlišení“ shrnuje nukleotidy, popsané odpovídajícím jednopísmenným kódem. Ve sloupci „komplement“ jsou uvedeny jednopísmenné kódy komplementárních nukleotidů (skupin nukleotidů). Například kód „Y“ označuje buď cytozin (C) nebo thymin (T) a k němu komplementární „R“ označuje adenin (A) nebo guanin (G), neboť A je komplementární k T a G je komplementární k C.

TABULKA 1

NUKLEOTID	ROZLIŠENÍ	KOMPLEMENT	ROZLIŠENÍ
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
S	C/G	S	C/G
w	A/T	W	A/T
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/T

44 • 4 4 4 • · · · • 4 4 ·

Degenerované kodony použité v SEQ ID NO:23, zahrnující všechny možné kodony pro danou aminokyselinu, jsou shrnuty v tabulce 2.

TABULKA 2
AMINO- KYSELINA	JEDNOPÍSMENNÝ KÓD	KODONY	DEGENEROVANÝ KODON
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	s	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gin	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter	-	TAA TAG TGA	TRR
Asn/Asp	B		RAY
Glu/Gln	Z		SAR
kterákoliv	X		NNN

aminokyselina • ·· · • ··

Odborník samozřejmě zaznamená jistou nejednoznačnost degenerovaných kodonů, které reprezentují všechny možné kodony kódující jednu aminokyselinu. Například degenerovaný kodon pro serin (WSN) může v některých případech kódovat aminokyselinu arginin (AGR) a degenerovaný kodon pro arginin (MGN) může v některých případech kódovat serin (AGY). Podobný vztah existuje mezi degenerovanými kodony pro leucin a fenylalanin. Některé polynukleotidy představované degenerovanou sekvencí tedy mohou kódovat variabilní aminokyselinové sekvence, ovšem odborník takovou sekvenční variantu snadno identifikuje porovnáním s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2. Funkčnost takových sekvenčních variant může být snadno testována tak jak je to popsáno zde.

Odborníkům je také zřejmé, že různé druhy mohou vykazovat různé preference při využívání jednotlivých kodonů („preferential codone usage“). Obecně se tímto jevem zabývají například Grantham et al., Nuc. Acid Res. 8/. 1893-1912, 1980; Hass et al., Curr. Biol, 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson et al, Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean and Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc, Acid Res. 14: 3075-87, 1986; nebo Ikemura, J. Mol. Biol, 158: 573-97, 1982. Termíny „preferenční využívání kodonů“ nebo „preferované kodony“ jsou odborné termíny popisující kodony, které jsou v buňkách daného druhu pro určitou aminokyselinu používány významně častěji než ostatní možné kodony pro tuto aminokyselinu (viz. tabulka 2). Například aminokyselina threonin (Thr) může být kódována kodony ACA, ACC, ACG nebo ACT, ovšem v savčích buňkách je nejčastěji využíván kodon ACC. Buňky jiných živých organismů, například hmyzu, kvasinek, virů nebo bakterií mohou preferovat jiné Thr kodony. Preferované kodony pro buňky konkrétních druhů mohou být do polynukleotidů podle vynálezu vneseny celou řadou obecně známých metod. Vnesení sekvence preferovaného kodonů do rekombinantní DNA může například zvýšit produkci proteinu, neboť učiní translaci proteinu v buňkách daného druhu efektivnější. Sekvence degenerovaných kodonů, znázorněná jako SEQ ID NO:23 slouží jako templát pro optimalizaci exprese polynukleotidů v různých typech buněk nejrůznějších organizmů, které se pro dané účely v oboru běžně používají a které jsou zde popsány. Sekvence obsahující preferované kodony může být dále testována a dále optimalizována pro expresi v buňkách různých druhů a dále může být testována její funkčnost tak, jak je to popsáno zde.

Fragmenty zsig37 mohou být hodnoceny s ohledem na jejich anti-mikrobiální vlastnosti, a to v oboru známými metodami, viz. například Barsum et al., Eur. Respir, J, 8(5): 709-14, 1995; Sandovsky-Losica et al., J, Med. Vet. Mvcol.

• φ φ · φφφ φ φφφ φφ φ • φφφφ φφφφ «φ φφ φφ φφ (England) 28(4): 279-287, 1990; Mehentee et al., J, Gen. Microbiot. (England) 135 (Pt 8): 2181-8, 1989; Segal and Savage, Journal of Medical and Veterinarv Mycologv 24: 477-479, 1986 a podobně. V případě potřeby je možné účinnost fragmentu zsig37 v daných podmínkách porovnat s účinnosti proteinů o kterých je známo,, že jsou v těchto podmínkách funkční, například proteiny bohaté prolinem, lysozym, histatiny, laktoperoxidáza a podobně. Dále mohou být fragmenty polypeptidu zsig37 posuzovány v kombinaci s jednou nebo více dalšími antimikrobiálními látkami, a to s ohledem na synergický účinek. Odborníkům je jistě zřejmé, že anti-mikrobiální vlastnosti zsig37 polypeptidů, fúzních proteinů, agonistů, antagonistů a protilátek mohou být hodnoceny obdobným způsobem.

Jako neurotransmitery nebo modulátory nervového přenosu mohou fragmenty zsig37 polypeptidů, stejně jako zsig37 polypeptidy, fúzní proteiny, agonisté, antagonisté nebo protilátky podle vynálezu ovlivňovat také koncentraci vápenatých iontů, svalovou kontrakci, sekreci hormonů, syntézu DNA nebo buněčný růst, přeměnu inositolfosfátu, uvolňování arachidonátů, aktivaci fosfolipázy C, vyprazdňováni žaludku, aktivaci neutrofilů u člověka nebo schopnost ADCC, produkci superoxidového iontu a podobně. Hodnocení takových vlastností je prováděno běžně známými metodami, z nichž některé jsou popsány zde.

Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na intracelulární hladinu vápníku lze stanovit běžně známými metodami, popsanými například v Dobrzanski et al, Regulátory Peptides 45: 341-52, 1993 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na svalovou kontrakci lze stanovit běžně známými metodami, popsanými například v Smits & Lebebvre, J. Auton. Pharmacol. 14: 383-92, 1994; Belloli et al, J, Vet. Pharmacol. Therap. 17: 379-83, 1984; Maggi et al., Regulátory Peptides 53: 259-74, 1994 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na sekreci hormonů lze stanovit běžně známými metodami jako jsou například metody pro stanovení uvolňování prolaktinu popsané v Henriksen et al., J. of Receptor and Signál Transduction research 15(1-4): 529-41, 1995 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na syntézu DNA nebo buněčný růst lze stanovit běžně známými metodami, popsanými například v Dobrzanski et al, Regulátory Peptides 45: 341-52, 1993 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na přeměnu inositolfosfátu lze stanovit běžně známými metodami, popsanými například v Dobrzanski et al, Regulátory Peptides 45: 341-52, 1993 a podobně.

• 9 9·9 9 • · 9 9 9 9 9

99 9 9999

999 9 999 99 9

9999 9999

99 99 9 9 99

Také vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na uvolňování arachidonátů lze stanovit běžně známými metodami, viz. například v Dobrzanski et al, Regulátory Peptides 45: 341-52, 1993 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na aktivaci fosfolipázy C lze také stanovit běžně známými metodami, viz. například v Dobrzanski et al, Regulátory Peptides 45: 341-52, 1993 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na vyprazdňování žaludku lze stanovit běžně známými metodami, popsanými například v Varga et al., Eur. J, Pharmacol. 286: 109-112, 1995 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na aktivaci lidských neutrofilů a schopnost ADCC lze stanovit běžně známými metodami, popsanými například v Wozniak et al., Immunologv 78: 62934, 1993 a podobně. Vliv zsig37 polypeptidu, fragmentu, fúzního peptidu, agonisty nebo antagonisty na tvorbu superoxidového aniontu lze stanovit běžně známými metodami, popsanými například v Wozniak et al., Immunologv 78: 62934, 1993 a podobně.

Navrhovaný vynález se dále týká zsig37 fúzních proteinů. Fúzní proteiny podle vynálezu obsahují například 1) polypeptid vybraný ze skupiny obsahující: a) molekuly polypeptidů obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji zobrazuje SEQ ID NO:2, počínaje aminokyselinou 1 (Met), 22 (Leu) nebo 26 (Arg) a konče aminokyselinou 281 (Pro); b) molekuly polypeptidů obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji zobrazuje SEQ ID NO:2, počínaje aminokyselinou 99 (Gly) a konče aminokyselinou 140 (Arg), tedy část zsig37 polypeptidu obsahující kolagenu podobnou doménu nebo její část schopnou dimerizace nebo oligomerizace; c) molekuly polypeptidů obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji zobrazuje SEQ ID NO:2, počínaje aminokyselinou 140 (Arg) nebo 141 (Cys) a konče aminokyselinou 281 (Pro), tedy část zsig37 polypeptidu obsahující globulární doménu nebo její aktivní část; d) molekuly polypeptidů obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji zobrazuje SEQ ID NO:2, počínaje aminokyselinou 99 (Gly) a konče aminokyselinou 281 (Pro), tedy část polypeptidu zsig37 obsahující kolagenu podobnou doménu a globulární doménu; a 2) další polypeptid. Dalším polypeptidem může být v tomto případě alternativní nebo doplňková globulární doména, alternativní nebo doplňková kolagenu podobná doména, signální peptid pro usnadnění sekrece fúzního proteinu a podobně. Globulární doména komplementu váže IgG, globulární doména zsig37 polypeptidu, fragmentu nebo fúzního proteinu bude mít tedy pravděpodobně podobnou úlohu.

fefe· fe • fefe • · • · • fefe fe

R « fe fe

Polypeptidy zsig37 počínající aminokyselinou 1 (Met) a končící aminokyselinou 281 (Pro); alternativní maturované polypeptidy zsig37 počínající aminokyselinou 22 (Leu) nebo 26 (Arg) a končící aminokyselinou 281 (Pro), nebo jejich alternativní vedoucí sekvence počínající aminokyselinou 1 (Met) a končící aminokyselinou 21 (Gly) nebo 25 (Ser), mohou být použity pro studium sekrece proteinů z buněk. V jednom z výhodných provedení navrhovaného vynálezu jsou připraveny maturované polypeptidy jako fúzní proteiny s hypotetickými sekrečními signálními sekvencemi; plazmid nesoucí regulační oblasti řídící expresi fúzního proteinu je vnesen do testovaných buněk a je sledována exprese maturovaného proteinu. V jiném z výhodných provedení tohoto aspektu navrhovaného vynálezu jsou alternativní vedoucí sekreční sekvence připraveny jako fúzní proteiny s alternativními proteiny vybranými pro sekreci; plazmid nesoucí regulační oblasti řídící expresi fúzního proteinu je vnesen do testovaných buněk a je sledována exprese zmíněného proteinu. Monitorování sekrece daného proteinu je prováděno běžně používanými technikami, například HPLC a podobně. Vysoce konzervované aminokyseliny, především ty, které se nacházejí v karboxykoncové globulární doméně polypeptidů zsig37, mohou být použity pro identifikaci nových členů této proteinové rodiny. Například RT-PCR (polymerázová řetězová reakce s použitím reverzní transkriptázy) může být použita pro amplifikaci sekvencí kódujících konzervované motivy z RNA získané z celé řady různých zdrojových tkání. Zvláště vhodné jsou v tomto případě degenerované primery navržené podle konzervovaných sekvencí. Konkrétně jsou velmi vhodné následující primery:

1. Aminokyseliny 269-274 SEQ ID NO:2 (odpovídající nukleotidům 975-992 SEQ ID NO:1);

2. Aminokyseliny 191-196 SEQ ID NO:2 (odpovídající nukleotidům 741-758 SEQ ID NO:1);

3. Aminokyseliny 163-168 SEQ ID NO:2 (odpovídající nukleotidům 657-674 SEQ ID NO:1);

4. Aminokyseliny 173-178 SEQ ID NO:2 (odpovídající nukleotidům 687-704 SEQ ID NO:1);

5. Aminokyseliny 243-248 SEQ ID NO:2 (odpovídající nukleotidům 897-914 SEQ ID NO:1);

Navrhovaný vynález se také zabývá degenerovanými sondami odvozenými od polynukleotidů popsaných výše. Sondy odpovídající komplementům výše uvedených polynukleotidů jsou také předmětem vynálezu.

9 9

9 9 • · 9

999 9 9 9

99 9

9 9

Izolované polynukleotidy podle vynálezu budou za stringentních podmínek s výhodou hybridizovat s podobně velkými úseky SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO.7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 nebo s jejich komplementárními sekvencemi. Obecně jsou za stringentní podmínky považovány následující: teplota asi o 5 °C nižší než je teplota tání (T_m) specifické sekvence při definované iontové síla a pH. T_m je teplota (při definované iontové síle a pH), při které 50 % cílových sekvencí hybridizuje s dokonale komplementární sondou. Typické stringentní podmínky jsou takové, kdy koncentrace solí dosahuje asi 0,03 M, pH je 7 a teplota je nejméně 60 °C. Předmětem navrhovaného vynálezu je dále farmaceutický prostředek obsahující purifikovaný zsig37 polypeptid spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem. Farmaceutický prostředek je určen pro použití k modulaci energetické rovnováhy u savců nebo k ochraně endoteliálních buněk před poškozením.

V otázce modulace energetické rovnováhy, zsig37 polypeptidy ovlivňují buněčné metabolické reakce. Mezi tyto metabolické reakce patří adipogeneze, glukoneogeneze, glykogenolýza, lipogeneze, příjem glukózy, syntéza proteinů, termogeneze, kyslíkový metabolismus a podobně. Charakter exprese zsig37 polypeptidu odpovídá expresi v buňkách endoteliální tkáně. V otázce ochrany endoteliálních buněk může být polypeptid zsig37 použit pro ochranu orgánů, pro ochranu při konzervaci hlubokým zmrazením, v chirurgii pro prevenci poškození následkem ischemie a/nebo zánětu a podobně. Exprese polypeptidu zsig37 v srdeční tkáni předpokládá, že protein může ovlivňovat uvolňování acetylcholinu a/nebo norepinefrinu. Polypeptidy zsig37 mohou nalézt použití také jako neurotransmitery nebo modulátory nervového přenosu, což napovídá exprese polypeptidu ve tkáních asociovaných se sympatickým nebo parasympatickým nervstvem. V souvislosti s tím mohou být zsig37 polypeptidy využity jako modulátory příjmu živin, například příjmu 2-deoxy-glukózy buňkami mozkové tkáně a podobně.

Mezi dalšími obecně známými a používanými metodami nebo zde popsanými metodami můžeme uvést například stanovení energetické rovnováhy u savců pomocí monitorování jedné nebo více následujících metabolických funkcí: adipogeneze, glukoneogeneze, glykogenolýza, lipogeneze, příjem glukózy, syntéza proteinů, termogeneze, kyslíkový metabolismus a podobně. Tyto metabolické funkce jsou monitorovány v oboru běžně používanými technikami (in vitro nebo na živočišných modelech); bližší popis viz. následující text. Například vliv • · ··«· ··· ······ · · ·· ·· ·· inzulínu na regulaci hladiny glukózy se uplatňuje především v játrech, kosterních svalech a v tukové tkáni. Inzulín se v těchto třech typech tkání váže na své buněčné receptory a iniciuje tkáňově specifickou reakci, která má za následek například inhibici produkce glukózy a stimulaci využívání glukózy. V játrech inzulín stimuluje příjem glukózy a inhibuje glukoneogenezi a glykogenolýzu. V kosterních svalech a v tukové tkáni působí inzulín jako stimulátor příjmu, ukládání a využívání glukózy.

Jsou známé metody pro monitorování všech výše zmíněných metabolických funkcí. Zkušený odborník je tedy schopen stanovit schopnost zsig37 polypeptidů, fragmentů, fúzních proteinů, protilátek, agonistů nebo antagonistů ovlivňovat metabolické funkce. Příklady jednotlivých technik jsou uvedeny dále.

Adipogeneze, glukoneogeneze a glykogenolýza jsou vzájemně spjaté pochody ovlivňující energetickou rovnováhu u savců, které mohou být hodnoceny známými metodami s použitím například ob/ob myší nebo db/db myší. Ob/ob myši jsou inbrední myši, mutované v obou alelách ob (obezitního) genu (mutovaný gen je neaktivní). Taková zvířata trpí hyperfagií a sníženým metabolismem a předpokládá se, že jsou deficientní v produkci cirkulujícího OB proteinu. Myši s genotypem db/db jsou inbrední myši mající homozygotní inaktivující mutaci v db (diabetickém) lokusu. Myši s genotypem db/db jsou fenotypově podobné ob/ob myším, ovšem db/db navíc vykazují i diabetický fenotyp. Takové db/db myši jsou pravděpodobně rezistentní k účinkům cirkulujícího OB proteinu. Pro stanovení zmíněných parametrů existuje také celá řada in vitro metod.

Inzulínem stimulovaná lipogeneze může být například monitorována měřením inkorporace ¹⁴C-acetátu do struktury triglyceridů (Mačkali et al., J, Biol, Chem. 251: 6462-6464, 1976) nebo měřením akumulace triglyceridů (Kletzien et al., MaL-EhaimafiakAI: 393-398, 1992).

Příjem glukózy může být stanoven například testem sledujícím inzulínem stimulovaný transport glukózy. Netransfektované diferencované L6 svalové buňky („myotubes“) (pěstované bez přítomnosti G418) jsou umístěny v DMEM s obsahem 1 g/1 glukózy, 0,5 až 1 % BSA, 20 mM HEPES a 2 mM glutaminu. Po 2 až 5 hodinách kultivace je médium vyměněno za čerstvé DMEM médium bez přídavku glukózy s obsahem 0,5 až 1 % BSA, 20 mM HEPES 1 mM pyruvátu a 2 mM glutaminu. Dále je přidána odpovídající koncentrace inzulínu nebo IGF-1 nebo ředící řada testované látky a buňky jsou inkubovány po dobu 20 až 30 minut. Poté je přidána ³H nebo ¹⁴C značená deoxyglukóza do finální koncentrace «50 1M a buňky jsou inkubovány po dobu 10 až 30 minut. Poté jsou buňky rychle promyty chladným pufrem (například PBS) a poté lyžovány vhodným lyzačním činidlem · 4 444

4 · 4 4«444

4444 44 4 4444

444 4 444 44 4

4 4 4 4 4 4444

444 444 44 44 44 44 (například 1% SDS nebo 1 N NaOH). Množství zabudované radioaktivní látky je poté v lyzátu stanoveno pomocí scintilačního počítače. Radioaktivita přijatá buňkou určuje po odečtení nespecifických vazeb, určených inkubací buněk v přítomnosti cytocholasinu b (inhibitoru glukózového transportu), úroveň transportu glukózy. Další metody jsou popsané například v Manchester et al., Am. J. Phvsiol. 266 (Endocrinol. Metab. 29): E326-E333, 1994 (inzulínem stimulovaný transport glukózy).

Syntéza proteinů může být hodnocena například porovnáním precipitace ³⁵Smethioninem značených proteinů následně po inkubaci testovaných buněk s ³⁵Smethioninem a ³⁵S-methioninem a s předpokládaným modulátorem syntézy proteinů.

Termogeneze může být hodnocena například tak jak je to popsáno v B. Stanley v The Biology of Neuropeptide Y and Related Peptides, W. Colmers and C. Wahlestedt (eds.), Humana Press, Ottawa, 1993; str. 457-509; C. Billington et al., Am. J. Phvsiol. 260: R321, 1991; N. Zarjevski et al., Endocrinology 133: 1753, 1993; C. Billington et al., Am. J. Phvsiol. 266: R1765, 1994; Heller et al., Am. J. Phvsiol, 252 (4 Pt 2): R661-7, 1987 a Heller et al., Am. J. Phvsiol. 245(3): R3218, 1983. Také úroveň metabolismu, která může být měřena mnoha různými technikami, je nepřímým ukazatelem termogeneze.

Využívání kyslíku může být hodnoceno například tak jak je to popsáno v Heller et al., Pflugers. Arch. 369(1): 55-9, 1977. Tato metoda také zahrnuje analýzu hypothalamické teploty a metabolické produkce tepla. Využívání kyslíku a termoregulace Byly u člověka hodnoceny také metodou popsanou v Haskell et al.,

J. Appl. Phvsiol. 51(4): 948-954, 1981.

Mezi dalšími metodami, popsanými v odborné literatuře nebo v tomto textu, můžeme zmínit metodu hodnocení ochrany buněk savčí endoteliální tkáně pomocí monitorování funkce endoteliální tkáně. Například funkce srdce (aorty) může být hodnocena pomocí monitorování uvolňování acetylcholinu, uvolňování norepinefrinu a dalších podobných parametrů. Tyto parametry jsou monitorovány technikami (ať již na vzorcích tkáně, nebo na živočišných modelech), které jsou odborníkům dobře známé a které jsou podrobněji vysvětleny dále.

Uvolňování acetylcholinu a norepinefrinu může být sledováno například pomocí HPLC. Levý, Electrophysiology of the Sinoatrial Nodes, Alan R. Liss, lne., 187197, 1998 popisuje měření norepinefrinu na výtoku z koronárního sinu. U živočichů může být navíc ovlivněna srdeční činnost elektricky („electrical páce“) a výsledky mohou být monitorovány tak jak to popisuje Elsner, European Heart φφφφ ··· φφ φφ φφ φφ

Journal 16 (Supplement Ν): 52-8, 1995 a Reiffel and Kuehnert, PÁCE 17 (Part 1): 349-65, 1994.

Mezi dalšími metodami, popsanými v odborné literatuře nebo v tomto textu, můžeme zmínit metodu hodnocení funkce přenosu nervového vzruchu monitorováním příjmu 2-deoxy-glukózy v mozkové tkáni. Tento parametr je stanovován technikami (ať již na vzorcích tkáně, nebo na živočišných modelech), které jsou odborníkům dobře známé, například autoradiograficky. Vhodné monitorovací techniky jsou popsány například v Kilduff et al., J. Neurosci, 10: 2463-75, 1990; příbuzné metody pro hodnocení „hibernujícího srdce“ jsou popsány v Gerber et al., Circulation 94(4): 651-8, 1996 a Fallavollita et al., Circulation 95(7): 1900-1909, 1997.

Polypeptidy zsig37, jejich fragmenty, fúzní polypeptidy, agonisté a antagonisté mohou být dále použity jako vhodné modulátory anti-mikrobiální funkce nebo přenosu nervového vzruchu. Například složka komplementy Clq hraje roli při obraně hostitele proti infekčním agens, jako jsou například bakterie nebo viry. Je známo, že Clg má několik specializovaných funkcí. Clq například spouští kaskádu komplementu, a to interakcí s navázanou protilátkou nebo s CRP (Creaktivním proteinem). Clq dále přímo interaguje s některými bakteriemi, RNA viry, mykoplazmami, krystaly kyseliny močové, s lipidem A (složkou bakteriálního endotoxinu) a s membránami některých intracelulárních organel. Předpokládá se, že Clq vazbou na Clq receptor podněcuje fagocytózu. Clq také pravděpodobně podporuje hostitelský obranný systém působením na zvýšení tvorby protilátek. Viz. například Johnston, Pediatr. Infekt. Dis. J, 12(1 1): 933941, 1993. Rozpustné molekuly podobné Clq mohou být tedy vhodnými antimikrobiálními látkami podněcujícími lýzi nebo fagocytózu infekčních agens. Polypeptidy zsig37 podle vynálezu také vykazují homologii s látkami, které jsou pravděpodobnými modulátory neurotransmise. Jak je vidět na obrázku 1, zsig37 polypeptidy jsou homologní s následujícími proteiny: HP25 TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell. Biol. 13: 1516-21, 1993 a Rondo & Rondo, J, Biol, Chem. 267: 473-8, 1992); HP27_TAMAS (Takamatsu et al., Mol. Cell, Biol, 13: 1516-21, 1993 a Rondo & Rondo, J. Biol. Chem. 267: 473-8, 1992) a CERLRAT (Wada & Ohtani, Brain, Res, Mol. Brain Res. 9: 71-7, 1991). HP25 a HP27 jsou polypeptidy, nacházející se v aktivním (letním) séru hybernujících Eutamias sibiricus. CERL je přítomen v krysím mozečku. Polypeptidy zsig37, jejich fragmenty, fúzní polypeptidy, agonisté a antagonisté mohou být tedy vhodné pro použití pro modulaci přenosu nervového vzruchu například vazbou neurotransmiterů na jejich receptory.

4444 ·· 4 44« 44 44

4 44 «4*44

4444 44 4 4444 » 444 4 «44 44 4 • 4 4444 4444

444 444 44 44 44 44

Hybridizační mapování pomocí radioaktivně značených sond je metodou buněčné genetiky, vyvinutou za účelem mapování savčích chromozómů s vysokým rozlišením (Cox et al., Science 250: 245-250, 1990). Částečná nebo úplná znalost sekvence genů umožňuje navržení PCR primerů, vhodných pro použití při mapování chromozómu pomocí hybridizace s radioaktivně značenými sondami. Panely radioaktivně značených hybridizačních sond, pokrývající celý lidský genom jsou komerčně dostupné, například Standford G3 RH Panel a GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, lne. Huntsville, AL). Tyto panely umožňují rychlou lokalizaci genů v rámci chromozómu, založenou na principu PCR a následně objednání těchto genů, oblastí značených určitou sekvencí (STSs, tj. „sequencetagged sites“) a dalších nepolymorfních a polymorfních markérů v rámci oblasti, která je předmětem našeho zájmu. To zahrnuje přímé stanovení poměrných fyzických vzdáleností mezi nově objevenými geny, které jsou předmětem našeho zájmu, a dříve zmapovanými markéry. Přesná znalost pozice genů může být užitečná pro řadu aplikací včetně: 1) určení, zda je sekvence součástí nějakého existujícího většího celku a získání okolních genetických sekvencí v různých formách jako jsou například YAC-, BAC-, nebo cDNA klony; 2) navržení genu jako možného kandidáta na původce dědičného onemocnění, které vykazuje vazbu s odpovídající oblastí chromozómu; 3) použití v referenčních modelových organismech jako jsou například myši, kde mohou napomáhat k určení funkce některého konkrétního genu.

Výsledky prokázaly že gen kódující zsig37 polypeptid je součástí chromozómu 17, oblasti 17q25.2. mapování bylo provedeno s použitím NIGMS Human/Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping Panel Number 2 (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of medical Research).

Navrhovaný vynález se dále týká reagencií, které nacházejí použití v diagnostických aplikacích. Tak například gen zsig37, sonda obsahující zsig37 DNA nebo RNA nebo jejich sled, mohou být použity pro stanovení přítomnosti genu zsig37 na chromozómu 17 nebo pro stanovení případných mutací zmíněného genu. Zjistitelné chromozomální aberace v genu zsig37 zahrnují aneuploidii, změny v počtu kopií genu, inzerce, delece, změny restrikčních míst, genové přestavby a jiné. Zmíněné aberace mohou nastat uvnitř kódující sekvence, v intronech nebo v lemovací sekvenci včetně upstream promotoru a regulačních oblastí a mohou se projevit jako fyzické změny v kódující sekvenci nebo jako změny v intenzitě exprese genu.

Obecně zahrnují zmíněné diagnostické metody následující kroky: a) získání genetického vzorku od pacienta b) inkubace genetického vzorku s ·· 9999

9999 • 9 99 • 9» · 9 9 9999

999 9 9 9 9 9 9 « • 999 9 999 99 9

9 9999 9999 «66 999 99 99 99 99 polynukleotidovou sondou nebo primerem (viz. výše) za podmínek umožňujících hybridizaci polynukleotidů s komplementární polynukleotidovou sekvencí za vzniku prvního reakčního produktu a c) porovnání prvního reakčního produktu s kontrolním reakčním produktem. Rozdíl mezi prvním reakčním produktem a kontrolním reakčním produktem je indikátorem genetické abnormality u sledovaného pacienta. Mezi genetické vzorky pro použití podle navrhovaného vynálezu patří genomová DNA, RNA a cDNA. Polynukleotidové sondy nebo priméry mohou být DNA nebo RNA molekuly a obsahují část SEQ ID NO:1, komplementu k SEQ ID NO:1 nebo RNA ekvivalent zmíněných sekvencí. Vhodnými testovacími metodami jsou v tomto případě v oboru obecně známé techniky molekulární genetiky jako například analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP), analýza krátkých tandemových repetic (STR), analýzy využívající PCR, ligační reakce (Barany, PCR Methods and Applications) 1: 5-16, 1991), analýzy využívající ochrany části sekvence proti štěpení ribonukleázami (ribonucleas protection assay) a mnohé další (Sambrook et al., ibid,. Ausbel et al., ibid.; Marian, Chest 108: 255-65, 1995). Ribonuclease protection assay (viz. např. Ausbel et al., ibid.. ch. 4) využívá hybridizace RNA sondy se vzorkem pacientovy RNA; vzniklý reakční produkt (RNA-RNA hybrid) je poté vystaven účinkům RNázy. Dvojřetězcové úseky RNA (tedy ty, které byly komplementární a hybridizovaly spolu) jsou proti štěpení RNázou chráněny. Pro PCR analýzy je pacientův genetický vzorek inkubován s párem polynukleotidových primerů a oblast mezi priméry je amplifikována. Změny ve velikosti a nebo množství produktu získaného amplifikací ukazují na mutační změnu v pacientově DNA. Další PCR technikou je analýza jednořetězcového konformačního polymorfismu („single strand conformational polymorphism analysis“, SSCP) (Hayashi, PCR Methods and Applications 1: 34-8, 1991).

Stavem asociovaným se 17q25.2 je porucha ukládání glykogenu II („glycogen storage disease II“). Polypeptid zsig37 může být tedy vhodný pro použití při studiu, prevenci nebo léčbě (například genovou terapií) tohoto stavu. Pokud má savčí organismus mutovaný zsig37 gen, nebo ho dokonce postrádá, může být zsig37 gen do savčích buněk uměle vnesen. V jednom z provedení navrhovaného vynálezu je gen kódující zsig37 polypeptid vnesen in vivo do virového vektoru. Takovým vektorem je atenuovaný nebo defektní DNA virus, jako například (ale nikoliv výhradně) virus herpes simplex (HSV), papillomavirus, virus Epstein Barrové (EBV), adenovirus, adeno-asociovaný virus (AAV) a podobně. Defektní viry, které úplně a nebo téměř úplně postrádají virové geny, jsou vhodnější. Defektní virus není po vnesení do buněk infekční. Používání defektních virových ···· ···· »· ·· ·· ♦ · » * ···♦ • ··· 9 9 9 9 · 9 9 • »99 9 ^99 99 9 • 9 99·· 9 · · r • 99 ·99 99 99 ·· 9· vektorů umožňuje jejich vnášení do buněk ve specifických, lokalizovaných oblastech bez nebezpečí že by mohl virus infikovat okolní buňky. Konkrétními příklady vektorů jsou defektní herpes virus 1 (HSV1) (Kaplitt et al., Molec. Cell Neurosci. 2: 320-330, 1991), atenuovaný adenovirový vektor popsaný v StradfordPerricaudet et al., J, Clin. Invest. 90: 626-630, 1992 a defektní adeno-asociovaný virový vektor (Samulski et al., J. Virol, 61: 3096-3101, 1987; Samulski et al., L. Virol. 63: 3822-3828, 1989). Tento seznam příkladů však v žádném případě není konečný.

V dalším z provedení vynálezu může být gen vnesen do retrovirového vektoru, jaké jsou popsány například v Anderson et al., U.S. patent No. 5,399,346; Mann et al., Cell 33: 153, 1983; Ternin et al., U.S. patent No. 4,650,764; Temin et al., U.S. patent No. 4,980,289; Markowitz et al., J, Virol. 62: 1120, 1988; Temin et al., U.S. patent No. 5,124,263; Internatinal Patent Publication No. WO 95/07358, March 16, 1995, Dougherty et al. a Blood 82: 845, 1993.

Alternativně může být vektor do buněk vnesen in vivo lipofekcí s pomocí lipozómů. Pro přípravu lipozómů pro in vivo transfekci genu kódujícího markér mohou být použity syntetické kationtové lipidy (Felgner et al., Proč. Nati, Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987; viz. Mackey et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8027-803 1, 1988). Použití lipofekce pro vnášení exogenních genů do specifických orgánů in vivo má některé praktické výhody. Jednou z oblastí těchto výhod je molekulární cílení lipozómů do specifických buněk. Je zřejmé, že cílená transfekce do konkrétních buněk představuje jednu z oblastí výhod. Je také zřejmé, že cílená transfekce do konkrétních buněk je zvláště výhodná v případě tkání heterogenních v zastoupení buněčných druhů, jako je například pankreas, játra, ledviny či mozek. Lipidy mohou být chemicky vázány s jinými molekulami za účelem cílení. S lipidy mohou být chemicky vázány za účelem cílení peptidy, například hormony nebo neurotransmitery, proteiny jako například antibiotika a také nepeptidové molekuly.

Je také možné vyjmout buňky z těla, vnést vektor ve formě nahého DNA plazmidu do buněk a poté implantovat transfektované buňky zpět do těla. Nahý DNA vektor pro genovou terapii může být vnesen do požadovaných hostitelských buněk obecně známými metodami, například transfekci, elektroporací, mikroinjekcí, transdukcí, fúzí buněk, pomocí DEAE dextranů, kalcium fosfátové precipitace, nástřelu genu nebo transportéru DNA vektoru, viz. například Wu et al., J. Biol. Chem. 267: 963967, 1992, Wu et al., J. Biol, Chem. 263: 14621-14624, 1988 a Johnston and Tang, Methods in Cell Biology 43: 353-65, 1994.

• fefe · • · · • · fefe • fefe · • · · ♦ • · · · · fe fefe * • · fefe

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu jsou antisense polynukleotidové prostředky, které jsou komplementární k segmentu polynukleotidů uvedených v SEQ ID NO:1. Takové syntetické antisense oligonukleotidy jsou navrženy tak, aby vázaly mRNA kódující zsig37 polypeptidy a inhibovaly tak translaci takové mRNA. Takové antisense oligonukleotidy jsou vhodné jako inhibitory exprese genů kódujících zsig3 7 polypeptidy v buněčných kulturách nebo v odpovídajícím organizmu.

Polypeptidy zsig37 mohou být použity také pro analýzu energetické účinnosti u savců. Polypeptidy zsig37 nalezené v séru nebo ve tkáňových vzorcích mohou být indikátorem schopnosti savců ukládat živiny a v případě vyšší účinnosti také sklonů k obezitě. Konkrétně se navrhovaný vynález zabývá způsoby detekce polypeptidů zsig37 zahrnujícími:

inkubaci vzorku, který pravděpodobně obsahuje polypeptid zsig37, s protilátkou navázanou na pevný nosič, kde zmíněná protilátka váže epitop zsig37 polypeptidů; promytí imobilizované protilátky s navázaným polypeptidem za účelem odmytí kontaminant, inkubaci imobilizované protilátky s navázaným polypeptidem s druhou protilátkou namířenou proti dalšímu epitopu zsig37 polypeptidů, kde zmíněná druhá protilátka je asociována se značkou umožňující detekci a detekci zmíněné značky. Koncentrace zsig37 polypeptidů v testovaném vzorku je indikátorem energetické účinnosti u testovaného savce. Tato informace může napomáhat analýze výživy savce. Potencionálně může být tato informace užitečná i pro identifikaci a/nebo zacílení energeticky deficientní tkáně.

Mezi dalšími navrhovanými aspekty vynálezu jsou předmětem vynálezu protilátky, které specificky váží polypeptidy zsig37, popsané výše. Takové protilátky jsou, kromě jiného, vhodné pro přípravu anti-idiotypových protilátek. Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je způsob identifikace agonistů nebo antagonistů polypeptidů zsig37, popsaných výše, kde zmínění agonisté nebo antagonisté mohou mít cenné vlastnosti, které budou dále podrobněji popsány. Jedním z aspektů vynálezu je způsob identifikace agonistů polypeptidů zsig37 zahrnující získání buněk, rozpoznávajících tyto agonisty, kultivaci těchto buněk v přítomnosti testované látky, porovnání buněčné odpovědi s buňkami kultivovanými v přítomnosti polypeptidů zsig37 a selekci testovaných látek, vykazujících stejný typ buněčné odpovědi.

Dalším z aspektů vynálezu je způsob identifikace antagonistů polypeptidů zsig37 zahrnující získání buněk, rozpoznávajících zsig37 polypeptid, kultivaci první části buněk v přítomnosti zsig37 polypeptidů, kultivaci druhé části buněk v přítomnosti • ···· 9 9 ····

9 9 · · · • ··· · · * • 9 9 9 9 · zsig37 polypeptidu a testované látky a detekci poklesu buněčné odpovědi u druhé části buněk v porovnání s první částí buněk. Kromě již zmíněných testů mohou být vzorky testovány na inhibici aktivity zsig37 celou řadou testů, navržených pro měření vazby na receptor nebo stimulace či inhibice buněčné odpovědi, závislé na zsig37. Buněčné linie, vykazující odpověď na zsig37, mohou být například transfektovány konstruktem reportérového genu, který je citlivý k buněčné dráze, stimulované zsig37. Konstrukty s reportérovým genem tohoto typu jsou v oboru známé a obecně obsahují zsig37-DNA citlivý element, operativně spojený s genem kódujícím snadno stanovitelný protein, například luciferázu. DNA citlivý element může zahrnovat například, ale nikoliv výhradně, cAMP citlivé elementy (CRE), elementy citlivé k hormonům (HRE), element citlivý k inzulínu (IRE) (nasrin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 5273-7, 1990) a elementy citlivé k séru (SRE) (Shaw et al., Cell 56: 563-72, 1989). Elementy citlivé k cAMP jsou souhrnně popsány například v Roestler et al., J, Biol. Chem, 263 (19): 9063-6, 1988 a Habener, Molec. Endocrinol, 4 (8): 1087-1094, 1990. Elementy citlivé k hormonům popisuje Beato, Cell 56: 335-344, 1989. U sloučenin, roztoků, směsí nebo extraktů je testována schopnost inhibovat aktivitu zsig37 u cílové populace buněk, která se projevuje poklesem stimulace exprese reportérového genu zsig37. Testy tohoto typu detekují látky, které přímo blokují vazbu zsig37 na receptory na povrchu buněk, stejně jako látky které blokují procesy v buněčných pochodech, které jsou vyvolány vazbou receptoru a ligandu. Alternativně může být u zmíněných sloučenin nebo dalších vzorků testována schopnost přímo blokovat vazbu zsig37 na receptor zsig37 s navázanou značkou, kterou lze snadno detekovat (příkladem může být ¹²⁵I, biotin, křenová peroxidáza, FITC a podobně). U tohoto typu testů je schopnost inhibovat vazbu značeného zsig37 k receptoru indikátorem inhibiční aktivity, která může být dále potvrzena dalšími sekundárními testy. Receptory, používané v rámci zmíněných testů vazby, mohou být buněčné receptory nebo izolované, imobilizované receptory.

Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je metoda pro studium inzulínu. Taková metoda podle vynálezu zahrnuje inkubaci adipocytů v kultivačním médiu s obsahem zsig3 7 polypeptidu, monoklonální protilátky, agonisty nebo antagonisty zmíněného polypeptidu a buď s nebo bez přídavku inzulínu a sledování změn v sekreci proteinů nebo diferenciaci adipocytů.

Anti-mikrobiální ochranné látky mohou působit přímo nebo nepřímo. Látky, působící cestou asociace s membránou nebo tvorbou pórů, působí přímo na mikroorganizmus. Antimikrobiální látky mohou působit také enzymaticky, tj. mohou například rozkládat ochranné látky mikroorganizmů nebo jejich buněčné stěny nebo membrány. Anti-mikrobiální látky, schopné inhibovat proliferaci mikroorganizmů nebo jejich působení, či schopné rozrušit integritu mikroorganizmů některým z mechanizmů, zmíněných výše, jsou vhodné pro prevenci kontaminace buněčných kultur mikroby citlivými ke zmíněným antimikrobiálním látkám. Takové způsoby prevence kontaminace zahrnují kultivaci buněk v přítomnosti účinného množství zmíněného zsig37 polypeptidu nebo jeho agonisty či antagonisty.

Polypeptidy zsig37 nebo jejich agonisté mohou být použity v buněčných kulturách jako reagencie pro in vitro studie exogenní infekce mikroorganismy, například bakteriemi, viry nebo houbami. Stejně tak mohou být tyto látky použity pro studium infekce in vivo na živočišných modelech.

Navrhovaný vynález se dále zabývá metodami studia savčího buněčného metabolismu. Takové metody podle vynálezu zahrnují inkubaci studovaných buněk, například lidských vaskulárních endoteliálních buněk, s a nebo bez přídavku zsig37 polypeptidu, monoklonální protilátky, agonisty nebo antagonisty a sledování změn v adipogenezi, glukoneogenezi, glykogenolýze, lipogenezi, příjmu glukózy a podobně.

Dalším z aspektů vynálezu je způsob studia dimerizace nebo oligomerizace. Zmíněný způsob studia dimerizace nebo oligomerizace podle vynálezu zahrnuje inkubaci zsig37 polypeptidů, fragmentů nebo fúzních proteinů, obsahujících kolagenu podobnou doménu, samostatně nebo spolu s dalšími polypeptidy nesoucími kolagenu podobné domény a sledování asociací, vzniklých mezi kolagenu podobnými doménami. Takové asociace jsou ověřeny HPLC, cirkulárním dichroizmem a podobně.

Jak bylo výše zmíněno, izolované polynukleotidy podle vynálezu zahrnují DNA a RNA. Způsoby izolace DNA a RNA jsou v oboru dobře známé. Obecně je s výhodou izolovat RNA z mozkových nádorů, srdce, placenty, tukové tkáně a podobně, ovšem DNA může být také připravena s použitím RNA z jiných tkání, nebo může být izolována jako genomová DNA. Celková RNA může být připravena s použitím guanidin/HCl extrakce následované izolací pomocí centrifugace v CsCl gradientu (Chirgwin et al., Biochemistrv 18: 52-94, 1979). Póly (A)⁺ RNA je připravena z celkové RNA s použitím metod podle Aviv and Leder, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 1408-1412, 1972. Komplementární DNA (cDNA) je připravena podle póly (A)⁺ RNA s použitím známých metod. Polynukleotidy, kódující zsig37 polypeptidy, jsou poté identifikovány a izolovány například hybridizací nebo pomocí PCR.

Navrhovaný vynález se dále zabývá odpovídajícími polypeptidy a polynukleotidy z jiných druhů (orthology nebo paralogy). Jinými druhy mohou být například (ale nikoliv výhradně) savci, ptáci, obojživelníci, plazi, ryby, hmyz a další obratlovci i bezobratlí. Zvláštní význam mají zsig37 polypeptidy z dalších druhů savců, například myší, krysí, prasečí, ovčí, hovězí, koňské, kočičí, psí a zsig37 polypeptidy primátů. Orthology lidských proteinů mohou být klonovány s použitím prostředků a informací podle navrhovaného vynálezu v kombinaci s běžnými klonovacími technikami. Například cDNA může být klonována s pomocí mRNA získané z tkáně nebo buněk exprimujících protein. Vhodný zdroj mRNA může být identifikován metodou Northern blot s pomocí sond navržených na základě sekvencí podle vynálezu. Z mRNA získané z pozitivní tkáně nebo buněčné linie je poté připravena knihovna. cDNA kódující zsig37 polypeptid může být poté izolována celou řadou způsobů, například hybridizací s totální nebo částečnou lidskou cDNA nebo s jedním nebo více soubory degenerovaných sond, odvozených od sekvencí podle vynálezu. cDNA může být také klonována pomocí PCR (Mullis, U.S. patent 4,683,202) za použití primerů navržených na základě sekvencí podle vynálezu. cDNA knihovna může být použita pro transformaci nebo transfekci hostitelských buněk a exprese požadované cDNA může být poté detekována protilátkami proti zsig37 polypeptidu. Podobné techniky mohou být aplikovány také v případě izolace genomických klonů. Orthology mohou být identifikovány také vyhledáváním v druhově specifických EST databázích s použitím sekvencí podle vynálezu. EST kódující myší zsig37 ortholog byl objeven při prohledávání myši EST databáze (viz. níže). Myší ortholog (SEQ ID NO:43) vykazuje 77% identitu s lidskou sekvencí na úrovni nukleotidové sekvence a 77% identitu na úrovni aminokyselinové sekvence.

Odborníkům je jistě zřejmé, že sekvence SEQ ID NO:1 a SEQ ID NO:2 představují jedinou alelu lidské zsig37 DNA a zsig37 proteinu a že jistě existují další alelické varianty a také možnost alternativního sestřihu. Alelické varianty této sekvence mohou být klonovány pomocí hybridizace cDNA nebo genomových knihoven z různých jedinců standardními technikami. Alelické varianty DNA sekvence zobrazené jako SEQ ID NO:1 včetně těch, které obsahují tiché mutace a těch, kde mutace mají za následek změnu v aminokyselinové sekvenci, jsou také předmětem vynálezu stejně jako alelické varianty SEQ ID NO:2. Předmětem vynálezu jsou také cDNA, vytvořené alternativním sestřihem mRNA a mající vlastnosti zsig37 polypeptidu, stejně jako polypeptidy kódované takovými cDNA a mRNA. Alelické varianty a varianty sestřihu těchto sekvencí mohou být klonovány pomocí • ···· ·· ···· · · ··

ΊΟ ··· ...··» · ....... · · • · · · * · · · · · • · · · · · ··· ······ ·· ·* · · ·· hybridizace cDNA nebo genomových knihoven z různých jedinců nebo tkání standardními, v oboru dobře známými metodami.

Navrhovaný vynález se také zabývá izolovanými zsig37 polypeptidy, které jsou v podstatě homologní s polypeptidy dle SEQ ID NO:2 a jejich druhově specifickými homology/orthology. Termín „v podstatě homologní“ je zde použit pro označení polypeptidů, vykazujících nejméně 50%, raději pak nejméně 60% a nejraději alespoň 80% identitu se sekvencemi SEQ ID NO:2, jejich paralogy nebo orthology. Zmíněné polypeptidy jsou s výhodou nejméně z 90 %, ještě raději pak nejméně z 95 a více % identické se SEQ ID NO:2 nebo jejími orthology nebo paralogy. Procento identity sekvencí je stanoveno konvenčními metodami, viz. například Altschul et al., Bull. Math. Bio, 48: 603-616, 1986 a Henikoff a

Henikoff, Eroc,_Nati.,_Acad._Sci. USA 89: 10915-10919, 1992. Krátce, dvě aminokyselinové sekvence jsou porovnány tak aby bylo optimalizováno skóre s použitím následujících parametrů: „gap opening penalty“ 10 (postih za vytvoření mezery); „gap extension penalty“ 1 (postih za prodloužení mezery); a „blosum 62“ bodovact matice dle Heinkoff a Heinkoff (ibid.) viz. tabulka 3 (aminokyseliny jsou označeny standardním jednopísmenným kódem). Procento identity je poté vypočítáno jako:

celkový počet identických párů

- x 100 [délka delší sekvence + počet mezer vnesených do delší sekvence z účelem uspořádání a porovnání obou sekvencí]

Tabulka 3

	A	R	N	D	C	Q	E	G	H
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	-3	-3	9
Q	-1	1	0	0	-3	5
E'	-1	0	0	2	-4	2	5
G	0	-2	0	-1	-3	-2	-2	6
H	-2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8
I	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3	-4	-3
L	-1	-2	-3	-4	-1	-2	-3	-4	-3
K	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1
M	-1	-1	-2	-3	-1	0	-2	-3	-2
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	-2
S	1	-1	1	0	-1	0	0	0	-1
T	0	-1	0	-1	-1	-1	-1	-2	-2
W	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1	-2	-3	2
v	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3

4

-3 -2 5 • 4 4 4 4

4444 4 4

4 4 · 4 · 4 4 4 44

ILKMFPSTWYV

1	2	-1	5
0	0	-3	0	6
-3	-3	-1	-2	-4 · 7
-2	-2	0	-1	-2 -1	4
-1	-1	-1	-1	-2 -1	1	5
-3	-2	-3	-1	1 -4	-3	-2	11
-1	-1	-2	-1	3, ‘3	-2	-2	2	7
3	1	-2	1	-1 -2	-2	0	-3	-1

• · · · ·· ··

Identita sekvencí polynukleotidových molekul je stanovena podobným způsobem a s použitím stejné rovnice, jaká je uvedena pro výpočet podobnosti proteinových sekvencí.

V podstatě homologní proteiny a polypeptidy jsou charakterizovány jako sekvence mající jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí. Tyto záměny jsou s výhodou minoritních charakteru, tj. konzervativní aminokyselinové substituce (viz. tabulka 4) a další substituce, které nikterak významně neovlivní skládání nebo aktivitu proteinu nebo polypeptidu; krátké delece, typicky dlouhé 1 až 30 aminokyselin a krátké amino- nebo karboxy-koncové extenze, například amino-koncový methionin, krátký spojovací peptid (20 až 25 aminokyselin) nebo krátká sekvence vykazující afinitu k nějakému substrátu. Polypeptidy obsahující afinitní sekvence mohou dále obsahovat místo, rozpoznávané a štěpené proteolytickým enzymem, umístěné mezi zsig37 polypeptidem a afinitní sekvencí. S výhodou je takovým místem například místo specificky štěpené thrombinem nebo faktorem Xa.

Tabulka 4

Konzervativní	aminokyselinové substituce
Bazické:	arginin lyzin histidin
Kyselé:	kyselina glutamová kyselina asparagová
Polární:	glutamin asparagin
Hydrofobní:	leucin izoleucin valin
Aromatické:	fenylalanin tryptofan tyrozin
Malé:	glycin alanin serin threonin methionin

• · 9 9

Proteiny podle navrhovaného vynálezu mohou dále obsahovat aminokyseliny, které se přirozeně nevyskytují. Mezi tyto aminokyseliny patří například trans-3methylprolin, 2,4-methanoproIin, czs-4-hydroxyprolin, Zroní-4-hydroxyprolin, Nmethylglycin, o/Zo-threonin, methylthreonin, hydroxyethylcystein, hydroxyethylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, kyselina pipekolová, thiazolidin karboxylová kyselina, dehydroprolin, 3- a 4-methylprolin, 3,3dimethylprolin, Zer/-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4azafenylalanin a 4-fluorofenylalanin. Tento výběr však není v žádném případě limitující. Je známo několik metod pro inkorporací aminokyselin, které se přirozeně nevyskytují, do struktury proteinů. Příkladem může být in vitro systém kde jsou nesmyslné mutace suprimovány s použitím chemicky aminoacylovaných supresorových tRNA. Způsoby syntézy aminokyselin a aminoacylace tRNA jsou v oboru známé. Transkripce a translace plazmidů, nesoucích nesmyslné mutace, jsou prováděny v bezbuněčném systému obsahujícím S30 extrakt z E. coli a komerčně dostupné enzymy a další reagencie. Proteiny jsou purifikovány chromatografií. Viz. například Robertson et al., J, Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol, 202: 301, 1991; Cung et al, Proč. Nati, Acad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993. Další metodou je translace v oocytech rodu Xenopus, do kterých je mikroinjekcí vpravena mutovaná mRNA a chemicky aminoacylované supresorové tRNA (Turcatti et al., J, Biol. Chem, 271: 19991-8, 1996). Třetím způsobem je kultivace buněk E. coli bez přítomnosti přirozeně se vyskytující aminokyseliny, která má být nahrazena (například fenylalaninu) a v přítomnosti požadované aminokyseliny (aminokyselin), která se přirozeně nevyskytuje (například 2azafenylalaninu, 3-azafenylalaninu, 4-azafenylalaninu nebo 4-fluorofenylalaninu). Aminokyseliny, které se přirozeně nevyskytují, jsou zabudovány do struktury proteinů na místo jejich přirozeně se vyskytujících protějšků (viz. Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994). Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky mohou být konvertovány na ty, které se v přírodě nevyskytují, in vitro chemickou modifikací. Chemická modifikace může být kombinována s místně specifickou mutagenezí, čímž může být ještě rozšířen rozsah substitucí (Wynn and Richards, Protein Sci. 2: 3 95-403, 1993.

V aminokyselinové sekvenci zsig37 může být proveden omezený počet nekonzervativních substitucí, tj. mohou být zařazeny aminokyseliny, které nejsou kódovány genetickým kódem a nevyskytují se přirozeně.

Esenciální aminokyseliny mohou být v polypeptidech podle vynálezu identifikovány v oboru známými technikami, například místně specifickou mutagenezí nebo alanine-scanning mutagenezí (Cunningham and Wells, Science

244: 1081-5, 1989; Bass et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 4498-502, 1991). Druhá z technik je založena na vnesení vždy jediné alaninové mutace na místo každého aminokyselinového zbytku v molekule a u výsledných mutantních molekul je testována jejich biologická aktivita (například schopnost ovlivňovat energetickou rovnováhu) a tak jsou stanoveny aminokyselinové zbytky, které jsou kritické pro zachování biologické aktivity molekuly. Viz. například Hilton et al., J. Biol, Chem. 271: 4699-708, 1996. Fyzikální analýzou struktury mohou být určena i místa zodpovědná za vazbu ligand-receptor nebo jiné biologické interakce. Vhodnými technikami jsou například nukleární magnetická rezonance, krystalografie, elektronová difrakce, nebo fotoafinitní značení ve spojení s mutací aminokyselin v potencionálním místě kontaktu. Viz. například de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J, Mol. Biol, 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Letters 309: 59-64, 1992. Esenciální aminokyseliny mohou být stanoveny také analýzou homologií s příbuznými polypeptidy.

Mnohočetné aminokyselinové substituce mohou být prováděny i testovány pomocí známých způsobů mutageneze a známých testovacích metod, viz. například Reidhaar-Olson and Sauer, Science 241: 53-7, 1988 nebo Bowie and Sauer, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989. Krátce, tito autoři popisují techniky pro simultánní randomizaci dvou nebo více pozic v polypeptidu a následné sekvenování mutovaných polypeptidů za účelem stanovení spektra přípustných substitucí v každé pozici. Mezi další metody, které mohou být použity, patří fágová expozice (např. Lownam et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., U.S. patent No. 5,223,409; Huse, WIPO Publication WO 92/06204) a oblastněspecifická mutageneze (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).

Varianty navrhovaných zsig37 DNA a polypeptidových sekvencí mohou být připraveny metodou náhodné mutageneze přenosem DNA („DNA shuffling“) tak jak ji popisuje Stemmer, Nátuře 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proč, Nati. Acad. Sci. USA 91: 10747-51, 1994 a WIPO Publication WO 97/20078. Krátce, varianty DNA jsou tvořeny in vitro homologní rekombinací, náhodnou fragmentací rodičovské DNA následovanou opětovným sestavením pomocí PCR, čímž vznikají náhodně umístěné bodové mutace. Tato technika může být modifikována použitím rodiny rodičovských DNA, jako jsou například alelické varianty nebo DNA pocházející z různých druhů, čímž je do procesu vnesena další, širší variabilita. Selekce mutant s požadovanou aktivitou, následovaná další mutagenezí a dalšími testy, je rychlou metodou „vývoje“ sekvencí výběrem žádoucích mutací a zároveň vyloučením nežádoucích mutací.

•9 9 9 9 9

9

9 ·

9 ♦

9 ·

9 9

99

Metody mutageneze, které byly popsány výše, mohou být kombinovány s vysoce účinnými automatizovanými metodami testování aktivity klonovaných mutovaných polypeptidu v hostitelských buňkách. Mutované molekuly DNA, kódující aktivní polypeptidy (například schopné modulovat energetickou rovnováhu) mohou být pomocí moderního vybavení z hostitelských buněk izolovány a rychle sekvenovány. Tyto moderní metody umožňují rychlou determinaci důležitosti jednotlivých aminokyselinových zbytků v sekvenci polypeptidu, který je předmětem našeho zájmu, a mohou být aplikovány i na polypeptidy neznámé struktury.

S použitím výše zmíněných metod může odborník identifikovat a/nebo připravit širokou škálu polypeptidů, které jsou v podstatě homologní s aminokyselinovými zbytky 22 až 281 SEQ ID NO:2, nebo jejich alelickými variantami a které zachovávají schopnost modulovat energetickou rovnováhu nebo jiné vlastnosti proteinu divokého typu. Takové polypeptidy mohou obsahovat navíc některé aminokyseliny, například další kolagenové repetice Gly-Xaa-Pro nebo Gly-XaaXaa typu. Takové polypeptidy mohou také obsahovat další polypeptidové segmenty, které byly obecně popsány výše.

Polypeptidy podle vynálezu včetně proteinů plné délky, jejich fragmentů a fúzních proteinů mohou být produkovány v geneticky upravených hostitelských buňkách běžně známými způsoby. Vhodné hostitelské buňky jsou takové, které mohou být transformovány nebo transfektovány exogenní DNA a které rostou v kultuře. Takovými buňkami mohou být buňky bakterií, hub a některé kultivované buňky vyšších eukaryot. Eukaryotické buňky, zvláště kultury buněk mnohobuněčných organizmů, jsou zvláště vhodné. Techniky pro manipulaci s klonovanou DNA a pro vnášení exogenní DNA do různých typů hostitelských buněk jsou popsány v Sambrook et q/, Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Ny, 1989 a Ausbel et al., (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, lne., NY 1987. Obecně, DNA sekvence kódující zsig37 polypeptid podle navrhovaného vynálezu je operativně spojena s dalšími genetickými elementy, nezbytnými pro expresi zmíněné sekvence, obecně zahrnujícími promotor a terminátor transkripce uvnitř expresního vektoru. Vektor také obvykle obsahuje jeden nebo více selekčních markérů a jeden nebo více počátků replikace, ačkoliv odborníci vědí, že u některých systémů jsou selekční markéry umístěny na zvláštních vektorech a replikace exogenní DNA může být zajištěna integrací vektoru do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, selekčních markérů, vektorů a dalších elementů je věcí rutiny a zkušeností odborného pracovníka. Množství • · · ♦ · * • ♦·

···

takových elementů je popsáno v literatuře a běžně dostupné od komerčních dodavatelů.

Aby bylo možné nasměrovat zsig37 do sekreční dráhy hostitelské buňky, musí expresní vektor obsahovat také operativně připojenou sekreční signální sekvenci (známou také jako vedoucí sekvenci, signální sekvenci, prepro-sekvenci nebo presekvenci). Sekreční signální sekvence může být bud’ vlastní signální sekvence zsig37 polypeptidů, nebo může být odvozena od signální sekvence jiného sekretovaného proteinu (např. t-PA), nebo může být syntetizována de novo. Sekreční signální sekvence je připojena k DNA sekvenci polypeptidů zsig37 ve správném čtecím rámci. Sekreční signální sekvence je obvykle umístěna v 5'pozici vzhledem k DNA sekvenci kódující polypeptid, který je předmětem našeho zájmu, ačkoliv některé signální sekvence mohou být umístěny kdekoliv v DNA sekvenci, určené pro sekreci (viz. např. Welch et al., U.S. patent No. 5,037,743; Holland et al., U.S. patent No. 5,143,830), Naopak signální sekvence polypeptidů zsig37 (aminokyseliny 1-21 nebo 1-25 SEQ ID NO:2) může být stejným způsobem použita pro zajištění sekrece alternativního proteinu.

Sekreční signální sekvence polypeptidů podle navrhovaného vynálezu mohou být použity také pro směrování jiných polypeptidů do sekreční dráhy hostitelských buněk. Předmětem navrhovaného vynálezu jsou i takové fúzní polypeptidy. Signální fúzní polypeptid může být připraven tak, že je běžně známými a zde popsanými technikami sekreční signální sekvence odvozená od aminokyselinových zbytků 1-22 nebo 1-25 SEQ ID NO:2 operativně spojena s jiným polypeptidem. Sekreční signální sekvence fúzních polypeptidů podle vynálezu je s výhodou Nterminálně fúzována s jiným peptidem aby směrovala tento jiný peptid do sekreční dráhy hostitelské buňky. Takové konstrukty nacházejí v oboru nesčetně uplatnění. Například, tyto nové fúzní konstrukty sekrečních signálních sekvencí mohou řídit sekreci aktivní složky proteinu, který za normálních okolností není sekretován, například receptoru. Takové fúzní konstrukty mohou být použity pro zajištění sekrece peptidů in vivo i in vitro.

Savčí buňky pěstované v kultuře jsou pro potřeby navrhovaného vynálezu vhodnými hostitelskými buňkami. Způsob vnášení exogenní DNA do savčích hostitelských buněk zahrnuje transfekci usnadněnou fosforečnanem vápenatým (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporaci (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845, 1982), transfekci zprostředkovanou DEAEdextranem (Ausbel et al., eds. Current protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, lne. NY, 1987), transfekci zprostředkovanou lipozómy (Hawley40 • 99·· 99 9999 ·· ·♦

9 · * 9 9 9 9 «

9 9* 99 9 9 W · ·

999 9 9*··9 9

9 9999 9*99

999 999 99 99 99 99

Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993) a vnášení pomocí virových vektorů (A. Miller and G. Rosman, BioTechniques 7: 980-90, 1989; Q. Wang and M. Finer, Nátuře Med. 2: 714-16, 1996). Produkce rekombinantních polypeptidů v kultuře savčích buněk je popsána například v Levinson et al., U.S. patent No. 4,713,339; Hagen et al., U.S. patent No. 4,784,950; Palmiter et al., U.S. patent No. 4,579,821 a Ringold, U.S. patent No. 4,656,134. Vhodnými savčími buňkami, pěstovanými v kultuře, jsou například COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651)), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC NO. CRL 1573; Graham et al., J. Gen, Virol, 36: 5972, 1977) a vaječníkové buňky čínského křečka (Chinese hamster ovary cells, například CHO-K1; ATCC No. CCL 61). V oboru jsou známé i další vhodné buněčné linie, dostupné ve veřejných sbírkách jako je například American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Obecně jsou vhodné silné transkripční promotory, například SV-40 promotor nebo promotor cytomegaloviru. Viz. například U.S. patent No. 4,956,288. Dalšími vhodnými promotory jsou metalothioneinové geny (U.S. patenty 4,579,821 a 4,601,978) a hlavní adenovirový pozdní promotor.

Selekčním faktorem, který je obecně nejčastěji používán pro selekci kultivovaných savčích buněk, do kterých byla vnesena exogenní DNA, je selekce na některá léčiva. Buňky, do kterých byla vnesena exogenní DNA se obvykle nazývají „transfektanty“. Buňky, které byly kultivovány v přítomnosti selekčního agens a jsou schopné přenášet gen, který je předmětem našeho zájmu, na potomstvo, se nazývají „stabilní transfektanty“. Výhodným selekčním markérem je gen kódující rezistenci k antibiotiku neomycinu. Selekce je poté prováděna v přítomnosti antibiotika neomycinového typu, například G-418 a podobně. Selekční systémy mohou být použity také pro zvýšení úrovně exprese genu, který je předmětem našeho zájmu, a to procesem zvaným amplifikace. Amplifikací se zde rozumí kultivace transfektantů v přítomnosti nízké koncentrace selekční látky a následné zvýšení koncentrace selekční látky za účelem selekce buněk, které produkují vysoké množství produktů cizorodých, vnesených genů. Zvláště vhodným selekčním markérem pro amplifikací je dihydrofolát reduktáza, která buňkám uděluje rezistenci k methotrexátu. Ovšem mohou být použity i jiné rezistenci kódující geny (např. gen pro rezistenci k hygromycinu, geny pro mnohočetnou rezistenci („multi-drug resistance“), gen pro puromycin acetyltransferázu). Jiné markéry, které pozmění fenotyp buněk, například zelený fluorescenční protein, povrchové buněčné proteiny jako CD4, CD8, MHC I, placentální alkalická fosfatáza a podobně, mohou být použity pro vytřídění • · · * · · ·· 44 « · 9 4 4 4 4 4

444 4 4 · · J · J • · 4 4 4 9 4 4 4 4

4 4 4 9 4 4 9 4

499 44 ·· 44 94 transfektantů od netransfektovaných buněk metodami jako je například FACS nebo separace pomocí magnetických kuliček.

Jako hostitelské buňky mohou být použity i jiné buňky vyšších eukaryot včetně buněk rostlin, hmyzu a ptáků. Použití Agrobacterium rhizogenes ve funkci vektoru pro vnášení expresních genů do rostlinných buněk bylo popsáno Sinkar et al., JL Biosci, (Bangalore) 1±: 47-58, 1987. Transformaci hmyzích buněk a produkci cizorodých polypeptidů v těchto buňkách popisuje Guarino et al., U.S. patent No. 5,162,222 a WIPO publication WO 94/06463. Hmyzí buňky mohou být infikovány rekombinantním bakulovirem, obvykle odvozeným od Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Viz. King and Possee, The Baculovirus Expressioji System; A Laboraíoty Guide, London, Chapman & Halí; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratorv Manual, New York, Oxford University Press., 1994; Richardson C.D., Ed. Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Další způsob přípravy rekombinantních zsig37 bakulovirů využívá systém založený na transpozónech, popsaný Luckowem (Luckow et al., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Tento systém, využívající transferových vektorů, je prodáván v sadě Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Tento systém využívá transferového vektoru pFastBacl™ (Life Technologies) obsahujícího transpozon Tn7 k přenosu DNA kódující zsig37 polypeptid do bakulovirového genomu, udržovaného v buňkách e. coli ve formě velkého plazmidu nazývaného „bacmid“. Viz. Hill-Perkins and Possee, J. Gen. Virol, 71: 971-6, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol, 75: 1551-6, 1994 a Chazenbalk and Rapoport, J. Biol, Chem, 270: 1543-9, 1995. Kromě toho mohou transferové vektory obsahovat také „in-frame“ (zachovávající správný čtecí rámec) fúzi s DNA kódující na C- nebo N- konci exprimovaného zsig37 polypeptidu nějaký rozpoznatelný epitop, například Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985). Pomocí v oboru známých technik jsou buňky E. coli transformovány transferovým vektorem obsahujícím zsig37 a poté jsou testovány na přítomnost bacmidu s přerušeným lacZ genem, indikátorem rekombinantního bakuloviru. Bacmidová DNA, obsahující rekombinantní bakulovirový genom je běžným způsobem izolována a použita pro transfekci buněk Sodoptera frugiperda, například buněčné linie Sf9. Výsledkem je produkce rekombinantního viru exprimujícího zsig37. Zásobní rekombinantní virus je připraven v oboru běžně známými metodami.

Rekombinantní virus je použit pro infekci hostitelských buněk, typicky buněčné linie odvozené od Sodoptera frugiperda. Pro obecné informace viz. Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Přinciples and Applications of Recombinant

4 ··· 4 ··«« »·· «

99 • 4 4 4 9 · · · · « ♦ 4 4 4 4

4 4 4 4

44 44

DNA. ASM Press, Washington D.C., 1994. Další vhodnou buněčnou linii je High FiveO™ (Invitrogen), odvozená od Trichoplusia ni (U.S. patent #5,300,435). Pro pěstování a udržování buněčných linií jsou používána komerčně dostupná bezsérová média. Vhodnými médii jsou Sf900 II™ (Life Technologies) nebo ESF 921™ (Expression Systems) pro Sf9 buňky a Ex-cell0405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) nebo Express FiveO™ (Life Technologies) pro T. ni buňky. Buňky jsou inokulovány v konečné koncentraci přibližně 2-5 χ 10⁵ a jsou pěstovány až do denzity 1-2 χ 10⁶ buněk. V tomto okamžiku je přidán zásobní roztok rekombinantního viru při multiplicitě infekce (MOI) 0,1 až 10, typicky okolo 3. Použité postupy jsou obecně vysvětleny v běžně dostupných laboratorních příručkách (King and Possee, ihitU- O'Reilly et al., ibid.; Richardson, ibid.). Následná purifikace polypeptidu zsig37 ze supernatantu může být provedena metodami, které jsou popsány zde.

Buňky hub, včetně buněk kvasinek, mohou být také použity podle navrhovaného vynálezu. Zvláště vhodnými kvasinkami pro tento účel jsou Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Pichia methanolica. Metody transformace buněk Saccharomyces cerevisiae exogenní DNA a produkce rekombinantních polypeptidů v těchto kvasinkách popisují například Kawasaki U.S. patent No. 4,599,311; Kawasaki et al., U.S. patent No. 4,931,373, Brake, U.S. patent No. 4,870,008; Welch et al., U.S. patent No.5,037,743; a Murray et al., U.S. patent No. 4,845,075. Transformované buňky jsou selektovány na základě fenotypu, určeného selekčním markérem, kterým obvykle bývá rezistence k nějakému léčivu nebo schopnost růst v nepřítomnosti některé živiny (například leucinu). Preferovaným vektorovým systémem pro použití u Saccharomyces cerevisiae je POTÍ vektorový systém popsaný v Kawasaki et al., U.S. patent No. 4,931,373, který umožňuje selekci transformovaných buněk na základě růstu v médiu s obsahem glukózy. Promotory a terminátory, vhodné pro použití v kvasničných systémech jsou promotory a terminátory genů pro glykolytické enzymy (viz. například Kawasaki, U.S. patent No. 4,599,3 1 1; Kingsman et al., U.S. patent No.4,615,974 a Bitter, U.S. patent No. 4,977,092) a genů pro alkohol dehydrogenázu. Viz. také U.S. patenty 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 a 4,661,454. V oboru jsou známé i transformační systémy pro další kvasinky včetně Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii a Candida maltosa.Niz.. například Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 a Cregg, U.S. patent No. 4,882,279. Buňky plísně rodu Aspergillus mohou být využity způsobem podle McKnight et al., U.S. patent No. 4,935,349. Způsoby

ΦΦΦΦ φφ φφφφ φ φ · φφφφ φ φ · φφφφ φφφ φ φφφ φφ φ φ φ φφφφ φφφφ φφφ φφφ «φφφ φφ φφ transformace Acremonium chrysogenum jsou popsány v Sumino et al., U.S. patent No. 5,162,228. Způsoby transformace buněk Neurospora popisuje U.S. patent No. Lambowitz, U.S. patent No. 4,486,533.

Použití Pichia methanolica jako hostitelského organizmu pro produkci rekombinantních proteinů je popsáno ve WIPO Publications WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 a WO 98/02565. DNA molekuly pro transformaci Pichia methanolica jsou obvykle připraveny jako dvojřetězcové cirkulární plazmidy, které jsou s výhodou před transformací linearizovány. Pro produkci polypeptidů v Pichia methanolica je s výhodou, jsou-li použitý promotor a terminátor transkripce na plazmidu promotorem resp. terminátorem některého z P. methanolica genů, například P. methanolica genu pro využití alkoholu („alcohol utilization gene“ AUG1 nebo AUG2). Dalšími vhodnými promotory jsou promotory genů pro dihydroxyaceton syntázu (DHAS), formát dehydrogenázu (FMD) a katalázu (CAT). Pro usnadnění integrace DNA do hostitelského chromozómu je s výhodou, je-li segment DNA, určený pro expresi v plazmidu na obou koncích ohraničen sekvencemi hostitelské DNA. Selekčním markérem, vhodným pro použití v P. methanolica je P. methanolica ADE2 gen, kódující fosforibosyl-5aminoimidazol karboxylázu (AIRC; EC 4.1.1.21), umožňující ade2 pozitivním hostitelským buňkám růst bez přítomnosti adeninu. Pro velkokapacitní průmyslové využití, kdy je žádoucí minimalizovat použití methanolu, je s výhodou používat hostitelské buňky, ve kterých byly oba dva geny pro využití methanolu (AUG1 a AUG2) deletovány. Pro výrobu sekretovaných proteinů je s výhodou používat hostitelské buňky, deficientní v genech pro vakuolární proteázu (PEP4 a PRB1). Pro usnadnění vstupu plazmidu, obsahujícího DNA kódující polypeptid, který je předmětem našeho zájmu, do buněk P. methanolica je používána metoda elektroporace. Je výhodné transformovat buňky P. methanolica elektroporací s použitím exponenciálně klesajícího pulzního elektrického pole o síle od 2,5 do 4,5 kV/cm, nejraději 3,75 kV/cm a s časovou konstantou (τ) od 1 do 40 milisekund, nejraději 20 milisekund.

Také prokaryotické buňky včetně buněk E. coli, Bacillus a jiných rodů jsou pro použití podle vynálezu vhodnými hostitelskými buňkami. Techniky transformace těchto hostitelských buněk a exprese cizorodé DNA v těchto buňkách jsou obecně známé a jsou popsány například v Sambrook et al., ibid. Při expresi polypeptidu zsig37 v bakteriálních buňkách, například v E. coli, je obvykle polypeptid shromažďován v cytoplazmě, typicky ve formě nerozpustných granulí, nebo může být bakteriální sekreční cestou směřován do periplazmatického prostoru. V prvním případě musí být buňky lyžovány a granule jsou získávány a denaturovány • · · · · ·

44 • · ·♦ • · • · ··· ♦·* • · · • 4 · • · «

4 9 4

44

4 4 ·

4 4 4

94 například pomocí guanidinisothiokyanátu nebo močoviny. Denaturovaný polypeptid může být poté znovu renaturován a dimerizován například dialýzou proti roztoku močoviny a směsi redukovaného a oxidovaného glutathionu a následně dialýzou proti pufrovanému roztoku soli. Ve druhém případě je protein získáván z periplazmatického prostoru v rozpustné a funkční formě po rozbití buněk (například sonikací nebo osmotickým šokem), kdy je obsah periplazmatického prostoru uvolněn do prostředí. V tomto případě je možné se vyhnout denaturaci a opětné renaturaci proteinu.

Transformované nebo transfektované hostitelské buňky jsou kultivovány obvyklým způsobem v kultivačním médiu s obsahem živin a dalších složek nezbytných pro růst vybraných hostitelských buněk. Odborníkům je jistě známa celá řada vhodných médií včetně definovaných médií a komplexních médií, která obecně obsahuji zdroj uhlíku, zdroj dusíku, esenciální aminokyseliny, vitamíny a minerály. Média mohou dále v případě potřeby obsahovat takové složky jako například růstové faktory nebo sérum. Kultivační médium je obvykle selekčním médiem pro buňky obsahující exogenní DNA. Příkladem může být selekční růst v přítomnosti nějakého antibiotika nebo naopak v nepřítomnosti některé esenciální živiny, kdy je neschopnost růstu v nepřítomnosti této živiny komplementována selekčním markérem přítomným na expresním vektoru nebo kotransfektovaným do hostitelské buňky spolu s expresním vektorem.

Exprimované rekombinantní polypeptidy zsig37 (nebo chimérní zsig37 polypeptidy) mohou být purifikovány s použitím frakcionace a/nebo běžnými purifikačními metodami a s použitím běžných médií. Jako metody frakcionace vzorků mohou být použity precipitace amonium sulfátem a kyselá nebo chaotropní extrakce. Purifikace může zahrnovat například následující kroky: rozdělení podle velikosti na hydroxyapatitové koloně, FPLC a HPLC na reverzní fázi. Mezi vhodná chromatografická média patří derivatizované dextrany, agaróza, celulóza, polyakrylamid, speciální silikáty a podobně. Zvláště vhodné jsou PEI, DEAE, QAE a Q deriváty. Dalšími příklady chromatografických médií jsou média derivatizovaná fenylovými, butylovými nebo oktylovými skupinami, například Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) a podobně; nebo polyakrylátové pryskyřice jako Amberchrom CG 71 (Toso Haas) a podobně. Vhodnými pevnými nosiči jsou skleněné kuličky, pryskyřice na bázi křemičitanů či celulózy, agarózové kuličky, zesíťované agarózové kuličky, polystyrénové kuličky, zesíťované polyakrylamidové pryskyřice a podobně, tj. látky, které jsou za používaných podmínek nerozpustné. Tyto nosiče mohou být modifikovány

Μ· « · · · φ Φ Φ ♦ · Φ · • Φ Φ Φ · Φ Φ • Φ Φ Φ Φ Φ Φ » Φ Φ Φ · Φ ΦΦ Φ φ Φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ

ΦΦΦ ΦΦΦ ΦΦΦΦ ΦΦ ΦΦ reaktivními skupinami, které umožňují zachycení proteinů jejich aminoskupinami, karboxylovými skupinami, sulfhydrylovými skupinami, hydroxylovými skupinami a/nebo uhlovodíkovými řetězci. Příkladem modifikace zmíněných nosičů je aktivace kyanobromidem, N-hydroxysukcinimidem, epoxidová aktivace, sulfhydrylová aktivace, hydrazidová aktivace a použití karboxy a aminoderiváty karbodiimidů. Tato a další pevná média jsou v oboru dobře známá a široce používaná a jsou dostupná od komerčních dodavatelů. Také způsoby navázání receptorových polypeptidů na pevné nosiče jsou v oboru známé. Výběr média a konkrétní způsob modifikace jsou věcí rutiny a konkrétních potřeb a jsou zčásti závislé na zvoleném pevném nosiči. Viz. například Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988. Polypeptidy podle vynálezu mohou být izolovány na základě znalostí jejich strukturních a vazebných vlastností. Například IMAC chromatografie (chromatografie adsorpcí na imobilizované kovové ionty) může být použita pro purifikaci proteinů bohatých histidinem nebo proteinů majících His-afinitní sekvenci (tzv. His-tag). Krátce, gel je nejprve nabit dvojmocnými kovovými ionty za vzniku chelátu (E. Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). Proteiny bohaté histidinem jsou poté na tuto matrici adsorbovány, a to s různou afinitou v závislosti na použitých kovových iontech, a poté jsou eluovány kompetitivní elucí, tj. snížením pH nebo pomocí silných chelatačních činidel. Mezi další způsoby purifikace patří purifikace glykosylovaných proteinů lektin-afinitní chromatografii a iontoměničovou chromatografii (Methods in Enzymol.. Vol. 182, „Guide to Protein Purification“, M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). V dalším z výhodných provedení vynálezu je připraven fúzní polypeptid obsahující polypeptid, který je předmětem našeho zájmu, a afinitní skupinu (například, maltóza-vazebný protein, FLAG, Glu-Glu, imunoglobulínovou doménu ..). Konstrukce takového fúzního polypeptidu velmi usnadní purifikaci, což bude podrobněji diskutováno v kapitole „Příklady provedení vynálezu“.

S výhodou mohou být použity metody opětovného složení proteinu po denaturaci a případně i jeho reoxidace. Je s výhodou purifikovat protein na čistotu >80 %, ještě raději >90 %, ještě raději >95 % a vůbec nejvhodnější je získat protein ve farmaceuticky čistém stavu, tj. v čistotě větší než 99 % s ohledem na kontaminující makromolekuly, především jiné proteiny nebo nukleové kyseliny, a zcela bez přítomnosti infekčních nebo pyrogenních agens. Je s výhodou, je-li protein v podstatě bez příměsí dalších proteinů, především proteinů živočišného původu.

··· · ·· ··* · • fe fefe fe · · · · · · · fefefe fefe · · » ♦ · fefefe · fe·· · · · • · fefe·· · · · · fefefe ··♦ ·· ·· ·· ··

Polypeptidy zsig37 i jejich fragmenty mohou být připraveny také chemickou syntézou. Takové zsig37 polypeptidy mohou být monomerní nebo multimerní, glykosylované nebo neglykosylované, pegylované (t.j. modifikované polyethylenglykolem za účelem snížení jejich antigenicity, pozn. překladatele) nebo nepegylované a mohou či nemusí obsahovat iniciační methioninový zbytek.

Pro purifikací zsig37 polypeptidů může být použita také metoda vazby ligandu polypeptidem, například zisg37 vazebným polypeptidem. Polypeptid je imobilizován na pevném nosiči, například skleněných kuličkách, agaróze, zesíťované agaróze, celulózních pryskyřicích, křemenných pryskyřicích, polystyrénu, zesíťovaném polyakrylamidu a podobných materiálech, které jsou v použitých podmínkách stabilní. Metody vazby polypeptidů na pevný nosič jsou v oboru známé a patří k nim například aktivace brómkyanem, aktivace Nhydroxysukcinimidem, epoxidem, sulfhydrylová aktivace a hydrazidová aktivace. Výsledné médium je obvykle plněno do kolony a tekutinou, obsahující ligand, je kolona jednou nebo několikrát promyta, čímž je umožněna vazba ligandu na vážící polypeptid. Ligand je poté z kolony vymýván změnou koncentrace solí, chaotropní látkou (například guanidin HCI) nebo změnou pH za účelem rozrušení vazby ligand-receptor.

S výhodou může být použit systém který využívá vazby ligand-receptor (nebo protilátky, některého z párů komplement/anti-komplement) a komerčně zařízení (BIAcore™, Pharmacia Biosenzor, Piscataway, dostupného biosenzorického NJ). Takový receptor, protilátka, jedna ze složek páru komplement-anti-komplement, nebo fragment je imobilizován na povrchu receptorového čipu. Použití takového přístroje je popsáno v Karlsson, J, Immunol, Methods 145: 229-40, 1991 a Cunningham and Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Takový receptor, protilátka, jedna ze složek páru komplement/anti-komplement, nebo fragment je kovalentně navázán s použitím aminové nebo sulfhydrylové vazby na dextranová vlákna která jsou přichycena na zlatý film v průtokové komoře. Testovaný vzorek prochází skrze průtokovou komoru. Je-li ligand, epitop nebo druhý člen páru komplement/anti-komplement přítomen ve vzorku, naváže se na imobilizovaný receptor, protilátku nebo první člen páru komplement/anti-komplement a způsobí změnu refrakčního indexu média, která je zachycena jako změna povrchové plazmonové rezonance zlatého filmu. Tento systém umožňuje výpočet vazebné afinity a stanovení stechimetrie vazby.

Ligand-vážící polypeptidy mohou být použity i v dalších testovacích systémech. Patří sem například Scatchardova analýza pro stanovení vazebné afinity (viz. Scatchard, An, NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) a kalorimetrické testy • · · · · · • ·· · · · · · ·«· · · · · · · · ··· · · · · 9 9 ·

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 99 (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).

Polypeptidy zsig37 mohou být také použity pro přípravu protilátek, které specificky váží zsig37 polypeptidy, peptidy či epitopy. Způsoby přípravy polyklonálních nebo monoklonálních protilátek jsou odborníkům dobře známé (viz. například Sambrook et <?/. Molecular Cloning. A Laboratorv Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Hurrell, J.G.R., Ed. Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications. CRC Press, lne., Boča Raton, FL, 1982).

Polyklonální protilátky mohou být připraveny inokulací celé řady teplokrevných živočichů jako jsou koně, krávy, kozy, ovce, psi, kuřata, králíci, myši, křečci, morčata a krysy, stejně jako transgenních zvířat jako transgenních ovcí, krav, koz nebo prasat. Protilátky mohou být exprimovány také v kultuře savčích nebo hmyzích buněk nebo v modifikované formě v kvasinkách nebo houbách. Polypeptid zsig37 nebo jeho fragment slouží jako antigen (imunogen), kterým je živočich zaočkován a který vyvolá imunitní odpověď. Vhodnými antigeny jsou polypeptid zsig37 kódovaný SEQ ID NO:2 počínaje aminokyselinou 22 a konče aminokyselinou 281, dále zsig37 kódovaný SEQ ID NO:2 počínaje aminokyselinou 26 a konče aminokyselinou 281 a nebo 9 až 281 fragment SEQ ID NO:2. imunogenicita zsig37 polypeptidu může být zvýšena použitím adjuvans, například hydroxidu hlinitého nebo kompletního nebo nekompletního Freundova adjuvans. Mezi polypeptidy, vhodné pro imunizaci patří také fúzní polypeptidy jako zsig37 polypeptid nebo jeho část fúzovaný s imunoglobulinem nebo s afinitní skupinou. Polypeptidovým imunogenem může být molekula plné délky a nebo jen její část. Je-li část polypeptidu natolik malá, že se podobá haptenu, je s výhodou navázat pro účely imunizace tento polypeptid k makromolekulárnímu nosiči jako je například KLH (hlavní klíšťový hemocyanin), BSA (hovězí sérový albumin) nebo tetanový toxoid.

Termín „protilátky“ tak jak je použit zde označuje polyklonální protilátky, afinitně purifikované polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a antigenvážící fragmenty jako F(ab')₂ a Fab proteolytické fragmenty. Dále se termín vztahuje na intaktní protilátky připravené metodami genového inženýrství, Fv fragmenty, jednořetězcové protilátky a podobně, stejně jako na syntetické antigen-vážící peptidy a polypeptidy. Protilátky ne-lidského původu mohou být humanizovány „naroubováním“ pouze CDR části na „kostru“ lidského původu, tj. variabilní doména je ne-lidského původu a konstantní části protilátky jsou lidské. Případně mohou být ještě exponované části variabilní oblasti zaměněny tak aby se • · • 9 ···· • 9 9 9 ·

9 9 9 ·

9 9 9 9 9 · 9 9 9

• 99 *

999 • 9 podobaly lidským, kdy je výsledkem tzv. „dýhovaná“ protilátka. V některých případech mohou mít humanizované protilátky některé aminokyseliny ne-lidského původu v jinak lidské variabilní doméně, což může zvýšit žádoucí vazebné charakteristiky. Díky humanizovaným protilátkám může být prodloužen biologický poločas a je snížena možnost nežádoucí imunitní reakce po podání lidskému pacientu. Dalšími technikami přípravy nebo výběru protilátek, vhodných pro použití podle vynálezu, jsou in vitro expozice lymfocytů proteinu nebo peptidu zsig37 a selekce protilátkových knihoven ve fágových nebo podobných vektorech (například pomocí imobilizoavných nebo značených zsig37 proteinů nebo peptidů.

Protilátky jsou definovány jako specificky vážící jestliže: 1) vykazují prahovou úroveň vazebné aktivity a/nebo 2) nevykazují signifikantní zkříženou reaktivitu s příbuznými polypeptidovými molekulami, protilátky podle vynálezu jsou specificky vážící jestliže váží zsig37 polypeptid, peptid nebo epitop s vazebnou afinitou (K_a) 10 ⁶ mol'¹ a větší, s výhodou pak 10⁷ mol'¹ a větší, ještě raději 10 ⁸mol'¹ a větší a vůbec nejraději 10⁹ mol'¹ a větší. Vazebná afinita protilátky může být snadno stanovena některou ze známých metod, například Scatchardovou analýzou (Scatchard, Ann. Ny Acad. Sci, 51: 660-672, 1949).

Protilátky podle vynálezu jsou dále specificky vážící, pokud nevykazují statisticky významnou zkříženou reaktivitu s příbuznými polypeptidovými molekulami, například pokud při western blot analýze detekují zsig37 polypeptid, ale nikoliv příbuzné polypeptidy (Ausbel et al., ibid.). Mezi známé příbuzné polypeptidy patří další členové této proteinové rodiny jako například Acrp30 (SEQ ID NO.3), polypeptidy zobrazené v porovnávací tabulce na obrázku 1 a podobně. V případě potřeby může skupina příbuzných polypeptidů zahrnovat také orthology a mutantní lidské zsig37 polypeptidy. Navíc mohou být protilátky „testovány proti“ známým příbuzným polypeptidům za účelem izolace populace protilátek, které specificky váží jen polypeptidy podle vynálezu. Například protilátky připravené proti lidským zsig37 polypeptidům jsou adsorbovány na příbuzné polypeptidy, navázané na nerozpustný nosič; protilátky specificky vážící lidské zsig37 polypeptidy za určitých podmínek (odpovídající pufr) protečou kolonou aniž by se na nosiči s navázaným polypeptidem zachytily. Tato metoda umožňuje izolaci polyklonálních a monoklonálních protilátek, které nevykazují zkříženou reaktivitu s blízce příbuznými polypeptidy (Antibodies: A Laboratory manual. Harlow and Lané (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunologv, Cooligan et q/. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, lne., 1995). Metody izolace a testování specifických ·« ····

9···

9 9 9 9 9 9 « · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

99 99 99 protilátek jsou v oboru dobře známé (viz. Fundamental Immunology. Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding J.W. (eds.), Academie Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann, Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984). Reprezentativními příklady zmíněných metod jsou například: souběžná imunoelektroforéza, radioimmunoassay, radioimunoprecipitace, ELISA, dot blot nebo western blot, inhibiční nebo kompetiční testy a „sandwich assay“.

Geny kódující polypeptidy s potenciálními zsig37 vazebnými doménami, „vazebné proteiny“, mohou být získány náhodným nebo řízeným prohledáváním fágových („phage dispaly“ - display knihovny jsou specializované knihovny kde fág protein odpovídající části cizorodé DNA, kterou nese, exprimuje na svém povrchu a například reakcí s odpovídající protilátkou lze snadno stanovit který klon nese požadovanou DNA, pozn. překladatele) nebo bakteriálních (např. E. coli) peptidových knihoven. Nukleotidové sekvence, kódující polypeptidy mohou být získány celou řadou způsobů, například náhodnou mutagenezí nebo syntézou náhodných polynukleotidů. Alternativně mohou být připraveny také omezené fágové knihovny (constrained phage display library). Tyto knihovny mohou být dále použity pro vyhledávání peptidů, které interagují se známým cílem, kterým může být protein nebo polypeptid, například ligand nebo receptor, biologická ěi syntetická makromolekula, nebo organická nebo anorganická látka. Techniky přípravy takových peptidových knihoven a vyhledávání v nich jsou odborníkům známé (Ladner et. al., U.S. patent No. 5,223,409; Ladner et. al., U.S. patent No.5,403,484; Ladner et. al., U.S. patent No.4,946,778 a Ladner et. al., U.S. patent No.5,571,698) a peptidové knihovny (peptide display library), stejně jako soupravy pro vyhledávání v takových knihovnách jsou dostupné komerčně například od firem Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen lne. (San Diego, CA), New England Biolabs, lne. (Beverly, MA) a Pharmacia LKB Biotechnology lne. (Piscataway, NJ). Za účelem identifikace proteinů vážících zsig37 jsou peptidové knihovny prohledávány pomocí zsig37 sekvencí, popsaných zde. Tyto „vazebné proteiny“, interagující s polypeptidy zsig37 mohou být použity ve funkci protilátek, pro značení buněk; pro izolaci homologních polypeptidů metodou afinitní purifikace; mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léčivy, toxiny, radionuklidy a podobně. Zmíněné vazebné proteiny mohou být použity také v analytických metodách, například pro prohledávání expresních knihoven a testování neutralizační aktivity. Zmíněné vazebné proteiny mohou být použity i v diagnostice pro stanovení hladiny cirkulujících polypeptidů; pro detekci nebo kvantifikaci rozpustných polypeptidů coby ukazatele skrytého patologického jevu •0 ···· ♦

• 0000 • · 0 * 000 • · • e ··· ··· • · 0

000 • 00 · • 9 9 9 «· 0« ·· 00 • 0 0 0 • · · · « 0 0 ·

0 0 0

00 nebo onemocnění. Poločas těchto vazebných proteinů lze zvýšit konjugací. Jejich biologické vlastnosti mohou být pro použití ve funkci agonistů nebo antagonistů modifikovány dimerizací nebo multimerizací. Vazebné peptidy mohou být testovány proti známým příbuzným polypeptidům tak jak to bylo popsáno výše. Protilátky proti zsig37 a vazebné proteiny vážící zsig37 mohou být použity pro značení buněk, které zsig37 exprimují; pro izolaci zsig37 metodou afinitní purifikace, v diagnostice pro stanovení hladiny cirkulujících zsig37 polypeptidů; pro detekci nebo kvantifikaci rozpustných zsig37 polypeptidů jako ukazatele nějaké patologie nebo onemocnění; v analytických metodách využívajících FACS; pro vyhledávání v expresních knihovnách, pro přípravu anti-idiotypových protilátek; ve funkci neutralizačních protilátek nebo antagonistů za účelem in vitro nebo in vivo blokování aktivity zsig37 polypeptidů, například modulace energetické rovnováhy. Mezi látky vhodné pro přímé značení patří radionuklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční značky, chemiluminiscenční značky, magnetické částice a podobně; Hlavními meziprodukty nepřímého značení bývají páry biotin/avidin nebo komplement/antikomplement. Navíc mohou být protilátky proti zsig37 nebo fragmentům zsig37 použity in vitro k detekci denaturovaných zsig3 7 polypeptidů nebo jejich fragmentů a to například metodou western blot nebo dalšími testy.

Protilátky nebo vazebné polypeptidy podle vynálezu mohou být také konjugovány s různými léčivy, toxiny, radionuklidy a podobně a tyto konjugáty mohou být použity pro in vivo diagnostiku nebo pro terapeutické účely. Polypeptidy nebo protilátky podle vynálezu mohou být například použity pro identifikaci nebo léčbu tkání nebo orgánů, které exprimují odpovídající anti-komplementární molekuly (například receptor nebo antigen resp.). Konkrétně mohou být polypeptidy zsig37 nebo anti-zsig37 protilátky nebo jejich biologicky aktivní fragmenty spojeny se snadno stanovitelnými nebo cytotoxickými molekulami a mohou být vpraveny do těla savce, jehož buňky, tkáně nebo orgány exprimují anti-komplementární molekuly.

Vhodné stanovitelné molekuly mohou být přímo nebo nepřímo navázány k molekule polypeptidu nebo protilátky a patří mezi ně radionuklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční značky, chemiluminiscenční značky, magnetické částice a podobně. Vhodné cytotoxické molekuly mohou být přímo nebo nepřímo navázány k molekule polypeptidu nebo protilátky a patří mezi ně bakteriální nebo rostlinné toxiny (například záškrtový toxin, exotoxin bakterií rodu Pseudomonas, ricin, abrin a podobně), stejně jako terapeutické radionuklidy jako například jód-131, rhénium-188 nebo yttrium-90 (přímo navázané k > · · 4 · 4 4 44 •••444 4® ·* ·· polypeptidu či protilátce nebo nepřímo navázané například prostřednictvím nějaké chelatační látky). Polypeptidy nebo protilátky mohou být také konjugované s cytotoxickými látkami jako je například adriamycin. Pro účely nepřímé vazby cytotoxické nebo stanovitelné molekuly může být tato molekula konjugována se členem páru komplement/anti-komplement, kde druhý člen páru je vázán s polypeptidem nebo protilátkou. Příkladem takového páru komplement/antikomplement, který je vhodný pro tyto účely, je pár biotin/streptavidin.

V dalším z provedení vynálezu mohou být použity fúzní proteiny polypeptid-toxin nebo protilátka-toxin pro cílenou inhibici nebo odstranění buněk či tkání (například při léčbě rakoviny buněk nebo tkání). Alternativně, má-li polypeptid více funkčních domén (například aktivační doménu nebo ligand vazebnou doménu a doménu rozpoznávající cílové místo), může být fúzní protein obsahující pouze doménu rozpoznávající cílové místo vhodný pro směrování rozpoznatelné molekuly, cytotoxické molekuly nebo komplementární molekuly k buňce nebo tkáni, která je předmětem našeho zájmu. V případech kdy fúzní proteiny obsahují pouze směrující doménu a komplementární molekulu může být s antikomplementární molekulou konjugována s nějakou snadno stanovitelnou nebo cytotoxickou molekulou. Takové fúzní proteiny, které obsahují jen směrující doménu a komplementární molekulu pak představují obecný směrovaný nosič pro tkáňově-specifické nebo buněčně-specifické směrování jakéhokoli obecného antikomplementárního konjugátu se snadno stanovitelnou nebo cytotoxickou molekulou. Biologicky aktivní polypeptidové nebo protilátkové konjugáty, popsané zde, mohou být podávány intravenózně, intraarteriálně, intraduktálně s DMSO, intramuskulárně, subkutánně, intraperitoneálně, ale také transdermálně elektrotransferem nebo perorálně či inhalační cestou.

Polynukleotidy kódující zsig37 polypeptidy jsou vhodné také pro genovou terapii v případě kdy je žádoucí zvýšit nebo naopak inhibovat aktivitu zsig37. Pokud je u savce gen pro zsig37 mutovaný nebo úplně chybí, může být do buněk tohoto savce gen pro zsig37 uměle vnesen. V jednom z provedení vynálezu je gen kódující zsig37 polypeptid vnesen in vivo do virového vektoru. Takovým vektorem může být atenuovaný nebo defektní DNA virus jako například (ale nikoliv výhradně) virus herpes simplex (HSV), papillomavirus, virus Epstein Barrové (EBV), adenovirus, adeno-asociovaný virus (AAV) a podobně.S výhodou jsou používány defektní viry, které úplně nebo alespoň téměř úplně postrádají virové geny. Defektní virus není po vstupu do buňky infekční. Používání defektních virových vektorů umožňuje vnesení virového vektoru do buněk ve specifické, lokalizované oblasti bez nebezpečí, že by vektor mohl infikovat ostatní buňky. Konkrétními • · • · ··· · • · · ·

příklady vektorů jsou defektní herpes virus 1 (HSV1) (Kaplitt et al., Molec. Cell Neurosci. 2: 320-330, 1991), atenuovaný adenovirový vektor popsaný v StradfordPerricaudet et al., J. Clin. Invest. 90: 626-630, 1992 a defektní adeno-asociovaný virový vektor (Samulski et al., J, Virol. 61: 3096-3101, 1987; Samulski et al., L. Virol. 63: 3822-3828, 1989). Tento seznam příkladů však v žádném případě není konečný.

V dalším z provedení vynálezu může být gen vnesen do retrovirového vektoru, jaké jsou popsány například v Anderson et al., U.S. patent No. 5,399,346; Mann et al., Cell 33: 153, 1983; Temin et al., U.S. patent No. 4,650,764; Temin et al., U.S. patent No. 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol. 62: 1 120, 1988; Temin et al., U.S. patent No. 5,124,263; Internatinal Patent Publication No. WO 95/07358, March 16, 1995, Dougherty et al. a Blood 82: 845, 1993.

Alternativně může být vektor do buněk vnesen in vivo lipofekcí s pomocí lipozómů. Pro přípravu lipozómů pro in vivo transfekci genu kódujícího markér mohou být použity syntetické kationtové lipidy (Felgner et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417, 1987; viz. Mackey et al., Proč, Nati. Acad. Sci. USA 85: 8027-8031, 1988). Použití lipofekce pro vnášení exogenních genů do specifických orgánů in vivo má některé praktické výhody. Jednou z oblastí těchto výhod je molekulární cílení lipozómů do specifických buněk. Je zřejmé, že cílená transfekce do konkrétních buněk představuje jednu z oblastí výhod. Je také zřejmé, že cílená transfekce do konkrétních buněk je zvláště výhodná v případě tkání heterogenních v zastoupení buněčných druhů, jako je například pankreas, játra, ledviny či mozek. Lipidy mohou být chemicky vázány s jinými molekulami za účelem cílení. S lipidy mohou být chemicky vázány za účelem cílení peptidy, například hormony nebo neurotransmitery, proteiny jako například antibiotika a také nepeptidové molekuly.

Je také možné vyjmout cílové buňky z těla, vnést vektor ve formě nahého DNA plazmidu do buněk a poté implantovat transfektované buňky zpět do těla. Nahý DNA vektor pro genovou terapii může být vnesen do požadovaných hostitelských buněk obecně známými metodami, například transfekci, elektroporací, mikroinjekcí, transdukcí, fúzí buněk, pomocí DEAE dextranu, kalcium fosfátové precipitace, nástřelu genu nebo transportéru DNA vektoru, viz. například Wu et al., J, Biol. Chem. 267: 963-967, 1992 a Wu et al., J. Biol, Chem, 263: 1462114624, 1988.

Antisense technika může být použita pro inhibici transkripce genu zsig37, jako například pro inhibici buněčné proliferace in vivo. Polynukleotidy, které jsou komplementární k části zsig37 kódující sekvence (například polynukleotidu • · • · · · • · 4 · · · · * · • 0 · · · «·· • « · · · · uvedeného jako SEQ ID NO:1), jsou navrženy tak, aby vázaly zsig37-kódující mRNA a inhibovaly tak translaci této mRNA. Takové antisense polynukleotidy se používají pro inhibici exprese genů kódujících zsig37 polypeptidy jak v buněčné kultuře, tak i v organizmu.

Dále mohou být navrženy transgenní myši exprimující zsig37 gen, nebo takové, které vykazují úplnou absenci funkce zsig37 genu, tzv. „knockout myši“ (Snouwaert et al., Science 257: 1083, 1992; Lowell et al., Nátuře 366: 740-42, 1993). Tyto myši mohou být použity pro studium zsig37 genu a jím kódovaného proteinu v systému in vivo.

Pro farmaceutické účely jsou proteiny podle vynálezu navrženy pro parenterální, především intravenózní nebo subkutánní, podávání běžnými způsoby. Intravenózní podávání je prováděno Bolusovou injekcí nebo infúzí v typických časových odstupech jedné nebo několika hodin. Obecně obsahují farmaceutické přípravky zsig37 protein v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem jako je například fyziologický roztok, pufrovaný roztok soli, 5% dextróza ve vodě a podobně. Přípravky mohou dále obsahovat jednu nebo několik pomocných látek, konzervační činidla, rozpouštědla, pufrační látky, albumin pro prevenci ztráty proteinů na povrchu lékovek atd. Způsoby přípravy takových farmaceutických prostředků jsou dobře známé a jsou popsány například v Remington, The Science and Practice of Pharmacv, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 19^th ed., 1995. Terapeutické dávky jsou obvykle stanoveny lékařem v souladu s obecnými zásadami a s přihlédnutím k povaze a závažnosti stavu, který je léčen, stavu pacienta atd. Stanovení dávky je v rámci běžných odborných znalostí. Vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které však nejsou v žádném případě limitující.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Rozšíření EST sekvence.

Nové polynukleotidy, kódující polypeptidy zsig37 podle vynálezu, byly nejprve identifikovány selekcí EST v EST databázi, na základě toho byla předpovězena sekvence proteinu a dále byly ve známých databázích proteinových sekvencí vyhledány sekretované proteiny, vykazující největší homologii s proteinovou sekvencí předpovězenou na základě EST. EST, které potenciálně kódují proteiny vykazující biologicky zajímavou homologii se známými sekretovanými proteiny byly identifikovány pro další studium. Byla nalezena jediná EST sekvence • · · · :φ · · e • · · · φ

• · · · « • · Φ · « φφφ φ φ ’ ι · · φ φ <

·· * · φφ kódující hypotetický protein homologní s proteinem specifickým pro adipocyty. Viz. například Scherer et al., J. Biol. Chem. 270(45): 26746-9, 1995. Klon, pravděpodobně obsahující odpovídající kódující sekvenci byl použit pro sekvenaci za účelem identifikace odpovídající cDNA. S použitím Invitrogen S.N.A.P.™ Miniprep kit (Invitrogen, Corp., San. Diego, CA) a podle instrukcí od výrobce bylo zpracováno 5 ml kultury pěstované přes noc v LB médiu s přídavkem 50 pg/ml ampicilinu. Templát byl sekvenován na DNA sekvenátoru ABIPRISM™ model 377 (Perkin-Elmer Cetus, orwalk, Ct.) s použitím ABI PRISM™ Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer Corp.) dle instrukcí od výrobce. Jako priméry pro sekvenování byly použity oligonukleotidy ZC695 (SEQ ID NO:5) a ZC694 (SEQ ID NO:6) komplementární k SP6 a T7 promotorům, obsaženým ve vektoru, který nese požadovanou DNA. K dokončení sekvenování daného klonu byly použity oligonukleotidy ZC13210 (SEQ ID NO:7), ZC13588 (SEQ ID NO:8), ZC13532 (SEQ ID NO:9), ZC13641 (SEQ ID NO:10),

ZC13586 (SEQ ID NO:11), ZC1365 1 (SEQ ID NO:12), ZC13622 (SEQ ID NO:13),

ZC13625 (SEQ ID NO:14), ZC13650 (SEQ ID NO.15), ZC13589 (SEQ ID NO:16),

ZC13624 (SEQ ID NO:17), ZC1353 1 (SEQ ID NO:18), ZC13587 (SEQ ID NO:19) a ZC13623 (SEQ ID NO:20). Sekvenační reakce byly prováděny v Hybaid OmniGene Temperature Cycling System (National Labnet Co., Woodbridge, NY). Pro analýzu dat byl použit SEQUENCHER™ 3.0 software (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Výsledná 2769 pb dlouhá sekvence je zde znázorněna jako SEQ ID NO:1. Porovnání původně odvozené EST sekvence se sekvencí SEQ ID NO.l ukázalo, že v celé sekvenci existuje jen v jednom páru baží nejednoznačnost (neznámá „N“ aminokyselina) a nebyly nalezeny žádné inzerce. Původně nejednoznačně určená aminokyselina tedy byla identifikována jako leucin. Mezi oběma odvozenými aminokyselinovými sekvencemi nebyl nalezen žádný posun čtecího rámce.

Příklad 2: Tkáňová distribuce.

S použitím Human Multiple Tissue Blots od firmy Clontech (Palo Alto, CA) byla provedena analýza metodou Northern blot. DNA sonda dlouhá 30 pb (ZC12447; SEQ ID NO:4), komplementární k 5' konci nukleotidové sekvence maturovaného proteinu, znázorněné jako SEQ ID NO:1, byla radioaktivně označena ³²P dle instrukcí od výrobce a s použitím T4 polynukleotid kinázy a „forward“ reakčního pufru (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Sonda byla purifikována na koloně NUCTRAP (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Pro prehybridizaci a jako • · hybridizační roztok pro Northern blot byl použit roztok EXPRESSHYB Clontech (Palo Alto, CA). Hybridizace byla prováděna přes noc při 50 °C a poté byly membrány promyty v 2x SSC a 0,1% SDS při 68 °C (asi o 5 °C méně než jaká je teplota tání). Byl objeven jeden transkript o velikosti asi 2,8 kb. Intenzita signálu byla nejvyšší v srdeční tkáni a v placentě, relativně méně intenzivní signál byl pozorován v ledvinách, vaječnících, nadledvinkách a v kosterním svalu. Ostatní testované tkáně vykazovaly signál velmi slabý.

Další Northern blot analýza byla provedena s použitím Gut Northern Tissue Blot. Byla použita mRNA z lidské adenokarcinomové buněčné linie SW480 (Clontech Palo Alto, CA), z tkáně lidského tenkého střeva (Clontech), z lidské žaludeční tkáně (Clontech), z lidské buněčné linie pocházející z hladké svaloviny střeva (Hism; ATCC No. CRL-1692; American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockwille, MD), z buněčné linie pocházející z normálního lidského tlustého střeva (FHC; ATCC No. CRL-1831; American Type Culture Collection) a z buněčné linie pocházející z normálního lidského zárodečného tenkého střeva (FHs74 Int.; ATCC No. CCL241; American Type Culture Collection).

Totální RNA byla z Hism, FHC a FHs74 Int. izolována kyselou guanidiovou metodou (Cheomczynski et al., Anal, Biochem. 162: 156-9, 1987). PolyA⁺ RNA byly odděleny z celkové RNA na koloně, zachycující polyA⁺ RNA (Aviv et al., Proč. Nati., Acad, Sci, ..UJSA^..69_: 1408-12, 1972). 2 pg polyA⁺ RNA z každého vzorku byly rozděleny elektroforézou v 1,5% agarózovém gelu v 2,2 M formaldehydu a fosfátovém pufru. RNA byla poté přes noc v roztoku 20x SSC přenesena na Nytran membránu (Schleicher and Schuell, Keene, NH). Blot byl poté opracován UV Stratalinker 2400 (Stratagene, La Jolla, CA) o energii 0,12 Joulů. Dále byla membrána tepelně opracována (1 hodina, 80 °C). Plná délka cDNA (SEQ ID NO:1) byla amplifikována metodou PCR a radioaktivně značena ³²P dCTP s použitím Redprime pellet kit (Ammersham, Arlington Heights, IL) dle instrukcí od výrobce. Blot byl hybridizován přes noc v EXPRESSHYB (Clontech) při teplotě 56 °C. Blot byl promyt při pokojové teplotě 2x SSC s 0,1% SDS, poté při 65 °C 2x SSC s 0,1% SDS a konečně při 65 °C 0,lx SSC s 0,1% SDS. Výsledky prokázaly, že zsig37 hybridizuje se všemi tkáněmi s výjimkou buněčné linie HISM z hladkého svalstva lidského střeva.

Příklad 3: Chromozomální mapování genu zsig37.

Pomocí PCR s použitím NIGMS Human/Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping Panel Number 2 (National Institute of General Medical Sciences, Coriell Institute of medical Research) byla stanovena poloha genu zsig37 v lidském genomu, a to v chromozómu 17, oblasti 17q25.2. Použitý panel se sestává z DNA izolované z 24 lidských/krysích hybridů somatických buněk, kde v každém z hybridů zůstává zachován jeden specifický lidský chromozóm a rodičovská DNA. Pro mapování zsig37 genu byly v 96 jamkové mikrotitrační destičce (Stratagene, La Jola, CA) připraveny 20 μΐ reakce a byl použit termální cyklovaě „RoboCycler Gradient 96“ (Stratagene). Každá z 27 PCR reakcí obsahovala 2 μΐ lOx KlenTaq PCR reactin buffer (Clontech Laboratorie, lne., Palo Alto, CA), 1,6 μΐ dNTP směsi (2,5 mM každý, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 μΐ primeru po smyslu čtení (SEQ ID NO:21), 1 μΐ primeru proti smyslu čtení (SEQ ID NO:22), 2 μΐ 7?eí//Load (research Genetics, lne.), 0,4 μΐ 50x Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, lne.), 25 ng DNA vždy z jednoho hybridního klonu nebo kontrolní DNA a ddHLO do 20 μΐ. Reakční směsi byly převrstveny stejným množstvím minerálního oleje a uzavřeny. PCR bylo prováděno za následujících podmínek: 5 minut denaturace při 95 °C, dále 35 cyklů zahrnujících 1 minutu denaturace při 95 °C, 1 minutu annealing (zchlazení při kterém dochází k nasednutí primeru na templátovou DNA, pozn. překl.) při 60 °C a 1,5 minuty dlouhou syntetickou fázi při 72 °C; celá PCR byla ukončena 1 cyklem 7 minut při 72 °C. Každá reakce byla rozdělena elektroforézou v 3% NuSieve GTG agarózovém gelu (FMC Bioproducts, Rockland, ME).

Příklad 4: Příprava savčích expresních vektorů zsig37NEE/pZP9 a zsig37CEE/pZP9.

Pro expresi polypeptidů zsig37 byly připraveny dva expresní vektory, zsig37NEE/pZP9 a zsig37CEE/pZP9, kde oba konstrukty byly navrženy tak aby exprimovaly zsig37 polypeptid mající na C-konci nebo N-konci sekvenci Glu-Glu.

zsig37NEE/pZP9

S použitím templátové DNA popsané v příkladu 1 a oligonukleotidových PCR primerů ZC15040 (SEQ ID NO:24) a ZC15033 (SEQ ID NO:25) byl připraven 800 pb dlouhý PCR fragment zsig37 DNA. PCR reakce byla provedena za následujících podmínek: 94 °C 3 minuty, dále 5 cyklů zahrnujících 94 °C 30 sekund, 30 °C 20 sekund a 72 °C 1 minutu, poté následovalo 25 cyklů zahrnujících 94 °C 3 0 sekund, 64 °C 20 sekund a 72 °C 1 minutu a na závěr prodlužovací cyklus 72 °C 5 minut. Výsledný PCR produkt byl rozdělen na 0,9%

TBE agarózovém gelu v 1% TBE pufru. Proužek očekávané velikosti byl z gelu vyříznut a DNA byla dle instrukcí od výrobce vyčištěna na Qiaex II® kolonce (Qiagen). DNA byla opracována restrikčními enzymy BamHI a Xbal a následně byla extrahována přesrážena. Vyříznutý a restrikčními enzymy opracovaný zsig37 DNA fragment byl sublkonován do plazmidu NEE/pZP9, který byl stejně jako DNA fragment opracován restrikčními enzymy BamHI a Xbal. Zsig37NEE/pZP9 expresní vektor zahrnuje TPA vedoucí sekvenci a k N-konci zsig37 kódující polynukleotidové sekvence připojuje Glu-Glu konec (SEQ ID NO:26). Plazmid NEE/pZP9 (uložený v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockwille, MD, ATCC No. 98668) je savčí expresní vektor obsahující expresní kazetu s myším methallothionein-1 promotorem a TPA vedoucím peptidem následovaným sekvencí kódující Glu-Glu konečnou sekvenci (SEQ ID NO:26), dále sekvenci obsahující množství restrikčních míst pro vkládání kódující sekvence a terminátor lidského růstového hormonu. Plazmid dále obsahuje E. coli ori (počátek replikace) a expresní jednotku umožňující selekci v savčích buňkách zahrnující SV40 promotor, zesilovač a počátek replikace, DHFR gen a SV40 terminátor.

zsig37CEE/pZP9

Postupem popsaným výše a s použitím PCR primerů ZC15721 (SEQ ID NO:27) a ZC15O35 (SEQ ID NO:28) byl připraven 866 pb dlouhý PCR fragment zsig37 DNA. Purifikovaný PCR fragment byl opracován restrikčními enzymy EcoRI a BamHI a vyčištěn v gelu a na Qiaex II kolonce tak jak to bylo popsáno výše. Vyříznutá a restrikčními enzymy opracovaná zsig37 DNA byla subklonována do plazmidu CEE/pZP9, který byl opracován stejnými restrikčními enzymy jako DNA fragment. V zsig37CEE/pZP9 expresním vektoru je použit nativní zsig37 signální peptid a pro snazší purifikaci je na C-konci navázán Glu-Glu epitop (SEQ ID NO:26). Plazmid CEE/pZP9 (uložený v American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockwille, MD, ATCC No. 98668) je savčí expresní vektor obsahující expresní kazetu s myším methallothionein-1 promotorem a sekvenci kódující Glu-Glu konečnou sekvenci (SEQ ID NO:26), dále sekvenci obsahující množství restrikčních míst pro vkládání kódující sekvence a stop kodon a terminátor lidského růstového hormonu. Plazmid dále obsahuje E. coli ori (počátek replikace) a expresní jednotku umožňující selekci v savčích buňkách zahrnující SV40 promotor, zesilovač a počátek replikace, DHFR gen a SV40 terminátor.

Pro přípravu konstruktů s Glu-Glu sekvencí na N-konci nebo C-konci kódující sekvence bylo ligováno při pokojové teplotě po dobu 4 hodin asi 30 ng restrikčními enzymy opracovaného inzertu a 50 ng odpovídajícího vektoru. Jeden mikrolitr každé ligační směsi byl okamžitě elektroporací vnesen dle instrukcí od výrobce do DH10B kompetentních buněk (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) a buňky byly vysety na LB plotny s obsahem 50 mg/ml ampicilinu a byly inkubovány přes noc.

Kolonie byly testovány metodou PCR tak jak to bylo popsáno výše. Pro testování kolonií zsig37NEE/pZP9 a zsig37CEE/pZP9 byly použity PCR primery ZC13006 (SEQ ID NO:29) a ZC13007 (SEQ ID NO:20). PCR reakce byla prováděna za následujících podmínek: 94 °C 2,5 minuty, dále 25 cyklů zahrnujících 94 °C 10 sekund, 58 °C 20 sekund a 72 °C 1 minutu. Na závěr byla rekce zahřáta na 5 minut na 72 °C. Vložená sekvence byla v pozitivních klonech, tj. 1013 pb pro zsig37NEE a 950 pb pro zsig37CEE, ověřena sekvenční analýzou. Izolace plazmidů byly v případě, kdy byl žádoucí velký výtěžek, prováděny s použitím QIAGEN® Maxi prep kit (Qiagen) a dle instrukcí od výrobce.

Příklad 5: Transfekce a exprese zsig37NEE a zsig37CEE polypeptidů.

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) byly vysety na destičky pro tkáňové kultury o průměru 10 cm a byly přes noc pěstovány do 50% až 70% nárůstu při teplotě 37 °C, 5% CO₂ v DMEM/FBS médiu (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) s 5% fetálním hovězím sérem (Hyclone, Logan, UT), 2 μΜ L-glutaminu (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 μΜ pyruvátu sodného (Gibco BRL)). Poté byly buňky transfektovány plazmidem zsig37NEE/pZP9 (Nkoncová Glu-Glu sekvence) nebp zsig37CEE/pZP9 (C-koncová Glu-Glu sekvence). Pro transfekci byl použit Lipofectamin™ (Gibco BRL) v bezsérovém médiu (SF) DMEM, Gibco/BRL High Glucose (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) s 2 raM Lglutaminem, 2 mM pyruvátem sodným, 10 pg/ml transferinu, 5 pg/ml inzulínu, 10 pg/ml fetuinu a 2 ng/ml selenu. Šestnáct mikrogramů zsig37NEE/pZP9 a 16 pg zsig37CEE/pZP9 bylo odděleně naředěno SF médiem v 15 ml zkumavkách na celkový konečný objem 640 μΐ. V oddělených zkumavkách bylo smíšeno 35 μΐ Lipofectaminu™ (Gibco BRL) s 605 μΐ SF média. Směs s Lipofectaminem™ byla přidána ke směsi DNA a roztok byl inkubován asi 30 minut při pokojové teplotě. Ke směsi Lipofectamin™:DNA bylo přidáno 5 ml SF média. Buňky byly lx promyty 5 ml SF média, médium bylo odsáto a k buňkám byla přidána směs

DNA:Lipofectamin™. Buňky byly inkubovány 5 hodin při teplotě 37 °C a poté bylo na misku přidáno 6,4 ml DMEM/10% FBS, 1% PSN média. Buňky byly inkubovány přes noc při teplotě 37 °C a následující den byla směs DNA:Lipofectamin™ nahrazena čerstvým FBS/DMEM médiem. Druhý den po transfekci byly buňky rozděleny do selekčního média (ESTEP #1 s 1 μΜ MTX) do 150 mm kultivačních misek v koncentracích 1:50, 1:100 a 1:200. Pátý den po transfekci bylo do misek doplněno čerstvé selekční médium.

Testování kolonií.

Asi 10. až 12. den po transfekci byla pro každou transfekci zvolena jedna 150 mm kultivační miska s koloniemi rezistentními na methotrexát, médium bylo odsáto a misky byly promyty 10 ml bezsérového ESTEP 2 média (668,7 g / 50 L DMEM (Gibco), 5,5 g / 50 L kyseliny pyrohroznové, sodná sůl 96% (Mallinkrodt), 185,0 g / 50 L NaHCCh (Mallinkrodt), 5,0 mg/ml, 25 ml / 50 L inzulínu, 10 mg/ml a 25 ml / 50 L transferrinu). Po promytí bylo médium odsáto a nahrazeno 5 ml bezsérového ESTEP 2 média. Na buňky byla poté umístěna sterilní teflonová síť (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA), předem navlhčená v bezsérovém ESTEP 2 médiu. Na síto byl dále umístěn sterilní nitrocelulózový filtr předem navlhčený v bezsérovém ESTEP 2 médiu. Orientační značky na nitrocelilóze byly přeneseny na kultivační misku. Buňky byly poté 5 až 6 hodin inkubovány v 5% CO₂ inkubátoru při teplotě 37 °C. Po inkubaci byl filtr odstraněn a médium bylo odsáto a nahrazeno DMEM/5% FBS, lx PSN médiem (Gibco BRL). Filtr byl poté uzavřen do uzavíratelného sáčku s 50 ml pufru (25 mM Tris, 25 mM glycin, 5 mM β-merkaptoethanol) a byl 10 minut inkubován ve vodní lázni při 65 °C. Filtry byly 15 minut blokovány při pokojové teplotě v pufru Western A s 10 % odtučněným sušeným mlékem (Western A: 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCl a 0,25% želatina). Blokování bylo prováděno na rotační třepačce. Poté byly filtry inkubovány s anti-Glu-Glu protilátkou konjugovanou s HRP, ředěnou 1:1000 v pufru Western A (Western A: 50 mM Tris pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,05% NP-40, 150 mM NaCl a 0,25% želatina) s 2,5% odtučněným sušeným mlékem. Inkubace s protilátkou byla prováděna na rotační třepačce přes noc při teplotě °C. Poté byly filtry při pokojové teplotě 3x promyty v PBS s přídavkem 0,1 % Tween 20. Každé promytí trvalo 5 až 15 minut. Dále byl filtr zpracován metodou ECL dle instrukcí od výrobce (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) a signál byl zachycen na film (Hyperfilm ECL, Amersham). Film byl exponován přibližně minut.

· 9 · · 9 «9

9 9 9

9 9 »

9 9 9 ·

9 9 9 ··

Film byl porovnán s kultivační miskou s koloniemi a na základě pozitivního signálu byly vybrány vhodné kolonie. Sterilní 3 mm klonovací disky (PGC Scientific. Corp., Frederick, MD) byly navlhčeny trypsinem a umístěny na povrch zvolené kolonie. Pro každý konstrukt bylo vybráno 12 kolonií, které byly přeneseny každá do 200 μΐ selekčního média na 96 jamkovou destičku. Pro každou kolonii byla připravena série sedmi dvojnásobných ředění. Buňky byly kultivovány po dobu 1 týdne při 37 °C. Byly vybrány jamky s nejnižším ředěním vykazujícím optimální denzitu, buňky byly opracovány trypsinem a přeneseny na 12 jamkovou destičku se selekčním médiem. 150 mm kultivační misky byly také opracovány trypsinem a zbylé buňky byly spojeny a podrobeny western analýze a testu na mykoplazmy. Vzorek buněk byl zamražen a uložen.

Klony byly převedeny přímo z 12 jamkové destičky do dvou kultivačních lahví T75. Jedna z lahví byla uchována pro další kultivaci, ve druhé byly buňky pěstovány v bezsérovém ESTEP 2 médiu, které bylo shromažďováno pro western blot analýzu. Na základě western blot analýzy byly pro každý expresní konstrukt vybrány pozitivní klony a buňky byly použity pro kultivaci ve velkém objemu.

Příklad 6: Exprese zsig37CEE v savčích hostitelských buňkách ve velkém objemu.

Jedna kultivační láhev T-162 obsahující spojené buňky exprimující zsig37CEE a jedna, obsahující zsig37 NEE, získaný expresí výše popsaným postupem, byly každá rozděleny do čtyř T-162 kultivačních lahví. Vždy jedna ze čtyř zmíněných lahví byla zamražena a ostatní tři byly použity pro přípravu „Nunc cell factory“. Buňky ze tří T-162 lahví s zsig37NEE a zsig37CEE byly použity pro okamžité zaočkování dvou „Nunc cell factories“ (10 vrstev, komerčně dostupné od VWR). Krátce, buňky z T-162 lahví, popsaných výše, byly rozděleny pomocí trypsinu, sklizeny a přidány k 1,5 1 ESTEP 1 média (668,7 g / 50 L DMEM (Gibco), 5,5 g / 50 L kyseliny pyrohroznové, sodná sůl 96% (Mallinkrodt), 185,0 g / 50 L NaHCO₃(Mallinkrodt), 5,0 mg/ml, 25 ml / 50 L inzulínu (JRH Biosciences), 10 mg/ml a 25 ml / 50 L transferrinu (JRH Biosciences), 2,5 L / 50 L fetálního hovězího séra (charakterizovaného) (Hyclone), 1 μΜ MTX, pH 7,05 +/- 0,05), předehřátého na 37 °C. Médium obsahující buňky bylo poté nálevkami naplněno do „Nunc cell factories“, které byly dále umístěny do 5% CO2 inkubátoru a kultivovány při teplotě 37 °C. Při 80 až 100% nárůstu byl u obsahu „Nunc cell factories“ proveden vizuální test kontaminace (fenolem; posouzením změny červené barvy). Pokud nebyla žádná kontaminace zjištěna, byl supernatant z buněčných továren • » · · * · · 4 ♦

4 * · · · *4 odčerpán do malého sběrného kontejneru, otestován a odstraněn. Adherované buňky byly lx promyty 400 ml PBS. Pro uvolnění adherovaných buněk byla každá z kultivačních nádob promyta 100 ml trypsinu a ve zbytkovém trypsinu byly buňky inkubovány 5 až 10 minut. Buňky byly sklizeny promytím 2x 200 ml ESTEP1 média. Bylo připraveno 10 lahví, každá s obsahem 1,5 1 ESTEP1 média, předehřátého na 37 °C. Do každé lahve bylo přidáno 40 ml sklizených buněk. Každá z lahví byla použita pro naplnění jedné „Nunc factory“ a každá tato továrna na buňky byla umístěna v 5% CO₂ inkubátoru při teplotě 37 °C.

Při 80 až 90% nárůstu byl u obsahu „Nunc cell factories“ proveden vizuální test kontaminace (fenolem; posouzením změny červené barvy). Pokud nebyla žádná kontaminace zjištěna, byl supernatant z buněčných továren odčerpán do malého sběrného kontejneru, otestován a odstraněn. Adherované buňky byly lx promyty 400 ml PBS. Do každé „Nunc cell factory“ bylo přidáno 1,5 1 média ESTEP 2 (668,7 g / 50 L DMEM (Gibco), 5,5 g Z 50 L kyseliny pyrohroznové, sodná sůl 96% (Mallinkrodt), 185,0 g / 50 L NaHCO₃ (Mallinkrodt), 5,0 mg/ml, 25 ml / 50 L inzulínu, 10 mg/ml a 25 ml / 50 L transferrinu) a tyto továrny na buňky byly inkubovány v 5% CO₂ inkubátoru při teplotě 37 °C.

Asi po 48 hodinách byl u obsahu „Nunc cell factories“ proveden vizuální test kontaminace (fenolem; posouzením změny červené barvy). Supernatant byl z každé z buněčných továren odčerpán do malého sběrného kontejneru a do každé z „Nunc cell factories“ bylo přidáno 1,5 litru čerstvého bezsérového média. Buňky byly inkubovány v 5% CO₂ inkubátoru při teplotě 37 °C. Vždy 1 ml supernatantu byl odebrán pro každý konstrukt, přenesen na podložní sklíčko a podroben mikroskopické analýze za účelem zjištění případné kontaminace. Obsahy malých sběrných kontejnerů byly pro každý konstrukt spojeny a okamžitě přefiltrovány. Buňky byly poté znovu sklizeny stejným způsobem, jaký byl popsán výše pro sklizeň po 48 hodinách. Pro aseptickou filtraci sklizeného supernatantu bylo použito asepticky sestavené filtrovací zařízení. Filterovací zařízení bylo sestaveno následujícím způsobem; k Opti-Cap filtru (Millipore Corp., Bedford, MA) a Gelman Supercap 50 filtru (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) byly drátem připevněny hadičky. Supercap 50 filtr byl dále připevněn ke sterilně uzavřenému kontejneru, umístěnému v digestoři; na hadičku umístěnou před Millipore OptiCap fitrem byla napojena peristaltická pumpa a volný konec hadičky byl vložen do velkého sběrnéhokontejneru. Peristaltická pumpa byla nastavena na 200 až 300 rpm a všechno médium bylo přefiltrováno přes 0,22 nm filtr do sterilního sběrného kontejneru. Filtrát byl umístěn až do okamžiku purifikace v chladné místnosti při teplotě 4 °C. Médium bylo lOx zkoncentrováno dle instrukcí od

Μ ·*· · • · φ · • · · · · · φφφ* φ·· · · * φ φφ * • · · · · φφφφ ··· ·9 ·· ·· ·· výrobce pomocí Millipore 5 kDa cut off concentrator (tj. filtrovací zařízení, které nepropustí molekuly větší než 5 kDa, pozn. překl.) (MilliporeCorp., Bedford, MA) a bylo otestováno metodou western blot s použitím anti-FLAG tag protilátky (Kodak).

Zsig37CEE:

T-162 kultivačních lahví = 0,12 mg/L, 38 kDa;

„Nunc cell factory“, FBS - 0,12 mg/L; 38 kDa;

„Nunc cell factories“, FBS = 0,12 mg/L, 38 kDa;

„Nunc cell factories“ (#1), SF - 1,20 mg/L, 38 kDa;

„Nunc cell factories“ (#2), SF = 3,56 mg/L, 38 kDa

Zsig37NEE:

T-162 kultivačních lahví = 0,137 mg/L, 35 kDa;

„Nunc cell factory“, FBS = 0,137 mg/L; 35 kDa;

„Nunc cell factories“, FBS - 0,137 mg/L, 35 kDa;

„Nunc cell factories“ (#1), SF = 1,37 mg/L, 35 kDa;

„Nunc cell factories“ (#2), SF = 4,11 mg/L, 35 kDa

Příklad 7: Purifikace zsig37NEE a zsig37CEE.

Pokud není řečeno jinak, všechny operace byly prováděny při teplotě 4 °C. Pro purifikaci zsig37 s N-koncovou nebo C-koncovou Glu-Glu (EE) sekvencí byl použit následující postup. Celkem 25 litrů média z BHK buněk („baby hamster kidney cell“) bylo postupně sterilně přefiltrováno přes čtyřpalcový, 0,2 mM Millipore (Bedford, MA) Opticap filtr a 0,2 mM Gelman (Ann Arbor, MI) Supercap 50 filtr. Materiál byl poté zkoncentrován na objem asi 1,3 1 pomocí tangenciálního koncentračního zařízení Millipore ProFlux A30 doplněného membránou S10Y3 (Amicon, Bedford, MA) (3000 kDa). Zakoncentrovaný materiál byl znovu sterilně přefiltrován přes Gelmanův filtr tak, jak to bylo popsáno výše.

K takto upravenému zakoncentrovanému médiu byla přidána směs inhibitorů proteáz v následujících výsledných koncentracích: 2,5 mM ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0,001 mM leupeptin (Boehringer-Mannheim, Indianopolis, IN), 0,001 mM pepstatin (Boehringer-Mannheim) a 0,4 mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim). Ke směsi bylo přidáno 25 ml anti-EE Sepharose, připravené tak jak je to popsáno níže fe · ftft • · · ♦ · · ft · · • ft ft ftft a směs byla jemně míchána po dobu 18 hodin při teplotě 4 °C (Wheaton, Millwille, NJ).

Směs byla poté nanesena do 5,0 x 20,0 cm Econo-Column (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) a gel byl promyt třiceti objemy kolony fosfátového pufru (PBS). Pufr proteklý kolonou byl odstraněn. V okamžiku kdy absorbance pufru po průtoku kolonou dosáhla při vlnové délce 280 nm hodnot menších než 0,05 byl průtok kolonou snížen na nulu a anti-EE sepharózový gel byl promyt dvěma objemy PBS s obsahem 0,4 mg/ml EE peptidu (AnaSpec, San Jose, CA). Použitý peptid má sekvenci Glu-Tyr-Met-Pro-Val-Asp, SEQ ID NO:31. Po jedné hodině při 4 °C byl průtok kolonou obnoven a protein byl z kolony eluován. Tato frakce byla považována za frakci eluovaného peptidu. Anti-EE sepharóza byla poté promyta dvěma objemy 0,1 M glycinu pH 2,5 a tato frakce byla shromažďována odděleně. pH glycinem eluované frakce bylo upraveno na 7,0 přidáním malého množství lOx PBS a frakce byla uložena při teplotě 4 °C pro případnou další analýzu.

Frakce eluovaného peptidu byla pomocí 15 000 Da membránového filtru (Millipore, Bedford, MA) dle instrukcí od výrobce zakoncentrována na objem asi 5 ml. Z této koncentrované peptidové frakce byl volný peptid oddělen chromatografií na 1,5 x 50 cm koloně, naplněné Sephadexem G-50 (Pharmacia, Piscataway, NJ) a ekvilibrované v PBS, při průtoku 1 ml/min s použitím BioCad Sprint HPLC (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA). Byly sbírány frakce po 2 ml a byla sledována absorbance při 280 nm. První vrchol eluční křivky při 280 nm byl eluován brzy za tzv. mrtvým objemem kolony a materiál odpovídající tomuto vrcholu byl zachycen, neboť právě tato frakce představuje čistý zsig37NEE nebo zsig37CEE peptid. Frakce čistého proteinu byla znovu zkoncentrována, tak jak to bylo popsáno výše, analyzována SDS-PAGE a Western blotem s použitím protilátek anti-EE a byly odebrány vzorky pro aminokyselinovou analýzu a N-terminální sekvenování. Zbylý vzorek byl rozdělen na aliquoty a standardím způsobem zmražen -80 °C.

Elektroforéza zsig37NEE proteinu v SDS-PAGE gelech bez použití redukčních činidel prokázala při barvení Comassie Biue výrazný pruh o zdánlivé molekulové hmotnosti 39 000 a dále několik minoritních pruhů zdánlivých velikostí 60 000 až 116 000. Všechny tyto pruhy vykazovaly na western blotu s anti-EE protilátkami zkříženou reaktivitu s hlavním 39 kDa produktem. V přítomnosti redukčního činidla byl po obarvení Comassie Blue pozorován jen jediný, nyní intenzivnější, pruh o velikosti 39 000. Tento pruh opět vykazoval při western blot analýze zkříženou reaktivitu s anti-EE protilátkami.

·♦ ► » · <

··· · • ·· «4 · * · ·

Elektroforéza zsig3 7CEE proteinu v SDS-PAGE gelech bez použití redukčních činidel prokázala při barvení Comassie Blue výrazný pruh o zdánlivé molekulové hmotnosti 39 000 a dále několik minoritních pruhů zdánlivých velikostí 60 000 až 1 16 000. Při western blot analýze vykazovaly zkříženou reaktivitu s anti-EE protilátkami jen pruhy o zdánlivé molekulové hmotnosti 150 000, 116 000 a 60 000. V přítomnosti redukčního činidla byl po obarvení Comassie Blue pozorován jen jediný pruh o velikosti 39 000. Tento pruh opět vykazoval při western blot analýze zkříženou reaktivitu s anti-EE protilátkami. Za těchto podmínek bylo pozorováno také malé množství zkříženě reagujícícho proteinu o velikosti 150 000.

Příprava anti-EE sepharózy.

Základní objem 100 ml protein G-sepharózy (Pharmacia, Piscataway, NJ) byl s použitím 500 ml filtrační jednotky Nalgen 0,45 mikronu promyt 3 x 100 ml PBS s 0,02% azidem sodným. Gel byl dále promyt šesti objemy 200 mM triethanolaminu pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO) a dále byl přidán jeden objem roztoku EE protilátky, obsahující celkem 900 mg protilátky. Sepharóza byla s protilátkou inkubována přes noc při teplotě 4 °C a nenavázaná protilátka byla poté odstraněna promytím pěti objemy 200 mM TEA (viz. výše). Dále byla sepharóza resuspendována ve dvou objemech TEA a převedena do vhodné nádoby, Ke směsi byl přidán dimethylpimilimidát-2HCl (Pierce, Rockford, IL), rozpuštěný v TEA, v konečné koncentraci 36 mg/ml gelu. Po 45 minutách při pokojové teplotě byla z gelu pomocí filtrační jednotky, jaká byla popsána výše, odstraněna tekutina. Nespecifická místa v gelu byla poté blokována inkubací 10 minut při pokojové teplotě s 5 objemy 20 mM ethanolaminu v 200 mM TEA. Gel byl promyt 5 objemy PBS s 0,02% azidem sodným a v tomto roztoku uložen při teplotě 4 °C.

Příklad 8: Testování buněčné adheze a proliferace.

Schopnost zsig37 polypeptidu stimulovat adhezi, tj. přilnutí TF-1 buněk k povrchu byla testována následujícím způsobem. Byla připravena ředící řada zsig37 polypeptidu s C-koncovou Glu-glu sekvencí v rozmezí od 10 do 0,0625 pg/ml v PBS nebo ELISA povlékacím pufru (0,1 M NaCO₃) a vzorky byly naneseny na 96 jamkovou mikrotitrační destičku (Costar, Pleasanton, CA) v množství 100 μΙ/jamku. Destičky byly inkubovány 2 hodiny při 37 °C, 5% CO₂. Dále byly destičky 3 x promyty RPMI/10% FBS (RPMI 1640, 2 mM L-glutamin, 110 pg/ml

Φ ΦΦ · Φ ··» φφ φφ φ φ φ · • φ · φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ pyruvátu sodného, PSN a 10% tepelně inaktivované fetální hovězí sérum) a ponechány 15 minut za účelem blokace nespecifických míst.

TF-1 buňky (odvozené od buněk akutní myeloidní leukemie) byly resuspendovány v RPMI/10% FBS a vysety do jamek potažených zsig37CEE proteinem v množství 10 000 buněk na jamku a v celkovém objemu 120 μΐ na jamku. Destičky byly inkubovány 2 hodiny při 37 °C, 5% CO₂. Dále byly destičky 3 x promyty PBS a do každé jamky bylo přidáno 200 μΐ růstového média (RPMI/10% FBS, 5 ng/ml GMCSF). Před a po promytí byla provedena mikroskopická kontrola buněk.

Pro kvantitativní stanovení počtu adherovaných buněk byla také použita metoda založená na inkorporaci barvy buňkami a následném stanovení kolorimetrických změn a vzrůstu fluorescenčního signálu. Do Jamek 96 jamkové mikrotitrační destičky byla přidána Alamar Blue™ (AccuMed, Chicago, IL) a buňky byly přes noc inkubovány při 37 °C, 5% CO₂. Barevná reakce byla poté změřena fluorometrem při excitační vlnové délce 544 nm a emisní vlnové délce 590 nm. V porovnání s destičkami s jamkami potaženými zsig37CEE-0,1 M NaCO₃vykazovaly buňky v destičkách s jamkami potaženými zsig37CEE-PBS vyšší adhezivitu. Přidání rozpustného zsig37 proteinu adhezi buněk k vázanému zsig37 neblokovalo.

Další test byl proveden s použitím TF-1, DA-1 (IL-3 závislá buněčná linie odvozená od buněk z lymfatických uzlin myší, trpících lymfomem B-buněk, pěstováním v IL-3 médiu (tuto linii poskytnul Dr. Kenneth Kaushansky, University of Washington, Seattle, WA)), pre-B (p53-/- buňky z myší kostní dřeně, IL-7 dependentní, B220+, Thyl low, Sca-1+) a A7BaF-3 buněčných linií dle výše popsaného postupu. Tentokrát bylo použito 5000 buněk na jamku. BHK buňky byly použity také, a to v množství 500 buněk na jamku. Zsig37 stimulační vliv na růst A7-BaF-3 buněk a mírně inhibiční vliv na růst DA-1 buněčné linie.

Příklad 9: Myší orthologní sekvence.

Nové lidské polynukleotidy kódující polypeptidy zsig37 podle navrhovaného vynálezu byly použity pro vyhledávání myších homologických sekvencí v myší EST databázi. Byla nalezena jediná EST sekvence odpovídající lidské zsig37 sekvenci. Klon, pravděpodobně obsahující odpovídající kódující sekvenci byl použit pro sekvenaci za účelem identifikace odpovídající cDNA. S použitím Invitrogen S.N.A.P.™ Miniprep kit (Invitrogen, Corp., San. Diego, CA) a podle instrukcí od výrobce bylo zpracováno 5 ml kultury pěstované přes noc v LB médiu s přídavkem 50 pg/ml ampicilinu. Templát byl sekvenován na DNA sekvenátoru • · ♦ ♦♦ · η

« · • · ·*· · * • ··

ABIPRISM™ model 377 (Perkin-Elmer Cetus, orwalk, Ct.) s použitím ABI PRISM™ Big Dye Terminátor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (PerkinElmer Corp.) dle instrukcí od výrobce. Jako primery pro sekvenování byly použity oligonukleotidy ZC694 (SEQ ID NO:6), ZC6768 (SEQ ID NO:32), ZC18297 (SEQ ID NO:33), ZC18298 (SEQ ID NO:34), ZC18402 (SEQ ID NO:35), ZC18403 (SEQ ID NO:36), ZC18456 (SEQ ID NO:37), ZC18457 (SEQ ID NO:38), ZC18560 (SEQ ID NO:39), ZC18561 (SEQ ID NO:40), ZC18687 (SEQ ID NO:41) A ZC18688 (SEQ ID NO:42). Sekvenační reakce byly prováděny v Hybaid OmniGene Temperature Cycling System (National Labnet Co., Woodbridge, NY). Pro analýzu dat byl použit SEQUENCHER™ 3.0 software (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, MI). Výsledná 2559 pb dlouhá sekvence je zde znázorněna jako SEQ ID NO:43 a odvozená aminokyselinová sekvence je uvedena pod číslem SEQ ID NO:44. Při porovnání s lidskou zsig37 nukleotidovou sekvencí (SEQ ID NO.l) vykazuje SEQ ID NO:43 77% identitu. Také předpokládané aminokyselinové sekvence myšího a lidského proteinu (SEQ ID NO:44 a SEQ ID NO:2 resp.) vykazují 77% identitu.

Příklad 10: Tesování buněk.

Polypeptidy zsig37 byly testovány in vitro za účelem identifikace látek, které selektivně aktivují buněčnou odpověď v buňkách nesmrtelných osteoblastových buněčných linií. V testu byla použita maturovaná osteoblastová buněčná linie odvozená od p53-/- (deficientních) myší, CCC4, která byla transfektována plazmidem nesoucím inducibilní SRE (sérum response element) element, řídící expresi luciferázy. Tyto buňky dále exprimují endogenní PTH, PDGF nebo bFGF receptory. Stimulace SRE a následná exprese luciferázy v CCC4 buňkách indikuje, že chemická látka pravděpodobně v osteoblastech stimuluje mitogenezi.

Buňky CCC4 linie byly opracovány trypsinem a byly naředěny médiem pro výsev buněk (alpha-MEM, 1% teplotně inaktivované hovězí fetální sérum, 1 mM pyruvát sodný a 2 mM L-glutamát) na koncentraci 5 χ 10⁴ buněk/ml. Buňky byly vysety do jamek matně bílé mikrotitrační destičky Dynatech Microlite (Dynatech, Chantilly, VA) v množství 200 μΙ/jamku a inkubovány přes noc při teplotě 37 °C a 5% CO₂. Poté bylo růstové médium odsáto a nahrazeno 50 μΙ/jamku testovacího média (F12 HAM, 0,5% hovězí sérový albumin, 20 mM HEPES, 1 mM pyruvát sodný a 2 mM L-glutamát). Byla připravena ředící řada zsig37 proteinu v testovacím médiu (konečná koncentrace zsig37 0,29 až 1000 ng/ml) a vzorky zsig37 byly přidány do jednotlivých jamek. Vzorky zsig37 byly testovány v tripletech. Dále bylo použito ···· ·· ··♦· ·· ·· • · · · • · · *

9 9 9 · • 9 9 9

9 99 sérum jako negativní kontrola a bFGF jako pozitivní kontrola. Finální koncentrace bFGF byla 3 ng/ml. Kontroly byly testovány ve čtyřech opakováních. Destičky se vzorky byly inkubovány 4 hodiny při 37 °C a 5% CO₂. Testovací médium bylo poté odsáto a destičky byly promyty PBS. Do každé jamky bylo poté přidáno 25 μΐ lyžujícího pufru (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI). Destičky byly inkubovány 15 minut při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno 50 μΐ/jamku substrátu pro luciferázu (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI) a aktivita luciferázy byla detekována pomocí Labsystems LUMINOSCAN® (2 sekundy/jamku, 1 sekunda prodleva). Průměrný bazální (neindukovaný) signál byl odečten od všech hodnot, které jsou znázorněny v tabulce 5 jako procento maximální indukce způsobené 3 ng/ml bFGF.

V tomto testu bylo zjištěno, že zsig37 indukuje expresi luciferázy, což naznačuje, že je stimulátorem osteoblastů. Zsig37 v koncentraci 1000 ng/ml vykazuje 73 až 75 % maximální indukce.

Dále byl proveden doplňující test zjišťující, zda zsig37 působí jako mimetikum růstového faktoru, především ligandů tyrozinkinázových receptorů PDGF, bFGF a EGF (inzulín-R negativní). V tomto pokusu byla použita klonální buněčná linie Swiss 3T3, odvozená od Swiss 3T3 myší, transfektovaná plazmidem nesoucím inducibilní SRE (sérum response element) element, řídící expresi luciferázy. Tyto buňky dále exprimují endogenní PMA, EGF nebo bFGF receptory. Stimulace SRE a následná exprese luciferázy v Swiss 3T3 buňkách indikuje, že chemická látka pravděpodobně napodobuje aktivitu růstových faktorů PDGF, bFGF a EGF.

Buňky Swiss 3T3 byly opracovány trypsinem, byly naředěny médiem pro výsev buněk na koncentraci 5 χ 10⁴ buněk/ml a byly vysety a inkubovány tak jako v předchozím případě. Poté bylo růstové médium odsáto a nahrazeno 50 μΐ/jamku testovacího média (F-12 HAM, 0,5% hovězí sérový albumin, 20 mM HEPES). Byla připravena ředící řada zsig37 proteinu v testovacím médiu (konečná koncentrace zsig37 0,29 až 1000 ng/ml) a vzorky zsig37 byly přidány do jednotlivých jamek. Vzorky zsig37 byly testovány v tripletech. Dále bylo použito sérum jako negativní kontrola a bFGF jako pozitivní kontrola podněcující buněčnou proliferaci. Finální koncentrace bFGF byla 3 ng/ml. Kontroly byly testovány ve čtyřech opakováních. Destičky se vzorky byly inkubovány 5 hodin při 37 °C a 5% CO₂. Testovací médium bylo poté odsáto a destičky byly 1 x promyty PBS. Do každé jamky bylo poté přidáno 25 μΐ lyžujícího pufru (Luciferase Assay Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI). Destičky byly inkubovány 15 minut při pokojové teplotě. Poté bylo přidáno 40 μΐ/jamku substrátu pro luciferázu (Luciferase Assay

99

9 9 9

9» 9

9 9 ·

99

9» 9999

9 • 999

9 * 999

9·

Reagent, E1501, Promega Corp., Madison, WI) a aktivita luciferázy byla detekována pomocí Labsystems LUMINOSCAN® (2 sekundy/jamku, 1 sekunda prodleva). Průměrný bazální (neindukovaný) signál byl odečten od všech hodnot, které jsou vyjádřeny jako procento maximální indukce vyvolané 3 ng/ml bFGF. Pět hodin působení bFGF, PDGF, EGF nebo PMA na tuto buněčnou linii vede ke 25 až 50 násobné indukci exprese SRE-luciferázy.

V tomto testu bylo zjištěno, že zsig37 není stimulátorem exprese luciferázy. Zsig37 v koncentraci 1000 ng/ml vykazuje 0,2 až 0,1 % maximální indukce.

Příklad 11: In vivo podání zsig37 pomocí adenovirového vektoru.

V tomto testu bylo použito 24 samců a 24 samic asi 12 týdnů starých myší kmene C57B16/J (Jackson Labs, Bar Harbor, ME). Po dobu čtyř dnů před injekcí byla zvířata každý den vážena, byla měřena jejich tělesná teplota a byl sledován příjem potravy (dny -4 až -1). V den 0 byla zvířata rozdělena do tří skupin. V jedné skupině obdržela zvířata 0,1 ml AdV-empty (prázdného) viru (1,8 x 1011 virových částic /0,1 ml) intravenózně do ocasní žíly. Ve druhé skupině obdržela zvířata stejným způsobem 0,1 ml AdV-zsig37-CEE viru (5 x 1011 virových částic/0,1 ml). Třetí skupina injekci nedostala. Injekce by měla způsobit u hostitele infekci jater a exprese virových genů by se měla projevit během 24 hodin a měla by pokračovat 1 až 4 týdny. Byly testovány tři skupiny myší, v každé 8 samiček a 8 samců. Skupina 1 neobdržela žádnou injekci, skupina 2 obdržela AdV-Empty (prázdný virus) a skupina 3 obdržela injekci AdV-zsig37-CEE.

Po dobu třech týdnů byla monitorována tělesná teplota a hmotnost zvířat a hmotnost přijaté potravy. Mezi třemi skupinami nebyly zjištěny žádné rozdíly. Dvacátý první den byly samičky myší uspány a usmrceny dekapitací. Stejným způsobem byly usmrceni 22. den také samci. Zvířata byla vykrvácena a byly odebrány tkáně pro nekropsii.

V okamžiku usmrcení byly provedeny standardní testy séra. Játra, ledviny i všechny metabolické parametry dosahovaly normálních hodnot, ovšem byly zjištěny rozdíly mezi skupinou ošetřenou zsig37 a skupinou která obdržela prázdný virus. Zvířata ošetřená zsig37 vykazovala vyšší průměrný lipemický index než kontroly, které obdržely jen prázdný virus. Rozdíl nebyl významný, ovšem další testy ho potvrdily. Ve zbylém séru byly u každého zvířete satnoveny celkové volné mastné kyseliny. Mezi samci ošetřenými zsig37 a kontrolními (prázdný virus) byl zjištěn statisticky významný rozdíl v hladině volných mastných kyselin v séru (p = 0,0379); myši ošetřené zsig37 vykazovaly vyšší

• 4 · 4 • · · · · 4 4

4 4 4 hladiny. Také u samiček byl zjištěn rozdíl, ovšem nikoliv statisticky významný (p = 0,3357). Po vyjmutí z těla byly tkáně (játra, slezina, ledviny, srdce, štítná žláza a mozek) zváženy. V hmotnosti odebraných tkání nebyly mezi skupinami zjištěny žádné rozdíly. Ani histopatologická analýza odebraných tkání a kostní dřeně neprokázala rozdíly mezi skupinami.

Pro potvrzení získaných výsledků bylo provedeno další testování s následujícími modifikacemi oproti prvnímu testu. Byly sledovány tři skupiny vždy po 20 myších C57B16/J (10 samců, 10 samic); a) neošetřené, na lačno; b) AdV-null (ošetřené prázdným virovým vektorem) a na lačno a c) AdV-zsig37-CEE a na lačno. Myši hladověly přes noc a poté bylo odebráno 100 μΐ séra pro stanovení bazálních hodnot následujících parametrů: glukóza na lačno, TP, alkalická fosfatáza, cholesterol, triglyceridy, volné mastné kyseliny a inzulín. Tělesná hmotnost byla určována 3 x týdně. V den 0 obdržela zvířata injekci 0,1 ml odpovídajícího roztoku viru do laterální ocasní žíly. Sedmnáctý den byla myším na lačno (celonoční půst) odebrána krev. Po třech týdnech byly myši usmrceny a byla jim odebrána krev. Část krve byla smíšena s EDTA pro pozorování v CBC's a se zbylou krví byly opět provedeny testy tak jak to bylo popsáno výše. Stejně jako v předchozím případě byly odebrány orgány a byla provedena histopatologická analýza.

Z předchozího textu je jistě zřejmé, že ačkoliv byly pro lepší pochopení popsány některé konkrétní aspekty navrhovaného vynálezu, může být provedena celá řada modifikací, aniž bychom se odchýlili od myšlenky vynálezu.V souladu s tím je navrhovaný vynález limitován pouze následujícími patentovými nároky.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu.
2. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, kde aminokyselinová sekvence zmíněného polypeptidu je nejméně z 90 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 22 až 281 SEQ ID NO:2.
3. Izolovaný polypeptid podle nároku 2, kde zmíněný polypeptid obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 281 SEQ ID NO:2 nebo 1 až 281 SEQ ID NO:44.
4. Izolovaný polypeptid podle nároku 1, mající na N-konci nebo C-konci kovalentně vázanou část, vybranou ze skupiny obsahující afinitní skupiny, toxiny, radionukleotidy, enzymy a fluorofory,
5. Izolovaný polypeptid podle nároku 4, který dále obsahuje mezi zmíněnou aminokyselinovou sekvencí a zmíněnou afinitní skupinou místo pro proteolytické štěpení.
6. Izolovaný polypeptid vybraný ze skupiny obsahující:

a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 99 až 140 SEQ ID NO:2;

b) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 140 nebo 141 až 281 SEQ ID NO:2 a

c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 99 až 281 SEQ ID NO.2.
7. Fúzní protein, který se v podstatě skládá ze dvou částí, spojených peptidovou vazbou, vyznačující se tím, že zmíněná první část obsahuje polypeptid vybraný ze skupiny obsahující:

a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2;

4 44 ·

944 ··> 4499

94 94

4 4 9 9

9 4 4 ·

4 9 9 4 ·

9 9 9 ·

94 94

b) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji ukazuje SEQ ID NO:2 od aminokyseliny 1, 22 nebo 26 do aminokyseliny 281;

c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji ukazuje SEQ ID NO:44 od aminokyseliny 1, 22 nebo 26 do aminokyseliny 281;

d) část zsig37 polypeptidu tak, jak ho ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, která obsahuje kolagenu podobnou doménu nebo část kolagenu podobné domény, schopnou dimerizace nebo oligomerizace;

e) část zsig37 polypeptidu tak, jak ho ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, která obsahuje doménu podobnou globulární, nebo aktivní část domény podobné globulární doméně; nebo

f) část zsig37 polypeptidu tak, jak ho ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, která obsahuje kolagenu podobnou doménu a globulární doménu a zmíněná druhá část zahrnuje jiný polypeptid.
8. Fúzní protein podle nároku 7 vyznačující se tím, že zmíněná první část je vybrána ze skupiny obsahující:

a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44 od aminokyseliny 99 do aminokyseliny 140;

b) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44 od aminokyseliny 140 nebo 141 do aminokyseliny 281;

c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44 od aminokyseliny 99 do aminokyseliny 281.
9. Fúzní protein vyznačující se tím, že obsahuje sekreční signální sekvenci mající aminokyselinovou sekvenci shodnou se sekvencí aminokyselinových zbytků 1 až 21 nebo 1 až 25 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, kde je zmíněná sekreční signální sekvence operativně spojena s dalším polypeptidem.
10. Expresní vektor vyznačující se tím, že obsahuje následující operativně spojené elementy:

promotor transkripce;

DNA segment kódující polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

• » ··· · ·»♦· • 9 9

9 999 »» ·· • · · · · · i • · » · · · · , * »♦· ·· · » · * · · _ · · · »· ·· ·· »·

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde

Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu; terminátor transkripce.
11. Expresní vektor podle nároku 10, vyznačující se tím, že zmíněný DNA segment kóduje polypeptid jehož aminokyselinová sekvence je nejméně z 90 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2.
12. Expresní vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný DNA segment kóduje polypeptid jehož aminokyselinová sekvence je nejméně z 90 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 22 až 281 SEQ ID NO:2.
13. Expresní vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný DNA segment kóduje polypeptid zahrnující sekvenci aminokyselinových zbytků 1 až 281 SEQ ID NO:2 nebo 1 až 281 SEQ ID NO:44.
14. Expresní vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný DNA segment kóduje polypeptid, který je na N-konci nebo C-konci kovalentně vázaný s afinitní skupinou.
15. Expresní vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že zmíněný DNA segment dále kóduje sekreční signální sekvenci, operativně spojenou se zmíněným polypeptidem.
16. Expresní vektor podle nároku 15, vyznačující se tím, že zmíněná sekreční signální sekvence obsahuje aminokyselinovou sekvenci shodnou se sekvencí aminokyselinových zbytků 1 až 21 nebo 1 až 25 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44.
17. Kultivovaná buňka vyznačující se tím, že byl do této buňky vnesen expresní vektor, obsahující následující operativně spojené elementy:

promotor transkripce;

DNA segment kódující polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde

Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu;

terminátor transkripce, a kde zmíněná buňka exprimuje zmíněný polypeptid, kódovaný zmíněným DNA segmentem.

• ···· • * · • ·»· ft · • * ft·· ftftft ·· ···· ftft ftft • ftft · • ftft · • · ftft ft • · · · ftft ftft
18. Způsob přípravy polypeptidů vyznačující se tím, že zahrnuje:

kultivaci buněk do kterých byl vnesen expresní vektor, obsahující následující operativně spojené elementy:

promotor transkripce;

DNA segment kódující polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, kteráje nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde

Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu;

terminátor transkripce, a kde zmíněné buňky exprimují zmíněný polypeptid kódovaný zmíněným DNA segmentem a izolaci zmíněného exprimovaného polypeptidů.
19. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid, kde zmíněný polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.
20. Protilátka, která specificky váže epitop polypeptidů, který obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu.
21. Vazebný protein, který specificky váže epitop polypeptidů, který obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu.
22. Izolovaný polynukleotid kódující polypeptid, kde sekvence aminokyselinových zbytků zmíněného polypeptidů je nejméně ze 75 %

49 44

4 4 4 ·

4 4 9 · • 9 4 · • 4 4 4

49 99 ·· ···» • ···· • · · * ··· » »

9 ·

44 4 ··· ·· identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2, kde zmíněná sekvence obsahuje:

Gly-Xaa-Xaa nebo Gly-Xaa-Pro repetice tvořící kolagenovou doménu, kde Xaa je kterákoliv aminokyselina a karboxy-koncovou globulární doménu.
23. Izolovaný polynukleotid podle nároku 22, kde sekvence aminokyselinových zbytků zmíněného polypeptidu je nejméně z 90 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2.
24. Izolovaný polynukleotid podle nároku 23, kde sekvence aminokyselinových zbytků zmíněného polypeptidu je nejméně z 90 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 22 až 281 SEQ ID NO:2.
25. Izolovaný polynukleotid podle nároku 23, který obsahuje aminokyselinové zbytky 1 až 281 SEQ ID NO:2 nebo aminokyselinové zbytky 1 až 281 SEQ ID NO:44.
26. Izolovaný polynukleotid podle nároku 22, kde zmíněný polynukleotid je DNA.
27. Izolovaný polynukleotid vybraný ze skupiny obsahující:

a) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1 od nukleotidu 465 do nukleotidu 688;

b) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1 od nukleotidu 688 do nukleotidu 1016;

c) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1 od nukleotidu 691 do nukleotidu 1016;

d) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1 od nukleotidu 465 do nukleotidu 1016;

e) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:43 od nukleotidu 364 do nukleotidu 490;

f) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:43 od nukleotidu 490 do nukleotidu 912;

g) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:43 od nukleotidu 364 do nukleotidu 912;

h) nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:43 od nukleotidu 364 do nukleotidu 490;

i) polynukleotid kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 99, 140 nebo 141 až 281 SEQ ID NO:2;

φφ « φ φ φ φ φ • φ φ • φ φ φφ φφ φφφφ φφ φ

φ φ

φ • · φ

• ···· ·· * • ··· • * • · ··· ··· • · ♦ φ • · • · · φφ

j) polynukleotid kódující polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 99 až 140 SEQ ID NO:2;

k) nukleotidové sekvence komplementární k sekvencím a), b), c), d), e), f),

g), h), i) nebo j) a

l) degenerované nukleotidové sekvence a), b), c), d), e), f), g), h), i), j) nebo k).
28. Izolovaný polynukleotid kódující fúzní protein který se v podstatě skládá ze dvou částí, spojených peptidovou vazbou, kde zmíněná první část fúzního proteinu obsahuje polypeptid vybraný ze skupiny obsahující:

a) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků, která je nejméně ze 75 % identická se sekvencí aminokyselinových zbytků 26 až 281 SEQ ID NO:2;

b) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji ukazuje SEQ ID NO:2 od aminokyseliny 1, 22 nebo 26 do aminokyseliny 281;

c) polypeptid mající sekvenci aminokyselinových zbytků tak jak ji ukazuje SEQ ID NO:44 od aminokyseliny 1, 22 nebo 26 do aminokyseliny 281;

d) část zsig37 polypeptidu tak, jak ho ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, která obsahuje kolagenu podobnou doménu nebo část kolagenu podobné domény, schopnou dimerizace nebo oligomerizace;

e) část zsig37 polypeptidu tak, jak ho ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, která obsahuje doménu podobnou globulární, nebo aktivní část domény podobné globulární doméně; nebo

f) část zsig37 polypeptidu tak, jak ho ukazuje SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, která obsahuje kolagenu podobnou doménu a globulární doménu a zmíněná druhá část fúzního proteinu zahrnuje jiný polypeptid.
29. Izolovaný polynukleotid kódující fúzní protein, kde zmíněný fúzní protein obsahuje sekreční signální sekvenci mající aminokyselinovou sekvenci shodnou se sekvencí aminokyselinových zbytků 1 až 21 nebo 1 až 25 SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:44, kde je zmíněná sekreční signální sekvence operativně spojena s dalším polypeptidem.
30. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci nukleotidů SEQ ID NO:23 od nukleotidu 1 do nukleotidu 843.
31. Oligonukleotidová sonda nebo primer obsahující nejméně 14 po sobě jdoucích nukleotidů polynukleotidové sekvence SEQ ID NO:23 nebo sekvence komplementární k SEQ ID NO:23.