CZ20001165A3 - Způsob výroby ergosterolu a jeho meziproduktů pomocí rekombinantních kvasinek - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby ergosterolu a jeho meziproduktů pomocí rekombinantních kvasinek a plasmidů pro transformaci kvasinek.

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká postupu výroby ergosterolu a jeho meziproduktů pomocí rekombinantních kvasinek a plasmidů pro transformaci kvasinek.

Dosavadní stav techniky

Ergosterol je konečným produktem syntézy sterolů v kvasinkách a v houbách. Hospodářský význam této látky spočívá jednak v získávání vitaminu D£ z ergosterolu působením UV-záření a jednak v získávání steroidních hormonů pomocí biotransformace, přičemž se vychází z ergosterolu. Skvalen se používá jako základní syntetický materiál pro syntézu terpenů. Jeho hydrogenovaná forma skvalan se používá v dermatologii a v kosmetice spolu s různými deriváty jako součást prostředků pro péči o pleť a vlasy. Hospodářský význam mají i meziprodukty látkové přeměny ergosterolu.

Nej důležitější z těchto mezipoduktů jsou farnesol, geraniol a skvalen. Hospodářsky využitelné jsou i další steroly, jako např. zymosterol a lanosterol, přičemž lanosterol je klíčovou přírodní i syntetickou látkou používanou pro chemickou syntézu saponinů a steroidních hormonů. Lanosterol dobře proniká do pokožky a dobře se roztírá, a proto se používá jako emulgační prostředek a jako účinná složka pleťových krémů.

Geny řídící látkovou přeměnu ergosterolu v kvasinkách • · • · ··· · · · · · · · ···· · · · · « ·· ·

2· · · · · ······· ·· · j sou dostatečně známy a klonovány, j ako např.

HMG-CoA-reduktasa (HMG1) (Basson a spol., 1988), skvalensynthetasa (ERG9) (Fegueur a spol., 1991),

Acyl-CoA:sterol-acyltransferasa (SÁTI) (Yu a spol., 1996) a skvalenepoxidasa (ERG1) (Jandrositz a spol., 1991). Skvalensynthetasa katalyzuje reakci farnesylpyrofosfátu přes preskvalenpyrofosfát na skvalen. Reakční mechanismy sterolacyltransferasy nejsou dosud zcela prozkoumány. Vysoká exprese genu těchto uvedených enzymů byla již ověřována, nevedla však k žádnému podstatnému zvýšení množství získaného ergosterolu. V případě HMG1-vysoké exprese byla popsána zvýšená produkce skvalenu, při této reakci byly kromě toho zaváděny mutace pro přerušení další reakce po získání skvalenu (EP-0 486 290). Zvýšená produkce geraniolu a farnesolu byla rovněž popsána, zde však nedocházelo k žádné vysoké expresi genů látkové přeměny ergosterolu, nýbrž k přerušení reakčního sledu ve směru tvorby geraniolu a farnesolu (EP-0313 465).

Specifické inhibitory biosyntézy ergosterolu mohou vést i k nahromadění větších množství určitých meziproduktů, například allylaminů, které brání přeměně skvalenu na skvalenepoxid. Tak je možno dosáhnout podstatného zvýšení množství skvalenu (až 600-násobek normálního množství) (Jandrositz a spol., 1991).

Použití inhibitorů sice umožňuje dosáhnout podstatného zvýšení množství např. skvalenu, přesto není přidávání těchto látek výhodné, poněvadž stejné účinky mají v organismu již jejich nepatrná množství, a proto je způsob výroby produktů biosyntézy ergosterolu způsobem zvýšené produkce výhodněj ší.

• ·

Λ · · ··· * · · · ···· · ··· · ·· » • · ··· ······· · · · • · · ··· ··«· «·«··· 9 9 9 9 9 9 9

Cílem tohoto vynálezu je vypracování mikrobiologického postupu výroby ergosterolu a jeho meziproduktů, k tomu potřebných mikroorganismů jako jsou kmeny kvasinek, které syntetizují zvýšená množství ergosterolu resp. potřebných meziproduktů a příprava plasmidů potřebných k transformaci kmenů kvasinek.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že je možno zvýšit množství ergosterolu a jeho meziproduktů, jestliže se vloží geny HMG1 (Basson a spol., 1988), ERG9 (Fegueur a spol., 1991, Current Genetics 20:365-372), SÁTI (Yu a spol., 1996) a ERG1 (Jandrositz a spol., 1991) v přeměněné formě do mikroorganismů jako jsou např. kvasinky, přičemž jsou tyto geny vkládány jednotlivě do jednoho plasmidů nebo v kombinaci do jednoho nebo více plasmidů a do hostitelských buněk se vkládají současně nebo postupně.

Předmětem předloženého vynálezu je způsob, jedož podstata spočívá v tom, že

a) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládá v přeměněné formě několik genů vhodných pro látkovou přeměnu ergosterolu nebo

b) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládá v přeměněné formě vždy jeden z genů vhodných pro látkovou přeměnu ergosterolu, • · « · • · • · • « · • « * • * · ······ ·· · · · ··

c) takto připraveným plasmidem se transformují mikroorganismy, přičemž se tyto mikroorganismy transformují jedním plasmidem podle a) nebo několika plasmidy podle

b) současně nebo postupně,

d) s takto připravenými mikroorganismy se provede fermentace na ergosterol,

e) po provedené fermentaci se ergosterol a jeho meziprodukty z buněk extrahuj i a analyzuj i a konečně

f) takto získaný ergosterol a jeho meziprodukty se čistí a izolují pomocí sloupcové chromatografie.

Předmětem tohoto vynálezu je zejména způsob, jehož podstata spočívá v tom, že a-i) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládají následující geny:

i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG), ii) gen skvalensynthetasy (ERG9) iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI) a iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo a-ii) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládají následující geny:

i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG), a ii) gen skvalensynthetasy (ERG9), • · «· »· · · · ·· ««· ··· · « · 0 ···· « ··· · ·« · • · · · · «··««/-· · · 9 nebo a-iii) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládají následující geny:

i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG) a

iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI), nebo a-iv) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládají následující geny:

i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG) a

iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo a-v) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládají následující geny:

ii) gen skvalensynthetasy (ERG9) a

iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI) • · ··· » · · ···· ···· · · · · · ·· · • · · « · ······· ·· · • · · · · · · · · · ······ · · · ·· · · nebo a-vi) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládají následující geny:

ii) gen skvalensynthetasy (ERG9) a

iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo a-vii) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládají následující geny:

iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI) iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo

b) se nejprve vytvoří plasmid, do něhož se vkládá vždy jeden z genů uvedených pod a-i,

c) pomocí takto připravených plasmidů se transformují mikroorganismy, přičemž tyto mikroorganismy se transformují jedním plasmidem uvedeným pod a-i) až a-vii) nebo několika plasmidy uvedenými pod b) současně nebo • · • · · « • · • · · · · postupně,

d) s takto získanými mikroorganismy se provede fermentace na ergosterol,

e) po provedené fermentaci se ergosterol a jeho meziprodukty vyextrahuj i z buněk a analyzuj i a konečně

f) takto získaný ergosterol a jeho meziprodukty se čistí a izolují pomocí sloupcové chromatografie.

Do plasmidů uvedených v a-ii), a-iii) a a-v) je možno dodatečně vložit gen skvalenepoxidasy (ERG1) a do plasmidů uvedeného v a-ii je možno dodatečně vložit gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI). Tyto plasmidy jsou rovněž předmětem tohoto vynálezu.

K meziproduktům patří skvalen, farnesol, geraniol, lanosterol, zymosterol, 4,4-dimethylzymosterol, ergost-7enol a ergosta-5,7-dienol, zejména steroly s 5,7-dienovou strukturou.

Použitými plasmidy jsou přednostně plasmid YepH2, který obsahuje střední (mittler) ADH-promotor, t-HMG (přeměněná varianta HMG1) a TRP-terminátor (viz obr.l), plasmid YDpUHK3, který obsahuje střední ADH-promotor, t-HMG (přeměněná varianta HMG1) a TRP-terminátor, gen pro kanamycinovou resistenci a gen ura3 (viz obr.2) a plasmid pADL-SATl, který obsahuje gen SÁTI a gen LEU2 z Yepl3.

Tyto plasmidy a jejich použití pro výrobu ergosterolu a jeho meziproduktů, jako jsou skvalen, farnesol, geraniol, lanosterol, zymosterol, 4,4-dimethylzymosterol, 4-methyl• · • · ······ ·· · · · ·· zymosterol, ergost-7-enol a ergosta-5,7-dienol, zejména steroly s 5,7-dřeňovou strukturou, jsou rovněž předmětem tohoto vynálezu.

Hostitelem pro zavádění plasmidů podle tohoto vynálezu mohou být v podstatě jakékoli mikroorganismy, zejména však kvasinky.

Přednostně je možno používat druh S.cerevisiae, zejména kmen S.cerevisiae AH22.

Předmětem tohoto vynálezu je i kmen kvasinek

S.cerevisiae AH22, který obsahuje plasmid pADL-SATl.

Rovněž je preferována kombinovaná transformace mikroorganismů s plasmidy pADL-SATl a YDpUHK3, zejména transformace kvasinek jako např. S.cerevisiae AH22.

Sled látkové přeměny ergosterolu je obecně ovlivňován následovně:

Reakční sled ve směru ergosterol je maximalizován, přičemž aktivita několika úzkoprofilových (flaschenhals) enzymů se zároveň zvyšuje. Rozhodující roli mají přitom různé enzymy, přičemž rozhodující vliv na zvýšení výtěžku ergosterolu má kombinace deregulace resp. vysoké exprese . Jako kombinace se používají enzymy resp. jejich geny HMG1 (Basson a spol., 1988), ERG9 (Fegueur a spol., 1991), acyl-CoA:sterol-acyltransferasa (SÁTI) (Yu a spol., 1996) a/nebo skvalenepoxidasa (ERG1) (Jandrositz a spol., 1991) vložené v pozměněné formě do kmene kvasinek, přičemž vkládání genů se provádí pomocí jednoho nebo více plasmidů a tento plasmid (tyto plasmidy) obsahují DNA-sekvence buď • · • · · • · · · · » · · I » · · 4

9 4 4 jednotlivě, nebo v kombinaci. Pozměněný znamená v případě genu HMG1, že z příslušného genu se exprimuje pouze jeho katalytická oblast bez domény vázané na membránu. Tato přeměna již byla popsána (EP-0486 290). Cílem přeměny HMG1 je zabránit zpětné (feed-back) regulaci způsobené meziprodukty biosyntézy ergosterolu. To znamená, že jak u HMG1, tak i u obou ostatních uvedených genů nedojde k transkripční regulaci. Kromě toho je promotor genů nahrazen středním (mittler) promotorem ADH1. Tento promotorový fragment ADH1-promotoru se vyznačuje přibližně konstitutivní expresí (Ruohonen a spol., 1995), takže transkripční regulace již dále přes meziprodukty biosyntézy ergosterolu neprobíhá.

Produkty vznikající při vysoké expresi je možno využívat pro biotransformace resp. jiné chemické a terapeutické účely, např. pro získávání vitaminu D2 z ergosterolu působením UV-záření a pro získávání steroidních hormonů z ergosterolu s použitím biotransformací.

Předmětem tohoto vynálezu jsou i mikroorganismy, zejména kmeny kvasinek, které s použitím vysoké exprese při postupu s geny uvedenými pod a-i) umožňují výrobu zvýšeného množství ergosterolu a ergosterolu v kombinaci se zvýšeným množstvím skvalenu.

Preferována je přeměněná varianta genu HMG1, v němž byla exprimována pouze katalytická oblast bez domény vázané na membránu. Tato přeměna byla popsána (EP-0486 290).

Předmětem tohoto vynálezu je i postup výroby ergosterolu a meziproduktů vznikajících při této reakci, který se vyznačuje tím, že geny uvedené v postupu pod a), zejména

0 00 «00 ·0 • •0 ♦ · · 0 · · • · · · 0 0 0 0 · ·· 0 · ··· ·····(* ·· · «00 0 0 « «0 0 0C 00 v postupu pod a-i) až a-vii) (dvojnásobná, trojnásobná, čtyřnásobná kombinace genů) se spolu s plasmidy nejprve nezávisle na sobě vloží do mikroorganismů stejného druhu, s nimi se provede fermentace na ergosterol a takto získaný ergosterol se z buněk extrahuje, analyzuje, čistí a izoluje pomocí sloupcové chromatografie.

Předmětem tohoto vynálezu jsou rovněž expresní kazety, zahrnující střední ADH-promotor, gen t-HMG, TRP-terminátor a gen SÁTI se středním ADH-promotorem a TRP-terminátorem a expresní kazety zahrnující střední ADH-promotor, gen t-HMG, TRP-terminátor, gen SÁTI se středním ADH-promotorem a TRP-terminátorem a gen ERG9 se středním ADH-promotorem a TRP-terminátorem.

Předmětem tohoto vynálezu je i kombinace expresních kazet, přičemž tuto kombinaci tvoří

a) první expresní kazeta, na níž je lokalizován ADH-promotor, gen t-HMG a TRP-terminátor

b) druhá expresní kazeta, na níž je lokalizován ADH-promotor, gen SÁTI a TRP-terminátor,

c) třetí expresní kazeta, na níž je lokalizován ADH-promotor, gen ERG9 s TRP-terminátorem.

Dále je předmětem tohoto vynálezu použití těchto expresních kazet pro transformaci mikroorganismů používaných pro fermentaci na ergosterol, přičemž těmito mikroorganismy jsou přednostně kvasinky.

Předmětem tohoto vynálezu jsou i mikroorganismy, jako jsou kvasinky, které obsahují tyto expresní kazety a rovněž jejich použití při fermentaci na ergosterol a jeho meziprodukty .

Následující příklady jsou určeny pro objasnění prováděných postupů.

Příklady provedení vynálezu

1. Restrikce

Restrikce plasmidů (1 až 30 gg) byla prováděna v šaržích po 30 gl. Přitom byly k DNA obsažené ve 24 gl J^O přidány 3 μΐ příslušného pufru, 1 μΐ RSA (hovězí sérový albumin) a 2 μΐ enzymu. Koncentrace enzymu byla 1 jedn./μΐ nebo 5 jedn./μΐ podle množství DNA. V některých případech byl přidán ještě 1 μΐ enzymu RNasa, aby se odbourala tRNA. Tato restrikční reakční směs byla inkubována 2 hodiny při teplotě 37 °C. Restrikce byla kontrolována s použitím Minigelu.

2. Gelová elektroforéza

Gelové elektroforézy byly prováděny v aparaturách Minigel (Minigelapparatur) nebo Vide-Minigel. Minigely (ca 20 ml, 8 jamek) a Vide-Minigely (50 ml, 15 nebo 30 jamek) se skládaly z 1% agarosy v TAE. Jako pufr byl použit 1 x TAE.

Ke vzorkům (10 μΐ) byly přidány 3 μΐ roztoku stoperu a vzorky byly naneseny. Jako standard byla použita I-DNA s Hindlll (pásy: 23,1 kb; 9,4 kb; 6,6 kb; 4,4 kb; 2,3 kb;

• · · · • · · · · · ·

2,0 kb; 0,6 kb). Dělení bylo prováděno při napětí 80 V po dobu 45 až 60 minut. Potom byl gel vybarven v roztoku ethidiumbromidu a vyhodnocován v UV-světle pomocí videodokumentačního systému INTAS nebo fotografován s použitím oranžového filtru.

3. Eluce gelu

Požadované fragmenty byly izolovány eluováním gelu. Restrikční reakční směs byla nanesena na několik jamek Minigelu a rozdělena. V roztoku ethidiumbromidu byly vybarveny pouze lambda-//i«dlll a stopa nějaké látky, tyto látky byly sledovány v UV-světle a požadovaný fragment byl označen. Tím se zabránilo poškození DNA v ostatních jamkách působením ethidiumbromidu a UV-záření. Požadovaný fragment bylo možno díky označení vyříznout z nevybarveného gelu po položení vybarvených a nevybarvených částí gelu na sebe. Podíl agarosy s izolovaným fragmentem byl vložen do dialyzační trubice, bylo přidáno trochu TAE-pufru bez vzduchových bublin a tento podíl byl vložen do aparatury BioRad Minigel. Jako promývací pufr byl použit 1 χ TAE, napětí bylo 100 V po dobu 40 minut. Potom byla na dobu 2 minut změněna polarita elektrického proudu, aby se uvolnila DNA ulpělá na dialyzační trubici. Pufr z dialyzační trubice obsahující DNA-fragmenty byl převeden do reakční nádobky a byl srážen ethanolem. Přitom byly k roztoku DNA přidány 1/10 objemu 3M octanu sodného, tRNA (1 μΐ na 50 μΐ roztoku) a dvaapůlnásobný objem ledově studeného 96%ního ethanolu. Tato reakční směs byla inkubována po dobu 30 minut při teplotě -20 °C a potom byla odstřeďována při 12 000 1/min po dobu 30 minut při teplotě 4 °C. Peleta DNA byla vysušena a vyjmuta do 10 až 50 μΐ vody (podle množství DNA).

· · · · » * · ···· · ··· · * · ·

4. Úprava podle Klenowa

Postupem podle Klenowa byly přečnívající konce DNAfragmentů vyplněny, takže vznikly tupé konce (bluntends). Na 1 pg DNA byly pipetovány následující složky:

Peleta DNA + 11 μΐ ř^O + 1,5 μΐ lOx pufr Klenow + 1 μΐ 0,1 M DTT + 1 μΐ nukleotid (dNTP 2 mM) + 1 μΐ Klenow-polymerasa (1 jedn./μΐ)

DNA je třeba připravit srážením ethanolem, aby se zabránilo inhibici Klenow-polymerasy způsobené nečistotami. Inkubace byla prováděna po dobu 30 minut při teplotě 37 °C, následujícím záhřevem po dobu 5 minut na teplotu 70 °C byla reakce zastavena. DNA byla z této reakční směsi získána srážením ethanolem a byla vyjmuta do 10 μΐ ř^O.

5. Ligace

Fragmenty DNA určené k navázání byly spojeny. V konečném objemu 13,1 μΐ bylo obsaženo cca 0,5 μΐ DNA s vektorovým poměrem 1:5. Tento vzorek byl inkubován po dobu 45 sekund při teplotě 70 °C, zchlazen na laboratorní teplotu (cca 3 minuty) a potom byl po dobu 10 minut ochlazován na ledu. Pak byl přidán ligační pufr: 2,6 μΐ 500 mM Tris.HCI pH 7,5 a 1,3 μΐ 100 mM MgC^ a tato směs byla po dalších 10 minut inkubována na ledu. Po přídavku 1 μΐ 500 mM DTT a 1 μΐ 10 mM ATP a dalších 10 minutách inkubace na ledu byl přidán 1 μΐ ligasy (1 jedn./μΐ). Celý reakční postup byl prováděn pokud možno bez otřesů, aby se konce DNA ležící u sebe opět neoddalovaly. Ligace byla prováděna přes noc při • · • · · • · · · I teplotě 14 °C.

6. Transformace E.coli

Příslušné buňky Escherichia coli (E.coli) NM522 byly transformovány DNA z ligační reakce. Jako pozitivní kontrola byla současně provedena reakce s 50 ng plasmidu pScL3 a jako nulová kontrola byla provedena reakce bez přídavku DNA. Při každé transformační reakci bylo pipetováno 100 μΐ 8% roztoku PEG, 10 μΐ DNA a 200 μί kompetentních buněk (E.coli NM522) do zkumavky stolní odstředivky. Reakční směsi byly na dobu 30 minut vloženy do ledu a občas protřepány. Potom byl proveden tepelný šok: 1 minuta při 42 °C. Pro regeneraci byl k buňkám přidán 1 ml LB-media a reakční směs byla inkubována po dobu 90 minut při teplotě 37 °C na třepačce. Na LB + Ampicilinové desky bylo naneseno po 100 μί neředěné reakční směsi, reakční směsi zředěné 1 : 10 a 1 : 100 a kultivace byla prováděna přes noc při teplotě 37 °C.

7. Izolace plasmidu z E.coli (minipreparace)

Kolonie E.coli byly vloženy přes noc do 1,5 ml media LB+Ampicilin do zkumavky do stolní odstředivky při 37 °C a 120 1/min. Následující den byly buňky odstřeďovány po dobu 5 minut při 5000 1/min. a teplotě 4 °C, získaná peleta byla vyjmuta do 50 μί TE-pufru. Ke každé reakční směsi bylo přidáno 100 μΐ 0,2 N NaOH, 1 % roztoku SDS, směs byla promíchána a vložena na 5 minut na led (lýze buněk). Potom bylo přidáno 400 μί roztoku Na-acetát/NaCl (230 μί H2O, 130 μΐ 3 M Na-acetát, 40 μΐ 5 M NaCl), reakční směs byla promíchána a na dalších 15 minut vložena na led (srážení proteinu). Po 15-timinutovém odstředění při 11 000 1/min. byl supernatant obsahující plasmid-DNA převeden do Eppen• · • » · · · · · ·· ··· · · · ···· • · · · · ··· · · · · « · ··· ······· ·· · ·····« · · · ·· «· dorfovy nádobky. Jestliže supernatant nebyl zcela čirý, bylo odstřeďování provedeno znovu. K supernatantu bylo přidáno 360 μΐ ledově studeného isopropanolu a směs byla inkubována po dobu 30 minut při teplotě -20 °C (srážení DNA). DNA byla odstředěna (15 min., 12000 1/min., 4 °C), supernatant byl odstraněn, peleta byla promyta 100 μΐ ledového 96% ethanolu, 15 minut inkubována při -20 °C a opět odstředěna (15 min.,

000 1/min., 4 °C). Získaná peleta byla vysušena v sušárně Speed Vac a potom byla vyjmuta do 100 μΐ 1^0. Plasmid-DNA byl charakterizován restrikční analýzou. Přitom byla vždy provedena restrikce s 10 μΐ reakční směsi a dělení bylo provedeno elektroforézou na gelu Vide-Minigel (viz dříve).

8. Zpracování plasmidů z E.coli (maxipreparace)

Pro izolaci většího množství plasmid-DNA byla použita metoda maxipreparace (Maxipráp). Dvě baňky obsahující po 100 ml media LB+Ampicilin byly zaočkovány kolonií resp. 100 μΐ zmrazené kultury nesoucí izolovaný plasmid a byly kultivovány přes noc při 37 °C a 120 1/min. Tato kultura (200 ml) byla následující den vlita do GSA-nádobky a odstřeďována při 4000 1/min. (2600 x g) po dobu 10 minut. Peleta buněk byla vyjmuta do 6 ml TE-pufru. Pro natrávení (Abdau) buněčné stěny bylo přidáno 1,2 ml roztoku lysozymu (20 mg/ml TE-pufru) a reakční směs byla inkubována po dobu 10 minut při laboratorní teplotě. Nakonec byla provedena lýza buněk působením 12 ml 0,2 N NaOH, 1 % roztoku SDS a inkubace byla prováděna dalších 5 minut při laboratorní teplotě. Proteiny byly vysráženy přídavkem 9 ml zchlazeného 3 M roztoku Na-acetátu (pH 4,8) při patnáctiminutové inkubaci na ledu.

Po odstředění (GSA-.13000 1/min. (27500 x g) , 20 min., 4 °C) byl supernatant obsahující DNA převeden do jiné GSA-nádobky

0

0 • 0 • · • 0 0 0 0 0 0 * « a DNA byla vysrážená 15 ml ledového isopropanolu při 30-minutové inkubaci při teplotě -20 °C. Peleta DNA byla promyta 5 ml ledového ethanolu a vysušena na vzduchu (cca 30 - 60 minut). Potom byla vyjmuta do 1 ml H2O. Kontrola plasmidu byla provedena restrikční analýzou. Koncentrace byla určena nanášením zřeďovaného roztoku na Minigel. Pro snížení obsahu solí byla provedena 30 až 60-timinutová mikrodialýza (velikost pórů 0,025 pm).

9. Transformace kvasinek

Pro transformaci kvasinek byla použita předpěstovaná kultura (Voranzucht) kmene Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) AH22. Baňka s 20 ml YE-media byla zaočkována 100 μΐ zmrazené kultury a kultivována přes noc při 28 °C a 12 1/min. Hlavní kultivace byla provedena za stejných podmínek v baňce se 100 ml YE-media, zaočkovaného 10 μΐ, 20 μΐ nebo 50 μΐ předpěstované kultury.

9.1 Příprava kompetentních buněk

Následující den byl obsah baněk vyhodnocen pomocí Thomovy komůrky (Thomakammer) a nadále byla zpracována baňka s obsahem 3 - 5x10' buněk/ml. Buňky byly získány odstředěním (GSA: 5000 1/min. (4000 x g), 10 minut). Peleta buněk byla vyjmuta do 10 ml TE-pufru a rozdělena do dvou zkumavek stolní odstředivky (po 5 ml). Buňky byly odstřeďovány 3 minuty při 6000 1/min. a ještě dvakrát promyty po 5 ml TE-pufru. Nakonec byla peleta buněk vyjmuta do 330 μΐ lithiumacetátového pufru na 10^ buněk, převedena do sterilní 50 ml Erlenmeyerovy baňky a jednu hodinu protřepávána při teplotě 28 °C. Tímto způsobem byly získány kompetentní buňky pro transformaci.

• 0 ·· *0 * 00 00 »·* 0 · * 0 * > ♦

00« * ««· 0 «« « • » 0 « 0 <««···· «0 0

00 «0 · 0000 ♦ 0 0 0 0 0 0« * · · *·

9.2 Transformace

Při každé transformační reakci bylo do zkumavky stolní odstředivky napipetováno 15 μΐ DNA sledího spermatu (Heringssperma DNA) (10 mg/ml), 10 μΐ transformované DNA (cca 0,5 μg) a 330 μΐ kompetentních buněk a tato směs byla inkubována po dobu 30 minut při teplotě 28 °C (bez třepání! ) . Potom bylo přidáno 700 μΐ 50 % PEG 6000 a inkubace byla prováděna další hodinu při 28 °C bez třepání. Pak následoval tepelný šok po dobu 5 minut při 42 °C.

100 μΐ této suspenze bylo naneseno na selekční medium (YNB, Difco), aby bylo možno provést selekci na leucinprototrofii. Při selekci na G418-rezistenci byla po tepelném šoku provedena regenerace buněk (viz Fáze regenerace, část 9.3).

9.3 Fáze regenerace

Vzhledem k tomu, že selekční markér znamená resistenci proti G418, potřebovaly buňky čas pro expresi resistenčního genu . K transformační reakční směsi byly přidány 4 ml YE-media a tato reakční směs byla kultivována přes noc při 28 °C na třepačce (120 1/min.). Následující den byly buňky odstředěny (6000 1/min, 3 min.), vyjmuty do 1 ml YE-media a z této směsi bylo naneseno 100 μΐ resp. 200 μΐ na desky YE-G418. Tyto desky byly kultivovány několik dnů při teplotě 28 °C.

10. Reakční podmínky pro PCR

Reakční podmínky pro polymerázovou řetězovou reakci (Polymerase Chain Reaction - PCR) bylo nutno optimalizovat • · • · · · pro každý pokus, takže nej sou všeobecně platné pro každou reakční směs. Kromě jiného je možno měnit množství DNA, koncentraci solí a teplotu rozpouštění (Schmelztemperatur). Pro naše podmínky bylo vhodné použít klobouček Eppendorf, určený pro zařízení Thermocycler, do něhož byly dány následující látky: Ke 2 μΐ (cca 0,1 U) polymerasy Super Taq Polymerase bylo přidáno 5 μΐ pufru Super Buffer, 8 μΐ dNTP (po 0,625 μΜ), 5’-primer, 3’-primer a 0,2 pg matrice DNA rozpuštěné v takovém množství vody, aby se získal celkový objem reakční směsi pro PCR 50 μΐ. Tato reakční směs byla krátce odstředěna a převrstvena kapkou oleje. Pro amplifikace bylo používáno 37 až 40 cyklů.

Dále uvedené příklady provedení popisují přípravu plasmidů podle tohoto vynálezu, přípravu kmenů kvasinek a jejich použití, tento vynález se však na uvedené příklady nij ak neomezuj e.

Příklad 1

Exprese tHMG v S.cerevisiae AH22

DNA-sekvence pro tHMG (Basson a spol., 1988) byla amplifikována standardními způsoby pomocí PCR z genomické DNA ze Saccharomyces cerevisiae S288C (Mortimer a Johnston, 1986). Použitými priméry byly DNA oligomery tHMG-5’ a tHMG-3’ (viz sekv. ID č. 1 a 2). Získaný fragment DNA byl po úpravě podle Klenowa vložen do klonovacího vektoru pUC19 (Yanish-Perron a spol., 1985) a poskytl tak vektor pUC19-tHMG. Po izolaci plasmidu a restrikci pUC19-tHMG pomocí endonukleas EcoRI a EamHI byl získaný fragment vložen do expresního vektoru kvasinek pPT2b (Lang a Looman, 1995), který byl rovněž upraven pomocí EcoRI a EamHI. Vzniklý plasmid pPT2b-tHMG obsahoval ADH1-promotor (Bennetzen a Halí, 1982) a TRPÍ-terminátor (Tschumper a Carbon, 1980), mezi něž byl vložen fragment tHMG-DNA. Z vektoru pPT2b-tHMG byl pomocí endonukleas EcoRV a Nrul izolován úsek DNA, který obsahoval tzv. střední ADH1-promotor obsahující tHMG a TRPÍ-terminátor. Tento úsek DNA byl vložen do kvasinkového vektoru YEpl3 (Fischhoff a spol., 1984), upraveného endonukleasou Sphl a DNA-polymerasou. Takto vzniklý vektor YEpH2 (obr. 1) byl upraven endonukleasou EcoRV a Nrul.

Vznikl tak DNA-fragment s následujícími oblastmi:

transkripčně-aktivní oblast z tetracyklin-resistentního genu (Sidhu a Bollon, 1990), ze středního ADH1-promotoru, z tHMG a z TRP-terminátoru (expresní kazeta). Tento DNA-fragment byl vložen do vektoru YdpU (Berben a spol., 1991), upraveného Stul. Takto vzniklý vektor YdpUH2/12 byl upraven endonukleasou Smál a navázán na DNA-sekvenci kódující kanamycinovou resistenci (Vebster a Dickson, 1983). Tento vzniklý konstrukt (YDpUHK3, obr. 2) byl upraven pomocí EcoRV. Tímto konstruktem byl transformován kmen kvasinek Saccharomyces cerevisiae AH22. Tato transformace kvasinek působením linearizovaného vektoru podle tohoto příkladu vede k chromosomální integraci celého vektoru v místě genu (Genlocus) URA3. Aby bylo možno z integrovaného vektoru eliminovat oblasti které nepatří do expresní kazety (pocházející z E.coli, E. colΐ-Ampicilinresistentního genu, TEF-promotoru a kanamycinresistentního genu), byly transformované kvasinky vystaveny selekčnímu tlaku (Selektionsdruck) pomocí FOA-selekce (Boeke a spol., 1987), kterou pozitivně ovlivňovaly uracil-auxotrofní kvasinky. Uracil-auxotrofní kmen vzniklý touto selekcí nese označení AH22/tH3ura8 a obsahuje tHMGl-expresní kazetu jako chromosomální integraci v URA2-genu.

• * • · · · • ·

Kmen kvasinek AH22/tH3ura8 a výchozí kmen AH22 byly kultivovány po dobu 48 hodin v YE při teplotě 28 °C při 160 1/min v kultivačních baňkách (Schikanekolben).

Podmínky při kultivaci:

Násada pro předpěstovanou kulturu VMVIII byla následuj ící:

směs 20 ml VMVIII + histidin (20 gg/ml) + uráčil (20 gg/ml) byla zaočkována 100 μΐ zmrazené kultury a tato směs byla inkubována 2 dny při 28 °C a 120 1/min (vratný pohyb). Touto předpěstovanou kulturou o objemu 20 ml byla zaočkována směs 100 ml VMVIII + histidin (20 gg/ml) + uráčil (20 gg/ml). Při hlavní kultivaci bylo 50 ml YE (ve 250 ml kultivačních baňkách) zaočkováno 1 x 10^ buněk. Tyto baňky byly inkubovány při 160 1/min na kruhové třepačce při 28 °C po dobu 48 hodin. Potom byla stanovena HMG-CoA-reduktasová aktivita (postup Quareshi a spol., 1981) a byly získány následující hodnoty:

Tabulka 1

	specifická HMG-CoAreduktasová aktivita * (jedn./mg proteinu)
AH22	3,99
AH22/tH3ura8	11,12

* Jednotka je definována jako přeměna 1 nmol NADPH za minutu v jednom mililitru reakční směsi. Měření byla prováděna s celými proteinovými izoláty.

» · • · ► · · · • · » · · • · · · · · • · · · · · ···« ·· · í*

Steroly byly vyextrahovány (Parks a spol., 1985) a analyzovány plynovou chromatografii. Byly získány následuj ící hodnoty:

Tabulka 2

	Skvalen (% hmotn.)	Ergosterol (% hmotn.)
AH22	0,01794	1,639
AH22/tH3ura8	0,8361	1,7024

Procentuální údaje jsou vztaženy na sušinu kvasinek.

Příklad 2

Exprese SÁTI v S.cerevisiae AH22

Sekvence pro Acyl-CoA: steroltransferasu (SÁTI·, Yang a spol., 1996) byla získána postupem uvedeným dříve pomocí PCR z genomické DNA ze Saccharomyces cerevisiae S288C. Použitými priméry byly DNA-oligomery SAT1-5’ a SAT1-3’ (viz sekv. ID č. 3 a 4). Získaný DNA-fragment byl klonován v klonovacím vektoru pGEM-T (Mezei a Storts, 1994) za vzniku vektoru pGEM-SATl. Po úpravě pGEM-SATl působením EcoRl byl získán fragment klonovaný v expresním vektoru kvasinek pADHlOOl, který byl rovněž upraven £coRI. Takto vzniklý vektor pADH-SATl byl upraven působením endonukleasy Nrul a navázán na fragment z Yepl3, který obsahoval L£Z/2-gen.

Tak vznikl expresní vektor kvasinek pADL-SATl • · « · ·« ♦·· ·· • · t ♦ · ú * · · ···· · · · · » ·· • · · · · ······· ·· «··*·· ·· 9 · · (obr.3), který byl vložen do kmene kvasinek AH22. Takto připravený kmen AH22/pADL-SATl byl inkubován po dobu 7 dnů v VMVIII (Lang a Looman, 1995) na Minimalmediu. Podmínky kultivace: (předpěstovaná kultura viz dříve). Hlavní kultivace: směs 50 ml VMVIII + histidin (20 pg/ml) + uráčil (20 pg/ml) (ve 250 ml kultivačních baňkách) byla zaočkována 1x10^ buněk. Baňky byly inkubovány při 160 1/min na kruhové třepačce při 28 °C po dobu 7 dnů. Vzniklé steroly byly analyzovány plynovou chromatografii (viz Tab.3).

Tabulka 3

	Skvalen (% hmotn.)	Ergosterol (% hmotn.)
AH22	nelze stanovit	1,254
AH22/pADL-SAT1	nelze stanovit	1,831

Procentuální údaje jsou vztaženy na sušinu kvasinek.

Příklad 3

Kombinovaná exprese zkrácené 3-hydroxy-3-methylglutarylCoA-reduktasy (tHMG) a acyl-CoA:sterol-acyltrasferasy (SÁTI)

Příklad 3.1

Kmen kvasinek AH22/tH3ura8 byl transformován SÁTI-expresním vektorem pADL-SATl za vzniku AH22/tH3ura8/pADL-SATl. Tento kombinovaný kmen byl kultivován po dobu 7 dnů v VMVIII. Steroly byly vyextra• · 9 ♦ · • · * · ♦ · · hovány (viz dříve) a analyzovány Byly získány následující hodnoty plynovou chromatografií. (viz Tab.4).

Tabulka 4

	Skvalen (% hmotn.)	Ergosterol (% hmotn.)
AH22/tH3ura8	1,602	3,798
AH22/tH3ura/pADL-SAT1	1,049	5,540

Procentuální údaje jsou vztaženy na sušinu kvasinek.

Přiklad 3.2

Kvasinkové kultury byly kultivovány po dobu 7 dnů v VMVIII, ke kulturám však byla přidávána různá množství uracilu. Množství uracilu v mediu bylo nastaveno na 10, 20, 40 a 100 pg/ml. Množství ergosterolu a skvalenu bylo maximální při suplementaci 20 pg/ml uracilu. Výsledky jsou uvedeny v obr. 4. Z výsledků vyplývá, že výtěžky ergosterolu a skvalenu v kmeni AH22/tH3ura/pADL-SATl byly značně závislé na množství uracilu přidaného do media VMVIII.

Příklad 3.3

Kvasinkové kultury byly kultivovány po dobu 7 dnů v VMVIII. Potom bylo postupem uvedeným dříve stanoveno celkové množství sterolů. Volné steroly byly extrahovány n-hexanem z kvasinek rozrušených pomocí skleněných perel.

Výsledky jsou uvedeny v Tab.5.

« · * • · · • · · ·

- 24 - .· :

Z těchto výsledků vyplývá, že enzym sterol-acyltransferasa (Satl) způsobuje vysoce efektivní reesterifikaci především u těch sterolů, které nemají 4,4-dimethylskupinu. To znamená, že tento postup by bylo možno použít pro oddělování 4,4-dimethylsterolů od jejich příslušných demethylovaných forem.

Tabulka 5

Procentuální podíl volných sterolů. Každý sterol byl stanovován jako volný sterol (bez zmýdelnění) a tato hodnota byla vztažena na celkové množství tohoto sterolu V závorkách jsou uvedeny příslušné absolutní hodnoty celkového obsahu sterolů vztažené na plochu/g sušiny. Lanosterol a 4,4-dimethylzymosterol jsou steroly obsahující 4,4-dimethylskupinu.

	% volných sterolů
Kontrola	AH22/tH3ura/pADL-SAT1
Lanosterol	54 (0,99)	59 (2,90)
4,4-dimethylzymosterol	58 (0,77)	84 (2,37)
4-methylzymosterol	7 (2,43)	10(7,62)
zymosterol	10(1,67)	11 (5,85)
ergost-7-enol, ergosta-5,7-dienol	24 (4,55)	12(9,00)

Vysvětlení obrázků na výkresech

V obr. 1 je zobrazen plasmid YEpH2 s příslušnými místy rozhraní.

V obr. 2 je zobrazen plasmid YDpUHK3 s příslušnými místy rozhraní.

t · • · • · • · · · • ·

V obr. 3 je zobrazen plasmid pADL-SATl s příslušnými místy rozhraní.

V obr. 4 je zachyceno chování při kultivaci a obsahy ergosterolu a skvalenu při různém dávkování uracilu. V tomto obrázku znamená:

OD = optická hustota, cultivation time = doba kultivace, yeast dry weight = sušina kvasinek, uráčil supplementation = dávkování uracilu.

PŘEHLED SEKVENCÍ

(1)	VŠEOBECNÉ	INFORMACE
(i)	ŽADATEL:
(A)	NÁZEV:	Schering AG
(B)	ULICE:	Můllerstrasse 178
(C)	MĚSTO:	Berlín
(E)	ZEMĚ:	Německo
(F)	PSČ:	D-13342
(G)	TELEFON:	(030)-4681 2085
(H)	FAX:	(030)-4681 2058

(ii) NÁZEV VYNÁLEZU:

• · • · · · « · · · · » ·

POSTUP VÝROBY ERGOSTEROLU A JEHO MEZIPRODUKTŮ POMOCÍ REKOMBINANTNÍCH KVASINEK (iii) POČET SEKVENCÍ: 4 (iv) FORMA ZPRACOVATELNÁ NA POČÍTAČI:

(A) TYP MEDIA: disketa (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0,

Verze #1.25 (EPO) (2) INFORMACE PRO SEKV. ID Č.l:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 25 bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) USPOŘÁDÁNÍ ŘETĚZCŮ (strandedness): jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) HYPOTETICKÁ SEKVENCE (HYPOTHETICAL): ne (iii) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID Č.l:

5’ - ACTATGGACCAATTGGTGAAAACTG (2) INFORMACE PRO SEKV. ID Č.2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• · • 0

- 27 -

0 · · 0 0 « · • · · · · ··· * » · · * 0 ······» 0 0·· ·· · · ·

(A) DÉLKA:	23 bází
(B) TYP: (C) USPOŘÁDÁNÍ ŘETĚZCŮ:	nukleová kyselina j ednoduché
(D) TOPOLOGIE:	lineární
(i i) HYPOTETICKÁ SEKVENCE:	ne
(iii) POPIS SEKVENCE: SEKV.	ID Č.2:

5’ - AGTCACATGGTGCTGTTGTGCTT (2) INFORMACE PRO SEKV. ID Č.3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:	25 bází
(B) TYP: (C) USPOŘÁDÁNÍ ŘETĚZCŮ:	nukleová kyselina jednoduché
(D) TOPOLOGIE:	lineární
(ii) HYPOTETICKÁ SEKVENCE:	ne
(iii) POPIS SEKVENCE: SEKV.	ID Č.3:

5’ - GAATTCAACCATGGACAAGAAGAAG (2) INFORMACE PRO SEKV. ID Č.4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA:	24 bází
(B) TYP: (C) USPOŘÁDÁNÍ ŘETĚZCŮ:	nukleová kyselina j ednoduché

• · • · (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) HYPOTETICKÁ SEKVENCE: ne (iii) POPIS SEKVENCE: SEKV. ID Č.4:

5’ - AGAATTCCACAGAACAGTTGCAGG

Přehled citované literatury

Basson, M.E., Thorsness, Μ. , Finer-Moore, J., Stroud, R.M., Řine, J. (1988) Structural and functional conservation between yeast and human 3-hydroxy-3-methylgluataryl coenzyme A reductases, the rate-limiting enzyme of sterol biosynthesis. Mol. Cell. Biol. 8: 3793-3808.

Bennetzen, J. L., Halí, B. D. (1982) The primary structure of the Saccharomyces cerevisiae gene for alcohol dehydrogenase. J. Biol. Chem. 257: 3018-3025.

Berben, G., Dumont, J., Gilliquet, V., Bolle, P. A., Hilger, F. (1991) The YDp plasmids: a uniform set of vectors bearing versatile gene disruption cassettes for Saccharomyces cerevisiae. Yeast 7: 475-477.

Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. (1987) 5-Fluorootic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods in Enzymology 154: 164-175.

Fegueur, Μ., Richard, L., Charles, A.D., Karst, F. (1991) isolation ans primary structure of the ERG9 gene of Saccharomyces cerevisiae encoding squalene synthetase. Current Genetics 20: 365-372.

Fischhoff, D. A., Vaterston, R. H., Olson, Μ. V. (1984) The yeast cloning vector YEpl3 contains a tRNALeu3 gene that can mutate to an amber suppressor. Gene 27: 239-251.

Jandrositz, A. , Turnowsky, F., Hógenauer, G. (1991) The gene encoding squalen epoxidase from Saccharomyces cerevisiae: cloning and characterization. Gene 107: 155-160.

Mezei, L. M., Storts, D. R. (1994) in: PCR technology: current innovations, Griffin, H. G. and Griffin, A. Μ. , eds CRC Press, Boča Raton, 21.

Mortimer, R. K., Johnston, J. R. (1986) Genealogy of principál strains of the yeast genetic stock center. Genetics 113: 35-43.

Lang C., Looman A.C. (1995) Efficient expression and secretion of Aspergillus niger RH5344 polygalacturonase in Saccharomyces cerevisiae. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44: 147-156.

Parks LV, Bottema CDK, Rodriguez RJ, Lewis TA (1985) Yeast sterols: yeast mutants as tools for the study of sterol metabolism. Meth. Enzymol. 111: 333-346.

Qureshi, N., Nimmannit, S., Porter, J. V. (1981)

3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase from Yeast. Meth. Enzymol. 71: 455-461.

Ruohonen, L., Aalto, M.K., Keranen, S. (1995) Modifications to the ADH1 promotér of Saccharomyces cerevisiae for efficient production of heterologous proteins. Journal of Biotechnology 39: 193-203.

Siduh, R. S., Bollon, A. P. (1990) Bacterial plasmid pBR322 sequences serve as upstream activating sequences in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 6: 221-229.

Tschumper, G., Carbon, J. (1980) Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and the TRPÍ ··· · * 9 ···· • · · · · · » · · · · · • « ··· ······· ·· · • ·· ·· · ···· «··*·· · · · ·· · · gene. Gene 10: 157-166.

Webster, T. D., Dickson, R. C. (1983) Direct selection of Saccharomyces cerevisiae resistant to the antiobiotic G418 following transformation with a DNA vector carrying the kanamycin-resistance gene of Tn903. Gene 26: 243-252.

Yang, Η., Bard, M., Bruner, D. A., Gleeson, A., Deckelbaum,

R. J., Aljinovic, G., Pohl, Τ. Μ., Rothstein, R., Sturley,

S. L. (1996) Sterol esterification in yeast: a two-gene process. Science 272: 1353-1356.

Yanisch-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. Gene 33 (1985) 103-119.

Yu, C., Rothblatt, J.A. Cloning and characterisation of the Saccharomyces cerevisiae acyl-CoA:sterol acyltrensferase (1996), The Journal of Bioiogical Chemistry, 271: 2415724163.

Claims (24)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob výroby ergosterolu a jeho meziproduktů, vyznačující se tím, že

   a) se nejprve provede konstrukce plasmidu, do něhož se vkládá několik genů vhodných pro látkovou přeměnu ergosterolu nebo

   b) se nejprve provede konstrukce plasmidu, do něhož se vkládá vždy jeden z genů vhodných pro látkovou přeměnu ergosterolu,

   c) takto připraveným plasmidem se transformují mikroorganismy, přičemž se tyto mikroorganismy transformují jedním plasmidem podle a) nebo několika plasmidy podle

   b) současně nebo postupně,

   d) s takto připravenými mikroorganismy se provede fermentace na ergosterol,

   e) po provedené fermentaci se ergosterol a jeho meziprodukty z buněk extrahují a analyzují a konečně

   f) takto získaný ergosterol a jeho meziprodukty se čistí a izolují pomocí sloupcové chromatografie.
2. 2. Způsob podle nároku 1, • · , že plasmidu, do něhož se

   - 33 vyznačující se tím a-i) se nejprve provede konstrukce vkládají následující geny:

   i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG), ii) gen skvalensynthetasy (ERG9) iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI) a iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo a-ii) se nejprve provede konstrukce plasmidu, do něhož se vkládají následující geny:

   i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG), a

   ii) gen skvalensynthetasy (ERG9), nebo a-iii) se nejprve provede konstrukce plasmidu, do něhož se vkládají následující geny:

   i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG) a

   iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI), nebo • · · · a-iv) se nejprve provede konstrukce plasmidů, do něhož se vkládají následující geny:

   i) gen HMG-CoA-reduktasy (t-HMG) a

   iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo a-v) se nejprve provede konstrukce plasmidů, do něhož se vkládají následující geny:

   ii) gen skvalensynthetasy (ERG9) a

   iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI) nebo a-vi) se nejprve provede konstrukce plasmidů, do něhož se vkládají následující geny:

   ii) gen skvalensynthetasy (ERG9) a

   iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo • · · • ::..

   .· : : • · · · · · a-vii) se nejprve provede konstrukce plasmidů, do něhož se vkládají následující geny:

   iii) gen acyl-CoA:sterol-acyltransferasy (SÁTI) a

   iv) gen skvalenepoxidasy (ERG1), nebo

   b) se nejprve provede konstrukce plasmidů, do něhož se vkládá vždy jeden z genů uvedených pod a-i,

   c) pomocí takto připravených plasmidů se transformují mikroorganismy, přičemž tyto mikroorganismy se transformují jedním plasmidem uvedeným pod a-i) až a-vii) nebo několika plasmidy uvedenými pod b) současně nebo postupně,

   d) s takto získanými mikroorganismy se provede fermentace na ergosterol,

   e) po provedené fermentaci se ergosterol a jeho meziprodukty vyextrahuj i z buněk a analyzuj i a konečně

   f) takto získaný ergosterol a jeho meziprodukty se čistí a izolují pomocí sloupcové chromatografie.

   • · · • · · • · · · • · ¹
3. 3. Způsob podle nároku 2 , vyznačující se tím, že se do plasmidu pod a-ii), a-iii) a a-v) navíc vkládá gen skvalenepoxidasy (ERG1) a do plasmidu a-ii) se vkládá navíc gen acyl-CoA:sterol-acyl-transferasy.
4. 4. Způsob výroby ergosterolu a jeho meziproduktů, vyznačující se tím, že geny s plasmidy, uvedené v nároku 1 pod a), v nároku 2 pod a-i) až a-vii) a v nároku 3 pod a-ii), a-iii) a a-v) , se nejprve nezávisle na sobě zavedou do mikroorganismů stejného druhu a spolu s nimi se provede fermentace na ergosterol a takto získaný ergosterol se z buněk extrahuje, analyzuje, čistí a izoluje pomocí sloupcové chromatografie.
5. 5. Způsob podle nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že meziprodukty jsou skvalen, farnesol, geraniol, lanosterol, zymosterol, 4,4-dimethylzymosterol, 4-methylzymosterol, ergost-7-enol a ergosta-5,7-dienol.
6. 6. Způsob podle nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že meziprodukty jsou steroly s 5,7-dřeňovou strukturou.
7. 7. Způsob podle nároků 1 až 4 , vyznačující se tím, že plasmidy jsou YEpH2 (obr. 1), YDpUHK3 (obr. 2) a pADL-SATl (obr. 3).
8. 8. Způsob podle nároků 1 až 4 , vyznačující se tím kvasinky.

   že mikroorganismy jsou • · « · • · «

   37 že použitým druhem že použitým kmenem je
9. 9. Způsob podle nároku 8 , vyznačující se jsou S.cerevisiae.
10. 10. Způsob podle nároku 9 , vyznačující se S.cerevisiae AH22.
11. 11. Kmen kvasinek S.cerevisiae AH22, obsahující jeden nebo více genů uvedených ve způsobu pod a-i).
12. 12. Plasmid pADL-SATl (obr. 3), skládající se z genu SÁTI a z genu LEU2 z YEpl3.
13. 13. Použití plasmidů podle nároku 12 pro výrobu ergosterolu.
14. 14. Použiti plasmidů podle nároku 12 pro výrobu meziproduktů při výrobě ergosterolu, kterými jsou skvalen, farnesol, geraniol, lanosterol, zymosterol,

    4,4-dimethylzymosterol, 4-methylzymosterol, ergost-7-enol, a ergosta-5,7-dienol.
15. 15. Použití plasmidů podle nároku 12 pro výrobu sterolů s 5-7-dienovou strukturou.
16. 16. Expresní kazety zahrnující střední ADH-promotor, ΐ-HMG-gen a TRP-terminátor a SATl-gen se středním ADH-promotorem a TRP-terminátorem.
17. 17. Expresní kazety zahrnující střední ADH-promotor, t-HMG-gen, TRP-terminátor, SATl-gen se středním ADH-promotorem a TRP-terminátorem a ERG9-gen se středním • · • 0 • · • · « ·

    ADH-promotorem a TRP-terminátorem.
18. 18. Kombinace expresních kazet, přičemž tuto kombinaci tvoří

    a) první kazeta, na níž je lokalizován ADH-promotor, t-HMG-gen a TRP-terminátor

    b) druhá expresní kazeta, na níž je lokalizován ADH-promotor, SATl-gen a TRP-terminátor

    c) třetí expresní kazeta, na níž je lokalizován ADH-promotor, ERG9-gen s TRP-terminátorem.
19. 19. Použití expresních kazet podle nároků 16 až 18 pro transformaci mikroorganismů, použitých pro fermentaci na ergosterol.
20. 20. Použití podle nároku 19 , vyznačující se tím, že mikroorganismem jsou kvasinky.
21. 21. Mikroorganismy obsahující expresní kazety podle nároků 16 až 18.
22. 22. Mikroorganismus podle nároku 21 , vyznačující se tím, že se jedná o kvasinky.
23. 23.

    Použití mikroorganismu podle nároků 21 a 22 pro fer39 • · ·· • · • · • · · · · · meirtaci na ergosterol.
24. 24. Použití mikroorganismu podle nároků 21 a 22 pro fer mentaci na meziprodukty ergosterolu.