CZ20001175A3 - Ve vodě rozpustné agregáty insulinových derivátů charakterizované větší velikostí než aldolasa, farmakologické preparáty, farmakologická směs - Google Patents

Abstract

Ve vodě rozpustné agregáty derivátů lidského insulinu, které mají prodlouženou délku působení. Prodloužení působení rozpustných insulinových derivátů, kde mechanismusje založen na částečné nebo úplné tvorbě rozpustných agregátových forem derivátů, vyznačujících se větší velikostí než aldolasa (M. hmotn.=158 kDa) v definovaném gelovém systému. Použití pro výrobu léčiva k léčení diabetes mellitus.

Description

Ve vodě rozpustné agregáty insulinových derivátů charakterizované větší velikostí než aldolasa, farmakologické preparáty, farmakologická směs |-zpťršob léčb|.

OBLAST TECHNIKY

Prezentovaný vynález se týká prodlouženého působení ve vodě rozpustných agregátů derivátů lidského insulinu, derivátů lidského insulinu schopných tvořit takové agregáty, farmaceutických prostředků je obsahujících a používaných k léčbě cukrovky.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Cukrovka je obecný termín pro poruchy u osob se zvýšeným vylučováním moči jako při diabetes mellitus a diabetes insipidus. Diabetes mellitus je metabolická porucha, při které je snížena nebo úplně ztracena schopnost utilizovat glukosu. Asi 2 % lidstva trpí cukrovkou.

Od objevení insulinu v roce 1920 vede stálý pokrok ke zlepšení léčby diabetes mellitus. K lepšímu zabránění extrémních glykemických hladin diabetici často praktikují mnohonásobnou injekční terapii, kdy je insulin podáván s každým jídlem. Mnoho diabetiků je léčeno několikrát denními insulinovými injekcemi v dietě zahrnující jedenkrát nebo dvakrát denní injekce zpomaleného insulinu k pokrytí bazální potřeby doplněné tabletovými injekcemi rychle působícího insulinu k pokrytí jídlem daných potřeb.

Zpomalené insulinové prostředky jsou dobře známy v technice. Jeden hlavní typ zpomalených insulinových prostředků obsahuje injektabilní vodnou suspenzi insulinových krystalů nebo amorfního insulinu. V těchto prostředcích jsou typicky využívanými insulinovými složkami protoaminový insulin, zinkový insulin a protaminový zinkový insulin.

Když je lidský nebo zvířecí insulin převeden do vysoce asociovaných forem např. za přítomnosti Zn²' iontů, je výsledkem vysrážení ve formě krystalů nebo amorfního produktu (Brange, Galenics of Insulin, pp. 20-27, Springer Verlag 1987). Tedy v pH 7 a použitím 6 Zn²⁺/hexameru prasečího insulinu je ve výsledku insulin skoro úplně vysrážen z roztoku (Grant, Biochem J. 126, 433-440, 1972). Nejrozpustnější navrhované agregáty jsou složeny ze 4 hexametrických jednotek odpovídající molekulové hmotnosti asi 144 kDa. Blundell et al. (Diabetes 21 (Suppl. 2), 492-505, 1972) popisuje rozpustnou jednotku porcinového insulinu za přítomnosti Zn²⁺při pH 7 jako hexamer. Počáteční ultracentrifugační studie při pH 2 ukazují jako běžný druh insulinový dimer o M. hmtn. 12 kDa (Jeffrey, Nátuře 197, 1104-1105, 1963; Jeffrey, Biochemistry 5, 4892

498, 1966; Jeffrey, Biochemistry 5, 3820-3824, 1966). Fredericq, pracující při pH 8 a používající

0,4 až 0,8 % (hmotn.) Zn²⁺ vzhledem k insulinu podává zprávu o molekulové hmotnosti 72 kDa odpovídající dodekamerické struktuře, a molekulové hmotnosti asi 200-300 kDa za použití 1%

Zn (Arch. Biochem. Biophys. 65, 218-228, 1956). Obsáhlý přehled asociovaných stavů zvířecího insulinu je popsán v Blundell et al. (Adv. protein Chem. 26, 297-330, 1972).

S použitím insulinových suspenzí se spojují jisté nevýhody. Tudíž pro zajištění přesného dávkování musí být insulinové částice suspendovány homogenně opatrným mícháním před odebráním určitého objemu suspenze z ampulek nebo vytlačení ze zásobníku. Pro skladování insulinových suspenzí musí být také teplotní limit omezenější než pro insulinové roztoky , aby bylo zabráněno tvoření shluků nebo koagulaci.

Zatímco se dříve věřilo, že protaminy jsou neimunogenní, teď se ukázalo, že protaminy mohou být imunogenní u lidí a že jejich použití pro medicinální účely může vést ke tvorbě protilátek (Sanuel et al., Studies on the immunogenicity of protamines in humans and experimental animals by means of a micro-complement fíxation test, Clin. Exp. Immunol. 33, pp. 252-260 (1978)). Také bylo objeveno, že protaminový-insulinový komplex je sám o sobě imunogenní (Kortz et al., Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins. Diabetologica 25, pp. 322-324 (1983)). Proto se tedy musí někteří pacienti vyvarovat užívání insulinových prostředků s prodlouženým působením obsahující protaminy.

Jiný typ insulinových prostředků s prodlouženým působením jsou roztoky mající hodnotu pH níže než je fyziologická hodnota pH, ze které bude insulin vysrážen se zvýšením hodnoty pH, při injektování roztoku. Nevýhoda je, že pevné insulinové částice působí jako lokání dráždidlo způsobující zánět tkáně v místě injekce.

WO 91/12817 (Novo Nordisk A/S) objevuje rozpustné insulinové prostředky s prodlouženým působením obsahující insulinové komplexy kobaltu (III). Prodloužení působení těchto komplexů je pouze přechodná a biologická dosažitelnost je redukována.

Rozpustné insulinové deriváty obsahující lipofilní substituenty připojené k ε-aminoskupině lysinových reziduí ve všech pozicích od B26 do B30, což bylo popsáno např. v WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S), WO 96/00107 (Novo Nordisk A/S) a WO 97/31022 (Novo Nordisk A/S). Takové deriváty mají prodloužené působení po podkožní injekci ve srovnání s rozpustným lidským insulinem, a toto prodloužené působení bylo vysvětleno jako vratné navázání na albumin v kůži, v krvi a v povrchových tkáních (Markussen, Diabetologia 39, 281-288, 1996; Kurzhals, Biochem J. 312, 725-731, 1995; Kurzhals, J. Pharm Sciences 85, 304-308, 1996; and Whittingham, Biochemistry 36, 2826-2831, 1997).

Avšak teď byl objeven nový mechanismus prodlužování působení některých rozpustných insulinových derivátů. Nový mechanismus je založen na částečné nebo úplné formaci agregátových forem derivátů vyznačujících se větším rozměrem než aldolasa (M.hmotn.=158kDa) v definovaném gelovém filtračním systému.

PODSTATA VYNÁLEZU

Exprese insulinových derivátů zde používané (a příbuzné exprese) se týkají lidského insulinu nebo jeho analogů, ve kterých je nejméně jeden organický substituent vázán k jedné nebo více aminokyselinám.

Analogem lidského insulinu, jak je zde použito, (a příbuzné exprese) se myslí lidský insulin, ve kterém byla jedna nebo více aminokyselin deletována nebo nahrazena jinými aminokyselinami zahrnujícími nekódované aminokyseliny, nebo lidský insulin obsahující přídatné aminokyseliny, to jest více než 51 aminokyselin.

Prezentovaný vynález je založen na objevu nové agregátové a rozpustné formy insulinových derivátů. Nové rozpustné agregátové formy insulinových derivátů disociují pomalu po podkožní injekci, což je vhodné pro insulinové preparáty s prodlouženým působením a jejichž výhodou je, že preparát neobsahuje sraženiny. Výhodami rozpustných preparátů před suspenzemi je vysoká přesnost dávkování bez míchání ampulek nebo zásobníků, dávka pro tenčí jehlu způsobující menší bolest při injekci, lehčí náplň ampulek nebo zásobníků a vyvarování se kuliček v zásobníku používaných pro rozpuštění sraženin za nepřítomnosti vzduchu.

Prezentovaný vynález se specielně týká ve vodě rozpustných agregátů insulinových derivátů charakterizovaných větší velikostí než aldolasa, lépe větší než ferritin, jak bylo určeno gelovým filtračním systémem jak je zde specifikováno.

Agregáty podle vynálezu mají zejména jasný objem odpovídající K_av hodnotě menší než 0,32, lépe menší než 0,2; jak bylo určeno gelovou filtrací za použití Sephacryl S-300 HR gel nebo K_av hodnotě menší než 0,5; lépe menší než 0,4; jak bylo určeno gelovou filtrací za použití Superose 6HR gel.

Agregáty jsou lépe rozpustné při pH v rozmezí 6,8 až 8,5.

Nové agregátové formy mohou být pozorovány pro insulinové deriváty mezi podmínkami, kde je existence hexamerů známá pro většinu insulinů. V preferované podstatě jsou agregátové formy tvořeny hexametrickými jednotkami, nejméně 4, lépe 5 až 50, ještě lépe 5 až 200. Všechny hexametrické jednotky agregátových forem tohoto vynálezu mohou mít všechny známé FL, R3T3 nebo T₆ struktury (Karsholm, Biochemistry 28, 4427-4435, 1989).

• · · ·· ···· · ♦ ·· • · · · · · · ···· • · ····· ···· • ··· · ··· · · · • · ·· · ···· ······· ·· ··· ·· *· t

U substancí jako Zn²⁺ a sloučenin fenolu známých stabilizací hexamerických jednotek byla také nalezena schopnost stabilizace nových agregátových forem některých insulinových derivátů. Stavebními bloky formujícími agregáty mohou být hexamerické jednotky známé z Xpaprskového krystalografického určení struktur insulinu (Blundell, Diabetes 21 (Suppl.2), 492505, 1972). Ionty jako Zn²⁺ známé jako stabilizátory hexamerických jednotek jako 2 nebo 4 Zn²⁺/hexamer komplexy (Blundell, Diabetes 21 (Suppl. 2), 492-505,1972), jsou nepostradatelné pro formaci agregátů pro některé deriváty jako Lys^B29 (Ν^ε ω-karboxyheptadekanoyl) des(B30) lidského insulinu. Obr.2 ukazuje gelovou filtraci Lys^B29 (N® ω-karboxyheptadekanoyl) des(B30) lidského insulinu v systému zde popisujícím preparáty obsahující 0, 2 a 3 Zn /hexamer.

V nepřítomnosti Zn²⁺ nejsou agregáty tvořeny, eluční pozice určují přítomnost monomeru nebo dimeru. Agregáty podle vynálezu obsahují nejméně 2 ionty zinku, lépe 2 až 5, zvláště 2 nebo 3 ionty zinku na 6 molekul insulinových derivátů. Avšak agregáty obsahují příznivě nejméně 3 molekuly fenolových sloučenin na 6 molekul insulinového derivátu. V centrální dutině 2 Zn /hexamerové struktury poskytuje 6 reziduí Glu ' vazebná místa pro nejvíce 3 Ca ionty (Sudmeier et al., Science 212, 560-562, 1981). Přídavek Ca²'iontů stabilizuje hexamery a může být přidán do farmaceutických formulací za podmínek, že jsou deriváty insulinu odstraněny z roztoku.

Poločas agregátů tohoto vynálezu po podkožní injekci u lidí je stejný nebo delší než u preparátu lidského insulinu NPH:

V zvláště preferované podstatě prezentovaného vynálezu jsou agregáty složeny z insulinových derivátů, které se váží na albumin, který je nižší než Lys^B29(N^Etetradekanoyl)des(B30) lidského insulinu.

Preferované primární struktury insulinových derivátů využité v prezentovaném vynálezu jsou ty, ve kterých jsou:

a) rezidua B24-B30 B-řetězce insulinových derivátů v sekvenci Phe-X-X-X-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny kódující aminokyseliny nebo delece;

b) rezidua B25-B30 B-řetězce insulinového derivátu je sekvence Phe-X-X-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny kódující aminokyseliny nebo delece;

c) rezidua B26-B30 B-řetězce insulinového derivátu je sekvence Tyr-X-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny kódující aminokyseliny nebo delece;

d) rezidua B27-B30 B-řetězce insulinového derivátu je sekvence Thr-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny kódující aminokyseliny nebo delece;

e) rezidua B28-B30 B-řetězce insulinového derivátu je sekvence Pro-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny kódující aminokyseliny nebo delece; nebo

• ·

f) rezidua B29-B30 B-řetězce insulinového derivátu je sekvence Lys-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny kódující aminokyseliny nebo delece;

a zajišťují, že insulinové deriváty vykazují sílu nejméně 5 % jak je například stanoveno zkouškou volnými tukovými buňkami nebo afinitou k insulinovému receptoru.

Substituenty v lysino vých zbytcích insulinového derivátu agregovaného podle vynálezu jsou zejména lipofilní skupiny obsahující od 6 do 40 uhlíkových atomů. Více preferovány jsou substituenty, které mají acylové skupiny obsahující od 6 do 40, lépe 12 až 36 uhlíkových atomů. Nejvíce preferovanými substituenty ve formě acylových skupin jsou: CH3-(CH2)_n-CO-, (COOH)-(CH₂)_n-CO-, (NH₂-CO)-(CH₂)n-CO-, HO-(CH₂)_n-CO-, kde 4<n<38.

V jiném preferovaném předmětu tohoto vynálezu je lipofilní substituent 5-ot lithocholová kyselina nebo 5-β lithocholová kyselina.

V jiném preferovaném předmětu tohoto vynálezu jsou lipofilními substituenty 5-ot nebo 5-β isomery cholové kyseliny, hyocholové kyseliny, deoxycholové kyseliny, chenodeoxycholové kyseliny, ursodeoxycholové kyseliny, hyodeoxycholové kyseliny nebo cholanikové kyseliny.

V jiném preferovaném předmětu je lipofilní substituent fusidová kyselina a deriváty fusidové kyseliny nebo glycyrrhetinové kyseliny.

V už jiném preferovaném předmětu je lipofilní substituent spojen s lysinovým zbytkem používajícím aminokyselinové spojení. Podle tohoto předmětu je lipofilní substituent vhodně spojen s lysinovým zbytkem přes γ nebo ot-glutamyl, nebo přes β nebo α-aspartyl, nebo přes otamido-y-glutamyl nebo přes ot-amido^-aspartyl.

Prezentovaný vynález kromě toho poskytuje nové insulinové deriváty schopné formovat agregáty. Tyto insulinové deriváty mohou být poskytovány ve formě agregátů ve farmaceutických preparátech nebo mohou být alternativně poskytnuty v neagregátových formách ve farmaceutických preparátech, v takovém případě se agregátové formy tvoří po podkožní injekci zmíněných preparátů.

Stejně tak jde prezentovanému vynálezu o to, aby farmaceutické preparáty zahrnovaly agregáty insulinových derivátů nebo neagregátové insulinové deriváty, které formují agregáty po podkožní injekci.

Farmaceutické preparáty podle prezentovaného vynálezu zahrnují agregáty, zejména velké frakce, v kterých mají agregáty (nejlépe více ne 75 %) větší velikost než aldolasa jak je určeno gelovou filtrací za použití média preparátu jako eluentu.

V jiném předmětu je poskytován farmaceutický preparát zahrnující oba, agregátový a rychle působící insulinový analog, druhý preferovaný lidský insulin nebo insulinový analog Asp lidského insulinu, Lys^B28Pro^B29 lidského insulinu nebo des(B30) lidského insulinu. Takové preparáty budou poskytovat rychlí začátek působení a stejně tak prodloužený akční profil.

V tomto případě zahrnují farmaceutické preparáty zejména agregátový insulin a rychle působící insulin v molárním poměru 90:10 až 10:90.

Pomalá disociace agregátových forem může být také zpomalen in vivo přídavkem fyziologicky akceptovatelného činidla, které zvýší viskozitu farmaceutického preparátu. Farmaceutický preparát podle vynálezu může také zahrnovat činidlo, které zvýší viskozitu, nejlépe polyethylenglykol, polypropylenglykol, jejich kopolymery, dextrany a polyaktidy.

Farmaceutické preparáty také zahrnují pufrovací látky takové jako Tris, fosfát, glycin, glycylglycin (nebo jiné povrchově aktivní látky) pufry, isotonická činidla jako NaCI, glycerol, manitol a laktosa, fenol a w-kresol jako přísady. Společně to jsou pomocné látky farmaceutických preparátů, chlorid sodný se používá jako isotonické činidlo, fenol jako konzervační látka, zvláště důležitá pro podporu agregátů v přípravě a tím efektivně prodlouženému času rozkladu v místě působení. Farmaceutické preparáty podle vynálezu zahrnují zejména Na⁺ ionty v koncentraci 10 až 150 mM.

Nej preferovanější farmaceutické preparáty jsou preparáty obsahující 0,1 až 2 mM insulinového derivátu podle presentovaného vynálezu; 0,3 až 0,9 % Zn (hmtn. % vzhledem k insulinovému derivátu) a fenolytické sločeniny jako je fenol nebo «/-kresol nebo jejich směs v celkové koncentraci 5 až 50 mM a Na⁺ ionty v koncentraci 10 mM až 150 mM.

Prezentovaný vynález se také týká metod léčby diabetes mellitus poskytující osobám, kteří potřebují takovou léčbu, efektivní množství ve vodě rozpustných agregátů insulinových derivátů podle vynálezu nebo efektivní množství insulinového derivátu podle vynálezu schopného formovat ve vodě rozpustné agregáty po podkožní injekci.

Insulinové deriváty tohoto vynálezu mohou být připraveny obecnými metodami popsanými v WO 95/07931 (Novo Nordisk A/S), WO 96/00107 (Novo Nordisk A/S), WO 97/31022 (Novo Nordisk A/S), PCT aplikace č. DK97/00296 (Novo Nordisk A/S), EP 511 600 (Kurakay Co. Ltd.) a EP 712 862 (Eli Lilly). Deriváty v tabulce 2 byly připraveny selektivní acylací εaminoskupiny Lys ^B29 des(B30) lidského insulinu pomocí ligandů aktivovaných ve formě příslušných esterů N-hydroxysukcinamidu. Konjugované estery mohou být připraveny použitím konvenční peptidové chemie (obr.4).

Některé deriváty jsou uvedené ve výše zmíněných patentových aplikacích a jsou popsány v publikacích Markussen, Diabetologia 39, 281-288, 1996; Kurzhals, Biochem. J. 312, 725-731, 1995; Kurzhals, J Pharm. Sciences 85, 304-308, 1996; a Whittingham, Biochemistry 36, 28262831, 1997, jak je prodlouženo působení následkem albuminového vazebného mechanismu, a ·

• · · · · · · ·«·« • · ····· ···· tvoří skupinu schopnou tvořit vysokomolekulámí rozpustné agregáty v souladu s prezentovaným vynálezem. Lys^B29(hT lithocholyl-y-Glu) des(B30) lidského insulinu z WO 95/07931 a Lys^B29(N® ω-karboxyheptadekanoyl-) des (B30) lidského insulinu zWO 97/31022 jsou příklady insulinových derivátů schopných tvorby vysokomolekulárních rozpustných agregátů v neutrálním pH. Zde je selektivita mezi lipofilními substituenty vjejich schopností indukovat tvorbu agregátů. Dva isomery Lys^B29(N^E lithocholyl-y-Glu) des(B30) lidského insulinu a Lys^B29(N^E lithocholyl-a-Glu) des(B30) lidského insulinu jsou pouze prvními formami agregátů použitých ve vyjádření v tabulce 1.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obr. 1. Kalibrační křivka Kav hodnoty proti molekulové hmotnosti v gelovém filtračním systému používajícím kolonu Sephacryl S-300 HR ve vodném neutrálním eluentu obsahujícím 125 mM chlorid sodný a 20 mM fosforečnan sodný pH 7,4. Je pozorována počáteční lineární závislost mezi Kav a logaritmem molekulové hmotnosti. Standardy jsou uvedeny v tabulce 1.

Obr.2. Gelová filtrace Lys^B29(N^e ω-karboxyheptadekanoyl-) des (B30) lidského insulinu má 0,2 a 3 Zn²⁺/hexamer používající kolonu Sephacryl S-300 HR ve vodném neutrálním eluentu obsahujícím 125 mM chlorid sodný a 20 mM fosforečnan sodný pH 7,4 ukazující důležitost Zn²⁺ pro tvorbu agregátů pro tyto deriváty. Kolona 28 x 1 cm je eluována rychlostí 15 mí/h. Insulinové deriváty byly injektovány (200pil) jak standardní preparáty obsahující 600 μΜ derivátu; 0,2 nebo 3 Zn²⁺/6 molekul insulinu, 20 mM NaCl, 16 mM fenol, 16 mM /n-kresol, 7 mM fosforečnan sodný při pH 7,5.

Obr.3. Gelová filtrace Lys^B29(N'^: ω-karboxyheptadekanoyl-) des (B30) lidského insulinu majícího 3 Zn²⁺/hexamer používající kolonu Sephacryl S-300 HR ve vodném neutrálním eluentu obsahujícím 5 mM sodium fosfátový pufr pH 7,5; 10 mM chlorid sodný, 16 mM fenol, 16 mM m-kresol a 1,6% (hmotn./obj.) glycerol. Ve srovnání s obr. 2 objasňuje důležitost koncentrace chloridu sodného pro tvorbu agregátů tohoto derivátu.

Obr.4. Schéma syntézy konjugovaných ligandů.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Agregátové formy jsou demonstrované gelovou filtrací používající gel s limitem do 1 500 kDa pro globulární proteiny a do 400 kDa pro lineární dextrany. Vodný neutrální pH sytém je použit v gelové filtraci a insulinové deriváty v agregátové formě jsou aplikovány do kolony ve formě • · · ·

farmaceutických preparátů v koncentraci 600 nmol insulinu/ml. Agregátové formy insulinových derivátů jsou eluovány před aldolasou, která má molekulovou hmotnost 158 kDa.

Gelový filtrační experiment používají podmínky popsané v této sekci je řízen fyzikálně chemickými metodami k odhalení potencionálních agregátových forem insulinových derivátů. Rozklad po podkožní injekci v prasatech ukazuje kombinaci albuminové vazby a polymeračních vlastností insulinového derivátu vedle různých biologických faktorů.

Tvorba vysokomolekulárních rozpustných agregátů je demonstrována gelovou filtrací používající kolonu Sephacryl S-300 HR ve vodném neutrálním eluentu obsahujícím 125 mM chlorid sodný a 20 mM fosforečnan sodný pH 7,4. Tento pufrovací systém byl vybrán k napodobení iontové síly a pH tkání, aby byl schopen detekovat deriváty agregované podmínkách podobných těm po podkožním vpravení. Evidentně v jiném pufrovacím systému mající nižší koncentraci chloridu sodného nebo nižší nebo vyšší pH hodnotu nemusí se deriváty vyskytovat v agregované formě. Avšak, když má být posouzen aktuální stav agregátů ve farmaceutických preparátech je médium preparátů, zejména Zn²⁺, který váže insulin, použito jako eluent pro gelovou filtraci.

Kolona 28 x 1 cm je eluována rychlostí 15 ml/h. Insulinové deriváty byly injektovány (200μ1) jako standardní přípravky obsahující 600 μΜ derivátu, 200 nebo 300 μΜ Zn , 20 mM NaCl (nebo různě), 16 mM fenol, 16 mM w-kresol, 7 mM fosfátový pufr pH 7,5.

Omezený limit Sephacryl S-300 HR je určen výrobcem Pharmacia, jako molekulová hmotnost 1 500 kDa pro globulární proteiny a 400 kDa pro lineární dextrany. V praxi eluce rozpustných látek rozdílné velikosti je charakterizováno dostupným objemem jak K_Av hodnotami:

K_Av=(Ve-Vo)/(Vt-V_o) kde Ve je eluční objem, Vo je nultý objem, např. luční objem modrého dexranu, Vt je celkový objem. Kav hodnota je nezávislá na rozměru kolony. V tomto systému je aldolasa (M.hmotn. 158 kDa) eluována při K_Av asi 0,32, albumin (M.hmotn. 67 kDa) při K_Av asi 0,38; a monomerická forma insulinu (M.hmotn. 6 kDa) s K \v asi 0,71. Kalibrace kolony používá sérii standardů molekulové hmotnosti vyskytujících se v lineární závislosti mezi K_Av a logaritmem molekulové hmotnosti obr. 1.

Tabulka 1. K_Av hodnota, albumin vazebné konstanty a poločas rozkladu asociovaných insulinových derivátů větších než aldolasa (M.hmotn. 158 kDa), neasociované insulinové deriváty menší než aldolasa a standardy používané jako markéry molekulové velikosti. Albumin vazebné konstanty a poločas rozkladu v prasatech byly normalizovány na použití Lys^B29(N^e « · tetradekanoyl-) des (B30) lidského insulinu jako referentní sloučeny. Rozklad Tso% pro NPH insulin v prasatech byl měřen 10,5 hodiny (Markussen et al. 1996).

Sloučeniny	Kav	Albumin vazebná Kass (mol/Ι)'1	Rozklad Tso%, (h)
Asociované deriváty lidského insulinu tvořící agregáty větší než aldolasa**
LysB29(NE lithocholyl-y-Glu-) des (B30)	0,04*	0,3xl05	22,8
LysB29(N£ ω-karboxyheptadekanoyl) des(B30)	0,05	25xl05	18,7
LysB29(NE ω-karboxynonadekanoyl) des(B30)	0,04	36xl05	21,9
LysB29(NE cholesteryloxykarbonyl)	0,00
Neasociované deriváty lidského insulinu tvořící agregáty menší než aldolasa**
Lidský insulin***	0,61	0	(2)
Lidský insulin (bez zinku)	0,72
LysB29(Nb lithocholyl) (bez zinku)	0,74
LysB29(NK dekanoyl) ***	0,67	0,06x105	5,1
LysB29(Nb tetradekanoyl) des(B30)	0,51	1,0x105	14,3
LysB29(Ne lithocholyl-cc-Glu-) des(B30)	0,53	0,3xl05	11,8
Standardy****
B9Asp, B27Glu lidský insulin (monometrický, M. hmotn 6 kDa)	0,71	0	(1)
Ribonukleasa (M.hmotn. 13,7 kDa)	0,63
Albumin (M.hmotn. 67 kDa)	0,38
Aldolasa (M.hmotn. 158 kDa)	0,32
Kataiasa (M.hmotn. 232 kDa)	0,30
Ferritin (M.hmotn. 440 kDa)	0,19
Thyroglobulin (M.hmotn. 669 kDa)	0,08

*75 % derivátů je eluováno v hlavním píku a 25 % v pozici monomeru nebo dimeru.

**Aplikováno 200 μΐ vzorku jako farmaceutického preparátu obsahujícího 600 μΜ derivátu, 200 μΜ Zn²⁺, 0 až 20 mM chloridu sodného, 7 mM fosforečnan sodný, 16 mM fenol, 16 mM w-kresol, 1,6% glycerol a pH 7,5.

***Stejnč jako **, ale 300 μΐ Zn²⁺.

****Standardy aplikovány rozpuštěné ve vodě.

• · • ·

Příklady insulinových derivátů schopných tvořit rozpustné vysokomolekulámí agregáty a majících prodloužené působení založeném na zejména na těchto vlastnostech jsou Lys^B29(N^£ lithocholyl-y-Glu-) des (B30) lidského insulinu v tab.l. Zejména poměr mezi poločasem rozpadu a albumin vazebnou konstantou je vysoký pro tuto třídu sloučenin. Příklady insulinových derivátů neschopných tvořit rozpustné vysokomolekulámí agregáty, ale májích prodloužené působení založené na albumin vazebných vlastnostech jsou Lys^B29(N^€ lithocholyl-y-Glu-) des (B30) lidského insulinu a Lys^B29(N^€ -tetradekanoyl-) des (B30) lidského insulinu, tab.l. Zejména poměr mezi poločasem rozkladu a albumin vazebnou konstantou je pro tuto třídu sloučenin nízký.

VWO 97/31022 a farmaceutické přípravě Lys^B29(N^E ω-karboxyheptadekanoyl) des(B30) lidského insulinu byl formulován obsah 600 nmol/ml derivátu, 5 mM sodium fosfátového pufru pH 7,5; 10 mM chlorid sodný, 16 mM fenol, 16 mM w-kresol, 2 až 3 Zn²⁺/hexamer a 1,6 % (hmotn./obj.) glycerolu. Ke stabilizaci stupně agregace v této formulaci byla gelová filtrace provedena použitím stejné kolony, jak je popsáno výše, ale s použitím média preparátu jako eluentu. Zn²⁺ jsou většinou insulin vazné a proto nejsou brány za základní složku média. Zatímco eluent obsahuje fenolové látky, koncentrace derivátu ve frakcích je monitorována HPLC, obr.3. K_Av hodnota okolo 0,45 ukazuje, že hexamerické nebo dodekamerické jednotky v preparátech převažují, např nevysokomolekulární agregáty insulinových derivátů byly prezentovány v publikovaných formulacích.

K měření způsobilosti insulinových derivátů tvořících rozpustné vysokomolekulámí agregáty byly vyvinuta alternativní metoda vhodná pro HPLC vybavení. Rozměry kolony, injekční objem a průtoková rychlost koresponduje s první metodou, kde teplota vzrostla na 37 °C a fosfátový pufr byl vyměněn trishydroxymethylaminomethan hydrochloridem a přidán chlorid sodný. Agregátové formy insulinu jsou eluovány před aldolasovými standardy gelové filtrace jako v první metodě.

Kav hodnoty jsou ukázány pro dvě hladiny zinku v tabulce 2. Srovnání s referencí, Lys^B29(N^E tetradecanoyl-) des(B30) insulinu, časově dlouhé čerpání z podkožní zásoby je v souladu s tendencí insulinového derivátu tvořit velké agregáty.

Tabulka 2. Agregáty insulinových derivátů měřené metodou gelové filtrace 2.

Sloučeniny	Kav (Superose 6HR)2)	Albumin. vazba	Rozklad u prasat υ
2Zn2+/6 ins	3Zn2+/6 ins	Kass (105M*’)	Tso%(h)
LysB29(LT lithocholoyl-y-Glu-) des (B30) HI	0,00	-0,01	0,33	22,8
LysB29(N® deoxycholoyl-y-Glu-) des (B30) HI	0,20	0,07	0,03	13,9
LysB29(N€ lithocholoyl-a-amido-y-Glu-) des (B30) HI	-0,02	0,00	0,23	>34
LysB29(Nh lithocholoyl-P-Asp-) des (B30) HI	0,18	0,11	n.d.	n.d.
LysB29(Ni: lithocholoyl-P-Ala-) des (B30) HI	0,00	0,13	n.d.	n.d.
LysB29(NK lithocholoyl-y-aminobutanoyl-) des (B30) HI	0,06	0,00	n.d.	n.d.
LysB29(N'' lithocholoyl -) des (B30) HI	-0,01	0,23	0,38	>34
LysB29(Nh dehydrolithocholoyl) des (B30) HI	0,05	0,03	0,26	>34
LysB29(NL cholanoyl) des (B30) HI	0,40	0,17	0,48	20,1
LysB29(Ní hexadekanoyl-a-amido-y-Glu-) des (B30) HI	0,38	0,41	0,56	15,3
AspA21LysB29(Nfctetradekanoyl-)des (B30) HI	0,55	0,46	0,97	16,4
LysB29(NKtetradekanoyl-)des (B30) HI	0,58	0,56	1,00	14,3
Lidský insulin, (HI)	0,64	0,64	-	2
Standardy
AspB9GluB2/ HI (monomer, M.hmotn. 6 kDa	0,73
Ribonukleasa (M.hmotn. 13,7 kDa)	0,72
Ovalbumin (M.hmotn. 43 kDa)	0,58
Aldolasa (M.hmotn. 158 kDa)	0,50
Ferritin (M.hmotn. 440 kDa)	0,40
Thyroglobulin (M.hmotn. 669 kDa)	0,28

¹'Vztažena na Lys^B2<J(N^ctctradekanovl-) des (B30) lidského insulinu (T_5fl%=14,3 h) ^2,Superose 6 HR 10/30 (Pharmacia Biotech) je eluována ph 37°C chloridem sodným 140 mM. trishvdroxymelhvlaminomethan 10 mM, azid sodný 0,02% a kyselina chlorovodíková do pH 7,4. Doba analýzy 90 min. (0,25 ml/min.) je následována promývací periodou 150 min. (0,5 ml/min.). Injekční objem je 200 μΐ.

Claims (44)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Ve vodě rozpustné agregáty insulinových derivátů charakterizované větší velikostí než aldolasa, jak bylo stanoveno gelovým filtračním systémem a specifikováno výše.
2. 2. Agregát podle nároku 1 charakterizovaný větší velikostí než ferritin, jak bylo stanoveno gelovým filtračním systémem a specifikováno výše.
3. 3. Agregát podle nároku 1 mající definovaný objem odpovídající K_Av hodnotě menší než 0,32; lépe 0,2; jak bylo stanoveno gelovou filtraci za použití Sephacryl S-300 HR gel.
4. 4. Agregát podle nároku 1 mající definovaný objem odpovídající K_Av hodnotě menší než 0,50; lépe menší než 0,40, jak bylo stanoveno gelovou filtrací používající Superose 6HR gel..
5. 5. Agregát podle některého z nároků 1 až 4 charakterizovaný rozpustností při pH 6,8 až 8,5.
6. 6. Agregát podle některého z nároků 1 až 5 složený v podstatě z hexamerických podjednotek insulinových derivátů.
7. 7. Agregát podle nároku 6 složený nejméně ze 4, lépe z 5 až 50, ještě lépe z 5 až 200 spojených hexamerických podjednotek.
8. 8. Agregát podle některého z nároku 1 až 7 obsahující nejméně 2 zinkové ionty, lépe 2 až 5 zinkových iontů, ještě lépe 2 až 3 zinkových iontů na 6 molekul insulinového derivátu.
9. 9. Agregát podle některého z nároků 1 až 8 charakterizovaný nejméně 3 molekulami fenolové sloučeniny na 6 molekul insulinového derivátu.
10. 10. Agregát podle některého z nároků 1 až 9 mající poločas rozkladu po podkožní injekci podané člověku stejně dlouhý nebo delší než u preparátu lidského insulinu NPH.
11. 11. Agregát podle některého z nároků 1 až 10, ve kterém jsou insulinové deriváty vázané k albuminu a jsou nižší než Lys^B29(N^E-tetradekanyl)des(B30) lidského insulinu
12. 12. Agregát podle některého z nároků 1 až 11, ve kterém rezidua B24-B30 řetězce B insulinového derivátu je sekvence Phe-X-X-X-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny aminokyseliny nebo delece a nejméně jedno X je N^E-substituovaný lysinový zbytek.
13. 13. Agregát podle některého z nároků 1 až 12, ve kterém rezidua B25-B30 řetězce B insulinového derivátu je sekvence Phe-X-X-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny aminokyseliny nebo delece a nejméně jedno X je ^-substituovaný lysinový zbytek.
14. 14. Agregát podle některého z nároků 1 až 13, ve kterém rezidua B26-B30 řetězce B insulinového derivátu je sekvence Tyr-X-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny aminokyseliny nebo delece a nejméně jedno X je N^E-substituovaný lysinový zbytek.

    • *
15. 15. Agregát podle některého z nároků 1 až 14, ve kterém rezidua B27-B30 řetězce B insulinového derivátu je sekvence Thr-X-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny aminokyseliny nebo delece a nejméně jedno X je Ν'-substituovaný Iysinový zbytek.
16. 16. Agregát podle některého z nároků 1 až 15, ve kterém rezidua B28-B30 řetězce B insulinového derivátu je sekvence Pro-X-X, kde každé X nezávisle reprezentuje všechny aminokyseliny nebo delece a nejméně jedno Xje Nesubstituovaný Iysinový zbytek.
17. 17. Agregát podle některého z nároků 1 až 16, ve kterém rezidua B29-B30 řetězce B insulinového derivátu je sekvence Lys-X, kde každé X reprezentuje všechny aminokyseliny nebo delece.
18. 18. Agregát podle některého z nároků 12 až 17, ve kterém je substituentem na lysinovém zbytku lipofilní skupina obsahující 6 až 40 uhlíkových atomů.
19. 19. Agregát podle nároku 18, ve kterém je substituentem acylová skupina mající 6 až 40, lépe 12 až 36 atomů uhlíku.
20. 20. Agregát podle nároku 19, ve kterém je acylovou skupinou CH3-(CH2)n-CO-, kde 4<n<38.
21. 21. Agregát podle nároku 19, ve kterém je acylovou skupinou (COOH)-(CH₂)n-CO-, kde 4<n<38.
22. 22. Agregát podle nároku 19, ve kterém je acylovou skupinou (NH₂-CO)-(CH₂)n-CO-, kde 4<n<38.
23. 23. Agregát podle nároku 19, ve kterém je acylovou skupinou HO-(CH₂)n-CO-, kde 4<n<38.
24. 24. Agregát podle nároku 19, ve které je lipofílním substituentem 5-ot lithocholová kyselina nebo 5-β lithocholová kyselina.
25. 25. Agregát podle nároku 19, ve kterém jsou lipofílním substituentem 5-ot nebo 5-β isomery cholové kyseliny, hyoholové kyseliny, deoxycholové kyseliny, aminodeoxycholové ursedeoxycholové kyseliny, hyodeoxycholové kyseliny a cholanikové kyseliny.
26. 26. Agregát podle nároku 19, ve kterém je lipofilní substituent 5-a nebo 5-β isomer dehydrolithocholové kyseliny.
27. 27. Agregát podle nároku 19, ve kterém je lipofilní substituent fusidová kyselina a její deriváty a glycerrhetinová kyselina.
28. 28. Agregát podle nároku 19 až 27, ve kterém je acylová skupina navázána na Iysinový zbytek používající aminokyselinu jako vazbu.
29. 29. Agregát podle nároku 28, ve kterém je aminokyselinové spojení tvořeno oc-glutamylovou nebo γ-glutamylovou vazba nebo β- nebo α-aspatylovou vazbou.
30. 30. Agregát podle nároku 28, ve kterém je aminokyselinové spojení tvořeno γaminobutanoylovou vazbou, β-alanylovou vazbou, oc-amido-y-glutamylovou vazbou nebo aamido^-aspartylovou vazbou.
31. 31. Nové insulinové deriváty schopné tvořit agregáty podle všech předchozích nároků.
32. 32. Farmaceutické preparáty vyznačující se tím, že obsahují agregáty insulinových derivátů podle jednoho z nároků 1 až 30.
33. 33. Farmaceutický preparát podle nároku 32 vyznačující se tím, že obsahuje agregáty podle nároků 1 až 30, kterých je většina, lépe více než 75 % větších než aldolasa, jak bylo určeno gelovou filtrací používající médium preparátu jako eluent.
34. 34. Farmaceutická směs vyznačující se tím, že obsahují agregované insulinové deriváty a rychle působící insulinové analogy a tím druhým je nejlépe lidský insulin nebo Asp^B28 lidský insulin, Lys^B28Pro^B29 lidského insulinu nebo des(B30) lidského insulinu.
35. 35. Farmaceutický preparát podle nároku 34 vyznačující se tím, že molární poměr agregovaného insulinu k rychle působícímu insulinu je 90:10 až 10:90.
36. 36. Farmaceutická směs podle některého z nároků 32 až 35 vyznačující se tím, že obsahuje činidla, které zvyšují viskozitu, nejlépe polyethylenglykol, propylenglykol, jejich kopolymery, dextrany a polyaktidy.
37. 37. Farmaceutická směs podle některého z nároků 32 až 36 vyznačující se tím, že obsahuje pufrovací látku, nejlépe TRIS, fosfátový nebo glycinový pufr.
38. 38. Farmaceutický preparát podle některého z nároků 32 až 37 vyznačující se tím, že obsahující povrchově aktivní pufrovací látku, nejlépe glycylglycin.
39. 39. Farmaceutický preparát podle některého z nároků 32 až 38 vyznačující se tím, že obsahuje izotonické činidlo, nejlépe NaCI, glycerol, manitol nebo laktosu.
40. 40. Farmaceutický preparát podle některého z nároků 32 až 39 vyznačující se tím, že obsahuje Na⁺ ionty v koncentraci 10 až 150 mM.
41. 41. Farmaceutický preparát podle některého z nároků 32 až 40 vyznačující se tím, že obsahuje fenolové nebo tn- kresolové přísady.
42. 42. Farmaceutický preparát vyznačující se tím, že obsahuje 0,1-2 mM insulinového derivátu podle nároku 31; 0,3-0,9 % Zn (hmotn. % k insulinovému derivátu), a fenolové sloučeniny jako fenol nebo «/-kresol nebo jejich směs v totální koncentraci 5 až 50 mM, a Na⁺ ionty v koncentraci 10 mM až 150 mM.
43. 43. Způsob léčení diabetes mellitus registrovaných osob s potřebou takové léčby vyznačující se tím, že používá v efektivním množství ve vodě rozpustných agregátů podle některého z nároků 1 až 30.

    • · · · · · · 4
44. 44. Způsob léčení diabetes mellitus, který poskytuje se osobám s potřebou takové léčby používající efektivním množství ve vodě rozpustných agregátů podle nároku 31 vyznačující se tím, že schopný formovat ve vodě rozpustné agregáty po podkožní injekci.

    • « · · • 9 • · «·«·· ·»«· • ···· *····· • · ·· ··«·· op.

    ř«g.i iooo

    Molekulová

    100000

    1000000 10000000

    0,9

    0,3

    0.7

    O.S o 0,3

    0,4

    0.3

    Q-Z

    0.1

    10000 • · · · · · • ·

    Ďíť.

    JKg-2

    2/7

    Absorbance, 280η »<· » ·| · * ·*·· ♦ · • 4 « ♦ · · * · · · · • · t « « · · ··«»· « · · · · # · • · · Λιβ · · · ·

    Konc., nmol/ml

    -0.5 -0.25 0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5

    Kav * «· * * · · » · «> · φ • · · · « · · ···· • · · · · · · · » » * • · · · ··»« • · · » · · · · ·· « ·

    N-hydroxysukcinimid

    Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiiniid

    Tetrahydrofuran' , 0 °C, 1h, RT, 16h

    OH

    H₂N

    CHjCHjCOOH

    COOtBu

    Diisopropyiethylamin Ν,Ν-dimethylformamid , RT, 3h

    COOtBu

    CH₂CI-L,COOH

    O-(N-sukcinimidyl)1,1,3,3 -tetramethyluronium tetrahydrofluoroborát

    Diisopropyiethylamin·Tetrahydrofuran'-, RT, 4h

    Des (B30) HI acetonitril/voda, pH 10, 15 °C, 1/2 h

    2. TFA, RT, 1h

    LysB29(NeTrthocholoyl-y-Glu-) des(B30) HI