CZ20002059A3 - Transfekční částice - Google Patents

Abstract

Transfekční částice pro zavedení nukleové kyseliny do buněk vyšších eukaryot in vitro nebo in vivo obsahuje jednu nebo více molekul nukleových kyselin kondenzovaných organickými kationtovými molekulami. Tyto diskrétní a stabilní částice se získaly vytvořením komplexů molekul nukleových kyselin se shodnými nebo různými organickými kationtovými prekurzorovými molekulami, aniž došlo k sítění molekul nukleové kyseliny a vzájemnému kovalentnímu spojení prekurzorových molekul na templátu nukleové kyseliny. V případě buněčného cílení částice mohou nést molekuly vhodné pro cílení, jako jsou například sacharidy. Preferované kationtové prekurzorové molekuly jsou lipofilní detergenty, které jsou spojené za vzniku lipidů. Částice přednostně obsahují jednu molekulu nukleové kyseliny, která je činí použitelnými při genové terapii a při zavádění velkých molekul DNA.

Description

Oblast techniky

Vynález popisuje zavadění nukleové kyseliny do buněk vyšších eukaryontů, zvláště při aplikaci v oblasti genové terapie. Vynález popisuje transfekční částice, které je možné použít při transfekci buněk vyšších eukaryontů in vitro a in vivo.

Dosavadní stav techniky

Kritickým krokem technologie rekombinace nukleové kyseliny je účinná transfekce buněk in .vitro a in vivo cizorodým genetickým materiálem.

Jako účinný nosič cizorodého genetického materiálu pro zavedení do buněk in vitro a in vivo se v běžném případě používají rekombinantní viry (Mulligan, R. C., The Basic Science of Gene Therapy. Science 260, 926-932 (1993)) . Rekombinantní viry jsou často buněčně specifické, což může být výhodné i nevýhodné v závislosti na jednotlivém experimentu. Cizorodý materiál navíc nese také svůj vlastní genetický materiál a je často náchylný k mutačním změnám během replikace. V organizmech s imunitními systémy se projevuje další nevýhoda virů in vivo. Je to nežádoucí imunitní odezva vyvolaná virovými částicemi, jako jsou kapsidové antigeny. Další nevýhodou je skutečnost, že příprava rekombinantních virů pro transfer genu je nákladný a pracný úkol.

Při transfekci buněk jsou také dostupné nukleotidové částice, které neobsahují viry. Pro tyto účely transferu genů se mohou také použít komplexy molekul nukleových kyselin, kde opačně nabitý iont kondenzuje s kationovými polyméry (popisuje se v publikaci Tang, M.X. and Szoka, F. C., The influence of polymer structure of the interactions of cationic polymers with DNA and morfology of the resulting complexes. Gene Therapy 4,

823-932 (1997)) nebo s kationovými lipidy (Labatmoleur, F., Steffan, A. M., Brisson, C. Perron, H., Feugeas, 0., Furstenberger, P., Oberling, F., Brambilla, E. and Behr, J. P. . An electron microscopy study into the mechanism of gene transfer with lipopolyamines. Gene Therapy 3, 1010-1017 (1996)). Tyto molekuly nukleových kyselin kondenzované s polymerem nebo lipidem jsou účinné při transfekci buněk v kultuře. Protože tyto kondenzované nukleotidy vzniklé na základě interakce proti iontů v obecném případě vedou ke vzniku multi molekulárních a polydisperzních agregátů, které velmi málo pronikají tkání nebo opouštějí krevní cévy.

Ukázalo se, že kationogenní detergenty kondenzují za vzniku diskrétních částic (popisuje se v publikaci Ber, J. P., DNA strongly binds to micelles and vehicles containing lipopolyamines or lipointercalants. Tet. Letter 27, 5861-5864 (1986)), které mohou obsahovat pouze jednu molekulu nukleové kyseliny (popisuje se v publikaci Melnikov, S. M., Sergeyev, V. G. and Yoshikawa, K. Discrete coil-globule transistion of large DNA induced by cationíc surfuctant. J. Am. Chem. Soc. 117, 2401-2408 (1995)). Detergenty však vykazují daleko vyšší rozpustnost ve vodě ve srovnání s lipidy a jejich rychlé uvolnění do prostředí indukuje dekondenzaci DNA a cytotoxicytu vztahující se k detergentu. Tato třída amfifilů je schopna transfekovat buňky (popisuje se v publikaci Behr, J. P., Synthetic gene-transfer vectors, Accounts Chem. Res. 26,, 274278 (1993)) .

Vzhledem k důležitosti zavedení genů při moderním biologickém a medicínském výzkumu a terapii, jako je například genová terapie, existuje rostoucí požadavek na existenci stabilních, finančně nenáročných a vhodných transfekčních systémů, které je možné použít při aplikacích in vitro a in vivo.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nový transfekčni systém zavedení nukleové kyseliny do buněk vyšších eukaryontů, který obchází nevýhody kationtových transfekčních systémů.

Vynález popisuje částice vhodné pro transfekci buněk vyšších eukaryontů molekulami nukleových kyselin in vitro a in vivo, které obsahují jednu nebo více molekul nukleových kyselin kondenzovaných s organizmými kationovými molekulami. Uvedené částice se získaly vytvořením komplexů molekul nukleových kyselin se shodnými nebo různými molekulami organických kationtových prekurzorů, aniž dojde k síťování molekul nukleových kyselin a ke vzájemnému kovalentnímu spojování molekul prekurzorů na templátu nukleové kyseliny. Částice podle vynálezu umožňují použití malých kationových prekurzorových molekul místo větších kationových molekul, které v podstatě neobsahují agregovanou nukleovou kyselinu. Dále se částice stabilizují dimérovými nebo oligomérovými kationovými molekulami vytvořenými kovalentním spojením prekurzorových molekul.

Není-li dále v textu definováno jinak, pro jednoduchost termín DNA zahrnuje DNA i RNA.

Stabilita částic by měla být vratná za tím účelem, aby DNA byla dostupná pro svůj požadovaný biologický účinek v buňce. V preferovaném provedení vynálezu je spojení kationových molekul vratné za podmínek, při kterých jsou částice konfrontovány po vstupu do buňky. Porušení vazby může být způsobeno slabě kyselým prostředím a/nebo redukčními podmínkami a/nebo enzymatickými buněčnými pochody, například endozómy.

Kationové molekuly, které kondenzují s DNA se získaly kovalentním spojením s kationovými molekulami prekurzorů.

Kationové molekuly prekurzorů podle vynálezu se definují tím, že budují bloky pro přípravu kationových molekul, které udržují DNA v kondenzované formě.

• ·· ·· ·· · * • · · · · · ····

Vynález popisuje jednu nebo více alespoň bifunkčních prekurzorových molekul, které jsou na jednu stranu kationové za účelem tvořit komplexy s molekulami nukleových kyselin, aniž se tvoří agregáty nebo dochází k síťování. Na druhou stranu jsou schopny se kovalentně vázat na shodné nebo odlišné kationové prekurzorové molekuly částic za účelem stabilizace uvedených částic.

Funkce pro kovalentní spojení s identickými nebo odlišnými kationovými molekulami prekurzorů, které jsou vhodné pro stabilizaci nové transfekční částice se může charakterizovat různými a komplementárními funkcemi nebo shodnými funkcemi. Příkladem shodné funkce je thiol, který je schopný vytvořit disulfidový můstek mezí shodnými nebo různými kationovými molekulami prekurzorů. V závislosti na počtu funkcí pro navázání na jednu kationovou prekurzorovou molekulu, kationové molekuly mohou být diméry nebo oligoméry různé nebo identické prekurzorové molekuly. Vynález se proto také týká transfekčních částic charakterizovaných tím, že kationové molekuly se připravují z převedených nebo oligomerizovaných shodných a/nebo různých kationových prekurzorových molekul.

Kationová funkce pro kondenzaci molekul nukleové kyseliny je v obecném případě základní funkcí, která získává za fyziologických podmínek další vodík a proto se stává pozitivně nabitou. Příkladem takové kationové funkce je funkce aminu nebo jeho derivátu. V jiném případě kationovou funkcí je kvartérní amin, který nevyžaduje protonizaci.

V preferovaném provedení vynálezu prekurzorové molekuly jsou kationové detergentové molekuly, které uspokojují shora definované požadavky.

Preferované provedení vynálezu se zakládá na základech supramolekulární chemie a využívá výhody dvou typů činidel vhodných pro zavedení DNA (na jednu stranu jsou to kationová povrchově aktivní činidla a na druhou stranu kationové lipidy) k vytvoření stabilních transfekčních částic připomínajících viry. Příklady tohoto preferovaného provedení vynálezu jsou znázorněny na obrázku č. 1: anionové molekuly DNA jednotlivě kondenzují s vhodným kationovým detergentem a výsledné částice se „zmrazí chemickou konverzí detergentu (kationová prekurzorová molekula) na templátu DNA na lipid prostřednictvím vzduchem indukované dimerizace.

Molekuly detergentu podle vynálezu obsahují kationovou polární část, nepolární část a reaktivní funkci pro navázání na jiné molekuly detergentu. V případě, že dvě nebo více molekul detergentu jsou vzájemně spojené, pak se redukuje detergentový charakter původních prekurzorových molekul a definují se jako lipidy, protože vykazují lipofilní charakter a podobnost k lipidům. V tomto okamžiku je nutné připomenout, že transfekční částice připravené přidáním lipidů k molekulám nukleové kyseliny vede ke vzniku velkých více molekulárních a polydisperzních agregátů (Labatmoleur, F. , Steffan, A. Μ., Brisson, C. Perron, H., Feugeás, 0., Furstenberger, P., Oberling, F., Brambilla, E. and Behr, J. P. . An electron microscopy study into the mechanism of gene transfer with lipopolyamines. Gene Therapy 3, 1010-1017 (1996)), které nejsou obsahem vynálezu.

Vynález dále popisuje transfekční částice, kde kationové molekuly jsou lipidové molekuly připravené z molekul detergentu spojených s jednou nebo více shodných nebo různých detergentových molekul v přítomnosti molekul nukleové kyseliny.

V preferované provedení vynálezu popisuje transfekční částice, přičemž kationové molekuly se připravují dimerizací nebo oligomerizací detergentových molekul. Detergenty mohou mít shodnou nebo odlišnou strukturu.

V obecném případě kationové detergentové molekuly vhodné pro použití jako kationové prekurzorové molekuly se mohou charakterizovat svými odlišnými funkčními rysy.

Vynález dále popisuje transfekční částice, které jsou charakterizované tím, že kationové detergentové molekuly obsahují:

a) alespoň jednu funkci pro navázání jedné nebo více jiných detergentových molekul,

b) alespoň jeden lipofilní zbytek

c) netoxický recipientní řetězec,

d) kationovou skupinu vhodnou pro navázání DNA.

Funkční zbytky pro navázání prekurzorových molekul jsou například thiolové zbytky, které reagují za vzniku disulfidových můstků (-S-S-), kyselé hydrazidy, které poskytují hydrazony (-C=N-N-), aminy a aldehydy, které poskytují Shiffovy zásady (iminy, -C=N-) a aminy, které reagují etylenovými zbytky, které jsou vhodně substituované (například halidy) za vzniku enaminů (-C=C-N-).

Transfekční částice se přednostně charakterizují tím, že funkce kationových detergentových molekul vázat se na jiné detergentové molekuly se vybrala ze schopnosti tvořit diméry nebo polyméry, jako jsou thioly, kyselé hydrazidy, aldehydy, aminy a etylenové zbytky, které jsou vhodně substituované za vzniky enaminů.

Transfekční částice se charakterizuje tím, že lipofilní zbytek detergentové molekuly se vybral z lipofilních amidů, esterů nebo etherů. Lipofilní funkce kationových molekul jsou kritické, když se používají detergenty, jako prekurzorové molekuly, protože lipofilní zbytky stanovují kritickou koncentraci micela detergentového prekurzoru, který je vhodný pro vznik diskrétních částic v požadované koncentraci. Čím je vyšší požadovaná koncentrace DNA, tím vyšší musí být c.m.c. detergentu.

V případě navázání preferovaných funkčních zbytků kationových molekul na molekuly nukleové kyseliny a zvláště pro navázání v případě detergentových molekul se používají aminy • · • 9 9999 9 9 ··

9 ·········♦· > 9999999··· ··· ··· ·· ·· ·· ·· nebo jiné jeho bazické a kationové deriváty. Vhodné aminy a deriváty se popisují dále v textu.

Je výhodné, aby transfekční částice podle vynálezu se charakterizovala tím, že funkce navázání na molekuly nukleové kyseliny se vybrala z aminu nebo jeho derivátu.

Aminofunkce podle vynálezu závisí na jejich schopnosti poskytnout pozitivní náboje pro vratné navázání molekul nukleových kyselin pomocí iontových sil závislých na náboji. Schopnost aminů a jejich derivátů vykazovat pozitivní náboj za fyziologických podmínek závisí na strukturní podobnosti aminu. Některé struktury s blízkými substituenty a se substituenty, který silně uvolňují elektrony nemohou být proto za fyziologických podmínek dostatečně bazické. Upřednostňuje se, aby aminofunkce kationových molekul podle vynálezu byly silně bazické. Jedna velmi bazická a fyziologicky přijatelná aminofunkce je guanidin, který je zvláště použitelný pro kationové molekuly podle vynálezu. Dalším příkladem vhodné aminokyselinové funkce je amídin. Obě tyto funkce vykazují silnou interakci s fosfátdiesterovými skupinami.

Je výhodné, aby se transfekční částice podle vynálezu charakterizovala tím, že funkcí vhodnou pro molekuly nukleových kyselin je guanidin.

Požadavky na recipientní řetězec v případě molekul detergentu podle vynálezu jsou zřejmé. Musí být vhodný a nesmí být pro buňky toxický.

V preferovaném provedení vynálezu se popisují transfekční částice, kde kationové prekurzorové molekuly odpovídají obecnému vzorci 1 kde

(1) ·· • ♦ · * • · · · • · · · • 9 9 9

99 • * symbol Ri znamená (Ci-Cio-alken)-SH, alkenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo větveným řetězcem, symbol R₂ znamená -NH₄R₅, -NHR₄R₅ ⁺, -N(R4)2R5⁺, -C (=NR4) NR₅R₆, C(=X)-Ci-Cio-alken, kde alkenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo větveným řetězcem a může být susbtituován až čtyřmi dialkylaminoskupinami nebo thiofnonosacharidem, symbol R3 označuje C5-C₃₀-alkyl s přímým nebo větveným řetězcem přednostně substituovaný jedním nebo více atomy halogenu nebo dialkylaminoskupinami nebo tento symbol označuje Cs-C₃o-alken s přímým nebo větveným řetězcem, který obsahuje až deset dvojných vazeb C=C a je přednostně substituován jedním nebo více atomy halogenu nebo dialkylaminoskupinami nebo tento symbol označuje C₅-C₃o-alkinyl s přímým a větveným řetězcem, který vykazuje až deset trojných vazeb a je přednostně substituován jedním nebo více atomy halogenu nebo dialkylaminoskupinami nebo tento symbol znamená C₆-Ci₀-aryl s možností substituce nebo tento symbol znamená C7-Ci6-aralkyl s možností substituce nebo tento symbol znamená C₅-C₃o-alkylový řetězec přerušovaný až 10 aminoskupinami -NR₄- a vykazující aminoskupinu, která je substituována aminokyselinou, symboly R₄, R5 a Rg nezávisle na sobě označují vodík nebo C1-C4alkyl, symbol X značí O nebo S, symbol Y značí C=0 nebo C=S a symbol Z značí O, S nebo -NR₄~.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují tranfekční částice charakterizované tím, že kationové prekurzorové molekuly odpovídají látce obecného vzorce 1, kde symbol R_x znamená (Ci-C₆-alken)-SH, kde alkenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo větveným řetězcem, φφ φφ • · • φ • φ • Φ ·* symbol R₂ znamená -NH4R5, -NHR₄R₅ ⁺, -N(R4)2R5⁺, -C (=NR4) NRsR₆,

C (=X) -Ci-C₄-alken, kde alkenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo větveným řetězcem a může být susbtituován až čtyřmi aminoradikály -NH₄R₅ nebo monosacharidem, symbol R3 označuje Cs-C₂o-alkyl s přímým nebo větveným řetězcem přednostně substituovaný F, Cl, Br nebo -NH₄R₅ nebo tento symbol označuje Cs-C₂o-alkenyl s přímým nebo větveným

řetězcem,	který obsahuje	až	pět dvojných vazeb	C=C	a je
přednostně	substituován F,	Cl,	Br nebo -NH4R5 nebo
tento symbol označuje	C5-C20-alkinyl s přímým	a větveným
řetězcem,	který vykazuje	až	pět trojných vazeb	c=c	a je
přednostně	substituován F,	Cl,	Br nebo -NH4R5 nebo

tento symbol znamená Cg-Cio-aryl přednostně substituovaný Ci-C₄alkyl, F, Cl, Br nebo -NH₄Rs nebo tento symbol znamená C7-Ci₄-aralkyl substituovaný Ci-C₄-alkyl, F, Cl, Br nebo -NH₄R₅ nebo tento symbol znamená C₅-C₂o~alkylový řetězec přerušovaný až 10 aminoskupinami -NR₄- a vykazující aminoskupinu, která je substituována aminokyselinou, symboly R₄, R5 a Rg nezávisle na sobě označuji vodík nebo Ci-C₄alkyl, symbol X značí O nebo S, symbol Y značí C=O nebo C=S a symbol Z značí O, S nebo -NR₄-.

Ve více preferovaném provedení vynálezu se popisují tranfekční částice charakterizované tím, že kationové prekurzorové molekuly vzhledem ke své shora popsané obecné struktuře jsou substituovány následujícím způsobem:

symbol R₄ znamená (Ci-C3-alken)-SH, kde alkenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým řetězcem nebo větvený uhlovodík, symbol R₂ znamená -NH₄Rs, -NHR₄Rs⁺, -N(R4)2R5⁺, -C (=NR4) NRsR₆,

C (=X) -Ci-C₄-alkyl, kde alkylový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým řetězcem nebo větvený uhlovodík a může být φ φ • φ φφ φφ φφ φφ φ ·· · φ φ φ φ φφ φφ φ φ φ φ ♦ φ φφφ φφφ φφ φφ φ φ φ φ φφ φφ substituován až čtyřmi aminoradikály -NH4R5 nebo Cgmonosacharidem, symbol R₃ označuje C₅-Ci2-alkyl s přímým nebo větveným řetězcem přednostně substituovaný F, Cl, Br nebo -NH₂ nebo tento symbol znamená Cs-Cis-alkylový řetězec přerušovaný až 7 aminoskupinami -NR₄- a vykazující aminoskupinu, která je substituována aminokyselinou cystein, symboly R₄, R5 a Rg nezávisle na sobě označují vodík nebo metyl, etyl, propyl, izo-propyl, n-butyl, izo-butyl nebo terciální butyl, symbol X značí 0 nebo S, symbol Y značí C=0 nebo C=S a symbol Z značí O, S nebo -NR₄-.

V nejvíce preferovaném provedení vynálezu se popisují tranfekční částice, kde kationové prekurzorové molekuly vzhledem ke své shora popsané obecné struktuře jsou substituovány následujícím způsobem:

symbol Ri znamená -CH₂SH, symbol R₂ znamená -NH₂, -NH₃ ⁺, -C (=NH⁺2) NH₂, -C (=0)-Ci-C₄-alkyl, s přímým nebo větvený řetězcem substituovaný F, Cl, Br nebo -NH₂ nebo symbol znamená radikál ornitinu nebo S-galaktozylový radikál symbol R₃ označuje C₆-Ci₅-alkyl s přímým nebo větveným řetězcem přednostně substituovaný F, Cl, Br nebo -NH₂, symbol Y značí C=0, symbol Z značí 0 nebo -NH-.

Preferují se transfekční částice, kde symbol Ri znamená C₃C₄-alken-SH. Více se preferují transfekční částice, kde symbol R_x znamená metylenthiol.

Preferují se transfekční částice, kde symbol R₂ je amin. Více se preferují transfekční částice, kde symbol R₂ znamená guanidin. Více se také preferují transfekční částice, kde symbol R₂ znamená ornitin.

• tt • tt tttt • tttt • tt tttt • tt tttt • tttt · • tttt · • tttt · • tttt · tttt tttt

Preferují se transfekční částice, kde symbol R₃ znamená decylový radikál.

Preferují se transfekční částice, kde symbol Y znamená karbonyl.

Preferují se také transfekční částice, kde symbol Z znamená amin.

Nejvíce se preferují transfekční částice, kde symbol R_x znamená metylenthiol, symbol R₂ znamená guanidin, symol R₃ znamená děkan, symbol Y znamená karbonyl a symbol Z znamená amin a jeho farmaceuticky přijatelné sole.

Zvláště preferované jsou transfekční částice, kde kationovou molekulou je N-decyl-2-guanidinium-cystein.

Nejvíce se také preferují transfekční částice, kde Ri znamená metylenthiol, symbol R₂ znamená ornitin, symbol R₃ znamená decylový radikál s přímým řetězcem, symbol Y znamená karbonyl, symbol Z je amin a jeho farmaceuticky přijatelné sole.

Zvláště preferované jsou transfekční částice, kde kationová molekula je N-decyl-2-ornitinyl-cystein.

Ci-C6-alkyl v obecném případě reprezentuje radikál uhlovodíku s přímým nebo větveným řetězcem, který obsahuje 1 až 6 atomů uhlíku, které jsou substituovány jedním nebo několika halogenovými atomy, upřednostňuje se fluorin, které mohou být shodné nebo se mohou lišit. Následující radikály se zmiňují způsobem příkladu:

metyl, etyl, propyl, 1-metyletyl(izopropyl), butyl, 1metylpropyl, 2-metylpropyl, 1,1-dimetyletyl, n-pentyl, 1metylbutyl, 2-metylbutyl, 1,1-dimetylpropyl, 1,2-dimetylpropyl,

2.2- dimetylpropyl, 1-etylpropyl, hexyl, 1.metylpentyl, 2metylpentyl, 3-metylpentyl, 4-metylpentyl, 1,1-dimetylbutyl,

1.2- dimetylbutyl, 1,3-dimetylbutyl, 2,2-dimetylbutyl, 2,3dimetylbutyl, 3,3-dimetylbutyl, 1-etylbutyl, 2-etylbutyl, 1,1,2 . trimetylpropyl, 1,2,2-trimetylpropyl, 1-etyl-lmetylpropyl a l-etyl-2-metyl-propyl.

φφ φφ • φ · φ φ φ φφ • φ · φ • Φ φφ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ

Stejná definice se aplikuje v případě alkandiylových radikálů.

C5-C₃o-alkyl znamená specificky uhlovodíkový radikál s přímým nebo větveným řetězcem, který má 5 až 39 atomů uhlíku. Je to například pentyl, hexyl, heptyl, oktyl, nonyl, decyl, undecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentadecyl, hexadecyl, dodekadecyl, nonadecyl, eikosyl, henikosyl, dokosyl a triakontyl.

Není-li uvedeno jinak, nižší alkyly mají 1 až 5 atomů uhlíku. Preferují se metyl, etyl, n-propyl, izopropyl, n-butyl, terciální butyl, n-pentyl nebo izo-pentyl. Stejná definice se aplikuje na alkandiylové radikály.

Alkenyi reprezentuje uhlovodíkový radikál s přímým nebo větveným řetězcem, který vykazuje 3 až 29 atomů uhlíku a jednu nebo více dvojných vazeb. Upřednostňuje se jedna dvojná vazba, která se může substituovat jedním nebo více halogenovými atomy, upřednostňuje se fluorin, které mohou být shodné nebo odlišné. Příklady zahrnují:

2-propenyl (alyl), 2-butenyl, 3-butenyl, l-metyl-2-propenyl, 2metyl-2-propenyl, 2-pentenyl, 3-pentenyl, 4-pentenyl, 1-metyl2- butenyl, 2-metyl-2-butenyl, 3-metyl-2-butenyl, l-metyl-3butenyl, 2-metyl-3-butenyl, 3-metyl-3-butenyl, 1,l-dimetyl-2propenyl, 1,2-dimetyl-2-propenyl, l-etyl-2-propenyl, 2-hexenyl,

3- hexenyl, 4-hexenyl, 5-hexenyl, l-metyl-2-pentenyl, 2-metyl-23-metyl-2-pentenyl, 4-mety1-2-pentenyl, pentenyl, pentenyl, pentenyl, pentenyl,

2-metyl-3-pentenyl, 1-metyl-4-pentenyl,

3-metyl-3-pentenyl, 3-metyl-4-pentenyl, l-metyl-34-metyl-34-metyl-41,l-dimetyl-2-butenyl, 1,l-dimetyl-2-butenyl, 1,1dimetyl-3-butenyl, 1,2-dimetyl-2-butenyl, 1,2-dimetyl-3butenyl, 1,3-dímetyl-2-butenyl, 1,3-dímetyl-3-butenyl, 2,2dimetyl-3-butenyl, 2,3-dimetyl-2-butenyl, 2,3-dimetyl-3butenyl, l-etyl-2-butenyl, l-etyl-3-butenyl, 2-etyl-l-butenyl, 2-etyl-2-butenyl, 2-etyl-3-butenyl, 1,1,2-trimetyl-2-propenyl, l-etyl-l-metyl-2-propenyl a l-etyl-2-metyl-2-propenyl.

«9 »· • ♦ « * • · ·« • * · • · * • ·♦· » 9 9 1

9· ·* * ·

9«

Alkinyl v obecném případě reprezentuje uhlovodíkový radikál s přímým nebo větveným řetězcem, který obsahuje 3 až 20 atomů uhlíku a jednu nebo více trojitých vazeb nebo jednu nebo více trojitých a dvojitých vazeb.

2-propynyl (propargyl), 2-butynyl, 3-butynyl, l-metyl-2propynyl, 2-pentynyl, 3-pentynyl, 4-pentynyl, l-metyl-2-butynyl l-metyl-3-butynyl, 2-metyl-3-butynyl, 1,l-dimetyl-2-propynyl, l-etyl-2-propynyl, 2-hexylnyl,.3-hexynyl, 4-hexynyl, 5-hexynyl,

1- metyl-2-pentynyl, 4-metyl-2-pentynyl, l-metyl-3-pentynyl, 2metyl-3-pentynyl, 1,l-dimetyl-3-butynyl, 1,2-dimetyl-3-butynyl,

1,3-dimetyl-2-butynyl, 1, 3-dimetyl-3-butynyl, 2,2-dimetyl-3butynyl, 2,3-dimetyl-2-butynyl, 2,3-dimetyl-3-butynyl, 1-etyl2- butynyl, l-etyl-3-butynyl, 2-etyl-3-butynyl a 1-etyl-l-metyl2-propynyl.

Monosacharidy podle vynálezu reprezentují C₅- a přednostně C6~ monosacharidy a vybraly se například z následující skupiny: galaktóza, laktóza, glukóza, arabinóza, fruktóza, sorbóza, xylóza, ribóza, manóza, přičemž každá se může vyskytovat ve své D- nebo L-formě.

Aryl v obecném případě reprezentuje aromatický radikál, který obsahuje 6 až 10 atomů uhlíku, také se vyskytují v různých kombinacích. V případě aromatického kruhu jsou možné substituce jednou nebo více nižších alkylových skupin, alkoxyskupinou, nitroskupinou, aminoskupinou a/nebo jedním nebo více halogenovými atomy, které jsou buď stejné nebo odlišné. Preferovanou arylovou skupinou, není-li uvedeno jinak, je fenyl.

Aralkyl v obecném případě reprezentuje arylový radikál, který obsahuje 7 až 14 atomů uhlíku, které se váží prostřednictvím alkenového řetězce. V případě aromatického kruhu je možná substituce jedním nebo více nižších alkylů, alkoxyskupinou, nitroskupinou, aminoskupinou a/nebo jedním nebo více halogenovými atomy, které jsou shodné nebo odlišné. Preferuje se, když aralkylové radikály obsahují 1 až 6 atomů

44

4 4 4

4 4 4 • · ·· ν» • 4 • 9

4 ·* ·»·

494 • 4 4 ·

44

4 4 4

99 uhlíku v části alifatické struktury a 6 až 10 atomů v aromatické části. Preferované aralkylové radikály, které se mohou zmínit, není-li uvedeno jinak, jsou: benzyl, fenetyl a fenylpropyl.

Alkoxy- v obecném případě reprezentuje O-alkylový radikál, kde alkyl se definoval shora v textu. Preferované alkoxyradikály obsahují shora definované nižší alkyly.

Alkyl nebo dialkylamino- reprezentuje aminoradikál substituovaný jednou nebo dvěma alkylovými skupinami, které jsou shodné nebo odlišné. Preferovanými alkylovými nebo dialkylaminosubstituenty jsou aminoradikály, které obsahují jeden nebo více nižších alkylů.

V jiném provedení vynálezu organická kationová prekurzorová molekula neobsahuje žádný lipofilní zbytek. Vhodné molekuly tohoto typu jsou schopny se vázat na molekuly DNA, aniž dochází k jejích síťování nebo agregaci. Aby se splnil tento požadavek, měly by být dostatečně malé, dostatečně adherentní pouze vůči jedné molekule DNA, aniž se vážou na jednu nebo více jiných molekul DNA. Navíc kationové molekuly obsahují funkce, které jim umožňují být kovalentně spojené s jinými shodnými nebo odlišnými kationovými prekurzorovými molekulami. Požadavky na funkční skupiny jsou stejné, jako se popisují v případě detergentových prekurzorových molekul. U kationových molekul se může testovat jejich vhodnost použití podle vynálezu tím, že přijdou do kontaktu s DNA a u získaných komplexů se testuje velikost částic například elektronovou mikroskopií, rozptylem laserového světla nebo atomovou mikroskopií před a po kovalentním spojení. Vhodné kationové molekuly netvoří před a po vytvoření vazby agregáty na druhou stranu musí po vytvoření často i před vytvořením vazby vykazovat tvorbu částic.

Kationové nelipofilní prekurzorové molekuly se mohou vybrat ze skupiny zahrnující molekuly se základním řetězcem, který nese pozitivně nabité skupiny. Základní řetězec není kritický. Může to být libovolná organická molekula, která nese pozitivní náboj buď na hlavním nebo na vedlejším řetězci. Jako příklad se může uvést skutečnost, kdy základní řetězec je peptid, pozitivní náboje poskytují pozitivně nabité aminokyseliny, například lyzin, arginin, ornitin. Vhodné pozitivně nabité skupiny mohou být stajné, jako ty, které se definují shora v textu v případě detergentových molekul. Aby došlo ke splnění požadavků, organické kationové prekurzorové molekuly mohou být ty, které se popisují v dokumentu WO 93/07283.

Funkční skupiny vhodné pro vytvoření kovalentních vazeb mohou poskytovat samotný základní řetězec, například jestliže molekula je peptid a má cysteínové zbytky nebo se mohou získat jejich navázáním na základní řetězec.

Alkyl nebo dialkylaminoskupina reprezentuje aminoradikál substituovaný jedním nebo dvěma alkyly, které jsou vzájemně shodné nebo odlišné. Preferované alkylové a dialkylaminosubstituenty jsou aminoradikály, které mají jeden nebo více nižších alkylů.

V preferovaném provedení vynálezu se transfekční částice charakterizují tím, že kationové prekurzorové molekula je amin nebo polyamin.

V určitém preferovaném provedení vynálezu se transfekční částice charakterizují tím, že kationové prekurzorové molekula je spermin-Nl, N12-bis-cysteinamid (SC₂) .

Shora uvedený derivát sperminu zcela splňuje všechny požadavky nezbytné pro využívání vynálezu v praxi. Primární a sekundární aminy vykazují za fyziologických podmínek kationové funkce a dvě thiolové skupiny umožňují dimerizaci nebo dokonce polymerizaci, aniž dochází k zesítění nebo agregaci DNA.

Kationové prekurzorové molekula spermin-Nl,N12-biscysteinamid(SC₂) se může připravit z komerčně dostupných činidel. V experimentech podle vynálezu se stanovily fyziologické parametry transfekčních částic připravené podle SC₂ a ukázalo se, že oproti částicím připraveným se sperminem, jsou stabilní.

Molekula SC2 obsahuje molekulu sperminu vázanou amidovou vazbou ke dvěma molekulám cysteinu, které mají volné thiolové funkce. Volba těchto molekul je spíše kritická. Spermin stejně jako jiné polyaminy, například putrescin, spermidin podmiňují udržování virové DNA v kondenzované formě. Různé studie in vitro ukázaly, že polyaminy kondenzují DNA a za optimálních podmínek je spermin schopen kondenzovat DNA do prstencových struktur s průměrem 0,1 pm. Přestože tyto prstence jsou relativně stabilní, jsou citlivé na koncentraci sole v médiu. Je holou skutečností, že při koncentraci 150 mM NaCl (což odpovídá iontové síle kultivačního média buněk) se spermin odpoutává z komplexů s DNA, což vede ke ztrátě prstencových struktur. Proto se částice DNA tvořící komplexy se sperminem nemohou využívat pro transfekci. 2a účelem stabilizovat strukturu částic komplexu DNA se na každý konec sperminu zachytily dvě skupiny nesoucí volnou thiolovou funkci. 2a jistých optimalizovaných podmínek molekuly SC2 přítomné v malé drážce DNA, která slouží jako templát, se budou vzájemně vázat prostřednictvím disulfidové vazby, přičemž vznikne základní schopny stabilizovat prstencovou neomezuje na jeden typ řetězec DNA, konformaci.

Vynález se které jsou žádném případě kationových prekurzorových molekul obsažených v transfekčních částicích. Tranfekční částice se mohou připravovat kovalentním spojením dvou nebo více různých kationových prekurzorových molekul. Je zřejmé, aby se kationové prekurzorové molekuly navázaly na různé kationové prekurzorové molekuly, musí být komplementární a proto se liší od jiného reakčního partnera s ohledem na jejich funkční skupiny. Kationové prekurzorové molekuly podle vynálezu mohou také poskytovat vedle funkčních variant strukturální varianty v případě navázání jiných než kationových prekurzorových molekul. V případě specifických aplikací je možné použít transfekční částice, které uspokojují

• · požadavky kombinováním strukturálně odlišných kationových prekurzorových molekul.

Tranfekční částice musí být stabilní v době, kdy se musí dostat na své místo určení, například cílová buňka nebo tkáň. V cílovém místě například v cílové buňce je samozřejmě nezbytné připravit nukleové kyseliny transfekčních částic vhodné pro buňku.

Materiál, který je pro buňku cizí je v obecném případě pohlcen endocytózou a prochází sérií kompartmentů a vstupuje mezi endozómy. V endozómech se cizorodý materiál konfrontuje s podmínkami, jako je hodnota pH okolo 6 a velké množství enzymů, zvláště hydroláz. Transfekční částice podle vynálezu se mohou dostávat do buněk a následně se přenášet do endozomálních korpartmentů. Ve vnitrobuněčnách korpartmentech transfekční částice podle vynálezu jsou vystaveny podmínkám, které způsobují jejich rozpad, zvláště pak štěpením dimérových nebo oligomérových kationových molekul, přičemž se uvolní nukleové kyseliny. Typický rozpad kationových molekul je způsoben redukcí disulfidických můstků. Příklady vazeb, které jsou labilní v kyselém prostředí jsou hydrazony, Schiffovy báze (iminy), enaminy, acetalové a ketalové funkce. Je nutné poznamenat, že vynález není v žádném případě omezen na shora uvedené vazby pro endozomální štěpení a že odborník ohodnotí alternativní vazby, které zcela splňují požadavky kationových molekul a jsou štěpitelné v endozomech nebo v jejich vnitrobuněčných kompartmentech.

V preferovaném provedení podle vynálezu se transfekční částice charakterizují vazbou mezi kationovými molekulami, které jsou degradovatelné za podmínek ve vnitrobuněčných kompartmentech.

Nové transfekční částice se používají při transfekci buněk molekulami nukleových kyselin in vitro stejně jako in vivo.

Nové transfekční částice se mohou zvláště použít při transfekci buněk vyšších eukaryontů in vivo a in vitro.

Za účelem účinného zavedení molekul nukleových kyselin může být nutné poskytnout specifické buněčné funkce pro cílení. To je důležité pro aplikaci in vivo za účelem zavést cílové geny do specifických buněk nebo orgánů. Účinnost transfekce se může dále zvyšovat zesílením pohlcení částic do buněk endocytózou po té, co jsou buňky vázány na cílových buňkách.

Vynález se dále týká transfekčních částic, které se charakterizují tím, že navíc nesou jednu nebo více funkcí pro specifické buněčné cílení a/nebo endocytózu.

Účinné buněčné pohlcení transfekčních částic se může dosáhnout ligandy, které se vážou na buněčné struktury na povrchu buněk a/nebo způsobují internalizaci vazebných struktur.

Buněčné funkce pro cílení jsou například buď proteinové ligandy nebo zbytky cukrů. Příklady ligandů jsou imunoglobuliny a fragmenty nebo jejich deriváty, Iektiny, adhézní molekuly, cytokiny nebo chemokiny, stejně jako malé organické struktury , například cukerné zbytky, které rozpoznávají specifické buněčné povrchové struktury a jsou schopny specifického cílení a/nebo internalizace. Příklady funkcí pro cílení jsou transferin, kyselina listová, peptid RGD a velký počet monoklonálních a polyklonálních protilátek. Může se použít libovolný ligand, který je schopný vázat se na cílovou buňku a internalizovat částice do buněk. Příklady vhodných ligandů, které se mohou použít podle vynálezu, se popisují v dokumentu WO 93/07283.

V preferované provedení vynálezu se to týká transfekčních částic charakterizovaných tím, že funkce cílení a/nebo endocytózy je buněčný proteinový ligand.

V dalším provedení vynález popisuje transfekční částice podle vynálezu, kde funkce cílení a/nebo endocytózy je cukerný zbytek.

Vedle ligandů cílení částice podle vynálezu mohou obsahovat funkci, která jim umožňuje procházet buněčnými membránami, buď membránovou fúzí , porušením nebo tvořením pórů (tato funkce se nazývá endosomolytickou funkcí). V případě, že kationové prekurzorové molekuly jsou detergenty, vykazují destabilizaci membrány/endosomolytickou funkci. Jestliže kovalentní vazba je bioreverzibilní a proto se rozpadá detergentové molekuly mohou uplatnit funkci. V jiném případě nebo vedle v buněčném prostředí, svou endosomolytickou funkce destabilizace membrány detergenty se tato funkce může provést endosomatickými činidly. Příklady vhodných použitelných endosomatických činidel podle vynálezu se popisují v dokumentu WO. 93/07283. Preferované příklady endosomolytických činidel jsou deaktivované adenovirové částice, membránové aktivní peptidy (to je fúzogenní nebo lytické peptidy, jejichž příklady se popisují v dokumentu WO 93/07283, a v publikaci Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., and Wagner, E. (1994) J. Biol. Chem. 269, 12918-12924, Mechtler and Wagner, E. (1997) , New J. Chemistry 21, 105-111; Gottschalk, S., Sparrow, J. T., Hauer, J., Mims, Μ. P., Leland, Ε. E., Woo, S. L. C. and Smith, L. C. (1996) Gene therapy 3, 448-457; membránový aktivní peptid vázající DNA se popisuje v publikaci Wyman, T. B., Nícol, F. , Zelphati, O., Scaria, P. V., Plank, C., and Szoka, F. C. (1997) Biochemistry 36, 3008-3017; amfipatický kationový peptid gramadicin se popisuje v publikaci Legendre, J. Y., and Szoka, F. C. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A.90, 893 a Legendre, J. Y., and Supersaxo, A. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 179-85) a povrchově aktivní činidla citlivá na pH, jako je N-alkyl-imidazol, který se popisuje v publikaci Wilson, P. D.,

104,

Firestone, R. A., and Lanard, J (1987) J. Cell. Biol. 1123-1229; Hughes, J. A., Aronsohn, A. I., Avrutskaya, A. V., and Juliano, R. L. (1996) Pharm. Res. 404-410.

Funkce cílení a/nebo endosomolytické funkce transfekčních částic podle vynálezu se mohou kovalentně vázat na několik, řadu nebo všechny kationové molekuly podle vynálezu. Jedna transfekční částice může vykazovat shodné nebo různé funkce cílení. Přítomnost funkce cílení/endosomolytické funkce, co se

týče typu a množství závisí na specifické aplikaci, zvláště na typu buňky, která se může obohatit podle určitých požadavků. V obecném případě procento kationových molekul, které vykazují takové funkce se pohybuje okolo 1 až 80 %, upřednostňuje se 10 až 50 %.

Příkladem prekurzorové molekuly s funkcí cílení, která je schopna se kovalentně vázat na prekurzorové molekuly kationových molekul podle vynálezu je lipofilní galaktosylový cystein (Remy, J. S., Kichler, A., Mordvinov, V., Schuber, F., Behr, J. P., Targeted gene transfer into hepatoma cells with lipopolyamine-condensed DNA particles presenting galactose ligands: A stage toward artificial viruses. Proč. nati. Acad. Sci USA 92, 1744-1748 (1995) (popisuje se dále v textu v příkladu 5) . Ačkoli uvedený lipofilní galaktosylový cystein není funkčně nutný pro vytvoření komplexů molekul nukleových kyselin, je schopen kovalentně vázat kationové prekurzorové molekuly za vzniku kationových molekul (heterodimérů), které jsou součástí transfekčních částic podle vynálezu. Je známo, že galaktosylové zbytky jsou funkcí pro cílení, kterou specificky rozeznávají buňky jater.

Funkce cílení/endosomolytická funkce může být přítomna ve formě konjugátu, kde je připojena k molekule vázající DNA, která je přítomná vedle prekurzorové molekuly, která může tvořit oligomer. Tato molekula může být oligomer podobně jako oligolyzin nebo polymer podobně jako polyetylenimin, aniž obsahuje dimerizovatelné funkce. Tyto cílené/endosomolytické konjugáty se mohou přidat k jiným komplexním partnerům transfekční částice dříve než dojde vytvoření komplexů nebo během tvoření komplexů.

Ligand/endosomolytická funkce se může začlenit do transfekčních částic následujícím způsobem:

a) příprava kationových prekurzorových molekul a/nebo neoligomerizovatelných malých molekul vázajících DNA, φ ♦ φ φ φ φ které jsou vybaveny funkcí cílení/endosomolytickou funkcí před a během tvoření komplexů,

b) připojení funkce cílení/endosomolytické funkce ke kationovým prekurzorovým molekulám a/nebo neoligomerizovatelných malých molekul vázajících DNA po té, co se vytvořily komplexy, před a během kovalentního navázání prekurzorových molekul.

c) připojení funkce cílení/endosomolytické funkce po kovalentním navázání prekurzorových molekul.

V případě b) a c) prekurozorové molekuly nebo neoligomerizovatelné molekuly jsou vybaveny reaktivní skupinou, která umožňuje navázáni funkce cílení/endosomolytické funkce. Reaktivní skupina znamená chemicky reaktivní skupinu, což jsou například aktivované estery, disulfidy nebo skupiny umožňující biochemickou interakci, například navázázní streptavidinu/biotinu (v tomto případě je molekula pro reakci vybavena streptavidinem nebo biotinem) . Reaktivní skupina se musí vybrat tak, že neinterferuje s procesem kovalentního navázání prekurzorových molekul.

Provedení a) má výhodu, že molekuly nesoucí funkci cílení/endosomolytickou funkci se mohou připravit předem v čisté formě ve větším množství a jsou dostupné stejně jako dobře definovaná reakční činidla. Toto provedení vynálezu se může zvláště aplikovat za účelem endosomolytické funkce, když je nutné mít tuto funkci obsaženou v transfekční částici.

v provedení vynálezu popsaném v odstavcích b) a c) se preferují velké ligandy, podobné proteinovým cílícím ligandům nebo endosomolytickým činidlům podobným adenovirům. Tyto ligandy/činidla mohou interferovat s kondenzací komplexů DNA s malými částicemi. Výhodou těchto provedení podle vynálezu je, že zaručí, že funkce se nachází na povrchu částice. Provedení vynálezu popsané v odstavci c) je dále výhodné, jestliže ligand je citlivý na podmínky, které se používají při kondenzaci a/nebo kovalentním navázání prekurzorových molekul.

• 9

V dalším provedení podle vynálezu se popisují transfekční částice, ve kterých funkci cílení tvoří sacharidový zbytek.

V preferovaném provedení vynálezu je sacharidem galaktóza.

V jiném provedení podle vynálezu je sacharidem manóza.

V jiném provedení vynálezu endosomolytickou funkci poskytuje fúzogenní peptid.

V. obrou jsou dobře známy metody vhodné pro zachycení činidel poskytujících funkce cílení/endosomolytické - funkce, například malé organické molekuly , jako jsou sacharidy nebo velké struktury, jako jsou proteiny nebo celé viry, na kationové molekuly.

Navázání chemickými metodami se může ovlivnit způsobem, který je dobře znám pro spojování peptidů a jestliže je to nezbytné jednotlivé komponenty se mohou poskytnout s linkerovými látkami dříve než dojde k reakci. Toto měření je nezbytné v případě., že není dostupná funkční skupina vhodná pro spojování. To je například merkaptoskupina nebo alkoholová skupina). Linkerové látky jsou bifunkční látky, které reagují nejdříve s funkčními skupinami jednotlivých komponentů, pak se jednotlivé modifikované komponenty spojují.

spojování se může porvádět:

a) disulfidovými můstky, které se mohou opět štěpit za redukčních podmínek (například když se použije sukcinimidyl-pyridyldithiopropionát),

b) látky, které jsou za biologických podmínek v podstatě stabilní (například thioétery reakcí maleimidolinkerů se sulfhydrylovou skupinou linkeru se vážou na druhý komponent),

c) můstky, které nejsou za biologických podmínek stabilní, například esterové vazby nebo acetalové nebo ketalové vazby, které nejsou stabilní a slabě kyselých podmínek,

d) reaktivní skupiny podobné izothiokyanátu, aktivované estery,

e) reaktivní spojování aldehydů s aminoskupinami.

• ♦»

9 « ·· 99 • 9 · · • 9 9 · • 9 9 9

9 9 9

99

V preferovaném provedení podle vynálezu nukleovou kyselinou transfekčních částic je DNA.

DNA může být lineární nebo cirkulární, jednořetšzcová nebo dvouřetězcová. Jestliže se bere do úvahu velikost DNA, vynález je možné uplatnit v širokém rozmezí, které zahrnuje malé oligonukleotidy obsahující přibližně 20 nukleotidů a velmi velké molekuly podobné umělým chromozomům o velikosti přibližně 100 až 2 OOOkb.

V preferovaném provedení vynálezu částice jsou s ohledem na DNA monomolekulární, což znamená, že obsahují jedinou molekulu DNA. Toto provedení vynálezu je zvláště použitelné pro zavedení DNA in vivo, kdy je nutné aplikovat malé částice za účelem překonat velikostní omezení fyziologických bariér.

Dále dostupnost monomolekulárních diskrétních stabilních částic je výhodné pro zavedení velkých molekul DNA in vitro a in vivo, protože takové částice se mohou jednodušeji pohlcovat buňkami ve srovnání s velkými agregáty.

Částice mohou však obsahovat více než jednu molekulu DNA, zvláště když se aplikují menší molekuly DNA jako oligonukleotidy.

Částice podle vynálezu vykazují v obecném případě sférickou strukturu, jejich průměr může kolísat od přibližné hodnoty 25 nm (v případě plazmidové DNA) do několika stovek nm. Zjistilo se, že objem vytvořených částic je přímo úměrný délce DNA. To silně naznačuje, že kondenzace molekul DNA je monomolekulární.

Vynález dále obsahuje použití kationových molekul a/nebo kationových prekurzorových molekul vhodných pro přípravu nových nukleotidových transfekčních částic.

Vynález dále popisuje způsob přípravy transfekčních částic, charakterizovaných tím, že kationové prekurzorové molekuly se přidají k molekulám nukleových kyselin ve vhodném pufru, což umožňuje tvořit komplexy s nukleovou kyselinou a umožňuje vznik kovalentní vazby se shodnou nebo odlišnou kationovou prekurzorovou molekulou na templátu nukleové kyseliny.

'.'.ýý 5—5

H-ř-: ··;':' ·.<· ·;

.: .:

• · • · • · ··· ··· ·· • 4 9 • · · • · · • · · ··

V prvním kroku metody se roztok DNA, který obsahuje jeden typ molekul DNA nebo směs různých molekul v pufru smísí s roztokem prekurzorových molekul, zvláště s různými roztoky prekurzorových molekul.

Vycházejíce z počáteční koncentrace DNA, která je nutná v konečné transfekční formulaci a daného poměru pozitivních a negativních nábojů, které závisí na specifické aplikaci, množství, se stanovily fyzikální charakteristiky (rozpustnost, c.m.c., atd.) prekurzorových molekul. Specifické aplikace se mohou definovat způsobem aplikace, například systémově nebo intravenózní cestou, v jejímž případě transfekční částice nemusí nést pozitivní náboj, aby nedošlo k nežádoucím reakcím s krevními komponenty, nebo cílovými buňkami, které jsou nutné pro specifické navázání nabitých částic. Při selekci vhodného detergentů jako prekurzorové molekuly je důležitá jeho kritická micelová koncentrace (c.m.c), která je pro daný detergent známa nebo se může stanovit způsoby Langmuirovy rovnováhy. Optimální výsledky podle vynálezu je možné získat, jestliže koncentrace detergentů je nižší než c.m.c..

Komponenty se inkubují za podmínek, které umožňují tvorbu komplexů. Obvykle se komplexy mohou tvořit při teplotě místnosti během krátkého časového období. To znamená během několika minut a několika hodin. Po promíchání komplexních partnerů, prekurzorové molekuly jsou kovalentně spojeny, což se může objevit v závislosti na rychlosti tvoření komplexů, bezprostředně po promíchání nebo po nutně dlouhé době. V závislosti na reaktivních skupinách, které jsou dostupné pro vytvoření vazeb, spojení se může objevit spontálně po kontaktu prekurzorových molekul, když se navážou na DNA. V jiném případě je nutné, aby se spojení zprostředkovalo dalším činidlem, jako je například kyslík. Je nutné, aby podmínky byly takové, že neovlivňují molekulu DNA, proto většina prekurzorových molekul, které se přednostně používají podle vynálezu se dimerizují nebo oligomerizují jednoduše na vzduchu. Vhodné reakční podmínky a

4 ·· 4 4 ·· 44 • 4 « « • 4 4 4

4 4 4 • 4 4 4 ♦· >4 časový průběh reakčních kroků se může stanovit provedením experimentů, ve kterých parametry kolísají monitorují se fyzikální charakteristiky reakčních produktů (meziproduktů) (komplexy a kompaktní částice) , například se měří velikost částic rozptylem laserového světla.

V případě funkce cílení/endosomolytické funkce je nutné, aby byly přítomné na prekurzorových molekulách nebo na nedimerizovatelných kationových molekulách. Způsob, například inkubační doba pro vytvoření komplexů nebo zavedení dalších kroků pro modifikaci kationových molekul, se může upravit.

Vhodné pufry pro přípravu nových transfekčních částic jsou libovolné pufry, které umožňují tvorbu komplexu ,a/nebo jsou kompatibilní s podmínkami pro kovalentní spojení mezi jednotlivými kationovými prekurzorovými molekulami a pro připojení optimální funkce cílení/endosomolytické funkce. Jiné parametry, jako je optimální hodnota pH, inkubační čas, teplota a koncentrace nukleových kyselin a kationtové prekurzorové molekuly a molekuly vhodné pro cílení a/nebo endocytózu závisí na každém individuálním provedení vynálezu. Tyto parametry se mohou optimalizovat v sériových experimentech, aniž to činí odborníkovi problém, protože parametry jsou omezeny například na vodné systémy a na upravení podmínek, které nemění molekuly nukleových kyselin. Takové parametry se popisují v příkladech a mohou se snadno modifikovat. Například vhodné parametry pro oxidaci prekurozorových molekul cysteinu v přítomnosti molekul nukleových kyselin, které vykazují hydrofilní funkci děkanu a kationovou funkci guanidinu za účelem vytvořit disulfidové můstky jsou roztok pufru obsahující 15 mM TrisHCl, pH 8,4, saturovaný kyslíkem ze tří cyklů vakuum/atmosferický kyslík, 90 μΜ (konečná koncentrace) kationových prekurzorových molekul přidaných dříve než se přidá 60 μΜ (konečná koncentrace) plazmidové DNA.

»· ·« * · · <

* · 4 <

» «9 I > 9 9 «

94 *· » · ♦ a » · ·· ’ 9 9 « » 4 4 « ·· 9·

Preferované použití nových transfekčních částic podle vynálezu je zavedení in vivo nukleové kyseliny do savčích buněk pro terapeutické aplikace.

V tomto případě nukleová kyselina je terapeuticky aktivní, nebo plazmid kódující se týká sekvence DNA jde například o oligonukleotid terapeuticky aktivní protein. Co neexistuje žádné omezení, mohou se použít libovolné sekvence vhodné pro terapii, například somatická genová terapie nebo imunoterapie. Příklady se popisují v dokumentu WO 93/07283.

Vynález se dále týká farmaceutických kompozic vhodných pro zavedení genů, které obsahují transfekční částice obsahující terapeuticky účinné množství nukleové kyseliny.

Takové farmaceutické kompozice mohou obsahovat transfekční částice, které se připravily čerstvě před aplikací nebo se mohou skladovat jako chlazená kapalina, ve zmrazené formě nebo jako lyofilizát a které mohou obsahovat další aditiva, jako jsou stabilizátory, cryoprotekční činidla. Vhodná aditiva a metody přípravy farmaceutických kompozic jsou známy v oboru popisují se v publikaci - Remington's Pharmaceutical Sciences (1980), Mack Publíshing Co., Easton , PA, Osol (ed.). V experimentech podle vynálezu se ukázalo, že kompozice obsahují transfekční částice podle vynálezu jsou účinné při intradermálním zavedení genů.

V preferuje se provedení farmaceutické kompozice, které je vhodné pro intradermální aplikaci.

Nehledě na zavedení DNA in vivo částice podle vynálezu je zvláště možné použít při zavedení velkých molekul DNA, například umělých chromozomů, do savčích buněk, které mohou být důležité při regulované expresi genu s dlouhým trváním.

Pro in vivo a in vitro transfekci je velmi výhodná existence transfekčních částic s požadovanými molekulami nukleových kyselin. Takový kit může například obsahovat jeden nebo více typů kationových prekurzorových molekul, které se mohou použít v různých kombinacích při optimalizaci jejich • Φ *» » φ φ φ » Φφφ * φ φ φ » φ φ φ ·· φφ ♦ φ φφ » φ φ φ ř Φ Φ φ » Φ Φ φ » φ Φ φ

Φ· ΦΦ vlastností, jednu nebo více molekul vhodné pro buněčnou specifickou funkci cílení/endosomolytickou funkci, vhodné pufry a jiná činidla nebo mechanická zařízení, které je možné použít pro přípravu, čištění nebo aplikaci nových transfekčních částic in vitro a in vivo.

Popisuje se uplatnění vynálezu v případě kationové prekurzorové molekuly N-decyl-2.-guanidinium-cystein:

Vytvořila se nová molekula detergentu (popisuje se v Příkladu 1) . Thiol se vybral jako dimerizovatelná funkce a cystein jako netoxický recipientní základní řetězec vhodný pro konstrukci polyfunkční molekuly. Očekává se, že uvnitř endozomálního kompartmentu lipofilní cysteinový ester nebo amidové vektory se budou enzymaticky štěpit na cystein a alifatický alkohol nebo amin s průběžnou dekondenzací DNA a s možnou lyží endozomu.

Zřejmý kolaps jedné molekuly DNA se v obecném případě očekává pouze v případě koncentrací detergentu nižších než je kritická micelová koncentrace (c.m.c.). Několik n-alkylových esterů cysteinu se dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) syntetizovalo dehydratací katalyzovanou DMAP a jejich

c.m.c. se stanovila Langmuirovou bilancí (20 mM pufr MES, pH 6), přičemž se získaly následující výsledky (délka n-alkylového řetězce/c.m.c.): dodekan/15 μΜ, undekan/80 μΜ, děkan /320 μΜ, oktan/>2 000 μΜ. Typické pracovní koncentrace plazmidů pro zavedení genu je 50 μΜ, přičemž dekanový řetězec je správná volba. Slabě bazická podstata funkce cysteinového esteru primárního aminu (pKa= 6,8) je nedostatečná pro simultánní navázání DNA (které vyžaduje protonovaný detergent) a významnou rychlost thiolové oxidace ve slabě bazickém médiu. Funkce aminu se pak převedla na vysoce bazický guanidin, který je znám tím, že interaguje s DNA ( CioC^G, obrázek č. 2).

Očekávalo se, že oxidační detergentové dimerizace je náchylná k templátovému účinku DNA (obrázek č. 1) . Rychlá vnitrokomplexní reakce je klíčový aspekt tvoření malých a ·♦ 44 • * « • ΦΦ • · Φ • Φ · ♦ · ΦΦ • * · « • · · Φ • · Φ φ • · Φ Φ ·· ΦΦ stabilních částic, protože rozsáhlá detergentová dimerizace na lipid dříve než se naváže DNA dostává systém zpátky k procesu agregace/tvorby klasických komplexů kationový lipid/DNA. V přítomnosti DNA se pozorovalo zvýšení rychlosti vzdušné oxidace (Obrázek č. 3).

Pod hodnotou c.m.c. hlavní přitažlivou sílou je skutečnost, že anionová DNA působí vůči izolovaným kationovým amfifilním molekulám. Dříve než dojde k oxidaci, komplexy by měly být elektroneutrální, dokonce i v případě, kdy detergent je slabě v nadbytku. Plazmidová DNA (60 μΜ v TrisHCl pH8,4 v koncentraci 15 mM) se proto smísila s Ci₀C^G+ (až 90 μΜ) a nechaly se ležet za aerobních podmínek po dobu 24 hodin. Během instantního kroku tvoření komplexu se zvýšilo typické UV absorpční spektrum DNA se středem při 260 nm o 15 %. Během oxidace se nepozorovaly další změny (jednou se upravila v případě disulfidové absorpce) a turbidita. CD spektrum komplexů bylo typické pro B-DNA, což vylučuje v komplexu výskyt kapalné krystalické fáze Y-DNA. Nejpřísnější test stability se však uskutečnil ve fyziologicky relevantních iontových koncentracích, kde komplexy kationový lipid/DNA tvoří agregáty3,9. UV spektrum komplexů CioC^G+ zůstává beze změn po 3 dnech ve 150 mM NaCl. Spektroskopie tak poskytuje nepřímý důkaz tvoření malých a stabilních komplexů amfifil/DNA.

Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) nefiltrovaného roztoku těchto komplexů vykazuje překvapivě homogenní populaci skoro specifických objektů (71 % monomérů, n=109) s několika většími strukturami (obrázek č. 4a) . Větší struktury byly jasně diméry (obrázek č. 4b, d) nebo oligoméry, které mohou vzniknout stejným způsobem a které nevykazují žádné tendence přimíchat se do těsněji fúzovaných agregátů jako kationové lipidy do3. Krok, kdy koncentrace detergentu je nižší než c.m.c. C₁₀C^G+ vede k výsledkům UV a TEM, které nejsou tak nízké, což způsobuje časově závislá agregace (data nejsou uvedena). Velikost částic se měřila při největším zvětšení (obrázek č. 4c) a stanovila se • 9 9

9 9

9 9

9 9 • · • 9 9

9 99 • 9 9

9 9 9 φφ hodnota 23 ± 4 nm. Výpočet za použití typické DNA a amfifilních molekulárních rozměrů vede ke kouli o průměru 28 nm, když se k 5 500 lípidovým molekulám přidají objemy 5,5 kbp. TEM poskytuje silný důkaz kolapsu monomolekulární DNA.

V sériích experimentů vratnost tvoření komplexu stejně jako stabilita DNA v komplexu vede k degradaci, která se stanovuje elektroforézou (obrázek č. 5) . Zatímco CioC^G+ si nebyla schopna udržet migraci DNA s výjimkou koncentrací nad c.m.c., kdy se objeví srážení (data nejsou uvedena), oxidované částice (CioC^G+) 2/DNA nemigrují a jsou během elektroforézy stabilní (Obrázek č. 5, dráha 2). Částice kationový lipid/DNA se mohou porušit buď v nadbytku detergentu dodecyisulfátu sodného (SDS, dráha 3) nebo přeměněním lipidu zpět na původní detergent Ci₀C^G+ s nadbytkem redukčního dithiotreitolu (DTT, dráha 4) . Sérové nukleázy přítomné v kultivačném médiu buněčných kultur rychle degradují dvoušroubovicovou plazmidovou DNA (dráhy 1 a 8) na šmouhu fragmentů s řadou zlomů (dráha 5) . Částice lipid/DNA jsou však v tomto kultivačním médiu fyzikálně stabilní (dráha 6) a chrání velký rozsah nukleové kyseliny od degradace, jak plazmid se v podstatě přeměňuje na pomaleji migrující cirkulární relaxovanou formu (uvolněnou po aplikaci SDS, dráha

7) .

Počáteční experimenty za použití kationových částic tvořených tří násobným přebytkem detergentu vede k expresi reportního genu v myších hepatocytech BNL CL2, což potvrzuje, že když je v buňce, záhuba komplexů není nevirový vektor. Další experimenty ukazují expresi in vitro za použití DNA komplexů potažených polykationtovými konjugáty nebo konjugáty polykátion-ligand nebo s částicemi, které obsahují deaktivovaný adenovirus. Dále je možné prokázat expresi genu in vivo po intradermálním zavedení komplexu.

Přehled obrázků na výkrese

Obrázek č. 1 znázorňuje schéma kolapsu plazmidové DNA vyvolaný kationovým detergentem.

Obrázek č. 2 znázorňuje syntézu lipofilního guanidylcysteinamidového detergentu.

Obrázek č. 3 znázorňuje skutečnost, že rychlost oxidace cysteinového detergentu CioC^G+ na cysteinový lipid (CioC^g+)2 je vyšší v přítomnosti templátové DNA.

Obrázek č. 4 znázorňuje transmisní elektronovou mikroskopii nefiltrovaného roztoku částic (CioC^g+)2 kationového lipidu/DNA.

Obrázek č. 5 znázorňuje fyzikální a chemickou stabilitu komplexů (Ci₀C^G+) 2 /DNA (elektroforéza na agarovém gelu).

Obrázek č. 6 znázorňuje stanovení velikosti částic kondenzovaných s CioC^G+. Měření velikosti částic

A: DNA fázgu lambda

B: DNA fágu T4

C: DNA CMVL

Obrázek č. 7A,B znázorňuje stanovení velikosti částic kondenzovaných s Ci₀C^G+ prokázanou pro kondenzaci monomolekulární DNA.

Obrázek č. 8 znázorňuje transfekce komplexů lipofilního guanidylcysteinamidu (CioC^G+)/DNA do buněčné linie BNL CL. 2.

Obrázek č. 9 znázorňuje syntézu lipofilního alkoholového cysteinesterového detergentu.

Obrázek č. 10 znázorňuje stanovení kritické micelové koncentrace (c.m.c.) lipofilních alkoholových cysteinesterových detergentů s a nebo bez DNA. c.m.c. detergentu s C8, CIO, Cil a C12 cysteinem.

Obrázek č. 11 znázorňuje stanovení kritické micelové koncentrace (c.m.c.) lipofilních alkoholových cysteinesterových detergentů s a nebo bez DNA.

A: c.m.c. CIO cysteinového detergentu s a nebo bez DNA

B: c.m.c. Cil cysteinového detergentu s a nebo bez DNA.

Obrázek č. 12 znázorňuje oxidaci CIO cysteinového detergentu s a bez DNA.

• ».··« ·· ·»

T ** * · A A A • · ·· · · s · ··: :

·· *♦ *· ··

Obrázek č. 13 znázorňuje syntézu lipofilního guanidyl-eysteinového esterového detergentu.

Obrázek č. 14 znázorňuje syntézu lipofilního ornitylcysteinamidového detergentu.

Obrázek č. 15 znázorňuje syntézu lipofilního alkoholového galaktozylcysteinového esterového detergentu.

Obrázek č. 16 znázorňuje UV spektroskopii spermin-Nl,N12bis-cysteinamidových nebo sperminových částic.

Obrázek č. 17 znázorňuje elektrof orézu na agarovém gelu. Stabilita částic tvořených buď sperminem nebo spermin-Nl,N12bis-cysteinamidem.

Obrázek č. 18 znázorňuje měření velikosti částic, které jsou výsledkem interakce komplexu (Ci₀C^G+) 2/DNA s různým množstvím PEI 25Kda.

Obrázek č. 19 znázorňuje měření velikosti komplexů (Ci₀C^G+) ₂/PEI25Kda-Gal4/DNA.

Obrázek č. 20 znázorňuje transfekci buněk komplexy SKOV3 (Ci₀C^G+) z/DNA/PEI 25KDa.

Obrázek č. 21 znázorňuje transfekci buněk BNL Cl. 2 komplexy (C_X0C^G+) 2/DNA/PEI 25KDa a (Ci0C^G+) 2/DNA/PEI 25KDa-Gal4 .

Obrázek č. 22 znázorňuje potažení komplexů (CioC^G+) ₂/DNA pol.ykationem spojeným s proteinem.

Obrázek č. 23 znázorňuje zeta potenciál částic (CioC^G+) ₂/DNA potažených transferin-polylyzinem.

Obrázek č. 24 znázorňuje transfekci buněk K562: účinek transferin-polylyzinu na zavedení komplexů (Ci₀C^G+) ₂/DNA.

Obrázek č. 25 znázorňuje transfekci buněk B16F10: účinek transferin-polylyzinu na zavedení komplexů (Ci₀C^G+) ₂/DNA.

Obrázek č. 26 znázorňuje transfekci buněk B16F10: účinek deaktivovaných adenovirových částic na zavedení komplexů (C₁₀C^g+)₂/DNA.

Obrázek č. 27 znázorňuje intradermální zavedení komplexů (C₁₀C^G+) 2/DNA in vivo.

alkoholov=ho

4

Obrázek č. 28 znázorňuje intradermální zavedení komplexů (Ci₀C^G+) ₂/DNA in vivo.

Obrázek č. 29 znázorňuje intradermální zavedení komplexů (Ci₀C^G+) 2/pCMVL/MannITC-PEI (25KDa) in vivo.

Obrázek č. 30 znázorňuje transfekci komplexů (C12CO) 2/DNA.

Zkratky:

Ac = CH₃-C(O)

DCC = dicyklohexylkarbodiimid

DMAP = dimetylaminopyridin

DCU = dicyklohexylmočovina

DDT = dithiotreitol

DMEM = Dulbeccovo modifikované minimální esenciální médium EDO = N-(3-Dimetylaminopropyl)-N-etyl-karbodiimidhydrochlorid Et = C₂H₅ eter = dietyleter

HEPES = hydroxyetylpiperazinetansulfonová kyselina

Me = metyl

MS = hmotnostní spektroskopie

MES = PEI polyetylenimin

BocON = 2-tert-butoxykarbonyl-oxyimino)-2-fenylacetonitril μΜ bp = mikromolární koncentrace DNA vypočtená na par baží (molekulární hmotnost je 660)

Cio~C^G+ = lipofilní guanydyl-cysteínamid

TA = Tris-acetát

THF = tetrahydrofuran

TLC = chromatografie na tenké vrstvě

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

a) syntéza lipofilního guanidylcysteinamidového detergentů

Syntéza lipofilní látky se provedla podle schématu znázorněném na obrázku č. 2.

Krok 1

Výroba N-tert-butoxykarbonyl-pyrazol-l-karboxamidinu

K roztoku di-tert-butyldikarbonátu (7,43 g, 33 mol) ve 100 ml dichlormetanu se přidalo 11,3 ml N,N-diízopropyletyleaminu (66 mmol) a 4,40 g lH-pyraol-l-karboxamidinhydrochloridu (30 mmol) . Roztok se míchal po dobu 3 hodin při teplotě místnosti a pak se odpařil do sucha. Získaná bílá pevná látka se rozpustila v 200 ml etylacetátu. Organická fáze se promyla 5 % (hmotn.) hydrogenuhličitanem sodným, sušila se průchodem přes síran hořečnatý a nakonec se odpařila do sucha. Zbytek se rozpustil ve vroucím hexanu. Roztok se nechal stát pří teplotě místnosti přes noc a pak po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C. Takto vytvořené krystaly se získaly filtrací a promyly se chladným hexanem (0°C)\ Po usušení se získalo 5,28 g bílých krystalů (25 mmol, výtěžek je 84 %) .

C₉Hi₄N₄O₂; 210,24 g/mol

TLC: Rf (20 % AcOEt/hexan) = 0,3.

TLC s reverzními fázemi: Rf (60 % CH₃CN/ 30 % H₂O/ 10 % MeOH) = 0,5.

NMR^XH (CDC1₃) ; δ ppm: 1,56 (s, 9H, C(CH₃)₃); 6,41 (dd, J_x= 3 Hz, J₂= 1,5 Hz, 1H, CH-CH=CH) , 7,50-7,70 (brs, 1H, =NH) ; 7,69 (d, J=l,l Hz, 1H, N=CH) ; 8,46 (d, J=3 říz, 1H, N-CH); 9,01-9,20 (brs, 1H, NHBoc) . ( v tomto i v jiném spektru NMR atomy vodíku připsané k signálu jsou psány tučným písmem).

MS(FAB+), m/z: 211,1 [MH⁺]; 155,0 [MH⁺-t-butyl].

• · • ·

Krok 2

Výroba N, N' -bis-tert-butoxykarbonyl-pyrazol-1karboxamidinu.

o

N

Tj

K suspenzi hydridu sodného (1,60 g, 40 mmol) ve 170 ml tetrahydrofuranu pří teplotě 0 °C se přidalo 2,10 g N-fcertbutoxykarbonyl-pyrazol-l-karboxamidinu (10 mmol). Suspenze se intenzivně míchala po dobu 1 hodiny při teplotě 0 °C. Pak se přidalo 4,5 g di-tert-butyldikarbonátu (20 mmol). Suspenze se nechala stát při teplotě místnosti a pak se postupně zahřívala pod zpětným chladičem. Po jedné noci pod zpětným chladičem se reakční médium zchladilo na teplotu 0 °C. Přidalo se 2,3 ml kyseliny octové a roztok se míchal po dobu 15 minut. Organická fáze se promyla 60 ml 5 % (hmotn.) hydrogenuhličitanu sodného, 60 ml saturovaného roztoku NaCl, sušila se přechodem přes síran hořečnatý a pak se odpařila do sucha. Získané zbytky se čistily chromatografií na oxidu křemičitém (gradient 5 až 15 % etylacetát v hexanu), přičemž se získalo 2,48 g pevné bílé látky (8,0 mmol, výtěžek je 80 %).

TLC: Rf (20 % AcOEt/hexan) = 0,3.

TLC s reverzními fázemi: Rf (60 % C₃CN/ 30 % H₂O/ 10 % MeOH) = 0,4. .

NMR¹H(CDC1₃) ; δ ppm: 1,52 (s, 9H, C(CH₃)₃); 1,58 (S, 9H, C(CH₃)₃);

6, 43-6, 46 (m, IH, CH-CH=CH), 7,64-7,66 (m, IH, N=CH) , 7,64-7,66 (m, IH, N=CH) , 8,33 (d, J= 3 Hz, IH, N-CH) , 8,93 (brs, IH,

NHBoc).

• · φ φ φ φ φ φ

MS(FAB+), m/z: 311,1 [ΜΗ⁺]; 255, 0 [ΜΗ⁺-t-butyl]; 211,0 [MH⁺-Boc];

199,0 [ΜΗ⁺-2 t-butyl]; 155,0 [MH⁺-boc- t-butyl].

Krok 3

Výroba N,S-bis-fcerfc-butoxykarbonylcystein-decylamidu.

K roztoku N,S-bis-tert-butoxykarbonylcysteinu (1 g, 3,11 mmol) v 6 ml dichlormetanu a 200 μΐ tetrahydrofuranu se přiadalo 430 mg N-hydroxysukcinimidu (3,73 mmol). Reakční směs se zchladila na teplotu 0°C a přidalo se 713 mg N,N'dicyklohexylkarbodíimidu (3,42 mmol). Po dvou hodinách reakce při teplotě 0 °C se přidalo 680 μΐ decylaminu (3,42 mmol) a roztok se míchal po dobu 6 hodin při teplotě okolí. Reakční médium se pak filtrovalo, odpařilo se do sucha a bylo pohlceno do 200 ml etylacetátu. Organická fáze se promyla v následujících krocích 100 ml 5 % (hmotn.) hydrogenuhličitanu sodného, 100 ml vody, 100 ml kyseliny citrónové o koncentraci 0,5 M, 100 ml vody, pak se sušila přechodem přes síran hořečnatý a pak se odpařila do sucha. Získaný zbytek se čistil chromatografií na oxidu křemičitém (gradient 1 až 3 % metanol v dichlorometanu), přičemž se získá 1,27 g oleje (2,75 mmol, výtěžek je 88 %).

C23H44N2O5S; 460,68 g/mol

TLC: Rf (5 % MeOH/1 % AcOH/CH₂C1₂) = 0,6.

• 9

1,21-1,38 (m, , 1,51 (s, 9H,

NMR¹H (CDC1₃) ; δ ppm: 0,89 (t, J=7 Hz, 3H, CH3);

14H, CH₃- (CH₂) ₇-CH₂CH₂NH) ; 1,45 (s, 9H, NH-C(CH₃)₃)

S-C(CH₃) ₃), 1,42-1,58 (m, 2H, CH₂-CH₂NH), 3, 08-3,32 (m, 4H, CH₂S, CH₂NHCO) , 4,27 (dd, Ji= 13 Hz, J₂=8 Hz, CH-CONH), 5,35-5,43 (brs, IH, NHBoc); 6,28-6,37 brs, IH, NHCOCH) .

MS(FAB+), m/z: 461,3 [MH⁺]; 405,3 [MH⁺-t-butyl]; 361,3 . [MH⁺-Boc];

349,2 [MH⁺-2 t-butyl]; 305,2 [MH⁺-t-butyl-boc], 261,2 [MH⁺-Boc].

Krok 4

Výroba S-tert-butoxykarbonylcysteindecylamidu.

o

461 mg N, S-bis-tert-butoxykarbonyl-L-cysteindecylamidu (1 mmol) se rozpustilo ve 3 ml 2N HCl/AcOEt při teplotě 0 °C a míchalo se po dobu 1 hodiny. Roztok se odpařil do sucha pohltil se do 100 ml etylacetátu. Organická fáze se dvakrát promyla s 5% (hmotn.) hydrogenuhličitanem sodným, pak se sušila přechodem přes síran hořečnatý a odpařila se do sucha. Získaný olej se čistil chromatografíí na oxidu křemičitém (gradient 1 až 3 % metanol v dichlorometanu), přičemž se získá 233 mg oleje (0,65 mmol, výtěžek je 65 %).

CigH₃gŇ₂O₃S; 360,56 g/mol

TLC: Rf (10 % MeOH/CH₂Cl₂) =0,7.

NMR^XH (CDC1₃) ; δ ppm: 0,89 (t, J=6 Hz, 3H, CH3); 1,10-1,40 (m, 14H, CH₃- (CH₂) 7-CH₂CH₂NH) ; 1,41-1,58 (m, 2H, CH₂-CH₂NH) , 1,50 (s, i

NH₂; 3,06 (dd, Ji= 14 Hz, J₂= 8

Hz, J₂= 7 Hz, 2H, CH₂-NHCO) ; 3,37 CH-S); 3,37 (dd, Ji= 14 Hz, J₂=4 • · ·· ·· ·♦ ·· • * ·· « «· · « * · • · · · ·· ♦ ··

9Η, S-C(CH₃)₃), 1,62 (brs, 2Η,

Hz, ÍH, CH-S); 3,24 (dt, Ji= 7 (dd, Ji= 14 Hz, J₂= 4 Hz, ÍH,

Hz, CH-S), 3,55 (dd, Ji= 8 Hz, J₂=4 Hz, ÍH, CH-CONH) , 7,3-7,4 (brs, ÍH, NH).

MS(FAB+), m/z: 361,2 [MH⁺]; 305,1 [MH⁺-tert-butyl]; 261,1 [MH⁺Boc].

Krok 5

Výroba N,N' -bis-tert-butoxykarbonylguanidinyl-S-tertbutoxykarbonylcysteindecylaminu

N, N' -bis-tert-butoxykarbonyl-pyrazol-1-karboxamidin (178 mg, 0,572 mmol) se přidal do roztoku S-tertbutoxykarbonylcystein-decylamidu (227 mg, 0,630 mmol) ve 3 ml acetonitrilu. Reakční směs se míchala po dobu 2 dní při teplotě místnosti a vysušila se. Zbytek se čistil chromatografií na silikagelu (10 až 15 % etylacetát v hexanu), vznikla bílá pevná látka (281 mg; 0,47 mmol, 81 %).

C29H54N4O7S; 602,84 g/mol

TLC: Rf (20 % AcOEt/hexan) = 0,6.

• · • · t

• ··

NMR^XH (CDC1₃) ; δ ppm: 0,9 (t, J=6 Hz, 3H, CH₃) ; 1,18-1,40 (m, 14H, CH₃-(CH₂) 7-CH₂CH₂NH) ; 1,45-1, 65 (m, 29H, 3 x -C(CH₃)₃, CH₂-CH₂NH) ;

3,17-3,35 (m, 4H, CH₂-S, CH₂-NHCO), 4,8 (dd, Ji= 11 Hz, J₂= 6 Hz, IH, CH-CONH); 6, 98-7,07 (m, IH, CH₂-CH₂-NH) ; 8,81 (d, J= 7 Hz, NH-Boc); 11,36 (sl, IH, NHCN(NH)).

MS(FAB+), m/z: 603,3 [MH⁺]; 547,2 [MH~- t-butyl]; 503,3 [MH⁺-Boc];

447,2 [MH⁺- t-butyl-boc]; 403,2 [MH-2Boc]; 347,1 [MH⁺-t-butyl2Boc]; 303,2 [MH⁺-3Boc].

Krok 6

a) výroba guanidylcysteindecylamidu (Ci₀C^G+)

SH

Ν, N '-bis-tert-butoxykarbonyl-guanidinyl-S-tertbutoxykarbonylcysteindecylamid (60 mg, 0,1 mmol)se rozpustil v 1 ml kyseliny trifluorooctové a míchal se v atmosféře argonu po dobu 2 hodin při teplotě místnosti. Směs se vysušila a výsledný bezbarvý olej se rozpustil v 1 ml perdeuteroetanolu. Výsledný zásobní roztok o koncentraci 0,1 M se udržoval v atmosféře argonu při teplotě -80 °C. Obsah thiolu se stanovil Elmannovým činidlem způsobem, který se popisuje v publikaci Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979) (87%).

C14H30N4OS; 302,84 g/mol

NMR^XH (CD₃CD₂OD) ; δ ppm: 0,90 (t, J=6 Hz, 3H, CH₃) ; 1,27-1,42 (m,

14H, CH₃- (CH₂) ₇-CH₂CH₂NH) ; 1,50-1,61 (m, 2H, CH₂-CH₂NH) ; 2,90-3,35 (m, 4H, CH₂-S, CH₂-NHCO), 4,32-4,40 (m, 2H, CH-CONH).

I • 9 » I 99

1 * 9 9

9 9

b) Rychlost oxidace cysteinového detergentu ChoC^54- na cysteinový lipid (Ci0-C^g+)2 je rychlejší v přítomnosti templátové DNA. Zásobní roztok pufru (TrisHCl) 15 mM pH8,4) se saturoval kyslíkem ve třech cyklech v atmosféře vakua/kyslíku. Cio~C^G+ se zavedl injekcí v koncentracích odpovídájících koncentrovanému zásobnímu roztoku až konečné koncentraci 90 μΜ. V každém časovém bodě se odebral alikvot 0,5 ml a smíchal se s 0,5 ml 2x koncentrovaného Ellmanova činidla. Zbývající volný thiol se kvantifikoval spektrofotometricky podle publikace Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979). Při templátovém experimentu se před přidáním detergentu přidala DNA plazmidu pCMVL (připravená způsobem, který se popisuje v dokumentu WO 93/07283), kdy konečná koncentrace je 60 μΜ. Výsledky experimentu se uvádějí na obrázku č. 3.

c) transmisní elektronová mikroskopie (obrázek č. 4).

Transmisní elektronová mikroskopie nefiltrovaného roztoku kationový lipid (Cio~C^g+)₂ /částice DNA vykazují a) velmi homologní populaci, b) tvoří koule c) , d) s poloměrem přibližně 23 nm, měřítko na všech obrázcích odpovídá 100 nm. Roztok vzorků se připravil přidáním detergentu (konečná koncentrace 90 μΜ) k roztoku 60 μΜ DNA pCMVL v pufru HEPES (15 mM, pH7,4) a roztok se nechal stát v aerobních podmínkách přes noc. Uhlíkaté filmy se připravily sublimací čerstvě štěpené slídy a získaly se flotací na síťku Cu/Rh (300 ok, Touzard and Matignon, Courtaboeuf, France) . Při sušení přes noc se sítě uchovávaly na blotačním papíře na petriho misce. Kapka vzorku (5 μΐ) se nechala ležet na síti po dobu 1 minuty. Komplexy se negativně obarvily roztokem vodného uranylacetátu (1% hmotn.) o objemu 30 μΐ po dobu 20 vteřin a přebytečný roztok se odstranil blotačním papírem. Pozorování se uskutečnilo transmisní elektronovou t

» » · * 9

9 99 · mikroskopií při 80 kV na zařízení Philips EM 410. Podobné výsledky se pozorovaly za použití 0,15 M NaCI (obrázek č. 4).

d) Fyzikální a chemická stabilita komplexů (CioC^G+) ₂/DNA (obrázek č. 5)

Provedla se elektroforéza na 1 % agarózovém gelu (90 min. při 8 V/cm v 40 mM Tris-acetátovém pufru pH8) 20 μΐ vzorku obsahující 0,4 μς (dráha 1 až 4) nebo 0,2 μμ (dráha 5 až 8) DNA plazmidu pCMV-luc. Komplexy se připravily přidáním 100 násobně koncentrovaného roztoku detergenu Ci₀-C^G+ (konečná koncentrace 90 μΜ) k roztoku plazmidu (60 μΜ) v pufru HEPES (15 mM, pH7,4). Roztok se lehce zamíchal a nechal se oxidovat po dobu 24 hodin. V dráze 1 je 60 μΜ plazmidová DNA. V dráze 2 je 60 μΜ oxidovaných komplexů (Ci0C^G+) 2/DNA. V dráze 3 je stejná DNA jako v dráze 2, ale je obsažena v 3 mM roztoku dodecylsulfátu sodného. V dráze 5 je 60 μΜ plazmidu inkubovaného po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C s ekvivalentním objemem kultivačního média DMEM, které obsahuje 10 % sérum. V dráze 6 je 60 μΜ oxidovaných komplexů (Ci₀C^G+) ₂/DNA inkubovaných stejným způsobem jako v dráze 5. V dráze 7 je stejný DNA jako v dráze 6, ale v 3 mM roztoku dodecylsulfátu sodného. V dráze 8 je 30 μΜ DNA plazmidu pCMV-luc.

e) Částice DNA kondenzované s Ci₀C^G+

Vytvořily se komplexy s plazmidem CMV-luc (o veliksoti 5,6 kb) , s DNA fága λ (o velikosti 48 Kbp) a s DNA T4 (o velikosti 167 Kbp) v koncentraci 15 μΜ v pufru Tris-HCl (15 mM pH 8,4). Po 24 hodinách inkubace se provedlo měření. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 6 (obrázek č. 6A: fág lambda, obrázek č. 6B: fág T4, obrázek č. 6C: CMV-Luc. 1 ekv. = 30 μΜ, 1,2 ekv. =36 μΜ, 1,4 ekv. = 42 μΜ).

V případě monomolekulární kondenzace molekul DNA objem vytvořených částic je přímo úměrný délce DNA:

• ♦ 4 4 •44 ··<

)1 ι:

objem. = konstanta χ délka DNA (bp)

V případě, že částice jsou koule, objem je úměrný jedné třetině průměru (objem = 4 PiR³/3) , který je možno prezentovat následující rovnicí:

průměr částic = konstanta x (délka DNA (bp)

1/3

Když se minimální velikost částic odvozená z různých DNA (obrázek č. 7B) vynesla do grafu jako funkce třetí odmocniny jejich velikostí (obrázek č. 7A) , je možné body zahrnující počátek propojit přímou čarou. To je ověřeno v případě monomolekulární kondenzace.

f) tranfekce komplexů alkohol-cystein amid (CioC^G+) /DNA do buněčné linie BNL CL.2 hodin před transfekci se buňky (získáno od ATCC) distribuovaly na kultivační plotny s 24 prohlubněmi (50 000 buněk v jedné prohlubni, buňky se kultivovaly v lahvích o objemu 75 cm² (Costar) v Dulbeccově upraveném médiu (DMEM, GIBCO), streptomycin v koncentraci 100 μg/ml (GIBCO), penicilín v koncentraci 100 mezinárodních jednotek/ml (GIBCO) a glutamin (glutamax) v koncentraci 0,286 g/ml (Lancaster) při teplotě 37 °C ve vlhké atmosféře obsahující 5 % CO2.

Komplexy s plazmidem CMV-Luc se vytvořily přidáním alikvotu koncentrovaného roztoku Ci₀C^G+ a k roztoku plazmidů (30 μΜ bp) v kyslíkem saturovaném Tris-HCl 15 mM pH 8,4. Roztok se pak inkuboval v atmosféře kyslíku po dobu 24 hodin. Bezprostředně před transfekci se kultivační médium nahradilo čerstvým médiem bez séra. Do prohlubně se přidalo 100 μΐ transfekčního roztoku, který obsahuje komplexy (2 μς DNA) . 3 hodiny po transfekci se přidalo 1 % sérum, o hodinu později se přidalo 9 % sérum, 6 hodin po transfekci se transfekční médium nahradilo médiem

4 doplněným 10 % sérem. O 24 hodin později se exprese luciferázy stanovila komerčně dostupným křtem (Promega) za použití luminometru (Berthold). Každý experiment se provedl jako duplikát a výsledky se uvádějí ve světelných jednotkách na miligram proteinu (test s kyselinou bicinchoninovou (BCA), Pierce). Jako mezinárodní standard se použil komplex DNA obsahující 10 nábojových ekvivalentů PEI (polyetylenimin, 25 KDa) (obrázek č. 8) .

Příklad 2:

a) Syntéza lipofilního alkoholového cysteinesterového detergentů

Syntéza se provedla podle schématu znázorněném na obrázku

č. 9 krok 1:

Výroba N,S-bis-tert-butoxykarbonyl-L-cysteinu ,0·

945 mg L-cysteinchlorohydrátu (6 mmol) se rozpustilo v 10 ml deionizované vody, ze které se plyny odstranily vakuem. Do roztoku se přidalo 2,625 g BocOBoc (12 mmol) v 10 ml THF a 5,4 ml trietylaminu (39 mmol). Po dvou dnech míchání v atmosféře argonu a při teplotě okolí se odpařilo reakční médium na objem o trochu menší než je 10 ml. Přidalo se 10’ml deionizované vody a vodní fáze se promyla eterem za účelem odstranit zbývající nezreagovaný BocOBoc. Vodní fáze se dále okyselila na hodnotu pH 3 saturovanou kyselinou citrónovou a extrahovala se eterem (3 x 60 ml). Éterové fáze se promyly 0,5 M kyselinou citrónovou φ

• * * φ φφ ♦ · ί Π ϊ φ ♦ φ φ φ · φ φ * · φφ (2 χ 100 ml) ·, sušily se na síranu hořečnatém a odpařila se do sucha. Za použití chromatografie s kolonou s oxidem křemičitým (eluce gradientem CH₂Cl₂/MeOH obsahujícím 1 % kyselinu octovou od 0 % do 2 %) se získalo 1,34 g N, S-bis-tert-butoxykarbonylcysteinu (4,2 mmol, výtěžek je 70 %).

TLC: Rf (CH₂C1₂, MeOH 5 %, AcOH 1 %) = 0,5.

Struktura získaného produktu se potvrdila magnetickou rezonancí NMR¹H (CDCI3) a chemickým posunem δ ppm: 1,46 (s, 9H, N-Boc) ; 1,50 (s, 9H, S-boc) , 3,22 (dd, Ji= 15 Hz, J₂= 7 Hz, IH, Ha); 3,36 (dd, Ji= 15 Hz, J₂= 5 Hz, IH, Ha); 5,45 (d, J = 7,2, IH, Hc), 6,34(brs, IH, Hd).

MS(FAB+):322,1 (MH+).

Krok 2

Výroba lipofilního alkoholového esteru N,S-bis-tertbutoxykarbonyl-L-cysteinu.

n = 0,2,3,4

.ϊ • ·

Κ roztoku lipofilního alkoholu (1,2 mmol) v 2,5 ml nevodného dichlormetanu se přidalo 321 mg N,S-bis-tertbutoxykarbonyl-cysteinu (1 mmol) a 24 mg 4-dimetylaminopyridinu (0,2 mmmol) . Roztok se pak ochladil na teplotu 0 °C a přidalo se 268 mg DCC (1,3 mmol nebo EDC). Roztok se pak míchal po dobu 2 hodin při teplotě 0 °C přes noc při teplotě místnosti. Reakční médium se pak odpařilo do sucha a zbytek se resuspendoval v 10 ml etylacetátu. Suspenze se pak filtrovala a filtrát se ředil v 10 ml etylacetátu. Organická fáze se promyla 20 ml destilované vody, 20 ml vodného roztoku 5 % uhličitanu sodného a 20 ml destilované vody. Organická fáze se pak sušila síranem hořečnatým a pak se odpařila do sucha. Získaný olej se nakonec čistil chromatograficky na koloně s oxidem křemičitým (eluce se provedla směsí hexan/etylacetát v koncentraci od 0% do 7%) za účelem získat čirý olej. V případě cysteinu CIO (n=2) se získal výtěžek 73 %. TLC (hexan, AcOEt 10 %) Rf = 0,50).

Struktura získaného produktu se potvrdila magnetickou rezonancí NMR¹H(CDCl3) a chemickým posunem δ ppm: 0,90 (t, J= 6,9 Hz, 3H, H₅); 1,25-1,42 (m, 12H, H₃) , l,46(s, 9H, N-Boc) , l,51(s, 9H, S-Boc), 1,56-1,71 (m, 4H, H₂, H₄) ; 3,18-3,38 (m, 2H,

MS(FAB+): 462,4 (MH+).

Krok 3

Výroba lipofilního alkoholového cysteinového esteru

·· *· »· ·9 * ·· · ♦ ·< tt ♦ · ·♦ « · « · • · · » · ♦ · · « β ·· · «« « « « «· ΦΦ _β>

0,2 mmol lipofilního alkoholové esteru N,S-bis-tertbutoxykarbonyl-L-cysteinu rozpuštěného v 1,5 ml kyseliny triflurooctové se míchalo v atmosféře argonu po dobu 1 hodiny. Reakční médium se odpařilo a získaný čirý olej se rozpustil v 1 ml deuteroetanolu a uchovával se v atmosféře argonu při teplotě -80 °C. Měření thiolových skupin s Eilmanovým činidlem (Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979) vykazuje, že se kvantifikovala deprotekční reakce.

V případě CIO cysteinu (n=2):

Struktura získaného produktu se potvrdila magnetickou rezonancí ΝΜΗ^Ή ([Dgjetanpl) a chemickým posunem δ ppm: 0,91 (t,

J= 6,8 Hz, 3H, H₅); 1,24-1,48 (m, 14H, H₃, H₄) , 1, 66-1,78 (m,

2H, H₂); 3,06-3,22 (m, 2H, H_a) , 4,18-4,40 (m, 3H, H_b, HJ .

MS(FAB+): 262,2 (MH+).

b) Stanovení kritické micelové koncentrace (c.m.c.) lipofilních alkoholových cysteinesterů s DNA a bez DNA i) c.m.c. detergentu s C8, CIO, Cil a C12 cysteinem

Měření c.m.c. se provedlo podle Langmuira v pufru MES (20 mM pH6) , který obsahuje 10 mM DTT. Když se povrchové napětí vyjádří jako logaritmická funkce koncentrace detergentu pozoruje se pokles c.m.c. (obrázek č. 10).

Aplikací této metody se stanovilo c.m.c, látek, které mají různé délky řetězců (C8, CIO, Cil, C12).

Cn-cystein	CMC
C8	větší jak 2 mM
CIO	320 μΜ '
Cil	80 μΜ
C12	15 μΜ

ii) c.m.c. CIO a Cil cysteinu s DNA a bez DNA. Analogickým způsobem, který se popisuje shora v textu se stanovily hodnoty c.m.c. cysteinu CIO a Cil. Použil se pufr obsahující DNA telecího brzlíku v koncentraci 30 μΜ bp (obrázek č 11A, B) .

Cn cystein	CMC bez DNA	CMC s DNA
CIO	32 0 μΜ	50 μΜ
Cil	8 0 μΜ	32 μΜ

c) Oxidace cysteinu CIO s DNA a bez DNA

Rychlost oxidace cysteinu CIO se stanovila měřením thiolových skupin za použití Ellmanova činidla (Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979)) jako funkce času. Měření se provedlo v roztoku obsahujícím 60 μΜ cysteinu CIO v 20 mM MES pH6 bez DNA nebo v přítomnosti 30 μΜ bp CMV-Luc (Obrázek č. 12).

Příklad 3:

Syntéza lipofilního alkoholového guanidylcysteinesterového detergentu.

Syntéza se provedla podle schématu znázorněném na obrázku č. 13.

Krok 1:

Výroba S-tert-butoxykarbonylcysteindecylesteru.

o.

nh ₂

231 mg N,S-bis-tert-butoxykarbonylcysteindecylesteru (0,5 mmol) se rozpustilo v 1,1 ml 2,2 N HCl/AcOEt. Roztok se míchal po dobu jedné hodiny při teplotě okolí a odpařil se do sucha. Získaný zbytek se pohltil do 50 ml acetátu. Organická fáze se promyla dvakrát 25 ml 5 % (hmotn.) hydrogenuhličitanu sodného, sušil se síranem hořečnatým a pak se odpařil do sucha. Získaný olej se čistil chromatografií na oxidu křemičitém (gradient směsi metanol v dichlormetanu 0 až 3 %), přičemž se získalo 141 mg žlutého oleje (0,39 mmol, výtěžek je 78 %).

Ci8H₃5NO₄S; 361,55 g/mol

NMR^ÍCDCls) ; δ ppm: 0,90 (t, J=7 Hz, 3H, CH₃) ; 1,20-1,42 (m,

14H, CH₃-O(CH₂)7-CH₂CH₂O) ; l,50(s, 9H, C(CH₃)₃); 1,5.8-1,72 (m, 4H, CH₂-CH₂ONH₂) , 3,03 (dd, J_x= 14 Hz, J₂= 7 Hz, 1H, CH-S) , 3,26(dd, Ji= 14 Hz, J₂= 5 Hz, 1H, CH-S), 3,71(dd, J_x= 7 Hz, J₂= 5 Hz, 1H, CH-COO), 4,13 (t, J= 6 Hz, 2H, CH₂O) .

MS(FAB+), m/z: 362,2 [MH⁺]; 306,2 [MH⁺-t-butyl]; 262,2 [MH⁺-Boc].

Krok 2:

Výroba Ν,N'-bis-tert-butoxykarbonyl-guanidinyl-S-tertbutoxykarbonylcysteindecylester

φφ φφ ♦ φ φ φ φ φ φ φ « φ φ φ φφ φφ φ

φ φ

φ φ »* φφ φ φ · φ ♦· φ φ φ φ φ φ φ · φ φ · ·

Κ roztoku 99 mg S-tert-butoxykarbonylcysteindecylester (0,275 mmol) v 1 ml acetonitrilu se přidalo 78 mg N,N'-bistert-butoxykarbonylpyrazol-l-karboxaimdinu (0,25 mmol). Reakční médium se míchalo po dobu 2 dní při teplotě okolí, pak se odpařilo do sucha. Získaný zbytek se čistil chromatografií na oxidu křemičitém (gradient směsi etylacetátu v hexanu je 0 až 7 %), přičemž se získalo 127 mg čirého oleje (0,21 mmol, výtěžek je 84 %).

C29H53N3O8S, 603,82 g/mol

TLC: Rf (10 % AcOEt/hexan) = 0,5.

NMR¹H(CDC1₃) ; 6'ppm: 0,9 (t, J=7 Hz, 3H, CH₃) ; 1,25-1,42 (m, 14H, CH3-(CH₂)7-CH₂CH2O) , 1,479 (s, 9H, C(CH₃)₃), 1,493 (s, 9H, C(CH₃)₃), C(CH₃)₃), 1,497 (s, 9H, C(CH₃) ₃), 1, 58-1, 73 (m, 2H, CH₂. CH₂O) , 3,31 (dd, Ji= 14 Hz, J₂= 5 Hz, IH, CH-S), 3,50 (dd, Ji= 14 Hz, J₂= 5 Hz, IH, CH-S), 4,05-4,20 (m, 2H, CH₂-O) , 5,15 (dt, J₃= 7 Hz, J₂= 5 Hz, IH, CH-COO), 9,00 (d, J= 5, IH, NH-Boc), 11,42 (brs, IH, NH-CH(NH)).

Krok 3

Výroba guanidylcysteindecylesteru.

SH

mg Ν,N-bis-etrt-butoxykarbonylguanidinyl-S-tertbutoxykarbonylcysteindecylesteru (0,05 mmol) rozpuštěného v 1 ml trifluorooctové kyselině se míchalo v atmosféře argonu po dobu 2 hodin při teplotě okolí. Reakční médium se pak odpařilo do sucha a získaný čirý olej se rozpustil v 1 ml deuteroetanolu. Roztok se uchovával v atmosféře argonu při teplotě -80 °C. Výtěžek reakce se stanovil měřením množství thiolových funkcí Ellmanovým činidlem (Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5^Zdithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979)). Výtěžek reakce je 80 %.

Ci₄H2₉N₃O2S, 303, 46 g/mol

NMR¹H (CD₃CD₂OD) ; δ ppm: 0,90 (t, J=6 Hz, 3H, CH₃) ; 1,25-1,47 (m,

14H, CH₃- (CH₂) 7-CH2CH2O) , 1,60-1,77 (m, 2H, CH₂-CH₂O) , 2,98-3,27 (m, 2H, CH₂-S), 4,12-4,30 (m, 2H, OCH₂) , 4,32-4,40 (m, ÍH, CHCONH) .

Příklad 4:

Syntéza lipofilního ornitylcysteinamidového detergentu. Syntéza se provedla podle schématu znázorněném na obrázku

č. 14 .

Krok 1:

Výroba S-tert-butoxykarbonylcysteinhydrochloridu.

Z

HOjC^NHj+ck

642 mg N,S-bis-tert-butoxykarbonylcysteinu (2 mmol) se rozpustilo ve 3 ml 2,9 N HCl/AcOEt a roztok se míchal při teplotě místnosti po dobu 20 minut . Do reakčního média se přidaly 3 ml eteru. Získané krystaly se shromáždily filtrací, promyly se eterem a nakonec se sušily ve vakuu. Přičemž se získalo 4%5 mg bílých krystalů (1,57 mmol, výtěžek je 79 %).

C₈Hi₆NO₄CIS; 257,74 g/mol ·· ·· • * » • · · • · 99

9 »

• · • 9

9

9 ·

9 • · ·♦

NMR¹H(DC1 0,1 Μ)); δ ppm: 1,44 (s, 9H, C(CH₃)₃); 3,31 (dd, J_x= 15 Hz, J₂= 7 Hz, 1H, CH-S), 3,49 (dd, J] = 7 Hz, J₂= 5 Hz, 1H, CHCO₂) .

MS(FAB+), m/z: 222,2 [MH⁺]; 166,2 [MH⁺-t-butyl].

Krok 2:

Výroba Ν,Ν'-bis-tert-butoxykarbonylornithyl-S-tertbutoxykarbonylcysteinu.

K roztoku Ν,N'-bis-tert-butoxykarbonylornithin (160 mg, 0,48 mmol) v 1 ml dichlormetanu se přidalo 60 mg Nhydroxysukcinimidu (0,52 mmol). Reakční směs se ochladila na teplotu 0°C a přidalo se 99 mg Ν,N'-dicyklohexylkarbodiimidu (0,48 mmol). Po 2 hodinách míchání při teplotě 0 °C se přidalo 130 mg hydrochlorid-S-tert-butoxykarbonylcysteínu (0,50 mmol), který je rozpuštěný v 1 ml metanolu, jenž obsahuje 234 μΐ trietylaminu (1,68 mmol). Roztok se pak míchal přes noc při teplotě okolí. Reakční médium se pak odpařilo do sucha, zbytek se pohltil do 10 ml etylacetátu a pak se filtroval. Po ředění v 50 ml etylacetátu, se filtrát promyl dvakrát 25 ml 5 % (hmotn.) kyselinou citrónovou , sušil se síranem hořečnatým a pak se odpařil do sucha. Získaný zbytek se čistil chromatografii na oxidu křemičitém (gradient směsi metanolu v dichlormetanu je 2 až 15 %) , přičemž se získalo 242 mg bílé pevné látky (0,45 mmol, výtěžek je 94 %).

C23H41N3O9S; 535, 66 g/mol

NMR¹H(CD₃OD) ; δ ppm: 1,42 (s, 9H, C(CH₃)₃); 1,45 (s, 9H, C(CH₃)₃); l,46(s, 9H, C(CH₃)₃); 1,47-1,88 (m, 4H, CH₂-CH₂-CH₂NHBoc) ; 3,04 (t, J= 6 Hz, 2H, CH2-CH2NHB0C, 3,13 (dd, Ji= 14 Hz, J₂= 7 Hz, IH, CH-S), 3,45 (dd, J_x= 14 Hz, J₂= 4 Hz, IH, CH-S), 4,0-4,1 (m, IH, CH2-CH2-CH2CH-CONH) , 4,40 (dd, Ji= 7 Hz, J₂= 4 Hz, IH, CH-CO₂) .

Krok 3:

Výroba Ν, N' -bis-tert-butoxykarbonylornityl-S-tert-

K roztoku Ν,N'-bis-tert-butoxykarbonylornityl-S-tertbutoxykarbonylcysteinu (100 mg, 0,187 mmol) v 0,5 ml dichlormetanu se přidá 26 mg N-hydroxysukcinimidu (0,224 mmol). Reakční směs se pak ochladila na teplotu 0 °C a přidalo se 42 mg Ν,N'-dicyclohexylkarbodiimidu (0,205 mmol). Po 2 hodinách reakce při teplotě 0 °C se zavedl n-alkylamin (0,205 mmol) a roztok se míchal přes noc při teplotě okolí. Reakční médium se pak odpařilo do sucha, zbytek se pohltil do 5 ml etylacetátu a pak se filtroval. Po naředění v 25 ml etylacetátu se filtrát promyl následnými kroky 10 ml vody, 10 ml 5 % (hmotn.) hydrogenuhličitenu sodného a 10 ml vody, sušil se síranem *

Φφ ·♦ • φ · φ • # ·» • · φ · « « · * φ φ» ·« φ φ φ φ φ · • · φ φ φ φ

Φ· Φ· vápenatým a odpařil se do sucha. Získaný zbytek se čistil na chromatografícké koloně s oxidem křemičitým (gradient směsi metanolu v dichlormetanu je 0 až 1 %) , přičemž se získá bílá pevná látka.

V případě N, N' -bis-tert-butoxykarbonylornityl-S-tertbutoxykarbonylcysteindedecylamidu se získalo 85 mg bílé pevné látky (0,121 mmol, výtěžek je 65 %) .

C₃sH₆6N₄O₈S; 703,00 g/mol

TLC: Rf(5% MeOH/CH₂-Cl₂) = 0,5

NMR^XH (CD₃OD) ; δ ppm: 0,89 (t, J=7 Hz, 3H, CH₃) ; 1,25-1,35 (m,

18H, CH₃-(CH₂)9-CH₂NH) ; 1,42 (s, 9H, C(CH₃)₃), 1,45 (s, 9H,

C(CH₃)₃), 1,49 (s, 9H, C(CH₃)₃), 1,5-1,9 (m, 6H, CH₂-CH₂-CH₂NHBoc, CH₂-CH₂NHCOCH) , 3,00 (t, J= 6 Hz, 2H, CH₂NHBoc) , 3,04-3,50 (m,

4H, CH₂-S, CH2-NHCOCH) , 3,94 (dd, J_x= 8 Hz, J₂= 5 Hz, IH, CH₂~

CH2-CH2CH-CONH) , 4,48 (dd, J_x= 8 Hz, J₂= 5 Hz, IH, CH-CONHCH₂) .

Krok 4:

Výroba ornitylcystein-n-alkylamidu.

0,11 mmol N,N'-bis-tert-butoxykarbonylornityl-S-tertbutoxykarbonylcystein-n-alkylamid v 1 ml trifluorooctové kyseliny se míchal v atmosféře argonu při teplotě okolí po dobu 1,5 hodiny. Odpařilo se reakční médium a získaný čirý olej se ředil v 1 ml deuteroetanolu. Roztok se uchovával v atmosféře argonu při teplotě -80 °C. Výtěžek reakce se stanovil měřením •Φ φφ • φ · · • · Φ· • · · 9 · φ • Φ Φ 9 ·· Φ9

ΦΦ * Φ ·

Φ Φ Φ » Φ · • Φ ·

ΦΦ

Φ

Φ

Φ

Φ· ΦΦ množství thiolových funkcí s Ellmanovým činidlem (Riddles, P. W. , Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979). V případě ornitylcysteindodecylamidu je výtěžek 84 %.

C20H42N4O2S; 402,64 g/mol

TLC: Rf(5% MeOH/CH₂-Cl₂) = 0,5

NMR¹H(CD₃OD) ; δ ppm: 0,89 (t, J=7 Hz, 3H, CH₃) ; 1,25-1,38 (m,

18H, CH₃-(CH₂) 9-CH2NH) ; 1,45-1,96 (m, 6H, CH₂-CH₂-CH₂NHBoc, CH₂CH₂NHCOCH) , 2,80-3,50 (m, 6H, CH₂-NH₃ ⁺, CH₂S, CH₂-NHCO) , 3,95-4,0 (m, IH, CH₂-CH₂-CH₂CH-CONH) , 4,42-4,48 (m, IH, CH-CONHCH₂) .

Příklad 5:

Syntéza lipofilního alkohol-galaktosylcysteinesterového detergentu.

Syntéza se provedla podle schématu na obrázku č. 15.

Krok 1:

S-tert-butoxykarbonylcysteinbromoacetamiddecylester y

o

K roztoku, který obsahuje 108 mg S-tertbutoxykarbonylcysteindecylesteru (0,30 mmol) v 1 ml dichlormetanu se přidalo 63 μΐ trietylaminu (0,45 mmol) a pak 86 mg anhydridu kyseliny bromooctové (0,33 mmol). Reakční médium se pak míchalo po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti a pak se odpařilo do sucha. Získaný zbytek se čistil chromatografií na oxidu křemičitém (gradient etylacetátu v hexanu je 5 až 10 %), přičemž se získalo 88 mg čirého oleje (0,18 mmol, výtěžek je 61 %) ·

C₂₀H₃₆BrNO₅S; 482,48 g/mol

TLC: Rf(20% AcOEt/hexan)= 0,5

NMR1H (CDC13) ; δ	ppm:	0,90 (t, J=7 Hz,	. 3H,	CH	3); 1,25-1	,40	(m,
14H, CH3-(CH2)7-	CH2-CH2O) ; 1,50 (s, 9H,	(CH3)	3) t	1,60-1,75	(m,	2H,
CH2-CH2O) , 3,26	(dd,	Ji= 15 Hz, J2= 6	Hz,	1H,	CH-S), 3,	42	(dd,
Ji= 15 Hz, J2=	4 Hz	, 1H, CH-S), 3,90	(s,	2H,	CH2Br) , 4	,17	(t,
J=7 Hz, CH2O) ,	4,79	(ddd, Ji= 7 Hz, J2=	= 6 Hz,	J3= 4 Hz,	1H,	CH-

COO), 7,20-7,35 (m, 1H, NH).

MS(FABt), m/z: 482,1 a 484, 1 [MH⁺]; 426, 2 a 428,1 [MH⁺-t-butyl], 382,1 a 384,1 [MH⁺-Boc].

Krok 2:

Výroba S-tertbutoxykarbonylcysteinthiogalaktosylacetamiddecylesteru.

o

K roztoku, který obsahuje 48 mg S-tertbutoxykarbonylcysteinbromoacetamiddecylesteru (0,1 mmol) v 1 ml dimeťylformamidu se přidalo 23 mg 1-thio-D-galaktopyranózy (0,1 mmol). Roztok se míchal po dobu 3 hodin při teplotě okolí a pak se odpařil do sucha. Získaný zbytek se čistil na chromatografií s oxidem křemičitým (gradient metanolu v dichlormetanu je 3 až 20 %), přičemž se získá 52 mg sklovité pevné látky (0,087 mmol, výtěžek je 87 %).

• · · · · · • · · · · β· ··

C₂6H47NO₁₀S₂; 597,79 g/mol

TLC: Rf(10% MeOH/CH₂Cl₂) = 0,4

NMR¹H (CD3OD) ; δ ppm: 0,90 (t, J=7 Hz, 3H, CH₃) ; 1,25-1,43 (m,

MS(FAB+), m/z: 620,2 [MNa⁺]; 598,2 [MH⁺]; 564,2 [MNa⁺-t-butyl],

542,2 [MH⁺-t-butyl], 520,2 [MNa⁺-Boc].

Krok 3:

Výroba cysteinthiogalaktosylacetmiddecylesteru.

HS

HO mg S-tert-butoxykarbonylcysteinthiogalaktosylacetamiddecylesteru (0,082 mmol) rozpuštěného v 1. ml kyseliny trifluoroctové se míchalo v atmosféře argonu po dobu 1,5 hodiny při teplotě prostředí. Reakční médium se pak odpařilo do sucha a získaný olej se uchovával v atmosféře argonu při teplotě -80

C.

Kvantitativní výtěžek reakce se stanovil měřením množství thiolových funkcí s Ellmanovým činidlem (Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979).

C₂iH₃₉NO₈S₂; 497,67 g/mol

NMR¹H (CD₃CD₂OD) ; δ ppm: 0,90 (t, J=7 Hz, 3H, CH₃) ; 1,20-1, 43 (m, 14H, CH₃- (CH₂) 7-CH₂-CH₂O) ; 1,60-1,76 (m, 2H, CH₂-CH₂O) , 2,85-3,08 (m, 2H, CH₂-S), 3,35-4,00 (m, 8H, H₂, H₃, H₄, H₅, H_s, CO-CH₂-S) ,

4,07-4,28 (m, 2H, CH₂-O) , 4,43 (d, J=9 Hz, IH) , 4,58-4,70 (m,

IH, CH-COO).

MS(FAB+), m/z: 520 [MNa⁺]; 498 [MH⁺].

Příklad 6:

Za účelem vytvořit monodisperzní transfekční částice DNA, které jsou stabilizované nelipidovými molekulami, se syntetizoval alternativní typ vektoru založený na látce spermin-Nl, N12-bis-cysteinamid (SC₂) .

Tato molekula se skládá z molekuly sperminu spojeného amidovou vazbou s 2 molekulami cysteinu, které mají dvě volné thiolové funkce.

« «

a) Syntéza látek špermin-Nl, N12-bis-cysteinamid.

NI£

1) 2 éq. Aciylonitrile MeCN

2) 2,2 éq. BocON Boc

NQx- cn

Boc 2 .SH

CUJN^CChH li,Ni Raney MeOH, soude 2M (6/2)

Boc

Boc

2,2 éq. BocOBoc 6.5 éq. NEí IÍO/THF (1/1)

SBoc

BocHN· CGH éq. DCC CHCI

O

Boc·

BocHN

HS h₃n

Boc π NHBoc 'K/xJhQA^S-Boc O

OgCOOH

CňCOO

N,N' -bis-tert-butoxykarbonyl-N, N' - (2-cyanoetyl) -1,4diaminobutan 2.

Roztok obsahující 2 ml 1,4-diaminobutan 1 (20 mmol), 2,63 ml akrylnitrilu (40 mmol) v 10 ml acetonitrilu se míchalo při teplotě okolí v atmosféře argonu a směs se nechala stát ve tmě.

Po 18 hodinách míchání se 10,835 g BocOn (44 mmol) a 6,2 ml trietylaminu (44 mmol) zavedlo do roztoku. Po třech dnech se reakční médium naředilo ve 100 ml eteru. Organická fáze se pak dvakrát promyla 2 M NaOH o objemu 50 ml) , 50 ml destilované vody a 50 ml 5 % (hmotn.) kyseliny citrónové. Organická fáze se pak sušila na síranu horečnatém a pak se odpařila s výtěžkem 4,27 g bílé pevné látky. Později se látka krystalizovala v eteru a získalo se 3,50 g látky 2 (8,9 mmol, výtěžek je 44 %) ve formě bílých krystalů).

C20H34N4O8,· 394,52 g/mol

TCL: Rf(CH2CI2 96//MeOH 4 %) =0,4.

NMR¹H(CDC1₃) ; δ ppm: 0,29-1, 65 (m, 22H, (CH₂) ₂-CH₂-CH₂, C(CH₃)₃; 2,50-2,68 (m, 4H, ČH₂-N (Boc) - (CH₂) ₂-CN) 3,19-3,32 (m, 4H, N (Boc)-CH₂-CH₂CN) , 3,44 (d, J=6,7 Hz, 4H, CH₂-CN) . , (atomy vodíku určený pro signál jsou psány tučným písmem).

Ν, N' -bis-tert-butoxykarbonyl-N, N'-(2-aminopropyl)-1,4diaminobutan 3.

Roztok obsahující 1,176 g Ν,N'-di-tert-butoxykarbonyl-N,N'(2-cyanoetyl)-1,4-diaminobutan 2 (3 mmol) v 6 ml metanolu a 2 ml 2 M NaOH (4 mmol)se míchalo v přítomnosti katalytického množství Raneyova niklu v atmosféře vodíku. Po čtyřech hodinách míchání se nikl odstranil celitní filtrací. Filtrát se pak odpařil a získaný zbytek se znovu suspendoval v 50 ml dichlormetanu. Organická fáze se pak promyla 50 ml 2M NaOH, sušila se na síranu hořečnatým a pak se odpařila, přičemž se získalo 810 mg látky 3 (2 mmol, výtěžek je 67 %) ve formě žluté viskózní kapaliny.

C₂₀H₄2N₄O4; 402,58 g/mol

TCL: Rf (CH₂C1₂ '20%/MeOH 60 %/NEt₃ 20%) = 0,4.

NMR^XH (CDC1₃) ; δ ppm: 1, 35-1,55 (m, 8H, (CH₂) ₂-CH₂-CH₂, NH₂) , 1,45 (s, 18H, 2xC(CH₃)₃); 1,64 (J= 6,8 Hz, 4H, CH₂-CH₂-NH₂) , 2,69 (t,

J= 6,7 Hz, 4H, CH₂-NH₂) ; 3,10-3,32 (m, 8H, CH₂-N (Boc) -CH₂) .

Spermin-N4, N9-bis-tert-butoxykarbonyl-Nl, N12-bis-cystein (N, Sbis-tert-butoxykarbonyl)amid 6.

K roztoku, který obsahuje 242 mg Ν,N'-bis-tertbutoxykarbonyl-N, N' - (2-aminopropyl) -1,4-diaminobutan 2 (0,6 mmol) a 388 mg N, S-bis-tert-butoxykarbonyl-cystein (1,2 mmol) v 1,5 ml dichlormetanu se přidalo 248 mg DCC (1,2 mmol) rozpuštěného v 1,5 ml dichlormetanu. Roztok se míchal jeden den a filtroval se za účelem odstranit vytvořený DCU a pak se odpařil. Zbytek se resuspendoval ve 100 ml etylacetátu, promyl se destilovanou vodou (100 ml), vodným roztokem uhličitanu sodného 0,5 M (100 ml), vodným saturovaným roztokem NaCl (100 ml), vodným roztokem kyseliny citrónové 0,2 M (100 ml) a nakonec vodným saturovaným roztokem NaCl (100 ml). Organická fáze se sušila síranem hořečnatým a pak se odpařila. Produkt se pak čistil na chromatografické koloně s oxidem křemičitým za účelem získat 401 mg látky 6 (0,4 mmol, výtěžek je 66 %) ve formě bílé pevné látky.

C₄6H84N₆Oi₄S₂; 1009,35 g/mol

TCL: Rf(CH₂C1₂ 97%/MeOH 3 %) = 0,5.

NMR^XH (CDC1₃) ; δ ppm: 1,50-1,89 (m, 8H, 2x (CH₂) ₂-CH₂-CH₂, 2xCH₂CH₂-NHCO), 1,44 (s, 18H, 2xC(CH₃)₃); 1,45 (s, 18H, 2xC(CH₃)₃),

1,50 (s, 18H, 2xC(CH₃)₃); 3,04-3,32 (m, 16H, (CH₂) ₃-CH₂-NBoc,

CH₂-(CH₂) ₂~NH-CO, CH₂-NH-CO, CH2-S-CO) , 4,23-4,40 (m, 2H, CH-CH₂S-Boc), 5,37-5,54 (m, 2H, NH-Boc), 7,32-7,46 (m, 2H, CH₂-NH-CO).

φ · φ · φ φ • φ • · · · • φ · · ♦ φ φ φ φ • · · φ φ · · «

MS(FAB+): 1009, 3 (ΜΗ⁺) , 909,2 (ΜΗ⁺-Βοο), 809,3 (MH⁺-2Boc) , 709,2 (MH⁺-3Boc) , 609,2(ΜΗ⁺-4Βοο) , 509,2 (MH'-5Boc), 409,1 (ΜΗ⁺-6Βοο) .

spermin-Nl,N12-bis-cysteinamid 7 .

mg látky 6 (0,05 mmol) rozpuštěné v 1 ml kyseliny trifluoroctové a 1 ml dichlormetanu se míchalo v atmosféře argonu po dobu 2 hodin. Reakční médium se pak odpařilo a získalo se 85 mg žluté viskózní kapaliny. Produkt se uchovával v přítomnosti přibližně 11 ekvivalentů kyseliny trifluoroctové za účelem zabránit oxidaci funkčních thiolových skupin. Měření thiolových skupin Ellmanovýcm činidlem (Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979)) ukazuje, že se kvantifikovala deprotekční reakce.

C₁₆H₃₆N₆O₂S₂; 408,64 g/mol

NMR^tDsO); δ ppm: 1,64-1,96 (m, 8H, (CH₂) ₂-CH₂-CH₂, CH₂-CH₂NHCO), 2,90-3,09 (m, 12H, (CH₂) ₃-CH₂-NBoc, CH₂-(CH₂) ₂-NH-CO, CH₂NH-CO), 3,21-3,37 (m, 4H, CH₂-SH), 4,04-4,15 (m, 2H, CH-CH₂-SH).

MS(FABf): 410,1 (MH⁺) .

b) biofyzikální charakteristika spermin-Nl, Nl2-bis-cysteinamidu i) UV spektroskopie

Charakterizace tvořených částic UV spektroskopií se provedla z různých důvodů. DNA v roztoku má charakteristické absorpční spektrum mezi 240 a 310 nm. Absorpční (optická hustota) má maximum při 260 nm a vykazuje nulovou hodnotu při 310 nm. Změna konformace DNA by měla změnit profil absorpčního spektra. Tvorba částic však vede k zesílení difúze, což lze pozorovat v UV zesílením optické hustoty. Když se vlnová délka nastaví na hodnotu těsně pod 310 nm (což je vlnová délka, při • 9 9 • · · ·· · které DNA v roztoku neabsorbuje) je možné monitorovat účinek tvorby částic.

Vytvořily se komplexy DNA telecího brzlíku a sperminu za podmínek, které jsou optimální pro získání prstencových struktur, jak se popisuje v publikaci Naroditsky et al., (76 μΜ bází DNA, 65 mM sperminu, 25 mM NaCl) . Absorpce pozorovaná mezi 230 a 330 nm zesílila během 10 minut, přičemž dochází k tvorbě komplexů DNA. Následně se redukce optické hustoty může detekovat v rozmezí 2 60 nm (což je maximum absorpce pro DNA) , zatímco zůstává stabilní při vlnové délce 300 nm. Nakonec se absorpce stabilizuje po jedné a půl hodině (obrázek č. 16A).

Když se koncentrace NaCl zvýšila na 100 mM, pozorované spektrum bylo shodné se spektrem DNA, které se pozorovalo před tvorbou komplexů se sperminem (obrázek č. 16B) .

Ze shora uvedených experimentů je možné vyvodit, že kondenzace se sperminem je viditelná v UV. Je však možné ukázat, že k reverznímu procesu dojde, když zesílí iontová síla roztoku.

Stejná zkušenost jako ve shora uvedeném experimentu se spermin-Nl,N12-biskoncentraci nahradil srovnatelná

Stanovením s SC₂ je sperminem.

získala, když se spermin cysteinamid (SC₂), který je přítomen ve stejné (obrázek č. 16C) .

Kinetika tvorby komplexů DNA s kinetikou, které se dosáhlo se thiolových funkcí Ellmanovým činidlem (Riddles, P. W., Blakeley, R. L. and Zerner, B. Ellman's reagent: 5,5'dithiobis(2-nitrobenzoic acid), a reexamination. Anal. Biochem. 94, 75-81 (1979)) se ukázalo, že se po 10 minutách 50 % thiolových skupin oxiduje, aniž je přítomen jiný kyslík, než ten rozpuštěný ve vodě (rozpustnost kyslíku v 1M vodném roztoku NaCl je 0,8 mM) . Augmentace koncentrace NaCl jednu a půl hodiny po smíchání SC₂ a DNA má pouze minoritní účinek na absorpční spektrum ve srovnání se sperminem. Při koncentrací NaCl 100 mM je absorpce při vlnové délce 330 nm 81 % absorpce dosažené při • ·

maximální optické hustotě pozorované při koncentraci NaCl 25 mM. Při koncentraci 150 mM NaCl je stále 71 %.

SC₂ tvoří komplexy s DNA stejným způsobem jako spermin. Na druhou stranu vytvořené částice se zdají být více stabilní v závislosti na iontové síle média, která je ve vztahu s oxidací thiolových funkcí.

ii) Elektroforéza na agarózovém gelu

Stabilita částic tvořených buď se sperminem nebo s SC₂ (76 μΜ baží RSV-Luc, 65 μΜ sperminu nebo SC₂, 25 mM NaCl, pH 6,5, 2 hodiny oxidace) se testovala elektroforézou na agarózovém gelu (1 % , Tris pufr pH 6,5). Je možné pozorovat, že zhutněná DNA, která vykazuje větší rozměry a menší náboj, migruje na agarózovém gelu pomaleji nebo vůbec ne (obrázek č. 17).

Částice vytvořené se sperminem nejsou stabilní za podmínek, které se používají při elektroporéze (shodná vibrace samotné DNA a DNA v komplexu se sperminem, dráhy 1 a 2) . Částice vytvořené s SC₂ jsou stabilní (dráha 3). Částice DNA-SC₂ jsou relativně stabilní dokonce i při zvýšené intové síle roztoku (dráha 5). Stabilita komplexů je způsobena oxidací SC₂. Jestliže se přidá činidlo redukující disulfidové můstky k roztoku komplexů DNA a SC₂, za podmínek, při kterých probíhá elektroforéza, komplexy nejsou dále stabilní.

Příklad 7: Měření velikosti částic, které vznikají interakcí komplexu (C_XoC^G+) ₂/DNA s různým množství PEI 25 KDa.

Roztok se připravil přidáním detergentů Ci₀C^G+ (30 μΜ) k roztoku DNA pCMVL (30 μΜ fosfát) v pufru Tris/HCl 15 mM pH 8,4 a roztok se nechal stát za aerobních podmínek po dobu 24 hodin. Pak se přidalo požadované množství PEI 25 KDa (Aldrich) a měření velikosti se provedlo o pět minut později zařízením Dynamic Light Scattering, jak se popisuje v publikaci Blessing et al., (1998) Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 95(4), 1427-1431 (obrázek č. 18) .

• · · · ♦ · ·· 9 « * ♦ · * · ·· · • · ·· ·«

Příklad 8: Měření velikosti komplexů (Ci₀C^G+) ₂/PEI 25 KDaGal4/DNA

Roztok komplexů se připravil přidáním detergentu CioC^G+ (30 μΜ) k roztoku DNA pCMVL (30 μΜ fosfát) v pufru Tris/HCl 15 mM pH 8,4 a roztok se nechal stát za aerobních podmínek po dobu 24 hodin. Pak se přidalo 10 ekvivalentů PEI 25KDa-Gal4. (PEI-Gal4 se získal reduktivní aminací mezi PEI25K a tetragalaktózou (Gala3GalB4Gala3Gal), jak se popisuje v publikaci Zanta, M.A. (1997) Bioconjugate Chem., 8, 839-844). Měření se provádělo 1 min po polymérové adici (cykly). 0 17 hodin později se přidal koncentrovaný roztok NaCl, aby jeho konečná koncentrace byla 150 mM (trojúhelníky) . Jako kontrola se vytvořily komplexy DNA pCMVL s 10 ekvivalenty PEI 25 KDa-Gal4 (čtverce), jak se popisuje v publikaci Boussif, 0., Lezoualch, F., Zanta, M.A., Mergny, M.D., Scherman, D., Demeneix, B. and Behr, J.P. A versatile vector for gene and .oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: Polyethylenimine. Proč. Nati.

Acad. Sci. USA 92, 7297-7301 (1995) (obrázek č. 19). Zjistilo se, že komplexy (CioC^G4) ₂/PEI 25 KDa-Gal4/DNA jsou daleko menší než komplexy PEI 25 KDa-Gal4/DNA.

Příklad 9: Transfekce buněk SKOV3 s komplexy (CioC^G+) ₂/DNA/PEI 25 KDa

Roztok se připravoval smícháním pCMVL (30 μΜ fosfát) s 30 μΜ Ci₀C^G+ v pufru Tris/HCl 15 mM pH8,4 a roztok se nechal stát při aerobních podmínkách po dobu 24 hodin. Pak se přidalo požadované množství PEI 25 KDa. 18 hodin před transfekci se na destičky se 24 prohlubněmi nanesly buňky SKOV3 (z karcinomu vaječníků, European Collection of Animal Cell Cultures (E.C.A.C.C.) v hustotě 50 000 buněk na jednu prohlubeň. Přidal se alikvot směsi komplexu (odpovídající 2 μς plazmidu na jednu prohlubeň) a buňky se udržovaly v kultivačním médiu RPMI 1640 bez séra. Po dvou hodinách se přidalo 10 % sérum. O 24 hodin později se monitorovala exprese genu luciferázy. Sloupec DNA tt · • tt odpovídá samotnému pCMVL (2 μς plazmidu v jedné prohlubni) (obrázek č. 20).

tttttt tttttt • · ♦ tttt • tttttttt • tt tttt

Příklad 10: Transfekce buněk BNL CL. 2 komplexy Ci₀C^g+/DNA/PEI 25 KDa a C₁₀C^g+/DNA/PEI 25 KDa-Gal4

Roztok se připravil smícháním pCMVL (30 μΜ fosfát) s 30 μΜ CioC^G+ v pufru Tris/HCl 15 mM pH8,4 a roztokse nechal stát při aerobních podmínkách po dobu 24 hodin. Pak se přidalo požadované množství PEI 25 KDa nebo ΡΕΙ 25KDa-Gal4 (5% vztaženo vůči celkovému aminu). 18 hodin před transfekci se buňky nanesly na destičky s 24 prohlubněmi při hustotě 50 000 buněk na jednu prohluběň. Přidal se alikvot směsi komplexu (odpovídající 2 pg plazmidu na jednu prohluběň) a buňky se udržovaly v kultivačním médiu DMEM bez séra. Po dvou hodinách se přidalo 10 % sérum. O 24 hodin později se monitorovala exprese genu luciferázy (obrázek č. 21).

Příklad 11: Potažení komplexů (CioC^G+) ₂/DNA polykationem spojeným s proteinem.

Měření velikosti částic, které vznikly z interakce komplexů (CioC^G+) 2/DNA s konjugátem transferin-polylyzin (TfpL36, popisuje se v příkladu 13). Roztok komplexu se připravil přidáním detergentu C1QC^G+ (30 μΜ) k roztoku DNA pCMVL (30 μΜ fosfát) v 15 mM pufru Tris/HCl pH8,4 a roztok se nechal stát v aerobních podmínkách po dobu 24 hodin. Pak se přidalo požadované množství PLL36-Tf (2% vztaženo vůči celkovému aminu). Měření se provedlo 1 minutu (otevřené kruhy) a 30 minut (plné kruhy) po polymérové adici. Pak se přidal koncentrovaný roztok NaCl a konečná koncentrace byla 15 mM (prázdné trojúhelníky) . O 30 minut později se stanovila velikost částic (plné trojúhelníky) (obrázek č. 22). Výsledky ukazují, že komplexy (CioC^G+) ₂/DNA se mohou potáhnout polykatíontem spojeným s proteinem a zachovávají se malé rozměry.

• ΦΦΦ Φ Φ · «

ΦΦΦ 99 9 Φ· 9 9 ·«

Příklad 12: Měření zeta potenciálu částic (CioC^G+) ₂/DNA potažených transferin-polylyzinem.

Roztok komplexu se připravil přidáním detergentu C_XoC^G+ (30 μΜ) k roztoku DNA pCMVL (30 μΜ fosfát) v 15 mM pufru Tris/HCl pH8,4 a roztok se nechal stát v aerobních podmínkách po dobu 24 hodin. Pak se přidalo požadované množství TfpL (2% vztaženo vůči celkovému aminu). Dříve než se provedlo měření, přidal se koncentrovaný roztok NaCl a konečná koncentrace byla 150 mM (obrázek č. 23). Výsledky ukazují, že částice (CXoC^G+) 2/DNA potažené transferin-polylyzinem si ponechávají negativní náboj.

Příklad 13: Transfekce buněk K562: účinek transferin-polylyzinu na zavedení komplexů (Ci₀C^G+) 2/DNA Komplexy (CioC^G+) 2/DNA pro transfekci se připravily nejdříve smícháním 10 μρ pCMVL v 1 ml HEPES (15 mM, pH=8,5) na konečnou koncentraci 30 μΜ s detergentem CioC^G+, aby konečná koncentrace byla 30 μΜ (1 ekvivalent) . Roztoky se slabě míchaly a nechaly se oxidovat po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Dále se komplexy smíchaly konjugátem hTf-pL36 transferinu (konjugát lidského a poly-L-lyzinu, průměrný molekulární stupeň je 36 lyzinových monomérů, molární poměr transferin : polylyzinu je 1/1,5) v 50 μΐ HEPES (15 mM, pH=8,5) v molárním poměru atomy dusíku polylyzinu ku fosfátu DNA (N/P) 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 a vše se inkubovalo 30 minut při teplotě polymerizace místnosti.

Suspenze buněk K562 (ATCC CCL 243) se nechala růst v kultivačním médiu RPMI 1640 doplněném 10 % fetálním telecím sérem (FCS) , 1 % L-glutaminem a antibiotiky a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C. Pro účely transfekce se buňky nanesly na plotny s 24 prohlubněmi s hustotou 500 000 buněk do jedné prohlubně. Kultivační médium se nahradilo směsí 1,05 ml transfekčního komplexu a 1 ml kultivačního média RPMI 1640 (10 % FCS, 1% L-glutamin, antibiotika) plus chlorochin tak, aby

44 <4 4 4 • 4 4

4 4

4 « 4 • 4 44 * 4

4 ♦ 4 44

4 4

4 4 • · 4

4 4

4 4 konečná koncentrace byla 100 μΜ. Po 4 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se transfekční médium nahradilo 2 ml čerstvého kultivačního média. Buňky se sklidily 24 hodin po transfekci, promyly se PBS a opětně se resuspendovaly ve 100 μΐ Tris (0,25 M, pH=7,9). Buňky se lyžovaly v cyklech zmrazit -roztát. Buněčný lyzát se centrifugoval po dobu 10 minut při 10 000 g, aby vznikl pelet debrisu. Světelné jednotky luciferázy se zjišťovaly ze supenatantu o objemu 10 μΐ.

Jednotky světí aznázorněné na obrázku č. 24 reprezentují celkovou aktivitu luciferázy ve vzorku transfekovaných buněk.

Příklad 24: Transfekce buněk B16F10: účinek transferinpolylyzinu na zavedení komplexů (C₁₀C^G+) 2/DNA

Komplexy CioC^g+/DNA vhodné pro transfekci se připravily nejdříve smícháním 5 μς pCMVL-Luc v 0,5 ml HEPES (15 mM, pH=8,5) na konečnou koncentraci 30 μΜ s detergentem C_XoC^G+, aby konečná koncentrace byla 30 μΜ (1 ekvivalent) . Roztoky se slabě míchaly a nechaly se oxidovat po dobu 24 hodin při teplotě místností. Dále se komplexy smíchaly konjugátem hTf-pL36 v 50 μΐ HEPES (15 mM, pH=8,5) v molárním poměru atomy dusíku polylyzinu ku fosfátu DNA (N/P) 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 a vše se inkubovalo 30 minut při teplotě místnosti.

Adherentní buňky B16E10 (NIH DCT depozit nádorů) se nechaly růst v DMEM doplněném 10 % fetálním telecím sérem (FCS), 1% Lglutaminem a antibiotiky a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C. Buňky se přenesly do lahve pro kultivaci tkání o objemu 25 cm². 18 hodin před transfekci se do lahve vneslo 400 000 buněk. Kultivační médium se nahradilo . směsí 0,55 ml transfekčního komplexu a 1 ml DMEM (10 % FCS, 1% L-glutamin, antibiotika) plus chlorochinem tak, aby konečná koncentrace byla 100 μΜ.

Po 4 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se transfekční médium nahradilo 2 ml čerstvého kultivačního média.

hodin po transfekci se testovala luciferázová aktivita.

Výsledky experimentu jsou uvedeny na obrázku č. 25.

Příklad 15: Transfekce buněk B16F10: účinek transferinpolylyzinu na zavedení komplexů (Ci₀C^G+) ₂/DNA

Komplexy CioC^g+/DNA vhodné pro transfekci se připravily nejdříve smícháním 5 μς pCMVL-Luc v 0,5 ml HEPES (15 mM, pH=8,5) s 30 μΜ detergentem C₁₀C^G+, aby konečná koncentrace byla 30 μΜ (1 ekvivalent). Roztoky se slabě míchaly a nechaly se oxidovat po dobu 24 hodin při teplotě místností. Dále se komplexy smíchaly

1) biotinylovanými adenovirovými částicemi dll014 (8,6x 10⁹) deaktivovanými 8-MOP (methoxypsoralen) ošetřenými streptavidinylovaným polylyzinem(250) v 50 μΐ HEPES (15 mM, pH= 8,5) a vše se inkubovalo 30 minut při teplotě místnosti.

2) biotinylovanými adenovirovými částicemi dll014 (8,6 x 10⁹) deaktivovanými 8-MOP smíchanými s polyetylanímínem (PEI, molekulová hmotnost 25 KDa) v 50 μΐ pufru HEPES (15 mM, pH= 8,5) při molárním poměru atomů dusíku PEI k fosfátu DNA (N/P) 0,4 nebo 1,0 a vše se inkubovalo po dobu 30 minut při teplotě místnosti.

Po dalších 30 minutách se komplexy použily pro transfekční experiment.

Adherentní buňky B16F10 se kultivovaly v kultivačním médiu DMEM doplněném 10 % fetálním telecím sérem (FCS) , 1% Lglutaminem a antibiotiky při teplotě 37 °C. Buňky se přenesly do lahve pro kultivaci tkání o objemu 25 cm². 18 hodin před transfekci se do lahve vneslo 500 000 buněk. Kultivační médium se nahradilo směsí 0,55 ml transfekčního komplexu a 1 ml DMEM (10 %,FCS, 1% L-glutamin, antibiotika).

Po 4 hodinách inkubace při teplotě 37 °C se přidal k transfekčnímu médiu 1 ml čerstvého kultivačního média.

hodin po transfekci se buňky sklidily a připravily se extrakty. Výsledná luciferázová aktivita (odpovídající 500 000 buněk je zobrazena na obrázku č. 26) .

9·

8 8

8 99

8 9 8

8 8

88

9 8

9 8

8 8

9

Příklad 16: Vytvoření komplexu a koncentrace vhodná pro aplikaci in vivo

Komplexy se vytvořily s DNA plazmidu pCMVL a detergentu CioC^G+ přidáním koncentrovaného zásobního roztoku Ci₀C^G+ (7,2 mM v etanolustanoveno thiolovým testem Elmanovým činidlem) k roztoku DNA plazmidu pCMVL v pufru HEPES (15 mM, pH= 8,5) .

Dříve než se přidal detergent přidalo se 80 ug DNA pCMV-Luc tak, aby konečná koncentrace byla 30 μΜ (v 8 ml pufru) . Detergent CioC^G+ se zavedl injekcí tak, aby konečná koncentrace byla

1) 30 μΜ (1 ekv.)

2) 21 μΜ (0,7 e kv. )

Roztoky se jemně míchaly a nechaly se oxidovat po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. V dalším kroku se přidalo 0,8 ml 50 % glukózy, aby konečná koncentrace glukózy v roztoku byla 5

o.

o ·

Vzorky se zakoncentrovaly za použití zařízení Vivaspín 4 s membránou 100 000 m. hmotn. Po centrifugaci při až 4 000 ot.za min. se získalo 0,3 ml komplexů, které obsahují

1) 4 4 μρ pCMVL DNA (výtěžek 55 %)

2) 50 μρ pCMVL DNA (výtěžek 63 %) .

Příklad 17: Intradermální genové zavádění komplexů (CioC^G+) ₂/DNA in vivo.

Komplexy se připravily způsobem, který se popisuje v příkladu 16. K roztoku pCMVL DNA (80 pg v 8 ml pufru, 30 μΜ) se přidal detergent Ci₀C^G+ tak, aby konečná koncentrace byla:

1) 21 μΜ (0,7 ekvivalent)

2) 30 μΜ (1,0 ekvivalent)

3) 37,5 μΜ (1,25 ekvivalent)

4) 45 μΜ (1,5 ekvivalent)

Po zvýšení koncentrace na zařízení Vivaspin se získalo 0,3 ml komplexů, které obsahuji

·* • * • *

·· • · • 9 • · « 9

1)	43	pg DNA pCMVL	(výtěžek	53	%)
2)	53	pg	DNA	pCMVL	(výtěžek	65	%)
3)	47	pg	DNA	pCMVL	(výtěžek	58	%)
4)	33		DNA	pCMVL	(výtěžek	41	%)

Komplexy se aplikovaly v adekvátním množství, aby se pro každý případ zavedlo 10 pg DNA pCMVL na jednu myš.

Různým skupinám se injekcí zavedly náseldující objem na jednu myš:

1) 0,7 ekv. komplexu Ci₀C^G+/DNA v 70 μΐ roztoku

2) 1,0 ekv. komplexu CioC^G+/DNA v 57 pl roztoku

3) 1,25 ekv. komplexu CioC^g+/DNA v 64 pl roztoku

4) 1,5 ekv. komplexu CiqC^g+/DNA v 90 pl roztoku.

V případě experimentů in vivo se použily samice A/J myši ve věku 8 až 12 týdnů (Harlan). Způsob intradermální aplikace komplexů, přípava tkáňových vzorků a kvantifikace exprese luciferázy cemoluminiscenčním testem byla stejná v případě všech experimentálních skupin. Den po vyholení zad myší se intradermálně injekcí aplikovaly komplexy CioC^g+/Luc DNA za použití injekčních jehel (0,40 mm x 21 mm). Místa aplikace injekce se označila. 24 hodin později po usmrcení myší se vyřízlo kolo s průměrem 15 mm okolo místa aplikace injekce. Kůže zahrnující tučnou tkáň se dala do 600 pl pufru Tris a zmrazila se. Za účelem kvantifikace exprese luciferázy se zmrazené vzorky kůže rozdrtily. Vzorky se pak centrífugovaly při teplotě 4 1C po dobu 8 minut (15 000 ot./min.) . V supernatantu se měřila exprese luciferázy.

Exprese genu luciferázy (v relevantních světelných jednobkách/na místo aplikace) 24 hodin po injekci je zobrazena na obrázku č. 27 (průměrné hodnoty a standardní odchylky pro každou skupinu). Podobná síla exprese se získala v rozmezí 0,7 ekv. až 1,25 ekv. komplexu Ci₀C^g+/DNA.

·· 99

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9 9 t 9 9 9 • 9 99 ♦ 9

9« 9

ΊΟ • · · • 99

9 9

9 9 9

9 9

Příklad 18: Intradermální genové zavádění komplexů (Ci₀C^G+) ₂/DNA in vivo.

Komplexy (vhodné pro skupinu 1) se připravily způsobem, který se popisuje v příkladu 16. K roztoku DNA pCMVL (100 gg v 10 ml pufru , 30 μΜ) se přidal detergent Ci₀C^G+ tak, aby konečná koncentrace byla 30 μΜ (1 ekv.) a nechal se oxidovat. Nakonec se přidal 1 ml 50 % glukózy, přičemž konečná koncentrace glukózy v rozotoku je 5 %. Po zvýšení koncentrace za použití zařízení Vivaspin se získalo 0,4 ml komplexu, který obsahuje 60 gg DNA pCMVL (výtěžek je 60 %) .

Skupina 2 obsahuje .41 μΐ stejného zásobního rozotoku DNA pCMVL smíchaného s 229 μΐ vody (dvakrát destilovaná voda) a 30 μΐ 50 % glukózy, přičemž konečná koncentrace je 10 gg DNA pCMVL/50 μΐ roztoku.

V případě skupiny 3 se k zásobnímu roztoku DNA pCMVL přidalo 268 μΐ vody (dvakrát destilovaná voda) a 30 μΐ 50 % glukózy, přičemž konečná koncentrace je 0,5 gg DNA /50 μΐ roztoku.

Ve třetí skupině se aplikovalo následujícíc množství DNA nebo komplexů:

1) 1,0 ekv. komplexu Ci₀C^G+/DNA (10 gg)

2) holá DNA pCMVL (10 gg/50 gl)

3) holá DNA pCMVL (0,5 gg/50 gl)

Injekce se aplikovala různým skupinám interdermálně a místa aplikace injekce se získala o 24 hodin později, jak se popisuje v příkladu 17. Luciferázová aktivita (vyjádřená v relativních světelných jednotkách/místo ) proteinových extraktů je zobrazena na obrázku č. 28 (jako průměrné hodnoty a standardní odchylky pro každou skupinu).

tt· • · « · • · • tttt • * tt · · tt tttt • tt • tt • tt tttt • tt • · • tt tttt

Příklad 19: Intradermální genové zavádění komplexů

Ci₀C^G+/pCMVL/MannITC-PEI (25KDa) in vivo.

V případě skupiny 1 se připravily komplexy CxoC^G+/DNA, jak se popisuje v příkladu 17. Pak následuje potažení manosylovaným polyetyleniminem (PEI) . K roztoku DNA pCMVL (100 μμ v 10 ml pufru, 30 μΜ) se přidal detergent Ci₀C^G+ tak,, aby konečná koncentrace byla 30 μΜ (1 ekv.), a rozotok se nechal oxidovat. V dalším kroku se komplex promíchal s 30 μρ konjugátu MannlTCPEI (25KDa), jehož příprava se popisuje dále v textu, v molárním poměru atomy dusíku PEI ku fosfátu DNA (N/P) 2,4 a vše se inkubovalo po dobu 30 min při teplotě místnosti. Nakonec se přidal 1 ml 50 % glukózy, přičemž koncentrace glukózy v rozotoku je 5 %. Po zvýšení koncentrace se získalo 0,25 ml komplexu, který obsahuje 21 μρ DNA pCMVL (výtěžek je 21 %) .

V případě skupiny 2 se připravily analogové komplexy, které neobsahují detergent CioC^G+. Komplexy se připravily smícháním pCMVL a MannITC-PEI (25KDa) v molárním poměru atomy dusíku PEI ku fosfátu DNA (N/P) '2,4. Směs 60 μς DNA pCMVL ve 120 μΐ a 18 μς MannITC-PEI (25 KDa) ve 150 μΐ se inkubovaly po dobu 20 minut při teplotě místnosti. Pak se přidalo 30 μΐ 50 % glukózy, aby konečná koncentrace glukózy v rozotoku byla 5 %.

Následujícím skupinám se aplikovalo (10 pg DNA a 3 pg manózalTC-modifikované PEI v 50 μΙ/myš) :

1) C₁₀C^G+/pCMVL/MannITC-PEI (25KDa) N/P=2,4

2) pCMVL/MannITC-PEI(25KDa) N/P= 2,4

Místa aplikace injekce se získala 24 hodin po intradermální injekci a měřila se exprese lucifrázy. Exprese (v relativních jsvětelných jednotkách/místo) je zobrazena na obrázku č. 29 (průměrné hodnoty a standardní odchylka pro každou skupinu).

Konjugát MannITC-PEI(25KDa), který obsahuje manózu vázanou na PEI prostřednictvím f enylizothiocyanátového můstku, se připravil za použití manopyranosylfenylizothiocyanátu (ManITC, Sigma) jako kopulačního činidla. Interakce se probíhala reakcí «· » 4 4

4 4

9 4

4 4

44

4 9

44

9 9 * · · 9 4 9

4 444 4· 4 4 mg PEI (molekulová hmotnost 25 kDa, Aldrich) v 0,33 ml 250 mM vodného rozotoku chloridu sodného s 25 mg ManITC v 0,2 ml dimetylsulf oxidu po dobu alespoň jednoho dne. Pak se obsah reakce naředil přidáním 4 ml vody a upravila se koncentrace chloridu sodného na 0,5M, pak proběhla chromatografie s výměnou kationtů (Biorad Macroprep High S, jako gradient sole se používá chlorid sodný od 0,5 M do 3 M) a dialýza proti 150 mM chloridu sodnému. ManITC-PEI (25 KDa) obsahuje PEI/ManlTC v hmotnostním poměru 1,4: 1. To reprezentuje modifikaci v průměru každého desátého dusíku PEI (25 kDa) s manózou.

Příklad 20: Transfekce buněk BNL CL.2 komplexy (C₁₂CO) ₂/DNA

Roztok se připravil smícháním pCMVL (30 μΜ . fosfát) s různými množství ornitylcyst.eindodecylamidového detergentu Ci₂CO (Příklad 4, krok 4, 4 ekvivalenty odpovídají 60 μΜ C_i2CO) v pufru Tris/HCl 15 mM pH8,4 a nechal se stát v aerobních podmínkách po dobu 24 hodin. 18 hodin před transfekci se buňky nanesly na destičky s 24 prohlubněmi při hustotě buněk 50 000 buněk na prohluběň. Alikvot směsi komplexů (odpovídající 2 μς plazmidu v prohlubni ) se přidal k buňkám, které se udržovaly v kultivačním médiu DMEM, které neobsahuje sérum. Po 2,5 hodinách se přidalo 10 % sérum. Exprese genu lucifarázy se monitorovala o 24 hodin později. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 30.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY $U)00Částice vhodná pro transfekci vyšších eukaryontních buněk molekulami nukleové kyseliny in vitro a in vivo vyznačující se tím, že obsahuje jednu nebo více molekul nukleové kyseliny kondenzované organickými kationovými molekulami, přičemž uvedené částice se získaly vytvořením komplexů molekul nukleové kyseliny se shodnými nebo odlišnými organickými kationovými prekurzorovými molekulami, aniž dochází k síťování molekul nukleové kyseliny a ke vzájemnému kovalentnímu spojení prekurzorových molekul na templátu nukleové kyseliny.

   částice

   Transfekční vyznačující se jsou lipidy získané podle nároku 1, tím, že kationové molekuly dimerizací nebo oligomerizací prekurzorových molekul kationogenního detergentu.
2. 3. Transfekční částice podle nároku 2, vyznačující se tím, že prekurzorové molekuly katiogenního detergentu obsahují:

   a) alespoň jednu funkci pro navázání jedné nebo více molekul detergentu,

   b) alespoň jeden lipofilní zbytek,

   c) netoxický recipientní základní řetězec,

   d) kationovou skupinu pro navázání molekul nukleové kyseliny.
3. 4. Transfekční částice podle nároku 3, vyznačující se tím, že funkce kationových prekurzorových detergentových molekul vhodných pro navázání jiných molekul detergentu je dímerizovatelnou nebo polymerizovatelnou funkcí vybranou z thiolů, kyselých hydrazidů, aldehydů, aminů a etylenových zbytků, které jsou vhodně substituovány, aby vznikly enaminy.

   4t

   4 4 <

   « · 4 λ t< t • · 44 • · · 4 • · · · 44 *4

   5. Transfekční částice podle nároku 4, vyznačuj í c i se tím, že lipofilní zbytek se vybral z lipofilních amidů, esterů nebo < eterů. 6. Transfekční částice podle nároku 3, vyznačuj i c i se tím, že funkce pro navázání molekul nukleové kyseliny se vybrala z aminu nebo jeho derivátu. 7 . Transfekční částice podle nároku 6, vyznačuj i c i se tím, že funkce pro navázání molekul nukleové kyseliny je guanidin. 8 . Transfekční částice podle nároku 1,

   vyznačující se tím, že organická kationová prekurzorové molekula je reprezentována obecným vzorcem 1, (0 kde symbol R_x představuje (Ci-Cio-alkylen)-SH, kde alkylenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo s větveným řetězcem, symbol R₂ představuje -NR₄R₅, -NHR₄R₅ ⁺, -N(R₄)₂R5⁺z

   C (=NR₄) NRsRg, -C (=X)-Ci-Cio-alkylen, kde alkylenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo větveným řetězcem a může být substituován až čtyřmi diaikylaminoskupinami nebo thiomonosacharidem.

   symbol R₃ představuje Cs-C₃o-alkyl s přímým nebo větveným řetězcem substituovaný přednostně s jedním nebo více halogenovými atomy nebo diaikylaminoskupinami nebo představuje Cs-C₃o-alkenyl s přímým nebo větveným řetězcem, který obsahuje až deset dvojných vazeb C=C a je přednostně •Φ

   9 9 9

   9 9 9

   9 9 9

   9 9 9 ··

   9 9 9

   9 99 • 9 9
4. 9 9 9 substituovaný jedním nebo více halogenovými atomy nebo dialkylaminoskupinami nebo představuje Cs-Cao-alkinyl s přímým nebo větveným řetězcem, který obsahuje až deset trojných vazeb C=C a může být přednostně substituovaný jedním nebo více halogenovými atomy nebo dialkylaminoskupinami nebo představuje C₆-C₁₀-aryl s možnou substitucí nebo představuje C7-Ci6~aralkyl s možnou substitucí nebo představuje Cs-Cao-alkylový řetězec přerušený až 10 aminoskupinami -NR₄- a vykazující možnou aminoskupinu, která může být susbtituována aminokyselinou, symboly R₄, R₅ a R₅ představují nezávisle na sobě vodík nebo

   Ci-C₄-alkyl, symbol X představuje O nebo S, symbol Y představuje C=O nebo C=S a symbol Z představuje O, S nebo -NR₄-.

   9. Transfekčni částice podle nároku 8, vyznačující se tím, že kationové prekurzorové molekuly odpovídají obecnému vzorci 1, kde symbol R_x představuje (Ci-Cg-alkylen)-SH, kde alkylenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo s větveným řetězcem, symbol R₂ představuje -NR₄R₅, -NHR₄R₅ ⁺, -N(R₄)₂R5⁺,

   C (=NR₄) NR₅R₆, —C (=X)-Ci~C₄—alkylen, kde alkylenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo větveným řetězcem a může být substituován až čtyřmi aminoradikály -NR4R5 nebo thiomonosacharidem, symbol R₃ představuje C₅-C₂o-alkyl s přímým nebo větveným řetězcem substituovaný přednostně F, Cl, Br nebo -NR₄R5 nebo představuje C₅-C₂o~alkenyl s přímým nebo větveným řetězcem, který obsahuje až pět dvojných vazeb C=C a je přednostně substituovaný F, Cl, Br nebo -NR4R5 nebo představuje C₅-C₂o-alkinyl s přímým nebo větveným řetězcem, který obsahuje až deset trojných vazeb CsC a může být přednostně substituovaný F, Cl, Br nebo -NR₄R₅ nebo představuje Cg-Ci₀-aryl, který může být přednostně substituovaný Ci-C₄-alkylem, F, Cl, Br nebo -NR₄R₅ nebo představuje C₇-Ci₄-aralkyl, který může být přednostně substituovaný Ci-C₄-alkylem, F, Cl, Br nebo -NR₄R₅ nebo představuje C5-C₂₀-alkylový řetězec přerušený až 10 aminoskupinami -NR₄- a vykazující aminoskupinu, která může být susbtituována aminokyselinou, symboly R₄, R₅ a Rg představují nezávisle na sobě vodík nebo Ci~C₄-alkyl, symbol X představuje O nebo S, symbol Y představuje. C=O nebo C=S a symbol Z představuje O, S nebo -NR₄-.
5. 10. Transfekční částice podle nároku 8, vyznačující se tím, že kationové prekurzorové molekuly odpovídají obecnému vzorci 1, kde symbol R_x představuje (Ci~C₄-alkylen)-SH, kde alkylenový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo s větveným řetězcem, symbol R₂ představuje -NR₄R₅, -NHR₄R₅ ⁺, -N(R₄)₂R₅ ⁺,

   C (=NR₄) NR₅R₆, -C (=X)-Ci-C₄-alkyl, kde alkylový radikál může reprezentovat uhlovodík s přímým nebo větveným řetězcem a může být substituován až čtyřmi aminoradikály -NR₄Rs nebo thiomonosacharidem, symbol R₃ představuje C₅-C₁₂-alkyl s přímým nebo větveným řetězcem substituovaný přednostně F, Cl, Br nebo -NH₂ nebo představuje Cs-Cis-alkylový řetězec přerušený až 7 aminoskupinami -NR₄- a vykazující aminoskupinu, která může být susbtituována aminokyselinou cysteinem, symboly R₄, R₃ a Rg představují nezávisle na sobě vodík nebo metyl, etyl, propyl, izo-propyl, n-butyl, izo-butyl nebo terciální butyl, symbol X představuje 0 nebo S, symbol Y představuje C=0 nebo C=S a symbol Z představuje 0, S nebo -NR₄-.
6. 11. Transfekční částice podle nároku 8, vyznačující se tím, že kationové prekurzorové molekuly odpovídají obecnému vzorci 1, kde symbol Ri představuje -CH₂-SH, symbol R₂ představuje -NH₂, -NH₃ ⁺, -C (=N⁺H₂) NH₂, -C(=0)-C1-C4alkyl s přímým nebo větveným řetězcem a může být substituován F, Cl, Br nebo -NH₂, nebo představuje radikál ornitinu nebo S-galaktosylu, symbol R₃ představuje radikál C₆-Ci₅-alkylu s přímým nebo větveným řetězcem substituovaný přednostně F, Cl, Br nebo NH₂, symbol Y představuje C=0, symbol Z představuje 0 nebo -NH-.
7. 12. Transfekční částice podle libovolného z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že symbol R₂ představuje guanidinornitin.
8. 13. Transfekční částice podle libovolného z nároků 8 až 12, vyznačuj ícíse tím, že symbol R₃ představuje radikál decylu.
9. 14. Transfekční částice podle libovolného z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že symbol Ri představuje metylenthiol, symbol R₂ je guanidin, symbol R₃ je radikál decylu s přímým řetězcem, symbol Y je karbonyl, symbol Z je amin a jeho farmaceuticky přijatelné sole.
10. 15. Transfekční částice podle nároku 14, vyznačující se tím, že kationová molekula je N-decyl-2-guanidium-cystein.
11. 16. Transfekční částice podle libovolného z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že symbol Ri představuje metylenthiol, symbol R₂ je ornitin, symbol R₃ děkan, symbol Y • · · · je karbonyl, symbol Z je amin a jeho farmaceuticky přijatelné sole.
12. 17. Transfekční částice podle nároku 16, vyznačující se tím, že kationová molekula je N-decyl-2-ornitinylcystein.
13. 18. Transfekční částice podle libovolného z nároků 8 až 11, vyznačující se tím, že monosacharid, který se váže prostřednictvím atomu síry se vybral ze skupiny zahrnující galaktózu, laktózu, glukózu, arabinózu, fruktózu, sorbózu , xylózu, ribózu, manózu, přičemž každý z nich je ve své D- nebo L-formě.
14. 19. Transfekční částice podle nároku 1, kde kationová prekurzorové molekula je polyamin.
15. 20. Transfekční částice vyznačující se podle tím, nároku 19, ž e kationová prekurzorové molekula je derivát sperminu.

    podle tím, derivát nároku 20, ž e kationová spermin-Nl,NI2-bis
16. 21. Transfekční částice vyznačující se prekurzorové molekula je cysteinamidu.
17. 22. Transfekční částice podle libovolného z nároků 1 až 21, vyznačující se kationovými molekulami je vhodných pro buňky.
18. 23. Transfekční částice vyznačující se molekulu nukleové kyseliny.
19. 24. Transfekční částice podle nároku vyznačující se tím, že kyseliny je molekula DNA.
20. 25. Transfekční částice vyznačující se plazmid.

    tím,, že spojení mezí degradovatelné v podmínkách podle tím, že podle tím, že nároku 1, obsahuje jedinou

    1 nebo 23, molekula nukleové nároku molekula

    24, DNA j e

    26 Transfekční částice podle nároku 1, v y z n a č u jící se tím, že molekula nukleové kyseliny je molekula RNA. 27 Transfekční částice podle libovolného z nároků 1 až 26, v y z n a č u jící se tím, ž e pro ni je

    charakteristické, že nese jednu nebo více funkcí pro cílení do buněk a/nebo jednu nebo více funkcí schopných usnadnit endocytózu.

    28 Transfekční částice podle nároku 27, vyznačuj 1 c 1 se t 1 m, ž e uvedené funkce j sou spojeny s kationovými molekulami. 2 9 Transfekční částice podle nároku 27, vyznačuj 1 cíše t 1 m, že uvedené funkce se

    spojují.s molekulami, které vážou nukleovou kyselinu a které

    jsou přítomny vedle kationových molekul. 30 Transfekční částice podle nároku 27, vyznačuj íc 1 se t 1 m, že funkce cílení je ligand buněčného proteinu. 31 Transfekční částice podle nároku 27, vyznačuj íc 1 se t 1 m, že funkce cílení je

    cukerný zbytek.

    32 Transfekční c částice podle nároku je galaktóza 31, v y z n a č u j 1 1 s e t i n n, ž e cukr 33 • Transfekční částice podle nároku 31, v y z n a č u j 1 c 1 s e tím, že cukr je manóza. 34 • Transfekční částice podle nároku 1, v y z n a č u j 1 c 1 s e tím, že pro ni je charakteristické ¹ r že : nese ; j ednu nebo vice endosomolytických funkcí. 35 • Transfekční částice podle nároku 34, v y z n a č u j í c 1 s e tím, ž e uvedené endosomolytické funkce j sou spojeny s kationovými molekulami. 36 • Transfekční částice podle nároku 34, v y z n a č u j í c i s e t i m, že uvedené funkce j sou

    ·· ·· • · « » · · I • · ·· • · · « nároku 34, endosomolytická spojeny s molekulami vázajícími nukleovou kyselinu, které jsou přítomny vedle kationových molekul.

    37. Transfekční částice podle tím, že vyznačující se funkce je fúzogenní peptid.

    38. Transfekční částice podle vyznačující se tím, funkce je virus.

    39. Transfekční částice podle nároku 34, endosomolytická nároku

    38, vyznačující se tím, že virus je adenovirus.

    40. Způsob přípravy transfekčních částic podle libovolného z nároků 1 až 39, vyznačující se tím, že k molekulám nukleové kyseliny ve vhodném pufru se přidají kationové prekurzorové molekuly, což umožňuje tvorbu komplexů s nukleovou kyselinou a kovalentní spojení se shodnými nebo různými kationovými prekurzorovými molekulami na templátu nukleové kyseliny.

    41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že kationové prekurzorové molekuly jsou lipofilní a mohou se kovalentně vázat za slabě oxidačních podmínek.

    42. Farmaceutická sloučenina obsahující farmaceuticky účinné množství transfekční částice podle nároku 1, kde molekula nukleové kyseliny je terapeuticky aktivní.

    43. Farmaceutická sloučenina podle nároku 42, kde molekula nukleové kyseliny je plazmid kódující terapeuticky aktivní protein.

    44. Způsob zavedení terapeuticky aktivní nukleové kyseliny do savce, vyznačující se tím, že transfekční částice podle nároku 1 se aplikuje uvedenému savci inťradermálně.

    tím,

    45. Sada částí, vyznačuj ícíse obsahuje jednu nebo více molekul nukleových kyselin, jednu nebo více kationových prekurzorových molekul, vhodné pufry a jiná činidla nebo mechanické prostředky, které je možné • · ·· ·· 99 «9 • · ·· · 9 · «9 9

    9 · 9 999 9 99 9 • 9 99 99 999 99 9 • 9 9999 9999

    999 999 99 99 99 99 použít při přípravě, čištění a aplikaci in vivo nebo in vitro transfekční částice podle libovolného z nároků 1 až 39.

    46. Sada částí podle nároku 45, v y z n a č u j í c í se t i m, ž e obsahuje navíc jednu nebo více funkcí pro cílení do buněk 47. Sada částí podle nároku 45, v y z n a č u j í c í se t í m, ž e obsahuje navíc jednu nebo více endosomolytických

    funkcí.