CZ20002214A3 - DNA molekula kódující mutantní preproneuropeptid Y, mutantní signální peptid, a jejich použití - Google Patents

Abstract

Sekvence DNA, která obsahuje fiukleotidovou sekvenci kódující prepro-neuropeptid Y (preproNPY), kde aminokyselina leucin v poloze 7 signálního peptidu, který je částí zmíněného preproNPY, je nahrazena prolinem. Mutovaný signální peptid, jako takový, nebo asociovaný s jakýmkoliv dalším produktem štěpení preproNPY, způsoby stanovení uvedené DNA sekvence nebo uvedeného proteinu v biologických vzorcích. Použití při diagnóze predispozice lidského jedince ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu a při léčbě lidského jedince s diagnózou predispozice ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu. Transgenní zvířata nesoucí buď mutovanou nebo normální sekvenci.

Description

DNA molekula kódující mutantní prepro-neuropeptid Y, mutantní signální peptid, a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká sekvence DNA kódující prepro-neuropeptid Y (preproNPY), mutantní signální peptid jako takový nebo asociovaný s jakýmkoliv dalším produktem štěpení preproNPY, dále způsobu stanovení uvedené DNA sekvence nebo uvedeného proteinu v biologických vzorcích. Vynáleze se také týká způsobu pro diagnózu predispozice lidského jedince ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu a způsobu léčby lidského jedince s diagnózou predispozice ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu. Do oblasti vynálezu patří také transgenní zvířata nesoucí buď mutovanou, nebo normální sekvenci.

Dosavadní stav techniky

Publikace a další zde použitý materiál k objasnění dosavadního stavu techniky a zvláště případy zajišťující dodatečné detaily respektující praxi jsou začleněné v odkazech.

Neuropeptid Y (NPY) je peptidový hormon skládající se z 36 aminokyselin hojně exprimovaný jak v centrálním, tak v periferním nervovém systému. NPY hraje centrální roli v hypotalamické regulaci příjmu potravy a výdeje energie. Centrální podávání NPY významně stimuluje příjem potravy, chronické infuze vedou ke vzniku obezity, hyperinsulinémie a inzulínové rezistence u experimentálních zvířat. O roli NPY v lidské obezitě nebo metabolických poruchách je známo poměrně málo.

Neuropeptid Y (NPY), patřící mezi peptidy, je neurotransmiter, který je hojně exprimován jak v centrálním, tak v periferním nervovém systému ^1,2. NPY jsou prokázány některé regulační funkce zahrnující příjem potravy ³’⁴’⁵, anxiolýzu ⁶’⁷, uvolňování hypofyzárních hormonů ^8,91°, termogenezi¹¹ a uvolňování inzulínu ¹².

U zvířat hraje NPY důležitou roli v hypotalamické regulaci energetické rovnováhy.

NPY významně stimuluje příjem potravy po centrálním podávání ¹³. Také snižuje výdej energie poklesem termogeneze v hnědé tukové tkáni a upřednostňuje uskladnění energie zvýšením aktivity lipoproteinové lipázy v bílé tukové tkáni ¹⁴. Chronické intracerebroventrikulární infuze NPY způsobují vznik obezity a inzulínové rezistence ¹³.

Omezení příjmu potravy významně zvyšuje hypotalamickou aktivitu NPY zatímco opětovné podávání potravy aktivitu snižuje. Hypotalamické NPY neurony jsou řízeny periferními hormonálními signály se zpětnou vazbou, jako je například inzulín a leptin ^14,15,16.

Hypotalamická exprese mRNA kódující preproNPY a hladina NPY je zvýšena u obézních krys fa/fa Zucker ¹⁷, ty mají poškozenou leptinovou signalizaci díky bodové mutaci v genu pro leptinový receptor ¹⁸. U lidí jsou koncentrace NPY v cerebrospinální tekutině zvýšeny u anorektických pacientů ¹⁹, to je ve shodě s předpokládanou aktivační kompenzací NPY mechanismu. Je důležité, že anorektičtí pacienti také vykazují zvýšené hladiny cholesterolu 20,2i^ y literatuře ale není žádná zmínka spojující gen pro NPY nebo NPY jako takový s metabolismem cholesterolu nebo hladinu sérového cholesterolu.

Odkazy

1. Gray TS, Morley J.E., Neuropeptide Y: anatomical distribution and possible function in mammalian nervous systém. Nátuře 1986 Feb 3;38(5):389-401

2. Lundberg JM, Terenius L, Hokfelt T, Martling CR, Tatemoto K, Mutt V, Polák J, Bloom S, Goldstein M. Neuropeptide Y (NPY)-like immunoreactivity in peripheral noradrenergic neurons and effects of npy on sympathetic function. Acta Physiol Scand 1982 Dec; 116(4}.-477-480

3. Clark JT, Kaira PS, Kaira SP. Neuropeptide Y stimulates feeding but inhibits sexual behavior inrats. Endocrinology 1985 Dec;l 17(6):2435-2442

4. Levine AS, Morley JE Neuropeptide Y; a potent inducer of consummatory behavior in rats. Peptides 1984 Nov;5(6): 1025-1029

5. Stanley EG, Leibowitz SF Neuropeptide Y injected in the paraventricular hypothalamus; a powerful stimulant of feeding behavior. Proč Nati Acad Sci USA 1985 Jun;82(ll):39403943

6. Heilig M, McLeod S, Brot M, Hsinrichs SC, Menzaghi F, Koob GF, Britton KT. Anxiolytic-like action of neuropeptide Y: mediation by Yl receptors in amygdala, and dissociation from food intake effects. Neuropsychopharmacology 1993 Jun;8(4):357-363

7. Wahlestedt C, Pich EM, Koob GF, Yee F, Heilig M.. Modulation of anxiety and neuropeptide Y-Yl receptors by ant is ense oligodeoxynucleotides. Science 1993 Jan 22;259(5094):528-531

8. Wahlestedt C, Skagerberg G/ Ekman R, Heiiig M, Sundler F, Hakanson R. Neuropeptide Y (NPY) in the area of the hypothalamic paraventricular nucleus activates the pituitaryadrenocorticai axis in the rat. Brain Res 1987 Aug 4;417(1):33-38

9. McDonald JK, Lumpkin MD, Samson WK, McCann SM. Neuropeptide Y affects secretion of luteinizing hormone and growth hormone in ovariectomized rats. Proč Nati Acad Sci U S A 1985 Jan;82(2):561-564

10. Sáhu A, Kaira SP, Crowley WR, Kaira PS. Testosterone raises neuropeptide-Y * · • · concentration in selected hypothalamic sites and in vitro release from the medial basal hypothalamus of castrated male rats. Endocrinology 1989 Jan; 124(1):410-414

11. Menendez JA, McGregor IS, Healey PA, Atrens DM, Leibowitz SF. Metabolic effects of neuropeptide Y injections into the paraventriculamucleus of the hypothaiamus. Brain Res 1990 May 14;516(1):8-14

12. Moltz JH, McDonald JK. Neuropeptide Y: direct and indirect action on insulin secretion inthe rat. Peptides 1985 Nov;6(6):1155-1159

13. ZrejevskiN, Cusin I, Vettor R, Rohner-Jeanrenaud F, Jeanrenaud B. Chronic intracerebroventricular NPY admisteration to normál rats mimics hormonal and metabolic changes of obesity. Endocrinology 133: 1753-1758

14. Sáhu A, Sninsky CA, Kaira PS, Kaira SP. Neuropeptide-Y concentration in microdissected hypothalamic regions and in vitro release from the medial basal hypothalamus-preoptic area of streptozotocin-diabetic rats with and without insulin substitution therapy. Endocrinology 1990 Jan; 126(1):192-198

15. Stephens TW, Basinski M, Bristow PK, Bue-Valleskey JM, Burgett SG, Craft L, Hale J, Hoffmann J, Hsiung HM, Kriauciunas A, et al. The role of neuropeptide Y in the antiobesity action of the obese geneproduct. Nátuře 1995 Oct 12;377(6549):530-532

16. Schwartz MW, Baskin DG, Bukowski TR, Kuijper JL, Foster D, Lasser G, Prunkard DE, Porte D Jr, Woods SC,Seeley RJ, Wei-gle DS. Specificity of leptin action on elevated blood glucose levels andhypothalamic neuropeptide Y gene expression in ob/ob mice. Diabetes 1996 Apr;45(4);531-535

17. Pesonen U, Huupponen R, Rouru J, Koulu M. Hypothalamic neuropeptide expression after food restriction in Zucker rats: evidence of persistent neuropeptide Y gene activation. Brain Res Mol Brain Res 1992 Dec; 16(3-4):255-260

18. Chua SC Jr, White DW, Wu-Peng XS, Liu SM, Okada N, Kershaw EE, Chung WK, Power-Kehoe L, Chua M, Tartaglia LA, Leibel RL. Phenotype of fatty due to Gln269Pro mutation in the leptinreceptor(Lepr). Diabetes 1996 Aug;45(8):l 141-1143

19. Kaye WH, Berrettini W, Gwirtsman H, George D.T.1990 Altered cerebrospinal fluid neuropeptide Y and peptide YY iimnunoreactivity in anorexia and bulimia nervosa. ArchGen. Psychiatry 47:548-556.

20. Mordasini R, Klose G, Greten H. Secondary type II hyperlipoproteinemia in patients with anorexia nervosa. Metabolism 1978 Jan;27(l):71-79

21. Sanchez-Muniz FJ, Marcos A, Varela P. Sérum lipids and apolipoprotein B values, blood pressure and pulse rate in anorexia nervosa. Eur J Clin Nutr 1991 Jan;45(l):33-36

4 4 4 • · ·

4 44 • 4

22. Uusitupa MI, Karhunen L, Rissanen A, Franssila-Kallunki A, Nískanen L, Kervinen K, Kesaniemi YA. Apolipoprotein E phenotype modifies metabolic and hemodynaniicabnorma titles related to centrál obesity in women. Am J Clin Nutr 1996 Aug;64(2): 131-136

23. Sipiiainen R, Uusitupa M, MeiKKinen b, Kissanen A, Laakso M. Polymorphism of the (3 - adrenergic receptor gene affects basal metabolic rate in obese Finns. 1997. Diabetes 46: 77-80

24. Uusitupa M, Siitonen 0, Aro A, Pyorala K. Prevalence of coronary heart disease, left ventricular failure and hypertension in middle-aged, newly diagnosed type 2 (non-insuiindependent) diabetic subjects. Diabetologia 1995 Jan;28(l);22-27

25. Minth CD, Andrews PC, Dixon JE. Characterization, sequence, and expression of the cloned human neuropeptide Y gene. J Biol Chem 1986 Sep 15;261 (26): 11974-11979

26. Roschlau P, Bemt E, Gruber W. Enzymatische Bestimniung des Gesamtchoiester,des im Sérum. Z Kliň Chern Biochem 1974,12: 403-407

27. Wahlenfield AW. Triglycerides. Determination after enzymatic hydrolysis. In; Bergmeyer HU (ed) Methods in enzymatic analysis. Academie Press. New York. pp 1831-1835

28. Uusitupa M, Siitonen 0, Penttiía I, Aro A, Pyorala K. Proteinuria in newly diagnosed type II diabetic patients. Diabetes Care 1987 Mar;10(2):191-194

29. Karhunen L, Franssila-Kallunki A, Rissanen A, Kervinen K, Kesaniemi YA, Uusitupa M. Determinants of resting energy expenditure in obese non-diabetic Caucasian women. Int J Oběs Relat Metab Disord 1997 Mar;21(3):197-202

30. Ehnholm C, Lukka M, Kuusi T, Nikkila E, Utermann G. Apolipoprotein E polymorphism in the Finnish population: gene frequencies and relation to lipoprotein concentrations. J Lipid Res 1985 Mar;27(3):227-235

31. Lundberg JM, Terenius L, Hokfelt T, Goldstein M. High levels of neuropeptide Y in peripheral noradrenergic neurons in various mammals including man. Neurosci Lett 1983 Dec 2;42 {2):167-172

32. Wang YN, McDonald JK, Wyatt RJ, Immunocytochemical localization of neuropeptide Y-like immunoreactivity in adrenergic and non-adrenergic neurons of the rat gastrointestinal tract. Peptides 1987 Jan;8(l):145-151

33. Roche C, Boutin P, Dina C, Gyapay G, Basdevant A, Hager J, Guy-Grand B,

Clement K, Froguel P. Genetic studies of neuropeptide Y and neuropeptide Y receptors Yl and Y5 regions in morbid obesity. Diabetologia 1997 Jun;40(6) :671-675.

• · • « • ·

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je DNA sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci kódující prepro-neuropeptid Y (preproNPY), kde aminokyselina leucin v poloze 7 signální části peptidu, která je částí zmíněného preproNPY, je nahrazena prolinem.

Dalším aspektem vynálezu je způsob vyšetřování jedinců za účelem zjištění, zda je daný jedinec nositelem mutantního genu pro NPY, tento způsob obsahuje krok zpracování biologického vzorku daného zkoumaného jedince a provedení testu pro detekci přítomnosti i) normálního nebo ii) mutovaného genu pro NPY v biologickém vzorku.

Ještě dalším aspektem vynálezu je signální peptid, který obsahuje v pozici 7 záměnu aminokyseliny leucin za aminokyselinu prolin, a uvedený signální peptid je asociován s jakýmkoliv dalším produktem štěpení preproNPY.

Dalším aspektem vynálezu jsou protilátky schopné rozpoznávat uvedený signální peptid nebo uvedený signální peptid asociovaný s jakýmkoliv dalším produktem štěpení preproNPY, a imunodetekčních metod pro stanovení uvedeného peptidu v biologickém vzorku.

Dalším aspektem vynálezu je způsob diagnózy predispozice pro zvýšenou hladinu sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu u lidských jedinců. Způsob podle vynálezu obsahuje určení, zda daný jedinec má polymorfísmus v signální části peptidu uvedeného preproNPY, zda daný polymorfísmus představuje substituci leucinu za prolin v pozici 7 signální části peptidu a zda je daný polymorfísmus směrodatný pro predispozici ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu.

Dalším aspektem vynálezu je způsob léčby lidského jedince s diagnózou pro zvýšenou hladinu sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu a prevence zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu u daného jedince; tento způsob zahrnuje podávání účinného množství látky, která kompenzuje vliv mutovaného genu pro NPY, lidskému jedinci.

Dalším aspektem vynálezu je způsobu léčby lidského jedince s diagnózou zvýšené hladiny sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu a prevence zvýšené hladiny sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu u daného jedince; způsob podle vynálezu zahrnuje vystavení jedince specifické genové terapii zaměřenou na opravu mutované sekvence NPY.

Vynález se dále týká transgenních živočichů, kteří jsou nositeli lidské DNA sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci kódující prepro-neuropeptid Y (preproNPY), kde leucin v pozici 7 signální části peptidu uvedeného preproNPY je i) buď nahrazen prolinem nebo ii) nezměněn.

* 4

I fl • 4

Vynález se také týká transgenních živočichů, kteří jsou nositeli DNA sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci kódující jinak normální myší sekvenci NPY nebo její část kódující konečný myší peptid NPY, ale ve které je nukleotidová sekvence kódující myší signální peptid nahrazena sekvencí lidského signálního peptidu, která kóduje buď normální, nebo mutovaný lidský signální peptid.

Za další se vynález týká také buněčné linie exprimující mutovaný lidský gen pro NPY nebo jeho část.

Vynález je částí vynálezcova studijního programu zaměřeného na výzkum genetického pozadí, energetického metabolismu a obezity. Je uvedena identifikace poměrně běžného polymorfismu v oblasti signálního peptidu genu pro NPY. Překvapivě bylo objeveno že, polymorfismus Leu7/Pro7 koreluje s významným zvýšením hladin jak celkového, tak LDLcholesterolu u normálních a obézních, nediabetických jedinců, ačkoliv nebyl dán do souvislosti s energetickým metabolismem nebo obezitou. DNA sekvence jak mutovaného signálního peptidu, tak daného peptidu asociovaného s jakýmkoliv dalším produktem štěpení preproNPY, může být použita pro vyšetření jedinců za účelem zjištění, zda je daný jedinec nositelem mutovaného genu pro NPY.

Stanovení může být provedeno nejen pomocí DNA analýzy obecně známými metodami, které zahrnují přímé DNA sekvenování normálního a mutovaného genu pro NPY, alelově specifickou amplifikaci s využitím PCR (polymerase chain reaction) umožňující detekci jak normální, tak mutované NPY sekvence, tak také nepřímou detekcí normálního nebo mutovaného genu pro NPY pomocí různých molekulárně biologických metod, které zahrnují například PCR - jednořetězcový konformační polymorfismus (SSCP) nebo gradientovou gelovou elektroforézu za denaturačních podmínek (DGGE). Stanovení normálního nebo mutovaného genu pro NPY může být provedeno také pomocí metody RFLP (restriction fragment lenght polymorphism), která je zvláště vhodná pro genotypizaci většího množství vzorků.

Stanovení může být také provedeno na úrovni detekce RNA analýzou exprimované RNA na úrovni tkání s využitím různých metod. Mohou být navrženy alelově specifické proby pro hybridizaci, hybridizace může být provedena například s využití Northern blotování, RNAáza ochranná zkouška (RNAse protection assay) nebo metodami in šitu hybridizace. RNA odvozená od normálního nebo mutovaného genu pro NPY může být také analyzována nejdříve převedením tkáňové RNA na cDNA a následně amplifikaci cDNA pomocí alelově specifické PCR metody.

• φ

ΦΦΦΦ φ · φφ ♦· • φ · · « φ φ « • φ φ φ φ φ φ φ φφ Φφ

Navíc, stanovení může být provedeno jako imunostanovení, kde vzorek je v kontaktu s protilátkou schopnou interagovat se signálním peptidem nebo daným peptidem asociovaným s jakýmkoliv štěpícím produktem preproNPY.

Protilátky mohou být specifické vůči normálnímu nebo mutovanému preproNPY nebo specifičtější vůči normální nebo mutované části signálního peptidu NPY. Protilátky mohou být získány in vivo z pokusných zvířat ve formě polyklonálních protilátek nebo in vitro s využitím buněčných linií jako monoklonální protilátky.

Lidský jedinec s diagnózou predispozice ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL-cholesterolu může být léčen preventivně proti zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL-cholesterolu podáváním účinného množství látky s kompenzujícím účinkem vzhledem k mutovanému genu pro NPY danému jedinci. To může být prováděno specifickou genovou terapií usilující o opravu mutované sekvence genu NPY nebo podstoupením farmakoterapie s cílem ovlivnit syntézu, uvolňování nebo metabolismus endogenního NPY nebo s cílem interagovat specifickými kroky s místy účinku NPY a tak modulovat účinek NPY pomocí specifických NPY receptorových proteinů. Bylo klonováno a charakterizováno pět různých subtypů NPY receptorů (Y1-Y5 receptory) a byly syntetizovány molekuly s léčivým účinkem, které specificky interagují s těmito NPY receptory. Popsaná farmakoterapie není omezena pouze na uvedené receptory nebo mechanismus, ale vztahuje se také k jiným NPY receptorům a příbuzným objeveným mechanismům.

Vliv mutované sekvence NPY na funkci NPY genu může být studována na transgenních zvířatech. Transgenní zvířata mohou být získávána pomocí metody cílené homologní rekombinace. Do sekvence genu pro NPY se zavede jak normální, tak mutovaná sekvence lidského signálního peptidu NPY (nebo jakékoliv DNA sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci kódující prepro-neuropeptid Y (preproNPY) nebo jeho část kódující aminokyselinovou sekvenci konečného myšího nebo lidského NPY peptidu, kde je buď i) aminokyselina leucin v pozici 7 části signálního peptidu uvedeného preproNPY nahrazena prolinem nebo ii) aminokyselina leucin v pozici 7 části signálního peptidu uvedeného preproNPY je nezměněna) a nahradí tak endogenní sekvenci signálního peptidu. Za těchto podmínek endogenní NPY gen funguje jinak normálně, ale syntéza preproNPY je regulována buď normální, nebo mutovanou sekvencí genu signálního peptidu lidského NPY. Tento transgenní model může být využit ke studiu fyziologické důležitosti mutovaného genu NPY velice specifickým způsobem. Připraví se také ideální preklinický model pro výzkum a screening nových lékových sloučenin, které jsou navrženy s cílem modifikovat vliv mutovaného NPY genu.

• ·

Vynález je detailněji popsán v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Metody

Kódující oblasti genu pro NPY byly zjišťovány pro možné sekvenční varianty u 90 obézních jedinců finské národnosti pomocí SSCP (single-stranded conformation polymorphism).

Alelické asociace identifikovaného polymorfismu Leu7-Pro7 s parametry spojenými s obezitou a metabolickými parametry byly analyzovány ve dvou nezávislých populačních studiích po genotypizaci 141 obézních, nediabetických objektů (studie 1) a 64 objektů s normální hmotností (studie 2) pomocí RFLP (restriction lenght polymorphism).

Jedinci podrobení studii pro SSCP screening genu NPY

Byly použity DNA vzorky devadesáti náhodně vybraných obézních Finů z populační studie 1 pro screening exonových sekvenčních variant v NPY genu.

Jedinci podrobení studii pro asociaci a genotypové frekvenční analýzy

Studie 1

V asociační studii sekvenčních variant NPY genu s fenotypovými parametry bylo zahrnuto 141 (29 mužů a 112 žen) obézních jedinců ze studie redukce hmotnosti (Uusitupa a kol., 1996) s normálními funkcemi jater, ledvin a štítné žlázy. Žádný z těchto jedinců neměl diabetes, neuváděl nadměrný příjem alkoholu nebo léků, o kterých je známo, že ovlivňují rychlost bazálního metabolismu (BMR), metabolismus cholesterolu (s výjimkou jednoho jedince, který užíval betablokátory) nebo glukózy. Jejich věk byl 43 ± 8 let (průměr ± SD) a průměrný BMI (body mass index) 34,7 v intervalu 28 - 43 kg/m². Všechna fenotypová stanovení byla provedena ráno po dvanáctihodinovém hladovění standardními metodami. Stanovení zahrnovala hmotnost, BMI, procenta tuku, respirační koeficient (RQ), BMR, poměr obvodu pasu a kyčli (WHR), hladiny leptinu, glukózy, inzulínu, cholesterolu a triglyceridů v séru odebraném na lačno. Hlavní charakteristiky jedinců studie 1 jsou uvedeny v tabulce 1. Analytické metody byly popsány dříve ^22,23. U všech obézních jedinců byl dostupný dietní kalendář s detailními údaji o denním příjmu některých nutričních látek zahrnujících karbohydráty, proteiny, tuk a cholesterol.

Studie 2

Originální náhodný kontrolní populační vzorek ve věku 45-64 let byl vybrán během let 1979 až 1981 z populace registrované v okresu Kuopio ve Finsku s využitím náhodných číselných tabulek zahrnutých v údajích distribuce populace žijící v zemědělských a průmyslových oblastech. Ze 183 původně kontaktovaných jedinců bylo pro studii získáno 144 jedinců. Jedinci s normální hmotností (BMI<27 kg/m²) byly vybrány z kontrolních jedinců této studie (studie 2) a byli sledováni po dobu 10 let. Celkem bylo testováno 64 (26 mužů a 38 žen) normoglykemických, nediabetických zdravých Finů. Kontrolní jedinci byli testováni po pěti a deseti letech po prvním testu v letech 1985-1986 a 1991-1992 v tomto pořadí. Hlavní charakteristiky jedinců populační studie 2 v těchto časových intervalech jsou uvedeny v tabulce 2. Protokol byl schválen Ethics Commitees univerzity Kuopio a Helsinki. Populace pro studii 2 byla detailně popsána dříve ²⁴.

PCR-SSCP analýza

Lidský gen pro NPY je rozdělen do čtyřech exonů, první exon obsahuje nepřekládanou oblast, druhý kóduje signální peptid (aminokyseliny 1 až 28) a konečný NPY (aminokyseliny 29 až 63), třetí exon kóduje aminokyselinové zbytky 64 až 90 a čtvrtý exon obsahuje karboxylový terminální heptapeptid pro NPY a nepřekládaný 3‘-konec (obr. la)²⁵. PCR páry primerů a odpovídající teploty kondenzace pro amplifikaci čtyřech exonových úseků genu pro NPY byly následující: pár 1: 5‘ TTGGGGTGTGGGTGGCTC (SEQ ID NO:7) a 5‘ CCTAGACAGACGGGTCGTAGCA (SEQ ID NO:8), Ta = 65°C, pár 2: 5‘

CCCGTCCGTTGAGCC TTCTG (SEQ ID NO:9) a 5‘ CGGTCCCGCGGTCCC (SEQ ID NO:10), Ta = 67°C, pár 3: 5‘ AAAAGACTTTTTTT TTTCCAG (SEQ ID NO: 11) a 5‘ AATGTCCCATCACAAG (SEQ ID NO: 12), Ta = 51°C, pár 4: 5‘ CCTTACAT GCTTTGCTTCTTA (SEQ ID N0:13) a 5‘ GATTTTTCATTGAGGAGGAT (SEQ ID NO: 14), Ta = 51°C. PCR reakční směs (celkový objem 5μ1) obsahovala 100 ng genomové DNA (izolované buď z celé krve, nebo ze stálých buněčných lymfoblastových linií), 1,0 mM dNTPs, 30 nM ³³P-dCTP, 2,5 mM každého primeru, 0,25 U Taq polymerázy (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT). Podmínky PCR reakce byly optimalizovány pomocí PCR Optimizéru^(tm) (Invitrogen, San Diego, CA). Vzorky byly amplifikovány pomocí Gene Amp PCR System 9600 (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 30 cyklů skládajících se z 30 s při teplotě 94°C, 30 s při optimální teplotě pro kondenzaci primerů s templátem (Ta) a 30 s při teplotě 72°C. Na závěr byl zařazen krok o délce 7 minut při teplotě 72°C. Amplifikované vzorky byly smíchány s SSCP pufrem obsahujícím 95% formamidu, 10 mM NaOH, 0,05% φφ ♦· ·· φφ • · φ · φφφφ · φ ·· ΦΦΦ· φ φ φφ φφφφ φφφφ φφφ· φφ φφ φφ φφ φ· xylen kyanolu a 0,05% bromfenolové modři (celkový objem 25μ1). Před nanesením na gel byly vzorky denaturovány 5 minut při teplotě 95 °C a ponechány 5 minut v ledu. Tři pl takto upravených vzorků byly naneseny na MDE™ gel (FMC, BioProduct, Rockland, MA). SSCP gelová elektroforéza byla prováděna dvěma různými způsoby: 6% MDE gel při teplotě 4°C a 3% MDE gel s 10% glycerolem při pokojové teplotě. Elektroforéza probíhala za konstantního proudu a výkonu 5W po dobu 20 hodin. Gel byl vysušen a vyhodnocen autoradiografií exponováním filmu Kodak BIO MAX MR po dobu 24 hodin při pokojové teplotě. Sekvenování

Abnormálně migrující frakce v SSCP byly sekvenovány pomocí kitu Thermo Cycíe Sequenase (tm) kit (Amersham Life Science, lne. Cleveland, OH).

Genotypizace

Primery použité pro genotypizaci objektů ve studii 1 a 2 byly ty, které byly použity pro PCR amplifikaci exonu 2. V exonu 2 substitucí T(1128) za C(1128) vzniká restrikční místo pro Bsi Ε I (New England Biolabs, lne. Beverly, MA). Štěpy byly analyzovány elektroforézou na 2% agarózovém gelu.

Stanovení parametrů séra odebraného na lačno a antropometrických parametrů

Krevní glukóza byla stanovována glukóza-oxidázovou metodou (Glox: Kabi Ab,

Stockholm, Sweden). Sérový inzulín byl stanovován metodou radioimunodetekce (protilátka M 8309: Novo Industries, Copenhagen, Denmark). Variační koeficient metody byl 5,4%, citlivost byla 2 mU na litr. Sérové a lipoproteinové lipidy byly stanovovány v séru po dvanáctihodinovém hladovění. Lipoproteiny byly separovány ultracentrifugací při hustotě 1 006, tak aby se odstranily VLDL, následovala precipitace infranatantové frakce dextransulfátem a chloridem hořečnatým . Pro stanovení cholesterolu a triglyceridů v plném séru, v horní vrstvě po ultracentriíugaci VLDL a supematantu po precipitací LDL byla použita enzymová reakce. LDL bylo vypočítáno jako rozdíl mezi obsahem v celkovém séru a součtem VLDL a HDL. Variace v rámci testu ve stanovení celkového cholesterolu, HDL cholesterolu a triglyceridů bylo 1,3%, 0,95% a 3,1% respektive, variace mezi testy byla 3,3%, 1,9% a 5,2% respektive. Výška ve stoje byla měřena bez bot s přesností 0,5 cm. Hmotnost byla měřena elektrickými vahami (model 707: Seca. Hamburg, Germany), jedinci byli bosí a oblečení ve spodním prádle. BMI (body mass index) byl vypočítán podle vztahu hmotnost (kg)/výška na druhou (m²). Obvod pasu pro výpočet poměru pas-boky byl měřen na úrovni uprostřed mezi dolním laterálním okrajem žeberního oblouku a horním okrajem • 0 • ··

0 0 0 0 • 0 0 0

0 0 <0 0

00 0000 0000 «··· ·· 00 ·· ·· ·· kyčelní kosti. Obvod boků byl měřen na úrovni většího trochanteru přes symiyzu stydkých kostí. Klidový energetický výdej byl měřen nepřímou kalorimetrií (Deltatrac, TM Datex,

Helsinky, Finland) s využitím počítačové analýzy průtoku plynů přes plynový stan pro analýzu plynů, kalibrace byla prováděna před každým měřením pomocí směsi plynů s přesným složením. Metoda byla již dříve podrobně popsána .

Statistická analýza

Distribuce genové frekvence byla testována na Hardy-Weinbergovo ekvilibrium pomocí X²-analýzy. Všechny výpočty týkající asociačních analýz byly prováděny pomocí programu SPSS/WIN verze 6.0 (SPSS, Chicago, IL). Statistické rozdíly ve fenotypových parametrech mezi skupinami byly vyhodnoceny pomocí Studentova testu. Ve studii 1 bylo provedeno násobné srovnávání mezi genotypem a fenotypovými parametry bez formální korekce pro násobné testování. Ve studii 2 se vycházelo z hypotézy, že polymorfismus asociuje s hladinou sérového cholesterolu, proto nebyly provedeny další statická srovnání než hladiny v séru odebraném na lačno celkového, LDL, HDL a VLDL cholesterolu.

Závěr

SSCP screening ústí v detekci substituce thymidinu (1128) za cytosin, což vede k záměně aminokyseliny leucin za prolin v pozici 7 aminokyselinového řetězce hydrofobní části signálního peptidů preproNPY. Alelová frekvence polymorfismu Leu7 za Pro byla 0,08 jak pro normální, tak pro obézní skupinu. Obézní jedinci s alelou Pro7 měli významně vyšší hladiny v séru odebraném na lačnocelkového, LDL a VLDL cholesterolu a nižší hladiny HDL cholesterolu ve srovnání s odpovídajícími hodnotami u jedinců s genotypem Leu//Leu7. Odpovídající hodnoty byly 6,2 ± 1,1 proti 5,3 ± 0,9 mmol/1 (P= 0,0001), 4,2 ± 1,0 proti 3,5 ±

0,8 mmol/1 (P= 0,0003), 0,9 ± 0,6 proti 0,7 ± 0,5 mmoVl (P= 0,042) a 1,1 ± 0,3 proti 1,2 ± 0,3 mmol/1 (P= 0,041). Tyto rozdíly nemohou být vysvětleny faktory, které by mohly vnést chybu jako jsou věk, pohlaví, kouření, paralelní léčba nebo apoE-fenotyp. Polymorfismus Leu7 za Pro v genu pro NPY neasociuje s jakýmkoliv parametrem vztaženým k obezitě se zahrnutím hmotnosti, BMI, poměru pasu a boků, množství tuků, rychlost bazálního metabolismu nebo dalšími metabolickými parametry jako hladina v séru odebraném na lačno glukózy, inzulínu, leptinu nebo triglyceridů u obézních jedinců. Významnost asociace alely pro7 s vyšší hladinou sérového celkového cholesterolu (p = 0,035) a LDL-cholesterolu (p = 0,036) byla potvrzena u jedinců s normální hmotností ve studii 2.

SSCP screening exonových úseků NPY genu ·

4 4 4

4 4«

44 • 4 4 4

44

4« · ·

4444 44

4 4 ·

44

44

4 4 · · · · · · ·

4 4 4

44

Jednotlivé exony obsažené v celém kódujícím úseku genu NPY byl pomocí SSCP podroben screeningu na mutaci. Identifikované polymorfismy byly 1) T(1128) za C(1128), 2) A(1258) za G(1258), 3) T(5671) za C(5671), a 4) T(8233) za A (8233). Očíslování polymorfismů se řídí prací Minth a spol., 1986, ve které byly již prezentovány polymorfismy 2 a 3 ²⁵.

Genotypové frekvence

Všechny alelické frekvence vykazovaly Hardy-Weinbergovu rovnováhu. Alelová frekvence nalezeného polymorfismů T(1128) na C(1128) byla 0,078 u obézních (n = 141) a 0,077 u Finů z kontrolní skupiny s normální hmotností (n = 64). Nebyl zde žádný další rozdíl v alelické distribuci mezi těmito dvěma populacemi.

Asociační analýzy

Studie 1:

Homozygocie s genotypem Pro7/Pro7 byla zjištěna pouze v jednom případě, který byl zahrnut do heterozygótní skupiny. Asociační analýza mezi jedinci s genotypem Pro7/Leu7 (se zahrnutím genotypu Pro7/Pro7) a divokým genotypem Leu7/Leu7 dávala vysoce významné rozdíly v hladinách celkového cholesterolu v séru odebraném na lačno 6,2 ± 1,1 proti 5,3 ± 0,9 mmol/1 (P = 0,0001), ), LDL cholesterolu 4,2 ± 1,0 proti 3,5 ± 0,8 mmol/1 (P= 0,0003), VLDL cholesterolu 0,9 ± 0,6 proti 0,7 ± 0,5 mmol/1 (P= 0,042) a HDL cholesterolu 1,1 ±0,3 proti 1,2 ± 0,3 mmol/1 (P= 0,041) (obr. 2). Rozdíly zůstávaly vysoce významné, pokud byla analýza provedena odděleně u obézních mužů (celkový cholesterol, LDL cholesterol, VLDL cholesterol a HDL cholesterol) a u obézních žen (celkový cholesterol a LDL cholesterol). Příjem celkového tuku, nasycených mastných kyselin, nenasycených mastných kyselin nebo dietního cholesterolu se nelišil v těchto dvou genotypových skupinách. Stupeň obezity nevysvětloval tyto nálezy. Nebyl zde žádný rozdíl v distribuci fenotypového parametru apolipoprotein E mezi rozdílnými skupinami (data nejsou ukázána).

Studie 2:

Jeden jedinec byl homozygót Pro7/Pro7, byl zařazen mezi heterozygóty. U jedinců s normální hmotností byly hladiny celkového a LDL cholesterolu v séru odebraném na lačno významně vyšší u jedinců obsahující alelu Pro7 než u jedinců s genotypem Leu7/Leu7 u všech tří měření. Celkový cholesterol v séru odebraném na lačno byl 7,4 ± 0,6 proti 6,7 ± 0,9 mmol/1 (P = 0,035),) a LDL cholesterol 5,2 ± 0,6 proti 4,5 ± 0,9 mmol/1 (P= 0,036). Nebyly zde statisticky významné rozdíly u VLDL cholesterolu 0,8 + 0,5 proti 0,7 ± 0,4 mmol/1 nebo HDL cholesterolu 1,3 + 0,4 proti 1,5 ± 0,3 mmol/1 (Obr. 3).

ΒΒ ΒΒ

Β · Β Β

Β Β Β Β

Β · Β Β

Β Β Β Β

ΒΒ ΒΒ ·· ·· ♦ ♦ » • BB

Β· ·· • · · Β • Β ·Β

Studie představuje první fakta, která ukazují, že polymorfismus Leu7 z Pro u NPY genu koreluje s hladinami klinicky nepříznivým sérovým cholesterolem a LDL cholesterolem jak u jedinců s normální hmotností, tak u obézních jedinců. To by mohlo naznačovat, že NPY má dříve nepoznanou roli v regulaci metabolismu cholesterolu u člověka a je jedním ze silnějších genetických faktorů, které byly identifikovány jako faktory ovlivňující hladinu sérového cholesterolu.

Hlavní pozorování studie je to, že identifikovaný polymorfismus Leu7 za Pro v signální části peptidu NPY genu významně asociuje se zvýšenými hladinami celkového a LDL cholesterolu u Finů. U obézních jedinců byla navíc zvýšena významně také hladina VLDL cholesterolu a snížena hladina HDL cholesterolu u jedinců s alelou Pro7. Tento hlavní fakt byl nejdříve zjištěn u obézních nediabetických jedinců a následně byl zopakován u jedinců s normální hmotností. Alelová frekvence těchto sekvenčních variant byla okolo 8% ve finské populaci. Pozorovaná asociace nemůže být vysvětlena dalšími faktory, o kterých je známo, že ovlivňují metabolismus cholesterolu, jako je věk, obezita, pohlaví, kouření, léky nebo apoE fenotyp. Je také vysoce nepravděpodobné, že by asociace mohla být způsobena chybou rozvrstvení u studovaných jedinců jelikož všichni jedinci byli původem Finové s podobným genetickým pozadím. Polymorfismus Leu7 za Pro v NPY genu může být považován za důležitý nový genetický znak pro vysoké hladiny celkového a LDL cholesterolu.

Polymorfismus Leu7 za Pro je lokalizován v signální části preproNPY. Signální peptid, který je od konečného NPY odštěpen, hraje důležitou roli při vedení vlastního svinování a balení peptidu v endoplasmatickém retikulu v průběhu syntézy a transportu do sekrečních vezikulů. Obvykle se signální peptid skládá z hydrofobního motivu, jako v případě preproNPY. Leucin je znám jako aminokyselina formující α-helix, zatímco prolin obvykle zavádí zlomy a záhyby do α-helikální části peptidové páteře. Ačkoliv nemáme biochemická data, jak polymorfismus Leu7 za Pro modifikuje syntézu preproNPY, dá se předpokládat, že intracelulární proces syntézy preproNPY je poškozen, což může následně vést ke změněné aktivitě NPY. Pro detailní potvrzení tohoto mechanismu jsou potřebné další experimenty.

Hladiny sérového celkového a LDL cholesterolu byly průměrně 0,9 a 0,7 mmoFl, respektive, vyšší u obézních a neobézních finských jedinců s Pro7 alelou ve srovnání s jedinci s Leu7/leu7 genotypem. U těchto jedinců byl nalezen trend k vyšším hladinám VLDL cholesterolu a nižším hladinám HDL cholesterolu. Vliv této genetické abnormality na hladinu oa sérového cholesterolu je vyšší než vliv alely pro apo E a má stejnou velikost (14%), která by mohla být získána nejlépe dietní terapií s nízkou hladinou cholesterolu u finských jedinců.

Φ· Φ· ·· ·· φφ • » · · φφφφ φ · φ φ • φφ φφφφ φφφφ φφ φφφ φφ φφφ φφ · φ φφ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφ

Jaký je důvod pro zvýšení sérového celkového a LDL cholesterolu u těchto jedinců, které představují 8% finské populace? Díku faktu, že gastrointestinální trakt je vydatně inervován nervy obsahujícími NPY ^{31, 32} dá se spekulovat, že NPY může být zahrnut v absorpci cholesterolu v přijímané potravě a jedinci s alelou Pro7 mohou mít zvýšenou absorpci cholesterolu. To může na druhé straně vyústit v regulaci snižující B/E (LDL) receptorovou aktivitu v játrech a zvýšení hladiny LDL a jeho prekurzorů v séru, například VLDL. Jelikož nejsou zaznamenány žádné abnormality v množství VLDL cholesterolu nebo triglyceridú u postižených jedinců, předpokládáme, že primární defekt není v syntéze nebo katabolismu VLDL. Je zajímavé, že centrální NPY zvyšuje expresi mRNA apolipoproteinové lipázy a zvětšuje enzymovou aktivitu v bílé tukové tkáni upřednostňující ukládání lipidů. Role enzymové aktivity lipoproteinové lipázy nemůže být vyloučena. Nejpřijatelnější možné vysvětlení pro zvýšení sérového cholesterolu je zmenšení množství nebo aktivity LDL receptorů, o kterých je známo, že regulují sérovou koncentraci LDL a v menší míře také hladiny IDL a VLDL částic. Zdá se, že obezita není ovlivněna polymorfismem Leu7 za Pro na úrovni sérových lipidů, jelikož rozdíly mezi jedinci s mutovanou a normální formou genu byly podobné u jedinců s normální hmotností a obézních jedinců. Nutno podotknout, že neexistuje jakékoliv experimentální potvrzení jakéhokoliv z těchto mechanismů diskutovaných výše, které mohou spojovat zvláště genetickou abnormalitu s metabolismem cholesterolu.

Jak bylo řečeno dříve, ApoE fenotyp 4 je také známý tím, že je asociován s vyšší hladinou sérového cholesterolu, jak bylo ukázáno dříve na našich studijních jedincích²². ApoE fenotyp 4 byl rovnoměrně rozložen v obou NPY skupinách a neovlivňoval asociaci polymorfismu v signální části NPY peptidu s rozdílností v hladinách sérového cholesterolu.

Z této studie se zdá, že identifikovaný polymorfismus Leu7 za pro v NPY genu není asociován k jakémukoliv parametru obezity, jako je hmotnost, BMI,WHR, BMR nebo RQ. V souladu s tím byla alelová frekvence mutované alely podobná u kontrol s normální hmotností a u obézních nediabetických jedinců. Tento závěr je také v souladu s nejnovější studií provedenou ve francouzské populaci, ve které vedlejší znaky genu NPY nebyly ve vztahu k jakémukoliv znaku obezity .

Studie představuje první fakta, která ukazují, že polymorfismus Leu7 z Pro u NPY genu koreluje s hladinami klinicky nepříznivým sérovým cholesterolem lipoproteinů jak u jedinců s normální hmotností, tak u nediabetických obézních jedinců. To by mohlo naznačovat, že NPY má dříve nepoznanou roli v regulaci metabolismu cholesterolu u člověka a je jedním ze silnějších genetických faktorů, které byly identifikovány jako faktory ovlivňující hladinu ·· 9 · *· • 99 9 9 99 9 »9 9 999 ··

9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 · 9 9

9 9 9

99 sérového cholesterolu. NPY mechanismus by mohl nabízet potenciální cíl působení nově vyvíjených léků.

Předpokládá se, že způsoby podle vynálezu mohou být zahrnuty v mnoha provedeních, pouze některé z nich jsou zde popsány. Pro odborníka je zřejmé, že další možná provedení nevybočují z oblasti vynálezu. Popsaná provedení jsou ilustrativní a nemohou být považována za vyčerpávající.

Tabulka 1: Demografické a klinické charakteristiky 141 obézních jedinců podle přítomnosti nebo absence Leu(7) na Pro(7) mutace v NPY genu. Hodnoty jsou průměrné ± dměrodatná odchylka (SD)

charakteristika	bez mutace	s mutací	P hodnota
Věk, roky	40,7±6,2	41,2±8,1	nespecifikováno
Pohlaví, žena/muž	95/25	17/4	nespecifikováno
BMI, kg/m2	34,7±3,8	35,7±3,3	nespecifikováno
WHR	0,93±0,08	0,94±0,08	nespecifikováno
BMR, kkal/d*	1635±142	1639±131	nespecifikováno
fs-insulin, pmol/1	94,8±45,3	97,7±53,5	nespecifikováno
fs-glukóza, mmol/1	5,5±0,7	5,5±0,8	nespecifikováno
fs-leptin, ng/1**	32,9±12,8	26,3±4,9	nespecifikováno
Systolický krevní tlak, mmHg	130,7±14,8	128,6±13,6	nespecifikováno
Diastolický krevní tlak, mmHg	87,4 ±10,8	84,7±6,6	nespecifikováno

* upraveno pro množství volného tuku a věk ** Hladiny leptinu byly dostupné od 69 jedinců.

Tabulka 2: Demografické a klinické charakteristiky 64 jedinců s normální váhou a počátku následující studie (během 1979-1981) podle přítomnosti nebo absence Leu(7) na Pro(7) mutace v NPY genu. Hodnoty jsou průměrné ± dměrodatná odchylka (SD)

charakteristika	bez mutace	s mutací
Věk, roky	55,8±2,0	55,1±1,8
Pohlaví, žena/muž	31/25	71
BMI, kg/m2	24,3±2,0	24,9±1,8
WHR	0,87±0,08	0,85±0,05

φ » φ· φφ ·· ·· ·· • φ · · φ φφ · · φφ φ • «φ φ φφφ φ φφ φ φφ φφφ φφ φφφ φφ · • · · φφφφ φφφφ φφφφ φφ φφφφ φφ φφ

fs-insulin, pmol/l	65,4±44,4	84,0±42,6
fs-glukóza, mmol/1	4,9±0,63	4,5±0,57
Systolický krevní tlak, mmHg	142,4±17,6	151,1±16,1
Diastolický krevní tlak, mmHg	86,9±9,0	91,1±8,4

Přehled obrázků

Obr. Ia znázorňuje schématicky molekulární strukturu lidského genu pro NPY, preproNPY peptid a konečný NPY peptid.

Obr. lb ukazuje nukleotidovou sekvenci lidského genu pro NPY. Velká písmena označují oblasti exonových sekvencí, malá písmena intronové sekvence. Pořadové číslo v genové bance je udáno v závorkách. Šipka ukazuje pozici, ve které je T u normálního genu nahrazeno C za vzniku mutantního genu. Podtržená sekvence v exonu 2 je sekvence, která kóduje signální peptid o délce 28 aminokyselin (Exon 1 je SEQ ID N0:l, Exon 2 je SEQ ID N0:2, Exon 3 je SEQ ID N0:3, Exon 4 je SEQ ID N0:4).

Obr. lc ukazuje nukleotidovou sekvenci lidské mRNA kódující preproNPY (SEQ ID N0:5, s proteinovou sekvencí uvedenou v SEQ ID N0:6). Šipka označuje pozici, ve které T u normální mRNA je nahrazeno C za vzniku mutantní mRNA.

Obr. 2 znázorňuje koncentraci v séru odebraném na lačno (sl) a) celkového cholesterolu, b) LDL-cholesterolu, c) HDL-cholesterolu a d) VLDL-cholesterolu u obézních jedinců, kde plné sloupce představují homozygóty Leu7/Leu7 v signálním peptidu preproNPY (n=120), a prázdné sloupce představují heterozygoty Leu7/Pro7 (n=21) nebo homozygoty Pro7/Pro7 v signálním peptidu preproNPY.

Obr. 3 ukazuje koncentraci v séru odebraném na lačno (sl) a) celkového cholesterolu, b) LDLcholesterolu, c) HDL-cholesterolu a d) VLDL-cholesterolu u normálních jedinců, kde plné sloupce představují homozygóty Leu7/Leu7 v signálním peptidu preproNPY (n=56), a prázdné sloupej j^edstavují heterozygoty Leu7/Pro7 (n=8) nebo homozygoty Pro7/Pro7 v signálním peptidu preproNPY.

• 99 • 9 « • » 99 • 9 9 9 9

9 9 * • · · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 9» 99 99 99

Sekvenační list (I) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL: Koulu, Markku

Karvonen, Matti,

Pesonen, Ullamari Uusitupa, Matti (ii) NÁZEV PŘIHLÁŠKY: DNA molekula kódující mutantní prepro-neuropeptid Y, mutantní signální peptid, a jejich použití (iii) POČET SEKVENCÍ: 14 (iv) ADRESA KORESPONDENCE (A) ADRESA: Rothwell, Figg, Ernst & Kurz. P.C.

(B) ULICE: 555 13th Street NW, Suitě 701-E (C) MĚSTO: Washington (D) STÁT: D.C (E) ZEMĚ: USA (F) ZIP: 20004 (v) DOSTUPNÁ POČÍTAČOVÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patenln Release # 1.0, Verse # 1.30 (vi) STÁVAJÍCÍ ÚDAJE O PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 08/994,946 (B) DATUM PODÁNÍ: 19.12.1997 (C) KLASIFIKACE:

(viii) ZÁSTUPCE/ INFORMACE O ZÁSTUPCI:

(A) JMÉNO: Ihnen, Jeřfrey L.

(B) REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 28,957 (C) REFERENČNÍ/ ČÍSLO V REJSTŘÍKU : 2328-110 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFON: 202-783-6040 (Β) (B) TELEFAX: 202-7B3-6031 • · 9 Λ 4 4 4 4 · · ·· ···· ···· 4 · 4 · • 44 4 ··· 4 ·· · ΐ8 : : : :: : : :: :

(2) INFORMACE Ο SEKVENCI SEQ ID NO:1:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 325 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE : SEQ IDN0.1:

CCGCTTCTTC AGGCAGTGC TGGGGCGGGA GGGTTGGGGT GTGGGTGGCT CCCTAAGTCG 60

ACACTCGTGC GGCTGCGGTT CCAGCCCCCT CCCCCCGCCA CTCAGGGGCG GGAAGTGGCG 120 GGTGGGAGTC ACCCAAGCGT GACTGCCCGA GGCCCCTCCT GCCGCGGCGA GGAAGCTCCA 180 TAAAAGCCCT GTCGCGACC GCTCTCTGCA CCCCATCCGC TGGCTCTCAC CCCTCGGAGA 240

CGCTCGCCCG ACAGCATAGT ACTTGCCGCC CAGCCACGCC CGCGCGCCAG CCACCGTGAG 300 TGCTACSAC; CSTCTGTCTA GGGGT 325 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:2:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 247 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:2:

CCCGTCCGTT GAGCCTTCTG TGCCTGCAGA TGCTAGSTAA CAAGCGACTG GGGCTGTCCG 60

GACTGACCCT CGCCCTGTCC CTGCTCGTGT GCCTGGGTGC GCTGGCCGAG GCGTACCCCT 120

CCAAGCCGGA CAACCCGGGC GAGGACGCAC CAGCGGAGGA CATGGCCAGA TACTACTCAG 180 CGCTGGGACA CTACATCAAC CTCATCACCA GGCAGAGGTG GGTGGGACCG CGGGACCGAT 240

TCCGGGA 247 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:3:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

• · · · · · · · (A) DÉLKA: 142 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

ACTTGCTTTA AAAGACTTTT TTTTTTCCAG ATATGGAAAA CGATCTAGCC CAGAGACACT 60

GATTTCAGAC CTCTTGATGA GAGAAAGCAC AGAAAATGTT CCCAGAACTC GGTATGACAA 120 GGCTTGTGAT C-GSGACATTG TT 142 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:4:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 300 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: DNA (genomová) (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

CCTTACATGC TTTGCTTCTT ATGTTTTACA GGCTTGAAGA CCCTGCAATG TGGTGATGGG 60

AAATGAGACT TGCTCTCTGG CCTTTTCCTA TTTTCAGCCC ATATTTCATC GTGTAAAACG 120

AGAATCCACC CATCCTACCA ATGCATGCAG CCACTGTGCT GAATTCTGCA ATGTTTTCCT 180 TTGTCATCAT TGTATATATG TGTGTTTAAA TAAAGTATCA TGCATTCAAA AGTGTATCCT 240

CCTCAATGAA AAATCTATTA CAATAGTGAG GATTATTTTC GTTAAACTTA TTATTAACAA 300 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:5:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 551 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: mRNA (ix) POPIS:

(A) JMÉNO/KLÍČ: signální peptid • · » « • · (Β) LOKALIZACE: 87..170 (ix) POPIS:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) LOKALIZACE: 87..377 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

ACCCCATCCG CTGGCTCTCA CCCCTCGGAG ACGCTCGCCC GACAGCATAG TACTTC-CCGC 60 CCAGCCACGC CCGCGCGCCA GCCACC ATG CTA GGT AAC AAG CGA CTG GGG CTG 113

Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu 1 5

TCC GGA CTG ACC CTC GCC CTG TCC CTG CTC GTG TGC CTG GGT GCG CTG 161

Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu 10 15 20 25

GCC GAG GCG TAC CCC TCC AAG CCG GAC AAC CCG GGC GAG GAC GCA CCA 209

Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro

35 40

GCG GAG GAC ATG GCC AGA TAC TAC TCG GCG CTG CGA CAC TAC ATC AAC 257

Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr Ile Asn

50 55

CTC ATC ACC AGG CAG AGA TAT GGA AAA CGA TCC AGC CCA GAG ACA CTG 305

Leu Ile Thr Arg Gin Arg Tyr Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu

65 70

ATT TCA GAC CTC TTG ATG AGA GAA AGC ACA GAA AAT GTT CCC AGA ACT 353

Ile Ser Asp Leu Leu Met Arg Glu Ser Thr Glu Asn Val Prs Arg Thr

80 85

CGG CTT GAA GAC CCT GCA ATG TGG TGATGGGAAA TGAGACTTGC TCTCTGGCCT 407

Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met Trp 90 95

TTTCCTATTT TCAGCCCATA TTTCATCGTG TAAAACGAGA ATCCACCCAT CCTACCAATG 467

CATGCAGCCA CTGTGCTGAA TTCTGCAATG TTTTCCTTTG TCATCATTGT ATATATGTGT 527

GTTTAAATAA AGTATCATGC ATTC 551 • · • · φ • φ ·» φ · φ · ·· (2) INFORMACE Ο SEKVENCI SEQ ID ΝΟ:6:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 98 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6:

Met Leu Gly Asn Lys Arg Leu Gly Leu Ser Gly Leu Thr Leu Ala Leu 15 10 15

Ser Leu Leu Val Cys Leu Gly Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Pro Ser Lys 20 25 30

Pro Asp Asn Pro Gly Glu Asp Ala Pro Ala Glu Asp Met Ala Arg Tyr 35 40 45

Tyr Ser Ala Leu Arg His Tyr lie Asn Leu lie Thr Arg Gin Arg Tyr 50 55 60

Gly Lys Arg Ser Ser Pro Glu Thr Leu He Ser Asp Leu Leu Met Arg 65 70 75 80

Glu Ser Thr Glu Asn Val Pro Arg Thr Arg Leu Glu Asp Pro Ala Met Trp

90 95 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:7:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 18 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc =“primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

TTGGGGTGTG GGTGGCTC

Φ · ♦ · · » · · ···· • ·· ·«·« · · ♦ » (2) INFORMACE Ο SEKVENCI SEQ ID NO:8:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 22 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc =“primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

CCTAGACAGA CGGGTCGTAG CA 22 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:9:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 20 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc =“primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

CCCGTCCGTT GAGCCTTCTG 20 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 10:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 15 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc -‘primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

flflflfl flfl

CGGTCCCGCG GTCCC 15 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:11:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 21 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc =“primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

AAAAGACTTT TTTTTTTCCA G 21 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 12:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 17 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc =“primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

AATGTCCCCA TCACAAG 17 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO: 13:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 21 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina • ·· (A) POPIS: /desc =“primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 13:

CCTTAC ATGC TTTGCTTCTT A 21 (2) INFORMACE O SEKVENCI SEQ ID NO:14:

(i) SEKVENAČNÍ CHARAKTERISTIKA:

(A) DÉLKA: 20 páru baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) STRINGENTNOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) MOLEKULOVÝ TYP: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: /desc =“primer“ (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

GATTTTTCAT TGAGGAGGAT • ·· · ··

Pl/ 2w0- W ·· ·· ·· ·· • · · · · ♦ · · • · · · · ·· · • · · · · · · · · ···· · · · · ·· ·· ·· ··

Opravené listy patentových nároků - určené k úplnému průzkumu

Claims (19)

1. DNA sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci kódující prepro-neuropeptid Y, kde aminokyselina leucin v pozici 7 části signálního peptidu prepro-neuropeptidu Y je nahrazena aminokyselinou prolin.

2. DNA sekvence podle nároku 1, obsahující genomovou nukleotidovou sekvenci, jak je ukázáno na obr. lb.

3. DNA sekvence podle nároku 1, kde DNA sekvence je cDNA.

4. RNA sekvence obsahující RNA sekvenci odpovídající DNA sekvenci podle nároku 1.

5. Způsob screeningu jedinců ke zjištění, zda jedinec je nositelem zmutováného genu obsahující nukleotidovou sekvenci kódující prepro-neuropeptid Y, vyznačující se tím, že se leucin v pozici 7 části signálního peptidu prepro-neuropeptidu Y nahradí prolinem, přičemž se připraví biologický vzorek pocházející zjedince, který se testuje, načež se provede test pro detekci přítomnosti normálního nebo mutovaného genu preproneuropeptidu Y v biologickém vzorku.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že testem je jakýkoliv test zpracovávající informaci DNA sekvence podle nároku 1.

7. Signální peptid, který má leucin v pozici 7 nahrazený prolinem.

8. Peptid obsahující signální peptid podle nároku 7 spojený s jakýmkoliv dalším produktem štěpení prepro-neuropeptidu Y.

9. Protilátka schopná vazby na signální peptid podle nároku 7.

10. Protilátka schopná vazby na signální peptid podle nároku 8.

11. Imunodetekční způsob stanovení peptidu podle nároku 7 nebo 8, vyznačující se tím, že se biologický vzorek vystaví působení protilátky schopné vazby s peptidem.

12. Způsob diagózy predispozice pro zvýšené hladiny sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu u lidského jedince, vyznačující se tím, že se stanoví, zda je jedinec nositelem polymorfismu v signální peptidické části lidského prepro-neuropeptidu Y, přičemž polymorfismus obsahuje substituci leucinu v pozici 7 za prolin v signální části preproneuropeptidu Y, a je indikátorem predispozice ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu.

13. Způsob léčby lidského jedince s diagnózou predispozice ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu podle nároku 12, vyznačující se tím, že se pro

44 ·4 • 4

4 44 • 4

4 4 4

4 4

4 4

4444 prevenci zvýšené hladiny sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu u jedince podá jedinci účinné množství látky vyrovnávající účinek mutovaného genu preproneuropeptidu Y.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že látka je farmaceuticky zamýšlena jako látka ovlivňující syntézu, uvolňování nebo metabolismus endogenního preproneuropeptidu Y, nebo jako látka interagující specifickým způsobem s cílovými místy účinku prepro-neuropeptidu Y a modulující tak působení prepro-neuropeptidu Y se specifickým proteinovým receptorem prepro-neuropeptidu Y.

15. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tůn, že látka je farmaceuticky zamýšlena jako látka ovlivňující expresi normálního nebo mutovaného genu pro prepro-neuropeptid Y.

16. Způsob léčby lidského jedince s diagnózou predispozice ke zvýšené hladině sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu podle nároku 12, vyznačující se tím, že pro prevenci zvýšené hladiny sérového cholesterolu nebo LDL cholesterolu u jedince se jedinec podrobí specifické genové terapii zamýšlené jako oprava mutované sekvence preproneuropeptidu Y.

17. Transgenní zvíře, které je nositelem lidské DNA sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci kódující prepro-neuropeptid Y nebo jeho část kódující konečný lidský peptid NPY, kde aminokyselina leucin v pozici 7 signální části daného peptidu preproNPY je nahrazena prolinem.

18. Transgenní zvíře, které je nositelem DNA sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci kódující jinak normální myší sekvenci prepro-neuropeptidu Y nebo její část kódující konečný myší prepro-neuropeptid Y, ale ve které je nukleotidová sekvence kódující myší signální peptid nahrazena sekvencí kódující lidský signální peptid jak normální, tak mutovanou.

19. Buněčná linie exprimující mutovaný lidský gen pro NPY nebo jeho část.