CZ20002315A3 - Nový receptor spřažený s G-proteinem - Google Patents

Nový receptor spřažený s G-proteinem Download PDF

Info

Publication number
CZ20002315A3
CZ20002315A3 CZ20002315A CZ20002315A CZ20002315A3 CZ 20002315 A3 CZ20002315 A3 CZ 20002315A3 CZ 20002315 A CZ20002315 A CZ 20002315A CZ 20002315 A CZ20002315 A CZ 20002315A CZ 20002315 A3 CZ20002315 A3 CZ 20002315A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
protein
leu
drr
amino acid
Prior art date
Application number
CZ20002315A
Other languages
English (en)
Inventor
Sultan Ahmad
Denis Banville
Yves Fortin
Paola Lembo
Dajan O´Donell
Shi-Hsiang Shen
Original Assignee
Astrazeneca Canada Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Astrazeneca Canada Inc. filed Critical Astrazeneca Canada Inc.
Priority to CZ20002315A priority Critical patent/CZ20002315A3/cs
Publication of CZ20002315A3 publication Critical patent/CZ20002315A3/cs

Links

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Nový receptor spřažený s G-proteinem

Description

Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká oblasti biologických receptorů a různého využití takových receptorů. Přesněji se vynález týká nukleových kyselin kódujících nové receptory spřažené s G-proteinem a receptorů samotných.
Dosavadní stav techniky
Receptory spřažené s G-proteinem (GPCR) tvoří rodinu proteinů majících společnou strukturální organizaci charakterizovanou extracelulárním N-terminálním koncem, sedmi hydrofobními alfa-šroubovicemi, které patrně tvoří transmembránové domény a intracelulární C-terminální doménou. GPCR váže různé ligandy, které spouštějí intracelulární signály aktivací přenašečových G-proteinů (Caron et al., Rec. Prog. Horm. Res. 48: 277-290 (1993); Freedman et al., Rec. Prog. Horm. Res. 51: 319-353 (1996)).
Dosud bylo klonováno více než 300 GPCR a předpokládá se, že existuje více než 1000 takových receptorů. Přibližně 50-60% klinicky relevantních léků působí přes ovlivňování funkcí různých GPCR (Cudermann et al., J. Mol. Med. 73: 51-63 (1995)). Zejména významné jsou receptory umístěné v gangliích zadních kořenů míšních. Tento region centrálního nervového systému je hustě inervován primárními nebo aferentními sensorickými neurony účastícími se na přenosu, modulaci a vnímání bolesti. Proto mohou být receptory z této oblasti použity v testech pro identifikaci nových činidel pro anestesii a analgesii.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen na objevu nového receptoru spřaženého s G-proteinem, který se liší od dříve popsaných receptorů ve své struktuře a v tom, že je přednostně exprimován v gangliích zadních kořenů míšních. Jeden receptor ganglií zadních kořenů míšních (DRR) byl izolován a sekvencován od krys a šest receptorů ganglií zadních kořenů míšních bylo izolováno a sekvencováno od člověka. Krysí receptor byl označen rDRR-1 a jeho aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1. Lidské receptory byly označeny jako:
hDRR-1 (SEQ ID NO: 3) ;
hDRR-2 (SEQ ID NO: 5) ;
hDRR-3 (SEQ ID NO: 7) ;
hDRR-4 (SEQ ID NO: 9) ;
hDRR-5 (SEQ ID NO: li) ;
hDRR-6 (SEQ ID NO: 13) .
Pokud není uvedeno jinak, označuje termín DRR, jak je zde použit, všechny receptory, jak lidské, tak krysí.
V prvním aspektu se vynález týká proteinů, s výjimkou přirozených proteinů, obsahujících aminokyselinovou sekvenci funkčního krysího nebo lidského DRR, jak jsou uvedeny v SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 nebo 13. Termín obsahující funkční sekvenci zahrnuje jakýkoliv receptorový protein, v jehož sekvenci byly provedeny adice, delece nebo substituce, které nemění významným způsobem funkční charakteristiky receptoru. Tak vynález zahrnuje proteiny mající v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedena v seznamu sekvencí, stejně jako proteiny s odlišnostmi, které nejsou zásadní, protože nemění základní, kvalitativní vazebné charakteristiky DRR receptoru. Vynález dále zahrnuje v podstatě čisté proteiny skládající se v podstatě z DRR • · aminokyselinové sekvence, protilátky, které se specificky váží na DRR (t.j. které mají alespoň 100-krát vyšší afinitu k DRR než k jakémukoliv jinému non-DRR proteinu) a protilátky připravené injekcí farmaceuticky přijatelných přípravků takových proteinů zvířeti, které je schopné produkce protilátek. Ve výhodném provedení je monoklonální protilátka k lidskému nebo krysímu DRR připravena injekcí farmaceuticky přijatelného přípravku receptoru myši a potom fúsí buněk myší sleziny s myelomovými buňkami.
Předkládaný vynález také obsahuje v podstatě čistý polynukleotid kódující protein skládající se z aminokyselinové sekvence složené z funkční sekvence krysího DRR (jak je uvedena v SEQ ID NO: 1) nebo lidského DRR (jak jsou uvedeny v SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, li nebo 13). Tento aspekt vynálezu zahrnuje polynukleotidy kódující proteiny skládající se v podstatě z aminokyselinových sekvencí uvedených v seznamu sekvencí, expresní vektory obsahující takové polynukleotidy a hostitelské buňky transformované takovými vektory. Tento aspekt také zahrnuje rekombinantní krysí a lidské DRR proteiny produkované hostitelskými buňkami získanými tímto způsobem.
Výhodně má polynukleotid kódující krysí DRR nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2a polynukleotid kódující lidský DRR má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, nebo 13. Je také výhodné, aby vektory a hostitelské buňky použité pro expresi DRR obsahovaly tyto konkrétní polynukleotidy.
V jiném aspektu se předkládaný vynález týká způsobu pro testování schopnosti sloučeniny vázat se na krysí nebo lidský DRR Způsob obsahuje inkubaci zdroje DRR s ligandem, o kterém je známo že se váže na receptor, a s testovanou sloučeninou. Zdroj DRR by měl být v podstatě prostý jiných typů receptorů spřažených s G-proteinem, t.j. více než 85% takových obsažených receptorů by « · ··« · » « « » • ··· · ·· · · · · · • ·····«· · ····· · · · • · · · · ·· ·· ·· mělo odpovídat DRR. Po dokončení inkubace se schopnost vazby testované sloučeniny na DRR stanoví podle rozsahu nahrazení vazby ligandu. Krysí DRR by měl, výhodně, odpovídat rDRR-1, jak je uveden v SEQ ID NO: 1. Lidský receptor by měl výhodně být hDRR-1 (SEQ ID NO: 3); hDRR-2 (SEQ ID NO: 5); hDRR-3 (SEQ ID NO: 7); hDRR-4 (SEQ ID NO: 9); hDRR-5 (SEQ ID NO: 11); nebo hDRR-6 (SEQ ID NO: 13) . V takových testech mohou být použity transformované buňky exprimující rekombinantní DRR nebo membrány připravené z takových buněk. Ačkoliv to není zásadní, může test také obsahovat stanovení aktivace dráhy druhého posla, jako je například dráha adenylatcyklasy. Toto může napomoci stanovit to, zda sloučenina, která se váže na DRR, působí jako agonista nebo jako antagonista.
Alternativním způsobem pro stanovení toho, zda je testovaná sloučenina agonista jakéhokoliv zde popsaného DRR, je použití testu buněčné signalizace, například testu měřícího buď intracelulární aktivitu adenylatcyklasy, nebo intracelulární koncentraci vápníku. Testovaná sloučenina je inkubována s buňkami exprimujícími DRR, ale v podstatě neobsahujícími jiné receptory spřažené s G-proteinem, obvykle s buňkami transfektovánými expresním vektorem kódujícím DRR. Testované sloučeniny, které jsou agonisty, jsou identifikovány podle toho, že způsobují statisticky významnou změnu výsledků získaných v testu buněčné signalizace ve srovnání s kontrolními transfektanty nevystavenými působení testované sloučeniny. Například, buňky vystavené působení testované sloučeniny mohou vykazovat významné zvýšení aktivity adenylat-cyklasy nebo zvýšení intracelulární koncentrace vápníku.
Předkládaný vynález také obsahuje způsob pro stanovení toho, zda je testovaná sloučenina antagonista DRR, který spočívá ve známé aktivaci receptorů spřažených s G-proteinem, ke které dochází tehdy, jsou-li takové receptory exprimovány ve velkých množstvích. Tento způsob vyžaduje, aby byla DNA kódující receptor • · • · • ♦ · ···· ··· • ··· · ·· · · « · · inkorporována do expresního vektoru tak, že je operativně navázaná na promotor a tento vektor je potom použit pro transfekci vhodného hostitele. Pro produkci dostatečného množství receptoru pro konstitutivní aktivaci receptoru (t.j. aktivaci za nepřítomnosti přirozeného ligandu) jsou přednostně použity expresní systémy schopné produkce kopií proteinu, například může být DRR DNA operativně navázaná na CMV promotor a exprimována v COS nebo HEK293 buňkách. Po transfekci jsou buňky s aktivovanými receptory selektovány podle toho, jestli vykazují zvýšenou aktivitu v testu buněčné signalizace ve srovnání s buňkami, které buď nebyly transfektovány, nebo které byly transfektovány vektorem, který není schopen exprese funnkčních DRR. Obvykle budou takové buňky selektovány buď podle toho, zda vykazují statisticky signifikantní zvýšení intracelulární aktivity adenyl-cyklasy, nebo podle toho, zda vykazují statisticky signifikantní zvýšení intracelulární koncentrace vápníku. Selektované buňky jsou kontaktovány s testovanou sloučeninou a test buněčné signalizace je opakován pro stanovení toho, zda tato sloučenina způsobuje snížení aktivity vzhledem ke kontrolním buňkám nekontaktovaným s testovanou sloučeninou. Například, statisticky významné snížení buď aktivity adenyl-cyklasy, nebo koncentrace vápníku, vzhledem ke kontrolním buňkám, naznačuje, že testovaná sloučenina je antagonistou DRR. v těchto testech může být použit jakýkoliv zde popsaný DRR.
Testy na sloučeniny interagující s DRR mohou být provedeny inkubací zdroje obsahujícího DRR, ale v podstatě neobsahujícího jiné receptory spřažené s G-proteinem (například stabilně transformovaných buněk) s angiotensinem II nebo III jak za přítomnosti, tak za nepřítomnosti testované sloučeniny, a potom měřením modulace intracelulární koncentrace vápníku. Statisticky významné zvýšení nebo snížení angiotensinem stimulované změny koncentrace vápníku v odpovědi na testovanou sloučeninu ukazuje na interakci s DRR. Mezi receptory, které mohou být použity v tomto • » • · · · · · · * · · · • ··· · ·· · · · · · • ······· · ····· ·· · •· · ♦· · · ·· ·· testu, patří krysí DDR-1 a lidské DRR-1, DRR-2, DRR-3, DRR-4, DRR-5 a DRR-6.
V jiném aspektu je předkládaný vynález zaměřen na způsob testování sloučenin na jejich schopnost alterovat expresi krysího nebo lidského DRR. Tento způsob je proveden kultivací buněk exprimujících DRR, ale v podstatě neobsahujících jiné receptory spřažené s G-proteinem, za přítomnosti testované sloučeniny. Buňky jsou potom získány z kultury a exprese DRR je srovnávána s expresí DRR v kontrolních buňkách kultivovaných za v podstatě stejných podmínek, ale za nepřítomnosti testované sloučeniny. Krysí receptor je výhodně rDDR-1 a lidský receptor je výhodně DRR-1, DRR-2, DRR-3, DRR-4, DRR-5 nebo DRR-6.
Výhodnou testovanou sloučeninou je oligonukleotid délky alespoň 15 nukleotidů obsahující sekvenci komplementární k sekvenci DRR použitého v testu.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1. Nukleotidová sekvence rDRR-1: klon 3B-32, kódující rDRR-1, byl izolován z krysí genomové knihovny za použití Promotor Finder Walking Kit (viz Metody, Clontech).
Klon byl uložen v mezinárodní instituci pro skladování mikroorganismů Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, adresa Mascheroder Weg IB, D-3300 Braunschweig, Germany. Uložení bylo provedeno 27.11.1997 pod přírůstkovým číslem DSM 11877.
Obr. 2. Odvozená aminokyselinová sekvence DRR-l: klon 3B-32 kóduje protein obsahující 337 aminokyselin. Aminokyselinová sekvence začíná prvním ATG v nukleotidové sekvenci.
► · · » · · · · <
> ·····«· < I · · · I • · · · ·
Obr. 3. Seřazení odvozené aminokyselinové sekvence klonu 3B-32 (rDRR-1) s pěti nejvíce homologickými sekvencemi. Zbytky v rámečkách a vybarvené zbytky jsou zbytky identické se zbytky v rDRR-1 sekvenci.
Obr. 4. Seřazení aminokyselin lidských DRR homologů: jsou seřazeny aminokyselinová sekvence všech 6 lidských homologů rDRR-1 (hDRR-1; hDRR-2; hDRR-3; hDRR-4, hDRR-5 a hDRR-6). Aminokyselinové zbytky lišící se od klonu 36 (HUMAN36.PR) jsou v rámečkách. Stupeň identity mezi těmito sekvencemi je v rozsahu od 77% do téměř 100%.
Definice
Následující popis využívá mnoha termínů, které se týkají technologie rekombinantní DNA. Pro jasné pochopení předkládaného vynálezu a patentových nároků, včetně rozsahu daných takovými termíny, jsou uvedeny následující definice.
Klonovací vektor: Plasmidová nebo fágová DNA nebo jiná DNA sekvence, která je schopná autonomní replikace v hostitelské buňce, a která je charakterizována jedním nebo malým počtem míst rozpoznávaných restrikční endonukleasou. Fragment cizorodé DNA může být vložen do vektoru v těchto místech, aby se dosáhlo replikace a klonování fragmentu. Vektor může obsahovat markér vhodný pro použití v identifikaci transformovaných buněk.
Například může markér způsobovat resistenci na tetracyklin nebo ampicilin.
Expresní vektor: Vektor podobný klonovacímu vektoru, který může indukovat expresi DNA, která byla klonována do vektoru, po jeho transformaci do hostitele. Klonovaná DNA je obvykle umístěna (například operativně navázána na) pod kontrolu určitých regulačních sekvencí, jako jsou promotory a zesilovače « · transkripce. Promotorové sekvence mohou být konstitutivní, indukovatelné nebo reprimovatelné.
V podstatě čistý: Jak je zde použit, označuje termín v podstatě čistý to, že vybraný materiál je v podstatě prostý kontaminující buněčných složek. V podstatě čistý protein nebo nukleová kyselina obvykle tvoří alespoň 85% vzorku, lépe ještě vyšší procento. Mezi kontaminující složky patří proteiny, uhlovodany nebo lipidy. Jednou metodou pro stanovení čistoty proteinu nebo nukleové kyseliny je elektroforesa přípravku v matrici, jako je například polyakrylamid nebo agarosa. Čistota je potvrzena detekcí jediného proužku po barvení. Jinými metodami pro stanovení čistoty jsou chromatografie a analytická centrifugace.
Hostitel: Jakákoliv prokaryotická nebo eukaryotická buňka, která je příjemcem replikovatelného expresního vektoru nebo klonovacího vektoru, je hostitelem pro vektor. Termín zahrnuje prokaryotické nebo eukaryotické buňky, které byly zpracované tak, aby inkorporovaly vybraný gen do svého chromosomu nebo do svého genomu. Příklady buněk, které mohou sloužit jako hostitelé, jsou dobře známé v oboru, stejně jako techniky pro transformaci buněk (viz například Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor (1989)).
Promotor: DNA sekvence, která je obvykle umístěna v 5' regionu genu, proximálně vzhledem ke start kodonu. Transkripce je iniciována v promotoru. Pokud je promotor indukovatelný, tak se rychlost transkripce zvyšuje v odpovědi na indukční činidlo.
Komplementární nukleotidová sekvence: Termín komplementární nukleotidová sekvence, jak je zde použit, označuje sekvenci, která vzniká při normálním párování baží. Například, nukleotidová sekvence 5-AGAC-3 bude mít komplementární sekvenci 5-GTCT-3.
• · · · · · ·
Exprese: Exprese je proces, který je produkován polypeptid z DNA. Proces vyžaduje transkripci genu na mRNA a translaci této mRNA na polypeptid.
Předkládaný vynález je zaměřen na DRR receptorové proteiny, genetické sekvence kódující receptory, způsoby pro testování sloučenin na vazbu na DRR receptory a způsoby pro testování sloučenin na jejich schopnost alterovat expresi DRR. Receptory a jejich nukleové kyseliny jsou definovány svou strukturou (jak je uvedena na obr. 1, 2 a 4; a v SEQ ID NO: 1-14).
Je třeba si uvědomit, že předkládaný vynález zahrnuje nejen sekvence identické se sekvencemi uvedenými na obrázcích a v seznamu sekvencí, ale také sekvence, které jsou v podstatě stejné a sekvence, které jsou významně podobné a které si zachovávají vazebné charakteristiky k receptoru, které jsou vlastní DRR. Například, je dobře známo, že techniky, jako je místně cílená mutagenese, mohou být použity pro vložení variací do struktury proteinu. Variace v DRR proteinu vložené tímto nebo jiným podobným způsobem jsou také obsaženy v předkládaném vynálezu, s podmínkou, že vzniklý receptor si zachovává základní kvalitativní vazebné charakteristiky nealterovaného DRR. Proto se vynález týká proteinů skládajících se z funkční sekvence SEQ ID NO: 1 (krysí) a SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11 a 14 (lidské).
I. Sekvence nukleových kyselin kódující DRR
DNA sekvence kódující DRR jsou exprimovány exklusivně, nebo alespoň značně přednostně, v gangliích zadních kořenů míšních, a tyto ganglia mohou sloužit jako zdroj pro izolování nukleových kyselin kódujících receptory. Dále, buňky a buněčné linie, které exprimují krysí nebo lidské DRR, mohou být zdrojem nukleových • ·
kyselin. Může se jednat o netransformované kultivované buňky, nebo o buněčné linie, které byly specificky zpracovány tak, aby exprimovaly rekombinantní DRR.
Ve všech případech je póly A+ mRNA izolována z ganglií zadních kořenů míšních, je reverzně transkribována a je klonována. Takto připravená knihivna cDNA může být potom vyšetřována za použití sond odvozených od sekvencí uvedených v připojeném seznamu sekvencí jako SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 nebo 14, podle toho, který konkrétní DRR je izolován. Sondy mají obvykle délku alespoň 14 baží a měly by být odvozeny od části DRR sekvence, která je málo konzervovaná {viz obr. 3 a 4). Vyšetřování může být také provedeno za použití genomových knihoven s jedním DRR genem, nebo částí genu, jako sondou pro izolování jiných DRR genů. Například, kompletní rDRR-1 může být označen a použit pro vyšetřování lidské genomové knihovny pro izolaci hDRR-1, hDRR-2 atd. (viz příklady provedení vynálezu).
Alternativně mohou být genomové DNA knihovny použity pro izolování DRR genů tak, že se provede PCR amplifikace za použití primerů umístěných na jednom z konců genů {popis postupu je uveden v příkladech provedení vynálezu). Například, lidská genomová DNA může být amplifikována za použití primerů:
5'-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC, a
5'-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG.
Tyto primery mohou být použity pro amplifikaci všech šesti lidských DRR genů identifikovaných zde jako hDRR-1; hDRR-2; hDRR-3; hDRR-4; hDRR-5; a hDRR-6. Tyto geny mohou být potom klonovány do vhodného vektoru, například pGEM-T (Promega), pro analýzu sekvence DNA.
• ·
II. Protilátky ke krysím a lidským DRR
Předkládaný vynález obsahuje také protilátky, které se specificky váží na krysí nebo lidské DRR a způsobů pro přípravu takových protilátek. Protilátky, které se specificky váží na DRR jsou definovány jako ty protilátky, které mají alespoň 100-krát vyšší afinitu k DRR než k jakémukoliv jinému proteinu. Způsob pro přípravu takových protilátek může vyžadovat bud' injekci DRR proteinu samotného vhodnému zvířeti, nebo lépe injekci krátkých peptidů odpovídajících různým regionům DRR. Peptidy by měly mít délku alespoň 5 aminokyselin a měly by být vybrány z regionů, o kterých se předpokládá, že jsou jedinečné pro konkrétní DRR protein, proti kterému má být protilátka zaměřena. Proto obvykle nejsou vysoce konzervované transmembránové regiony použity jako peptidy pro přípravu protilátek. Způsoby pro přípravu a detekci protilátek jsou dobře známé v oboru a jsou popsány ve standardních pracích (např. Harlow et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1988); Klein, Imunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (1982); Kennett et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses (1980); a Campbell, Monoclonal Antibody Technology, v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology (1984)).
Termín protilátka, jak je zde použit, označuje jak intaktní molekulu, tak její fragmenty, které si zachovávají schopnost vazby na antigen (například Fab a F(ab)2 fragmenty). Tyto fragmenty jsou obvykle připraveny proteolytickým štěpením intaktních protilátek za použití enzymů jako je papain (pro přípravu Fab fragmentů) nebo pepsin (pro přípravu F(ab)2 fragmentů). Termín protilátka také označuje monoklonální i polyklonální protilátky. Polyklonální protilátky jsou získány ze séra zvířat imunizovaných antigenem. Monoklonální protilátky mohou být připraveny technikou hybridomů • · « 4 (Kohler et al., Nátuře 256: 495 (1975); Hammerling et al., v Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas, Elsevier, M.Y., str. 563-681 (1981)). Obecně, tato technika vyžaduje imunizaci zvířete, obvykle myši, buď intaktním DRR, nebo fragmentem odvozeným od DRR. Splenocyty imunizovaného zvířete jsou extrahovány a jsou fúsovány s vhodnými myelomovými buňkami, například s SP2O buňkami. Po fúsi jsou výsledné hybridní buňky selektivně udržovány v HAT mediu a potom jsou klonovány limitním ředěním (Wands et al.,
Gastroenterology 80: 225-232 (1981)). Buňky získané takovou selekcí jsou potom testovány pro identifikaci klonů, které secernují protilátky schopné vazby na DRR.
Protilátky, nebo fragmenty protilátek, podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro detekci přítomnosti DRR proteinu za použití jakéhokoliv z mnoha imunotestů. Například, protilátky mohou být použity v radioimunotestech nebo v imunometrických testech, které jsou též známé jako dvou-místné nebo sandwichové testy (viz Chard, T., An Introduction to
Radioimmune Assay and Related Techniques, v Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., N.Y. (1978)). V typickém imunometrickém testu je množství neznačené protilátky navázáno na pevný nosič, který je nerozpustný v testované kapalině, například v krvi, lymfě, buněčných extraktech a podobně. Po počáteční vazbě antigenu na imobilizovanou protilátku se přidá množství detekovatelně značené sekundární protilátky (která může, ale nemusí být stejná jako první protilátka) pro detekci a/nebo kvantifikaci navázaného antigenu (viz např. Radioimmune Assay Method, Kirkham et al., ed., str. 199-206, E. and S. Livingstone, Edinburg (1970)). V oboru je známo mnoho variant těchto typů testů a tyto varianty mohou být použity pro detekci DRR.
Protilátky ke krysímu nebo k lidským DRR mohou být také použity • ·
pro přečištění intaktních receptorů nebo fragmentů receptorů (obecně viz Dean et al., Affinity Chromatography, A Practical Approach, IRL Press (1986)). Obvykle je protilátka imobilizovaná na koloně a přípravek obsahující DRR prochází kolonou za podmínek podporujících vazbu, například za podmínek nízké koncetrace solí. Kolona je potom promyta a navázaný DRR je eluován za použití pufru, který způsobuje disociaci DRR z protilátky, například pufru majícího jiné pH nebo koncentraci solí. Eluovaný DRR může být přenesen do vybraného pufru, například dialýzou, a potom může skladován nebo přímo použit.
III. Radioligandový test vazby na receptor
Jedním z hlavních využití DRR nukleových kyselin a rekombinantních proteinů je použití v testech navržených pro identifikaci činidel schopných vazby na DRR receptory. Taková činidla mohou být bud' agonistická, napodobující normální účinky vazby na receptor, nebo antagonistická, inhibující normální účinky vazby na receptor. Zejména významná je identifikace činidel, které se váží na DRR a modulují aktivitu adenyl-cyklasy v buňkách. Tato činidla mají potenciální terapeutické použití jako analgetika a anestetika.
V radioligandovém vazebném testu je zdroj DRR inkubován s ligandem, o kterém je známo, že se váže na receptor, a se sloučeninou, která je testována na vazebnou aktivitu. Výhodným zdrojem DRR je buňka, výhodně savčí buňka, transformovaná tak, aby rekombinantně exprimovala receptor. Vybraná buňka by neměla exprimovat významná množství jiných receptorů spřažených s G-proteinem, které se mohou vázán na ligand a které mohou zkreslovat výsledky. Toto může být snadno stanoveno provedením vazebných testů na buňkách získaných ze stejné tkáně nebo buněčné linie jako buňky rekombinantně exprimující DRR, které však nebyly • · • · • · • · · · · · · • · · · · * · · • ······· · ··· • · · · 9 · • · · · 4 · · • · · · • · · · • · · · • · · · • · · · • · · · transformovány.
Test může být proveden za použití intaktních buněk nebo za použití membrán připravených z buněk (viz Wang et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10230-10234 (1993)). Membrány jsou inkubovány s ligandy specifickými pro DRR receptor a s přípravkem testované sloučeniny. Po dokončení vazby je receptor separován od roztoku obsahujícího ligand a testovanou sloučeninu, například filtrací, a stanoví se množství vazby. Výhodně je použitý ligand detekovatelně značen radioaktivním izotopem, jako je I12S. Nicméně, pokud je to nutné, může být místo izotopu použito fluorescenční nebo chemiluminiscenční činidlo. Mezi nejčastěji používané fluorescenční značící sloučeniny patří fluoresceinisothiocynat, rhodamin, fykoerythrin, fykocyanin, alofykocyanin, o-ftaldehyd a fluorescamin. Mezi použitlné chemiluminiscenční sloučeniny patří luminol, isoluminol, theromatický ester akridinia, imidazol, sůl acridinia a oxalatový ester. Jakékoliv z těchto činidel může být použito pro přípravu ligandu vhodného pro tento test.
Nespecifická vazba může být provedena vazebnou reakcí za přítomnosti velkého nadbytku neznačeného ligandu. Například, značený ligand může být inkubován s receptorem a testovanou sloučeninou v přítomnosti tisícinásobného nadbytku neznačeného ligandu. Nespecifická vazba by měla být odečtena od celkové vazby, t.j. vazby za nepřítomnosti neznačeného ligandu, pro získání specifické vazby pro každý testovaný vzorek. Pokud je to nutné, může test obsahovat další kroky, jako je promytí, míšení, třepání, filtrování a podobně. Obvykle je promytí provedeno po separaci ligandu navázaného na membránu od ligandu zůstávajícího v roztoku a před kvantifikací množství navázaného radioligandu, například pomocí stanovení radioaktivního izotopu. Specifická vazba získaná za přítomnosti testované sloučeniny je srovnávána s vazbou získanou za přítomnosti značeného ligandu samotného pro stanovení rozsahu vazby testované sloučeniny na receptor.
Při provádění vazebných testů musí být věnována pozornost vyloučení artefaktů, které mohou způsobit zdánlivou interakci testované sloučeniny s DRR receptorem, ačkoliv ve skutečnosti je vazba inhibována nějakými jinými mechanismy. Například, testované sloučeniny by měly být v pufru, který sám o sobě významně neinhibuje vazb ligandu na DRR a měly by být testovány v několika různých koncentracích. Přípravky testované sloučeniny by měly být také vyšetřovány na proteolytickou aktivitu a je žádoucí, aby testy obsahovaly antiproteasy. Konečně, je vysoce žádoucí, aby sloučeniny, které byly identifikovány jako sloučeniny vytěsňující ligand z vazby na DRR receptor, byly znovu vyšetřovány v rozmezí koncentrací dostatečném pro provedení Scatchardovi analýzy výsledků. Tento typ analýzy je dobře známý v oboru a ,ůže být použit pro stanovení afinity testovaných sloučenin pro receptor (viz například Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 11.2.1-11.2.19 (1993); Laboratory Techniques and Biochemistry and Molecular Biology, Work et al., ed., N.Y. (1978), atd.). Počítačové programy mohou být použity pro usnadnění analýzy výsledků (viz například Munson, P., Methods Enzymol., 92: 543-577 (1983); McPherson, G.A., Kinetic, EBDA Ligand. Lowry-A Collection of Radioligand Binding Analysisi Programs, Elsevier-Biosoft, U.K. (1985)) .
Aktivace receptoru vazbou ligandu může být monitorována za použití mnoha různých testů. Například, testy na adenyl-cyklasu mohou být provedeny kultivací buněk v jamkách mikrotitrační plotny a potom inkubací různých jamek za přítomnosti nebo za nepřítomnosti testované sloučeniny. cAMP může být extrahován v ethanolu, může být lyofilizován a resuspendován v testovacím pufru. Stanovení takto získaného cAMP může být provedeno za použití jakékoliv techniky pro stanovení koncentrace cAMP, * · · <r« • » · · · · • · · * · « · • ······· ♦ například Biotrack cAMP Enzyme-Immunoassay System (Amersham) nebo Cyclic AMP (3H) Assay System (Amersham). Obvykle budou testy na adenyl-cyklasu provedeny odděleně od vazebných testů, ale je také možné provést vazebný test a test na adenyl-cyklasu na jediném přípravku buněk. Další testy buněčné signalizace, které mohou být použity pro monitorování aktivity receptoru, jsou popsány dále.
IV. Identifikace DRR agonistů a antagonistů za použití testů buněčné signalizace
DRR mohou být také použity pro vyhledávání kandidátů na léky za použití testů buněčné signalizace. Pro identifikaci agonistů DRR je DNA kódující receptor inkorporována do expresního vektoru a potom je transfektována do vhodného hostitele. Tranformované buňky jsou potom kontaktovány se sérií testovaných sloučenin a je sledován efekt každé sloučeniny. Mezi testy, které mohou být použity, patří testy měřící produkci cAMP (viz výše), testy měřící aktivaci reporterového genu, nebo testy měřící modulaci vazby GTP-gamma-S.
Testy buněčné signalizace mohou být také použity pro identifikaci antagonistů DRR. Receptory spřažené s G-proteinem mohou být uvedeny do aktivovaného stavu i za absence jejich ligandu tím, že jsou exprimovány ve velmi -vysokých koncentracích v heterologním systému. Například, receptor může být nadměrně exprimován za použití bakulovirové infekce hmyzích Sf9 buněk nebo může být DRR gen operativně navázán na CMV promotor a může být exprimován v COS nebo HEK293 buňkách. V tomto aktivovaném konstitutivním stavu může být antagonista receptoru identifikován za absence ligandu měření schopnosti testované sloučeniny inhibovat konstitutivní buněčnou signalizační aktitvitu. Vhodnými testy pro tento účel jsou, opět, cAMP testy, testy aktivace * · ♦ «· 9 9 tf' «« •·· ·*·· · · « a • · * · · »· * 9 » > • »»···«· « *>«»·· - « «
-i«7 r»é ····«»# x / ** · · · 9 9 · · · * · reporterového genu nebo testy měřící vazbu GTP-gamma-S.
Jeden výhodný test buněčné signalizace je založen na pozorování, že buňky stabilně transfektováné DRR vykazují změny v intracelulární koncentraci vápníku v reakci na inkubaci v přítomnosti angiotensinu II nebo III (viz příklad 5). Tak je postup, který může být použit pro identifikaci DRR agonistů nebo antagonistů, podobný radioreceptorovému testu popsanému výše s tou výjimkou, že místo značeného ligandu je použit angiotensin II nebo III a místo navázané radioaktivity je měřena koncentrace vápníku. Koncentrace vápníku za přítomnosti testované sloučeniny a angiotensinu II nebo III je srovnávána s koncentrací za přítomnosti pouze angiotensinu II nebo III pro stanovení toho, zda interaguje testovaná sloučenina s DRR receptorem. Statisticky významné zvýšení intracelulárního vápníku v reakci na testovanou sloučeninu naznačuje, že testovaná sloučenina působí jako agonista, zatímco statisticky významné snížení intracelulárního vápníku v reakci na testovanou sloučeninu naznačuje, že testovaná sloučenina působí jako antagonista.
V. Testy na schopnost modulace exprese DRR
Jednou cestou pro zvýšení nebo snížení biologických účinků DRR je alterace exprese receptorů v buňkách. Proto jsou významné testy identifikující sloučeniny, které inhibují nebo zesilují expresi receptorů. Tyto testy jsou provedeny kultivací buněk exprimujících DRR za přítomnosti testované sloučeniny a potom srovnáním exprese receptorů v těchto buňkách s expresí receptorů v buňkách kultivovaných za v podstatě identických podmínek, ale za absence testované sloučeniny. Stejně jako ve vazbených testech popsaných výše je žádoucí, aby buňky v podstatě neobsahovaly kompetující receptory spřažené s G-proteinem. Jednou cestou pro kvantifikaci exprese receptorů je fúsování DRR sekvence na sekvenci kódující
4 ««· 4 · 4 4 ···· « 4 4 4 4 4 4 · 4 · * » « 44444·· 4 ····· *4 « ··· 4 4 4 *444
4 44 44 ·· 4 * peptid nebo protein, který může být snadno kvantifikován.
Například, DRR sekvence může být ligována na sekvenci kódující haemaglutinin, jak je popsána v příkladu 5, a tato sekvence může být použita pro stabilní transfekci buněk. Po inkubaci s testovanou sloučninou může být komplex haemaglutinin/receptor zpracován imunosrážením nebo westernovým přenosem s protilátkou proti haemaglutininu. Alternativně může být provedena Scatchardova analýza vazebných testů se značeným ligandem pro stanovení počtu receptorů. Vazebné testy mohou být provedeny způsobem popsaným výše a přednostně budou využívat buňky, které byly zpracovány tak, aby rekombinantně exprimovaly DRR.
Výhodná skupina testovaných sloučenin pro použití v testech exprese DRR se skládá z oligonukleotidů komplementárních k různým segmentům sekvence DRR nukleové kyseliny. Tyto oligonukleotidy by měly být alespoň 15 baží dlouhé a měly by být odvozeny od nekonzervovaných regionů sekvence nukleové kyseliny receptoru. Sekvence mohou být odvozeny od sekvencí uvedených jako SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 nebo 14.
Oligonukleotidy, o kterých bylo zjištěno, že snižují expresi receptoru, mohou být derivatizovány nebo konjugovány pro další zvýšení své účinnosti. Například, nukleosid-fosforothioaty mohou být substituovány za své přirozené protějšky (viz Cohen, J., Oligodeoxynucleotides, Antisense Inhibitors of Gene Expresion, CRC Press (1989)). Oligonukleotidy mohou být podány pacientovi in vivo za účelem inhibice exprese DRR. Pokud je prováděno toto podání, tak je výhodné, aby byl oligonukleotid podán ve formě, která zvyšuje jeho vychytávání buňkami. Například, oligonukleotid může být podán v liposomech nebo může být konjugován na peptid, který je tráven buňkami (viz například U.S. patenty č. 4897355 a 4394448; viz též non-US patentové přihlášky WO 8903849 a EP 0263740) . Jiné způsoby pro zvýšení účinnosti podání • · • · • · • · · « · · · • * · · · · · • ····· ·· ♦ oligonukleotidů jsou dobře známé v oboru a jsou také použitelné v předkládaném vynálezu.
Po předešlém popisu předkládaného vynálezu bude tento vynález dále vysvětlen v následujících příkladech, které jsou uvedeny pouze pro dokreslení vynálezu a nijak neomezují jeho rozsah.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Klonování krysího DRR-1
Izolace cDNA fragmentu
Byly syntetizovány degenerované oligonukleotidy k vysoce konzervovaným regionům receptorů spřažených s G-proteinem (transmembránové překlenující domény 2 a 7) s následujícími sekvencemi nukleotidů:
5’ GG CCG TCG ACT TCA TCG TC(A/T) (A/C)(T/C)C TI(G/T) CI(T/C) TIG C(A/C/G/T)G 3’ (TM2: kóduj ící) SEQ ID NO: 15; a
5’ (A/G)(C/A/T)(A/T) (A/G)CA (A/G)TA IATIATIGG (A/G)TT 3’ (TM7:protismyslná) SEQ ID NO: 16.
Póly A+ mRNA byla izolována z kultivovaných fetálních krysích ganglií zadních kořenů míšních (Sprague-Dawley). mRNA byla reverzně transkribována za použití First strand cDNA Synthesis kitu (Pharmacia Biotech), byla amplifikována polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití Ampli-Taq DNA (Perkin-Elmer Cetus) polymerasy za následujících podmínek: 3 minuty při 94 °C, 40 cyklů o 1 minutě při 94 °C, 45 °C a 72 °C. Byl izolován cDNA PCR fragment odpovídající přibližně 650 bp a tento fragment byl subklonován do pGEM-T-vektoru (Promega Corporation). Nukleotidová • · sekvence rekombinantního klonu byla určena za použití T7-dideoxy Chain termination sekvencovacího kitu {Pharmacia Biotech) a při průzkumu Genbank/EMBL databází bylo zjištěno, že je jedinečná.
Kompletní krysí DRR-1 sekvence byla získána z krysí genomové DNA za použití 650 bp fragmentu a Promotor Finder DNA Walking kitu (Clontech, katal. č. K1806-1). Kit obsahuje pět knihoven neklonovaných, na adaptor navázaných fragmentů genomové DNA.
Postup vyžaduje dvě postupné PCR reakce. Obě reakce byly provedeny za použití Advantage tth Polymerasa Mix, která byla také získána od Clontech, podle postupu doporučovaného výrobcem. První PCR reakce byla provedena za použití zevního adaptorového primeru (API) obsaženého v kitu a zevního, genově specifického primeru (GSPl) odvozeného od sekvence DRR-1 PCR fragmentu. Primární PCR směsi byly ředěny a byly použity jako templáty pro sekundární (nested) PCR reakci s nested adaptorovým primerem (AP2) a (nested) genově specifickým primerem (GSP2). Pro získání sekvence krysího DRR-1 genu před sekvencí původního PCR fragmentu byly použity následující oligonukleotidy:
GSPl: oligo YF3B59-B, 5‘-CGCAGATGAGGTAGTACAGCATCAC SEQ ID NO: 17
GSPl: oligo MML-R.1, 5‘- CTGTGAGAGAGATGGTAACATACAG SEQ ID NO: 18
Z první knihovny byl získán fragment AP2-MMLR1 velikosti 1,9 kb a ze třetí knihovny byl získán fragment velikosti přibližně 1,0 kb. Pro získání sekvence za známou sekvencí byly použity následující primery:
GSPl: oligo YF3B59-F2, 5‘-GCATCCTTGACTGGTTCTTCTCAG SEQ ID NO: 19 GSP2: oligo MML-F1, 5 GGGTGAGACTCATCATCATTTGTGG. SEQ ID N0:20 • ·
Fragment MMLF1-AP2 velikosti přibližně 1 kb byl získán z první knihovny a fragment velikosti přibližně 600 bp byl získán ze třetí knihovny. Složená sekvence velikosti 1154 nukleotidů obsahující kompletní předpokládaný otevřený čtecí rámec DRR-1 je uvedena na obr. 1. Otevřený čtecí rámec kóduje protein obsahující 337 aminokyselin (obr. 2) s předpokládanou molekulovou hmotností 38,7 kDa. Proteinová sekvence obsahuje všechny charakteristické vlastnosti receptorů spřažených s G-proteinem: sedm hydrofobních šroubovic pravděpodobně představujících transmebránové domény, potenciální glykosylační místo na N-terminální extracelulární doméně (pozice 30) a konzervovanou NPXXY sekvenci v pozici 285-289.
Příklad 2: Klonování genů pro lidské DRR receptory
Dva přístupy byly použity pro identifikaci a klonování nových lidských DNA sekvencí homologických a/nebo příbuzných s krysím DRR-1 genem. V prvním přístupu byla lidská genomová knihovna vyšetřována v lambda vektoru, Fix II (STratagene katal. č.
946203) . Přibližně 106 lidských genomových klonů bylo umístěno na plotny a přeneseno na nitrocelulosové membrány pro hybridizaci s kompletní, 32P-značenou krysí DRR-1 sekvencí jako sondou. Hybridizace byla provedena při 42 °C přes noc. Filtry byly promyty při teplotě okolí při nízké přísnosti (IX SSC/0,1% SDS) pro umožnění detekce příbuzných, ale ne nutně identických sekvencí.
Insertovaná lidská DNA přítomná v pozitivních fágách byla amplifikována PCR za použití Expand PCR kitu od Boehringer Mannheim za podmínek umožňujících přesnou amplifikaci velmi velkých fragmentů DNA. Tyto dlouhé fragmenty DNA byly tráveny různými restrikčními enzymy a byly subklonovány do plasmidového vektoru. Části těchto klonů, které hybridizovaly s krysí DRR-1 genovou sondou, byly sekvencovány za použití ABI cycle • · • · · · · • · ·* sekvencovacího kitu.
Druhý přístup pro identifikaci nových lidských sekvencí příbuzných k DRR-1 spočívá v použití polymerasové řetězové reakce (PCR) provedené na celkové lidské DNA. Primery byly syntetizovány podle lidských genomových klonů popsaných výše a měly následující sekvence:
HML.H, 5’-GCAAGCTTTCTGAGCATGGATCCAACCGTC, SEQ ID 21 a HML.Bg, 5’-CCCTCAGATCTCCAATTTGCTTCCCGACAG. SEQ ID NO:22.
Po amplifikaci se získaly fragmenty velikosti přibližně 1 kb obsahující celou kódující sekvenci lidských genů. Tyto získané fragmenty byly subklonovány do pGEM-T (Promega) vektoru pro analýzu sekvence DNA.
Za použití výše uvedených strategií bylo izolováno šest lidských klonů:
klon 7, SEQ ID NO: 3a 4;
klon 18, SEQ ID NO: 5 a 6;
klon 23, SEQ ID NO: 7 a 8;
klon 24, SEQ ID NO: 9 a 10;
klon 36, SEQ ID NO: 11 a 12;
klon 40, SEQ ID NO: 13 a 14.
Žádný z těchto klonů neobsahoval introny a jejich seřazení je uvedeno na obr. 3.
Na aminokyselinové úrovni je krysí DRR-1 klon ze 47% až 49% identický s lidskými klony.
Na úrovni nukleových kyselin je krysí DRR-1 klon z 56% až 58% • · • · • · · 4 · ··· «··· · · » « ···· ···· ···· • ······· · ····· · « * ··· · · · ···· • 4 · ·· · « ·« »· identický s lidskými klony. Hladina identity sekvence mezi lidskými klony (7, 18, 23, 24, 36, 40) je velmi vysoká, od 77% do 98% na úrovni aminokyselin. Všechny lidské sekvence byly použity jako vzory pro vyhledáváni homologických sekvencí v publikovaných databázích (Genbank, Swissprot, EST). Nebyly zjištěny žádné identické sekvence. Nejvíce příbuznými sekvencemi byly proteiny rodiny mas onkogenu. Celková homologie aminokyselinové sekvence mezi krysím DRR-1 a jakýmkoliv z izolovaných lidských genů se pohybovala od 47% do 50%. Nicméně, určité úseky vykazovaly mnohem vyšší homologii sekvence, zejména regiony kódující domnělou transmembránovou doménu III a VII (TM3 a TM7) a intracelulární smyčky 2 a 3, kde byly homologie mezi krysí sekvencí a lidským homologem přibližně 80%.
Příklad 3: Pokusy s hybridizací in šitu
Příprava tkáně: Samci dospělých Sprague-Dawley krys (přibližně 300 g, Charles River, S. Constant, Quebec) byly usmrceni dekapitací. Byly odebrány mozky a míchy s ganglii zadních kořenů, byly rychle zmrazený v isopentanu při -40 °C během 20 sekund a byly uskladněny při -80 °C. Zmrazené lidské mozky, míchy a ganglia zadních kořenů míšních byly získány od Brain and Tissue Bank for Devolopmental Disorders, University of Maryland v Baltimore, v souladu s přísnými etickými předpisi. Zmrazená tkáň byla nařezána v 14 m na Microm HM 500 M kryostatu (Germany) a byla v roztátém stavu umístěna na ProbeOn Plus sklíčka (Fisher Scientifics, Montreal, Quebec). Řezy byly uloženy při -80 °C do hybridizace in šitu.
Syntéza ribosond: Plasmid pGemT-3b32 GPCR byl linearizován za použití bud' SacII, nebo Notl restrikčního enzymu. Kódující a protismyslné DRR ribosondy byly transkribovány in vitro za použití buď T7, nebo SP6 RNA polymerasy (Pharmacia Biotech), v příslušném « * ·
pořadí, v přítomnosti (35S)UTP (přibližně 800 Ci/mmol; Amersham, Oakville, Ontario). Plasmid pGemT-Clone 36 GPCR byl linearizován za použití restrikčních enzymů SacII a Pstl. Kódující a protismyslné Clon36 ribosondy byly transkribovány in vitro za použití buď SP6, nebo T7 RNA polymerasy (Pharmacia Biotech), v příslušném pořadí, v přítomnosti (35S)UTP. Po transkripci byl DNA templát tráven DNAsou I {Pharmacia). Ribosondy byly přečištěny fenol/chloroform/isoamyl/alkoholovou extrakcí a byly vysráženy v 70% ethanolu obsahujícím octan amonný a tRNA. Kvalita značených ribosond byla potvrzena elektroforesou na polyakrylamidovém-močovinovém gelu.
Hybridizace in šitu: Řezy byly post-fixovány ve 4% paraformaldehydu (BDH, Poole, England) v 0,1 M fosfátovém pufru (pH 7,4) po dobu 10 minut při teplotě okolí a byly vymyty třikrát 2X standardním citratovým pufrem (SSC; 0,15 M NaCl, 0,015 M citrát sodný, pH 7,0) . Řezy byly potom uvedeny do rovnováhy v 0,1 M triethanolaminu, byly zpracovány 0,25% anhydridem kyseliny octové v triethanolaminu, byly vypláchnuty ve 2X SSC a byly dehydratovány v ethanolové sérii (50-100%). Hybridizace byla provedena v pufru obsahujícím 75% formamid (Sigma, St. Louis, MO) , 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, IX Denhartova roztoku (Sigma), 50 g/ml denaturované lososí spermatické DNA (Sigma) , 50/*g/ml kvasinkové tRNA (Sigma), 10% dextran síran (Sigma), 20 mM dithiothreitol a (35S)UTP-značené cRNA sondy (10 x 106cpm/ml) při 55 °C během 18 hodin ve zvlhčované komůrce. Po hybridizaci byla sklíčka promyta ve 2X SSC při teplotě okolí, byla zpracovávána 20 g/ml RNAsy IA (Pharmacia) v RNAsovém pufru (10 ml Tris, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) po dobu 45 minut a byla promyta na konečnou přísnost 0,lxSSC při 65 °C. Řezy byly potom dehydratovány a exponovány na Kodak Biomax MR filmu po dobu 21 dnů a/nebo ponořeny do Kodak NTB2 emulse ředěné 1:1 destilovanou vodou a exponovány po dobu 4-6 týdnů při 4 °C před vyvíjením a • · • · • · • · · • · · ···· · • · · · ···· · • ······· · ·«··· • · · · · · · · · ·· kontrastním barvením cresyl-violeť-acetatem (Sigma).
Výsledky: Ze všech regionů vyšetřovaných v nervovém systému krys byla DRR-1 mRNA exprimována výlučně v gangliích zadních kořenů míšních. Emulsní autoradiografie s vysokou rozlišovací schopností ukázala akumulaci stříbrných zrn výlučně v neuronech s malou a střední velikostí. Tento jedinečný a vysoce omezený charakter distribuce DRR-1 byl potvrzen v krysím embryu. Sagitální řez E17 krysím plodem ukázal, že DRR-1 mRNA je omezena na ganglia zadních kořenů míšních. V žádných dalších strukturách krysího embrya nebyl detekován žádný specifický hybridizační signál, což potvrzuje -vysoce selektivní charakter exprese DRR-1.
Exprese receptoru lidského klonu 36 byla přítomná ve fetálních gangliích zadních kořenů míšních, ale nikoliv v míše. Specifický hybridizační signál pro klon 36 nebyl detekován v žádné dosud vyšetřované lidské dospělé tkáni CNS. Mezi tyto vyšetřované tkáně patří mícha, kůra mozková, hippocampus, thalamus, substantia nigra a periaquaductální šedá hmota (data nejsou uvedena). Přítomnost mRNA klonu 36 v gangliích zadních kořenů míšních dospělých jedinců musí být ještě vyšetřena. Standardní kontroly, ve kterých byly další řezy míchou s gangliemi zadních kořenů hybridizovány s DRR-1 protismyslnými nebo klon 36 kódujícími sondami značenými 35S, neukázaly žádný specifický hybridizační signál.
Příklad 4: Northemové přenosy
Komerční krysí a lidské membrány pro northernové přenosy obsahující 2 g póly A RNA z různých tkání (Clontech) byly použity pro stanovení exprese a distribuce krysí DRR-1 mRNA a jejích lidských homologů. Radioaktivně značené sondy byly připraveny následujícím způsobem:25 ng 650 bp 3b-32 PCR fragmentu získaného z krysího DRR-1 viz příklad 1) nebo lidského kolnu 36 bylo náhodně • · · • · · · • · · v · • ·····«· • · « · • · · · · značeno za použití Ready-to-Go DNA značkovacího kitu (Pharmacia Biotech) a (32P)CTP (3000 Ci/mmol/Amersham). Membrána byla prehybridizována po dobu 1 hodiny při 68 °C za použití Expresshyb (Clontech) a potom byla provedena hybridizace (2x106 cpm/ml sondy) po dobu 1 hodiny za použití stejných podmínek. Membrány byly promyty při teplotě okolí ve 2X SSC, 0,05% SDS po dobu 30 minut a potom byly provedeny 3 promytí ve 0,2X SSC, 1% SDS při 50 °C po dobu 60 minut a membrány byly exponovány při -80 °C na Kodak Biomax filmu po dobu 6 dnů.
Exprese a distribuce krysího DRR-1: Všechny studované krysí tkáně (srdce, mozek, slezina, plíce, kosterní sval, ledviny a varlata) byly negativní na expresi DRR-1 po 2 týdenní expozici, zatímco southernová analýza krysího genomu ukázala 1,1 kb proužek při sondování stejným cDNA fragmentem.
Exprese a distribuce lidského klonu 36: Northernové membrány obsahující RNA z různých lidských tkání byly sondovány radioaktivně značeným DNA fragmentem z klonu 36. Všechny studované lidské tkáně (lidský fetální mozek, plíce, játra a ledviny a dospělý lidský mozeček, mozková kůra, prodloužená mícha, okcipitální lalok, frontální lalok, temporální lalok, putamen, mícha, amygdala, nucleus caudatus, corpus callosum, hippocampus, celý mozek, subtalamické jádro a thalamus) byly negativní z hlediska exprese tohoto receptorů po 2 týdenní expozici.
Příklad 5: Vápníková signalizace v odpovědi na angiotensin I-III
Kódující sekvence lidského klonu 24 byla přenesena do pcDNA3 vektoru a byla modifikována tak, aby přidávala haemaglutininovou koncovku na C-konec sekvence receptorů. Tento klon, označený pcDNA3-HML-HA24, byl transfektován do HEK293 buněk za použití modifikované CaCl2 metody (Maniatis, Molecular Cloning: A • · e ·
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Buňky byly kultivovány v kultivačním mediu při 37 °C, 5% C02 a byly ředěny 10-krát každé 3 dny.
Buňky byly naočkovány na 90 mm tkáňové kultivační disky (5 x 105 buněk na nádobu) v Dulbeccově modifikovaném esenciálním mediu (DMEM, Gibco BRL) doplněném 10% fetálním hovězím sérem (FBS), 100 U/ml penicilinu, 100 g/ml streptomycinu a 0,25 g/ml fungizonu. Jeden den po naočkování byly buňky dočasně transfektovány 30 g plasmidové DNA na disk. Buňky byly sklízeny 48 hodin po transfekci a byly analyzovány. Exprese genu byla nejprve potvrzena imunoprecipitací a westernovým přenosem s anti-haemaglutininovou protilátkou. Protein velikosti přibližně 43 kD byl detekován ve stabilně, stejně jako v přechodně transfektovaných HEK293 buňkách, ale nikoliv v kontrolních buňkách.
Stabilně transfektováné HEK293 buňky byly získány po přibližně 21 dnech selekce v kultivačním mediu obsahujícím 800 g/ml G418. Měření vápníkové signalizace bylo provedeno za použití jedné z těchto stabilně transfektovaných buněčných linií,
293/pcDNA3-HML-HA24. Buňky byly kultivovány na 24 mm okrouhlých sklíčkách do 50-70% konfluence. Po promytí buněk 1,8 NBS pufrem (135 mM Naci, 5 mM KC1, 1,2 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 5 mM glukosa a 10 mM HEPES, pH 7,3) byly buňky inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě okolí za přítomnosti 0,5 ml 3,5 M FURA-2AM (Molecular Probe, F-1221) ředěné v 1,8 NBS. Buňky byly potom třikrát promyty 1,8 NBS a byly inkubovány po dobu dalších 30 minut při teplotě okolí. Odstraňování vápníku bylo měřeno za použití PTI (Photon Technology International) D 104 fotometru vybaveného PTI Delta RAM High Speed osvětlovacím přístrojem s mnoha vlnovými délkami, PTI SC500 Shutter kontrolním zařízením, PTI LPS220 ARC zdrojem světla a PTI FELIX softwarem, v. 1.2. Byly vybrány skupiny 2 až 8 buněk a byly izolovány za použití membrány fotometru. Buňky byly vystaveny • · • · 4 4 4 44 44 ••4 · 4 4 · 4 4 · 4
44» 4 44 4 ····
4944944 4 44444 94 4 •4 4 94 4 444»
4 94 44 44 »4 světlu 340 a 380 nm a světlo vlnové délky 510 nm emitované buňkami bylo snímáno. Angiotensin I, II a II byly postupně přidávány - v různém pořadí v různých pokusech - a potom byl jako pozitivní kontrola přidán bradykinin. Při stimulaci angiotensinem II a III byla získána významná odpověď. Přidání angiotensinu I nevyvolalo žádou odpověď.
Všechny zde citované publikace jsou zde uvedeny jako odkazy. Z úplného popisu vynálezu bude odborníkům v oboru jasné, že vynález může být prováděn za použití různých podmínek, parametrů a podobně, bez toho, že by byl narušen rozsah vynálezu nebo jakéhokoliv jeho provedení.
• · • · · ·· ·· · · • · · · · · · · « · · • · · · · ·· · * «· · • · ···· · · · ··· · · · · · ·· · · · · · · · ··
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Přihlašovatel: Astra Pharma lne., Kanada (ii) Název vynálezu: Nový receptor spřažený s G-proteinem (iii) Počet sekvencí: 22 (iv) Adresa pro korespondenci:
(A) Adresa: Astra AB, Patent Department (B) Ulice: S-151 85 Sodertalje (C) Město: Sodertalje (D) Země:
(E) Stát: Švédsko (F) ZIP: ne (v) Počítačová čtecí forma:
(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (vi) Data^současné přihlášky:
(A) Číslo přihlášky:
(B) Datum podání:
(C) Klasifikace:
(ix) Telekomunikační informace:
(A) Telefon: 46-8 553 26000 (B) Telefax: 46-8 553 28820 (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 337 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Řetězec: není relevantní (D) Topologie: není relevantní (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:
• · • · • · · · · • · · · · 9 · · · · • · · · ·· · · 99 · • ···· · · · ··· · * · · ·· · · · · · · · ► · · ·· ·· · · · ·
MeC Val Cys Val Leu Arg Asp Thr Thr Gly Arg Phe Val Ser Met Asp
10 15
Pro Thr Ile Ser Ser .Leu Ser Thr Glu Ser Thr Thr Leu Asn Lys Thr
25 30
Gly His Pro Ser Cys Arg Pro Ile Leu Thr Leu Ser Phe Leu Val Pro
40 45
Ile Ile Thr Leu Leu Gly Leu Ala Gly Asn Thr Ile Val Leu Trp Leu
55 60
Leu Gly Phe Arg Met Arg Arg Lys Ala Ile Ser Val Tyr Val Leu Asn
70 15 80
Leu Ser Leu Ala Asp Ser Phe Phe Leu Cys Cys His Phe Ile Asp Ser
90 95
Leu Met Arg Ile Met Asn Phe Tyr Gly Ile Tyr Ala His Lys Leu Ser
100 105 110
Lys Glu Ile Leu Gly Asn Val Ala Phe Ile Pro Tyr Ile Ser Gly Leu
115 120 125
Ser Ile Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp
130
135
140 • ·
Pro Ile Trp Tyr His Cys His Arg
145 150
Cys Val Leu Ile Trp Val Leu Ser
165
Phe Phe Ser Gly Phe Leu Gly Glu
180
Val Asp Phe Ile Val Thr Ala Phe
195 200
Phe Gly Ser Ser Leu Ala Leu Leu
210 215
Arg Lys Pro Leu Ser Arg Leu Tyr
225 230
Val Tyr Leu Ile Cys Gly Leu Pro
245
Tyr Trp Phe Gly Ile His Leu His
260
Val Thr Val Leu Leu Ser Cys Val
Pro Arg Asn Met Ser Ala Ile Ile
155 160
Phe Leu Met Gly Ile Leu Asp Trp
170 175
Thr His His His Leu Trp Lys Asn
185 190
Leu Ile Phe Leu Phe Met Leu Leu
205
VaL Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg
220
Val Thr Ile Ser Leu Thr Val Met
235 240
Leu Gly Leu Tyr Leu Phe Leu Leu
250 255
Tyr Pro Phe Cys His Ile Tyr Gin
265 270
Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile
275
280
2B5 »· 4 4 4
Tyr Phe Leu Val Gly Ser Phe Arg His Arg Lys Lys His Arg Ser Leu
290 295 300
Lys Met Val Leu Lys Arg Ala Leu Glu Glu Thr Pro Glu Glu Asp Glu
305 310 315 320
Tyr Thr Asp Ser His Val Gin Lys Pro Thr Glu Ile Ser Glu Arg Arg
325 330 335 (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 1011 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
ATGGTTTGTG TTCTCAGGGA CACTACTGGA AGATTTGTGA GCATGGATCC AACCATCTCA 60
TCCCTCAGTA CAGAATCTAC AACACTGAAT AAAACTGGTC ATCCCAGTTG CAGGCCAATC 120
CTCACCCTGT CCTTCCTGGT CCCCATCATC ACCCTGCTTG GATTGGCAGG AAACACCATT 180
GTACTCTGGC TCTTGGGATT CCGCATGCGC AGGAAAGCCA TCTCAGTCTA CGTCCTCAAC 240
CTGTCTCTGG CAGACTCCTT CTTCCTCTGC TGCCATTTTA TTGACTCTCT GATGCGGATC 300
ATGAACTTCT ATGGCATCTA TGCCCATAAA TTAAGCAAAG AAATCTTAGG CAATGTAGCA 360
TTCATTCCCT ATATCTCAGG CCTGAGCATC CTCAGTGCTA TCAGCACGGA GCGCTGCCTG 420
• · ··· · · · · ···· • ··· · ·· · · ·· ·
33 • · · • · · ·
TCTGTATTGT GGCCAATCTG GTACCACTGC CACCGCCCAA GAAACATGTC AGCTATTATA 480
TGTGTTCTAA TCTGGGTTCT GTCCTTTCTC ATGGGCATCC TTGACTGGTT TTTCTCAGGA 540
TTCCTGGGTG AGACTCACCA TCATTTGTGG AAAAATGTTG ACTTTATTGT AACTGCATTT 600
CTGATTTTTT TATTTATGCT TCTCTTTGGG TCCAGTCTGG CGCTACTGGT GAGGATCCTC 660
TGTGGTTCCA GACGGAAAGC ACTGTCCAGG CTGTACGTTA CAATCTCTCT CACAGTGATG 720
GTCTACCTCA TCTGCGGCCT GCCTCTCGGG CTTTACTTGT TCCTGCTATA TTGGTTTGGG 780
ATCCATTTAC attatccctt TTGTCACATT TACCAAGTTA CTGTGCTCCT GTCCTGTGTG 840
AACAGCTCTG CCAACCCCAT CATTTACTTC CTTGTAGGGT CCTTTAGGCA CCGTAAAAAG 900
CATCGGTCCC TCAAAATGGT TCTTAAAAGG GCTCTGGAGG AGACTCCTGA GGAGGATGAA 960
TATACAGACA GCCATGTTCA GAAACCCACT GAGATCTCAG AAAGGAGATG T 1011
(2) Informace pro SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 322 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Řetězec: není relevantní (D) Topologie: není relevantní • · • · · · • · β · · • ·«····» • · ♦ · • · · •· ·« ·· • · · · · . .
• · · · · · « ····♦· .. β • · · · ♦ · • · · · · · (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Met Asp Pro Thr Ile Pro Val Leu Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn
5 10 15
Gly Arg Glu Glu Thr Pro cys Tyr Asn Gin Thr Leu ser Phe Thr Gly
25 30
Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Ala Leu Thr Gly Asn Ala Val Val
40 45
Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr
55 60
Ile Leu Asn Leu Val Ala Ala Asn Phe Leu Phe Leu Ser Gly His Ile
70 75 80
Ile Phe Ser Pro Leu Pro Leu Ile Asn Ile Arg His Pro Ile Ser Lys
90 95
Ile Leu Ser Pro Val Mec Thr Phe Pro Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Met
100
105
110
Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu
115 120
Trp Tyr His Cys Arg Arg Pro Arg Tyr Leu
130 135
Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser
145 150
Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asn Ser
165 170
Asp Phe Ile Thr Ile Ala Trp Leu Val Phe
180 185
Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile
195 200
Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile
210 215
Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile
225 230
Arg Ile His Leu Asp Trp Lys Val Leu Phe
245 250
Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser *·· ·» · · ♦ · · · • · · · · · · ·««· • ·»· · · · · · « · v • ·*····· · ····· · * · ·· » · · · ···· • · · ·· ·· ·· · ·
Ser Ile Leu Trp Pro Ile
125
Ser Ser Val Met Cys Val
140
Ile Leu Glu Trp Met Phe
155 160
Val Trp Cys Glu Thr Ser
175
Leu Cys Val Val Leu Cys
190
Leu Cys Gly Ser Arg Lys
205
Leu Leu Thr Val Leu Val
220
Gin Trp Ala Leu Phe Ser
235 240
Cys His Val His Leu Val 255
Ala Asn Pro Ile Ile Tyr
260
265
270 • · » · · • · · · • · · · · • ······· • · ·
Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gin Arg Gin Asn Arg Gin Asn Leu Lys 275 280 285
Leu Val Leu Gin Arg Ala Leu Gin Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly 290 295 800
Gly Gly Trp Leu Pro Gin Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu 305 31° 315 320
Glu Gin (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 969 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
ATGGATCCAA CCATCCCAGT CTTGGGTACA AAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 50
ACTCGTTGCT ACAACCAAAC CCTGAGCTTC ACGGGGCTGA CGTGCATCAT TTCCCTTGTC 120
GCGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180
GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGTCGCG GCCAACTTCC TCTTCCTTAG CGGCCACATT 240 • · · · · ♦ • ·
ATATTTTCGC CGTTACCCCT CATCAATATC CGCCATCCCA TCTCCAAAAT CCTCAGTCCT 300
GTGATGACCT TTCCCTACTT TATAGGCCTA AGCATGCTGA GCGCCATCAG CACCGAGCGC 360
TGCCTGTCCA TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CACTGCCGCC GCCCCAGATA CCTGTCATCG 420
GTCATGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCTGTCC CTGCTGCGGA GTATCCTGGA GTGGATGTTC 480
TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTAATTCT GTTTGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATTACA 540
ATCGCGTGGC TGGTTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600
AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTCCTC 660
ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTGGGC CCTGTTTTCC 720
AGGATCCACC TGGATTGGAA AGTCTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC cattttcctg 780
TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG 840
CGTCAAAATA GGCAAAACCT GAAGCTGGTT CTCCAAAGGG CTCTGCAGGA CACGCCTGAG 900
GTGGATGAAG GTGGAGGGTG GCTTCCTCAG GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960
GAGCAGTGA
969 »· · »· »· ·· ··· · -» » · «Oř,.
» · · · ··«« β • ······· i · · · » · r • · · · « · ·*·>
*r · ·’ ·· ·· (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 322 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Řetězec: není relevantní (D) Topologie: není relevantní (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne
xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Met Asp Pro Thr Val Pro Val Leu Gly Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn
1 5 10 15
Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Lys Gin Thr Leu Ser Phe Thr Gly
20 25 30
Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Ala Leu Thr Gly Asn Ala Val Val
35 40 45
Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr
50 55 60
Ile Leu Asn Leu Val Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly His Ile
65 70 75 80
Ile Cys Ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Pro Ile Ser Lys
55 90 95
Zle Leu Ser Pro Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Met
100
105
110 «
·· · • # » • » * • · · · • · • · • * 9 - φ « β
Leu Asn. Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Ile Leu Trp Pro Ile
115 120 125
Trp Tyr His Cys Arg Arg Pro Arg Tyr Leu Ser Ser Val Met Cys Val
130 135 140
Leu Leu Trp Ala Pro Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Phe
145 150 155 160
Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Val Arg Cys Glu Thr Ser
165 170 175
Asp Phe Ile Thr Ile Ala Trp Leu Val Phe Leu Arg Val Val Leu Cys
180 185 190
Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys
195 200 205
Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val
210 215 220
Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gin Trp Ala Leu Phe Ser 225 230 235 240
Arg Ile His Leu Asp Trp Lys Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val
245
250
255 • · • · • · * · · · · · · · · *··· ··*» ···« • ······» · · · · · · · · · *0* · · · · · · · ·’ ♦ «... ....
i
Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tvr !
i
250 265 270
Phe Phe Mec Gly Ser Phe Arg Gin Leu Gin Asn Arg Lys Thr Leu Lys
275 280 285
Leu Val Leu Gin Arg Asp Leu Gin Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly
290 295 300
Gly Trp Trp Leu Pro Gin Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu
305 310 315 320
Glu Ile (2) Informace pro SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 969 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
ATGGATCCAA CCGTCCCAGT CTTGGGTACA GAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60
ACTCCTTGCT ACAAGCAGAC CCTGAGCTTC ACGGGGCTGA CGTGCATCGT TTCCCTTGTC 120
GCGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180
GTCTCCATCT acatcctcaa CCTGGTCGCG GCCGACTTCC TCTTCCTTAG CGGCCACATT 240
ATATGTTCGC CGTTACGCCT CATCAATATC AGCCATCCCA TCTCCAAAAT CCTCAGTCCT 300
GTGATGACCT TTCCCTACTT TATAGGCCTA AGCATGCTGA ACGCCATCAG CACCGAGCGC 360 • ·
TGCCTGTCCA TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CACTGCCGCC GCCCCAGATA CCTGTCATCG 420
GTCATGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCCGTCC CTGCTGCGGA GTATCCTGGA GTGGATGTTC 480
TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTGATTCT gttcggtgtg AAACGTCAGA TTTCATTACA 540
ATCGCGTGGC TGGTTTTTTT ACGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 500
aggattctct GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTCCTC 660
ACAGTGCTGG rp <» tr* «τ' r· ** (·* r* *τ» CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTGGGC 720
aggatccacc TGGATTGGAA AGTGTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC CATTTTCCTC· 730
TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACGCCATC ATTTACTTCT TCATGGGCTC CTTTAGGCAG 840
CTTCAAAACA GGAAGACCCT CAAGCTGGTT CTCCAGAGGG ATCTGCAGGA CAC3CCTGAG 900
GTGGATGAAG GTGGATGGTG gcttcctcag GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960
GAGA7C7GA 969 (2) Informace pro SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 322 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Řetězec: není relevantní (D) Topologie: není relevantní • · « · · ···· ··· • ··· · · · · · ·« • ·····»· · · · · · * · * (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
Mac Asp Pro Thr Val Ser Thr Leu Asp Thr Glu Leu Thr Pro lis Asn
10 15
Gly Thr Glu Glu Thr Leu Cys Tyr Lys Gin Thr Leu Ser Leu Thr Val
25 30
Leu Thr Cys Xle Val Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val
40 45
Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr
S0 55 60
Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly Arg Leu
70 75 80
Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Phe Ile Ser Ile Pro His Thr Ile Ser Lys
90 95
Ile Leu Tyr Pro Val Met Met Phe Ser Tyr Phe Ala Gly Leu Asn Phe
100 105 110
Leu Ser Ala Val Ser Thr Asp Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile
115 120 125
Trp Tyr Arg Cys His Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val
130
135
140 • · · « · · • · · · * · · · « · • · « • · ·
Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu
145 150
Cys Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala
165
Asp Phe Ile Thr Val Ala Trp Leu
ISO
Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Ile
195 200
Arg Ser Ile Leu Glu Trp Mec Leu
155 160
Asp Ser Ala Trp Cys Gin Thr Ser
170 _ 175
Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys
185 190
Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys
205
Ile Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val
210 215 220
Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Gin Phe Phe Leu Phe Leu
225 230 235 240
Trp Ile His Val Asp Arg Glu Val Leu Phe Cys His Val His Leu Val
245 250 255
Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr
250 265 270
Phe Phe Val Gly Ser Leu Arg Gin Arg Gin Asn Arg Gin Asn Leu Lys
275 280 285 • · • ·
Leu Val Leu Gin Arg Ala Leu Gin Asp Thr Pro Glu Val Asp Glu Gly 290 295 300
Gly Gly Trp Leu Pro Gin Glu Thr Leu Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu
305
310
320
Glu Gin (2) Informace pro SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 969 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
ATGGATCCAA CCGTCTCAAC CTTGGACACA GAACTGACAC CAATCAACGG AACTGAGGAG
ACTCTTTGCT ACAAGCAGAC CTTGAGCCTC ACGGTGCTGA CGTGCATCGT TTCCCTTGTC
GGGCTGACAG GAAACGCAGT TGTACTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCG 130
TTCTCCATCT ACATCCTCAA CTTGGCCGCA GCAGACTTCG TCTTCCTCAG CGGCCGCCTT 240
ATATATTCCC TGTTAAGCTT CATCAGTATC CCCCATACCA TCTCTAAAAT CCTCTATCCT 300
GTGATGATGT TTTCCTACTT TGCAGGCCTG AACTTTCTGA GTGCCGTGAG CACCGATCGG 3ó0
TGCCTGTCCG TCGTGTGGCC CATCTGGTAC CGCTGCCACC GCCCCACACA CCTGTCAGCG 420
GTGGTGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCTGTCC CTGCTGCGGA GCATCCTGGA ATGGATGTTA 480 • · • · • · ··· ···· · · · a ·*·· · · · · ···· • ······· · ····· · · »
TGTGGCTTCC TGTTCAGTGG TGCTGATTCT GCTTGGTGTC AAACATCAGA TTTCATCACA 540
GTCGCGTGGC TGATTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGATC 600
AGGATTCTCT GTGGATCCCG GAAGATACCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTGCTC 660
ACAGTACTGG TCTTCCTCCT CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTTTTT CCTATTTTTA '20
TGGATCCACG TGGACAGGGA AGTCTTATTT TGTCATGTGC ATCTAGTTTC CATTTTCCTG 780
TCCGCTCTTA ACAGCAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CCTTAGGCAG 840
CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAGAGGG CTCTGCAGGA CACGCCTGAG 900
GTGGATGAAG GTGGAGGGTG GCTTCCTCAG GAAACCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAGATTG 960
GAGCAGTGA 969 (2) Informace pro SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 322 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Řetězec: není relevantní (D) Topologie: není relevantní (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
• · · * · • ♦ • · • · « ·
Met Asp Pro Thr Val Ser Thr Leu Asp Thr Glu Leu Thr Pro Ile Asn
10 15
Gly Thr Glu Glu Thr Leu Cys Tyr Lys Gin Thr Leu Ser Leu Thr Val
Leu Thr Cys Ile Val Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val
40 45
Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Phe Ser Ile Tyr
55 60
Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Gly Arg Leu
70 75 80
Ile Tyr Ser Leu Leu Ser Phe Ile Ser Ile Pro His Thr Ile Ser Lys
90 95
Ile Leu Tyr Pro Val Met Met Phe Ser Tyr Phe Ala Gly Leu Ser Phe
100 105 110
Leu Ser Ala Val Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile
115 120 125
Trp Tyr Arg Cys His Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val
130 135 140
Leu Leu Trp Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ser Ile Leu Glu Trp Met Leu
145 150 155 160
Cys Gly Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ala Trp Cys Gin Thr Ser
165
170
175
Asp Phe lie Thr Val Ala Trp Leu Ile Phe
180 185
Gly Ser Ser Leu Val Leu Leu Ile Arg Ile
195 200
lie Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile
210 215
Phe Leu Leu Cys C-ly Leu Pro Phe Gly Ile
225 230
Trp Ile His Val Asp Arg Glu Val Leu Phe
245 250
Ser Ile Phe Leu Ser Ala Leu Asn Ser Ser
260 265
Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gin Arg Gin
275 230
Leu Val Leu Gin Arg Ala Leu Gin Asp Ala
290 295
Gly Gly Gin Leu Pro Gin Glu Thr Leu Glu
305 310 <«· 4 4 4 · · » ♦ ♦ «··« · 4 · · »··« • 4 4 4 4 4 «· · 4 4 4 4 4 ·· · • 4 » 4 4 · 4 4·· • · * 4 4 4 · ·· · ·
Cys Val Val Leu Cys i
190
Cys Gly Ser Arg Lys
205
Leu Thr Val Leu Val
220
Phe Phe Leu Phe Leu
240
His Val His Leu Val
255
Asn Pro Ile Ile Tyr
270
Arg Gin Asn Leu Lys
285
Glu Val Asp Glu Gly
300
Ser Gly Ser Arg Leu
320
Glu Gin • · • 4 • « • 4 · ···< ···« « · · · · ·* · · · * β • ······· · ····« ·· · ·' · ··’ ·· ·· *··* (2) Informace pro SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 969 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
ATGGATCCAA CGGTCTCAAC CTTGGACACA GAATTGACAC CAATCAACGG AACTGAGGAG 60
ACTCTTTGCT ACAAGCAGAC CTTGAGCCTC ACGGTGCTGA CGTGCATCGT TTCCCTTGTC 120
GGGCTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCC 180
TTCTCCATCT ACATCCTCAA CTTGGCCGCA GCAGACTTCC TCTTCCTCAG CGGCCGCCTT 240
ATATATTCCC TGTTAAGCTT CATCAGTATC CCCCATACCA TCTCTAAAAT CCTCTATCCT 300
GTGATGATGT TTTCCTACTT TGCAGGCCTG AGCTTTCTGA GTGCCGTGAG CACCGAGCGC 360
TGCCTGTCCG TCCTGTGGCC CATCTGGTAC CGCTGCCACC GCCCCACACA CCTGTCAGCG 420
GTGGTGTGTG TCCTGCTCTG GGCCCTGTCC CTGCTGCGGA GCATCCTGGA GTGGATGTTA 480
TGTGGCTTCC TGTTCAGTGG TGCTGATTCT GCTTGGTGTC AAACATCAGA TTTCATCACA 540
GTCGCGTGGC TGATTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGGGT CCAGCCTGGT CCTGCTGATC 600
AGGATTCŤCT GTGGATCCCG GAAGATACCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTGCTC 660
• · • · • ·
ACAGTACTGG *P Γ* £ f* rp CTGTGGCCTG CCCTTTGGCA TTCAGTTTTT 720
TGGATCCACG TGGACAGGGA. AGTCTTATTT TGTCATGTTC ATCTAGTTTC TATTTTCCTG 7S0
TCCGCTCTTA ACAGCAGT GC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG . 340
CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAGAGGG CTCTGCAGGA CGCGTCTGAG 900
GTGGATGAAG GTGGAGGGCA GCTTCCTGAG GAAATCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAGATTG 9Ó0
GAGCAGTGA 959 (2) Informace pro SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 322 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Řetězec: není relevantní (D) Topologie: není relevantní (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
Mec Asp Pro Thr Val Pro Val Leu Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn
I 5 10 .15
Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Lys Gin Thr Leu Ser Phe Thr Val • · • · · ··«· ···· ···· ···· · · · · • ······· · ····· « · · ······«··· ·· · ♦· ·· ·· ··
Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val val
40 45
Leu Trp Leu Leu Gly Cys Arg Met Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr
55 60
Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Phe Gin Ile
70 5 80
Ile Cys Arg Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Leu Ile Arg Lys
90 95
Ile Leu Val Ser Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Thr Gly Leu Ser Met
100 105 110
Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile
115 120 125
Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val
130 135 140
Leu Leu Trp Ala Gly Leu Leu Leu Phe Ser Met Leu Glu Trp Are Phe
1^5 ISO 155 ISO
Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ser Trp Cys Glu Thr Ser
165 170 175
Asp Phe Ile Pro Val Ala Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys
130
185
190 • *
Val Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys
195 200 205
Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val
210 215 220
Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Leu Gly Ala Leu Ile Tyr
225 230 235 240
Arg Met His Leu Asn Leu Glu Val Leu Tyr Cys His Val Tyr Leu Val
245 250 255
Cys Met Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr
260 265 270
Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gin Arg Gin Asn Arg Gin Asn Leu Lys
275 280 285
Leu Val Leu Gin Arg Ala Leu Gin Asp Lys Pro Glu Val Asp Lys Gly
290 295 300
Glu Gly Gin Leu Pro Glu Glu Ser Leu Glu Leu Ser Gly Arg Arg Leu
305 310 315 320
Gly Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 969 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý • · « · · · · • · · ···· ··«· ···· ···· ···· • ······· · ····· · · · (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
ATGGATCCAA CCGTCCCAGT CTTGGGTACA AAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60
ACTCCTTGCT ACAAGCAGAC CCTGAGCTTC ACGGTGCTGA CGTGCATCAT TTCCCTTGTC 120
GGACTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT GCCGCATGCG CAGGAACGCT 180
GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGCCGCA GCAGACTTCC TCTTCCTCAG CTTCCAAATT 240
ATACGTTCGC CATTACGCCT CATCAATATC AGCCATCTCA T C CG CAAAAT £ i~rr* Λ^η-ifjirrMRirR 300
GTGATGACCT TACAGGCCTG AGTATGCTGA GCGCCATCAG CACCGAGCGC 360
TGCCTGTCTG TTCTGTGOCC CATCTGGTAC CGCTGCCGCC GCCCCACACA cctgtcagcg 420
GTCGTGTGTG TCCTGC7CTG GGGCCTGTCC CTGCTGTTTA GTATGCTGGA GTGGAGGTTC 430
TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTGATTCT AGTTGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATCCCA 540
GTCGCGTGGC ATGTGTGGTT CTCTGTGTTT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600
AGGATCCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTATGTGAC CATCCTGCTC 660
ACAGTGCTGG TCTTCCTCCT CTGCGGCCTG CCCTTCGGCA TTCTGGGGGC CCTAATTTAC 720
• ·
AGGATGCACC TGAATTTGGA AGTCTTATAT TGTCATGTTT ATCTGGTTTG CATGTCCCTG 780
TCCTCTCTAA ACAGTAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTT7AGGCAG 840
CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAGAGGG CŤCTGCAGGA CAAGCCTGAG 900
GTGGATAAAG GTGAAGGGCA GCTTCCTGAG GAAAGCCTGG AGCTGTCGGG AAGGAGATTG 950
GGGCCATGA (2) Informace pro SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 322 aminokyselin (B) Typ: aminokyselinová (C) Řetězec: není relevantní (D) Topologie: není relevantní (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
Mec Asp Pro Thr Val Pro Val Phe Gly Thr Lys Leu Thr Pro Ile Asn
5 10 15
Gly Arg Glu Glu Thr Pro Cys Tyr Asn Gin Thr Leu Ser Phe Thr Val
25 30
Leu Thr Cys Ile Ile Ser Leu Val Gly Leu Thr Gly Asn Ala Val Val
40 45
Leu Trp Leu Leu Gly Tyr Arg Mec Arg Arg Asn Ala Val Ser Ile Tyr • ·
>♦ ·· ·· ·· • ·· · · · * · • · · · · · · · • · ····· ·· · • · · · · · · • · · · ·· ··
Ile Leu Asn Leu Ala Ala Ala Asp Phe Leu Phe Leu Ser Phe Gin Ile
70 75 80
Ile Arg Ser Pro Leu Arg Leu Ile Asn Ile Ser His Leu Ile Arg Lys
90 95
Ile Leu Val Ser Val Met Thr Phe Pro Tyr Phe Thr Gly Leu Ser Met
100 105 110
Leu Ser Ala Ile Ser Thr Glu Arg Cys Leu Ser Val Leu Trp Pro Ile
115 120 125
Trp Tyr Arg Cys Arg Arg Pro Thr His Leu Ser Ala Val Val Cys Val
130 135 140
Leu Leu Trp Gly Leu Ser Leu Leu Phe Ser Met Leu Glu Trp Arg Phe
145 150 155 160
Cys Asp Phe Leu Phe Ser Gly Ala Asp Ser Ser Trp Cys Glu Thr Ser
165 170 175
Asp Phe Ile Pro Val Val Trp Leu Ile Phe Leu Cys Val Val Leu Cys
180 185 190
Val Ser Ser Leu Val Leu Leu Val Arg Ile Leu Cys Gly Ser Arg Lys
195 200 205
Met Pro Leu Thr Arg Leu Tyr Val Thr Ile Leu Leu Thr Val Leu Val
210
215
220 >· ·»
Phe Leu Leu Cys Gly Leu Pro Phe Gly Ile Leu Gly Ala Leu Ile Tyr
215 230 235 240
Arg Met His Leu Asn Leu Glu Val Leu Tyr Cys His Val Tyr Leu Val
245 250 _ 255
Cys Met Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ala Asn Pro Ile Ile Tyr
250 265 270
Phe Phe Val Gly Ser Phe Arg Gin Arg Gin Asn Arg Gin Asn Leu Lys
275 2B0 235
Leu Val Leu Gin Arg Ala Leu Gin Asp Lys Pro Glu Val Asp Lys Gly
290 295 300
Glu Gly Gin Leu Pro Glu Glu Ser Leu Glu Leu Ser Gly Ser Lys Leu
305 310 315 320
Gly Pro (2) Informace pro SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 969 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: dvojitý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne • · · · · 99 99 99 • · · ♦ · · 9 · 9 9 9 ··· · ·· · « · · · • 99999»· 9 ····· »9 · ··· ·· 9 9999 ·· 9 ·· 99 99 99 (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
ATGGATCCAA CCGTCCCAGT CTTCGGTACA AAACTGACAC CAATCAACGG ACGTGAGGAG 60
ACTCCTTGCT ACAATCAGAC CCTGAGCTTC ACGGTGCTGA CGTGCATCAT TTCGCTTGTC 120
GGACTGACAG GAAACGCGGT TGTGCTCTGG CTCCTGGGCT ACCGCATGCG CAGGAACGCT 180
GTCTCCATCT ACATCCTCAA CCTGGCCGCA GCAGACTTCC TCTTCCTCAG CTTCCAAATT 240
ATACGTTCGC CATTACGCCT CATCAATATC AGCCATCTCA TCCGCAAAAT CCTCGTTTCT 300
GTGATGACCT TTCCCTACTT TACAGGCCTG AGTATGCTGA GCGCCATCAG CACCGAGCGC 360
TGCCTGTCTG TTCTGTGGCC CATCTGGTAC CGCTGCCGCC GCCCCACACA CCTGTCAGCG 420
GTCGTGTGTG TCCTGCTCTG GGGCCTGTCC CTGCTGTTTA GTATGCTGGA GTGGAGGTTC 480
TGTGACTTCC TGTTTAGTGG TGCTGATTCT AGTTGGTGTG AAACGTCAGA TTTCATCCCA 540
GTCGTGTGGC TGATTTTTTT ATGTGTGGTT CTCTGTGTTT CCAGCCTGGT CCTGCTGGTC 600
AGGATCCTCT GTGGATCCCG GAAGATGCCG CTGACCAGGC TGTACGTGAC CATCCTGCTC 66 0
ACAGTGCTGG CTGCGGCCTG CCGTTCGGCA TTGTGGGGGC CCTAATTTAC 723
AGGATGCACC TGAATTTGGA AGTCTTATAT TGTCATGTTT ATCTGGTTTG CATGTCCCTG 730
• · · · · • · · · · • · · · · · • · · · · · · • ··»···· ·
TCCTCTCTAA ACAGTAGTGC CAACCCCATC ATTTACTTCT TCGTGGGCTC CTTTAGGCAG 840
CGTCAAAATA GGCAGAACCT GAAGCTGGTT CTCCAAAGGG CTCTGCAGGA CAAGCCTGAG 900
GTGGATAAAG GTGAAGGGCA GCTTCCTGAG GAAAGCCTGG AGCTGTCGGG AAGCAAATTG 960
GGGCCATGA 969 (2) Informace pro SEQ ID NO: 15:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 35 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:
GGCCGTCGAC TTCA7CGTCW MYCTIKCIYT IGCNG 35 (2) Informace pro SEQ ID NO: 16:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 15 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne • · · · · (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:
RHWRCARTAI ATIAT 15 (2) Informace pro SEQ ID NO: 17:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:
CGCAGATGAG GTAGTACAGC ATCAC 2:
(2) Informace pro SEQ ID NO: 18:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:
CTGTGAGAGA GATGGTAACA TACAG 22 (2) Informace pro SEQ ID NO: 19:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 24 párů baží « 4· 4»
4 » « 4 • 4 * Μ » 44 4 9 - »» »!··«»· 4 4 ť a 4 4 (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:
GCATCCTTGA CTGGTTCTTC TCAG 24 (2) Informace pro SEQ ID NO: 20:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:
GGGTGAGACT CATCATCATT TGTGG (2) Informace pro SEQ ID NO: 21:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne • · · • · · (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:
GCAAGCTTTC TGAGCATGGA TCCAACCGTC (2) Informace pro SEQ ID NO: 22:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 30 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: jiná nukleová kyselina (A) Popis: /popis = syntetický PCR primer (iii) Hypotetická: ne (iv) Protismyslná: ne (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:
CCCTCAGATC TCCAATTTGC TTCCCGACAG

Claims (47)

1. Protein, s výjimkou přirozeného proteinu, zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky krysí DRR-1, zahrnující aminokyselinovou sekvenci sestávající ze SEQ ID NO: 1.
2. V podstatě čistý protein podle nároku 1, ve kterém aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1.
3. V podstatě čistý polynukleotid kódující protein zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky krysí DRR-1, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1.
4. Polynukleotid podle nároku 3, který kóduje protein skládající se v podstatě z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 1.
5. Polynukleotid podle nároku 4, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2.
6. Protein, s výjimkou přirozeného proteinu, zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-1, zahrnující aminokyselinovou sekvenci sestávající ze SEQ ID NO: 3.
7. V podstatě čistý protein podle nároku 6, ve kterém aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 3.
8. V podstatě čistý polynukleotid kódující protein zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-1, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 3.
• · (náhradní strana) • · · · • ti · * · · ·
9. Polynukleotid podle nároku 8, který kóduje protein skládající se v podstatě z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 3.
10. Polynukleotid podle nároku 9, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 4.
11. Protein, s výjimkou přirozeného proteinu, zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-2, zahrnující aminokyselinovou sekvenci sestávající ze SEQ ID NO: 5.
12. V podstatě čistý protein podle nároku 11, ve kterém aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 5.
13. V podstatě čistý polynukleotid kódující protein zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-2, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 5.
14. Polynukleotid podle nároku 13, který kóduje protein sestávající v podstatě z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 5.
15. Polynukleotid podle nároku 14, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 6.
16. Protein, s výjimkou přirozeného proteinu, zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-3, zahrnující aminokyselinovou sekvenci sestávající ze SEQ ID NO: 7.
17. V podstatě čistý protein podle nároku 16, ve kterém aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 7.
18. V podstatě čistý polynukleotid kódující protein zachovávající (náhradní strana) kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-3, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 7.
19. Polynukleotid podle nároku 18, který kóduje protein sestávající v podstatě z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 7.
20. Polynukleotid podle nároku 19, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 8.
21. Protein, s výjimkou přirozeného proteinu, zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-4, zahrnující aminokyselinovou sekvenci sestávající ze SEQ ID NO: 9.
22. V podstatě čistý protein podle nároku 21, ve kterém aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 9.
23. V podstatě čistý polynukleotid kódující protein zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-4, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 9.
24. Polynukleotid podle nároku 23, který kóduje protein sestávající v podstatě z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 9.
25. Polynukleotid podle nároku 24, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 10.
26. Protein, s výjimkou přirozeného proteinu, zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-5, zahrnující aminokyselinovou sekvenci sestávající ze SEQ ID NO: 11.
27. V podstatě čistý protein podle nároku 26, ve kterém aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z aminokyselinové (náhradní strana) sekvence uvedené v SEQ ID NO: 11.
28. V podstatě čistý polynukleotid kódující protein zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-5, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 11.
29. Polynukleotid podle nároku 28, který kóduje protein sestávající v podstatě z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 11.
30. Polynukleotid podle nároku 29, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 12.
31. Protein, s výjimkou přirozeného proteinu, zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-6, zahrnující aminokyselinovou sekvenci sestávající ze SEQ ID NO: 13.
32. V podstatě čistý protein podle nároku 31, ve kterém aminokyselinová sekvence sestává v podstatě z aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 13.
33. V podstatě čistý polynukleotid kódující protein zachovávající kvalitativní ligandové vazebné charakteristiky lidské DRR-6, mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 13.
34. Polynukleotid podle nároku 33, který kóduje protein sestávající v podstatě z aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 13.
35. Polynukleotid podle nároku 34, který má nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 14.
36. Protilátka, která se specificky váže na protein DRZR-l ze sekvence SEQ ID NO: 1, připravená způsobem zahrnujícím krok injikování farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího (náhradní strana) •« « *· ·· · · ·· • · · · · · · · · ♦ • » · · · ·· * · « · • ·····«· · ····· ·· ··· ·· · ··· ·· 9 · · » * ·· ·· protein podle jakéhokoliv z nároků 1 nebo 2, zvířeti schopnému produkovat uvedenou protilátku.
37. Protilátka, která se specificky váže na protein DRR-1 ze sekvence SEQ ID NO: 3, připravená způsobem zahrnujícím krok injikování farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího protein podle jakéhokoliv z nároků 6 nebo 7, zvířeti schopnému produkovat uvedenou protilátku.
38. Protilátka, která se specificky váže na protein DRR-2 ze sekvence SEQ ID NO: 5, připravená způsobem zahrnujícím krok injikování farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího protein podle jakéhokoliv z nároků 11 nebo 12, zvířeti schopnému produkovat uvedenou protilátku.
39. Protilátka, která se specificky váže na protein DRR-3 ze sekvence SEQ ID NO: 7, připravená způsobem zahrnujícím krok injikování farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího protein podle jakéhokoliv z nároků 16 nebo 17, zvířeti schopnému produkovat uvedenou protilátku.
40. Protilátka, která se specificky váže na protein DRR-4 ze sekvence SEQ ID NO: 9, připravená způsobem zahrnujícím krok injikování farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího protein podle jakéhokoliv z nároků 21 nebo 22, zvířeti schopnému produkovat uvedenou protilátku.
41. Protilátka, která se specificky váže na protein DRR-5 ze sekvence SEQ ID NO: 11, připravená způsobem zahrnujícím krok injikování farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího protein podle jakéhokoliv z nároků 26 nebo 27, zvířeti schopnému produkovat uvedenou protilátku.
• · · ·· · * ·· ·* ··· »»·· · · · · (náhradní strana) í í hí. . í *..! · I · ί ··♦·♦»···· ·· · ·· · * ·« · ·
42. Protilátka, která se specificky váže na protein DRR-6 ze sekvence SEQ ID NO: 13, připravená způsobem zahrnujícím krok injikování farmaceuticky přijatelného přípravku obsahujícího protein podle jakéhokoliv z nároků 31 nebo 32, zvířeti schopnému produkovat uvedenou protilátku.
43. Protilátka, která se specificky váže na jakýkoliv z proteinů podle nároků 1, 2, 6, 7, 11, 12, 16, 17, 21, 22, 26, 27, 31 nebo 32.
44. Expresní vektor pro expresi krysího DRR-1, obsahující polynukleotid podle některého z nároků 3 nebo 4.
45. Expresní vektor pro expresi kteréhokoliv z:
(i) lidského DRR-1, obsahující polynukleotid podle nároků 8 nebo 9;
(ii) lidského DRR-2, obsahující polynukleotid podle nároků 13 nebo 14;
(iii) lidského DRR-3, obsahující polynukleotid podle nároků 18 nebo 19;
(iv) lidského DRR-4, obsahující polynukleotid podle nároků 23 nebo 24;
(v) lidského DRR-5, obsahující polynukleotid podle nároků 28 nebo 29;
(vi) lidského DRR-6, obsahující polynukleotid podle nároků 33 nebo 34.
46. Hostitelská buňka transformovaná vektorem podle nároku 44 nebo 45.
47. Rekombinantní krysí DRR-1, lidský DRR-1, lidský DRR-2, lidský DRR-3, lidský DRR-4, lidský DRR-5, lidský DRR-6, produkovaný hostitelskou buňkou podle nároku 46.
CZ20002315A 1998-12-16 1998-12-16 Nový receptor spřažený s G-proteinem CZ20002315A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20002315A CZ20002315A3 (cs) 1998-12-16 1998-12-16 Nový receptor spřažený s G-proteinem

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20002315A CZ20002315A3 (cs) 1998-12-16 1998-12-16 Nový receptor spřažený s G-proteinem

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20002315A3 true CZ20002315A3 (cs) 2001-01-17

Family

ID=5471094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002315A CZ20002315A3 (cs) 1998-12-16 1998-12-16 Nový receptor spřažený s G-proteinem

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ20002315A3 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6696257B1 (en) G protein-coupled receptors from the rat and human
EP1071714B1 (en) A novel g-protein coupled receptor
EP0647275B1 (en) Cloning and expression of gonadotropin-releasing hormone receptor
EP0912610B1 (en) A novel galanin receptor
US6927041B2 (en) Human neuropeptide Y-like G protein-coupled receptor
CZ20002315A3 (cs) Nový receptor spřažený s G-proteinem
EP1200473B1 (en) G-Protein coupled RECEPTOR
US20020053091A1 (en) Isolated human G-protein coupled receptors, nucleic acid molecules encoding human GPCR proteins, and uses thereof
WO2001072839A2 (en) Human g-protein coupled receptors
EP1278839A2 (en) Isolated human g-protein coupled receptors, nucleic acid molecules encoding human gpcr proteins, and uses thereof
CA2352569A1 (en) Novel g protein-coupled receptor
US20030139589A1 (en) G protein coupled receptor A4
US20030233668A1 (en) Isolated human G-protein coupled receptors, nucleic acid molecules encoding human GPCR proteins, and uses thereof
WO2004009631A2 (en) Human gnrh (type 2) receptor

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic