CZ20002659A3 - Monoklonální protilátka anti av-integrin a její použití k inhibicí vazby avbetaó-integrinu na fibronektin - Google Patents

Abstract

Monoklonální protilátka, jejíž výhodné provedení se označuje 14D9.F8, reaguje pouze s HV-řetězcem lidských HV-integrinů a inhibuje selektivně vázání buněk nesoucích HVn6-integrin na integrinový substrát a hybridová buněčná linie, kteráji produkuje. Protilátka je vhodná pro výrobu farmaceutických prostředků pro potlačování karcinomů zvláště plic a tlustého střeva.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nové monoklonální protilátky a hybridomové buněčné linie produkující tuto protilátku. Monoklonální protilátka, jejíž výhodné provedení se označuje jako 14D9.F8 má následující vlastnosti:

- reaguje pouze s αν-řetězcem lidských av-integrinů a

- inhibuje selektivně vázání buněk nesoucích ανβ6-ίntegrin na integrinový substrát.

Vynález se týká monoklonální protilátky mající tyto vlastnosti. Kromě toho se vynález týká monoklánonální protilátky produkující linii hybridomových buněk majících označení 271. 14D9.F8 a uložených pod objedněcím číslem DSM ACC2331, jakož také monoklánonální protilátky mající shora uvedené vlastnosti a která je získatelná uvedenou linií hybridomových buněk.

Vynález se také týká farmaceutického prostředku, který obsahuje shora definovanou protilátku.

Dosavadní stav techniky

Integriny jsou superrodina receptorů adheze na buněčný povrch, které řídí vázání buněk na pevné mimobuněčné prostředí jak k mimobuněčné matrici (extracel1ular matrix ECM) tak k jiným buňkám. Adheze má základní význam pro buňky; umožňuje zakotvení, poskytuje popud k migraci a signalizuje růst a diferenciaci. Integriny se přímo podílejí na četných normálních a patologických stavech a jako takové jsou primárním štítem pro terapeutický zásah. Integriny jsou integrální transmembránové proteiny, heterodimery, jejichž vázání specificky závisí na tom, který z 15 α-řetězců se kombinuje s některým z 8 βřetězců. Integriny se zatřidují do čtyř překrývajících se podrodin, obsahujících β1, β2, β3 nebo αν řetězce a určitá buňka může expresovat několik různých integrinů z každé podrodiny. V posledním desetiletí se zjistilo, že integriny jsou hlavními receptory podílejícími se na adhezi buněk (například E. Ruoslahti, J. Clin. Invest, 1991, 87; a R. 0. Hyneš (Cell, 1992, 69) a mohou tak být vhodným štítem pro terapeutický zásah.

S výjimkou erythrocytů všechny lidské buňky expresují jeden nebo několik integrinů. Jejich funkce jsou řízeny v četných úrovních avšak primárně jejich ligandová specifičnost závisí na tom, který α-řetězec se asociuje se kterým β-řetězcem na heterodimer a na stavu aktivace integrinů (Hyneš, 1992, Diamond and Springer, 1994). Buněčný základ, na kterém integriny pracují (Chán a Hemler, 1993), a forma střihové varianty použitého integrinů (Delwel a kol., 1993) mohou rovněž ovlivňovat specificitu. Se zřetelem na tuto komplexnost ukázal výzkum integrinů, že činidla, která mohou specificky blokovat funkci integrinů, jsou rozhodujícími faktory ve funkční analýze od funkce blokovat ASAT-proti 1átku, která první definovala integrinový βΐ-řetězec (Neff a kol.,1982) až k četným vitálním pozdějším příkladům (například P1D6, P1B5 (Wayner a Carter, 1987), P4C10 (Carter a kol., 1990) a LM6O9 (Cheresh a Spiro, 1987): obor je absolutně závislý na takových činidlech.

Integriny série αν se nyní považují za hlavní podrodinu jak s klasickými tak s novými funkcemi. Klasickou funkcí je zprostředkovávání vázání buňky a růst buňky (Pytela a kol., 1985, Cheresh, 1991), přičemž se αν integriny také podílejí na schopnosti pohybu buněk (Seftor a kol., 1992), na receptorové intemalizaci (Panetti a McKeown Longo, 1993a; Panetti a McKeown Longo, 1993b), působí jakožto virové koreceptory (Wickham a kol., 1993) v hospodaření mimobuněčných proteázových • · · · • · kaskád (de Boer a kol., 1993) a jako regulátry nádorové progrese (Felding-Habermann a kol., 1992). Specifičnosti pěti známých integrinů série αν, ανβ1 (Zhang a kol., 1993), -β3 (Pytela a kol., 1985; Cheresh a kol., 1987), -β5 (Cheresh a kol., 1989), -β6 (Busk a kol., 1992) a -β8 (Moyle a kol.,1991) byly z části definovány a zdá se, že výlučně rozpoznávají ligandy nesoucí RGD- (NH2-arginin-glycin-asparagová kyselinaCOOH) tripeptidové sekvence včetně sekvencí ve vitronektinu (ανβ1, ανβ3, ανβ5), ve fibronektinu (ανβ1, ανβ3, ανβ5, ανβ6) a ve von Wi11ebrandově faktoru, fibrinogenu a osteopontinu (ανβ3) (například 1991; Busk a kol., 1992; Zhang a kol., 1993; Denhardt a Guo, 1993; Smith a Cheresh, 1990).

Je známo, že ανβ3 a ανβ5 se podílejí na nádorové angiogenézi, zatímco ανβ6 je kostimulátor buněčné proliferace karcinomu tlustého střeva a je řízen v průběhu zánětlivé epitelové proliferace a epitelové karcinogenéze (Breuss a kol., J. Cell. Sci. 108, str. 2241 až 2251, 1995). Zdá se, že jeho exprese vyznačuje neo-hyperproliferativní epithelia (Zambruno a kol., Cell Biol. 129, str. 853 až 865, 1995). Nadměrná exprese integrinu může vyvolávat modelové stavy podobné lupénce. Specifické antagonisty a agonisty ανβδ-integrinů mohou tudíž mít široký terapeutický potenciál.

RGD-peptidy blokují ανβ6 vázání na fibronektin, blokují však také jiné buněčné povrchové fibronekti nové receptory včetně ανβ1 (R. Pytela a kol., Cell 40, str. 191 až 198, 1985) a ανβ3 (R. Pytela, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, str. 5766 až 5770, 1985). Byly popsány inhibiční protilátky, které jsou štítem všech αν-integrinů (Lehmann a kol., Cancer Res. 54, str. 2102 až 2107, 1994) a ανβ3 nebo ανβ5 komplexy (Weinacker a kol., J. biol. Chem. 269, str. 6940 až 6948, 1994), není však dosud známo žádné činidlo, které by selelektivně inhibovalo ανβ6.

• · • ·

Byla již popsána řada protilátek, které váží lidské αν-integri nové řetězce včetně neinhibiční ho Mab 14D9.F8 (Mitjans a kol., J. Cell. Sci. 108, str. 2825 až 2838, 1995).

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je monoklonální protilátka, která

- reaguje pouze s αν-řetězcem lidských av-integrinů a

- inhibuje selektivně vázání buněk nesoucích ανβ6-ιntegrin na integrinový substrát.

Vynález se tedy týká nové monoklonální protilátky reagující pouze s αν-integrinovým řetězcem lidských av-integrinů a blokující selektivně vázání na integrinový substrát ανβ3- a ανβθ-integrin nesoucí buňku, která se označuje jako 14D9.F8.

čištění a zdroje proteinů, buněčné linie a jejich kultura, ELISA, testy adheze, analýza FACS, produkce a charakterizace používaných protilátek jsou v literatuře podrobně popsány (Mitjans a kol., J. Cell. Sci. 108, str. 2825 až 2838, 1995). Mab 14D8.F8, 11D1 a 17E6 se zbavují séru prostých hybridomových supernatantů protein-A afinitní chromatografií s následným odstraněním endotoxinů a v případě vyšší než 99% čistoty SDS-PAGE (Mitjans a kol., J. Cell. Sci. 108, str.2825 až 2838, 1995). Myší monoklonální 11D1 je IgGi , je zaměřen proti β5-ίηtegrinu. Pro myší IgG se předpokládá molekulová hmotnost 155 kDa. Způsob přípravy transmembránového seříznutého rekombinantního ανβ6 popsal v podstatě A. Weinacker a kol. (J. Biol. Chem. 269, str. 6940 až 6948, 1994). P3D10 (M. Agrez a kol.,

J. Cell. Biol. 127, str. 547 až 556, 1994; E. Wayner, University of Minnesota, Minneapolis) a 4B7 (J. Marshal1, IRCF, London) jsou mocné jedy. Proti látková selektivita použitých protilátek je uvedena v tabulce I a integrinový profil použité buněčné linie je uveden v tabulce II. Buněčná linie je uložena pod objednacím číslem DSM ACC2331 v německé sbírce mikroorga• ·

I · · ' » · · ' • · . · · · · nizmů (Braunschweig, Německo).

DNA- a aminokyselinové sekvence obsahují také mírně obměněné nebo změněné sekvence například mutanty a varianty, které se mohou získat záměrně nebo náhodně chemickými nebo fyzikálními způsoby. Obecně jsou zahrnuty všechny takové mutanty a varianty, které vykazují popsané vlastnosti a funkce.

Výraz protilátka zahrnuje také zpravidla protilátkové fragmenty, například Fab’ , F(ab’)2 nebo jednořetězcový Fvs. Tyto fragmenty se mohou produkovat o sobě známými způsoby.

Tabu!ka I:	Derivace a	charakterizace těchto	protilátek je de-
finovaná v	citované literatuře a v tomto popise. (Ve sloupci I
je uvedena	prot i 1át ka,	ve sloupci II specificita a ve sloupci
III odkaz	na literaturu, přičemž * znamená	Marshalovo osobní
sdělení a	** odkaz na	předmětné podlohy).
Tabulka I
I		11	III
	Vázání	Inhibice
1 7E6	αν	αν	(3)
14D9.F8	αν	ανβ6-ανβ3>ανβ1	(3)
L23O	αν	αν	(5)
P3D1O	α5	α5	(2)
P4D1O	β1	β1	(6)
4B7	β1	žádné	*
AP3	β3	žádné	(7)
1 1D1	β5	žádné	* *
E7P6	β6	žádné	(1 )
LM6O9	ανβ3	ανβ3	(4)
P1F6	ανβ5	ανβ5	(1 )

Tabulka II: Integrinové expresní profily těchto linií byly de• · · *

I · · « » · · · » · · « » · · « finovanány povrchovým značením a analýzou FACS nebo imunoprecipitací (FACS = fluorescenční aktivovaný buněčný třídič) (v posledním sloupci je odkaz na literaturua a ** znamená odkaz na předmětné podlohy).

Tabulka II

Buňka

UCLA-P3 HT-29 WM-164

Int egri n (vazby) ανβ3 (VN.FN) ανβδ (VN) ανβδ (FN) α5β1 Litera(FN) tura (1.3) (8.9)

- * *

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1

Mab 14D9.F8 váže αν-integrinové řetězce v některých případech: Rekombinantní rozpustný ανβ3 (A), placentový ανβδ (Β), rekombinantní rozpustný ανβ6 (C) a destičkový αΙ^β3 (D) (všechny ve množství 1 pg/ml) se absorbují na 96 důlkových destičkách ELISA a sondují se uvedenými koncentracemi Mab 14D9.F8 (plné čtverečky), 17E6 (plná kolečka), 4B7 (plné trojúhelníčky se špičkou vzhůru), 11D1 (plné trojúhelníčky se špičkou dolů), AP3 (plné kosočtverečky), E7P6 (prázdná kolečka) použitými jako hybridomové supernatanty, přičemž δ pg/ml bod znamená supernatantové zředění 1:5. Vázaná protilátka se zjištuje s peroxidázou konjugovaným antimyším IgG. Rozptyl chyb = SD (n=3). Na ose x je množství protilátky v pg/ml, na ose y OD 450 nm.

Obr

Mab na fibronektin nikoliv karcinom plic UCLA-P3

14D9.F8 inhibuje buněčnou adhezi však na vitronektin:

Karcinom tlustého střeva HT-29 (A,B), (C,D), melanom WM-164 (E,F) se nechají vázat na destičky povlečené 5 pg/ml roztoky fibronektinu (A,C,E) nebo vitronektinu » * · « » l»· r

• · (B,D,F) v přítomnosti uvedené koncentrace Mab 14D9.F8 (plné čtverečky), 17E6 (plná kolečka), P1F6 (plné trojúhelníčky se špičkou dolů), P4C1O (plné trojúhelníčky se špičkou vzhůru), LM 609 (plné kosočtverečky). Po jedné hodině se nevázané buňky smyjí a vázané buňky se zjištuji stanovením lysozomální hexosaminidázou. Vázání se normalizuje za použití maxima buněk vázaných jakožto 100 %. Skutečné vázání buněk na fibronektin a na vitronektin je HT-29 (27 %, 53 %), UCLA-P3 (42 %, 64 %), WM-164 (84 %, 50 %). Rozptyl chyb = SD (n=3). Na ose x je množství protilátky v pg/ml, na ose y buněčná adheze v procentech se zřetelem na kontrolu.

Obr. 3

Mab 14D9.F8 působí selektivně na avp6-integrin

SW480 buňky napodobené transfektované (mock) nebo transfektované plnou délkou lidského β6 integrinu (beta-6) se nechají vázat na destičky povlečené fibronektinem (FN) nebo vitronektinem (VN) po dobu jedné hodiny v přítomnosti 10 pg/ml protilátek, jak popsáno v souvislosti s obr. 2. Rozptyl chyb = SD (n=3). Na ose y je buněčná adheze v procentech se zřetelem na kont rolu.

Odkazy na literaturu

1. A. Weinacker, A. Chen, M. Agrez, R.I.Cone, S. Nishimura, E. Wayner, R. Pytela a D. Sheppard, J. Biol. Chem. 269, str. 6940 až 6948, 1994

2. M. Agrez, A. Chen, R.I.Cone, R. Pytela a D. Sheppard, J. Cell. Biol. 127, str. 547 až 556, 1994

Sutter, J.M. Marinez, C.

3. F. Mitjans, D. Sander, J. Adan, A. Jággle, J. Moyano, H.-G. Kreysch, J.

Piulats a S.L. Goodman,

J. Cell. Sci. 108, str. 2825 až 2838, 1995

4. D. A. Cheresh a R.C. Spiro, J. Biol. Chem. 262, str. 17703 až 17711, 1987

5. A.N. Houghton, M. Eisinger, A.P. Albino, J.G. Caimcross a φ ·· » · « · · · • φ * * φ * · · φ φ φ ^r « φ » ·

• <

φ · « φ · ·

L.J. Old, J. Exp. Med. 156, str. 1755 až 1766, 1982,

6. W. Carter, E. Wayner, T. Bouchard a P. Kaur, J. Cell. Sci. 110, str. 1387 až 1404, 1990

7. K. Furihata, D.J. Nugent, A. Bissonette, R.H. Aster a T.J. Kiinicki, J. Clin. Invest. 80, str. 1 624 až 1630, 1987

8. E.C. Ebert, Dig. Dis. Sci. 41, str. 1551 až 1556, 1996,

9. K. Koretz, S. Bruderlein, C. Henne, T. Fietz, M. Laque a P. Moller, Virchows Arch. 425, str. 229 až 236, 1994

Monoklonální protilátka 14D9.F8 se váže silně na ανβ1 , ανβ3, ανβδ, ανβ6 integriny. Κ získání 50% maximální vazby (obr. 1) bylo potřeba v ELISA na čištěných lidských integrinech 14D9.F8 a 17E6 vykazujících stejné reakční profily a podobné koncentrace protilátkek. 14D9.F8 nereaguje s αΙ^β3, což naznačuje, že je zasažen αν-řetězec, jak již bylo shledáno na základě FACS analýzy (F. Mitjans a kol., J. Cell. Sci. 108, str. 2825 až 2838, 1995). 14D9.F8 má malý vliv na vázání buňky zprostředkované ανβ5 a má slabý až střední působení na vázání zprostředkovávané ανβ3 a ανβ1 (F. Mitjans a kol.,J. Cell. Sci. 108, str. 2825 až 2838, 1995). Pokud se však testuje 14D9.F8 se zřetelem na schopnost ovlivnit vázání HT-29 a buněk karcinomu UCLA-P3 na fibronektin, ukázalo se, že je mimořádně aktivní (obr. 2).

14D9.F8 narušuje adhezi HT-29 buňky na fibronektin při IC50 0,3 nM zatímco na vitronektin je koncentrace až 600 nM spíše stimulační. Pro tento jev není vysvětlení. Vázání HT-29 na vitronektin je zcela inhibováno P1F6 a fibronektin je necit livý na P1F6 avšak narušuje se 17E6. LM6O9 nereaguje s HT-29 nebo se UCLA-P3 buňkami (F. Mitjansa kol., J. Cell. Sci. 108, str. 2825 až 2838, 1995) a nepůsobí na jejich vázání na vitronektin a nebo na fibronektin (obr. 2A, B). Proto av-integrin nikoliv však ανβ3 nebo ανβδ moduluje HT-29 adhezi na fibronektin a tento integrin je selektivně blokován Mab 14D9.F8, zatímco integriny zprostředkovávající adhezi na vitronektin jsou

inaktivovány Mab P1F6 a tento integrin je slabě inhibován 14D9.F8.

K doložení, že to není zvláštnost HT-29 buněk se opakovaly inhíbiční zkoušky za použití UCLA-P3, buňky karcinomu z odlišného zdroje, plic, které expresují vysoké hladiny ανβδ a ανβθ, přičemž se získaly podobné výsledky (obr. 2C.D).

Mab 14D9.F8 narušil adhezi buňky na fibronektin, adheze je zprostředkována hlavně 17E6-ci11 ivými molekulami s určitým příspěvkem P4C10-cit1ivých molekul (pravděpodobně ανβ5 nebo ανβ1) na vitronektin 14D9.F8 inhibovaný do 30 % buněčné vazby, avšak P1F6 ji zrušil. Jestliže podle předpokladu je P1F6 selektivní pro ανβ5 (A. Weinacker a kol., J. Biol. Chem. 269, str. 6940 až 6948, 1994), vedou tyto hodnoty k poznatku, že integrinem na UCLA-P3 zprostředkovávané vázání na fibronektin je ανβ5 a tato molekula je inhibována 17E6 řádově 4 krát silněji než 14D9.F8 . Jak podle ELISA tak FACS 17E6 a 14D9.F8 vážou ανβ3, ανβδ a ανβ6 s velmi podobnou závislostí na koncentraci. To je neočekávatelný poznatek.

Melanomové buněčné linie jednotně expresují ανβδ, ανβ3 nebo ανβ1 nikoliv však ανβθ nebo ανβδ (J. F. Marshal1 a kol., Semin. Cancer Biol. 7, str. 129 až 138, 1996). Jak je zřejmé z obr. 2 E,F na WM164 melanomové buňky je vázání na vitronektin necitlivé pro αν-inhibitory, zatímco vázání na vitronektin je blokováno 17E6 a z 50 % 14D9.F8 a až z 80 % LM6O9. Přídavně P1F6 k LM6O9 nebo k 14D9.F8 dokonale inhibuje WM164 vázání na vitronektin. Tento poznatek naznačuje, že je toto vázání zprostředkováváno jak LM6O9 tak P1F6-cit1 ivými molekulami a že LM6O9, nikoliv však P1F6, citlivé štíty jsou rovněž inhibovány 14D9.F8.

Mnohé karcinomové buňky expresují ανβθ (D. Sheppard,

Bioessays 18, str. 655 až 660, 1996). Je domněnka, že adheze • · · · · karcinomové buňky na fibronektin je zprostředkovávána ve velké míře ανβ6 a že 14D9.F8 selektivně inhibuje tuto molekulu, zatímco neinhibuje ανβ3 a ανβ5. K potvrzení tohoto poznatku se měří vázání buněčné linie SW480, transfektované plnou délkou lidského β6 v přítomnosti 14D9.F8:

V případě fibronektinu jsou SW48O-B6-transfektanty málo ovlivněny P3D1O, zatímco 14D9.F8, 17E6 a L23O jsou mocnými inhibitory vázání (obr. 3A). Avšak vázání napodobeného transfektovaného SW480 na fibronektin, když se použije výlučně α5β1 jakožto adhezního receptoru, může být silně blokováno za použití Mab P3D1O (obr. 3B) (A. Weinacker a kol., J. Biol. Chem. 269, str. 6940 až 6948, 1994) a 17E6, L23O a 14D9.F8 mají pouze mírnou přídavnou aktivitu možná v důsledku inhibice ανβ1 (J.F. Marshal1 a kol., J. Cell Sci. 108, str. 1227 až 1238, 1995). Na vitronektin je adheze buněk silně inhibována P1F6 a 17E6, avšak je neovlivněna 14D9.F8 (obr. 3C). Společně tyto hodnoty dokládají, že 14D9.F8 selektivně inhibuje ανβ6 a ανβ3 silněji než ανβ1 a neovlivňuje ανβ5, jakkoliv silně všechny tyto integriny váže.

Molekulové detaily tohoto procesu nejsou známy, avšak společnou interpretací těchto dat je, že podstatné zněmy integrinového uspořádání probíhají

Schwartz a 599, 1995) 14D9.F8 na po ligandové vazbě (M. A. kol., Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 11, str. 549 až Proto se upřednostňuje možnost, že v případě vazby αν-řetězec ανβ6 a ανβ3 se brání pohybu β-řetězců proti αν-řetězci , který je nutný k umožnění ligandové vazby. Porovnání sekvence ukazuje možné sekvence, které vykazují nutnou konservaci mezi β3 a β6 a odchylují se u případného β5 (nepublikované pozorování).

Protilátka podle vynálezu se může podávat lidem za účelem terapie. Proto se vynález týká farmaceutického prostředku obsahujícího jako účinnou látku alespoň jednu protilátku nebo fragment protilátky, shora definované, spolu s jedním nebo • ·

s několika farmaceuticky přijatelnými nosiči, excipienty nebo ředidly. Zpravidla se protilátka podle vynálezu podává injekcí intravenózně nebo parenterálně. Obecně je rozsah dávkování protilátky (nebo jejího fragmentu) dostatečně široký k dosažení potlačení nebo lýze nádoru. Dávka závisí na věku, stavu, pohlaví a na rozsahu onemocnění a je 0,1 mg/kg až 200 mg/kg, s výhodou 0,1 mg/kg až 100 mg/kg a podává se najednou nebo v několika denních dávkách po dobu jednoho nebo několika dní.

Jakožto prostředky pro parenterální podávání se uvádějí sterilní vodné nebo nevodné roztoky, suspenze nebo emulze. Jakožto příklady nevodných rozpouštědel se uvdějí propylenglykol, polyethylenglykol, rostlinné oleje například olivový olej a vstřikovatelné organické estery například ethyloleát a další rozpouštědla známá v oboru, která jsou vhodná pro tyto účely. Protilátky podle vynálezu se mohou používat ve směsi obsahující fyziologicky přijatelný nosič. Jakožto příklady takových vhodných nosičů se uvádějí solanka, PBS, Ringerův roztok, nebo laktátovaný Ringerův roztok. Farmaceutické prostředky mohou obsahovat konzervační a jiné přísady, například antibiotika, antioxidanty a chelatační činidla.

Protilátka (nebo její fragment) se také může konjugovat o sobě známými způsoby na cytokiny, například IL-2 k podpoře jejich cytotoxicity.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou vhodné pro ošetřování karcinomů.

Pro diagnostické účely se protilátka může konjugovat například s radioopakním barvivém nebo se může radioaktivně značit. Výhodným způsobem značení je způsob na bázi jodu. Pro diagnostické účely se s výhodou protilátka podává jakožto scFv fragmenty. Takové podání poskytuje lepší výsledky takže není nutné odečítání pozadí.

Vynález blíže objasňuji, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Procenta a díly jsou míněny hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Materiály

Živočichové: Myši pro produkci protilátky (samičky BALB/c, o stáří osmi týdnů) a nádorové modely (holá myš: samičky homozygotové bez brzlíku BALB/c nu/nu, o stáří čtyř až pěti týdnů) (Criffa, Barcelona, špaňalsko). Holé myši se udržují ve sterilní místnosti v mikroizolační kleci a podává se jim sterilovaná potrava a voda podle libosti. Všechny manipulace se provádějí v digestoři s laminárním prouděním.

Proteiny: Fibronektin (Ruoslahti a kol., 1982) a vitronektin (Yatohgo a kol., 1988) se izolují z čerstvě zmrazené lidské plasmy.

Pokud není uvedeno jinak, provádějí se všechny manipulace při teplotě 20 °C a pro všechna promývání se používá PBS prostého vápníku a hořčíku (PBS: 137 mM NaCl, 2,8 mM KC1, 8,1 mM Na2HP04, 1,5 mM K2HPO4, hodnota pH 7,4). PBS++ je PBS s přidaným 1 mM MgCl2 a 1 mM CaCl2. Pokud není jinak uvedeno, jsou chemikálie (Merck KGaA, Darmstadt) nejvyšší dosažitelné čistoty. Cyklické peptidy jako RGDfV se syntetizují o sobě známými způsoby (například FEBS Let. 291, str. 50 až 54, 1991).

Nádorové buněčné linie a kultury: Americká sbírka American

Type Culture Collection (ATCC) dodává HT29 karcinomy, UCLA-P3 lidské plicní adenokarcinomy (Cheresh a kol., 1989) (Dr D.A.

Cheresh; Scripps) a WM164 melanom (Dr M. Herlyn, Wistar) (Her·· ·· ···· ·· ·· • · ·« · · « · · *· · · · » · · · ····· ·· ·· ·· ·

1yn a kol., 1990). Všechny buňky se kultivují při teplotě 37 °C v prostředí obsahujícím 7,5 % oxidu uhličitého a 92,5 % vzduchu v 90% RPMI 1640, 10 % telecího zárodečného séra (FCS) plus 2 mM L-glutaminu, v podstatě prostém mykoplasmy podle testu vlastníka (Mycotect kit; Gibco).

Protilátky: monoklonální protilátkové (MAb) fúze, skríning ELISA, subklonování a udržování kultur vždy za použití standardních způsobů (Harlow a Lané, 1988), pokud není uvedeno jinak .

Příklad 2

Imunizace MAb proti ανβ3 se provádí intraperitoneální (ip) injekcí čištěného placentového ανβ3 imobi1 izovaného na Sepharose (80 pg ανβ3 na 80 pl Sepharose ve 200 pl PBS) nebo živých M21 buněk (1 x 10⁶ buněk v 0,5 ml PBS) vždy dvakrát za týden po dobu dvanácti týdnů, čtyři dny po poslední injekci se provede PEG navozená fúze za použití Friendly Myeloma (Ventrex) jakožto partnera. Protilátky k 200 kDa s melanomem spojeným povrchovým proteinem se produkují imunizací nedotčených M21 buněk (1 x 10⁶ buněk v 0,5 ml PBS).

Používá se skríningu ELISA na receptorech a na fixovaných M21 buňkách. Pro receptor ELISA se 96 důlkové destičky ELISA (Dynatech) povléknou čištěným ανβ3 (1 pg/ml v PBS, 16 hodin, 4 °C), blokovaným (1,5 % odstředěného mléka v PBS, jedna hodina, 4 °C) a inkubovaným s hybri domovými supernatanty. Detekce vázaných imunoglobul inů se provádí s alkalickým fosfatázovým konjugátem antimyšího IG (Dako) za použití p-nitrofenylfosfátu jakožto substrátu. Pro celulární ELISA se fixují buňky UCLA-P3 na 96 důlkových tkáňových kultivačních destičkách (4 % paraformaldehydu v PBS, 15 minut, 20 °C) a blokují se (3 % BSA, PBS, jedna hodina, 4 °C) před inkubací s hybri domovými supernatanty a detekce se provádí jako v receptorů ELISA. Pozitivní • · • « · · hybridy se subklonují třikrát omezováním ředění a za přizpůsobení RPMI prostředí. Imunoglobuli nový isotyp se stanovuje za použití protilátkek podtřídy se specifickým těžkým řetězcem (Zymed) nebo protilátkek s lehkými řetězci (Promega). Jiné myší MAb, použité pro studium, jsou darem našich kolegů LM6O9 na ανβ3, P4C10 na β1 integrin (Carter a kol., 1990) (Telios) a AP3 na β3 řetězec (Furihata a kol., 1987) (ATCC).

Příklad 3 čištění protilátky. Pro čištění ve velkém měřítku se sklidí protilátkové supernatanty z exponenciálních fázových kultur pěstovaných v otáčecích baňkách. Protilátky čištěné na proteinové A Sepharose CL-4B (Pharmacia) se dialyzují proti PBS před sterilní filtrací (0,45 pm) a skladují se při teplotě -70 °C (Harlow a Lané, 1988). čištěné protilátky se zbaví endotoxinů vedením sloupcem Kurimover-II (Kurita-Vater; Tokyo). Toto snížilo hladiny endotoxinů z více než 250 IU endotoxinů na mg protilátky na méně než 0,2 IU na mg při testu Limulus (Melvaer a Fystro, 1982). Připraví se fragmenty F(ab’)2 a F(ab)’ 17E6 (myší IgGi ) o sobě známými způsoby pepsinového štěpení a separace na sloupcích proteinu-A (Pharmacia) s následným papainovým štěpením a separací gelovou filtrací (Harlow a Lané,

1988).

čištění integrinu: Izoluje se ανβ5 z lidské placenty (Smitj a Cheresh, 1988). Placenta se rozkrájí a promyje přibližně dvěma objemy ledově chladného roztoku A (0,05 % hmotnost/objem digitoninu, 2 mM CaClž, 2 mM PMSF, hodnota pH 7,4) a zfiltruje se. Zbylý materiál se extrahuje přibližně čtyřmi objemy ledobě » chladného pufru B (100 mM oktyl-3-D-glukopyranosidu [OG] , 1 mM

CaCl2, 2 mM PMSF v PBS) a odstředuje se (12000 gmax, 45 minut, 4 °C). Supernatant se recirkuluje přes P3D10 sloupec (16 hodin, 4 °C). Po promytí pufrem C (0,1 % NP-40 v PBS; přibližně 10 cv) a pufrem D (0,1 % NP-40, 2 mM CaCl2, 10 mM octanu sodného, hodnota pH 4,5; přibližně 10 cv) se vázaný materiál eluuje pufrem E (pufr D nastavený na hodnotu pH 3,1). Eluant se neutralizuje 3M Tris (hodnota pH 8,8), dialyzuje se proti pufru C a zkoncentruje se přibližně 10 krát za použití Aquacide II (Calbiochem). čištěné receptory se skladují při teplotě -70 °C.

Rekombinantní ανβ3 a ανβ6 se zbavují baciloviru infikovaného nejvýše pěti buňkami afinitní chromatografií na LM6O9 (ανβ3) a 17E6 (ανβ6) za eluování, koncentrování a skladování jako ανβ5. Připraví se αΙ^β3 z lidských destiček (Pytela a kol., 1986). Prošlé koncentráty se smísí s jedním objemem pufru Tyrodes, peletované (1200 g max) a peleta se extrahuje (jedna hodina, 20 °C) lýzovým pufrem (50 mM OG, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 1 μΜ MnCl2, 2 mM PMSF, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,4). Po odstředování (32000 g max, 30 minut, 4 °C) se supernatant recirkuluje (16 hodin, 4 °C) přes GRGDSPK-konjugovaný CL-4B Sepharosový sloupec. Sloupec se promyje lýzovým pufrem (přibližně 10 cv) a eluuje se za použití GRGDSPK (3 mg/ ml v 90% lýzovém pufru, 10 % DMSO). Pík se koncentruje přibližně pětinásobně, dialyzuje se proti modifikovanému 1ýzovému pufru (0,1 % NP-40 substituovaného pro OG) a skladovaného při teplotě -70 °C. Integrinové preparáty mají čistotu přibližně 95% a hodnotí se anti integrinem ELISA za použití a- a β-řetězce specifických monok1onálních protilátek a SDS-Page.

Technická využitelnost

Monoklonální protilátka pro výrobu farmaceutických prostředků pro potlačování karcinomů zvláště plic a tlustého střeva.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Monoklonální protilátka, která

   - reaguje pouze s αν-řetězcem lidských av-integrinů a

   - inhibuje selektivně vázání buněk nesoucích ανβθ-integrin na integrinový substrát.
2. 2.

   j ehož

   Monoklonální protilátka podle nároku růst buněk se má inhibovat, je karcinom

   1, přičemž nádor, plic UCLA-P3.
3. 3. Monoklonální protilátka podle nároku 1, přičemž nádor, jehož růst buněk se má inhibovat, je karcinom tlustého střeva HT-29.
4. 4. Fragment monoklonální protilátky mající vlastnosti mo noklonální protilátky podle nároku 1 až 3.
5. 5. Hybridomová buněčná 1 ložená pod objednacím číslem monoklonální protilátku podle
6. 6. Monoklonální protilátka linií DSM ACC2331.

   me oznacovana 271.14D9.F8 a uDSM ACC2331, schopná produkovat nároku 1 až 3.

   získatelná hybridomovou buněčnou
7. 7. Farmaceutický prostředek vyznačující se t í m , že obsahuje monoklonální protilátku podle nároku 1 až 4 nebo 6 a farmaceuticky vhodný nosič.
8. 8. Způsob přípravy monoklonální protilátky podle nároku 1 až 3 imunizací myši lidskou nádorovou buněčnou linií M21.
9. 9. Způsob přípravy monoklonální protilátky podle nároku 6 imunizací myši buněčnou linií M21 , selekcí klonů vázajících se na čištěné αν-integriny způsobem ELISA a produkcí o sobě známými způsoby buněčné linie podle nároku 5, která produkuje prot i 1át ky.
10. 10. Použití monoklonální protilátky podle nároku 1 až 4 nebo 6 pro výrobu drogy zaměřené na nádory, zvláště na buňku karcinomu tlustého střeva nebo plic nebo pro diagnostické lokace a posouzení růstu nádoru.