CZ2000284A3

CZ2000284A3 - Kosmetický prostředek

Info

Publication number: CZ2000284A3
Application number: CZ2000284A
Authority: CZ
Inventors: Sreekumar Pillai; Uma Santhanam; Marieann Barratt; Carol Annette Bosko
Original assignee: Unilever N. V.
Priority date: 1997-07-25
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2000-07-12
Also published as: WO1999004748A3; JP2001510778A; US6030620A; TW510800B; DE69812367T2; EP1003470A2; CN1264290A; CA2299457A1; WO1999004748A2; AU8858598A; CZ295087B6; EP1003470B1; KR100602963B1; DE69812367D1; RU2202336C2; ZA986043B; ES2194341T3; PL338337A1; BR9811113B1; KR20010022183A

Description

Kosmetický prostředek

Oblast techniky

Kosmetické prostředky s obsahem organického extraktu cizrny (chick peas) a způsoby kondicionování kůže nanesením těchto prostředků na kůži.

Dosavadní stav techniky

Lidská pokožka se skládá z dvou hlavních vrstev, spodní silnější vrstvy dermis a vrchní tenčí vrstvy epidermis. Dermis je vrstva, která ío dodává kůži pevnost, elasticitu a tloušťku.

Hlavním typem buněk v dermis jsou fibroblasty, které jsou odpovědné za syntézu a sekreci všech složek dermální matrix jako je kolagen, elastin a glykosaminoglykany. Kolagen poskytuje pevnost, elastin elasticitu a glykosaminoglykany vlhkost a měkkost kůže.

Stárnutím se tloušťka dermální vrstvy snižuje a předpokládá se, že tento jev je částečně odpovědný za tvorbu vrásek u stárnoucí kůže. Vrchní vrstva lidské pokožky nebo epidermis, která poskytuje elastičnost a bariérové vlastnosti kůže, je složena z mnoha různých typů buněk včetně keratinocytů, melanocytů a langerhansových buněk.

Keratinocyty hlavním typem buněk v epidermis (75 až 80 % celkového počtu buněk v lidské epidermis). Richards a další uváděli, že estrogen stimuluje sekreci proteinu prolaktinu buňkami lidských dermálních fibroblastů a prolaktin potom stimuluje proliferaci keratinocytů (viz Richards a další, Human Dermal Fibroblasts Express

Prolactin In Vitro, J. Invest. Dermatol., 106: 1250, 1996).

Estrogeny a syntetické sloučeniny působící podobně jako estrogeny podle dosavadních znalostí zvyšují tloušťku dermální vrstvy a snižují tvorbu vrásek u stárnoucí pokožky. Změny v kůži jako je ···· ·· · ·· ·» • 4·· 444·

4444 444·

44 444444« · · · • ··· ···· suchost kůže, ztráta elasticity kůže a měkkosti probíhající po menopauze je připisována nedostatku produkce estrogenů. Estrogenová terapie zabraňuje nebo zpomaluje mnoho těchto změn spojených se stárnutím kůže (Creidi a další, Effect of a conjugated estrogen cream on aging facial skin, Maturitas, 19, str. 211, 1994). Některé z účinků estrogenů na kůži jsou: zvětšení tloušťky kůže a zmizení jemných vrásek, zvýšení rychlosti mitózy epidermis, snížení velikosti a aktivity mazových žláz, zpomalení rychlosti růstu vlasů, stimulace obratu kolagenu a zvýšení produkce kyseliny hyaluronové ío a glykosaminoglykanu fibroblastů (Pugliese, Menopausal skin, Skin lne., březen/duben 1994: str. 69 - 77).

V posledních letech se stále více používají pro terapeutické účely fytoestrogeny (tj. přírodní sloučeniny s aktivitou podobnou estrogenům, které se nacházejí v rostlinách). Některá z popisovaných použití jsou hypocholesterolemické a antiatherogenické prostředky, léčba kardiovaskulárních onemocnění zvláště u žen po menopauze, léčení osteoporózy u starších osob a protirakovinný prostředek zvláště u rakoviny prsní žlázy a rakoviny děložního hrdla a endometria u žen (Knight a další, Phytoestrogens - a short review, Maturitas, 22: 167 20 75, 1995).

Požadavek zákazníků na „přírodní“ produkty v posledních letech stoupá. Zákazníci vnímají chemickou syntézu jako nebezpečnou pro životní prostředí. Chemicky syntetizovaná složka může obsahovat škodlivé chemikálie. Na přírodní produkty se pohlíží jako na čisté a jemné a lepší než produkty chemicky syntetizované. Získávání kosmeticky prospěšných účinků z rostlinných zdrojů však není jednoduché. Pro odvození skutečného prospěšného účinku z „přírodního“ zdroje musí být identifikována nejen rostlina nebo část rostliny obsahující konkrétní účinnou látku, ale musí být také identifikována minimální koncentrace a/nebo zvláštní extrakt této rostliny, které skutečně přispívají k dosažení kosmeticky prospěšného účinku.

····· ··· ·· ·· • · · · · · · · · · • · ···· · · · · • · · · ······· ·· · • · ··· ···· • · · · · · · ·· ··

- 3 Bylo popsáno více než 500 sloučenin přítomných v rostlinách s estrogenními účinky. Tyto sloučeniny, které se souhrnně nazývají fytoestrogeny, se nacházejí v řadě rostli včetně obilovin, luštěnin (včetně cizrny) a trav (Price a další, Naturally occurring estrogens in foods - a review, Food additives and contaminants, 2, str. 73 - 106, 1995). Jejich koncentrace se liší v různých částech rostlin, podle zeměpisné polohy, roku pěstování apod. Dvě hlavní třídy rostlinných sloučenin s fytoestrogenními účinky jsou flavonoidy a kumestany. Některé z běžně popisovaných sloučenin jsou genistein, biochanin A, ío formononetin, daidzein ajejich glykosidové deriváty (Knight a další, Phytoestrogens - a short review, Maturitas, J. Climactreic and postmenopause, 22, str. 167 - 75, 1995).

Cizrna neboli španělský hrách (Cicer arietinum), běžná dietní luštěnina, obsahuje flavonoidy včetně daidzeinu, formononetinu, biochaninu A, pratenseinu, homoferreirinu, medicarpinu, maackiainu, methylkumestrolu, medicagolu, glukosidu formononetinu a glukosidu biochaninu A (Ingham a další, v: Progress in the chemistry of Organic natural products, díl 43: ed. W. Herz a další, Springer-Verlag, Wien, New York 1983).

Uvádí se, že flavonoidy z cizrny způsobují snižování hladiny lipidů v krvi a játrech krys. Několik studií zabývajících se výživou uvádělo použití proteinu z cizrny jako dodatku k výživě a způsoby pro zlepšení jakosti proteinu cizrny. Vasiliou, US patent No. 4,761,285 popisuje použití cizrny jako doplňku výživy pro vnitřní nebo místní léčení hemoroidů. V Indii se z práškové cizrny ve směsi s vodou vyrábí kosmetická maska nebo prostředek pro ošetření kůže pro běžné zkrášlování pokožky.

WO 96/38162 popisuje různá použití lektinů odvozených mj. z cizrny včetně obnovení původního vzhledu vrásčité kůže.

3o Výše popsaný dosavadní stav techniky neuvádí organické extrakty cizrny a jejich použití pro péči o kůži nebo v kosmetice.

• ···· ··« ·· ·· • · φ · · φ · · · · • · φ φ φ · ···· • φ «· ΦΦΦΦ··· ·· · ·· ··· ···· •ΦΦΦ φφ φ ·· ··

- 4 Dosavadní stav techniky neuvádí místní použití organických extraktů cizrny jako fytoestrogenu a jako látky se specifickou estrogenní aktivitou.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález zahrnuje prostředek pro péči o kůži obsahující:

(i) organický extrakt cizrny v dostatečném množství pro poskytnutí ekvivalentu estrogenní aktivity alespoň 1 nM estradiolu, ío přičemž estrogenní aktivita se stanoví testem popsaným v příkladu 1 popisu;

(ii) kosmeticky přijatelné vehikulum.

Předkládaný vynález také zahrnuje způsob zlepšení nebo prevence stavu kůže s různými typy vrásek, suché, olupující se, zestárlé, nebo působením světla poškozené kůže a zlepšení tloušťky, elasticity, pružnosti a měkkosti kůže pro prevenci nebo snížení degenerativních změn.

Předkládaný vynález také zahrnuje kosmetický způsob zvýšení proliferace fibroblastů a epidermálních kožních buněk v lidské kůži nanesením prostředku podle vynálezu na kůži.

Podrobný popis vynálezu

Cizrna

Cizrna je vhodná pro použití v prostředcích podle vynálezu ve formě organického extraktu. Extrakt cizrny se připravuje pro použití v předkládaném vynálezu ze sušené cizrny. Sušená cizrna může být získána od firmy Arrowhead Mills, z obchodu se zdravou výživou nebo v supermarketech.

»· · ··· · · · · • · · · · · ···· • · ·· ······· ·· · • · ··· · · · · ···· ·· · ·· ··

- 5 Organické extrakty cizrny se připravují extrakcí sušené cizrny rozpouštědlem mícháním jedné části sušené cizrny s dvěma až pěti částmi rozpouštědla po dobu 4 až 24 hod při pokojové teplotě. Vhodná rozpouštědla jsou popsána dále. Extrakty se vyčeří filtrací a/nebo centrifugací, potom se suší odpařením (popřípadě ve vakuu) za získání organického extraktu cizrny.

Mezi rozpouštědla vhodná pro přípravu extraktu cizrny pro použití v rámci předkládaného vynálezu patří bez omezení: ethanol, methanol, hexan, chloroform, dichlormethan a ethylacetát. Výhodnými ío rozpouštědly pro dosažení optimálního účinku jsou dichlormethan, methanol nebo ethanol.

Extrakt je možno dále koncentrovat, frakcionovat, reextrahovat nebo purifikovat, například extrakcí organickým rozpouštědlem nebo chromatograficky.

Jako součást vynálezu bylo zjištěno, že organický extrakt cizrny musí být použit v určitém minimálním množství, aby bylo dosaženo estrogenního účinku.

Extrakt nebo prášek cizrny se používá v množství od 0,0001 do 50 % hmotnostních, pokud poskytne estrogenní účinek ekvivalentní alespoň 1 nM estradiolu, obecně v rozmezí od 1 nM do 100 nM estradiolu. Estrogenní aktivita extraktu cizrny se určuje porovnáním s aktivitou 1 nM estradiolu s použitím buněk ZR-75 v porovnávacím experimentu, jak je popsáno v příkladu 1 níže.

Extrakt cizrny se s výhodou používá v takovém množství, aby bylo dosaženo estrogenní aktivity ekvivalentní alespoň 2 nM estradiolu.

Kosmeticky přijatelné vehikulum

Prostředek podle vynálezu také obsahuje kosmeticky přijatelné

3o vehikulum, které působí jako ředivo, dispergační prostředek nebo * ♦ · φφ φφ • · · · · · • · · φ φ · ·

ΦΦΦΦΦΦ· · · · • · φφφ φφφφ ··· · ·· φ φφφφ

- 6 nosič pro extrakt cizrny v prostředku, aby bylo umožněno dosáhnout distribuce extraktu při nanášení prostředku na kůži.

Mezi vehikuly jinými než voda nebo navíc k vodě mohou být obsaženy kapalné zvláčňující prostředky, rozpouštědla, zvlhčující látky, zahušťovadla a pudry. Zvláště výhodným nevodným nosičem je polydimethylsiloxan a/nebo polydimethylfenylsiloxan. Jako silikony podle předkládaného vynálezu mohou být použity sloučeniny s viskozitami kdekoli v rozmezí od přibližně 10'⁵ do 10 m²s’¹ při 250 °C. Zvláště žádoucí jsou směsi silikonů s nízkou a vysokou ío viskozitou. Tyto silikony jsou dostupné od firmy General Electric Company pod obchodními známkami Vicasil, SE a SF a od firmy Dow Corning Company pod označením 200 a 550 Series. Množství silikonu, které může být v prostředcích podle předkládaného vynálezu použito, se pohybuje od 5 % do 95 % hmotnostních, s výhodou od 25 % do

90 % hmotnostních.

Kosmeticky přijatelné vehikulum bude obvykle tvořit od 5 % do 99,9 % hmotnostních, s výhodou od 25 % do 80 % hmotnostních z prostředku a v nepřítomnosti jiných kosmetických pomocných látek může doplňovat celkové složení prostředku do 100 %. Vehikulum s výhodou obsahuje alespoň 80 % hmotnostních vody z množství vehikula. Voda s výhodou tvoří alespoň 50 % hmotnostních prostředku podle vynálezu, výhodněji od 60 do 80 % hmotnostních prostředku.

Popřípadě přítomné další látky s prospěšným účinkem na kůži a kosmetické pomocné látky

Olej nebo olejovitý materiál může být přítomen spolu s emulgátorem pro poskytnutí emulze buď typu voda v oleji nebo olej ve vodě v závislosti ve velké míře na průměrné hydrofilně-lipofilní rovnováze (HLB) použitého emulgátoru.

• · · · ······· · · · • · ··· ···· • · · · · * · « · « ·

- 7 Prostředky podle vynálezu s výhodou obsahují látky s ochranným účinkem proti slunečnímu záření. Mezi látky $ ochranným účinkem proti slunečnímu záření patří látky běžně používané pro zabránění přístupu ultrafialového světla. Ilustrativními sloučeninami jsou deriváty PABA, cinnamát a salicylát. Je například možno použít oktylmethoxycinnamátu a 2-hydroxy-4-methoxybenzofenonu (známý také jako oxybenzon). Oktylmethoxycinnamát a 2-hydroxy-4methoxybenzofenon jsou komerčně dostupné pod obchodními názvy Parsol MCX a Benzophenone-3. Přesné množství látek s ochrannými účinky proti slunečnímu záření použitých v emulzích může záviset na požadovaném stupni ochrany před UV zářením slunce.

Do kosmetických prostředků podle předkládaného vynálezu se také často přidávají zvláčňující látky. Množství těchto zvláčňujících látek může být 0,5 % až 50 % hmotnostních, s výhodou mezi 5 % a 30 % hmotnostními z celkového prostředku. Zvláčňovadla je možno zařadit do obecných chemických kategorií jako estery, mastné kyseliny a alkoholy, polyoly a uhlovodíky.

Estery mohou být mono- nebo diestery. Vhodnými příklady mastných diesterů jsou dibutyladipát, diethylsebakát, diisopropyldimerát a dioktylsukcinát. Přijatelné mastné estery s rozvětveným řetězcem jsou například 2-ethylhexylmyristát, isopropylstearát a isostearylpalmitát. Mezi přijatelné estery s tribasickými kyselinami patří triisopropyltrilinoleát a trilaurylcitrát. Přijatelnými mastnými estery s přímým řetězcem jsou například laurylpalmitát, myristyllaktát a stearyloleát. Mezi výhodné estery patří kokosový kaprylát/kaprát (směs kokosového kaprylátu a kokosového kaprátu), propylenglykolmyristyletheracetát, diisopropyladipát a cetyloktanoát.

Mezi vhodné mastné alkoholy a kyseliny patří sloučeniny obsahující od 10 do 20 atomů uhlíku. Zvláště výhodné jsou sloučeniny jako cetyl-, myristyl-, palmityl- a stearylalkoholy a kyseliny.

- 8 Mezi polyoly, které mohou sloužit jako zvláčňující prostředky, patří alkylpolyhydroxylové sloučeniny s přímým a rozvětveným řetězcem. Výhodné jsou například propylenglykol, sorbitol a glycerol. Mohou být také použity polymerní polyoly, jako je polypropylenglykol a polyethylenglykol. Zvláště výhodné sloučeniny umožňující zvýšení penetrace jsou butylen a propylenglykol.

Jako příklady uhlovodíků, které mohou být použity jako zvláčňující látky jsou sloučeniny s délkami uhlovodíkového řetězce od 12 do 30 atomů uhlíku. Konkrétními příklady jsou minerální olej, ropná ío vazelína, skvalen a isoparafiny.

Další kategorií funkčních složek v kosmetických prostředcích podle předkládaného vynálezu jsou zahušťovadla. Zahušťovadla budou obvykle přítomna v množství od 0,1 do 20 % hmotnostních, s výhodou od přibližně 0,5 % do 10% hmotnostních z prostředku.

Příklady zahušťovadel jsou zesítěné polyakrylátové materiály dostupné pod obchodním názvem Carbopol formy B. F. Goodrich Company. Mohou být také použity gumy jako je xanthanová, karagenanová guma, želatina, karaya, pektin a rohovníkový mannogalaktan. Za jistých podmínek mohou jako zahušťovadla fungovat také materiály sloužící jako silikon nebo zvláčňující prostředek. Takovou dvojí funkci mají například silikonové gumy s větší viskozitou než 10 x 10'⁶ m²s¹a estery jako je glycerolstearát.

Do kosmetického prostředku podle vynálezu mohou být také přidány pudry. Mezi pudry patří křída, talek, kaolin, škrob, smektitové jíly, chemicky modifikovaný křemičitan hořečnatohlinitý, organicky modifikovaný montmorillonitový jíl, hydratovaný křemičitan hlinitý, koloidní oxid křemičitý, hlinitá sůl škrobového oktenylsukcinátu a jejich směsi.

Do kosmetických prostředků podle předkládaného vynálezu mohou být také přidány další pomocné složky přítomné v menším množství. Mezi tyto složky mohou patřit barviva, zakalovadla « φφ φ • · φ · · ♦ · · · · • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 99 · 9999 9 9 99 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 Φ ♦· »·

- 9 a parfémy. Množství těchto dalších pomocných složek přítomných v menším množství může být v rozmezí od 0,001 % hmotnostních až do 20 % hmotnostních z celkového prostředku.

Použití prostředku

Prostředek podle vynálezu je primárně určen jako výrobek pro místní použiti na lidskou pokožku, zvláště jako prostředek pro kondicionování, zvlhčování a vyhlazování kůže, zvětšení její tloušťky, pružnosti a elasticity a zabránění nebo snížení přítomnosti různých ío druhů vrásek nebo zestárlé kůže.

Při použití se na oblasti kůže vystavené působení vnějšího prostředí nanese z vhodného zásobníku nebo aplikátoru malé množství prostředku, například od 1 do 100 ml, a potom se v případě potřeby roztírá a/nebo vtírá do pokožky použitím ruky nebo prstů nebo vhodného zařízení.

Forma výrobku a balení

Prostředek pro místní použití k péči o kůži podle vynálezu může být ve formě pleťové vody, krému nebo gelu. Prostředek může být balen ve vhodném zásobníku, který vyhoví viskozitě prostředku a požadovanému použití zákazníkem. Například pleťovávoda nebo krém mohou být baleny v lahvičce nebo kuličkovém aplikátoru nebo aerosolovém zařízení s hnacím plynem nebo zásobníku opatřeném pumpičkou vhodnou pro pohon prstem. Jestliže je prostředkem krém, může být jednoduše skladován v nedeformovatelné lahvičce nebo vymačkávacím zásobníku, jako je například tuba nebo nádobka opatřená víčkem. Prostředek může být také obsažen v kapslích, jako se popisují například v US patentu 5,063,507, který se zařazuje odkazem. Vynález tedy také poskytuje uzavřený zásobník obsahující kosmeticky přijatelný prostředek definovaný výše.

• 9

9 9

9 9 9

9 9 9 4»

- 10 Následující konkrétní příklady dále ilustrují vynález, který však není na tyto příklady omezen. Všechny hodnoty p v příkladech byly vypočteny s použitím Studentova t-testu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Tento příklad ukazuje, že organický extrakt cizrny při dostatečné koncentraci pro poskytnutí fytoestrogenní aktivity ekvivalentní alespoň 1 nM estradiolu je použitelný pro předkládaný vynález.

Příprava extraktů cizrny

Sušená cizrna byla získána od firmy Arrowhead Mills (Hareford, TX) a za sucha v mlýnku rozemleta na prášek. Takto získaná prášková cizrna byla extrahována použitím dichlormethanu (DMC) nebo methanolu (1:3 hmotnost/objem) mícháním suchého prášku s rozpouštědlem 20 hod při pokojové teplotě. Extrakty byly vyčeřeny filtrací a centrifugací. Extrakty byly potom vysušeny odpařením ve vakuu za získání suchého extraktu. Extrakce 63 g suché práškové cizrny DCM rozpustila 1,47 g suchého materiálu; extrakce 60 g

2o práškové cizrny methanolem rozpustila 2,434 g suchého materiálu. To odpovídá extrakci 2,31 % hmotnostních s použitím DCM a 4,06 % hmotnostních s použitím methanolu. Tento suchý extrakt byl potom znovu rozpuštěn v dimethylsulfoxidu (DMSO) při koncentraci 50 pg/pl pro dávkování pro buňky.

Metody použité pro stanovení rychlosti syntézy DNA v buňkách

Pro měření buněčné proliferace (ZR75 nebo keratinocyty) bylo použito inkorporace ³H-thymidinu. Thymidin je jedním ze čtyř deoxynukleosidů, které jsou monomerními jednotkami DNA. Před ·· · ··· ···· * · ···· « φ · · • · «· ·····«· · · · ·· ··· ···· ··* · ·· · ·· ··

- 11 buněčným dělením somatické buňky se replikuje úplný genom buňky, u které probíhá dělení. Tento proces zahrnuje syntézu DNA ve velkém měřítku buňkou a umožňuje, aby obě dceřinné buňky získaly identické kopie genetického materiálu. Jestliže se do kultivačního média obsahujícího buňky syntetizující DNA při přípravě na dělení buněk přidá ³H-thymidin, potom se do nově syntetizované DNA inkorporuje značený thymidin. Míra inkorporace ³H-thymidinu do populace buněk je úměrná rychlosti syntézy DNA u této populace buněk, a proto je ukazatelem proliferace těchto buněk.

Následující test byl použit pro zjištění, zda mají organické extrakty cizrny fytoestrogenní aktivitu a zda je tato aktivita ekvivalentní koncentraci estradiolu alespoň 1 nM.

Buněčná linie ZR75 je buněčná linie karcinomu vývodu mléčné žlázy, který byl původně izolován z maligního prsního epitelu 36 letě kavkazské ženy (Engel a další, Human breast carcinoma celíš in continuous culture: A review, Cancer Res., 38: 4327 - 4339, 1978). Tato buněčná linie obsahuje receptory pro estrogen, progesteron a jiné steroidní hormony, ale zvýšením proliferace odpovídá pouze na estrogen. Buněčná line obsahuje receptory specifické pro estrogen s vysokou afinitou. Proto se tato buněčná linie používá pro testování estrogenové aktivity (Markiewicz a další, In vitro bioassays of nonsteroidal phytoestrogens, J. Steroid Biochem. Molec. Biol., 45: 399 405, 1993).

1. Buňky ZR75 (získané z American Type Culture Collection,

Rockville, Maryland) byly pěstovány v médiu RPMI1640 (firmy

Gibco Life Technologies) s 10 % fetálního bovinního séra (FBS), 100 jednotkami penicilinu na ml a 100 jednotkami streptomycinu na ml. Média neobsahovala, fenolčerveň (látka mírně napodobující účinky estrogenu). Buňky byly vysévány na hustotu jeden milion do láhve 75 cm². Pro experiment byly buňky

- 12 očkovány do 24-jamkových destiček v množství 100 000 buněk na ml na jamku.

2. Po 24 hod růstu byla média odstraněna, buňky byly promyty

PBS a 1 ml RPMI 1640 bez séra (ale se streptomycinem a penicilinem). Byly připraveny zásobní roztoky cizrnového extraktu v dimethylsulfoxidu (DMSO) a estradiolu ve vodě. Potom byly přímo do každé jamky dávkovány různé koncentrace organického extraktu cizrny a estradiolu, jak je uvedeno v ío tabulce 1. Po dalších 24 hod bylo do každé jamky přidáno 370 kBq [methyl-3H]thymidinu. Médium bylo odstraněno po 24 hod. Buňky byly jednou promyty PBS, PBS bylo úplně odsáto a buňky byly ponechány na ledu inkubovat s 1 ml na jamku 10 % TCA (kyselina trichloroctová) 30 min. Destičky byly třikrát promyty 5 % TCA pro odstranění veškerých stop thymidinu, který nebyl inkorporován do buněk. Do každé jamky bylo přidáno 500 μΙ 0,1 M hydroxidu sodného a destičky byly inkubovány při pokojové teplotě dalších 30 min. 250 μΙ každého vzorku bylo převedeno do scintilačních lahviček a po přidání 5 ml scintilační kapaliny bylo prováděno počítání impulzů v lahvičkách po dobu vždy 5 min s nastavením na tritium. Údaje z triplikátů stanovení v jamkách byly přepočteny jako procenta inkorporace thymidinu do DNA ve srovnání s kontrolními jamkami, do kterých nebyl přidán extrakt cizrny ani estradiol. Hodnoty byly vyjádřeny jako střední hodnota triplikátů jamek ± standardní odchylka.

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 1.

- 13 ·· · ·· ·· • · · » · · · • ♦ · · · · · · • · · ♦ I··· · · · · · • · · · · · · · • ·· · ·· ·♦

Tabulka 1

Estradiol (nM)	Syntéza ZR 75 DNA (% kontroly)	DCM extrakt cizrny (pg/ml)	Syntéza ZR 75 DNA (% kontroly)
0	100 ± 10	0	100 ± 17,5
0,01	117 ± 19,7	0,01	106 ± 12,8
0,1	106 ± 16,3	0,1	176 ± 25,6*
1,0	162 ± 3,2*	1,0	174 ± 16,6*
10,0	267 ± 15,1*	10,0	226 ± 28,7*
100	203 ± 51,2*
1000	178 ± 20,1*

* Hvězdičkou je označena statisticky významná stimulace syntézy DNA ve srovnání s kontrolou s hladinou p <0,05.

Jak je vidět z výsledků v tabulce 1, koncentrace estradioiu 1 nM (0,274 ng/ml) nebo vyšší, zvyšovaly syntézu DNA u buněk ZR75. Podobná aktivita uvedeného extraktu cizrny byla získána při koncentraci 0,1 pg/ml nebo vyšší.

Organický extrakt cizrny je vhodný pro použití v prostředcích ío podle vynálezu v takovém množství, které poskytne estrogenní aktivitu ekvivalentní alespoň 1 nM estradioiu. U tohoto konkrétního extraktu poskytlo požadovanou aktivitu 0,1 pg cizrny na 1 ml média.

Příklad 2

Příklad 1 byl dvakrát opakován s různými koncentracemi cizrny, jak je uvedeno v tabulce 2.

• · · ·

- 14 • Φ ♦· • · · · · 9 « • · · · · · · · • · · · ···* »9 «φ · • · · · · · · 9 • ·· · ·· ·♦

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.

Tabulka 2

Testovaná látka	cpm±SD	% kontroly	hodnota p
Experiment 2:
Kontrola	14 566 ± 719	100 ± 4,9
Estradiol (10 nM)	122 254 ± 3940	839 ± 27	0,000003
DCM extrakt cizrny (10 pg/ml)	22 530 ± 1302	154,6 ± 8,9	0,0016
Experiment 3:
Kontrola	14 302 ± 1669	100 ± 11,6
Estradiol (10 nm)	30 158 ± 1087	211 ± 7,6	0,0004
DCM extrakt cizrny (1,0 pg/ml)	26 053 ± 901	182 ± 6,3	0,0009
DCM extrakt cizrny (10,0 pg/ml)	49 541 ± 591	346 ± 2,1	0,000005

Jak je vidět z výsledků uvedených v tabulce 1 (reprezentujících experiment 1) a tabulky 2, která ve třech oddělených experimentech provedených ve třech různých dnech s použitím tří různých pasáží buněk ZR75, organický extrakt cizrny signifikantně stimulovat proliferaci buněk ZR75.

- 15 Příklad 3

Tento příklad ilustruje, že keratinocyty vylučovaly působením organického extraktu cizmy látku, která stimulovala proliferaci fibroblastů.

Buněčná kultura keratinocvtů

Lidské keratinocyty izolované z novorozenecké předkožky působením trypsinu byly pěstovány v médiu Dulbecco Modification Eagle (DME) Hams F12 (3:1)/5 % fetální telecí sérum v přítomnosti ío myších fibroblastů 3T3 ošetřených mitomycinem C pro vytvoření kolonií dělících se keratinocytů. Buňky byly za těchto podmínek pěstovány až do druhé pasáže a byly uchovávány pro další použití ve zmrazeném stavu. Zmrazená druhá pasáž keratinocytů byla ponechána roztát, byla vyseta na výše uvedené médium a byla pěstována 5 dnů. Pátý den, kdy buňky dosáhly 70 až 80 % konfluence, byly buňky trypsinizovány a vysety v koncentraci 20 000 až 30 000 buněk na jamku do 24-jamkových destiček v bezsérovém médiu pro růst keratinocytů (KGM, firma Clonetics, San Diego CA) s obsahem 0,15 mM vápníku. Buňky byly pěstovány do 80 % konfluence 5 dnů před experimentem.

Buněčná kultura fibroblastů

Fibroblasty novorozenecké lidské předkožky získané od firmy Clonetics Corporation (San Diego, CA) byly pěstovány v médiu DMEM s obsahem 10 % fetálního bovinního séra (firma Life Technologies, Grand Island, NY). Experimenty byly prováděny na buňkách mezi pátou a patnáctou pasáží. Buňky byly vysety v koncentraci 7000 až 10 000 na ml do 24-jamkových destiček a pěstovány do 80 % konfluence 5 dnů před experimentem.

·«··

- 16 ·· ·· ► · · · » · · · » · · · > · · · ·· ·· keratinocytů cizrny, bylo následujícím

Příprava média kondicionovaného keratinocyty

Pro experimenty, které hledaly interakci a fibroblastů jako odpověď na působení extraktů připraveno médium kondicionované keratinocyty způsobem: keratinocyty v 80 % konfluenci připravené jak bylo popsáno výše, byly smíseny s různými koncentracemi extraktů cizrny (jak je uvedeno v tabulce 3) a kultura byla pěstována 24 hod v médiu RPMI bez séra a fenolčerveni. Médium odebrané z těchto destiček se označuje jako „médium kondicionované keratinocyty).

Metodologie testu

Ke keratinocytům a fibroblastům byly odděleně přidávány různé koncentrace extraktu cizrny v 1 ml média RPMI bez séra a fenolčerveni. Do fibroblastů byl také přidáván 1 ml média kondicionovaného keratinocyty. Po 24 hodinách byl přidán ³H-thymidin v koncentraci 370 kBq na jamku a buňky byly inkubovány 24 hod. Množství ³H-thymidinu asociovaného s buněčnou DNA bylo zjišťováno podle popisu v kroku 2 příkladu 1.

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

»· • 4 4 4

4 4 4

4 4 ·

4 4 4

44

- 17 • 4·4· ·* 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4 • 4 4* 44444

4 4 4 4 •444 44 4

Tabulka 3

Testovaná látka	Keratinocyty cpm±SD (% kontroly)	Fibroblasty cpm±SD (% kontroly)	Médium kondicionované keratinocyty na fibroblastech cpm±SD (% kontroly)
Kontrola	105 514 ± 19 070 (100 ± 18,1)	32 206 ± 1207 (100 ± 3,7)	24 385 ± 3056 (100 ± 12,5)
DCM extrakt cizrny
0,1 pg/ml	109 855 ± 28 739 (104 ± 27,2) p = 0,838	39 617 ± 6046 (123 ± 18,7) p = 0,1057	47 799 ± 3920 (196 ± 16,0) p = 0,00132
1,0 pg/ml	105 596 ± 19 888 (100 ± 18,8) p = 0,996	35 237 ± 3279 (109 ± 10,2) p = 0,2074	42 093 ± 5448 (172 ± 1,83) p = 0,0079

Výsledky v tabulce 3 ukazují, že extrakty cizrny nemají přímý vliv ani na proliferaci keratinocytů, ani fibroblastů. Extrakt cizrny však 5 indukoval u keratinocytů sekreci látek podporujících růst fibroblastů, protože kondicionované médium z keratinocytů vystavených působení extraktu cizrny významně zvyšovalo proliferaci fibroblastů.

Příklad 4 ío Tento příklad ukazuje, že organické extrakty cizrny zvyšují proliferaci buněk u epidermální části kůže selete. V tomto příkladu byly testovány estradiol, čisté fytoestrogenní sloučeniny a extrakty cizrny na jejich vliv na proliferaci epidermálních buněk.

- 18 ·*·« ·♦ · ·· ·· • · · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 «Μ' 99 9 9 9 ·· · · · · · ·· 9 99 99

Orgánová kultura kůže selete

Prasečí kůže je morfologicky a biochemicky podobná lidské kůži a proto se běžně používá pro testování vlivů látek pro místní použití na lidské kůži. Čerstvě oholená kůže selat byla získána z místních jatek, omyta mýdlem Dove® Soap a nařezána na plátky o tloušťce 200 pg pro získání vrchní epidermální a dermální vrstvy. Stejnoměrné biopsie nařezané prasečí kůže byly získány použitím průbojníku 7 mm. Bioptické vzorky byly promyty v médiu obsahujícím vysoké koncentrace antibiotik/antimykotik (kanamycin a penicilín a streptomycin firmy Gibco) a inkubovány 3 dny v médiu DMEM s vysokou koncentrací glukózy obsahujícím hydrokortizon, L-glutamin, antibiotikum a antimykotikum, bez přítomnosti séra na destičkách typu transwell, tři bioptické vzorky na jamku. Médium bylo přiváděno ode dna jamky takovým způsobem, že epidermální vrstva bioptických vzorků byla ve styku se vzduchem. Třetí den bylo médium zaměněno za čerstvé médium a bioptické vzorky byly vystaveny působení různých koncentrací různých účinných látek v 1 pl DMSO, jak je uvedeno v tabulce 4. O tři dny později bylo médium vyměněno, znovu byly přidány účinné látky a bioptické vzorky byly značeny 370 kBq ³H thymidinu na jamku. Po promytí bioptických vzorků PBS byla epidermis oddělena od dermis inkubací bioptických vzorků 24 hod ve 2 M roztoku bromidu sodného za třepání. Epidermis byla odtržena od dermis pinzetou a rozpuštěna v 1 ml 0,5 N NaOH při inkubaci přes noc při

60 °C. Pro scintilační počítání bylo použito 200 pl rozpuštěné epidermis pro zjištění množství inkorporace ³H thymidinu do epidermis. Údaje byly vypočteny jako střední hodnota cpm pro alespoň čtyři opakování a byly také vypočteny jako procenta kontrolních bioptických vzorků, ke kterým nebyly přidány žádné účinné látky.

Získané výsledky jsou shrnuty v tabulce 4.

·♦ ·· ····

- 19 ·« · ·· · • · · • · · · • · · ···· · • · · ·· · • « · • · · • · · « · · *· ··

Tabulka 4

Testovaná látka	cpm ± SD	% kontroly	hodnota p
Experiment 1
Kontrola	4563+1523	100+33,3
Estradiol
1 nM	2690±1113	58,9+24,4
10 nM	5190+1096	113+24	0,476
100 nM	1757+1492	39,0+32,6
Isoflavonoidy
Kontrola	3789+1164	100+30,7
Daidzein 1 μΙ/ml	8599+927	227+24,4	0,000226
10 pl/ml	11065+2901	292+76,5	0,00228
Formononetin 1 pg/ml	4770+1260	126+33,2	0,826
10 pg/ml	6608+2886	174+76,1	0,1867
DCM extrakt cizrny
0,1 pg/ml	10922+3887	288+102	0,0099
1,0 pg/ml	13149+3037	347+80	0,000686
Experiment 2
Kontrola	1155+69	100+5,9
Estradiol 1 nM	2273+783	196+67,7	0,1147
Estradiol 10 nM	3817+1175	330+101	0,0292
Estradiol 100 nM	2785+751	241+65	0,0339
Methanolový extrakt cizrny
Kontrola	4451+1961	100+44

- 20 Tabulka 4 - pokračování

Testovaná látka	cpm ± SD	% kontroly	hodnota p
0,01 pg/ml	5503±3026	123±67,9	0,5463
0,1 pg/ml	8435±2034	189±45,6	0,0205
1 pg/ml	2256±704	50,6±15,8	—

Jak je vidět z výsledků v tabulce 4, ve dvou oddělených experimentech zvyšoval estradiol při 10 nM koncentraci proliferaci epidermálních buněk selat (v experimentu 2 byl přírůstek statisticky významný). Daidzein také vykázal tento účinek, přičemž byl účinnější než přírodní hormon estradiol. Další isoflavon, formononetin, neměl významné stimulační účinky na růst epidermis prasete. Vliv na podporu růstu měly jak methanolové, tak dichlormethanové extrakty ío cizrny, přičemž dichlormethanový extrakt byl účinnější než extrakt methanolový. Dichlormethanový extrakt cizrny byl ještě účinnější než čisté isoflavony nebo estradiol. Výsledky ukazují prospěšné účinky organického extraktu cizrny na kožní buňky v modelovém systému, který se velmi podobá lidské kůži.

Příklady 5 až 10 ilustrují prostředky podle předkládaného vynálezu k péči o kůži. Prostředky je možno zpracovávat běžným způsobem. Jsou vhodné pro kosmetické použití. Tyto prostředky jsou zvláště vhodné pro použití na kůži s různými druhy vrásek, hrubou, suchou, olupující se kůži, zestárlou kůži a/nebo kůži poškozenou působením UV záření pro zlepšení vzhledu kůže a pocitu, stejně jako pro použití na zdravou pokožku pro zabránění nebo zpomalování její degradace.

999 999 9

9999 9999

99 9999999 99 9

999 9999

99 9 99 99

- 21 Příklad 5

Tento příklad ilustruje emulzi typu voda v oleji s vysokým obsahem vnitřní fáze obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
DCM extrakt cizrny	0,5
1,3-dimethyl-2-imidazolidinon	0,2
Brij 92*	5
Bentone 38	0,5
MgSO₄ . 7H₂O	0,3
Butylovaný hydroxytoluen	0,01
Parfém	qs
Voda	do 100

* Brij 92 je polyoxyethylen (2) oleylether • · · · ···· • * · · · · «· · • · · ······· · · · • · · · · · · · • ·· · · · ··

- 22 Příklad 6

Tento příklad ilustruje krém typu olej ve vodě obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
Methanolový extrakt cizrny	2
Minerální olej	4
1,3-dimethyl-2-imidazolidinon	1
Brij 56*	4
Alfol 16RD*	4
Triethanolamin	0,75
Butan-1,3-diol	3
Xanthanová guma	0,3
Parfém	qs
Butylovaný hydroxytoluen	0,01
Voda	do 100

* Brij 56 je cetylalkohol POE (10) Alfol 16RD je cetylalkohol

- 23 Příklad 7

Tento příklad ilustruje alkoholickou pleťovou vodu obsahující prostředek podle předkládaného vynálezu.

	% hmotnostní
Methanolový extrakt cizrny	5
1,3-dimethyl-2-imidazolidinon	0,1
Ethanol	40
Parfém	qs
Butylovaný hydroxytoluen	0,01
Voda	do 100

Příklad 8

Tento příklad ilustruje další alkoholickou pleťovou vodu obsahující směs podle předkládaného vynálezu.

	% hmotnostní
DCM extrakt cizrny	10
1,3-dimethyl-2-imidazolidinon	0,01
Ethanol	40
Antioxidant	0,1
Parfém	qs
Voda	do 100

• ··· ···· • ···· ···· • ·· ······· ·· · • ··· ···· ·· · · · · · · ·

- 24 Příklad 9

Tento příklad ilustruje krém s ochrannými účinky proti působení slunečního záření obsahující prostředek podle vynálezu.

	% hmotnostní
Ethanolový extrakt cizrny	2
1,3-dimethyl-2-imidazolidinon	0,2
Silikonový olej 2 χ 10'⁴ m²s'¹	7,5
Glycerylmonostearát	3
Cetostearylalkohol	1,6
Polyoxyethylen-(20)-cetylalkohol	1,4
Xanthanová guma	0,5
Parsol 1789	1,5
Oktylmethoxycinnamát (PARSOL MCX)	7
Parfém	qs
Barva	qs
Voda	do 100

- 25 Příklad 10

Tento příklad ilustruje nevodný prostředek k péči o kůži obsahující kombinaci podle vynálezu.

	% hmotnostní
DCM extrakt cizrny	5
1,3-dimethyl-2-imidazolidinon	1
Silikonová guma SE-30¹	10
Silikonová kapalina 345²	20
Silikonová kapalina 344³	50,26
Skvalen	10
Kyselina linolová	0,01
Cholesterol	0,03
Kyselina 2-hydroxy-n-oktanová	0,7
Vitamin E, linoleát	0,5
Rostlinný olej	0,5
Ethanol	2

Dimethylsilikonový polymer s molekulovou hmotností alespoň 50 000 a viskozitou alespoň 10'² m²s'¹ při 25 °C firmy GEC.

Dimethylsiloxanový cyklický pentamer firmy Dow Corning Corp.

Dimethylsiloxanový tetramer firmy Dow Corning Corp.

• * · ··· ···· • · · · · · ···· • · · · · ···· · · · · · • · · · · ···· • · · · · · · · · ··

- 26 Je zřejmé, že konkrétní formy podle vynálezu ilustrované a popsané v přihlášce, mají být pouze reprezentativní, U ilustrovaných provedení je tedy možné provádět změny včetně bez omezení změn navrhovaných v této specifikaci, aniž by došlo k odchýlení od 5 předmětu uvedeného v popisu. Plný rozsah vynálezu je uveden v následujících nárocích.

Claims

1. Kosmetický prostředek k péči o kůži, vyznačující se tím, že obsahuje:

5 (i) organický extrakt cizrny v dostatečném množství pro poskytnutí estrogenní aktivity ekvivalentní koncentraci estradiolu alespoň 1 nM, při stanovení estrogenní aktivity testem popsaným v příkladu 1 popisu;

(ii) kosmeticky přijatelné vehikulum.

2. Kosmetický způsob dodávání fytoestrogenu do lidské kůže, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle nároku 1 na kůži.

15

3. Kosmetický způsob zlepšení vzhledu kůže s různými druhy vrásek, suché, odlupující se, zestárlé nebo působením světla poškozené kůže a zlepšení tloušťky, elasticity, pružnosti a měkkosti kůže, vyznačující se tím, ž e zahrnuje nanesení prostředku podle nároku 1 na kůži.

4. Kosmetický způsob zvýšení proliferace fibroblastů v lidské kůži, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle nároku 1 na kůži.

25 5. Kosmetický způsob zvýšení proliferace epidermálních kožních buněk, vyznačující se tím, že zahrnuje nanesení prostředku podle nároku 1 na kůži.