CZ20002864A3 - Prostředek obsahující virus, způsoby jeho koncentrace a purifikace - Google Patents

Abstract

Předmětem tohoto řešení je prostředek obsahující virus ve složení zahrnujícím polyhydroxylovaný uhlovodík pufrovaný na hodnotu pH v rozmezí od asi 7 do asi 8,5 za teploty v rozmezí od 2°C do 27°C. Dále se řešení zabývá metodami pro koncentraci a pufrování virového preparátu.

Description

Prostředek obsahující virus, způsoby jeho koncentrace a purifikace.

OBLAST TECHNIKY

PreJfentovaný vynález se týká prostředků obsahuj ící^iry, speci&lně virové vektory s významně zlepšenou stabilitou. Prostředky presentovaného vynálezu jsou využitelné pro udržení stability virů během skladování a virus obsahující prostředky prezentovaného vynálezu jsou zvláště využitelné pro terapeutická použití jako je genová terapie. Nové metody pro koncentrované a puntíkované virové preparáty jsou také poskytovány.

DOSAVADNÍ stav techniky

Viry se staly zvýšeně důležitými pro terapeutická využití jako jsou vakcíny a genová terapie a jsou potřebné pro vývoj a přípravu stabilních virus obsahujících prostředků, které mohou být lépe skladovány a transportovány se zachováním dostačující bezpečnosti a účinnosti. Především značné použití virových vektorů existující v genové terapii je důležité pro vývoj a přípravu prostředků, které mohou stabilně zachovat živé rekombinantní viry, když nesou terapeutické transgeny.

Avšak je zde kritická potřeba složení, která mohou stabilizovat virové preparáty na prodlouženou dobu při teplotě vyšší než - 80 °C. Virus obsahující prostředky normálně požadují uchovávání při -80 °C a nemohou být skladovány při standardní teplotě chladniček (asi od 2 °C do 8 °C nebo vyšší) na dlouhou dobu. Toto omezení reprezentuje vážnou hrozbu ne pouze pro skladování, ale také pro přípravu, distribuci a široké klinické použití.

Je také potřeba vyvinout virus obsahující prostředky, které mohou udržet pH okolo 7 až okolo 8,5 na dlouhou dobu navzdory tomu, že jsou vystavovány teplotám chladničky a navzdory tomu, že jsou podrobován drsným podmínkám jako jsou:

a) přídavek polyhydroxylovaných uhlovodíků k virovému preparátu ve finální koncentraci polyhydroxylovaných uhlovodíků asi 20 % nebo více; a

b) podrobení se virové preparaci pomocí filtru zatímco je virus zachován a

00 0 0 00 0

0 0000 00 0 0

0 0 00 0 00000 00 0 000 00 0 0000

00· 00 00 0» 0·

Také je zde poskytována metoda pro koncentrování virových preparátů obsahujících:

a) centrifugací prostředku, který má v první vrstvě obsaženy polyhydroxylované uhlovodíky v koncentraci 35 % až 80 % (obj./obj.), první vrstva je překryta druhou vrstvou obsahující polyhydroxylované uhlovodíky v koncentraci od 5 % do 30 % (obj./obj.), druhá vrstva je překryta třetí vrstvou obsahující virus; a

b) odběr viru z první vrstvy.

Avšak presentující vynálezci nalezly, že jejich nová metoda zvýšení virové koncentrace má další využití ke zlepšení dalších procesů (např. redukcí nebo eliminací problematických částí během následující purifikace poskytující výrazně zvýšenou výkonnost během kroků procesu takových jako je velikostní vylučovací chromatografíe). V preferované podstatě je metoda koncentrace virových preparátů v souladu s předloženým vynálezem dále obsahujícím následující kroky (např. velikostní vylučovací chromatografii). V tomto ohledu je metoda presentovaného vynálezu zvláště užitečná, když krok velikostní vylučovací chromatografíe je převáděn do následující iontovýměnné chromatografíe a virové preparáty jsou koncentrovány (podle presentovaného vynálezu) po iontovýměnné chromatografii, ale před velikostní vylučovací chromatografii. Virové frakce získané z iontovýměnné chromatografíe obsahují například typicky vyšší hladinu solí a možná jiné nečistoty, které také snižují virovou stabilitu během koncentračních procedur. Ve zvláště preferované podstatě poskytuje presentovaný vynález metodu purifikace virového preparátu zahrnující:

a) podrobení virového preparátu anionvýměnné chromatografii, kde je virus eluován jako produkt virového preparátu z anionvýměnného chromatografického média;

b) přídavek polyhydroxylovaných uhlovodíků k produktu virového preparátu z kroku a) tak, že koncentrace polyhydpoxylovaného uhlovodíku v preparátu dosahuje finální koncentrace asi 25 % nebo víc; a

c) zvýšení koncentrace viru v produktu virového preparátu z kroku b) tlakem na preparát tak, že je rozpouštědlo odstraněno z virového preparátu přes filtr, zatímco je virus zadržen; a

d) podrobení koncentrovaného produktu virového preparátu z kroku c) jedné nebo více přídatných kroků procesu.

Presentovaný vynález také poskytuje virové preparáty koncentrované a purifikované jinými metodami.

44

4 4

4 4

444

4 4

44 • «

PODSTATA VYNALEZU

Jak bylo zmíněno dříve, předkládaná přihláška objevuje nové virus obsahující prostředky, stejně tak nové metody koncentrace a purifikace virus obsahujících prostředků. i

S ohledem na prostředky objevují presentující vynálezci nové pufrované seskupení, které může uchovat virové preparáty se zvýšenou stabilitou. Zvláště vhodné seskupení může virový preparát dobře uchovat při vyšší teplotě než -80 °C. Více důležité jsou přesto prostředky presentovaného vynálezu stabilní při typických teplotách chladničky od 2 °C do 8 °C nebo vyšších na dlouhou dobu, na několik měsíců a více. To je kritická přednost protože, jak bylo zmíněno výše, s ohledem na vyhovění klinickým potřebám, je nepraktické uchovávat virové preparáty zmražené při -80 °C během skladování a transportu.

Důležitou vlastností prostředků presentovaného vynálezu je přídavek polyhydroxylovaných uhlovodíků. Jak bylo zde použito, polyhydroxylovanými uhlovodíky rozumíme větvené, lineární.

nebo cyklické sloučeniny substituované dvěmi nebo více ( lépe 2 až 6, ještě lépe 2 až 4) jg_ hydroxyskupinami. Polyhydroxylované uhlovodíky mají pro použití v presentovaném vynálezu zejména polyhydroxyly substituované alkylové sloučeniny (větvené nebo nevětvené), zejména mající 2 až 7 atomů uhlíku, a mohou zahrnovat např. glycerol, sorbitol a polypropanol. Glycerol jé zvláště preferován. Jak ukazují data níže, presentující vynálezci zjistily, že glycerol umožňuje překvapivě vyšší stupně stability pro delší časové periody také při standardních podmínkách v ledničce.

V efektivním množství polyhydroxylovaných uhlovodíků pro prostředky presentovaného vynálezu je množství dostatečné ke stabilizaci viru ve formulaci prezentovaného vynálezu bez nepříznivého vlivu na efektivitu viru pro jiné použití, zejména v případech, kde virus obsahuje transgeny pro použití v genové terapii. Polyhydroxylované uhlovodíky jsou zejména obsaženy ve finální koncentraci asi 20 až 200 mg/ml. Užší okruh může být 80 až 120 mg/ml. Více než jeden polyhydroxylovaný uhlovodík může být použit k dosažení vytouženého množství polyhydroxylovaného uhlovodíku v prostředku presentovaného vynálezu.

Polyhydroxylované uhlovodíky v prostředcích presentovaného vynálezu mohou volitelně obsahovat aldehydovou skupinu. Zvláště může být polyhydroxylovaný uhlovodík disacharid takový jako je sacharóza. Avšak jestliže také polyhydroxylované uhlovodíky vybírané pro prostředek neobsahují aldehydovou skupinu, prostředky mohou přídatně obsahovat disacharid jako je sacharóza jako stabilizátor a tónické přídatné činidlo. Jestliže prostředek preŽntovaného vynálezu už obsahuje vhodný polyhydroxylovaný uhlovodík (jako je glycerol) a disacharid má v • φ

• · φφ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φφφφ φφ φφ φφ φφ podstatě funkci přídatného stabilizátoru nebo tónického přídatného činidla, disacharid je zejména obsažen v množství okolo 5 až 25 mg/ml, lépe 20 mg/ml a nejlépe je-li disacharid sacharóza. Farmaceuticky akceptovatelný stabilizátor, dvoj mocná sůl kovu, jako jsou hořečnaté soli, zinečnaté soli, vápenaté soli jsou použity v preferovaných podstatách prostředku presentovaného vynálezu. Jako sůl se preferuje chloridová sůl nebo hořečnatá sůl, hořečnatá sůl je zvláště preferována. Sůl (např. hořečnatá) je přítomna v množství od asi 0,1 do 1 mg/ml, lépe v množství asi 0,4 mg/ml.

Farmaceuticky akceptovatelné stabilizátory, jednomocná sůl kovu, jako je draselná, sodná, lithná a česná sůl, mohou být zahrnuty v preferované podstatě presentovaného vynálezu jako možné stabilizátory. Sůl je zejména chlorid sodný přítomný v množství od 0,6 do 10 mg/ml, lépe v množství okolo 5,8 mg/ml.

Dále může chlorid sodný pro stabilizaci prostředku potlačit poměr a míru tvorby vedlejších produktů fermentace, což má za výsledek farmaceuticky vytříbenou prezentaci, a může být. redukován antigenní potenciál způsobený proteinovými shluky. Přídavek chloridu sodného nemá vliv na pH prostředku.

Prostředek presentovaného vynálezu je schopný udržení pH v oblasti asi 7 až 8,5 po dlouhou dobu také, když je vystaven drsným podmínkám takovým jako je skladování v ledničce nebo mrznutí/tání' Avšak prostředky mohou zůstat stabilní a hlavně požadované pH rozmezí také, když podléhají relativně pomalému přechodu mrznutí/tání, které se může objevit ve spojení s produkcí, distribucí a manipulací ve větším měřítku. Jak bylo zmíněno dříve, udržení pH je důležité pro virovou preparaci, protože při pH nižším než 7 a nad 8,5 se živé virové částice stávají nestabilní a degradují. Částicová skladba virů dělá viry těžce stabilizovatelné a konzervovatelné.

K dosažení udržení pH, v nevhodných podmínkách obsahuje předkládaný vynález pufrovací systém, který může udržet optimální pH v oblasti asi od 7 do asi 8,5 i přes uchovávání mezi -80 °C a 27 °C a navzdory podrobení se podmínkám mrznutí/tání. Zatímco může pH různě záviset na teplotě, pH v rozmezích prezentovaného vynálezu jsou více specificky popsány níže s odkazy na specifické teplotní oblasti. Pro příklad v teplotách chladničky (např. od 2 °C do 8 °C) je preferované rozmezí pH asi od 7,7 do 8,3, lépe asi od 7,9 do 8,2. Za laboratorní teploty (např od 20 °C do 27 °C, lépe 22 °C až 25 °C) je preferované pH rozmezí asi 7,3 až 8,2, lépe asi 7,4 až

7,9.

Preferovaný pufrovací systém prezentovaného vynálezu zahrnuje dihydrát monobasického fosforečnanu sodného o koncentraci asi 0,5 až 10 mg/ml a tromethamin o koncentraci asi 0,5 až 10 mg/ml. (Trometamin je také známý jako TRIS nebo Trisma, distribuovaný Sigma Chemical φφ · ♦ · φφ φφ φφ φφφφ φφφφ φφφφ φφ φ φφφφ φφφφ φ φ φφφφ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φφ φ φφφφ φφ φφφ φφ ·· φφ Φ·

Co.). Avšak mohou být také použity jiné pufrovací systémy. Například dihydrát dibasického fosforečnanu sodného může být použit v páru s kyselou formou Tris pufru. V zvláště preferované podstatě obsahuje pufrovací systém dihydrát monobasického fosforečnanu sodného o koncentraci asi 1,7 mg/ml a tromethaminu o koncentraci asi 1,7 mg/ml a má schopnost udržet prostředek v optimálním pH rozmezí asi od 7,3 do asi 7,9 při 25 °C.

Prostředek presentovaného vynálezu má další výhodu mít schopnost stabilizovat vysoké koncentrace virů ve výše zmíněných nevhodných podmínkách (jako jsou teploty ledničky a proces mrznutí/tání). Zejména prostředek presentovaného vynálezu mohou stabilizovat hlavně viry v koncentracích pohybujících se do 1 x 10¹³ částic/ml. Preferované rozmezí virových koncentrací pro použití v prezentovaném vynálezu je v množství od 1 x 10⁹ do 1 x 10¹³ ěástic/ml, lépe do x 10¹² částic/ml, např. 1 x 10⁹ (nebo 1 x 1O¹⁰) až 1 x 10¹².

Termín „ rozpouštědlo“ jak je zde užito může být rozpouštědlo (např. voda, preferuje se sterilní, voda) nebo směs rozpouštědla a jiných ingrediencí jako přídatná rozpouštědla, přídatné stabilizátory, přídatné pufry, a jiné látky, které nemají vliv na bezpečnost, účinek a stabilitu prostředku. S ohledem na rozpouštědla, stabilizátory, pufry a podobně může být utvořen odkaz např. Remingtonů Pharmaceutical Science, 15^th Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania

Surfaktant, nejlépe neionický detergent jako ester polyoxyethylenové mastné kyseliny (např. polyoxyethylenenesorbitany jako jsou Polysorbát 20, Polysorbát 40, Polysorbát 60 nebo Polysorbát 80 z ICI Americas, lne., Wilmington Delaware nebo Tween 20, Tween 40, Tween 60 a Tween 80 ze Sigma, St. Louis, Mo.) mohou být volitelně začleněny do prostředku presentovaného vynálezu. Neionickým detergentem je zejména ester polyethylenové mastné kyseliny a ester polyoxyethylenové mastné kyseliny je zejména Polysorbát 80, který může působit jako stabilizátor v prostředku presentovaného vynálezu. Koncentrace neionického detergentu je zejména v rozmezí 0,03 až 0,3 mg/ml; lépe 0,15 mg/ml.

Skladby presentovaného vynálezu mohou také obsahovat jeden nebo více „přenos zlepšující činidlo“. „ Přenos zlepšující činidla“ jsou všechny činidla, která zlepšují přenos terapeutického genu jako je tumorový supresorový gen pro rakovinné tkáně nebo orgány. Příklady takových přenos zlepšujících činidel zahrnují, ale nelimitují jimi, detergenty, alkoholy, glykoly, surfaktanty, žlučové soli, heparinové antagonisty, cyklooxygenásové inhibitory, hypertonické roztoky solí a acetáty.

Detergenty (jako termín zde užitý) může zahrnovat anionické, kationické, zwitterionické a neionické detergenty. Příkladné detergenty zahrnují, ale nejsou jimi limitovány, taurochoát, ·· # 99 ·· 99 99

9 99 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 deoxycholát, taurodeoxycholát, cetylpyridium, benalkonium chlorid, ZWITTERGENT 3-4 detergent, CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammoniol)-l-propansuífonát hydrát, Aldrich), Big CHAP, Deoxy Big CHAP, TRITON-X-lOO detergent, C12E8, oktyl-B-Dglukopyranosid, PLURONIC-F68 detergent, TWEEN 20 detergent, a TWEEN 80 detergent (CALBIOCHEM Biochemicals).

Použití přenos zlepšujících činidel je popsáno detailně vU.S. patentové přihlášce U.S.S.N. 08/889 335, 8. července 1997 a v mezinárodní přihláškové publikaci č. WO 97/25072, 17. červenec 1997 a vU.S. patentové přihlášce U.S.S.N. 09/112 074, 8.červenec 1998, mezinárodní přihláška PCT/US 98/14241. Dále použití kalpainových inhibitorů v konjugaci s virovými vektory ke zlepšení transdukční úspěšnosti je popsáno v U.S. patentových přihláškách U.S.S.N. 09/172 685 a 60/104321, 15.října 1998.

Široké spektrum virů může být použito v prostředcích presentovaného vynálezu zahrnujících, ale jimi nelimitujících, adenoviry, pox viry, iridoviry, herpes viry, papovaviry, paramixoviry,. orthomyxoviry, retroviry, adenoasociované viry, vakcinační viry, rotaviry atd. (uvedeno např. v Anderson, Science (1992) 256: 808-813); adenoviry jsou zvláště preferovány. Viry jsou zvláště rekombinantní viry, ale mohou zahrnovat klinické izoláty, zeslabené vakcinační kmeny a podobně. Například tento učebnicový rekombinantní adenovirus, který může být použit v prostředcích vynálezu je A/C/N/53, který byl objeven v PCT patentové přihlášce č. WO 95/11984.

Prostředek preíjentovaného vynálezu je zejména dobře vybaven pro stabilizaci rekombinantního viru takového jako žijící rekombinantní adenovirus (nebo „virový vektor“), pro terapeutické použití v genové terapii. Například virus použitý v presentovaném vynálezu může zahrnovat tumorové supresorové geny takové jako divoký typ p53 gen nebo Rb gen (např. pllO¹⁰³ nebo p56^RB) a s transgeny takovými jako divoký typ p53 vložený do virového vektoru, prostředek presentovaného vynálezu může být použit jako farmaceutický prostředek na léčení rakoviny.

V tomto ohledu prostředky presentovaného vynálezu mají pozoruhodnou schopnost udržet životaschopnost živého viru, zvláště virového vektoru, do kterého bude vložena nukleotidová sekvence kódující transgeny takové jako p53. Tyto vlastnosti dovolují viru udržet jejich schopnost injektovat se přímo do buněk a tak jsou terapeutické proteiny kódované insertními transgeny adekvátně produkovány.

Se specifickým ohledem na p53 a jeho použití může být poznamenáno, že mutace p53 genu je nejvíce přípustnou genetickou změnou v lidských rakovinách (Bartek (1991) Oncogene, 6: 16991703, Hollstein (1991) Science, 253: 49-53). Vnos divokého typu p53 v savčích nádorových φφ ·φ φφ φφ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φφφ φφ φ φφφφ • Φ φφφ φφ φφ φφ φ» buňkách postrádajících endogenní divoký typ proteinu p53 oslabuje neoplastický fenotyp těchto buněk) uvedeno např v U.S. patent 5 532 220).

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

V příkladech níže je virus živý rekombinantní adenovirus obsahující divoký typ p53 gen. Konkrétní virový vektorový konstrukt použitý v těchto příkladech je zde uveden jako „A/C/N/53“. A/C/N/53 (také uváděn jako „ACN53“) je zvláště preferován virový vektorový konstrukt popsaný v přihlášce USSN 08/328 673, 25. říjen 1994 a vWO 95/11984 (4.květen 1995) expresně zahrnuté zde v odkazech.

Reprezentativní složení pro preferované předměty presentovaného vynálezu, které zahrnuje Polysorbát 80 je sestaveno dále níže:

	Reprezentativní složení
Aktivní látka	A/C/N/53	1 x 10y až 1 x 10Bčástic/ml
Pufr	monobasický fosforečnan sodný	0,5 až 10 mg/ml
tromethamin	0,5 až 10 mg/ml
Stabilizátor/tónické činidlo	sacharóza	5 až 25 mg/ml
Stabilizátory	glycerol	20 až 200 mg/ml
chlorid hořečnatý	0,1 až 1 mg/ml
Polysorbát 80	0,03 až 0,3 mg/ml
Rozpouštědlo	Voda pro injektování q.s. ad	1 ml

(Prostředky jsou běžně skladovány v 1 ml lahvičkách, „q.s. ad“ ve složení výše zmíněném znamená přiměřený přídavek rozpouštědla k dosažení 1 ml totálního objemu).

Čtyři zvláště preferované podstaty jsou sestaveny níže. (Polysorbát 80 je presentovaných příkladech 1 a 2, ale chybí v příkladech 3 a 4).

» « • · · • · • »

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9 9 ·· ··· ·· ··

99

	Příklad 1	Příklad 2
A/C/N/53	7,5 x 1011 částic/ml	7,5 x 10*ύ částic/ml
Dihydrát monobasického fossforečnanu sodného	1,7 mg/ml	1,7 mg/ml
Tromethamin	1,7 mg/ml	1,7 mg/ml
Hexahydrát chloridu hořečnatého	0,4 mg/ml	0,4 mg/ml
Sacharóza	20 mg/ml	20 mg/ml
Polysorbát 80	0,15 mg/ml	0,15 mg/ml
Glycerol	100 mg/ml	100 mg/ml
Voda pro injektování q.s.ad	1 ml	1 ml
pH	7,4 až 7,8	7,4 až 7,8

	Příklad 3	Příklad 4
A/C/N/53	7,5 x 1011 částic/ml	7,5 x 1010 částic/ml
monobazický dihydrát fosforečnanu sodného	1,7 mg/ml	1,7 mg/ml
Tromethamin	1,7 mg/ml	1,7 mg/ml
Hexahydrát chloridu hořečnatého	0,4 mg/ml	0,4 mg/ml
Sacharóza	20 mg/ml	20 mg/ml
Glycerol	100 mg/ml	100 mg/ml
Voda na injektování q.s.	1 ml	1 ml
pH	7,4 až 7,9	7,3 až 7,8

Následující ingredience: monobasický dihydrát fosforečnanu sodného, tromethamin, hexahydrát chloridu hořečnatého, sacharóza a glycerol mohou být získány od např. EM Industries, INC., 7 Skyline Drive, Hawthorne, New York 10532. Polysorbát 80 je k dostání od např. ICI Americas, lne., Wilmington Delaware, 19897.

Prostředky presentovaného vynálezu mohou být připraveny během purifíkace virů v gelové filtrační chromatografické koloně kombinací ingrediencí (vyjma Polysorbátu-80) v žádaných koncentracích v gelové filtrační koloně. (S ohledem na gelové filtrační metody, odkazy mohou být vytvořeny např. v sekci 5 níže). Jestliže je požadováno ředění koncentrace viru nebo ·

9·· ··«· 9 9 9 9

9 9 ···· 9 9 9 9

9 9 9 9 9 999 9 9 · 9 9

9 9 9 9 4 9 9 9 9

9 9 99 9 9 9 9 9 9 9 9 inkorporování Polysorbátu-80, potom mohou být rozpouštědla připravgna standardními technikami. Ilustrativní příklad je uveden níže:

Přidej a rozpust monobazického dihydrátu fosforečnanu sodného, tromethaminu, sacharózy, hexahydrátu chloridu hořečnatého a glycerolu v přibližně 75 % vsádkového objemu vody pro injektování při laboratorní teplotě v nádobě z nerezavějící oceli vybavené míchadlem. Převeď vsádku výsledného ředění na finální objem vodou pro injektování. Zkontroluj pH. Spočítej požadovaný objem A/C/N/53 (adenovirus s divokým typem p53 jako transgen) drogové substance v suspenzi a požadovaný objem rozpouštědla k tvorbě A/C/N/53 injekce. Jestliže finální A/C/N/53 injekce bude obsahovat Polysorbát 80, příprav zásobního roztoku, tak aby obsahoval 10 % přebytku Polysorbátu 80 v rozpouštědle. Přidej spočítaná množství A/C/N/53 drogové substance v suspenzi a zřeď v nerezavějící ocelové nádobě a promíchej. Přidej roztok Polysorbátu 80, dříve než přidáš všechno rozpouštědlo, do 10 % totálního A/C/N/53 injekčního vsádkového objemu jestliže je tak požadováno. Asepticky filtruj suspenzi přes sterilní filtr~(0,22. pm nebo ekvivalentně). Testuj neporušenost filtru po filtraci. Spoj a naplň sterilní suspenzi do viálek majících vhodný objem. Uzavři a utěsni viálky.

Data stability pro příklady 1, 2, 3 a 4 jsou uvedeny v tabulkách 1, 2, 3 a 4 níže.

V tabulkách níže je antirůstová zkouška biozkouška používaná k měření schopnosti produktu zastavovat rakovinné buňky a je založena na procedurách používaných Wills, et al., 1994, _ Human Gene Therapy, 5:1079-1088. Sestavená čísla naznačující aktivity, kde kontrola nemá aktivitu.

Plagová zkouška měří virové částice v kultuře počtem virových plagů jako funkce ředění a na základě obecných procedur popsaných v Graham, F.L., a Prevec, L., Methods in Molecular Biology, vol. 7: Gene Transfer and Expresion Protocols, E.J. Murray, ed. (Humana Press lne., Clifton NJ) 109-128 (1994); uvedeno také v Graham, F.L., Smiley, J., Russel, W.C., a Nairn, R.,

J. Gen. Virol. vol. 36, pp 59-74 (1977).

FACS zkouška ukazuje schopnost viru injektovat buňky a měření je obecně založeno na metodách popsaných např. v mezinárodní patentové přihlášce PCT/US97/11865 (WO 98/01582, publikované 15. února 1998). V dalším sloupci vpravo reprezentuje počet prezentovaný pod hlavičkou Koncentrace koncentraci celkového počtu virových částic. Nakonec čísla pod hlavičkou Částice/FACS poměr reprezentuje poměr celkového počtu virových částic k počtu infekčních virových částic, což určuje relativní potenciál virového preparátu.

Data pod hlavičkou UV určuje agregaci virových částic jak je určeno UV absorbančním poměrem při vlnových délkách A320/A260 jakje určeno rozptylem světla. Absorbance při 320 nm ·· · »· ne ·» ·· ···» · » · · ···· • ♦ · ···· «··· • · · · · · ··· · · · · · ··· · · « · · · · ·· ··· ·· ·· »· ·· měří v podstatě množství světelného rozptylu, kde absorbance při 260 nm vlnové délce souvisí s množstvím DNA.

Teplota uvedená v druhém sloupci tabulek pod podmínkami určuje teplotu skladování. Fyziologické zkoušky jsou provedeny při 37 °C a pH v posledním sloupci je měřeno za laboratorní teploty, asi 25 °C.

Tabulka 1: Data stability pro příklad 1

Stabilita čas	Podmiň. °C	Antirůst. zkouška x 105 SPU/ml	Plagová zkouška x 1O10 PFU/ml	FACS x 10n U/ml	Koncentr. x 1011 část ./ml	Částic./ FACS poměr	UV A320/A260	pH
začátek		3,3	5,8	3,86	7,95	21	0,23 -	7,53 -
1 týden	25	4,9	10	2,27	8,06	36	0,24	7,53
2 týden	4	3,1	6,6	3,41	7,84	23	0,23	7,49
4 týden	4	3,4	17	3,91	7,79	20	0,23	7,63
8 týden	4	5,8	8,8	3,38	7,80	23	0,24	7,61
12 týden	4	3,9	36	, 2,24	7,80	35	0,24	7,72
5 měsíců	4	nt.	nt	1,57	8,21	52	0,26	7,60
6 měsíců	4	3,0	7,6	2,74	7,68	28	0,28	7,58
9 měsíců	4	3,1	19	3,47	7,19*	21	0,28	7,58
11 měsíců	4	nt	nt	nt	6,71	-	0,29	nt
12 měsíců	4	2,6	10	0,81	6,13	76	0,30	7,62

*Opakované měření UV vzorku po 9 měsících: 6,89 x 10“ částic/ml; Α₃2ο/Α₂6ο⁼θ,28 • ·

Tabulka 2: Data stability pro příklad 2

Stabilita čas	Podmiň. °C	Antirůst. zkouška χ 104 SPU/ml	Plagová zkouška χ 107 PFU/ml	FACS χ 109 U/ml	Koncentr. χ 1O10 část./ml	Částic./ FACS poměr	UV A320/A260	PH
začátek		3,3	4,8	1,99	10,0	50	0,24	7,36
1 týden	25	2,4	7,1	1,64	nd*	-	0,46	7,42
2 týden	4	2,4	6,9	2,13	9,79	46	0,24	7,51
4 týden	4	3,2	8,4	2,50	9,24	37	0,22	7,55
8 týden	4	6,9	8,6	2,60	8,10	31	0,25	7,54
12 týden	4	5,5	8,3	1,09	8,60	79	0,24	7,64
5 měsíců	4	nt	nt	1,74	8,03	46	0,27	7,55
6 měsíců	4	3,3	7,3	2,10	8,25	39	0,23	7,52’
9 měsíců	4	2,3	13	1,97	7,59	39	0,24**	7,53
11 měsíců	4	nt	nt	nt.	7,48	-	0,23	nt
12 měsíců	4	1,8	9,4	0,60	4,94	82	0,26	7,59

* Neurčeno kvůli zkouškové interferenci.

** Opakované testování UV vzorku po 9 měsících: 7,37 x 1O¹⁰ částíc/ml; A32o/A₂6o⁼0,24. Tabulka 3: Data stability pro příklad 3

Stabilita čas	Podmiň. °C	Antirůst. zkouška χ 105 SPU/ml	Plagová zkouška χ 108 PFU/ml	FACS χ 1O10 U/ml	Koncentr. χ 1011 část./ml	Částic./ FACS poměr	UV A320/A260	PH
začátek		3,2	6,3	2,59	7,45	29	0,24	7,67
1 týden	25	4,4	4,3	1,65	7,49	45	0,24	7,68
2 týden	4	2,3	8,0	3,62	7,27	20	0,24	7,49
4 týden	4	2,7	7,6	4,08	6,97	17	0,24	7,75
8 týden	4	5,9	8,7	2,69	7,00	26	0,25	7,82
12 týden	4	3,0	15	0,70	7,10	101	0,25	7,80
óměsíců	4	2,4	6,4	2,45	7,12	29	0,25	7,76
9 měsíců	4	2,8	9,4	2,51	7,06	28	0,26	7,81
11 měsíců	4	nt	nt	nt	6,71	-	0,25	nt.
12 měsíců	4	2,2	9,8	0,74	6,75	91	0,26	7,81

• · * ·

Tabulka 4: Data stability pro příklad 4

Stabilita čas	Podmiň. °C	Aňtirůst. zkouška x 104 SPU/ml	Plagová zkouška x 107 PFU/ml	FACS xlO9 U/ml	Koncentr. x 1010 část./ml	Částic./ FACS poměr	UV A320/A260	pH
začátek		3,3	4,7	2,36	8,91	38	0,23	7,37
1 týden	25	2,3	9,3	1,40	8,25	59	0,24	7,37
2 týden	4	2,8	8,0	2,16	8,80	41	nd*	7,37
4 týden	4	2,9	6,6	2,54	9,35	37	0,20	7,63
8 týden	4	6,9	7,2	2,56	7,60	30	0,24	7,60
12 týden	4	4,4	8,6	1,45	7,20	50	0,23	7,73'
6 měsíců	4	3,6	7,1	2,85	7,92	28	0,21	7,58
9 měsíců	4	2,9	11	1,87	7,26	39	0,20	7,60
11 měsíců	4	nt	nt	nt	6,93	-	0,22	nt
12 měsíců	4	2,4	22	0,70	7,15	102	0,23	7,61

*Neurčeno kvůli zkouškové interferenci.

Příklad 5:

Složení pro příklad 5: A/C/N/53 (7,5 x 10¹¹ částic/ml), tromethamin (TRIS) (1,7 mg/ml), dihydrát monobasického fosforečnanu sodného (1,7 mg/ml), sacharóza (20 mg/ml), hexahydrát chloridu hořečnatého (0,4 mg/ml), glycerol (100 mg/ml), chlorid sodný (5,8 mg/ml), finální objem=10 ml.

Tabulka 5: Data stability pro příklad 5

Stabilita čas	Podmiň. °C	Aňtirůst. zkouška x 105 SPU/ml	FACS xlO10 U/ml	Koncentr. x 10” část./ml	Částic./ FACS poměr	UV A320/A260	PH
začátek		4,5	1,87	7,81	42	0,23	7,80
1 měsíců	4	8,0	1,67	7,83	47	0,23	7,80
4 měsíců	4	13,0	1,58	7,84	50	0,23	7,70

• ·

V některých případech může být pozorována tvorba částic během skladování.při 4 °C. Analýza částic SDS-PAGE naznačuje, že částice jsou složeny z malých nečistot (ňapř. přídatných proteinů a nějakých nezralých virových částic), a tak tyto částice neovlivňují použitelnost složení. Nicméně v preferované podstatě pro další objasnění složení (k prevenci možných částicových formací), možný krok mikrofiltrace může vést k odstranění všech možných částic se malou ztrátou virových částic. (Když je provedena mikrofiltrace, mělo by být poznamenáno, že dostatečná mikrofiltrační povrchová plocha membrány na filtrační objem je kritická pro vyhnutí se ztráty virů při odstraňování částic.)

Dále v preferované podstatě presentující vynálezci nalezli, že rozrušování takové jako je míchání, může urychlit tvorbu částic a je proto dalším možným krokem v objasnění procesu. Tudíž opatrné míchání (např. přes noc, 10 °C, použití magnetického míchadla) následované mikrofiltrací vykázalo odstranění částic takových, že se nebude tvořit více částic do dalšíhomíchání.

Bylo také objeveno, že cykly tuhnutí/tání by mohlo podporovat tvorbu částic během opakovaného míchání. V další preferované proceduře může být jeden nebo více cyklů tuhnutí/tání volitelně uskutečněno, následováno mícháním a potom mikrofiltrací pro prevenci tvorby částic během skladování virových finálních produktů v teplotách chladničky (např. 4 °C). Presentovaná přihláška také otevírá nové metody stabilně koncentrovat existují virový preparát . využitím sekundární průtočné filtrace (později občas uvedeno jako „TFF“), dovolující snadnou selekci a přípravu klinických dávek v širokém spektru chtěných koncentrací. Nová metoda koncentrování virových preparátů zahrnuje:

a) přídavek polyhydroxylovaných uhlovodíků k virovému preparátu k finální koncentraci polyhydroxylovaných uhlovodíků asi 20 % nebo víc; a

b) podrobení virového 'preparátu filtračnímu procesu, kde koncentrace viru vzroste po podrobení tlaku na preparát takového, že roztok je odstraněn z virového preparátu přes filtr, zatímco je virus zachován.

Metody nynějšího vynálezu jsou přístupné k širokému spektru virů zahrnujících, ale nelimitujících adenoviry, pox viry, iridoviry, herpes viry, papovaviry, paramyxoviry, orthomyxoviry, retroviry, adenoasociované viry, vakcinační viry, rotaviry, atd.; adenoviry jsou zejména preferovány. Viry jsou zejména rekombinantní viry, ale mohou zahrnovat klinické izoláty, zeslabené vakcinační viry a podobně. Presentovaný vynález je zvláště použitelný pro koncentrované rekombinantní viry nesoucí heterologní transgeny pro použití v genové terapii. Takové viry jsou zvláště citlivé k potencionálně destabilizačním vlivům takovým jako přídatné střižné síly doprovázející metody koncentrace virových preparátů. Příkladný rekombinantní adenovirus, který může být koncentrován metodou vynálezu je A/C/N/53, který je popsán v PCT patentové přihlášce č. WO 95/1984.

Filtrační proces používaný pro koncentraci viru podle metody presentovaného vynálezu může zahrnout všechny filtrační procesy (např. ultrafiltraci), kde koncentrace vzroste zesílením rozpouštědla, které má projít přes filtr takovým způsobem, že rozpouštědlo je odstraněno z virového preparátu, kde je virus neschopný projít filtrem a proto tedy zůstává v koncentrované formě ve virovém preparátu. Ultrafiltrace je popsána v detailu v např. Microfiltration and Ultrafiltration: Principles and Applications, L. Zeman and A. Zydney (Marcel Dekkar, lne., New York, NY, 1996). Zvláště preferovaný filtrační proces je tangentová průtočná filtrace (TFF) jak je popsáno v např. Millerore katalogu nazvaném Pharmaceutical Process Filtration catalogue pp. 177-202 (Bredford, Massachutsetts, 1995/96). Preferované TFF aparatury zahrnující také Pellicon II nebo Pellicon XL filtrační systém z Millipore Corporation, 80 Ashby Rd., Bedford, Massachusetts (internetová adresa: www.millipore.com), a Pellicon XL systém je zvláště preferován. V preferované podstatě jsou metody presentovaného vynálezu prováděny při teplotách v rozmezí od 2 °C do 27 °C.

Jiné koncentrační procesy mohou být použity ke koncentraci virových preparátů v souladu s presentovaným vynálezem. Pro příklad použití polyhydroxylovaných uhlovodíků může být vhodně použito ke koncentraci virového preparátu centrifugací. Presentovaný vynález také poskytuje metodu pro koncentraci virového preparátu zahrnující:

a) centrifugací přípravku, který zahrnuje první fázi obsahující polyhydroxylované uhlovodíky v koncentraci 35 % až 80 % (obj./obj.), první fáze je překryta druhou fází obsahující polyhydroxylované uhlovodíky v koncentraci 5 % až 30 % (obj./obj.), druhá fáze je překryta třetí fází obsahující virus; a

b) odběr viru z první fáze

Jako příklad může být adenovirový preparát koncentrován nižší rychlostí centriťugace při 3 200 g použitím točivých nádobovitých rotorů centrifugy Beckman. K dosáhnutí tohoto může být virový preparát umístěn do stejných 5 ml zkumavek, každá zkumavka obsahuje 6,25 % objemu 70% glycerolu v první fázi na dně zkumavky, překryto 2,5 % objemu 20% glycerolu s virovým preparátem daným na povrch. Preparát je potom centrifugován při 3 200 g při 4 °C asi 16 hodin pro usazení koncentrovaného viru v glycerolových fázích a potom nově koncentrovaný virový preparát je následně znovu získán z první fáze. Virus koncentrovaný procedurami popsanými výše má dobré schopnosti rozptylovat světlo a má vhodné infekční vlastnosti.

S ohledem na použití polyhydroxylovaných uhlovodíků v metodách presentovaného vynálezu polyhydroxylovanými uhlovodíky jsou míněny větvené, lineární nebo cyklické sloučeniny substituované 2 nebo více (zejména 2 až 6, lépe 2 až 4) hydroxy skupinami a efektivní množství polyhydroxylovaných uhlovodíků je množství dostatečné pro stabilizaci viru proti potencionálním destabilizačním silám takovým jako mechanické střižné síly, které se objevují během koncentračního procesu. Zejména polyhydroxylované uhlovodíky ve virus koncentračních metodách presentovaného vynálezu jsou předkládány v minimální koncentraci 20 %, lépe 25 %. Polyhydroxylované uhlovodíky pro použití v presentovaném vynálezu jsou zejména polyhydroxyly substituované alkylové sloučeniny (větvené nebo nevětvené), zejména mající 2 až 7 atomů uhlíku a mohou zahrnovat glycerol, sorbitol a polypropanol. Zvláště preferován je glycerol.

Novátorská nová metoda zvýšení virové koncentrace má přídatný užitek ve zlepšení zpracování např. eliminací problematických úskalí připuštěním významně vyššího výkonu během rů-znýchkroků procesu takových jako je velikostní vylučovací chromatografie. V preferované podstatě může být metoda pro koncentraci virových preparátů v souladu s presentovaným vynálezem aplikována na metody purifikace virů, kde krok velikostní vylučovací chromatografie (např. gelová filtrace) je proveden následně po anionvýmněné chromatografii. V této podstatě jsou zde přídatná ohrožení virové stability pramenící ne pouze z mechanických střižných sil potřebných pro koncentraci viru před poměr limitujícím krokem velikostní vylučovací chromatografie, ale také následkem faktu, že virový preparát eluovaný z anionvýměnné chromatografie obsahuje typicky vysoké hladiny solí a jiných nečistot, které také oslabují virovou stabilitu. Ve zvláště preferovaném vynálezu poskytuje prezentovaný vynález metodu purifikace a virové preparace zahrnující:

a) podrobení virového •'preparátu anionvýměnné chromatografii, kde je virus eluován jako produkt virové preparace z anionvýměnného chromatografického média;

b) přídavkem polyhydroxylovaných uhlovodíků k produktu virového preparátu kroku a) tak, že koncentrace polyhydroxylovaných uhlovodíků v preparátu dosahuje finální koncentrace asi 25 % nebo více; a

c) zvětšením koncentrace viru ve virovém preparačním produktu kroku b) aplikováním tlaku na preparát tak, že je rozpouštědlo odstraněno z virového preparátu přes filtr, zatímco je virus zachován; a

d) podrobení koncentrovaného produktu virového preparátu z kroku c) jedné nebo více přídatným procesním krokům.

* · • ·

V preferované podstatě ve spojení s anionvýměnnou chromatografií se stanovuje výše, že minimální hladina glycerolu je 25 % (lépe než 20% minimální hladina v obecných aplikacích koncentračních metod presentovaného vynálezu), protože tato konkrétní přihláška musí brát v úvahu přídatná ohrožení stability představovaná vysokými koncentracemi solí v produktu eluovaném z anionvýměnné chromatografie. Přídavek 25% glycerolu (lépe 30%) způsobuje stabilitu sůl obsahující DEAE lázně na více než 10 dnů při např. 4 °C; proto dodatečné kroky koncentrace virů a /nebo gelové filtrace mohou být provedeny v oddělených dnech se značnou flexibilitou v periodě 10 dnů. Jak bude zhodnoceno, použití polyhydroxylovaných uhlovodíků ve vyšší koncentraci 25 % nebo více může být také použito v metodách presentovaného vynálezu, kdy virový preparát obsahuje vysoký obsah solí následkem jiných procesních podmínek. Následující příklady ilustrují preferované podstaty presentovaného vynálezu; rámec vynálezu není konstruován jako tímto limitovaný.

Rychlý přehled - Koncentrovaná vsádka začíná se surovým virovým materiálem pocházejícím zfermentace. V jedné podstatě je adenovirový produkt prvně purifikován anionvýměnnou chromatografií. Dále před přidáním preparátu do velikostní vylučovací kolony, může být ionovýměnná náplň koncentrována sekundární průtočnou filtrací (TFF) v přítomnosti 30% (obj./obj.) glycerolu. Alternativně v jiné podstatě může být TFF koncentrační krok uskutečněn v přítomnosti 20% (obj./obj,) nebo více (zejména 25%) glycerolu po velikostní vylučovací. chromatografií.

V preferované podstatě adenovirová ionovýměnná náplň je připravena pro koncentraci jako v následujícím. Zmrzlé virové materiály z fermentace a ze znovunabývajících koků jsou rozmraženy a filtrovány přes 0,45 μηι hydrofilní membránu. Koncentrace solí ve filtrátu je upravována 4 M chloridem sodným. Tento nasycený roztok je potom aplikován do Fractogel EMD DEAE-650M kolóny ekvilibrované 50 mM fosforečnanem sodným pH 7,5, 260 mM chloridem sodným, 2 mM chloridem hořečnatým, 2% (hmotn./obj.) sacharózou (pufr A). Adenovirové vazby k anionvýměnné pryskyřici, kde většina média a nečistoty hostitelských buněk procházejí přes kolonu jsou vyčerpány spotřebováním náboje. Kolona je zpočátku omyta 4 objemy pufru A, následuje druhé omytí 94% pufrem A o objemu 8 výplní a 6% pufrem B (50 mM fosforečnan sodný pH 7,5; 600 mM chlorid sodný, 2 mM chlorid hořečnatý, 2% (hmotn./obj.) sacharóza) k odstranění přídatných nečistot. Virus je eluován z kolony 30 objemy výplně lineárního gradientu od 6 % do 100 % pufru B. Adenovirový pík elučního profilu jak je určeno A₂so je odebrán. Pak je do DEAE přidán glycerol ve finální koncentraci 30 % (obj./obj.) pro další zpracování.

• 4

4

4 4

4 « • 444

44

4 4 4

4 4 4

DEAE (připraveno v souladu s dříve popsaném) je 10 krát až 20 krát koncentrován použitím Millipore TFF jednotky (Pellicon XL Systém) pro molekulovou hmotnost 1 000, uzavřené Biomax membránami. Proces je uskutečněn ve 2 až 10 °C nebo za laboratorní teploty (25 °C). Následné filtrační parametry jsou použity v této proceduře: průměrný průtočný tlak =14 psi; průměrný permanentní tlak = O psi; průměrná průtoková rychlost = 13 l/h*m². Finální koncentrace adenoviru dosahuje asi 1 až 2 x 10¹³ částic na ml. Založeno na Resource Q-HPLC a UV absorbanci (A₂6o) analýze, znovunabytí v koncentračním kroku je >80 % s nevýznamnou agregací (zkouška rozptylu světla při A320/A260)·

Koncentrovaný adenovirový preparát je aplikován do Superdex-200 velikostní vylučovací kolony ekvilibrované 20 mM fosforečnanem sodným pH 8, 100 mM chloridem sodným, 2 mM chloridem hořečnatým, 2% (hmotn./obj.) sacharózou, 10% glycerolem (pufř C) nebo 11 mM fosforečnanem sodným, 14 mM Tris, 2 mM chloridem hořečnatým, 2% (hmotn./obj.) sacharózou, 10% glycerolem, pH 7,8 (pufř D). Kolona je eluována ekvilibračním pufrem. ElučnT profil adenovirového píku je určen A₂so odebrán a kompletován. Koncentrovaný adenovirový preparát je filtrován přes 0,2 pm hydrofilní membránu s odolnými póry (Stericup, Millipore) při 2 až 10 °C, a může být skladován při -80 °C nebo při vyšších teplotách (jako je 2 až 10 °C).

Jak bylo diskutováno dříve, preferovaná podstata presentovaného vynálezu zahrnuje koncentrování viru po anionvýměnné chromatografii, ale před gelovou filtrací. Avšak v jiné . podstatě může být také použito objevené metody koncentrovaných virových preparátů po gelovém filtračním kroku (také jestliže nevirový koncentrační krok byl použit mezi anionvýměnným krokem a gelovou filtrací). V tomto případě jsou filtrační paramertry stejné jako ty pro koncentraci DEAE bez toho, že mohou být přidány polyhydroxylované uhlovodíky (např. glycerol) do Superdex-200 ve finální koncentraci 20 % (obj./obj.), jestliže není dále nezbytné zabývat se vyšší koncentrací solí v DEAE. S tímto ohledem musí být poznamenáno, že v případě, kde přídavek polyhydroxylovaných uhlovodíků je odložen na dobu až po gelové filtraci, DEAE by měl být aplikován okamžitě po gelové filtrační koloně (kvůli zranitelnosti DEAE s její vysokou koncentrací soli). Může být viděno, že přídatným vlivem přidaných polyhydroxylovaných uhlovodíků k DEAE (v souladu s prezentovaným vynálezem) je zvýšení flexibility v časovém intervalu a skladovacích podmínkách během časové periody mezi anionvýměnnou chromatografii a dalšími procesy.

Metody koncentrace virových preparátů mohou být aplikovány ve spojení s různými purifikačními metodami. Pro přídatné informace o purifikačních metodách mohou být přidány tyto odkazy, např. Huyghe et al., Human Gene Therapy, Vol. 6, pp. 1403-1416 (1995) a U.S. patent aplikační seriál č. 08/989 227, expresně zahrnuté zde v odkazech.

00

0 0 ·

0 0 *

0 0 ·

0 0 ·

00

Jak je ukázáno v experimentálních níže, metody presentovaného vynálezu poskytují skvěle zlepšenou virovou stabilitu navzdory mechanickým střižným silám koncentrovaného viru a navzdory drsným podmínkám jako je hladina solí v DEAE lázni. Metody presentovaného vynálezu poskytují spolu s dalšími věcmi 1) rychlou přípravu klinických nádob pro všechny žádané koncentrace (také když začínám s materiálem majícím nižší koncentraci), 2) zvýšení efektivity (např. dovolenou významně vyšší .výkonností během velikostní vylučovací chromatografie) a 3) stabilitu sůl obsahující DEAE lázně na více než 10 dnů při 2 až 10 °C (to je dovoleno pro následující kroky virové koncentrace a /nebo gelové filtrace vykonané v oddělených dnech s následnou flexibilitou v periodě 10 dnů.

V následujících třech příkladech stabilní koncentrace adenoviru preparo váného koncentrovanými DEAE lázněmi v 30% glycerolu (v souladu s metodami presentovaného vynálezu). Preparáty byly potom podrobeny další purifikaci Superdex-200 gelovou filtrační chromatografií ke získání konečného složení k testování.

Příklad 6: Finální složení

Výsledky:

mM NaPi, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2% sacharóza, 10% glycerol, pH 8 při 2 až 10 °C.

Částice/FACS=24

Světelné paprsky (A3₂o/A₂6o)=0,22

Koncentrace=l,6 x 10¹³ částic/ml

Příklad 7:

Finální složení: 14 mM Tris base, 11 mM NaPi, 2 mM MgC12, 2% sacharóza, 10% glycerol, pH 7,8 při 2 až 10 °C

Výsledky: Částice/FACS=17

Světelné paprsky (A₃₂o/A26o)=0,25 Koncentrace=l,5 x 10¹³ částic/ml

Příklad 8: Finální složení:

mM NaPi, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl₂, 2% sacharóza, 10% glycerol, pH 8 při 2 až 10 °C.

Φ· ·· ·· ·· • · » · * ·· · ·«·· ♦♦·· • · · · · ♦ · · · · • · · · · · · ·· ·· ·♦ ··

Výsledky: Částice/FACS=24

Světelné paprsky (A32o/A26o)~O,25 Koncentracemi,3 x 10¹³ částic/ml

Příklad 9:

V následujícím příkladu byl virový preparát koncentrován v 20% glycerolu následně po gelové filtraci.

Finální složení: 16 mM NaPi, 80 mM NaCl, 1,6 mM MgCh, 1,6% sacharóza, 20% glycerol, pH 8 při 2 až 10 °C.

Výsledky: Částice/FACS=72

Světelné paprsky (A32o/A26o)⁼0,26 Koncentracemi, 66 x 10¹³ částic/ml

Všechny publikace, patenty a patentové přihlášky zde citované jsou zahrnuty jako celek v odkazech ve stejném rozsahu jako individuální publikace, patenty nebo patentové přihlášky byly specifikovány a individuálně uvedeny v referencích.

Modifikace a variace tohoto vynálezu budou zřejmé pro jejich odbornost v technice. Specifické podstaty zde popsané jsou nabídnuty touto cestou pouze v příkladech a vynález není sestaven jako limitující.

Claims (28)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Prostředek obsahující virus ve složení zahrnujícím polyhydroxylované uhlovodíky pufrované pro udržení pH v rozmezí od asi 7 do asi 8,5 při teplotě v rozmezí od 2 °C do 27 °C.
2. 2. Prostředek podle nároku 1, kde je virem rekombinantní virus.
3. 3. Prostředek podle nároku 1, kde polyhydroxylovaný uhlovodík je glycerol.
4. 4. Prostředek podle nároku 1 dále obsahující disacharid.
5. 5. Prostředek podle nároku 1, kde kompozice obsahuje pufrovací systém obsahující dihydrát monobasického fosforečnanu sodného o koncentraci asi 0,5 až 10 mg/ml a tromethamin o koncentraci asi 0,5 až 10 mg/ml.
6. 6. Prostředek podle nároku 1 také obsahující dvojmocnou sůl kovu v koncentraci asi 0,1 až 1 mg/ml.
7. 7. Prostředek podle nároku 1, který také obsahuje rozpouštědlo obsahující vodu.
8. 8. Prostředek podle nároku 1, kde je virus přítomen v koncentraci asi 1 x 10⁹ až 1 x 10¹³ částic/ml.
9. 9. Prostředek podle nároku 1, kde je virem adenovirus.
10. 10. Prostředek podle nároku 2, kde rekombinantní virus obsahuje divoký typ genu p53.
11. 11. Prostředek podle nároku 10, kde je rekombinantním virem A/C/N/53.
12. 12. Prostředek podle nároku 1, kde je virem adenovirus; polyhydroxylovaným uhlovodíkem je glycerol; pufrovací systém udržuje pH v rozmezí od asi 7,3 do asi 7,9 při teplotě v rozmezí od 20 °C do 27 °C; a prostředek dále obsahuje disacharid.
13. 13. Prostředek podle nároku 12, kde adenovirus je A/C/N/53; disacharid je sacharóza; pufrovací systém obsahuje dihydrát monobasického fosforečnanu sodného a tromethamin; a prostředek dále obsahuje dvojmocnou sůl kovu a vodu.
14. 14. Způsob koncentrace virového preparátu vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) Přídavek polyhydroxylovaného uhlovodíku k virovému preparátu do konečné koncentrace polyhydroxylovaného uhlovodíku asi 20 % nebo více, a

    b) podrobení virového preparátu filtračnímu procesu, kde koncentrace viru vzroste působením tlaku na preparát tak, že je rozpouštědlo odstraněno z virového preparátu přes filtr, zatímco je virus zachován.
15. 15. Způsob koncentrace podle nároku 14 vyznačující se tím, že filtrační proces zahrnuje ultrafiltraci.
16. 16. Způsob koncentrace podle nároku 14 vyznačující se tím, že filtračníproces zahrnuje sekundární průtočnou filtraci.

    φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φφ ·» • Φ φφφ φφ φφ φ ί φ φ φ φ · · φ φ · · φ φ φ · φφ φφ
17. 17. Způsob purifikace virového preparátu vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) podrobení virového preparátu anionvýměnné chromatografii, kde je viros eluován jako produkt virové preparace z anionvýměnného chromatografického média;

    b) přídavek polyhydroxylovaných uhlovodíků k produktu virového preparátu kroku a) tak, že koncentrace polyhydroxylovaných uhlovodíků v preparátu dosahuje hodnoty asi 25 % a více; a

    c) zvýšení koncentrace viru ve virovém preparačním produktu z kroku b) působením tlaku na preparát tak, že rozpouštědlo je odstraněno z virového preparátu přes filtr, zatímco je virus zachován; a

    d) podrobení koncentrovaného virového preparačního produktu z kroku c) jednomu nebo více přídatným procesních kroků.
18. 18. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že virem je rekombinantní virus.
19. 19. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že virem je rekombinantní virus nesoucíterapeutické transgeny pro použití v genové terapii.
20. 20. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že přídatný procesní krok zahrnuje velikostní vylučovací chromatografii.
21. 21. Způsob podle nároku 17 vyznačující se tím, že proces kroku c) zahrnuje sekundární průtočnou filtraci.
22. 22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že proces kroku c) je proveden použitím aparatury zahrnující Pellicon XL filtrační systém.
23. 23. Virový preparát koncentrovaný metodou podle nároku 14.
24. 24. Virový preparát purifikovaný metodou podle nároku 17.
25. 25. Způsob koncentrace virového preparátu vyznačující se tím, že zahrnuje:

    a) centriíugaci prostředku, který zahrnuje první fázi obsahující polyhyroxylovaný uhlovodík v koncentraci 35 % až 80 % (obj./obj.), první fáze je převrstvena druhou fází obsahující polyhydroxylované uhlovodíky o koncentraci 5 % až 30 % (obj./obj.), sekundární fáze je převrstvena třetí fází zahrnující virus; a

    b) znovu získání viru z první fáze.
26. 26. Prostředek podle nároku 1, kde je prostředek podroben přídatnému procesnímu kroku míchání následovaném mikrofiltrací pro zamezení tvorby částic během skladování prostředku.
27. 27. Prostředek podle nároku 1, kde je prostředek podroben jednomu nebo více cyklům tuhnutí/tání následovaným mícháním a potom mikrofiltrací pro zamezení tvorby částic během skladování kompozice.

    ΦΦ φ

    • φ

    φφ *

    φ φ *

    φ β φ φφφ φφ φ* φφ • φ φ φ φ φ φ φφφ » φ φφ ·« φφ φ φ φ · φ φ φ • φ φ · « φ φ φ φ
28. 28. Prostředek podle nároku 12 dále obsahující jednomocnou sůl kovu v koncentraci asi 0,6 až lOmg/ml.