CZ20002958A3 - Metoda pro detekci cílové nukleové kyseliny pomocí PCR - Google Patents

Description

Metoda pro detekci cílové nukleové kyseliny pomocí PCR

Předkládaný vynález poskytuje metodu pro detekci cílového polynukleotidu ve vzorku, například monitorováním amplifikační reakce (přednostně kvantitativním způsobem) a také sondy a kity pro použití v těchto metodách. Metoda je také vhodná pro určení charakteristik sekvence, jako například polymorfismů nebo alelické varianty a tak se může použít v diagnostických metodách.

Mezi známé metody monitorující fluorescenci polymerázové řetězové reakce (PCR, polymerase chain reaction) patří jak sekvenčně specifické, tak obecně použitelné DNA interkalační techniky. Tyto metody se dají použít na několika PCR teplotních cyklátorech druhé generace.

Obecně použitelné metody používají DNA interkalační barviva, která vykazují při navázání na dvouřetězcovou DNA zvýšenou fluorescenci. Zvýšení fluorescence díky zvýšení celkové koncentrace DNA během amplifikace se může použít pro měření průběhu reakce a pro určení počtu kopií cílové molekuly. Kromě toho je možné sledováním fluorescence při kontrolované změně teploty generovat křivky teplot tání DNA, například na konci cyklických změn teplot charakteristických pro PCR.

Obecně použitelné DNA metody monitorují zvýšení celkové koncentrace nukleových kyselin bez dalších časových nároků. U každé reakce se může provést jednotlivé měření fluorescence v ten samý okamžik. Pro rozlišení artefaktů a amplikonů a pro rozlišení amplikonů se může použít analýza teplot tání na konci reakce. I u koncentrací, které není možné vizualizovat na agarózovém gelu, je možné pozorovat píky jednotlivých produktů.

Aby se získaly přesná data o teplotách tání, musí se tento experiment provést pomalu, což na existujících přístrojích zabere až pět minut. Průběžným monitorováním fluorescence při amplifikaci se může ale vytvořit 3D obraz zpoždění tání a hybridizace. Tento 3D obraz je závislý na amplikonů a může poskytovat dostatek informací pro rozlišení produktu.

• ·

Zjistilo se, že analýza křivek teplot tání DNA je obecně výkonný nástroj pro optimalizaci PCR. Určením teplot tání amplikonů je možné snížit denaturační teplotu v PCR reakci na tuto teplotu. Optimalizace amplifikace na základě produktů z první generace amplifikace (místo genomové DNA) omezí tvorbu artefaktů, ke které dochází v pozdějších cyklech. Teploty tání příměrových oligonukleotidů a jejich komplementů se můžou použít pro určení jejich teplot nasednutí a omezit tak nutnost empirické optimalizace.

Obecné interkalační metody jsou ale pouze zdánlivě sekvenčněspecifické a nejsou tedy nijak zvlášť vhodné tam, kde je nutná sekvenčně specifická detekce.

Pro řetězec specifické metody používají pro monitorování postupu amplifikačních reakcí jako další reakční komponentu nukleovou kyselinu. Tyto metody můžou jako základ pro detekci využívat přenos fluorescenční energie (FET, fluorescence energy transfer). Jedna nebo více sond z nukleové kyseliny se označí fluorescenčními molekulami, z nichž jedna působí jako dodavatel (donor) energie a druhá jako molekula přijímající energii (akceptor). Tyto molekuly jsou také známé jako „zpravodajská (či reporterová) molekula (reportér molecule) a zhášecí molekula (quencher molecule). Donorová molekula je excitována světlem o určité vlnové délce, při které normálně vykazuje emisní fluorescenci o určité vlnové délce. Akceptorová molekula je excitovaná při této vlnové délce tak, že může přijmout emisní energii donorové molekuly různými, na vzdálenosti závislými, přenosy energie. Specifický příklad přenosu fluorescenční energie ke kterému může dojít je „fluorescenční resonanční přenos energie, FRET (fluorescence resonance energy transfer). Obecně akceptorová molekula přijímá emisní energii donorové molekuly, když jsou v úzké blízkosti (tj. na té samé nebo sousedící molekule). Základ pro FET nebo FRET detekci je monitorování změny při emisních vlnových délkách donoru a akceptoru.

Existují dva běžně používané typy FET nebo FRET sond - ty, které využívají hydrolýzu nukleové kyseliny sondy pro oddělení donoru a akceptoru a ty, které používají pro změnu vzájemné polohy donorových a akceptorových molekul hybridizaci.

Hydrolyzačni sondy jsou komerčně dostupné jako TaqMan™ sondy. Skládají se z DNA oligonukleotidů, které jsou označené donorovými a akceptorovými molekulami. Sondy jsou navržené tak, aby se vázaly na specifickou oblast jednoho řetězce PCR produktu. Po nasednutí PCR primerů na tento řetězec, Taq enzym prodlužuje svojí 5' -3' polymerázovou aktivitou DNA. Taq enzym má ale také 5'-3' exonukleázovou aktivitu. TaqMan™ sondy jsou na 3' konci fosforylovány, aby se zabránilo tomu, že budu působit jako primery pro Taq prodlužování. Když je TaqMan™ sonda hybridizovaná k řetězci produktu, pak postupující Taq molekula může hydrolyzovat sondu a uvolnit tak donora od akceptoru.To je základ pro detekci. Signál je v tomto případě kumulativní, koncentrace volných donorových a akceptorových molekul se v každém cyklu amplifikační reakce zvyšuje.

Fakt, že je tvorba signálu závislá na existenci reakce hydrolyzující sondu znamená, že je s touto metodou spojené časové zpoždění. Kromě toho může přítomnost sondy rušit bezproblémový průběh PCR reakcí.

Také se zjistilo, že hydrolýza se může stát nespecifickou, zejména při velkém počtu amplifikačních cyklů, například když je nutné provádět více než 50 cyklů. V těchto případech bude nespecifická hydrolýza způsobovat přehnaně vysoký signál.

To znamená, že takovéto techniky nejsou příliš kompatibilní s rychlými PCR metodami, které se stávají s vývojem rychlých, horký vzduch využívající teplotních cyklátorů (jako je RapidCycler™ a LightCycler™ od Idaho Technologie lne.), stále důležitějšími. Jiná rychlá PCR zařízení jsou popsaná například v současně projednávaných British Patent Aplication 9625442.0 a 9716052.7. Výhody rychlého cyklování před konvenčním teplotním cyklováním byly popsány jinde. Takovéto techniky jsou zejména užitečné například v detekčních systémech pro biologický boj, kde je rychlost získání výsledků důležitým faktorem pro zabránění ztrát na životech nebo vážných poškození.

Hydrolyzačni sondy navíc neposkytují podstatnou informaci co se týče průběhu tání, protože je signál nejvíce závislý na hydrolýze sondy, ne na teplotě tání amplikonu.

Hybridizační sondy jsou dostupné ve značném počtu různých forem. „Molekulární majáky (molecular beacons) jsou oligonukleotidy, které mají komplementární 5' a 3' sekvence, čímž se tvoří vlásenková smyčka. Když se vytvoří vlásenka, jsou fluorescenční značky na koncích v těsné blízkosti pro FRET. Po hybridizací molekulárního majáku na komplementární sekvenci jsou fluorescenční barviva (prostorově) oddělena, takže nedochází k FRET a v tom spočívá princip detekce.

Můžou se také použít páry značených oligonukleotidů. Ty hybridizují v těsné blízkosti na řetězec PCR produktu, čímž se dostanou donorové a akceptorové molekuly k sobě, takže může dojít k FRET. Principem detekce je zvýšení FRET. Varianty tohoto typu používají značené amplifikační primery s jednou přilehlou sondou.

Použití dvou sond, nebo sond typu molekulární maják, které zahrnují použití dvou označených molekul, zvyšuje cenu procesu.

Kromě toho tato metoda vyžaduje přítomnost přiměřeně dlouhé známé sekvence, aby se dvě dostatečně dlouhé sondy navázaly v těsné blízkosti. To může být problém v některých diagnostických aplikacích, kde délka konzervované sekvence v organismu, který se může použít pro návrh účinné sondy (jako třeba u HIV viru) může být relativně krátká.

Kromě toho použití párů sond zahrnuje komplexnější experimentální návrh. Například signál získaný při analýze tání sondy je funkcí uvolnění obou sond. Studium malých nehomologií, nebo když se vyžaduje, aby se jedna ze sond vázala přes oblast sestřihu (splice region) (například pro detekci RNA v porovnání s DNA ve vzorku, kdy se může sekvence na obou stranách intronu použít jako místo pro sondu) může poskytnout nepřesné výsledky, jestliže se druhá sonda uvolní dříve.

Žadatel vyvinul test pro detekci přítomnosti určitých sekvencí nukleových kyselin, který se může adaptovat pro kvantifikaci množství cílové nukleové sekvence ve vzorku.

Vynález tedy poskytuje metodu pro detekci přítomnosti cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku, přičemž zmíněná metoda zahrnuje (a) amplifikační reakci zmíněného vzorku s využitím nukleotidů, z nichž je alespoň jeden fluorescenčně označený, (b) kontakt amplifikačního produktu se sondou za podmínek, kdy sonda

bude hybridizovat ke zmíněné cílové sekvenci a kdy zmíněná sonda obsahuje reaktivní molekulu, která je schopná absorbovat fluorescenci nebo dodat fluorescenční energii zmíněnému fluorescenčně značenému nukleotidu a (c) monitorování fluorescence zmíněného vzorku.

Při použití analýzy tohoto typu se fluorescenční značka inkorporuje jenom do amplífikačního produktu. Když sonda hybridizuje s jakoukoliv specifickou cílovou sekvencí, vzniklou jako výsledek amplifikační reakce, reaktivní molekula absorbuje vyzařovanou energii ze značeného nukleotidu, nebo předá energii značenému nukleotidu díky FET nebo FRET a změní tedy signál z fluorescenčního nukleotidu. Je vhodné, když je reaktivní molekula schopná absorbovat fluorescenci ze značeného nukleotidu a tak je jeho fluorescence redukovaná. Tato redukce se může detekovat a to svědčí o navázání sondy.

Ještě vhodnější je, když je reaktivní molekula akceptořovou molekulou, která emituje fluorescenci o charakteristické vlnové délce. V tomto případě zvýšení fluorescence z akceptorové molekuly, které má odlišnou vlnovou délku než ze značeného nukleotidu, také ukazuje navázání sondy.

Přítomnost takto značeného amplífikačního produktu se může detekovat monitorováním fluorescence akceptorové molekuly na sondě, která se specificky váže pouze na cílovou sekvenci. V tomto případě se může signál z amplifikovaného produktu odlišit od signálu pozadí fluorescenční značky a také od jakéhokoliv nespecifického amplífikačního produktu.

Fakt, že je signál částečně spojený s amplifikačním produktem a částečně spojený se sondou znamená, že systém je vysoce specifický co se týče detekce specifických cílových sekvencí v reakčních směsích, které obsahují velké množství vnesené DNA. Je tomu tak proto, že signál z nespecifických amplifikačních produktů se může od naměřeného signálu účinně eliminovat.

Test tohoto druhu se může provádět s použitím levných reagencií. Sondy značené jednou značkou jsou ekonomičtější ve srovnání s těmi, které mají jak akceptorové, tak donorové molekuly.

Zde používaný výraz „sada nukleotidů se vztahuje ke skupině nukleotidů, které jsou postačující pro tvorbu nukleové kyseliny,

Φ» Μ · ·· · · ··«· «··« · · · • ··«· ·· · · · · • · » · · · ·

W · · · · · · · · ·· · · · jako DNA nebo ΕΝΑ. Jedná se tedy o adenosin, cytosin, guanin a thymin nebo uráčil. Jeden z nich (nebo i více) je fluorescenčně označený. Označený uráčil je dostupný od firmy Boehringer Mannheim. Mezi vhodná fluorescenční barviva patří fluorescein.

Použití značeného uracílu může být zejména výhodné z hlediska strategie prevence kontaminace nebo ochrany před přenosem (amplikonů) z jedné amplifikační reakce na následující prováděné v reakčních zkumavkách. V inkubačním kroku před amplifikaci se můžou použít enzymy, které rozštěpí nukleovou kyselinu obsahující uráčil, jako například uracil-N-glykosyláza; tím se zajistí, že jakékoliv zbytky amplikonů (z předcházejících amplifikaci) jsou před započetím následného teplotního cyklování rozloženy.

Je vhodné, když je více než jeden nukleotid, a nejlépe když jsou všechny nukleotidy označené, čímž se zvýší hladina signálu z amplifikovaného produktu a tedy FET nebo FRET signál.

Amplifikace se provede podle známých amplifikačních reakcí, jako je polymerázová řetězová reakce - PCR, ligázová řetězová reakce - LCR (ligase chain reaction), SDA (strand displacement assay) nebo NASBA, ale především PCR.

Je vhodné, když se monitoruje fluorescence jak nukleotidu, tak akceptorové molekuly a propočítá se vztah mezi emisemi.

Vhodnými reakčními molekulami (jako akceptorové molekuly) jsou rodaminová barviva, nebo jiná barviva, jako Cy5. Ty se můžou připojit k sondě obvyklým způsobem. Pozice reaktivní molekuly v sondě není důležitá, i když obecně se umisťují v koncové oblasti sondy.

Aby docházelo k FET (například FRET) mezi reaktivní molekulou a fluorescenční emisí nukleotidů, musí být fluorescenční emise prvku (reaktivní molekuly nebo značeného nukleotidu), který působí jako donor o kratší vlnové délce, než akceptorového prvku.

Vhodné kombinace jsou tedy uvedené v následující tabulce:

Donor	Akceptor
SYBRGold	r ódami n
SYBRGreen I	rodamin
SYBERGold	Cy5
SYBRGreen I	Cy5
fluorescein	etidium bromid

«« ·« · 4· ·« ·♦«· ···» · · · • * « 9 9 9 9 9

999» 99 999 · • 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 99 9 9 9 » · ·

Upřednostňuje se, když molekuly použité jako donor a/nebo akceptor vytváří ostré píky, a když je přesah emisních vlnových délek malý nebo žádný. Za těchto podmínek nemusí být nutné odlišit „pík specifický pro řetězec od signálu vytvořeného amplifikačním produktem. Jednoduché měření samotného signálu specifického pro řetězec (tj. toho, který je poskytován reaktivní molekulou) poskytne informaci o rozsahu FET nebo FRET způsobené cílovou reakcí. Tento požadavek může splnit kombinace etidium bromid/fluorescein. V tomto případě bude pramenově specifická reakce kvantifikovatelná zmenšením fluorescence při 520 nm, nejlépe vyjádřená jako 1/fluorescence.

Když ale dochází k přesahu spekter fluorescenčního signálů z donorových a akceptorových molekul, může se tato hodnota ve výsledku vyjádřit, například empirickým určením vztahu mezi spektry a použitím tohoto vztahu pro rozlišení (jednotlivých) signálů ze dvou signálů.

Metoda vynálezu je extrémně versatilní co se týče aplikací.

Metoda se může použít jak pro vytváření kvantitativních, tak kvalitativních údajů o nukleové kyselině s cílovou sekvencí ve vzorku, jak je rozvedeno dále. Vynález neposkytuje jenom amplifikační kvantitativní údaje , ale může se také použít (ať už samostatně nebo doplňkově) pro získání charakteristických údajů, jako například o teplotě destabilizace duplexu nebo bodech tání.

V metodě vynálezu může být vzorek vystaven podmínkám, za kterých sonda hybridizuje se vzorky během, nebo po skončení amplifikační reakce. Proces umožňuje provedení detekce stejným způsobem, poněvadž amplifikace a monitorování se může provádět v jedné reakční zkumavce, přičemž se všechny reagenční činidla můžou přidat na začátku. Není nutný žádný další krok přidání činidel. Není zde také žádná nutnost provádět metodu za přítomnosti pevného nosiče (i když tato možnost existuje, jak je diskutována dále).

Například když je sonda přítomná během amplifikační reakce, může fluorescenční signál monitorovat průběh amplifikační reakce.

Tímto způsobem se může kvantifikovat množství cílové sekvence přítomné ve vzorku.

Během každého cyklu amplifikační reakce se prameny amplikonu, obsahující cílovou sekvenci, vážou se sondou a tak se vytvoří akceptorový signál. Jak se množství amplikonu ve vzorku zvyšuje, tak • φ · ·<·» ·· • ·· ·Φ ♦ φ * φ φ φ · • « « · ·

9 Φφφ 9

9 9 9 9 •»« λ· »· r vzrůstá signál akceptoru. Vynesením rychlosti vzrůstu oproti cyklům se může určit počáteční bod tohoto vzrůstu.

Sonda může obsahovat molekulu nukleové kyseliny, jako DNA nebo RNA, která bude hybridizovat s cílovou sekvencí nukleové kyseliny, když je tato cílová sekvence nukleové kyseliny v jednořetězcové formě. V tomto případě krok (b) bude zahrnovat použití podmínek, které zajistí, aby byla cílová nukleová kyselina jednořetězcová. Sonda také může obsahovat molekulu například nukleové kyseliny peptidu (peptide nucleic acid), která se váže specificky na cílovou sekvenci v dvouřetězcové formě.

Použitá amplifikační reakce bude zejména zahrnovat krok vystavení vzorku podmínkám, kdy všechny cílové sekvence nukleové kyseliny ve vzorku budou jednopramenné, jako například při PCR nebo LCR.

Sonda pak může hybridizovat během průběhu amplifikační reakce za předpokladu, že se vyskytnou vhodné hybridizační podmínky.

V preferovaném případě může být sonda navržena tak, že se tyto podmínky vyskytnou během každého cyklu amplifikační reakce. V určitý okamžik každého cyklu amplifikační reakce tak sonda bude hybridizovat k cílové sekvenci a vytvářet signál jako výsledek FET nebo FRET. Jak amplifikace postupuje, sonda se uvolní nebo teplotně uvolní z cílové sekvence a signál produkovaný reaktivní molekulou se buď zeslabí nebo zvýší v závislosti na tom, jestli obsahuje donorovou nebo akceptorovou molekulu. Když se například jedná o akceptor, v každém cyklu amplifikační reakce se tvoří fluorescenční pík z reaktivní molekuly. Jak amplifikace pokračuje, intenzita píku se zvýší, protože je více a více dostupných cílových sekvencí pro navázání sondy.

Sledováním fluorescence reaktivní molekuly ve vzorku během každého cyklu se může různými způsoby monitorovat postup amplifikační reakce. Například se můžou analyzovat údaje poskytnuté píky tání, třeba propočtem plochy pod píky tání a vynesením těchto dat proti počtu cyklů.

Fluorescence se vhodně monitoruje využitím známého fluorimetru. Jejich signál, například ve formě elektrického napětí fotonásobiče, se posílá do modulu zpracovávajícího data a převádí na spektrum spojené s každým vzorkem. Současně se může hodnotit více vzorků, tttt 9 9 ttt · například 96. Data se tímto způsobem můžou získávat v opakovaných intervalech, například každých 10 ms, během celé reakce.

Spektra generovaná tímto způsobem se můžou rozlišit například s využitím „shod (fits) předem vybraných fluorescenčních složek, jako třeba barviv, aby se vytvořily zástupci píků každé signální složku (tj. nukleotidové značky a/nebo reaktivní molekuly). Můžou se určit plochy pod píky, které representují hodnotu intenzity každého signálu, a je-li to požadováno, můžou se vyjádřit jako vzájemný podíl. Rozdíl intenzit signálu a/nebo poměry umožní zaznamenat změny FET nebo FRET během reakce nebo za odlišných reakčních podmínek, například teplot. Jak je naznačeno výše, změny se vztahují ke vzniku vazby mezi sondou a cílovou sekvencí. Integrál plochy pod odlišnými píky umožní výpočet hodnotu intenzity FET nebo FRET.

Tyto údaje poskytují jeden způsob kvantifikace množství cílové nukleové kyseliny přítomné ve vzorku.

Sonda může být buď volně v roztoku nebo imobilizovaná na pevnou fázi.Tou může být například povrch kuliček, například magnetických kuliček používaných v separačních výrobcích, nebo povrch detektoru zařízení, například vlnovodu plazmonového rezonančního detektoru (waveguide of a surface plasmon resonance detector). Výběr bude záležet na povaze daného sledovaného testu a na konkrétních použitých detekčních způsobech.

Sonda muže být navržena tak, že je hydrolyzována DNA polymerázou použitou při amplifikační reakci, čímž se uvolní akceptorová molekula. Tím vznikne kumulativní signál, kdy se množství reaktivní molekuly přítomné v systému každým cyklem zvyšuje. Není ale nutné, aby při tomto testu byla sonda rozložená tímto způsobem, protože signál nezávisí na hydrolýze sondy.

Aby se získal zcela reversibilní signál, který je přímo úměrný množství amplifikovaného produktu přítomného v každé fázi reakce a/nebo kde je nejdůležitější rychlost reakce, například v rychlé PCR, je žádoucí, když je sonda navržena tak, že se uvolní neporušená z cílové sekvence a tak se může opět zúčastnit reakce. Tak tomu může být například během fáze prodlužování řetězce při amplifikační reakci. Protože ale signál nezávisí na hydrolýze sondy, může být sonda navržená tak, že se hybridizuje a uvolní z cílové sekvence v jakékoliv části amplifikačního cyklu, včetně nasedání primerů nebo • · • · · • · denaturační fáze reakce. Takovéto sondy zajistí, že interference s amplifikační reakcí je minimalizována.

Když se užívají sondy, které se váží během fáze prodlužování, může se jejich uvolnění v nepoškozeném stavu dosáhnout použitím enzymu bez 5'-3' exonukleázové aktivity, jako je Stoffleho fragment Taq nebo Pwo. To může být užitečné, když je nezbytná rychlá PCR, protože se vynechají hydrolyzační kroky.

Když se používají tímto způsobem, je důležité zajistit, že se sonda nebude prodlužovat během prodlužovací fáze reakce. 3' konec sondy se tedy vhodně blokuje fosforylaci.

Data získaná tímto způsobem se můžou interpretovat různými způsoby. V nej jednodušší formě je vzrůst fluorescence akceptorové molekuly v průběhu, nebo na konci amplifikační reakce ukazatelem vzrůstu množství přítomné cílové sekvence. Naznačuje fakt, že proběhla amplifikační reakce a že tedy byla cílová sekvence přítomná ve vzorku. Jak je ale naznačeno výše, kvantifikace je také možná monitorováním amplifikační reakce v jejím průběhu. Nakonec je také možné získat charakteristická data a zejména analýzu teplot tání buď na konci amplifikace nebo v jejím průběhu s cílem získat informace o sekvenci, jak to bude diskutováno dále.

Preferovaná forma vynálezu zahrnuje tedy metodu pro detekci amplifikace nukleové kyseliny, která zahrnuje: amplifikaci nukleové kyseliny na cílovém polynukleotidu za přítomnosti (a) polymerázy nukleové kyseliny (b) alespoň jednoho primeru schopného hybridizovat s daným cílovým polynukleotidem (c) sadou nukleotidů, z nichž je alespoň jeden fluorescenčně značený a (d) oligonukleotidovou sondou, která je schopná vazby k dané cílové polynukleotidové sekvenci a která obsahuje reaktivní molekulu, která je schopná absorbovat fluorescenci z daného označeného nukleotidu nebo předání fluorescence danému označenému nukleotidu, a sledování změn ve fluorescenci během amplifikační reakce. Je vhodné, když je reaktivní molekula akceptorovou molekulou, která může absorbovat energii ze značeného nukleotidu.

Amplifikace se výhodně provádí pomocí páru primerů, které jsou navrženy tak, že je amplifikovaná pouze cílová nukleotidová sekvence na DNA prameni. To je odborníkům běžně známé. Polymerázou nukleové • · · · · · · • ···· ♦· ··· • · · · · · ···· ·· ··· ·· · kyseliny je nejlépe termostabilni polymeráza jako například Taq polymeráza.

Odborníkům jsou dobře známé vhodné podmínky, za kterých se může provádět amplifikace. Optimální podmínky můžou být různé, vždy závislé na daném amplikonu, povaze použitých primerů a použitém enzymu. Optimální podmínky může určit pro každý případ zkušený pracovník. Typická denaturační teplota je zhruba 95 °C, typická teplota pro nasedání primerů je okolo 55 °C a teplota prodlužování řetězce je okolo 72 °C.

V určité formě vynálezu se může sonda použít pro kvantifikaci RNA transkriptů, například v expresních experimentech, které se můžou využívat při hledání léků. Zvláště je tento případ vhodný pro expresní studie v pletivech eukaryontních orgánů. DNA kódující proteiny v eukaryontních buňkách může obsahovat introny, nekódující oblasti DNA sekvence, a exony, které kódují proteinové sekvence. Nekódující intronové sekvence se z RNA sekvence (která je odvozená od DNA sekvence) odstraní během buněčného procesu „sestřihu. PCR primery jsou normálně navržené pro kódující oblast a když se provádí PCR s revezní transkripcí s celkovým extraktem nukleových kyselin, výsledné produkty budou odvozené jak od amplifikace DNA, tak od amplifikace RNA. Proto když se užije pro expresní studie samotná PCR, dostaneme výsledky z genomové DNA a exprimované RNA.

Sonda, která je navržená tak, aby se vázala přes introny na odlehlé koncové oblasti kódujících exonů, bude mít omezenou interakci díky oblasti intronu. Sestřižená RNA bude mít tyto oblasti odstraněné a proto odlehlé koncové oblasti kódujících exonů tvoří jednu souvislou sekvenci umožňující účinné navázání sondy.

Naopak sonda může detekovat pouze amplifikační produkt genomové DNA když je navržená tak, že se váže na intronovu oblast. Signál vytvořený takovouto sondou by se vztahoval pouze k DNA koncentraci a ne RNA koncentraci ve vzorku.

V další formě vynálezu je tedy sonda specifická buď pro oblast sestřihu RNA nebo intron v DNA, takže je detekována a/nebo kvantifikovaná buď pouze amplifikovaná RNA nebo amplifikovaná DNA.

Případně (a nebo navíc) se může metoda vynálezu použít v hybridizačních testech pro určení charakteristik sekvence. Vynález tedy v dalším aspektu poskytuje metodu pro určení charakteristiky • · ·· * ·· ·· ···· ···· · * · ··· ··· ·· • ···· ·· · · ♦ · « · · · · · · ······ ····· ·· * sekvence, přičemž daná metoda zahrnuje (a) amplifikaci dané sekvence s využitím sady nukleotidů, z nichž je alespoň jeden fluorescenčně značený (b) reakci amplifikáčního produktu se sondou za podmínek, kdy se bude sonda hybridizovat k dané cílové sekvenci, přičemž daná sonda obsahuje reaktivní molekulu, která je schopná buď absorbovat z, nebo předat fluorescenční energii danému fluorescenčně značenému nukleotidu a (c) monitorováním fluorescence daného vzorku a určením konkrétní reakční podmínky, charakteristické pro danou sekvenci, kdy se mění fluorescence, jako výsledek hybridizace sondy ke vzorku nebo destabilizace duplexu tvořeného mezi sondou a sekvencí cílové nukleové kyseliny.

Vhodné reakční podmínky zahrnují teplotu, elektrochemií, nebo odpověď na přítomnost určitých enzymů nebo chemikálií. Sledováním změn fluorescence v závislosti na variabilitě těchto vlastností se můžou získat informace charakterizující přesné vlastnosti sekvence. Například v případě teploty - může se určit třeba teplota, při které se sonda uvolní od sekvencí ve vzorku jako reakce na zahřívání.To může být mimořádně užitečné například pro detekci (a když je to potřebné i pro kvantifikaci) polymorfismů a/nebo alelické varianty při genetických diagnózách. Pod „polymorfismy patří tranzice, transverze, inzerce, delece nebo inverze, ke kterým může přirozeně v sekvencích docházet.

Zpoždění tání bude odlišné, jestliže se bude cílová sekvence odlišovat třeba i jenom jedním nukleotidem. Jestliže tedy bude vzorek obsahovat jenom jednu alelickou variantu, teplota tání sondy bude mít určitou hodnotu, která bude odlišná od té, kterou bude mít vzorek, který obsahuje pouze jinou alelickou variantu. Vzorek, obsahující obě alelické varianty bude vykazovat dva body tání odpovídající každé alelické variantě. Podobné úvahy platí co se týká elektrochemických vlastností nebo v přítomnosti určitých enzymů nebo chemikálií. Sonda může být imobilizovaná na pevném povrchu, na který se může aplikovat elektrochemický potenciál. Sonda se bude vázat nebo bude odpuzována od cílová sekvence při určitých elektrochemických hodnotách závisejících na přesné povaze sekvence.

Navíc umožní kinetiky hybridizace sondy určení koncentrace cílové sekvence (v absolutním označení). Změny ve fluorescenci vzorku umožňují vypočet rychlosti hybridizace sondy ke vzorku.

k · · · ··

Zvýšení rychlosti hybridizace se bude vztahovat k množství cílové sekvence ve vzorku. Jak se koncentrace cílové sekvence s pokračující amplifikací zvyšuje, bude docházet k rychlejší hybridizací sondy. Tento parametr tedy může být také použitý jako základ pro kvantifikaci. Tento způsob zpracování dat je užitečný proto, že informace nezávisí na intenzitě signálu.

Další aspekty vynálezu zahrnují kity pro použití metodou vynálezu. Tyto kity budou obsahovat sondu specifickou pro cílovou nukleotidovou sekvenci, která obsahuje reaktivní molekulu, zejména akceptorovou molekulu. Je-li to žádoucí, sonda může být imobilizovaná na nosič, jako třeba na kuličky (například magnetické kuličky) nebo nosič použitý v detektoru, jako například vlnovod detektoru zanikajících vln (waveguide of an evanescent wave detector device).

Navíc můžou kity obsahovat jeden nebo více fluorescenčně značených nukleotidů, který je/které jsou kompatibilní se zmíněnou reaktivní molekulou. Mezi další potenciální komponenty křtu patří reagencie použité při amplifikační reakci, jako například DNA polymeráza.

Vynález bude dále popsán zejména na příkladech s odkazem na doprovodné schematické nákresy, kde:

Obrázek 1 ukazuje schematicky interakce uplatňující se v metodě vynálezu

V ilustraci amplifikační reakci je DNA molekula (1) připravená pro amplifikací díky přítomnosti páru primerů (2), (3) a sady nukleotidů (4), z nichž jsou některé značené fluorescenční značkou (5). DNA molekula (1) se uvede do jednořetězcového stavu (obrázek 1B), kdy se primery (2, 3) naváží známým způsobem jako zpětný (reverse) a dopředný (forward) primer v amplifikační reakci.

Během průběhu následující amplifikační reakce vzniká produkt amplikon (6) (obrázek 1C). Do vznikajícího produktu se inkorporují jak značené, tak neznačené nukleotidy. Při normální amplifikací obsahuje amplikonový produkt (6) pouze cílovou sekvenci definovanou primery.

Když se tento produkt během následující fáze amplifikace denaturuje, sonda (7) obsahující akceptorovou molekulu (8) se naváže na cílovou sekvenci (obrázek ID). Při FRET interakci mezi • » · fluorescenčním nukleotidem a akceptorovou molekulou (8) vznikne signál o vlnové délce charakteristické pro akceptor.

Signál akceptoru (8) se může monitorovat konvenčními fluorescenčními detekčními zařízeními.

Claims (21)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Metoda pro detekci přítomnosti sekvence cílové nukleové kyseliny ve vzorku, přičemž zmíněná metoda zahrnuje (a) vystavení , zmíněného vzorku amplifikační reakci s využitím sady nukleotidů, , z nichž je alespoň jeden fluorescenčně značený (b) kontakt • amplifikačního produktu se sondou za podmínek, kdy bude sonda hybridizovat se zmíněnou cílovou sekvencí, přičemž zmíněná sonda obsahuje reaktivní molekulu, která je schopná absorbovat fluorescenci ze zmíněného fluorescenčně značeného nukleotidu, nebo předat fluorescenční energii zmíněnému fluorescenčně značenému nukleotidu a (c) sledování fluorescence zmíněného vzorku.
2. 2. Metoda podle nároku 1, kde reaktivní molekula absorbuje fluorescenci ze zmíněného fluorescenčně značeného nukleotidu.
3. 3. Metoda podle nároku 2, kde je reaktivní molekula akceptorovou molekulou, která emituje energii o charakteristické vlnové délce.

   »
4. 4. Metoda podle nároku 3, kde je akceptorová molekula je w rodaminové barvivo nebo jiná barviva, jako Cy5.
5. 5. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde je značeným nukleotidem značený uráčil.
6. 6. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde jsou všechny nukleotidy použité při amplifikaci značené.
7. 7. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde amplifikační reakce zahrnuje polymerázovou řetězovou reakci (PCR).
8. 8. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde se sleduje fluorescence jak značeného nukleotidu, tak reaktivní molekuly a vypočítá vztah jejich vyzařování.
9. 9. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde je sonda přítomná při amplifikační reakci.
10. 10. Metoda podle nároku 9, kde se sleduje fluorescenční signál a výsledky se použijí pro kvantifikaci množství cílové sekvence přítomné ve vzorku.
11. 11. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde je sonda navržená tak, že je při amplifikační reakci hydrolyzována DNA polymerázou, použitou při amplifikaci.
12. 12. Metoda podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10, kde je sonda navržená tak, že je ve fázi prodlužování řetězce při amplifikační reakci uvolněná od cílové sekvence neporušená.
13. 13. Metoda podle nároku 12, kde se amplifikační reakce provádí s využitím enzymu bez 5'-3' exonukleázové aktivity.
14. 14. Metoda podle nároku 13, kde je enzymem Stoffleho fragment (Stoffle fragment) Taq nebo Pwo.
15. 15. Metoda podle kteréhokoliv z nároků 12 až 15, kde je 3' konec sondy blokován fosforylací.
16. 16. Metoda detekce amplifikace nukleové kyseliny zahrnující: amplifikaci nukleové kyseliny na cílovém polynukleotidu za přítomnosti (a) polymerázy nukleové kyseliny (b) alespoň jednoho primeru schopného hybridizovat se zmíněným cílovým polynukleotidem (c) sady nukleotidů, z nichž je alespoň jeden fluorescenčně značený a (d) oligonukleotidové sondy, která je schopná vazby k dané cílové polynukleotidové sekvenci a která obsahuje reaktivní molekulu, která je schopná absorbovat fluorescenci ze zmíněného označeného nukleotidu nebo předat fluorescenční energii zmíněnému označenému • · « · nukleotidu; a sledování změn ve fluorescencí během amplifikační reakce.
17. 17. Metoda podle nároku 16, kde se amplifikace provádí s využitím páru primerů, které jsou navrženy tak, že je amplifikována jenom cílová nukleotidová sekvence na DNA řetězci
18. 18. Metoda podle kteréhokoliv z předchozích nároků, kde je sonda specifická buď pro oblast sestřihu RNA nebo intron v DNA, takže jsou detekovány a/nebo kvantifikovány buď jenom amplifikovaná RNA nebo amplifikovaná DNA.
19. 19. Metoda pro určení charakteristiky sekvence, přičemž zmíněná metoda zahrnuje (a) amplifikaci zmíněné sekvence s využitím sady nukleotidů, z nichž je alespoň jeden fluorescenčně značený, (b) reakci amplifikačního produktu se sondou, za podmínek, kdy dojde k hybridizaci sondy ke zmíněné cílové sekvenci, přičemž zmíněná sonda obsahuje reaktivní molekulu, která je schopná absorbovat fluorescenční energii ze zmíněného fluorescenčně značeného nukleotidu nebo předat energii zmíněnému fluorescenčně značenému nukleotidu a (c) sledování fluorescence zmíněného vzorku a určením konkrétní reakční podmínky, vlastnosti zmíněné sekvence, kdy se mění fluorescence jako výsledek hybridizace sondy ke vzorku nebo destabilizace duplexu tvořeného mezi sondou a cílovou sekvencí nukleové kyseliny.
20. 20. Metoda pro detekci polymorfismů a/nebo alelických variant, přičemž zmíněná metoda zahrnuje amplifikaci sekvence s předpokládaným zmíněným polymorfismem nebo variantou s využitím metody definované v nároku 1, měření teploty, kdy se sonda uvolní od amplifikovaného produktu s využitím produkovaného fluorescenčního signálu a vztažením tohoto signálu k přítomnosti polymorfismů nebo alelické varianty,
21. 21. Souprava pro použití v metodě kteréhokoliv z předchozích nároků, která obsahuje sondu specifickou pro cílovou nukleotidovou « · · · sekvenci s reaktivní molekulou a fluorescenčně značený nukleotid, který je kompatibilní se zmíněnou reaktivní molekulou.