CZ20003008A3 - Protilátky proti lidským CD40 - Google Patents

Description

(5 7) Anotace:

Nové chimemí a humanizované protilátky proti lidským CD40, které blokují interakci mezi gp39 a CD40. Protilátky CD40 jsou účinné v modulaci humorálních imunních odpovědí proti antigenům dependentním na T-buňkách, kolagenem indukované arthritidě a transplantaci kůže a jsou rovněž využitelné pro své protizánětlivé vlastnosti.

(13) Druh dokumentu: A3 (51) Int. Cl.⁷;

A 61 K 39/395 C 07 K 16/28 C 12 N 15/13

Protilátky proti lidským CD40

Dosavadní stav techniky

Iinunní/zánětlivé odpovědi jsou zprostředkovány komplexní sérií interakcí. Jeden pár receptorů/ligandu, který se ukázal jako důležitý v těchto procesech, je CD40/gp39. Interakce gp39/CD40 zprostředkuje řadu důležitých signálních událostí mezi aktivovanými T-buňkami a jinými efektorovými buňkami imunního systému, které vedou k amplifikaci imunní/zánětlivé odpovědi. Odpovědi na signalizaci prostřednictvím CD40 zahrnují pomoc T-buněk B-buňkám v humorální imunní odpovědi, indukci cytokinů monocyty a expresi adheze molekul endoteliálními buňkami.

CD40 je typ I receptorů na buněčném povrchu a patří do skupiny supergenů receptorů faktoru nekrózy tumoru (TNFR). Ačkoli byl původně identifikován jako antigen B-buněk, dnes se má za to, že jeho exprese je způsobována všemi antigen-presentujícími buňkami (APC), včetně dendritových buněk, keratinocytů a monocytů. Exprese CD40 je rovněž způsobena buněčnými typy, které za určitých podmínek mohou působit jako APC, jako například vaskulárními endoteliálními buňkami nebo buňkami, účastnícími se přímých interakcí s T-buňkami nebo prekursory T-buněk, jako například epiteliálními buňkami thymu. Nedávno se rovněž ukázalo, že exprese CD40 může být způsobena fibroblasty, eosinofily a aktivovanými T-buňkami. Exprese CD40 byla také pozorována v rakovinných buňkách. Důkazy pro to jsou primárně odvozeny od identifikace některých buněčných linií odvozených od karcinomů a melanomů, které jsou CD40⁺. (Clark a Ledbetter, Proč. Nati. Acad. Sci. 83., 4494 - 4498 (1986); Schriever a kol., J. Exp. Med. 169, 2043 - 2058 (1989); Caux a kol.,

J. Exp. Med. 180, 1263 - 1272 (1994); Alderson a kol., J. Exp. Med. 178, 669 - 674 (1993); Young a kol., Int. J.

Cancer 43., 786 - 794 (1989); Paulie a kol., Cancer Immunol.

• · — ·9 · ···

Cancer 43 , 786 - 794 (1989); Paulie a kol., Cancer Immunol. Immunother. 20. 23 - 28 (1985); Denfeld a kol, Eur. J. Immunol. 26. 2329 - 2334 (1996); Gaspari a kol., Eur. J. Immunol. 26., 1371 - 1377 (1996); Peguet-Navarro a kol., J. Immunol. 158, 144 - 152 (1997); Hollenbaugh a kol., J. Exp. Med. 182, 33 - 40 (1995); Galy a Spits, J. Immunol. 149,

775 - 782 (1992);

T-buňky. Gp39 je rovněž znám jako CD40L, TRAP, T-BAM a nyní má oficiální označení CD z workshopu o leukocytech CD154. Ve zkouškách in vitro se objevuje gp39 na T-buňkách přibližně 2 až 4 hodiny po aktivaci T-buněk a nejvyšších hladin dosahuje po 6 až 8 hodinách. Hladina proteinu poté rychle klesá a 24 hodin po stimulaci již není detekovatelná.

Exprese gp39 byla rovněž detekována na eosinofilech a mastocytech (Noelle a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 89,

6550 - 6554 (1992); Hollenbaugh a kol., EMBO J. 11, 4313

- 4321 (1992); Spriggs a kol., J. Exp. Med. 176, 1543

- 1550 (1992); Graf a kol., Eur. J. Immunol. 22, 3191

- 3194 (1992); Covey a kol., Mol. Immunol. 31, 471 - 484 (1994); Castle a kol., J. Immunol. 151, 1777 - 1788 (1993); Roy a kol., J. Immunol. 151, 2497 - 2510 (1993); Gauchat a kol., Nátuře 365, 340 - 343 (1993); Gauchat a kol., Eur.

J. Immunol. 25. 863 - 865 (1995); Koshy a kol., J. Clin. Invest. 98., 826 - 837 (1996); Desai-Mehta a kol., J. Clin. Invest. 97, 2063 - 2073 (1996).

CD40 je silný signální receptor, poskytující mechanismus pro aktivované T-buňky k regulaci širokého okruhu imunních a zánětlivých odpovědí. Studie in vitro a in vivo s rekombinantními formami ligandů gp39 a s anti-CD40 monoklonálními protilátkami ukázaly, že signalizace prostřednictvím těchto receptorů vede k buněčné odpovědi u všech známých CD40⁺ buněk a tento výsledek se liší nejen u typu buněk, ale je rovněž modulován souběžnými signálními událostmi zprostředkovanými ostatními receptory.

V B-buňkách například signalizace CD40 ve spojení se signalizací IL-4 receptory vede k proliferaci B-buněk a tvorbě protilátek isotypu IgE, zatímco signalizace CD40 ve spojení se signály z IL-IO receptoru vede k proliferaci B-buněk a tvorbě protilátek isotypu IgG (Gordon a kol., Eur.

J. Immunol. 17, 1535 - 1538 (1987); Rouset a kol., J. Exp.

Med. 173, 705 - 710 (1991); Jabara a kol., J. Exp. Med.

172, 1861 - 1864 (1990); Gascan a kol., J. Immunol. 147, 8 - 13 (1991). Signalizace CD40 zprostředkovaná gp39 může hrát roli v buněčné imunitě prostřednictvím indukce CD80 a CD86, důležitých kostimulačních molekul T-buněk, které váží CD28 a CTLA4 (Goldstein a kol., Mol. Immunol. 33., 541 - 552 (1996).

Systém receptor/ligand CD40/gp39 je jedním z mnoha systémů, zapojených do produktivní interakce mezi aktivovanými T-buňkami a jinými buňkami imunitního systému. Nicméně řada poznatků ukazuje, že tato interakce je jedinečná a ústřední v regulaci humorální imunní odpovědi u lidí. Zejména defekty v expresi nebo struktuře gp39 se ukázaly jako příčina lidské imunodeficience známé jako hyper IgM syndrom (HIM), vázaný na X-chromozom. Tato imunodeficience je charakterizována neschopností postižených jedinců vytvářet jiné protilátky než daného IgM izotypu, což indikuje, že produktivní interakce mezi gp39 a CD40 je nutná pro účinnou humorální odpověď (Allen a kol., Science 259,

990 - 993 (1993); Aruffo a kol., Cell 72, 291 - 300 (1993); Di Santo a kol., Nátuře 361, 541 - 543 (1993); Fuleihan a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 90(6), 2170 - 2173 (1993); Korthauer a kol., Nátuře 361, 539 - 541 (1993); Notarangelo a kol., Immunodef. Rev. 3., 101 - 122 (1992). Podobně poslední údaje indikují, že HIM syndrom, který není vázán na X-chromozom u lidí je způsoben defekty v molekule CD40. Použitím, technologie, vedoucí ke knockoutu genu (vyřazení genu z činnosti), byly připraveny myši, kterým chybí CD40 nebo gp39. Tyto myši projevují fenotyp, který má stejné charakteristiky jako HIM syndrom, z čehož lze předpokládat,

že myš může sloužit jako vhodný model, na němž lze zkoušet in vivo účinky léčby buď anti-CD40 nebo anti-gp-39 monoklonálních protilátek, které blokují interakci mezi CD40 a gp39 (Kawabe a kol., Immunity 1, 167 - 178 (1994); Xu a kol., Immunity 1, 423 - 431 (1994); Renshaw a kol., J. Exp. Med. 180, 1889 - 1900 (1994); Castigli a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 91, 12135 - 12139 (1994).

Účinky in vivo inhibice interakce CD40/gp39 se intenzivně studovaly na normálních myších a myších modelech nemoci za použití křeččí monoklonální protilátky proti myší gp39 (MR1). Imunosupresivní kapacita protilátky se odráží v její schopnosti kompletně inhibovat humorální imunní odpověď na T-buňky dependentní antigeny (Foy a kol., J. Exp. Med. 178, 1567 - 1575 (1993). Na několika myších modelech nemocí imunity se rovněž ukázalo, že tyto nemoci byly inhibovány léčbou protilátkou, včetně těch nemocí, zprostředkovaných buněčnými imunními odpověďmi. Ukázalo se, že modely nemocí byly inhibovány léčbou anti-gp39, včetně arthritidy indukované kolagenem, experimentální alergické encefalomyelitidy, lupus nefritis, rejekce transplantátů a reakce štěpu proti hostiteli (Durine a kol., Science 261, 1328 - 1330 (1993); Berry a kol., nevydané; Gerritse a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 93., 2499 - 2504 (1995);

Mohan a kol., J. Immunol. 154, 1470 - 1480 (1995); Larsen a kol., Transplantation 61, 4-9 (1996); Hancock a kol.,

Proč. Nati. Acad. Sci USA 93, 13967 - 13972 (1996); Parker a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA 92, 9560 - 9564 (1995); Durie a kol., J. Clin. Invest. 94, 1333 - 1338 (1994); Wallace a kol., nevydáno). Úloha CD40/gp39 v amplifikaci buněčné imunní odpovědi může být přímá, prostřednictvím stimulace subpopulace aktivovaných T-buněk, které jsou schopny exprese CD40, nebo nepřímo prostřednictvím indukce cytokinů a expresí důležitých ko-stimulačních molekul buněčného povrchu, jako CD 80 a Cd86, které vážou k T-buňkám receptory CD28 a CTLA-4. Protizánětlivé účinky inhibitorů byly ukázány studiemi na myším modelu poškození plic indukovaném

kyslíkem. Účinky na zánět in vivo se předpokládají na základě výsledků in vitro, které ukazují stimulaci CD40 na buňkách cévního endotelu a monocytech, jejíž výsledkem je exprese molekul buněčné adheze, oxidu dusnatého (NO), metaloproteinázy matrix a prozánětlivých cytokinů (Kiener a kol., J. Immunol. 155, 4917 - 4925 (1995); Malík a kol., J Immunol. 156, 3952 - 3960 (1995); Hollenbaugh a kol., J. Exp Med. 182, 33 - 40 (1995).

Studie s monoklonálními protilátkami proti lidským gp39 na opicích ukázaly, že biologické látky, které inhibují interakci mezi gp39 a CD40 in vivo jsou účinnými imunosupresivními látkami u primátů. Anti-gp39 monoklonální protilátky se ukázaly účinnými v inhibici protilátkových odpovědí na antigeny dependentní na T-buňkách a při ochraně alografních štěpů před rejekcí. Tyto výsledky jsou analogické jako u hlodavců.

Souhrnně ukázaly studie uvedené výše, že látky, které přerušují interakci mezi gp39 a CD40, budou silnými imunosupresivními a protizánětlivými látkami. Proto je zapotřebí účinný způsob blokování interakce CD40/gp39, aby poskytl imunosupresivní a protizánětlivý účinek. Cílem předloženého vynálezu je poskytnout protilátku, která blokuje interakci mezi gp39 a CD40.

Dalším cílem předloženého vynálezu je poskytnout chimerní protilátku účinnou při blokování interakce mezi CD40 a gp39.

Doplňkovým cílem předloženého vynálezu je poskytnout humanizovanou protilátku účinnou při blokování interakce mezi CD40 a gp39.

Dalším cílem předloženého vynálezu je způsob modulace imunní odpovědi podáváním protilátky, chimerní protilátky nebo humanizované protilátky poskytnutého vynálezu. Způsob může být účinný v léčbě řady autoimunních chorob, stejně jako transplantace kůže a jiných orgánů.

Podstata vynálezu *· ·*· · _· · · · • · · · · * * · · · · « · · · ······ · ·

Poskytnutý vynález zahrnuje novou protilátku, výhodněji chimérizovanou monoklonálni protilátku proti lidským CD40, která blokuje interakci mezi gp39 a CD40.

V jednom ztělesnění poskytnutého vynálezu je zvláště výhodná chimerizovaná monoklonálni protilátka proti lidským CD40 nazývána chi220. Chi220 je chimerní protilátka obsahující rozličné myší a lidské kappa a gama 1 konstantní oblasti Chi220 se, jako její mateřská myší m-protilátka, váže na CD40 a výsledkem je účinné blokování humorální imunní odpovědi na antigeny dependentní na T-buňkách v režimu závislém na dávkách.

V rámci poskytnutého vynálezu jsou rovněž humanizované protilátky proti CD40, které blokují interakci mezi gp39 a CD40. V jednom ztělesnění poskytnutého vynálezu humanizovaná protilátka je označena jako F4; v jiném ztělesnění humanizovaná protilátka je označena jako L3.17. Výhodné humanizované protilátky poskytnutého vynálezu zahrnují lidské proměnlivé těžké a proměnlivé lehké oblasti s myšími naštěpovanými CDRs.

Protilátky proti CD40 poskytnutého vynálezu, výhodně chimerní a humanizované protilátky zde popsané jsou účinné v modulaci humorální imunní odpovědi proti antigenům dependentním na T-buňkách, arthritidě indukované kolagenem a rejekci transplantátů. Protilátky proti CD40 poskytnutého vynálezu, výhodně chimerní a humanizované protilátky zde popsané jsou rovněž užitečné pro své protizánětlivé vlastnosti (které jsou stejné jako vlastnosti pozorované u anti-gp39).

Protilátky poskytnutého vynálezu, výhodně anti-CD40 chimerní a humanizované protilátky chi220 a anti-CD40 a humanizované protilátky F4 a L3.17 mají široké léčebné uplatnění, zahrnující autoimunní nemoci, zánětlivé nemoci a transplantace. Díky expresi CD40 pozorované v maligních buňkách několika histologických typů je evidentní potenciální uplatnění protilátek proti CD40 v onkologii,

0000 _ 7· —· ♦ • 0 0 0 0 · • ·

0*00

zejména chimerních a humanizovaných protilátek poskytnutého vynálezu.

Následující zkratky jsou používány v poskytnuté přihlášce a jsou známy odborníkům v oboru: APC (antigen presenting cell - buňka prezentující antigen), CDR (complementarity-determining region - oblast, určující komplementaritu), CHO (chinese hamster ovary - vaječník čínského křečka), CIA (collagen-induced arthritis

- arthritida indukovaná kolagenem), C_max (maximální koncentrace v séru), COS (linie buněčných fibroblastů africké zelené opice), DMARD (disease modifying anti-rheumatic drugs - antirevmatika modifikující průběh choroby), ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay

- enzymová imunoanalýza), EPT (end point titers - konečné titry), EU (endotoxin units - jednotky endotoxinu), FAB (antigen binding fragment - fragment vážící antigen), FITC (fluoroisothiokyanát), Hu humanizovaný, hl06-2 humanizovaná monoklonální protilátka proti gp39, HAMA (human anti-mouse antibodies - lidské protimyší protilátky), im (intramuskulární), KLH (keyhole limpet hemocyanin -), mAb monoklonální protilátka, MTX (metotrexát), OVA (ovalbumin), PBS (phosphate buffered šalině - roztok soli pufrovaný fosforečnanem), PCR (polymerase chain reaction

- polymerázová řetězová reakce), PE (phycoeritherin), sc (subkutánní - podkožní), SDS-PAGE (elektoforéza na gelu polyakrylamidu síranu dodecylsodného), SEC (size exclusion chromatography - vylučovací chromatografie), SRBC (sheep red blood cells - ovčí červené krvinky), STR (stirred tank reactor - reakční nádobka s mícháním), TNF (tumor necrosis factor - faktor nekrózy tumoru), VL (proměnná oblast lehkého řetězce protilátky), VH (proměnná oblast těžkého řetězce protilátky).

Nukleová kyselina kódující výhodný lehký řetězec chimerní protilátky poskytnutého vynálezu (chimerní protilátky 2.220) byla uložena v Americké sbírce typů kultur

9999

···· _ · 9

9 99 a bylo jí přiděleno vstupní číslo ATCC _. Nukleová kyselina kódující výhodný těžký řetězec chimerní protilátky poskytnutého vynálezu (chimerní protilátky 2.220) byla uložena v Americké sbírce typů kultur a bylo jí přiděleno vstupní číslo ATCC _.

Nukleová kyselina kódující výhodný lehký řetězec humanizované protilátky poskytnutého vynálezu (humanizované protilátky F4) byla uložena v Americké sbírce typů kultur a bylo jí přiděleno vstupní číslo ATCC _. Nukleová kyselina kódující doplňující výhodný lehký řetězec humanizované protilátky poskytnutého vynálezu humanizované protilátky L3.17) byla uložena v Americké sbírce typů kultur a bylo jí přiděleno vstupní číslo ATCC _. Nukleová kyselina kódující výhodný těžký řetězec humanizované protilátky poskytnutého vynálezu (F4 a L3.17) byla uložena v Americké sbírce typů kultur a bylo jí přiděleno vstupní číslo ATCC _.

Tyto zmíněné úschovy budou udržovány za podmínek Budapešťské úmluvy o mezinárodním uznávání úschov mikroorganismů pro účely patentové procedury. Tyto úschovy jsou poskytovány pouze jako výhoda (potřeba) pro odborníky v oboru a nejsou přiznáním, že úschova je požadována podle § 112 U.S.C.35. Sekvence polynukleotidů obsažená v uschovaných látkách, stejně jako sekvence aminokyselin polypeptidů jimi kódovaných jsou zde zahrnuty v odkazech a jsou kontrolními v případě jakéhokoli konfliktu s jakýmkoli popisem sekvencí, zde podaným. Pro přípravu, užití nebo prodej uschovaných látek je možno požadovat licenci a žádná tato licence zde není udělena.

Všechny odkazy citované v této přihlášce, jak výše tak níže, jsou zde zahrnuty v jejich celku.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje inhibici navázání sgp39 na Rajiho buňky protilátkami proti lidskému CD40.

·· ·Μ· — Q· —· · · · ··

·· ·»··

···· ···

Obrázek 2 je schematickým náčrtem protokolu studie u primátů. Dny léčby jsou vyznačeny kosočtverci. Imunizace SRBC a KLH jsou označeny obdélníky a trojúhelníky. Zvířata léčená 2.36 nebyla zahrnuta ve studii po fázi I a zvířata léčená 1.106 nebyla zahrnuta ve studii po fázi II.

Obrázek 3 ukazuje protilátkovou odpověď anti-SRBC u primátů. Obrázek 3a ukazuje výsledky analýzy IgM protilátek proti SRBC. Obrázek 3b ukazuje výsledky analýzy IgG protilátek proti SRBC.

Obrázek 4a ukazuje sekvenci proměnné oblasti lehkého řetězce chi220 zvýrazněně (SEQ ID N0:l) a obrázek 4b ukazuje sekvenci proměnné oblasti těžkého řetězce chi220 zvýrazněně (SEQ ID NO:2). Podtržené sekvence na obrázku 4a a 4b jsou vložené signální sekvence lidské protilátky s nejbližší homologií, které se použily jako templát pro humanizaci.

Obrázek 5 ukazuje výsledky zkoušek in vitro testujících chimerní a humanizované protilátky poskytnutého vynálezu. Obrázek 5a ukazuje navázání chi220 a h220v3 na hCD40-mG2b ve zkoušce založené na metodě ELISA. Obrázek 5b ukazuje inhibici kostimulace lidských B-buněk s protilátkami proti lidským CD40 zprostředkované sgp39.

Obrázek 6 ukazuje IgM anti-SRBC protilátkovou odpověď. Obrázek 6a ukazuje výsledky na opicích získané dávkami 10, nebo 100 mg/kg chi220. Obrázek 6b ukazuje výsledky na opicích získané dávkami 0,1 nebo 1 mg/kg chi220.

Obrázek 7 ukazuje IgG anti-SRBC protilátkovou odpověď. Obrázek 7a ukazuje výsledky na opicích získané dávkami 10, nebo 100 mg/kg chi220. Obrázek 6b ukazuje výsledky na opicích získané dávkami 0,1 nebo 1 mg/kg chi220.

Obrázek 8 ukazuje anti-OVA protilátkovou odpověď u primátů. Obrázek 8a ukazuje výsledky analýzy IgM protilátek anti-OVA. Obrázek 8b ukazuje výsledky analýzy IgG protilátek anti-OVA.

Obrázek 9 ukazuje anti-KLH protilátkovou odpověď u primátů. Obrázek 9a ukazuje výsledky analýzy IgM protilátek anti-KLH. Obrázek 9b ukazuje výsledky analýzy IgG

4«

- το • · • ·

4444 ··· • 4 4*44

4 · • 4 · • · · • 4 4 • 4 4

protilátek anti-KLH.

Obrázek 10 ukazuje srovnání schopnosti protilátky 7E1-G1 a 7E1-G2b snížit IgG protilátkové odpovědi na SRBC.

Obrázek 11 ukazuje závislost inhibice protilátkové odpovědi na SRBC pomocí 7E1-G2b na dávce.

Obrázek 12 ukazuje expresi vektorových map oblasti těžkého řetězce a oblasti lehkého řetězce chimerní protilátky poskytnutého vynálezu.

Obrázek 13 poskytuje sekvenci nukleových kyselin (SEQ ID NO:5) pro expresi vektoru schopnou způsobit expresi těžkého řetězce chimerní protilátky poskytnutého vynálezu. Iniciační kodón ATG (nukleotidy 1000 - 1002), kódující startující Met vložené signální sekvence lidské protilátky jsou zvýrazněny. Nukleotidy 1057 až 1422 (SEQ ID NO:13), které jsou podtržené, poskytují výhodnou sekvenci nukleových kyselin kódující proměnný těžký řetězec protilátky poskytnutého vynálezu.

Obrázek 14 poskytuje sekvenci nukleových kyselin (SEQ ID NO:6) pro expresi vektoru schopnou způsobit expresi lehkého řetězce chimerní protilátky poskytnutého vynálezu. Iniciační kodón ATG (nukleotidy 1005 - 1007), kódující startující Met vložené signální sekvence lidské protilátky jsou zvýrazněny. Nukleotidy 1065 až 1388 (SEQ ID NO:14), které jsou podtržené, poskytují výhodnou sekvenci nukleových kyselin kódující proměnný lehký řetězec protilátky poskytnutého vynálezu.

Obrázek 15 ukazuje řazení proměnných oblastí řetězců myší anti-CD40 a sekvence lidského templátu. Sekvence aminokyselin proměnných oblastí H a L řetězců myší anti-CD40 se použily k identifikaci homologních lidských sekvencí zárodečných linií. Číslování zbytků a definice CDRs (podtrženo) jsou založeny na Kabat a kol. (Kabat E.A. a kol., Sequences of proteins of immunological inter?st 5.vydání (1991). Washington DC: United States department of Health and Human Services; Kabat E.A. a kol., J. Biol.

Chem. 252, 6609 - 6616 (1977). Rozdíly v sekvenci jsou • 9 určovány vertikálními liniemi a rámcové pozice charakterizované v kombinatorické knihovně exprese jsou označeny hvězdičkou.

Obrázek 16 ukazuje výsledky titrace humanizovaných anti-CD40 variant na imobilizovaném antigenu. Byly charakterizovány bakteriálně expresovaný chimerní anti-CD40 FAB a zvolené varianty z každé z knihoven. Chimerní (plná kolečka), Hu I-19C11 (prázdná kolečka), Hu II-CW43 (prázdné čtverečky) , Hu III-2B8 (plné trojúhelníky) a nevýznamné (plné čtverečky) FAB se uvolnily z periplasmatického prostoru 15 ml bakteriální kultury a jednotlivá po sobě jdoucí zředění se inkubovaly s antigenem CD40-Ig imobilizovaným na mikrotitračních destičkách. Vazba protilátek byla kvantifikována způsobem popsaným níže.

Obrázek 18 ukazuje, jak afinita protilátek koreluje s inhibici vazby rozpustné gp39 na CD40-Ig. Ligand pro receptor CD40, gp39 se zachytil na mikrotitrační destičce. Následně se ko-inkubovala různá množství chimerní (plná kolečka), Hu II-CW43 (prázdné čtverečky), Hu III-2B8 (plné trojúhlelníky), Hu II/III-2B12 (prázdné trojúhelníky) a nevýznamné (plné čtverečky) FAB se 2μg/ml CD40-Ig na mikrotitrační destičce. Vazba CD40-Ig na gp39 byla kvantifikována způsobem popsaným níže.

Obrázek 18 ukazuje kvantifikaci myších rámcových zbytků v aktivních variantech. Proměnné oblasti nejaktivnějších variant anti-CD40 z knihovny rámcové optimizace Hu I (A) a knihovny rámcové optimizace HCDR3 se sekvenovaly, aby se identifikovaly aminokyseliny na pozicích pracovní knihovny čtecích rámců. Každá jednotlivá varianta se kategorizovala na základě celkového počtu myších zbytků, které se udržely na 8 pozicích pracovní knihovny čtecích rámců. Sekvencovalo se třicet jedna klonů z knihovny Hu I a čtrnáct klonů z knihovny Hu II, což vedlo k identifikaci 24 a 10 jednotlivých variant. Pevná linie indikuje rozdělení sekvencí, jaké se očekává od stejného počtu náhodně zvolených variant.

Podrobny popis vynálezu

Původci poskytli chimerní a humanizované protilátky proti lidským CD40 s imunosupresivními vlastnostmi. Takové protilátky proti lidským CD40 mají zřejmé využití jako léčiva. Původci rovněž poskytli úzce spojené monoklonální protimyší protilátky proti CD40 (úzce spojené s monoklonálními protilátkami proti lidským CD40), které jsou využitelné pro studium účinků monoklonálních protilátek proti CD40 v řadě myších modelů imunních a zánětlivých onemocnění. Vývoj protilátek proti CD40 komplikuje skutečnost, že CD40 je silná signální molekula. Protilátky, které se vážou na tento antigen, lze kategorizovat na základě schopnosti stimulovat signalizaci CD40 stejně jako schopnosti blokovat interakci CD40/gp39.

Monoklonální protilátka proti lidským CD40, předložená přihlašovateli patentu, která blokuje interakci CD40/gp39, byla zvolena z rozsáhlého seznamu anti-CD40 monoklonálních protilátek. Protilátka, značená 2.220, byla chimerizována a humanizována. Chimerní protilátky zahrnují lehký řetězec a těžký řetězec: lehký řetězec zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce a stálou oblast lehkého řetězce; těžký řetězec zahrnuje proměnnou oblast těžkého řetězce a stálou oblast těžkého řetězce. Chimerní protilátky zahrnují proměnné oblasti jednoho druhu a stálé oblasti jiného druhu (například myší proměnné oblasti spojené s lidskými stálými oblastmi). (Viz například U.S. patenty 4816397 a 4816567). Každá z proměnných oblastí lehkého řetězce (VL) a proměnných oblastí těžkého řetězce (VH) se skádá z rámcových oblastí přerušených třemi hyperproměnnými oblastmi nazývanými oblasti určující komplementaritu nebo

CDRs.Humanizované protilátky obsahují protilátky s lidskými proměnnými oblastmi kombinované s CDRs z dárcovského myšího nebo krysího imunoglobulinu. (Viz například U.S. patent 5530101). Humanizované protilátky • 9 ···· ···

obsahující CDRs odvozené z myších proměnných řetězců popsaných zde jsou rovněž zahrnuty v rámci poskytnutého vynálezu.

Nej zřejmější přístupová cesta k humanizaci protilátky se skládá z naštěpování CDRs od dárcovské monoklonální protilátky na lidský rámec (Jone P.T. a kol., Nátuře 321,

522 - 525 (1985). Nicméně jisté zbytky rámců podporují strukturu CDR a kontaktní antigen štěpující myší CDRs na lidské rámcové templáty mohou snížit vazebnou aktivitu výsledné humanizované monoklonální protilátky (Foote J. a kol., J. Mol. Biol. 224, 487 - 499 (1992). Hodnocení možného příspěvku zbytků specifického rámce na afinitu protilátky přináší dva problémy. Zaprvé je obtížné předvídat, které zbytky rámce hrají klíčovou roli při udržení afinity a specificity u jednotlivé monoklonální protilátky. Zadruhé je pro rámcové pozice, které se liší mezi mateřskou monoklonální protilátkou a lidským templátem, obtížné předvídat, zda aminokyselina odvozená z myšího rodiče nebo lidského templátu přinese aktivnější monoklonální protilátku. Výsledně proto nejsou vždy úspěšné způsoby humanizace protilátek, spoléhající výhradně na predikcích struktury.

Současné znalosti oboru obsahují popis strategie všeobecného inženýrství protilátek, která odpovídá obtížím při zachování aktivity vázat protilátky po humanizaci (Rosok M. J. a kol., J. Biol. Chem. 271, 22611 - 22618 (1996). Potenciálně významné zbytky rámců které se liší mezi mateřskou monoklonální protilátkou a lidským templátem, jsou charakterizovány v jediném stupni syntézou a expresí knihovny kombinatorních protilátek, která obsahuje všechny možné kombinace mateřských a lidských aminokyselin templátu v rámci zkoumané pozice. Varianty ukazující optimální strukturu rámce jsou identifikovány vyhledáváním (screeningem) a následně je (jsou) optimální rámcová struktura (rámcové struktury) určeny sekvenováním DNA. Typicky odhalí sekvencující vícenásobné klony rozhodující • ·· · rámcové pozice, nutné pro expresi příslušné aminokyseliny. Obráceně, exprese myší nebo lidské aminokyseliny v pozici pracovní knihovny čtecích rámců ve stejné frekvenci v aktivních klonech je v souladu s méně důležitou funkcí této jednotlivé rámcové pozice. Takto je humanizována verse protilátky, která zabezpečuje vazebnou aktivitu mateřské monoklonální protilátky rychle identifikována na základě funkční vazby.

Proces humanizace protilátky a vyzrání (maturace) afinity se často provádí v šetrných stupních (Rosok, (1996), viz výše; Yelton D. E. a kol., J. Immunol. 155, 1994 - 2004 (1995); Wu H. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 95, 6037 - 6042 (1998); Bača M. a kol., J. Biol. Chem. 272,

10678 - 10684 (1997); Marks J. D. a kol., J. Biol. Chem.

267, 16007 - 16010 (1992). Za použití modifikované strategie popsané níže byly připraveny vícenásobné humanizace verse myších monoklonálních protilátek 2.220 vykazující afinitu shodnou nebo lepší než chimerní FAB.

Chimerní protilátka anti-CD40, poskytnutá předkladateli vynálezu, je zde označována jako chi220.

Úzce spojená protimyší monoklonální protilátka proti CD40, poskytnutá předkladateli vynálezu, je zde označována jako 7E1. Humanizované protilátky anti-CD40, poskytnuté předkladateli vynálezu, jsou zde označovány jako F4 a L3.17.

Byly připraveny dvě varianty izotypu 7E1. Tyto dvě varianty 7E1 jsou využitelné při zkoumání úlohy podílu Fc molekuly při léčbě monoklonální protilátkou proti CD40 v preklinických modelech imunních a zánětlivých onemocnění. Příprava monoklonální protilátky proti myším CD40, kriteria pro volbu té, která je vlastnostmi vhodná k chi220, příprava izotypových variant monoklonálních protilátek a jejich aktivita in vivo na myších modelech imunních nemocí jsou zde rovněž poskytnuty. Studie jak s chi220 tak s jejich mateřskou myší monoklonální protilátkou 2.220 na opicích, stejně jako studie s 7E1 na myších ukázaly, že tyto • · · · · ·

- 4¾ ?• · · · ·— β · · · anti-CD40 monoklonální protilátky jsou účinné imunosupresivní látky a jejich výsledky budou detailněji dikutovány dále. Studie zde popsané byly prováděny za použití standardní techniky známé odborníkovi v oboru.

Shrnuto, ukázalo se, že protilátky, poskytnuté předkladateli vynálezu snižují humorální imunní odpověď u opic. Stejně tak vykázaly dvě izotypové varianty úzce spojených monoklonálních protilátek proti myším CD40, 7E1 imunosupresivní aktivitu v řadě preklinických modelů studií lidských nemocí. Shrnuto, tyto výsledky ukazují, že chi220, F4 a L3.17 jsou užitečné pro jejich klinické využití při léčbě autoimunních nemocí a transplantací.

Následující příklady slouží pouze ilustrativním účelům a neomezují rozsah vynálezu, který je určen pouze patentovými nároky.

Příklad 1

A. Izolace a charakterizace in vitro

Panel monoklonálních protilátek se připravil proti lidským CD40 za použití standardní technologie hybridomů s lidským proteinem fuze CD40 jako imunogenem. Protilátky se vyhledaly pro vazbu na CD40 pomocí jak buněčné linie CD40⁺, tak proteiny fuze. Zkoušky gp39 vážící se na CD40 a funkční zkoušky stimulace prostřednictvím CD40 se použily k charakterizaci klonovaných protilátek. Zvolené protilátky se poté charakterizovaly pro jejich zkříženou reaktivitu s buňkami primátů, aby se zjistila vhodnost protilátek pro užití v preklinických modelech u primátů.

1. Imunizace a fuze

Provedly se dvě fuze ke generování hybridomů vytvářejících monoklonálních protilátek proti lidským CD40. Imunizace pro vznik imunních lymfocytů se provedly na 6 až 8 týdnů starých samičkách myší BALB/c za použití jako imunogenů rekombinantních proteinů fuze složených z extracelulární domény lidské CD40 fúzované k zavěšení,

CH2 a CH3 domény myší protilátky IgG2b (hCD40-mG2b).

Pro fúzi 40-1 se myš zpočátku imunizovala subkutánně na 3 až 4 místech emulzí (celkově 200 μΐ) 30 ug hCD40-mG2b v kompletním Freundově adjuvans. Zvíře se 21. den stejným způsobem podpůrně injikovalo hCD40-mG2b v nekompletním Freundově adjuvans a poté se mu 37.den aplikovala finální pre-fuzová imunizace intravenosní injekcí 30 ug hCD40-mG2b v PBS. Imunizace pro fúzi 40-2 se provedla stejným způsobem s výjimkou toho, že adjuvans Ribi (R-730) nahradil Freundovo adjuvans. Podpůrné imunizace se provedly v 21. a 42. dnu s finální pre-fuzovou injekcí 58. den.

Tři dny po finálních podpůrných injekcích se získaly leukocyty ze sleziny a lymfatických uzlin a fúzovaly se v poměru 3:1 s X63-Ag8.653 myšími myelomovými buňkami za použití standardních metod (Kearney a kol., J. Immunol.

123. 1548 - 1550 (1979); Lané, J. Immunol. 81, 223 - 228 (1985). Suspenze buněk z každé fuze se naočkovala do deseti ploten pro kultivaci, obsahujících každá 96 jamek při destičkové denzitě přibližně 170000 celkových buněk (před fúzí) na jamku.

2. Screening (vyhledávání) a klonování

Použily se dva formáty zkoušek pro identifikaci monokolonálních protilátek u přírodní humanizované CD40. Supernatanty buněčné kultury ze všech jamek se zpočátku podrobily vyhledávání (screeningu) k určení jejich schopnosti vázat CD40-pozitivní EBV-transformované linie lidských B-buněk (1A2-2C) ve formátu založeném na metodě ELISA. Každý supernatant se potom testoval ve formátu založeném na metodě ELISA na reaktivitu s purifikovaným rekombinantním fúzovaným proteinem, skládajícím se z extracelulárních domén lidské CD40 fúzované k zavěšení,

CH2 a CH3 domén lidské IgGl protilátky, hCD40-Ig a stejným způsobem vytvořeným nevýznamným lidským Ig fúzovaným proteinem, Leu8-Ig (Hollenbaugh a kol., EMBO J. 11, 4313 • « ··· ·

- 4321 (1992). Reaktivita s dříve uvedeným fúzovaným proteinem a nikoli s posledně uvedeným z nich, ve spojení s údaji o buněčné vazbě, ukázala na přítomnost protilátky specifické pro přírodní CD40 u přibližně 200 hlavních jamek.

Klíčovou funkční vlastností pro požadovanou anti-CD40 monoklonální protilátku byla kapacita úplně blokovat interakci CD40 a jejího ligandu gp39. Takto se jako další krok ve výběru protilátky všechny supernatanty ze specifických hlavních jamek CD40 hodnotily s ohledem na jejich schopnost inhibovat vazbu rozpustného rekombinantní myší CD8-lidský gp39 fuzní protein, sgp39, na imobilizovaný hCD40-Ig ve formátu založeném na metodě ELISA. Ty, které kompletně inhibovaly tuto interakci, se následně titrovaly ve stejném formátu, aby se určilo, které jamky obsahovaly nejvyšší titr inhibující protilátky. Deset nejsilněji inhibujících hlavních jamek z této analýzy bylo vybráno ke klonování.

Klonování vhodných buněk vylučujících protilátku se provedla v procesu sestávajícím ze dvou kroků. Buňky z každé hlavní jamky se nejprve miniklonovaly při hustotě očkování 10 buněk na jamku, po kterém se CD40-specifický miniklon s nejvyšším titrem formálně klonoval pomocí metody limitního vyřeďování.

3. Další charakterizace

Pro charakterizaci protilátek se použilo šest formátů zkoušek. Byly to inhibice vazby gp39 na lidské B-buňky, inhibice proliferace B-buněk indukované sgp39 spolu s anti-IgM, inhibice syntézy protilátky in vitro B-buňkami indukovanými aktivovanými T-buňkami, přímá kostimulace B-buněk pomocí anti-IgM, kostimulace B-buněk pomocí anti-IgM za přítomnosti lehkého řetězce anti-kappa protilátky imobilizovaného pomocí cross-linking a kostimulace B-buněk pomocí anti-IgM v přítomnosti druhé anti-CD40 monoklonální protilátky, G28-5. Tato monoklonální protilátka je známa svojí kostimulační aktivitou a tím, že • · · · ·

- *1« :-..

kompletně blokuje interakci CD40/gp39. Pro účely srovnání byla tato protilátka zahrnuta v mnoha zkouškách.

Tyto analýzy vedly k výběru čtyř monoklonálních protilátek: 1.66 (IgG2b), 2.36 (IgG2a), 2.174 (IgGl) a 2.220 (IgG2a). Prováděly se testy k charakterizaci monoklonálních protilátek. V jednom experimentu se inkubovaly buňky z lidské B-buněčné linie Ráji s 2 nebo 20ug/ml různých anti-CD40 monoklonálních protilátek, po této inkubaci následovala druhá inkubace v nezředěném supernatantu COS buněk obsahujícím protein fuze mCD8-gp39 (sgp39). Vázaný sgp39 se detekoval další inkubací buněk s anti-mCD8 monoklonální protilátkou, značenou FITC a analýzou buněk na FACScanu. Procento inhibice bylo spočítáno dělením střední fluorescence vzorků inkubovaných s protilátkou střední fluorescencí vzorků bez protilátky při první inkubaci (Obrázek 1).

Jak je ukázáno na obrázku 1, každá z těch čtyř monoklonálních protilátek byla schopna kompletně inhibovat vazbu proteinu fuze sgp39 na linie lidských B-buněk vykazujících vysoké hladiny CD40, ačkoli v případě 2.174 byla ke kompletnímu blokování nutná relativně vysoká koncentrace. Podobné údaje byly získány za použití lidských tonsilárních B-buněk. Zadruhé, každá z nich významně inhibovala tvorbu IgG a IgM ve zkoušce in vitro syntézy protilátky B-buněk dependentních na T-buňkách.

Tři z těchto čtyř protilátek vykázaly omezenou schopnost kostimulace proliferace B-buněk za přítomnosti anti-IgM. Monoklonální protilátka 2.220 byla stálejší ve své schopnosti vyvolat slabou kostimulační aktivitu. Za přidání anti-kappa lehkého řetězce protilátky, použité pro cross-link imobilizaci anti-CD40 monoklonálních protilátek, získala 2.36 významnou kostimulační aktivitu, zatímco aktivita ostatních tří protilátek nebyla ovlivněna. Ukázalo se, že kostimulační schopnost G28-5 byla odlišně modulována, když byla spárována v kombinaci s každou ze čtyř nových anti-CD40 monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky — *1 Q· *· · · • ·· · ·»» • ·

1.66 a zvláště 2.174 zvyšovaly kostimulaci G28-5, zatímco

2.220 a 2.36 ji snižovaly. Po selekci založené na hodnocení v lidských systémech in vitro byly čtyři anti-CD40 monoklonální protilátky dále zkoušeny pro jejich vhodnost pro hodnocení in vivo ve studiích na primátech jiných než lidech. Dva klíčové prvky analýzy byly relativní potence každé z nich vázat B-buňky primátů a supresi syntézy protilátky B-buněk dependentních na T-buňkách za podmínek in vitro. Zjistilo se, že každá ze čtyř monoklonálních protilátek reagovala zkříženě s B-buňkami Cynomolgus macaque (Macaca fascicularis). 2.36 a 2.220 vázaly s větší aviditou než 2.174 a 1.66. Nižší zřejmá vaznost monoklonálních protilátek 2.174 a 1.66 nebyla způsobena jejich jednotlivými isotypy, protože jiné isotypově spojené anti-CD40 monoklonální protilátky vykázaly vazebné hladiny srovnatelné s 2.36 a 2.220 (např. G28-5 a 2.118). Tyto výsledky byly v kontrastu s výsledky pozorovaanými na lidských B-buňkách, kde každá z monoklonálních protilátek vykázala srovnatelnou vaznost. Schopnost čtyř monoklonálních protilátek snižovat syntézu protilátek opičími B-buňkami se ukázala být ve shodě se schopností vazby.

B. Charakterizace in vivo

Provedly se dvě studie na primátech jiných než člověk za použití myších monoklonálních protilátek proti lidským CD40 ke zhodnocení vhodnosti anti-Cd40 jako imunosupresivní látky a ke zvolení vhodné protilátky k dalšímu vývoji.

Zaprvé se porovnala clearance a akutní toxicita in vivo čtyř zvolených anti-CD40 monoklonálních protilátek.. Tyto výsledky se použily k volbě dvou protilátek, 2.36 a 2.220, které byly pak testovány ve druhé studii připravené pro hodnocení účinnosti inhibice protilátkové odpovědi na T-dependentní antigen a akutní toxicity.

Studie účinnosti 2.36 a 2.220 na primátech

- žo:

Na základě předchozích zjištění se hodnotily monoklonální protilátky 2.36 a 2.220 z hlediska jejich schopnosti snižovat T-dependentní protilátkovou odpověď po intravenózním podání opicím Cynomolgus. Tato studie byla rozdělena na tři fáze (obrázek 2). Ve fázi I byla každá ze čtyř skupin složených z jednoho nebo dvou samečků a jedné nebo dvou samiček opic Cynomolgus imunizována intravenózně ve dni 1 ovčími červenými krvinkami (SRBCs) a pak léčena monoklonální protilátkou 2.36, 2.220, 1.106 (IgGl myší protilátky proti lidské gp39 - pozitivní kontrola) nebo L6 (IgG2a myší protilátky proti lidskému tumorovému antigenu - negativní kontrola) v dávce 20 mg/kg v 1., 3. a 5. dni. Určily se titr IgM a IgG na imunogen SRBC, sérové hladiny testovaných a kontrolních látek, přítomnost protilátek proti testovaným a kontrolním látkám, hladiny sérových imunoglobulinů, počet leukocytů v periferní krvi a frekvence různých subpopulací lymfocytů v periferní krvi. Ve fázi II, poté co se zvířata zbavila testovaných a kontrolních látek, byla imunizována SRBC a druhým antigenem, KLH (keyhole limpet hemocyanin), aby se zhodnotila indukce imunologické tolerance a reversibilita pozorované imunosuprese. Ve fázi III se zvolená zvířata reimunizovala, aby se zjistilo, zda původně snížená protilátková anti-SRBC odpověď se opět vrátila do původního stavu po doplňkovém testu SRBC a zhodnotila se sekundární protilátková odpověď na KLH.

Provedl se experiment, aby se ukázalo, že monoklonální protilátka 2.220 významně snižovala primární protilátkovou odpověď na SRBCs (obrázek 3). Opice se léčily buď monoklonální protilátkou 1.106, L6, 2.36 nebo 2.220 v 1.,

3. a 5. dni fáze I dávkou 20mg/kg. Opice se imunizovaly SRBC v 1. dni fáze I, II a III. Obrázek 3a ukazuje výsledky vzorků séra, které byly analyzovány na IgM protilátky proti SRBC. Obrázek 3b ukazuje výsledky vzorků séra, které byly analyzovány na IgG protilátky proti SRBC. Data jsou vyjádřena v geometrikém průměru titru anti-SRBC pro každou skupinu (n=3 nebo 4).

· ·· ···· ·2ΐ:κ.

Vrcholová primární odpověď byla inhibována 85 % pro IgM a 98 % IgG. Poté, co clearance monoklonálni protilátky

2.220 v seru se dostala pod úroveň detekovatelnosti, vrcholová sekundární odpověď na SRBCs byla stále inhibována 79 % pro IgM a 56 % IgG ve srovnání s kontrolní odpovědí ve fázi I. To bylo v protikladu k pozitivní kontrole, monoklonálni protilátka 1.106, kde byla pozorována silná sekundární protilátkové odpověď na SRBC. Terciární odpověď na SRBC nebyla inhibována, což ukazuje, že monoklonálni protilátka 2.220 indukuje prolongovanou imunosupresi, ale nikoli imunologickou toleranci. Všechna zvířata imunizovaná KLH měla primární a sekundární anti-KLH odpověď, což ukazuje, že imunosuprese je reversibilní. Zvířata léčená 2.36 se nezahrnula do fáze II, protože ve fázi I studie nebyla pozorována významná inhibice.

Průměrné vrcholové sérové koncentrace, které se objevily ihned po poslední dávce, byly 744 μg/ml pro monoklonálni protilátku 2.220 a 405 μg/ml pro 2.36. Zatímco sérum se očistilo od monoklonálni protilátky 2.36 pod úroveň detekovatelnosti za 15 dnů, u monoklonálni protilátky 2.220 se neočistilo až do 29. dne. Obě monoklonálni protilátky 2.36 a 2.220 byly imunogenní.

Nebyla žádná klinická pozorování spojená s léčivy, ani změny tělesné hmotnosti, spotřeby potravy nebo změny hematologické nebo hladin sérových Ig u žádného zvířete. Jediným pozorovaným zjištěním, spojeným s léčivy, byly přechodné poklesy v procentuálním zastoupení periferních B-buněk o 70 % u monoklonálni protilátky 2.36 a 43 % u monoklonálni protilátky 2.220. Návrat B-buněk na normální hladinu se projevil během 2 až 3 týdnů po léčbě.

Shrnuto, monoklonálni protilátka 2.220 významně snížila protilátkovou odpověď na SRBCs, zatímco 2.36 nikoli. Ačkoli monoklonálni protilátka 2.220 indukovala prolongovanou na antigen specifickou imunosupresi, byla tato imunosuprese reversibilní. Na základě těchto zjištění byla zvolena monoklonálni protilátka 2.220 k dalšímu vývoji.

• ·· · • · · · · · • 9 9 9 9

9999 999 9 9 ·

Příklad 2

Příprava chimerní protilátky chi220

K ovlivnění imunogenicity myší monoklonální protilátky protilidské 2.220, připravily se rekombinantní formy, ve kterých se proměnné oblasti fúzovaly k lidským stálým oblastem a srovnávala se jejich účinnost in vitro. Dva použité přístupy byly příprava chimerní protilátky, obsahující nezměněné myší proměnné oblasti a humanizované formy, ve kterých se myší hyperproměnné oblasti (CDRs) naštěpovaly na lidské rámcové sekvence v rámci proměnných oblastí. Chimerní protilátky si udržují vlastnosti vážící antigen, jako mají jejich mateřské protilátky, ale je u nich větší pravděpodobnost, že budou imunogenní. Je méně pravděpodobné, že humanizované protilátky budou imunogenní, ale mutace zavedené při humanizaci mohou ovlivnit vaznost antigenu.

A. Vytvoření a charakterizace in vitro chimerních a humanizovaných protilátek

Oblasti VL a VH anti-CD40 monoklonální protilátky

2.220 se získaly PCR. CDNA se připravila z RNA izolované z hybridomů expresujících 2.220 monoklonální protilátku za použití IgGl-specifického nebo C_K-specifického anti-sense primeru (primeru protismyslové orientace), aby se získaly oblasti VH nebo VL. Poly-G konec se přidal k těmto jednoduchým šroubovicím DNA. Proměnné oblasti se poté amplifikovaly PCR za použití jako sense primeru (primeru smyslové orientace) oligonukleotidu obsahujícího sekvenci poly-C komplementární k poly-G konci a hnízda antisense primerů (primerů protismyslové orientace). Produkt získaný PCR se potom vložil do bakteriálního vektoru za použití restrikčních míst zahrnutých v primerech. Vícenásobné klony se potom sekvenovaly dideoxynukleotidovým sekvenováním. Provedly se dva nezávislé pokusy, které začínaly ve fázi RNA • ·

- ·23^.

· • 9

9999 999 a získané sekvence byly stejné.

Pro přípravu chimerní formy protilátky se proměnné oblasti amplifikovaly PCR za použití primerů, které zavedly sekvenci, kódující signální sekvenci lidské protilátky, která byla zjištěna jako nejblíže spojená se sekvencí 2.220, jak ukazuje obrázek 4. Podtržené podíly sekvence proměnného lehkého řetězce (obrázek 4a) a sekvence proměnného těžkého řetězce (obrázek 4b) označují vložené signální sekvence lidské protilátky s nejbližší homologií k myší 2.220. Tyto produkty PCR se vložily do vektoru obsahujícího sekvence kódující stálé oblasti lidské kappa nebo lidské τΐ, aby vznikl kompletní lehký nebo těžký řetězec. Vektory rovněž obsahovaly vhodné geny rezistence na léčiva pro přípravu a amplifikaci stálých linií expresujících protein. Protein k iniciální charakterizaci se vytvořil přechodnou expresí z buněk COS, po které následovalo čištění proteinu A.

Pro příklad, linie buněk vytvářejících chimerní protilátku se vytvořily transfekcí buněk CHO DG44 s oddělenými vektory exprese pro lehké a těžké řetězce chimerní protilátky a vysokokopiová elektroporační metoda se použila k podpoře kointegrace. (Viz U.S. Patent 4956288). Těžké a lehké řetězce chi220 se klonovaly do vektorů pDl7 a pD16 v tomto pořadí. Oba vektory jsou odvozeny od In Vitro plasmidu pcDNA3 a obsahují následující články (viz obrázek 12): (1) gen rezistence na neomycin z pcDNA3 se nahradil genem myší reduktázy dihydrofolátu (DHFR) za kontroly promotoru SV40 bez enhanceru (rovněž označovaném jako oslabený DHFR,· stojí za povšimnutí, že pouze promotor byl oslaben, nikoli enzym DHFR - promotor bez enhanceru stále obsahuje SV40 původ replikace, a tak tyto vektory lze použít při přechodných COS transfekcích); (2) gen, o který jde, je expresován z CMV promotoru a signál pro polyadenylacl je z genu hovězího růstového hormonu; (3) kazeta exprese pro gen, o který jde, je obklopena sekvencemi pro ukončení transkripce (například 5' do promotoru a 3' do místa póly φ φ φφ φφφ

- *24:·τ.

φ φφφφ φφφ

Α); (4) vektory obsahující dva odlišné polylinkery s restrikčními místy, jeden 3' k promotoru pro klonování genu, o který jde, a jeden 5' k promotoru pro linearizaci vektoru před transfekcí; (5) gen rezistence na ampicilin a ColEl původ pro plasmidovou propagaci v E. coli.

Použité geny těžkého a lehkého řetězce byly genomové produkty s následujícími modifikacemi: (1) kódující sekvence pro signální peptid těžkého řetězce, proměnná oblast a CHi doména byly přilehlé (neobsahovaly žádné introny) a (2) kódující sekvence pro signální peptid lehkého řetězce a proměnná oblast byly přilehlé.

Jiné vektory exprese, známé odborníkovi v oboru, které jsou schopné exprese chimerní protilátky, jsou předvídány v poskytnutém vynálezu. Sekvence nukleových kyselin použitelná ve vektoru exprese, schopném exprese těžkého řetězce chimerní protilátky poskytnutého vynálezu je ukázána na obrázku 13? sekvence nukleových kyselin použitelná ve vektoru exprese, schopném exprese lehkého řetězce chimerní protilátky poskytnutého vynálezu je ukázána na obrázku 14.

Kompletní sekvence aminokyselin těžkého a lehkého řetězce chimerní protilátky (chi220), zahrnující proměnné a stálé oblasti, je uvedena níže (zvýrazněné aminokyseliny označují proměnný těžký a proměnný lehký řetězec):

Sekvence těžkého řetězce (SEQ ID NO:3)

QIQLVQSGPE LKKPGETVRI SCKASGYAFT TTGMQWVQEM PGKGLKWIGW 50 INTHSGVPKY VEDFKGRFAF SLETSANTAY LQISNLKNED TATYFCVRSG 100 NGNYDLAYFA YWGQGTLVTV SAASTKGPSV FPLAPSSKST SGGTAALGCL 150 VKDYFPEPVT VSWNSGALTS GVHTFPAVLQ SSGLYSLSSV VTVPSSSLGT 200 QTYICNVNHK PSNTKVDKKV EPKSCDKTHT CPPCPAPELL GGPSVFLFPP 250 KPKDTLMISR TPEVTCVWD VSHEDPEVKF NWYVDGVEVH NAKTKPREEQ 300 YNSŤYRWSV LTVLHQDWLN GKEYKCKVSN KALPAPIEKT ISKAKGQPRE 350 PQVYTLPPSR DELTKNQVSL TCLVKGFYPS DIAVEWESNG QPENNYKTTP 400 PVLDSDGSFF LYSKLTVDKS RWQQGNVFSC SVMHEALHNH YTQKSLSLSP 450 GK 452 • · ··· · ♦· ·♦·· • · · · * · — ος »-a·· · · ·

Α» · · · · · • · · · ·

Sekvence lehkého řetězce (SEQ ID NO:4)

DIVLTQSPAT LSVTPGDRVS LSCRASQSIS DYLHWYQQKS HESPRLLIKY 50 ASHSISGIPS RFSGSGSGSD FTLSINSVEP EDVGIYYCQH GHSFPWTFGG 100 GTKLEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV 150

DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTWnr onn LSSPVTKSFN RGEC

214

Bylo připraveno několik humanizovaných forem 220.

Tento proces zahrnuje identifikaci myších a lidských sekvencí zárodečných linií s nejbližší homologií k VH a VL doménám. Myší sekvence zárodečných linií se použily k identifikaci pravděpodobných lokací somatických mutací, které vznikly během procesu vyzrávání afinity. Lidské sekvence se potom použily jako templáty a ty oblasti sekvence, u nichž je známo nebo se předpokládá, že jsou důležité ve vazebné specificitě, se nahradily v lidských sekvencích jak VH, tak VL. Struktury těchto sekvencí se potom modelovaly za použití jako templátu proteinu s nejbližší homologií, pro který se rozpustila krystalická struktura. Plasmidy kódující humanizované formy se připravily za použití PCR řízemé mutageneze a použily se k přípravě protilátky přechodnou expresí z COS buněk.

Zkoušky in vitro se provedly s chimerními a humanizovanými protilátkami poskytnutého vynálezu a jejich výsledky ukazuje obrázek 5. Obrázek 5a ukazuje výsledky vazebné zkoušky testující vazbu chi220 a h220v3 na hCD40-mG2b ve zkoušce založené na metodě ELISA. Jamky destiček Immulon-2 se potáhly hCD40-mG2b v koncentraci 10 ng/ml v PBS po dobu 2 hodin. Jamky byly blokovány vzorkovým rozpouštědlem (Genetic Systems) a přidaly se protilátky v označených koncentracích. Následovala inkubace po dobu 1 hodiny, jamky se promyly, detekovala se přítomnost protilátky za použití IgG kozí protilidské protilátky značené peroxidázou. H220v3 je humanizovaná forma monoklonální protilátky 2.220. Hodnoty jsou průměrem ze dvojitých jamek a sloupce chyb představují ·» ·>·· • · ··· · ·_· • ·*· ···· ··· • · • · • · · * • · · ·· *

standartní odchylku.

Obrázek 5b ukazuje výsledky zkoušky testující inhibici kostimulace, zprostředkované sgp-39, lidských B-buněk s monoklonálními protilátkami proti lidským CD40. Lidské tonsilární B-buňky v klidové fázi (50000 na jamku) se inkubovaly s proteinem fuze sgp39, 20 μg/ml imunokuličkami (immunobeads) potaženými králičím protilidským IgM a označenými koncentracemi monoklonálními protilátkami proti CD40 nebo pouze mediem ke kontrole na destičkách s 96 jamkami. 72 hodin po iniciaci kultur se všechny jamky označily [³H]thymidinem na hodnotu 1 uCi na jamku a buňky se kultivovaly po dobu dalších 18 hodin. Buňky se potom sklidily a začleněný [³H]thymidin se měřil na počítači scintilace.

Na základě výsledků zkoušek in vitro (obrázky 5a a 5b, které ukazují, že jak chimerní, tak humanizovaná protilátka účinně vázala CD40 a inhibovala stimulaci B-buněk) byla pro další studii zvolena chimerní protilátka.

Příklad 3

Účinnost chi220

A. Chimerní monoklonální protilátka 2.220: Studie účinnosti v jedné dávce na primátech jiných než lidech.

Chi220 se hodnotila na opicích Cynomolgus z hlediska její schopnosti snižovat primární a sekundární humorální imunní odpovědi na antigeny dependentní na T-buňkách.

V jedné studii se skupiny čtyř opic imunizovaly ovčími erythrocyty (SRBCs) a dostaly ovalbumin (OVA) k sekundární imunizaci těsně před podáním jedné intravenózní bolusové dávky buď chi220 v dávce 10, 40 nebo 100 mg/kg nebo sterilního roztoku soli pufrované fosforečnanem (PBS) jako kontroly. Bylo pozorováno významné snížení primární humorální imunní odpovědi na SRBCs ve všech třech dávkách, což demonstruje účinnost chi220 u primátů. Byla pozorována ·· ·«*· ·· ··« · • · · · · 27.·-»··..: : .· • · · · φ • ΦΦΦ φφφ ·· ·

přechodná, na dávce závislá deplece periferních B-buněk u všech opic, léčených chi220 a doba, po kterou se B-buňky dostaly zpět na původní hladinu, rovněž závisela na dávce.

Ve dvou nejvyšších dávkách byly pozorovány přechodné mírné poklesy průměrného absolutního počtu periferních T-buněk. Byly také pozorovány přechodné minimální poklesy hladin IgM v séru, ale žádné změny hladin IgG nebo IgA v séru, spojené s podáváním léčiva.

Pro hodnocení indukce imunní tolerance a reversibility imunosupresivní účinnosti se všechny opice imunizovaly OVA, SRBCs a neoantigenem, keyhole limpet hemocyanin (KLH) ve 149. dnu, když sérové hladiny chi220 ve skupině s dávkou 100 mg/kg byly již pod hladinami, o nichž se předpokládá, že jsou imunosupresivní (přibližně 10 μg/ml) a počty periferích B-buněk se vrátily na hladiny před podáním dávky. Anti-SRBC odpověď při nejnižší dávce byla všeobecně srovnatelná s primární anti-SRBC protilátkovou odpovědí u kontrolních opic. Protilátková odpověď na SRBC byla nicméně stále částečně nebo významně snížena u opic léčených dvěma vyššími dávkami.

K dalšímu prozkoumání závislosti imunosuprese a deplece B-buněk na dávce se provedla druhá studie, ve které se další opice (čtyři na skupinu) imunizovaly SRBCs a poté se jim dala chi220 v jedné dávce 0,1 nebo 1,0 mg/kg nebo PBS. Suboptimální imunosuprese protilátkové odpovědi na SRBCs byla pozorována u obou dávek. Mírná deplece periferních B-buněk byla evidentní u opic, které dostaly dávku 1,0 mg/kg chi220 k 8. dni a vrátila se na původní hladinu k 29. dni. Při dávce 0,1 mg/kg byl pozorován pokles průměrného počtu a procentuálního zastoupení periferních B-buněk, ale hodnoty nebyly mimo normální rozmezí procentuálního zastoupení B-buněk. Pro absolutní počty periferních B-buněk nebyly dosud stanoveny limity. U^- opic, které dostaly dávku 1 mg/kg chi220, byly pozorovány přechodné minimální poklesy počtu periferních T-bunék a mírné poklesy v proliferaci T-buněk ex vivo. A konečně

9 9

9 « ·· ·««» 28 *-··« nebyla prokázána aktivace komplementu ani změny v sérových hladinách IL-6 nebo TNFa, spojené s podáváním léčiva. Aktivace T-buněk ex vivo, aktivace komplementu a hladiny cytokinů v séru se nehodnotily u opic, které dostaly dávku 10, 40 nebo 100 mg/kg chi220.

V obou studiích se zkoušely vzorky séra po podání chi220 na hladiny testované látky v oběhu a na hodnocení tvorby protilátky proti ní. Farmakokinetická analýza ukázala, že průměrná maximální koncentrace v séru (C_max) chi220 nerostla proporcionálně v závislosti na dávce a že biologický poločas chi220 se prodloužil při zvýšení podané dávky. Bylo zjištěno, že chi220 je imunogenní při podání v dávkách 0,1, 1 nebo 10 mg/kg. Při koncentracích v oběhu nad 10 gg/ml se zdá, že chi220 může snížit protilátkovou odpověď zaměřenou proti ní.

1. Protokol experimentu

V zahajovací studii, která byla zmíněna výše, se přidělily opice Cynomolgus do čtyř skupin, skládajících se ze dvou samců a dvou samic. Všechny opice se 28 dní před podáním chi220 nebo kontroly imunizovaly OVA (5 mg/kg intramuskulárně a 10 mg/kg subkutánně). 1. den se všechny opice imunizovaly SRBCs (1,7 ml/kg 10% suspenze intravenózně) a druhou imunizaci OVA dostaly (5 mg/kg intramuskulárně a 10 mg/kg subkutánně) těsně před podáním jedné intravenózní bolusové dávky buď chi220 v dávkách 10, nebo 100 mg/kg nebo sterilního PBS jako kontroly. Ve 149. dnu, poté co hladiny chi220 v séru poklesly pod domněle imunosupresivní hladiny (přibližně 10 gg/ml) a hodnoty periferních B-buněk se navrátily na hladiny před podáním dávky ve všech skupinách, se opice imunizovaly OVA, SRBCs a KLH (10 mg/zvíře intramuskulárně). Cílem imunizace KLH bylo ukázat, že opice jsou schopny zahájit imunní odpověď na neoantigen poté, co byly léčeny chi220.

S cílem demonstrovat lepší závislost odpovědi na dávce

u imunosuprese a deplece periferních B-buněk, další opice se v druhé studii (dvě jednoho pohlaví na skupinu) imunizovaly SRBCs a poté dostaly jednu dávku bud’ chi220 v dávce 0,1 nebo 1,0 mg/kg nebo PBS jako kontrola v 1. dni. Monitorovaly se hematologické parametry a subpopulace lymfocytů periferní krve ve zvolených časech během obou studií. Monitorovaly se sérové chemické parametry u opic, které dostaly dávky chi220 10, 40, nebo 100 mg/kg, ale tyto parametry se nemonitorovaly u opic, které dostaly dávky 0,1 nebo 1,0 mg/kg, protože ve vyšších dávkách nebyla zjištěna žádná pozorování se vztahem k léčivu. Kromě toho se měřily hladiny IgM, IgG a IgA a chi220 v séru. Pro hodnocení účinnosti se zjišťovala tvorba specifických IgM a IgG protilátek proti SRBC a OVA imunogenům ve vhodných vzorcích séra získaných těsně před aplikací imunogenu a po týdnech poté. Tvorba specifických IgM a IgG protilátek proti testované látce u opic, kterým byla aplikována chi220, se měřila před podáním testované látky v 1. dni a po týdnech poté. Při porovnávání protílátkové odpovědi skupinami se použily geometrické průměry titrovaných hodnot. Kromě toho se měřily celková hemolytická aktivita komplementu (CH₅₀) a hodnoty C4d fragmentu a hodnoty TNF-α a IL-6 se určovaly u opic, které dostaly dávky 0,1 nebo 1 mg/kg chi220 ve zvolených časech po podání chi220. Aktivace ex vivo T-buněk periferní krve se rovněž hodnotila po stimulaci konkanavalinem A u opic, které dostaly dávky 0,1 nebo 1 mg/kg chi220 v 17. a 31. dni, aby se hodnotily účinky chi220 na odpověď T-buněk na mitogen. Konečně byly všechny opice pozorovány z hlediska klinických známek toxicity, tělesná hmotnost se zaznamenávala týdně a spotřeba potravy denně.

Opice se imunizovaly SRBC před podáním nosiče nebo chi220 v dávce 10, 40 nebo 100 mg/kg (obrázek 6a) nebo chi220 v dávce 0,1 nebo 1 mg/kg (obrázek 6b) v 1. dni.. Vzorky séra se analyzovaly na IgM protilátky proti SRBC pomocí ELISA. Data jsou vyjádřena jako geometrický průměr • · · ·

konečného titru (end-point titer - EPT) anti-SRBC protilátky pro každou skupinu (n=2 [100 mg/kg po 15 dnech] nebo 4), kde EPT je ekvivalentní reciproční hodnotě nejvyššího zředění séra s absorbanci větší než dvojnásobek průměru pozadí destičky.

2. Výsledky

a. Protilátková odpověď proti SRBC

Při podání opicím v dávkách 10, 40 nebo 100 mg/kg byla chi220 účinná k významnému snížení primární protilátkové odpovědi proti SRBCs. Ve dni s nejvyšší hladinou primární protilátkové IgM odpovědi proti SRBC (8. den), průměrná primární protilátková IgM odpověď proti SRBC se snížila přibližně o 92 až 94 % u opic, léčených chi220 v dávkách 10, 40 nebo 100 mg/kg ve srovnání s kontrolou (obrázek 6a). Průměrná protilátková IgM odpověď proti SRBC ve skupině se nestala pozitivní v průběhu 85. dne při dávkách 10, 40 nebo 100 mg/kg. Ve dni s nejvyšší hladinou primární protilátkové IgG odpovědi proti SRBC (15. den), průměrná primární protilátková IgG odpověď proti SRBC se snížila o 98 až 99 a 85 % u opic, léčených chi220 v dávkách 10, 40 nebo 100 mg/kg v tomto pořadí ve srovnání s kontrolou (obrázek 7a). Vyšší celkové titry protilátky proti SRBC před podáním dávky mohly způsobit zjevnou absenci závislosti imunosuprese na dávce. Celkově, u opic léčených chi220 v dávce 10 nebo 100 mg/kg se nezvyšovala primární protilátková IgG odpověď proti SRBC až do 85. dne. Nicméně dvě opice léčené chi220 v dávce 40 mg/kg měly opožděnou primární protilátkovou IgG odpověď proti SRBC (srovnatelnou s velikostí kontrolní odpovědi), která se stala pozitivní k 31. dni a měla vrchol v 51. dni.

149. den, poté, co hladiny chi220 poklesly pod údajně imunosupresivní hodnoty (přibližně 10 μg/ml) a hladiny B-buněk v periferní krvi se ve všech skupinách vrátily na původní úroveň, se opice podruhé imunizovaly SRBCs. Jak se • · · . · <

Ml - ·31·.

předpokládalo, u kontrolních opic se zvýšila silná sekundární protilátkové IgG odpověď proti SRBCs.

Opice léčené chi220 v dávce 10 mg/kg vykazovaly primární IgM a IgG protilátkové odpovědi na SRBCs všeobecně srovnatelné s primární odpovědí u kontrolních opic. Protilátkové odpověď na SRBCs byla nicméně stále částečně snížena při dávce 40 mg/kg a významně snížena při dávce 100 mg/kg. Ačkoli se u dvou opic léčených chi220 v dávce 40 mg/kg, které předtím vykázaly slabé primární protilátkové odpovědi na SRBC, vytvořily titry IgM a IgG protilátek proti SRBC charakteristické pro sekundární protilátkovou odpověď, protilátkové odpovědi proti SRBC u ostatních dvou opic této skupiny a u zbylých opic léčených chi220 v dávce 100 mg/kg byly stále sníženy přibližně o 90 % ve srovnání s průměrem primární protilátkové odpovědi proti SRBC u kontrolních opic.

Suboptimální imunosuprese protilátkové odpovědi na SRBC byla pozorována po podání 0,1 nebo 1,0 mg/kg chi220 (obrázky 6b a 7b). Zatímco všechny opice léčené chi220 vykázaly pozitivní IgM protilátkovou odpověď a SRBC antigen, celkový průměrný vrchol IgM protilátkové odpovědi proti SRBC se snížil přibližně o 56 % u opic léčených chi220 v dávce 1 mg/kg ve srovnání s průměrným vrcholem kontrolní odpovědi. U opic léčených chi220 v dávce 0,1 mg/kg nebylo pozorováno žádné snížení protilátkové odpovědi na SRBC. Průměrná IgM protilátkové odpověď na SRBC dosáhla vrcholu 15. den u kontrolních opic a 8. den u opic, které dostaly 0,1 a 1,0 mg/kg chi220. Celkově se průměrný vrchol IgG protilátkové odpovědi proti SRBC snížil přibližně o 56 % a 42 % u opic léčených chi220 v dávce 0,1 a 1,0 mg/kg v daném pořadí. Průměrná IgG protilátkové odpověď na SRBC dosáhla vrcholu 15. den u kontrolních opic a u opic, léčených 1 mg/kg chi220 a 8. den u opic, které dostaly 0,1 mg/kg chi220.

b. Protilátkové odpověď proti OVA • · · ·

- ·3δ···

Opicím se 1. den podala intravenózní dávka 10, 40 nebo 100 mg/kg chi220. Navíc se všechny opice imunizovaly OVA 28., 1. a 149. den. Vzorky séra se analyzovaly na IgM (obrázek 8a) nebo IgG (obrázek 8b) protilátky proti OVA. Údaje jsou vyjádřeny jako geometrický průměr konečných titrů (EPT) protilátek proti OVA pro každou skupinu (n=2 [100 mg/kg po 15 dnech] nebo 4), kde EPT jsou ekvivalentní reciproční hodnotě nejvyššího zředění séra s absorbancí větší než dvojnásobek průměru pozadí destičky.

Tvorba specifických IgM a IgG protilátek proti OVA se monitorovala týdně během studie u opic, které dostaly chi220 v dávkách 10, 40 nebo 100 mg/kg. Primární a sekundární protilátkové odpovědi proti OVA byly velmi proměnlivé a u všech opic všeobecně slabé, (obrázek 8). Opice, kterým se podala chi220 1. den, měly větší titry protilátky proti OVA než opice v kontrolní skupině.

149. den dostaly opice terciární imunizaci OVA.

Všechny opice vykázaly pozitivní IgG protilátkové odpovědi na OVA během 7 dnů po imunizaci. Kontrolní opice a opice léčené chi220 v dávce 10 mg/kg měly titry protilátek charakteristické pro terciární protilátkovou odpověď, zatímco opice léčené chi220 v dávce 40 nebo 100 mg/kg měly titry protilátek více charakteristické pro sekundární protilátkovou odpověď.

c. Protilátková odpověď proti KLH

Opicím se 1. den podala intravenózní dávka 10, 40 nebo 100 mg/kg chi220. Navíc se všechny opice imunizovaly KLH 149. den. Vzorky séra se analyzovaly na IgM (obrázek 9a) nebo IgG (obrázek 9b) protilátky proti KLH. údaje jsou vyjádřeny jako geometrický průměr konečných titrů (EPT) protilátek proti KLH pro každou skupinu (n=2 [100 mg/kg po 15 dnech] nebo 4), kde EPT jsou ekvivalentní reciproční hodnotě nejvyššího zředění séra s absorbancí větší než dvojnásobek průměru pozadí destičky.

' Ví

- ·3·3<

Ve 149. dnu, poté co hladiny chi220 v séru poklesly pod domněle imunosupresivní hladiny (přibližně 10 μ9/ιιι1) a hodnoty periferních B-buněk se navrátily na hladiny před podáním dávky ve všech skupinách, se opice imunizovaly KLH (10 mg/zvíře intramuskulárně). Všechny opice vykázaly pozitivní IgM a IgG protilátkové odpovědi na KLH, což ukazuje, že schopnost imunní odpovědi na nový antigen poté nebyla oslabena.

d. Sérové hladiny testovací látky a protilátkové odpovědi proti testovací látce

Vzorky séra se zkoušely po podání chi220, aby se určily hladiny cirkulující testovací látky a hodnotila tvorba protilátky proti ní. Maximální koncentrace chi220 v séru (C_max) se objevila tři minuty po podání dávky 10 nebo 40 mg/kg a šest hodin po podání dávky 100 mg/kg. Hodnoty ^cmax ^chi²²⁰ byly 329, 2429 a 2343 μg/ml u opic léčených dávkami 10, 40 nebo 100 mg/kg. Významná variabilita se nicméně objevila u jednotlivých opic ve skupinách léčených dávkami 40 a 100 mg/kg. Průměrný poločas chi220 v séru byl odhadnut přibližně na 114, 173 a 315 hodin u opic léčených dávkami 10, 40 nebo 100 mg/kg.

Průměrné hodnoty C_max tři minuty po podání chi220 byly 1,77 a 33 μg/ml pro dávky 0,1 a 1 mg/kg v tomto pořadí. Nebyly pozorovány žádné rozdíly sérových hladin chi220 v závislosti na pohlaví při žádné dávce. Průměrné hodnoty ^AUCinf ¹⁵>^{5 a 847} ug.h/ml pro dávky 0,1 a 1 mg/kg v tomto pořadí. Shrnuto, výsledky studií ukazují, že poločas chi220 se prodlužuje se zvyšující se dávkou. Navíc se zdá, že chi220 roste nerovnoměrně s rostoucí dávkou.

Ačkoli IgM odpověď na testovací látku u opic, kterým se podala dávka 10, 40 nebo 100 mg/kg chi220, byla minimální nebo chyběla vůbec, byla pozorována významná IgG odpověď na testovací látku u opic, kterým se podala dávka 10 mg/kg chi220. Průměrná IgG odpověď na testovací látku u opic, « w 9 99 9 *- 54..999 9 99 • 9 9 » · 9 9

9 9 kterým se podala dávka 10 mg/kg chi220, byla pozitivní 29. den, přibližně 1 týden poté, co průměrná koncentrace chi220 v séru poklesla pod hodnotu 10 μg/ml a dosáhla vrcholu ve

36. a 43. dnu při titru o geometrickém průměru 12,627.

Výskyt IgG protilátek proti testovací látce u opic, kterým se podala dávka 10 mg/kg chi220 se rovněž shodoval s prvním detekovatelným nárůstem počtu B-buněk následujícím po depleci. Až do posledního dne měření (149. dne) opice, kterým se podala dávka 40 nebo 100 mg/kg chi220, stále nevykázaly pozitvní protilátkovou odpověď proti chi220, ačkoli průměrné sérové hladiny chi220 byly nižší než 10 μg/ml do 57. dne (u skupiny, která dostala 40 mg/kg) nebo do 92. dne (u skupiny, která dostala 100 mg/kg).

Chi220 byla imunogenní při podání v dávce 0,1 nebo 1 mg/kg. Tři ze čtyř opic, kterým se podala dávka 0,1 nebo 1 mg/kg chi220, měly do 15. dne studie slabě pozitivní IgM protilátkovou odpověď proti testovací látce. Tři ze čtyř opic, kterým se podala dávka 1 mg/kg chi220, měly do 22. dne studie významnou IgG protilátkovou odpověď proti testovací látce, která dosáhla vrcholu při titru o výsledném geometrickém průměru 16,618. Celkově vzato, geometrický průměr IgG protilátkové odpovědi na testovací látku nebyl pozitivní u opic, kterým se podala dávka 0,1 mg/kg chi220 a pouze jedna opice které se podala dávka 0,1 mg/kg chi220, měla slabě pozitivní IgG protilátkovou odpověď na testovací látku, která dosáhla vrcholu 22. den při konečném titru 2430. Shrnuto, tyto údaje naznačují, že chi220 je schopna imunosuprese protilátkové odpovědi proti ní při hladinách v séru větších než přibližně 10 μg/ml.

Příklad 4

Příprava humanizovaných protilátek F4 a L3.17 proti CD40

Pro humanizaci monoklonálních protilátek se použila řada způsobů známých v oboru. Přístupy založené na struktuře

• · * · ·· ř se ukázaly jako užitečné, ale komplexnost, která vychází z vysokého počtu rámcových zbytků potenciálně se účastnících vazebné aktivity snižuje míru úspěšnosti. Spíše než předvídání optimálního rámce založeného na modelování umožňuje identifikaci aktivních konformací rámce založené na skreeningu početných kombinací přístup knihovny protilátek, který je popsán níže. Přístupy mutagenetické spojené do způsobů výběru umožňují analýzu mnoha variant a mimiky v procesu maturace in vivo (shrnutých v Marks J. D. a kol., J. Biol. Chem. 267, 16007 - 16010 (1992). Mutageneze založená na kodonu umožňuje vytvoření knihoven které charakterizují příspěvěk specifických zbytků a takto je účinnější než přístupy náhodné mutageneze. Například vysokokontrolovaná PCR nemůže být použita k syntéze knihoven kombinatorních rámců, popsané níže. Kromě toho náhodná mutageneze vytváří větší a rozmanitější knihovny a naneštěstí většina mutací nezvyšuje vazebnou aktivitu monoklonální protilátky. V důsledku toho musí projít screeningem větší počet klonů, aby se identifikovaly aktivní varianty.

Strategie nazvaná řízený výběr se použila k izolaci lidské monoklonální protilátky z fágové knihovny v procesu, sestávajícím ze dvou kroků, který používá hlodavci monoklonální protilátku jako templát (Jespers L. S. a kol., Bio/Technology 12, 899 - 903 (1994). Nedávno byla popsána variace řízeného výběru používající technologie využívající fágových knihoven, ve které se použil chimerní Fd fragment k výběru L řetězce z knihovny obsahující lidské L řetězce s naštěpovaným myším CDR3 (Rader C. a kol., Proč Nati. Acad. Sci. USA 95, 8910 - 8915 (1998). Následně se použil nejaktivnější L řetězec k výběru H řetězce z knihovny lidských H řetězců obsahující myší HCDR3. Monoklonální protilátky izolované těmito přístupy jsou výhradně lidské (Jespers, viz výše) nebo většinou lidské (Rader, viz výše), ale značná rozmanitost protilátek, která vzniká v každém kroku procesu, způsobuje nutnost použití způsobů zvyšujících * · ·_ : ; Y • · 9 · · ® • · Φ · · · · · ···· «·· ·· Φ Φ· ··· afinitu.

Využily se následují materiály a postupy k přípravě humanizovaných protilátek poskytnutého vynálezu F4 a L3.17 proti CD40:

1. Příprava chimerní protilátky proti CD40

Připravily se a purifikovaly překrývající oligonukleotidy kódující VH a VL (69 - 75 baží na délku) na základě sekvence myší monoklonálni protilátky 2.220 proti CD40. Proměnné H a L domény se syntetizovaly odděleně kombinováním 25 pmol každého z překrývajících se oligonukleotidů s Pfu DNA polymerázou (Stratagene) v 50 μΐ PCR reakci skládající se z 5 cyklů: denaturace při teplotě 94°C po dobu 20 sekund, chlazení při teplotě 50°C po dobu 30 sekund, dosažení teploty 72°C během 1 minuty a udržování při teplotě 72°C po dobu 30 sekund. Následně se chladící teplota zvýšila na 55 °C v 25 cyklech. Reversní primer a biotinem značený forward primer se použily , aby se dále amplifikoval 1 μΐ fuzního produktu v 100 μΐ PCR reakci za použití stejného postupu. Produkty se čistily elektroforézou na agarozovém gelu, podrobily se elektroeluci a fosforylaci pomocí T4 polynukleotidové kinázy (Boehringer Mannheim) a poté se inkubovaly s streptavidinovými magnetickými kuličkami (Boehringer Mannheim) v 5 mM Tris-Cl o pH 7,5,

0,5 mM EDTA, 1 M NaCl a 0,05% Tweenem 20 při teplotě 25°C po dobu 15 minut. Kuličky se promyly a minusová vlákna DNA neznačená biotinem se vymyla inkubací s 0,15 M NaOH při teplotě 25°C po dobu 10 minut. Chimerní anti-CD40 FAB se syntetizovala v modifikovaném M13IX104 vektoru (Kristensson

K. a kol., Vaccines 95, 39 - 43 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (1995), pojmenovaném M13IX104CS, cestou hybridizační mutageneze (Rosok M. J. a kol., J. Biol. Chem. 271, 22611 - 22618 (1996); Kunkel T. A., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 488 - 492 (1985) za použití VH a VL oligonukleotidů ve trojnásobném molárním nadbytku uridinylátovaných vektorových templátů. Vektor M13IX104 se modifikoval výměnou cysteinových zbytků na konci • · 4 ·

4444

37.kappa a τΐ stálých oblastí za serin. Reakce byla elektroporována do DH10B buněk a titrována na buňkách of XL-1 Blue.

2. Příprava kombinatorního rámce a knihoven rámec/CDR3

Knihovna kombinatorních rámců (Hu I) se syntetizovala stejným způsobem, použitým k přípravě chimerní anti-CD40 s modifikacemi. Syntetizovaly se překrývající se oligonukleotidy kódující rámcové oblasti H a L proměnných domén lidského templátu a myších anti-CD40 CDRs jak je definoval Kabat a kol. (Kabat E.A. a kol., Sequences of proteins of immunological interst 5.vydání, (1991). Washington DC: United States department of Health and Human Services; Kabat E.A. a kol., J. Biol. Chem. 252, 6609

- 6616 (1977). Připravily se degenerované oligonukleotidy kódující jak myší tak lidské aminokyseliny na sedmi VH a jedné VK rámcové pozici (obrázek 15, zbytky označeny hvězdičkou).

Knihovny rámec/HCDR3 (Hu II) a rámec/HCDR3/LCDR3 (Hu III) se syntetizovaly stejným způsobem jako knihovna kombinatorních rámců s modifikacemi. Zbytky CDR vybrané pro mutagenezi byly: Ser⁹⁵-Tyr¹⁰² v HCDR3 a Gln⁸⁹-Thr⁹⁷ v LCDR3 (obrázek 15, podtrženo). Oligonukleotidy kódující HCDR3 a LCDR3 se označily pro přeměnu jednoduchého CDR zbytku a syntetizovaly se zavedením NN(G/T) v každé pozici, jak je v oboru popsáno (Glaser S. M. a kol., J. Immunol. 149, 3903

- 3913 (1992). Překrývající se oligonukleotidy kódující myší CDRs z knihovny rámců a ty, které nejsou z knihovny rámců se zkombinovaly s 25 pmol oligonukleotidů kódujících mutované HCDR3 nebo s 25 pmol každého z oligonukleotidů kódujících mutované HCDR3 a LCDR3.

3. Screening fágových expresních knihoven

Hu II a Hu III se nejprve vyhledaly modifikovaným ·· · · • · • · · • « 9 99 9 · 9

- .38·% • ·

plakovým přístupem známým v oboru, pojmenovaným capture lift (Watkins J. D. a kol., Anal. Biochem. 256, 169 - 177 (1998). Ve stručnosti, nitrocelulózové filtry (82-mm) se potáhly kozí protilidskou kappa, obsadily 1% BSA a nasadily na agarovou destičku obsahující fágy infikované bakteriální buňky. V zahajovacím screeningu se fágy vysazovaly při hustotě 10^ fágů na lOOmm destičku. Po zachycení fágy expresovaných anti-CD40 variant FAB se filtry inkubovaly po dobu 3 hodin při teplotě 25 °C s 5 ng/ml anti-CD40-Ig v PBS obsahujícím 1 % BSA. Filtry se promyly čtyřikrát PBS, obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a inkubovaly se kozím protimyším IgG₂]₃-alkalickým fosfatázovým konjugátem (Southern Biotechnology) zředěným 3000-krát v PBS obsahujícím 1 % BSA po dobu 1 hodiny při teplotě 25 °C. Filtry se čtyřikrát promyly PBS obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a vyvolaly postupem popsaným Watkinsem (1998), viz výše. K izolaci individuálních klonů, se pozitivní plaky ze zahajovacího screeningu vybraly a vysadily s nižší hustotou (10³ fágů na lOOmm destičku) a vyhledávaly se stejným způsobem.

Hu I kombinatorní knihovna se nejprve prozkoumávala metodou ELISA, která umožňuje rychlé zhodnocení relativních afinit variant (Watkins J. D. a kol., Anal Biochem. 253,

- 45 (1997). Kromě toho se ELISA použila k charakterizaci klonů, identifikovaných screeningem metodou capture lift. Ve stručnosti, mikrotitrační destičky se potáhly 5 μg/ml kozí protilidské kappa (Southern Biotechnology) a blokovaly 3%

BSA v PBS. Dále se 50 μΐ FAB ze supernatantu kultury Escherichia coli nebo z buněčného lyzátu inkubovala na destičce po dobu 1 hodiny při teplotě 25 °C, destička se promyla třikrát PBS obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a 0,1 μg/ml CD40-Ig v PBS obsahujícím 1 % BSA po dobu 2 hodin při teplotě 25 °C. Destička se promyla třikrát PBS, obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a přidal se kozí protimyší IgG₂]₃-alkalický fosfatázový konjugát zředěný 3000-krát v PBS obsahujícím 1 % BSA po dobu 1 hodiny při teplotě 25 °C. Destička se třikrát promyla PBS obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a vyvolala ·· ···· ·· ···· ·· · • « * ·· · ·«··

- 3*9··*. < : ; ·* · í i i • ···· · · · ·«·· ··· ·· · ·« ··· postupem popsaným Watkinsem (1997), viz výše.

4. Sekvenování DNA

Jednoduchá šroubovice DNA se izolovala a geny proměnných oblastí H a L řetězců humanizovaných protilátek poskytnutého vynálezu se sekvenovaly metodou fluorescenční dideoxynukleotidové terminace (Perkin - Elmer, Foster City, CA) .

Sekvence nukleových kyselin (SEQ ID NO:7)

a aminokyselin (SEQ

ID NO:8)

proměnného

lehkého

řetězce

humanizované protilátky

F4 je následující:

GAA

ATT

GTG

TTG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

42

E

I

V

L

T

Q

S

P

A

T

L

S

L

s

14

CCA

GGG

GAA

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGT

CAG

AGT

84

P

G

E

R

A

T

L

S

C

R

A

S

Q

S

28

ATT

AGC

GAT

TAC

TTA

CAT

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

GGC

CAG

126

I

S

D

Y

L

H

W

Y

Q

Q

K

P

G

Q

42

GCT

CCC

AGG

CTC

CTC

ATC

TAT

TAC

GCA

TCC

CAC

TCC

ATC

TCT

168

A

P

R

L

L

I

Y

Y

A·

S

H

s

I

S

56

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

210

G

I

P

A

R

F

S

G

S

G

S

G

T

D

70

TTC

ACT

CTC

ACC

ATC

AGC

AGC

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

GCA

252

F

T

L

T

I

S

S

L

E

P

E

D

F

A

84

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAT

GGC

CAC

TCT

TTT

CCT

TGG

ACC

TTC

294

V

Y

Y

C

Q

H

G

H

S

F

P

W

T

F

98

GGA

GGG

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATT

AAA

321

G

G

G

T

K

V

E

I

K

107

Sekvence nukleových kyselin (SEQ ID NO:9) a aminokyselin (SEQ ID NO:10) proměnného těžkého řetězce humanizovaných protilátek F4 a 13.17 je následující:

CAG

GTG

CAG

CTG

GTG

CAA

TCT

GGG

TCT

GAG

TTG

AAG

AAG

CCT

42

Q

V

Q

L

V

Q

S

G

S

E

L

K

K

P

14

GGG

GCC

TCA

GTG

AAG

GTT

TCC

TGC

AAG

GCT

TCT

GGA

TAC

GCC

84

G

A

S

V

K

V

S

C

K

A

s .

G

Y

A

28

0 0 0 0 0

0

TTC

ACT

ACC

ACT

GGC

ATG

CAG

TGG

GTG

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

126

F

T

T

T

G

M

Q

W

V

R

Q

A

P

G

42

CAA

GGG

CTT

GAG

TGG

ATG

GGA

TGG

ATC

AAC

ACC

CAC

AGC

GGG

168

Q

G

L

E

W

M

G

W

I

N

T

H

S

G

56

GTC

CCA

AAG

TAT

GTC

GAG

GAC

TTC

AAA

GGA

GGG

TTT

GTC

TTC

210

V

P

K

Y

V

E

D

F

K

G

R

F

V

F

70

TCC

TTG

GAC

ACC

TCT

GTC

AGC

ACG

GCA

TAT

CTG

CAG

ATC

AGC

252

S

L

D

T

S

V

S

T

A

Y

L

Q

I

S

84

AGC

CTA

AAG

GCT

GAG

GAC

ACT

GCC

GTG

TAT

TAC

TGT

GCG

AGA

2 94

S

L

K

Ά

E

D

T

A

V '

Y

Y

C

A

R

98

TCT

GGC

AAT

GGG

AAC

TAT

GAC

CTG

GCA

TAC

TTT

AAG

TAT

TGG

336

S

G

N

G

N

Y

D

L

A

Y

F

K

Y

W

112

GGC

CAG

GGA

ACC

CTG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

366

G

Q

G

T

L

V

T

V

S

S

122

Sekvence nukleových kyselin (SEQ ID NO:11) a aminokyselin (SEQ ID NO:12) proměnného lehkého řetězce

humanizované protilátky L3.17 je následující:

GAA ATT

GTG

TTG

ACA

CAG

TCT

CCA

GCC

ACC

CTG

TCT

TTG

TCT

42

E

I

V

L

T

Q

S

P

A

T

L

S

L

s

14

CCA GGG i

GAA .

AGA

GCC

ACC

CTC

TCC

TGC

AGG

GCC

AGT

CAG

AGT

84

P

G

E

R

A

T

L

S

C

R

A

S

Q

s

28

ATT

AGC

GAT

TAC

TTA

CAT

TGG

TAC

CAA

CAG

AAA

CCT

GGC

CAG

126

I

S

D

Y

L

H

W

Y

Q

Q

K

P

G

Q

42

GCT

CCC

AGG

CTC

CTC

ATC

TAT

TAC

GCA

TCC

CAC

TCC

ATC

TCT

168

A

P

R

L

L

I

Y

Y

A

S

H

S

I

s

56

GGC

ATC

CCA

GCC

AGG

TTC

AGT

GGC

AGT

GGG

TCT

GGG

ACA

GAC

210

G

I

P

A

R

F

S

G

S

G

S

G

T

D

70

TTC

ACT

CTC

ACC

ACT

AGC

AGC

CTA

GAG

CCT

GAA

GAT

TTT

GCA

252

F

T

L

T

I

S

S

L

E

P

E

D

F

A

84

GTT

TAT

TAC

TGT

CAG

CAT

GGC

CAC

. TCT

TAT

CCT

TGG

ACC

TTC

294

V

Y

Y

C

Q

H

G

H

S

Y

P

W

T

F

98

GGA

GGG

GGG

ACC

AAG

GTG

GAA

ATT

AAA

321

G

G

G

T

K

V

E

I

K

107

5.

Exprese a čištění FAB

Některé FAB se klonovaly do vektoru exprese pod kontrolou arabinosou-regulovaného BAD promotoru. Kromě toho se smyčka šesti histidinů fúzovala ke karboxylovému konci H řetězce, aby se umožnilo čištění nikl-chelátujícími pryskyřicemi. Čištěná FAB se kvantifikovala, jak je popsáno Watkinsem (1997), viz výše.

6. Charakterizačni zkoušky

Mikrotitrační destičky Immulon II se potáhly 0,1 μg/ml CD40-Ig v PBS obsahujícím 1 % BSA po dobu 16 hodin při teplotě 4 °C a blokovaly se 3% BSA v PBS. Destičky se promyly třikrát PBS, obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a FAB uvolněná z periplasmatického prostoru se zředila sériově trojnásobně v PBS, obsahujícím 1 % BSA a inkubovala s destičkou po dobu 2 hodin při teplotě 25 °c. Potom se destička promyla čtyřikrát PBS, obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a navázání protilátky se detekovalo inkubací s kozím protimyším IgG₂fo-alkalickým fosfatázovým konjugátem zředěným 2000-krát v PBS obsahujícím 1 % BSA po dobu 1 hodiny při teplotě 25 °C. Destička se čtyřikrát promyla PBS obsahujícím 0,1 % Tweenu 20 a vyvolala kolorimetricky (Watkins (1997), viz výše).

Pro testování variant na inhibici navázání ligandu se mikrotitrační destičky Immulon II potáhly 2 μg/ml protimyší CD8 k zachycení proteinu fuze sgp39, který expresuje CD8 doménu. Destičky se propláchly jednou PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20 a blokovaly 3 % BSA v PBS. Destička se jednou promyla PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20 a inkubovala mediem buněčné kultury obsahujícím nasycené hladiny sgp39 po dobu 2 hodin při teplotě 25 °C. Nenavázaný sgp39 se odsál a destička se dvakrát promyla PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu

20. Potom se přidalo 25 μΐ čištěné varianty FAB zředěné seiově 3-krát v PBS a potom 25 μΐ roztoku 4 μg/ml

4« 4«·· · · ··*· ··

···· · · ·

4·· ··· ·· * ·4 ···

CD40-lidský Ig v PBS. Destičky se inkubovaly po dobu 2 hodin při teplotě 25 °C a potom třikrát promyly PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20. Navázaný CD40-Ig se detekoval po 1-hodinové inkubaci při 25 °C s kozím F(ab')₂ protilidským IgG FcT-specifickým křenovým peroxidázovým konjugátem (Jackson) zředěným 10000-krát v PBS. Destička se čtyřikrát promyla PBS obsahujícím 0,05 % Tweenu 20 a vazba se kvantifikovala kolorimetricky inkubací s roztokem 1 mg/ml orto-fenylendiamindihydrochloridu a 0,003% peroxidem vodíku v 50 mM kyseliny citrónové, 100 mM hydrogenfosforečnanu sodného o pH 5. Reakce se ukončila přidáním kyseliny sírové do konečné koncentrace 0,36 M a určila se absorbance při 490 nm.

7. Analýza BIAcore

Konstanty kinetiky interakce mezi CD40 a anti-CD40 variantami se určily pomocí resonance plasmonového povrchu (BIAcore). Fuzní protein CD40-Ig se imobilizoval na hydrochlorid (l-ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]-karbodiimidu a N-hydroxysukcinimidem aktivovaný snímací čip CM5 injikováním 8 μΐ roztoku 10 ^g/ml CD40-Ig v 10 mM octanu sodného, pH 4. Cd40-Ig se imobilizoval při nízké denzitě (přibližně 150 RU), aby se zabránilo znovunavázání FAB během disociační fáze. Aby se získaly asociační konstanty (k_Qn), určil se vazebný poměr při šesti různých koncentracích FAB v rozmezí 25 až 600 nM v PBS při průtokové rychlosti 20 μΐ/min. Disociační konstanty (k_off) se určily jako průměr šesti měření získaných analýzou disociační fáze. Sensogramy se analyzovaly pomocí 3.0 programu BIA hodnocení. K_d se počítala z K^ = k_Qff/k_on. Zbytková FAB se odstranila po každém měření prolongovanou disociací.

Výsledky analýzy kinetiky humanizovaných protilátek F4 a L3.17 porovnané s chimerní FAB ukazuje tabulka 1:

• 9 9999 99 9999 99 ^ř 4a.T : : .· : í ·

Tabulka 1:

1 ID klon| I	kon	n Γ 1 Koff 1 J_L	Kd	1 1 L	Poznámka
Γ Chimerní| FAB | 1 I	8,43*105	1 1 1 1 I	2,65*10“3| 1 1 I	3,14	nM	τ 1 1 I	Připravena štěpením chimérního 2.220 IgG papainem
1 F4 | 1	2,00*106	1 1 I	1 4,77*104| I	0,24	nM	1 1 1	Human i z ováná
Γ |L3.17 | 1_L	3,17*106	1 1 l	1 3,28*10-4| 1	0,10	nM	1 1 L	Humanizovaná _

8. Výsledky humanizace

Jak je uvedeno výše, rámcové sekvence proměnné oblasti myší monoklonální protilátky anti-CD40 se použily k identifikaci nejvíce homologních lidských zárodečných sekvencí. Zbytky rámce H řetězce byly ze 74 % identické lidským zárodečným sekvencím VH7 (7 - 4,1) a JH4, zatímco L řetězec byl ze 75 % identický příslušným lidským zárodečným sekvencím VKIII (L6) a JK4. Řazení proměnných sekvencí H a L řetězců ukazuje obrázek 15. Zbytky CDR, jak je definoval Kabat a kol. (Kabat E.A. a kol., Sequences of proteins of immunological interst, 5.vydání, 1991.

Washington DC: United States department of Health and Human Services; Kabat E.A. a kol., J. Biol. Chem., 252, 6609

- 6616, 1977) jsou podtrženy a byly vyloučeny z analýzy homologie. Zbytky rámců, kde byly odlišnosti mezi myšími monoklonálními protilátkami a lidskými templáty, se hodnotily jednotlivě.

Na základě strukturní a sekvenční analýzy lze říci, že protilátkové CDRs s výjimkou HCDR3 vykazují omezený počet hlavních konformací řetězce, pojmenovaných kanonické struktury (Chothia C. a kol., J. Mol. Biol. 196, 901

- 917 (1987); Chothia C. a kol., Nátuře 342, 877 - 883

4 0 ·

»»·<

•0 0400 ‘ 44..0 0 0 0 0 04000® 4® ® ® 0® 0 (1989). Navíc se identifikovaly určité zbytky rozhodující pro určení konformace hlavního řetězce loopů CDR (Chothia (1987), viz výše, Chothia (1989), viz výše). Kanonické rámcové zbytky myší anti-CD40 se proto identifikovaly a zjistilo se, že aminokyseliny ve všech rozhodujících kanonických pozicích v rámci rámců H a L řetězců lidských templátů jsou identické s příslušnými myšími zbytky.

Myší povrchové aminokyseliny, které se normálně nenacházejí v lidských protilátkách, pravděpodobně přispívají k imunogenicitě humanizované monoklonální protilátky (Padlan E. A., Mol. Immunol. 28, 489 - 498 (1991). Proto se analyzovaly zbytky rámců, v nichž jsou odlišnosti mezi myší anti-CD40 a lidskými templáty a na základě expozice rozpouštědla se predikovalo, zda jsou skryty nebo lokalizovány na povrchu (Padlan (1991), viz výše). U reziduí rámců vystavených rozpouštědlu distálních na CDRs se nepředpokládalo, že by významně přispívaly k vazbě antigenu a proto s výjimkou dvou zbytků H řetězců se všechny změnily na příslušnou lidskou aminokyselinu, aby se snížila potenciální imunogenicita. Bylo predikováno, že zbytky 28 a 46 H řetězce byly vystaveny rozpouštědlu.

Nicméně H28 je umístěn uvnitř oblasti HCDR1, jak ji definoval Chothia a kol., viz výše a potenciálně interaguje s antigenem. Navíc lysin v H46 v myší monoklonální protilátce je něco neobvyklého a významně se liší od kyseliny glutamové lidského templátů. Proto se myší a lidské zbytky na H28 a H46 expresovaly v kombinatorické knihovně (obrázek 15, hvězdičky).

Zbývající odlišné zbytky rámců, u všech z nich bylo predikováno, že jsou většinou skryty uvnitř protilátky, se hodnotily z hlediska:

(1) blízkosti k CDRs; (2) způsobilosti kontaktovat doménu na opačném vlákně VK - VH interface; (3) příbuznosti odlišných aminokyselin; (4) předpokládaného významu v modulaci aktivity CDR, jak ho definoval Studnička (Studnička G. M.

a kol., Protein Eng. 7_, ⁸⁰⁵ “ 814 (1994). Většina rozdílů

4 » 4 —· * *

4*5· “

4 ve skrytých zbytcích rámce L řetězce se týkala aminokyselin v pozicích, které se nepovažují za pravděpodobně přímo zapojené do konformace CDR. Nicméně L49 je umístěna do sousedství s LCDR2, potenciálně kontaktuje VH doménu, není ve vztahu k lidskému zbytku a může být zahrnuta do určení konformace LCDR2. Z těchto důvodů byly jak myší tak lidské aminokyseliny v L49 expresovány v kombinatorické knihovně rámců (obrázek 15, hvězdičky).

Analýza sekvence myšího H řetězce a lidského templátu byla komplexnější. Zbytek H9 je prolin v myší monoklonální protilátce, zatímco lidský templát obsahuje nesouvisející serinový zbytek. Pozice H9 může rovněž hrát roli při modulaci konformace CDR a proto byla zvolena jako místo kombinatorní knihovny (obrázek 15, hvězdičky). Zbývající skryté zbytky rámce, které se lišily mezi myší anti-CD40 a templátem H řetězce byly v rámcových pozicích 38, 39, 48 a 91. Myší monoklonální protilátka proti CD40 obsahovala glutamin a kyselinu glutamovou v pozicích H38 a H39 v tomto pořadí, zatímco lidský templát obsahoval arginin a glutamin. Zbytek H38 je v blízkosti HCDR1, záměna glutamin—arginin není zpětně proveditelná a exprese glutaminu na tomto místě u myších protilátek je něco neobvyklého. Podobně, záměna glutamové kyseliny za glutamin je nekonzervativním rozdílem pro skryté aminokyseliny, H39 je potenciální VK kontaktní zbytek a kyselina glutamová je něco neobvyklého u myších monoklonálních protilátek. Zbytek H48 je ve značné blízkosti k HCDR2 a o H91 se předpokládá, že je místem velmi rizikovým (Studnička (1994), viz výše, Harris L. a kol., Prot. Sci.

4, 306 - 310 (1995), které potenciálně kontaktuje VK doménu. Jak myší tak lidské zbytky se tedy expresovaly v pozicích H38, 39, 48 a 91 (obrázek 15, hvězdičky).

Shrnuto, knihovna rámců se skládala z myších CDRs naštěpovaných do lidských templátů. Navíc jeden zbytek rámce na L řetězci a sedm zbytků rámce na H řetězci se považuje za potenciálně důležité pro udržení aktivity monoklonální protilátky. Všechna tato místa se charakterizovala syntézou • ·· · « ·

• · 4» · · « ··· ··· ·· 0 ·· kombinatorní knihovny, která expresovala všechny možné kombinace myších a lidských aminokyselin, nalezených v těchto zbytcích. Celková diversita této knihovny, nazvané HU I, byla 2⁸ nebo 256 variant (tabulka 2, níže).

Tabulka 2: Souhrn knihoven fágově expresovaných anti-CD40 protilátek

-r Knihovna | I	Pozice	1 knihovny | 1	1 Velikost* | 1	1 Screenováno+|
1 HU I | I	rámec	1 1 I	1 256 | I	2,4 X 103 |
Γ HU II | I	rámec,	1 HCDR3 | I	1 1,1 x io5 | 1	2,0 X 106 |
r HU III | 1_L	rámec,	1 HCDR3, LCDR3 | 1	1 3,1 x 107 | L	5,5 X 105 | _1

JU

Množství jedinečných klonů založené na sekvenci DNA.

Třicet dva kodóny se použily ke kódování všech 20 aminokyselin na každé pozici CDR.

⁺ Knihovna Hu I byla screenována metodou ELISA za použití protilátek expresovaných v bakteriálních kuturách v malém měřítku (Watkins (1997), viz výše). Knihovny Hu II a Hu III se nasadily na XL-1 Blue buňky na agaru při hustotě 10⁵ plaků na 10Omítl misku a screenovaly se metodou capture lift (Watkins (1998), viz výše).

Knihovna Hu I se expresovala v bakteriálních kulturách v malém měřítku (< 1 ml), stejná množství FAB uvolněné z periplasmatického prostoru se zachycovala na mikrotitrační destičce a vazebná aktivita protilátek se porovnávala přímo metodou ELISA (Watkins (1997), viz výše). Ačkoli byly identifikovány varianty, které váží cílový antigen s afinitami srovnatelnými nebo lepšími než chimerní FAB, většina screenovaných klonů z Hu I byla méně aktivní než chimerní anti-CD40 FAB. Přibližně 6 % náhodně vybraných variant Hu I vykázalo vazebné aktivity srovnatelné • · ··

47. · s chimerní FAB (data nejsou uvedena). Identifikace vícečetných variant Hu I s aktivitou srovnatelnou s chimerní CD40 je v souladu s výkladem, že nejvíce rozhodující zbytky rámců byly obsařeny v kombinatorní knihovně.

Aktivní klony se dále charakterizovaly titrací na imobilizovaný antigen, potvrzující identifikaci vícečetných variant se zvýšenou afinitou. Například klon 19C11 váže receptor pro CD40 s větší afinitou než chimerní FAB, jak ukazuje změna titračního profilu (obrázek 16, prázdná kolečka versus plná kolečka). Sekvencování DNA 34 nejaktivnějších klonů vedlo k identifikaci 24 jedinečných kombinací rámců, z nichž každá obsahuje 2 až 6 myších zbytků rámce (data nejsou uvedena).

LCDR3 a HCDR3 kontaktují antigen přímo, interagují s jinými CDRs a často významně ovlivňují afinitu a specificitu protilátek (Wilson I. A. a kol, Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 113 - 118 (1993), Padlan E. A., Mol. Immunol. 31, 169 - 217 (1994). Navíc jsou konformace LCDR3 a HCDR3 určeny částečně určitými zbytky rámců.

K identifikaci nejaktivnější protilátky se použila mutageneze založená na kodonu (Glaser S. M. a kol., J. Immunol. 149, 3903 - 3913 (1992), aby se syntetizovaly oligonukleotidy, které zavedou mutace do každé pozice v HCDR3, vždy pouze jednu, vznikající při expresi všech 20 aminokyselin v každém zbytku CDR. Žádný oligonukleotid nekódoval více než jednu změnu aminokyseliny. Zásoba oligonukleotidů kódujících knihovnu HCDR3 se smíchala s překrývajícími se oligonukleotidy, kódujícími kombinatorní rámec a jinými CDRs, aby se vytvořila knihovna rámec/HCDR3. Diverzita této knihovny, pojmenované Hu II byla 1,1 χ 10⁵ (tabulka 2, viz výše). Knihovna pro LCDR3 se syntetizovala stejným způsobem. Oligonukleotidy kódující LCDR3, HCDR3 a kombinatorní rámec se použily pro vytvoření knihovny rámec/HCDR3/LCDR3 pojmenované Hu III. Velké množství kombinací rámec/CDR3 vzniklo v knihovně s komplexitou 3, l χ 10⁷ (tabulka 2, viz výše).

:c8.Kombinováním mutací v LCDR3 a/nebo HCDR3 s knihovnou rámců vzrostla potenciální diverzita humanizovaných variant anti-CD40 z 256 na více než 10⁷. Aby se i tyto knihovny screenovaly efektivněji, použila se modifikovaná plaková zkouška, nazvaná capture lift (Watkins (1998), viz výše). Ve stručnosti, fágy infikované bakterie se nasadily na agarové destičky a následně se pokryly nitrocelulózovými filtry, které byly potaženy reagenciem specifickým na FAB. Po zachycení téměř stejných množství fágově expresované FAB se filtry zkoušely 5 ng/ml CD40-Ig fúzního proteinu. Protože filtry byly zkoušeny antigenem o koncentraci významně nižší než je K_d FAB, byly detekovatělně jen varianty se zvýšenou afinitou. Vícečetné klony vykazující vyšší afinity se identifikovaly po screeningu více než 10⁶ variant z knihovny Hu II a více než 10⁵ variant z knihovny Hu III za použití 82mm filtrů obsahujících přibližně 10⁵ variant na filtr.

Z důvodu vysoké denzity fágů na filtrech se pozitivní plaky sesbíraly a znovu nasadily při nižší denzitě a opět screenovaly. Následně se charakterizovaly metodou ELISA varianty vytvářející nej intenzivnější kolorimetrický signál ve zkoušce capture lift. Jak se očekávalo, většina klonů identifikovaných screeningem capture lift vázala CD4O lépe než chimerní FAB. Titrace variant na imobilizovaný CD40-Ig identifikovala vícečetné klony vykazující afinitu větší než chimerní a humanizované FAB (obrázek 16, porovnej prázdné čtverečky a plné trojúhelníky s kolečky).

Mutace rámec/CDR, které propůjčují zvýšenou afinitu, se identifikovaly sekvenováním DNA. Sekvence jedinečných proměnných oblastí se identifikovaly v 10/13 Hu II variantách a 3/4 Hu III variantách. Jak varianty Hu II tak Hu III obsahovaly 1 až 5 myších zbytků rámců a 0 až 2 mutace CDR3, jak níže shrnuje tabulka 3.

* ·,*. · · · · - 4&·- · ♦ · ·

Tabulka 3. Simultánní optimizace zbytků rámce a CDR identifikuje varianty s vyšší afinitou

	Knihovna	Klon	Zbytky myšího	rámce CDR mutace |
		chimerní	(43)	0 1
	Hu I	19C11	(2) H28, 48	0 1
	Hu II	CW43	(3) H9, 28,	91 HCDR3, 101A—*R |
		2B12	(5) H9, 28,	38, 46, 48 HCDR3, 101A-HK |
	HU III	2B12	(5) H9, 28,	38, 46, 48 HCDR3, 101A—*-K |
		2B8	(1) H28	HCDR3, 101A—*K |
				LCDR3, 96R—>Y |

* Počet zbytků myších rámců, které se liší od nejvíce homologních lidských zárodečných sekvencí založených na definici CDRs, podané Kabatem a kol., viz výše. Počet zbytků myších rámců lišících se od lidského templátu je označen v závorkách. Všechny rozdíly rámců mezi myší monoklonální protilátkou humanizovanými versemi jsou umístěny na H řetězci (H) v označených pozicích za použití systému číslování, použitého Kabatem a kol.

Afinity bakteriálně expresovaných chimerních FAB a zvolených variant z každé z knihoven se charakterizovaly důkladněji za použití měření povrchové plasmonové rezonance, aby se určily asociační a disociační konstanty čištěné FAB s imobilizovaným CD40-Ig. Chimerní anti-CD40 měla disociační konstantu K^ = 3,14 nM a v souladu s výsledky screeningu mnoho variant vykázalo vyšší afinity. Dva z nej lepších klonů, F4 a L3.17 měly K^ 0,24 nM a 0,10 nM (v daném pořadí) (tabulka 1). Zlepšené afinity variant anti-CD40 byly převážně výsledkem pomalejších disociačních konstant, protože asociační konstanty byly velmi podobné u všech variant (v rozmezí 0,9 až 3,2 χ 10⁶ M^-1s^_1).

Konečně se varianty, vykazující zvýšenou afinitu testovaly na jejich způsobilost blokovat vazbu ligandu gp39

• · 4 4 · ·· 4 · · 444 na receptor CD40. Všechny varianty inhibovaly vazbu rozpustného proteinu fuze CD40-Ig na imobilizovaný antigen gp39 v závislosti na dávce, která korelovala s afinitou FAB (obrázek 17). Například nejsilnějším inhibitorem vazby ligandu na protein fuze CD40-Ig byla varianta 2B8, což byla rovněž varianta s nejvyšší afinitou k CD40 (obrázek 17). Varianta 2B8 vykázala přibližně 17-krát vyšší afinitu k CD40 než chimerní FAB a inhibovala vazbu ligandu přibližně 7-krát účinněji.

Příklad 5

Systém myšího modelu

Poskytovatelé patentu rovněž vyvinuli a testovali in vivo krysí protimyší monoklonální protilátku označenou 7E1-G2b a jejího předchůdce, 7E1-G1. Příprava této protilátky se provedla, aby se prozkoumaly možnosti léčby anti-CD40 u myších modelů autoimunní, zánětlivé a posttransplantační nemoci. Primárním cílem systému myšího modelu bylo připravit protimyší modelový systém, který napodoboval kompletní silnou blokádu interakce gp39/CD40, jako má 2.220, zatímco by měl slabou kostimulační aktivitu a testovat ji in vivo na standardních modelech nemoci.

A. Izolace a charakterizace protimyších CD40 monoklonálních protilátek 7E1-G1 a 7E1-G2L·

1. Imunizace, fuze a charakterizace

Rekombinantní myší protein fuze CD40 a imunoglobulinu skládající se z extracelulární oblasti myší Cd40 fúzovaný k zavěšení, CH2 a CH3 domény myší IgG2a protilátky (mCD40-mIg) se použily pro imunizaci 8 týdnů starých samiček krys Lewis cestou inokulace do tlapky. Tři dny po poslední imunizaci se fúzovaly leukocyty z odtékajících mízních uzlin s X63-Ag8.653 buňkami myšího myelomu, aby se vytvořily heterohybridomy krysa x myš. Jamky obsahující protilátku specifickou pro přírodní myší CD40 se identifikovaly pro reaktivitu s původním mCD40-m!g imunogenem metodou ELISA

-.sr

·· a pro reaktivitu s CD40 pozitivními myšími B-buňkami lymfomové buněčné linie (WEHI-231, ATCC CRL-1702). Supernatanty se pak testovaly na způsobilost inhibovat navázání mCD40-mIg na rozpustný rekombinantní protein fuze mCD8-myší gp39, mgp39, myší ekvivalent sgp39. Přibližně dvanáct z původních jamek s nejsilnějšími inhibitory se klonovaly pomocí metody limitního vyřeďování.

Po klonování se provedly funkční zkoušky se supernatanty kultur a čištěnou protilátkou, aby se přesněji ohodnotila způsobilost anti-CD40 monoklonální protilátky inhibovat interakci myší gp39 s CD40 a určit jejich stimulační vlastnosti. Inhibiční vlastnosti se měřily schopností inhibovat vazbu mgp39 na WEHI-231 za použití standardních postupů, známých v oboru. Stimulační vlastnosti se měřily indukcí pevné homotypové adheze WEHI-231 buněk a proliferaci slezinných B-buněk za přítomnosti protilátky a anti-IgM za použití postupů, známých v oboru.

Z těchto výsledků se určily tři monoklonální protilátky (5A3, 7E1-G1 a 8E1), které jsou nejvíce podobné protilidské CD40 monoklonální protilátce 2.220 s ohledem na blokádu gp39/CD40 a na úroveň kostimulační aktivity.

2. Výběr 7E1 jako přednostně použitelné protimyší CD40 monoklonální protilátky

Studie in vivo na myších byly zaměřeny na identifikaci, která z blokujících/nestimulujících anti-CD40 monoklonálních protilátek nejsilněji snižuje specifické protilátkové odpovědi na T-dependentní antigen. Studovalo se snížení IgG protilátkové odpovědi na SRBC u myší pomocí protimyší CD40 monoklonální protilátky. Skupiny pěti myší BALB/c se imunizovaly IV (intravenózně) 1 χ 10⁸ SRBCs a souběžně se léčily ip (intraperitoneálně) 1 mg protimyšími CD40 monoklonálními protilátkami 5A3, 7E1-G1 nebo 8E1. Jako kontroly se skupiny stejně imunizovaných myší léčily MR1 (křeččí protimyší gp39, pozitivní kontrola, 250 ug), 6E9 (krysí protilidský gp39, negativní kontrola, 1 mg) nebo PBS. Myši se hodnotily na titry IgG anti-SRBC metodou ELISA 7., • ·

14., 21. a 35. den. Výsledky ukazují, že při podání jedné dávky v době expozice antigenem SRBCs se projevuje monoklonální protilátka 7E1-G1 jako účinnější supresor IgG odpovědi na SRBC ve srovnání s monoklonálními protilátkami 5A3 nebo 8E1, a proto byla vybrána jako přednostně použitelná anti-CD40 monoklonální protilátka pro studie na myších.

3. Izotypová záměna variant monoklonální protilátky 7E1-G1

7E1-G1 neměl charakteristiky efektorové funkce srovnatelné s charakteristikami chimerní 2.220 protilidské CD40 monoklonální protilátky (například krysí IgGl není tak účinný jako lidský IgGl při fixaci komplementu a Fc receptorové interakci) a profil suprese specifické protilátky in vivo není u 7E1-G1 tak kompletní jako byl pozorován u monoklonální protilátky 2.220 u primátů. Hledala se tedy protilátka, mající specificitu 7E1, ale s krysím izotypem podobnějším lidské IgGl ve svých efektorových schopnostech. K tomu se připravila přírodní izotypová záměnná varianta 7E1 z IgGl na IgG2b pomocí metody sib-selekce (Hae a kol., J. Immunol. Methods 103(1) , 59 - 67 (1987). Stručně, anti-CD40 monoklonální protilátka izotypu IgG2b se identifikovala metodou ELISA mezi supernatanty z destičky s 96 jamkami, která byla nasazena buňkami při 1000 buňkách/jamku s původním 7E1 hybridomem. Následné serie nasazení a identifikace IgG2b pozitivních jamek při nasazovací hustotě 200 a poté 20 buněk na jamku následovaných dvěma seriemi klonování pomocí metody limitního vyřeďování vedly k izolaci clonal IgG2b záměnných variant 7E1, 7E1-G2b.

7E1-G2b je všeobecně uznávaná záměnná varianta IgGl jak bylo ukázáno na třech skupinách údajů. Zaprvé, sekvenování N-konce těžkého řetězce ukázalo, že obě verze byly shodné ve zbytcích prvních 35 aminokyselin. Zadruhé, analýza PCR používající primery specifické pro proměnný těžký řetězec CDRs 7E1-G1 získala spojení vhodné velikosti z cDNA, získané buď z 7E1-G1 nebo z 7E1-G2b a nikoli dvou «· ·♦·· ^J 32.*dalších nesouvisejících protilátek. Konečně hodnocení vazebné aktivity čištěných podílů těchto dvou verzí na imobilizovaný mCD40-hIg metodou ELISA za použití anti-kappa zbytkového reagencia podalo zásadně stejné titrační křivky.

B. Studie in vivo

1. Srovnání in vivo 7E1-G1 a 7E1-G2b v modelu protilátkové odpovědi

7E1-G1 se srovnávala s 7E1-G2b na účinnost in vivo za použití SRBCs jako antigenu dependentního na T-buňkách. Skupiny tří až pěti zvířat se imunizovaly iv (intravenózně) SRBC a souběžně léčily ip (intraperitoneálně) protilátkami 7E1-G1 nebo 7E1-G2b v dávkách 1, 0,25 nebo 0,1 mg látky v 0. dni, jak ukazuje obrázek 10. Protimyší gp39 monoklonální protilátka MR1 sloužila jako pozitivní kontrola na imunosupresivní účinek. Monoklonální protilátky 6E9 a PBS sloužily v daném pořadí jako kontroly irelevantní monoklonální protilátkou a žádnou monoklonální protilátkou. Myši se hodnotily na titry anti-SRBC metodou ELISA 7., 14. a 21. den. Titry představovaly spočtené zředění séra, aby se získala hodnota OD = 0,3 v testu ELISA. Jak ukazuje obrázek 10, 7E1-G2b snížil IgG protilátkovou odpověď na SRBCs v dávkách, v nichž jí nesnížil 7E1-G1.

2. Závislost odpovědi na dávce 7E1-G2b v myším modelu T-dependentního antigenu

7E1-G2b se zkoušel na modelu primární imunní odpovědi dependentní na T-buňkách za použití SRBC jako antigenu. 7E1-G2b se testoval v různých dávkách, aby se určila nejnižší účinná dávka. Myši BALB/c (n=5) se intravenózně injikovaly 1 x 10⁸ SRBCs a léčily se jednou injekcí 7E1-G2b v indikovaných dávkách nebo MR1 (protimyší gp39) nebo PBS podanou ve stejný čas jako antigen v 1. dni. Obrázek 11 ukazuje IgG odpověď proti SRBC v 7., 16. a 28. dni. Uváděné hodnoty jsou hodnoty absorbance při měření metodou ELISA při zředění séra 1/50. Sloupce chyb představují standartní odchylku.

Jak ukazuje obrázek 11, jednodávková léčba 7E1-G2L· v dávce 25 μ9/πιγ§ (1,25 mg/kg) snížila IgG imunní odpověď o 87 % 16. den a úplná suprese se dosáhla dávkami 50 nebo 100 μg 16. den. Ve 28. dni dávka 50 μg/myš snížila IgG odpověď o 89 % a dávka 100 μg/myš způsobila úplnou supresi. Stojí za povšimnutí, že MR1 se použila jako pozitivní kontrola pro imunosupresi v suboptimální dávce 100 μ9/ιηγέ.

3. 7E1-G2b v preventivním myším modelu kolagenem indukované arthritidy (CIA)

Standardní experimentální myší model pro revmatoidní arthritidu, model kolagenem indukované arthritidy (CIA) se použil pro určení účinku 7E1-G2L· na prevenci arthritidy. Samcům myší DBA/1J o stáří 6 až 8 týdnů se injikovalo 200 μg kuřecího kolagenu typu II (Cil) v kompletním Freundově adjuvans intradermálně 0. den. Léčba 7E1-G2L· v dávce 250 μg na jednu dávku se podala intraperitoneálně každé 4 dny, počínaje 7. dnem. Kontrolní skupina se léčila PBS ve stejném dávkovacím schématu. Všem myším se podal Cil v nekompletním Freundově adjuvans 21. den. U myši byla denně pozorována velikost otoku tlapky a subjektivně skórována na stupnici 0 až 3, kde 3 se rovnalo maximálnímu otoku a erythemu.

Tlapky se rovněž denně měřily posuvným měřítkem. Udávané klinické skóre bylo odvozeno od součtu skóre každé tlapky v okamžiku vykrvácení a děleno celkovým počtem zvířat v každé skupině. Uváděné hodnoty jsou průměrným rozmezím skupin.

Rozvoj arthritidy a tím způsobený zánět kloubů u myší byl úplně inhibován léčbou 7E1-G2b, jak ukazuje tabulka 4 níže. Myši léčené 7E1-G2b byly v průběhu 90 dnů úplně bez nemoci.

···· Φ 0 0

Tabulka 4. Léčba kolagenem indukované arthritidy

Skup. Τ_χ Incidence Medián (rozmezí) arthritidy den nástupu

7E1-G1 0/5 7E1-G2b 0/5 kontrola PBS 4/4 (27-32)

Medián (roz.) Medián (roz.) | kliň. skoré rozměr tlapky |

0,075 |

0,075 |

3,5 (3-4) 0,114 (0,110-0,117)1

I

Jak bylo ukázáno výše, protilátky poskytnutého vynálezu jsou silnými imunomodulátory s léčebným využitím u řady nemocí.

Poskytnutý vynález zahrnuje chimerní a humanizované protilátky jak byly popsány výše s doplňujícími konzervativními substitucemi aminokyselin, které nemají žádný podstatný efekt na navázání CD40. Konzervativní substituce typicky zahrnuje substituci jedné aminokyseliny za jinou se stejnými charakteristikami, tedy substituce v rámci těchto skupin: valin, glycin; glycin, alanin; valin, izoleucin, leucin; kyselina asparagová, kyselina glutamová; asparagin, glutamin; serin, threonin; lysin, arginin; a fenylalanin, tyrosin.

V jednom ohledu je poskytnutý vynález zaměřen na produkci chimerních a/nebo humanizovaných protilátek, jak je popsáno výše, expresí rekombinantních segmentů DNA kódujících myší lehký proměnný řetězec a myší těžký proměnný řetězec (nebo jejich části), připojené k segmentům DNA kódujícím lidské stálé oblasti. Příkladmé sekvence DNA označené v souladu s poskytnutým vynálezem kódují polypeptidové řetězce zahrnující veškerou oblast lehkého proměnného řetězce nebo její část jak ukazuje SEQ ID N0:l nebo její depozitní ATCC klon a/nebo veškerou oblast těžkého proměnného řetězce nebo její část jak ukazuje SEQ ID NO: 2 nebo její depozitní ATCC klon.

4» 4444

4 >

4 4

4444 • · *

- ρβ·*-.

• · 4444 ···

4 4

4

4« 4 · 4 4

4 4

4 4

4 4

444

V rámci poskytnutého vynálezu jsou rovněž zahrnuty odhalené oblasti lehkého a těžkého proměnného řetězce a jejich aktivní nebo funkční části. Imunologicky kompetentní nebo funkční formy proteinu nebo jejich části se zde rovněž nazývají jako oblast lehkého/těžkého proměnného řetězce nebo jejich biologicky aktivní část. V tomto případě jejich biologicky aktivní část zahrnuje část zmíněného lehkého nebo těžkého řetězce, která, pokud je začleněna do protilátky, stále umožňuje, aby protilátka vázala lidský CD40.

Zvláště jsou v rámci poskytnutého vynálezu zahrnuty sekvence nukleových kyselin kódující proměnný lehký řetězec a proměnný těžký řetězec protilátky poskytnutého vynálezu. Například nukleotidy 1057 až 1422 (SEQ ID NO:5) na obrázku 13 poskytují výhodnou sekvenci nukleových kyselin kódující proměnný těžký řetězec protilátky poskytnutého vynálezu; nukleotidy 1065 až 1388 (SEQ ID NO:6) na obrázku 14 poskytují výhodnou sekvenci nukleových kyselin kódující proměnný lehký řetězec protilátky poskytnutého vynálezu. SEQ ID N0:7 a SEQ ID NO:11 ukazují výhodnou sekvenci nukleových kyselin kódující proměnný lehký řetězec humanizovaných protilátek poskytnutého vynálezu; SEQ ID NO:9 ukazuje výhodnou sekvenci nukleových kyselin kódující proměnný těžký řetězec humanizované protilátky poskytnutého vynálezu. Plasmidy zahrnující polynukleotidy, které ukazují SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9 a SEQ ID NO:11 byly deponovány s ATCC.

Chimerní a/nebo humanizované protilátky, které se váží na lidský CD40 a které zahrnují polypeptidy, které jsou značně homologní nebo vykazují značnou shodnost sekvence se sekvencemi proměnného lehkého a těžkého řetězce odhalenými zde, jsou rovněž uvažovány v poskytnutém vynálezu. Například chimerní protilátky zahrnující oblast lehkého řetězce, vykazující shodnost nejméně v asi 85 % sekvence, výhodněji nejméně v asi 90 % sekvence a ještě výhodněji nejméně v asi 95 % sekvence a nejvýhodněji nejméně v asi 98 % sekvence s oblastí lehkého řetězce, jak ji ukazuje SEQ ID NO:4 jsou • i t<k* ·

«« * « » ·· » « · • · · > · · ·« «·· zahrnuty do rámce poskytnutého vynálezu. Zvláště jsou rovněž zahrnuty do rámce poskytnutého vynálezu chimerní protilátky zahrnující proměnnou oblast lehkého řetězce, vykazující shodnost nejméně v asi 85 % sekvence, výhodněji nejméně v asi 90 % sekvence a ještě výhodněji nejméně v asi 95 % sekvence a nejvýhodněji nejméně v asi 98 % sekvence s proměnnou oblastí lehkého řetězce, jak ji ukazuje SEQ ID NO:1. Rovněž jsou zahrnuty do rámce poskytnutého vynálezu humanizované protilátky zahrnující oblast lehkého řetězce, vykazující shodnost nejméně v asi 85 % sekvence, výhodněji nejméně v asi 90 % sekvence a ještě výhodněji nejméně v asi 95 % sekvence a nejvýhodněji nejméně v asi 98 % sekvence s oblastí lehkého řetězce, jak ji ukazují SEQ ID NO:8 a/nebo SEQ ID NO:12. Doplňkově jsou zahrnuty do rámce poskytnutého vynálezu chimerní protilátky zahrnující oblast těžkého řetězce, vykazující shodnost nejméně v asi 85 % sekvence, výhodněji nejméně v asi 90 % sekvence a ještě výhodněji nejméně v asi 95 % sekvence a nejvýhodněji nejméně v asi 98 % sekvence s oblastí těžkého řetězce, jak ji ukazuje SEQ ID NO:3. Zvláště jsou rovněž zahrnuty do rámce poskytnutého vynálezu chimerní protilátky zahrnující proměnnou oblast těžkého řetězce, vykazující shodnost nejméně v asi 85 % sekvence, výhodněji nejméně v asi 90 % sekvence a ještě výhodněji nejméně v asi 95 % sekvence a nejvýhodněji nejméně v asi 98 % sekvence s proměnnou oblastí těžkého řetězce, jak ji ukazuje SEQ ID NO:2. Doplňkově jsou zahrnuty do rámce poskytnutého vynálezu humanizované protilátky zahrnující oblast těžkého řetězce, vykazující shodnost nejméně v asi 85 % sekvence, výhodněji nejméně v asi 90 % sekvence a ještě výhodněji nejméně v asi 95 % sekvence a nejvýhodněji nejméně v asi 98 % sekvence s oblastí těžkého řetězce, jak ji ukazuje SEQ ID NO:10.

Segmenty DNA typicky dále zahrnují sekvence kontroly exprese DNA operativně spojené se sekvencemi kódujícími chimerní nebo humanizovanou protilátku, obsahující přirozeně asociované nebo heterologní oblasti promotoru. Výhodně > · . · · · · · . · · · · ••co· · · * ‘ • »••58 ·- · · · · sekvence kontroly exprese budou eukaryotické promotorové systémy ve vektorech schopných transformace nebo transfekce eukaryotických hostitelských buněk, ale rovněž lze použít kontrolní sekvence pro prokaryotické hostitele. Když se vektor začlenil do vhodné buňky, udržuje se hostitel za podmínek vhodných pro vysokou úroveň exprese sekvence nukleotidů a, je-li to žádoucí, může následovat sběr a čištění proměnného lehkého řetězce, těžkého řetězce, dimerů lehkého/těžkého řetězce nebo nedotčené protilátky, vážících se fragmentů nebo jiných forem imunoglobulinů. (Viz Beychok S., Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academie Press, Ν. Y. (1979)). Protilátky s jednoduchým řetězcem lze rovněž produkovat spojením sekvencí nukleových kyselin, kódujících oblasti VL a VH zde odhalených s DNA kódující polypeptidový linker.

Prokaryotičtí hostitelé, jako je E. coli a jiné mikroby, jako kvasinky, lze použít k expresi protilátky poskytnutého vynálezu. Navíc k mikroorganismům lze rovněž použít buněčnou kulturu savčích tkání k expresi a produkci protilátky poskytnutého vynálezu. Eukaryotické buňky lze preferovat, protože v oboru bylo vyvinuto mnoho vhodných linií hostitelských buněk, schopných sekrece nedotčených imunoglobulinů, do nichž lze zahrnout CHO buněčné linie, různé COS buněčné linie, HeLa buňky, myelomové buněčné linie a hybridomy. Exprese vektorů pro tyto buňky může zahrnovat sekvence kontroly exprese, jako je promotor nebo enhancer a místa nezbytná pro zpracování informace, jako jsou místa vážící ribozomy, místa spojení RNA, místa polyadenylace a transkripční terminátorové sekvence, všechny známé v oboru.

Vektory obsahující segmenty DNA, které jsou předmětem zájmu (tedy sekvence kódující těžký a/nebo lehký řetězec a sekvence kontroly exprese) lze přenést do hostitelské buňky dobře známými způsoby, které se liší v závislosti na typu buněčného hostitele. Například transfekce chloridem vápenatým se běžně používá u prokaryotických buněk, zatímco • ·

působení fosforečnanem vápenatým nebo elektroporací lze použít u jiných buněčných hostitelů, (iz například Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1982)).

Když jsou expresovány, mohou se celé protilátky, jejich dimery, jednotlivé lehké a těžké řetězce nebo jiné formy imunoglobulinů poskytnutého vynálezu čistit podle standardních postupů v oboru, zahrnujících precipitaci síranem amonným, metodu sloupcové afinity, sloupcovou chromatografií, elektoforézu na gelu a podobně. Výhodné jsou významně čisté imunoglobuliny s nejméně 90 až 95% homogenitou a nejvýhodnější jsou ty s 98 až 99% homogenitou pro farmaceutické použití.

Protilátky poskytnutého vynálezu najdou typicky své uplatnění v léčbě nemocí zprostředkovaných protilátkové a/nebo zprostředkovaných T-buňkami. Typické stavy nemoci vhodné pro léčbu zahrnují reakci štěpu proti hostiteli a rejekci transplantátu, autoimunní nemoci jako diabetes I. typu, lupénka, roztroušená skleróza, revmatoidni arthritida, systémový lupus erythematosus a myastenia gravis.

Protilátky a farmaceutické přípravky poskytnutého vynálezu jsou zejména užitečné při parenterálním podání, například subkutánně, intramuskulárně nebo intravenózně. Farmaceutické přípravky pro parenterální podání budou obvykle zahrnovat roztok protilátky rozpuštěné ve vhodném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Lze použít řadu vodných nosičů, dobře známých v oboru, například vodu, pufrovanou vodu, roztok chloridu sodného, glycinu a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a celkově bez obsahu částic. Tyto farmaceutické přípravky lze sterilizovat konvenčními dobře známými postupy. Tyto přípravky mohou obsahovat farmaceuticky vhodné pomocné látky jsou-li nutné proto, aby se přiblížily fyziologickým podmínkám, jako jsou pH adjustující a pufrovací látky, toxicitu adjustující látky a podobně, například octan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, mléčnan sodný, lidský albumin v· ·

atd.

Přípravky obsahující protilátky poskytnutého vynálezu lze podat pro profylaktické nebo léčebné účely. Při léčebném podání se přípravky podávají pacientovi, který již trpí nemocí v množství dostatečném pro léčbu nebo přinejmenším pro částečné zpomalení nemoci a jejích komplikací. Množství dostatečné, aby tohoto dosáhlo, se definuje jako terapeuticky účinná dávka. Množství účinná pro toto použití budou záviset na tom, jak těžký je stav nemoci a celkový stav pacientova vlastního imunnitního systému a může je určit odborník v oboru.

Při profylaktickém podání se přípravky podávají pacientovi, který ještě netrpí nemocí, aby se zvýšila pacientova odolnost (snížila imunní odpověď). Takové množství dostatečné, aby tohoto dosáhlo, se definuje jako profylakticky účinná dávka. Přesná množství pro toto použití budou opět záviset na stavu pacientova zdraví a celkové úrovni jeho imunity. Výhodné profylaktické použití je k prevenci rejekce transplantátu, například rejekci transplantované ledviny.

Ačkoli byl poskytnutý vynález popsán v některých podrobnostech cestou ilustrací a příkladů kvůli jasnosti a porozumění, bude zřejmé, že určité změny a modifikace lze uskutečnit v rámci připojených patentových nároků.

Claims (29)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Proměnná oblast lehkého řetězce, která zahrnuje celou sekvenci aminokyselin nebo její biologicky aktivní část, jak je ukazána v SEQ ID NO;1 (obrázek 4a).
2. 2. Proměnná oblast těžkého řetězce, která zahrnuje celou sekvenci aminokyselin nebo její biologicky aktivní část, jak je ukazána v SEQ ID N0;2 (obrázek 4b).
3. 3. Chimerní protilátka, která váže lidský CD40 a zahrnuje lehký řetězec a těžký řetězec, kde zmíněný lehký řetězec zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce podle nároku 1.
4. 4. Chimerní protilátka, která váže lidský CD40 a zahrnuje lehký řetězec a těžký řetězec, kde zmíněný těžký řetězec zahrnuje proměnnou oblast těžkého řetězce podle nároku 2.
5. 5. Chimerní protilátka podle nároku 3, kde zmíněný těžký řetězec zahrnuje proměnnou oblast těžkého řetězce podle nároku 2.
6. 6. Chimerní protilátka, která váže lidský CD40 a zahrnuje lehký řetězec a těžký řetězec, výše zmíněný lehký řetězec zahrnuje celou sekvenci aminokyselin nebo její biologicky aktivní část, jak je ukazána v SEQ ID NO;4 a výše zmíněný těžký řetězec zahrnuje celou sekvenci aminokyselin nebo její biologicky aktivní část, jak je ukazána v SEQ ID NO:3
7. 7. Molekula nukleové kyseliny, která zahrnuje sekvenci nukleotidů kódující proměnnou oblast lehkého řetězce podle nároku 1.
8. 8. Molekula nukleové kyseliny, která zahrnuje sekvenci nukleotidů kódující proměnnou oblast těžkého řetězce podle nároku 2.

   ·· • · »· ···· .-..62 -ί ·· ····
9. 9. Vektor exprese, který zahrnuje sekvenci nukleových kyselin podle nároku 7.
10. 10. Vektor exprese, který zahrnuje sekvenci nukleových kyselin podle nároku 8.
11. 11. Humanizovaná protilátka, která zahrnuje část proměnné oblasti lehkého řetězce podle nároku 1.
12. 12. Humanizovaná protilátka, která zahrnuje část proměnné oblasti těžkého řetězce podle nároku 2.
13. 13. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje chimerní protilátku podle nároku 5.
14. 14. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje chimerní protilátku podle nároku 6.
15. 15. Chimerní protilátka, která váže lidský CD40 a zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce a proměnnou oblast těžkého řetězce, ve které výše zmíněná proměnná oblast lehkého řetězce zahrnuje sekvenci aminokyselin mající nejméně 90% shodnost sekvence s proměnnou oblastí lehkého řetězce podle nároku 1.
16. 16. Chimerní protilátka, která váže lidský CD40 a zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce a proměnnou oblast těžkého řetězce, ve které výše zmíněná proměnná oblast těžkého řetězce zahrnuje sekvenci aminokyselin mající nejméně 90% shodnost sekvence s proměnnou oblastí těžkého řetězce podle nároku 2.
17. 17. Způsob léčení pacienta trpícího poruchou zprostředkovanou T-buňkami, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeuticky účinné dávky «« .·«· ··»· ·· • *-* Í 3 J ¹ · * · · . «.Í?J · · « · » • « · · · · · · · farmaceutického přípravku podle nároku 14 zmíněnému pacientovi.
18. 18. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 7, která zahrnuje sekvenci nukleotidů, jak je ukázána v SEQ ID NO:6.
19. 19. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 8, která zahrnuje sekvenci nukleotidů, jak je ukázána v SEQ ID NO:5.
20. 20. Chimerní protilátka podle nároku 6, která zahrnuje sekvenci aminokyselin lehkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:4 a sekvenci aminokyselin těžkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:3.
21. 21. Humanizovaná protilátka podle nároku 11, která zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO: 8.
22. 22. Humanizovaná protilátka podle nároku 11, která zahrnuje proměnnou oblast těžkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:10.
23. 23. Humanizovaná protilátka podle nároku 12, která zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO: 8.
24. 24. Humanizovaná protilátka podle nároku 12, která zahrnuje proměnnou oblast těžkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:10.
25. 25. Humanizovaná protilátka podle nároku 11, která zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:8 a proměnnou oblast těžkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:10.
26. 26. Humanizovaná protilátka podle nároku 11, která zahrnuje

    - 6¼ ····.

    *“·⁴ίΓ proměnnou oblast lehkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID N0:12.
27. 27. Humanizovaná protilátka podle nároku 26, která zahrnuje proměnnou oblast těžkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:10.

    27. Humanizovaná protilátka podle nároku 11, která zahrnuje proměnnou oblast lehkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:12 a proměnnou oblast těžkého řetězce, jak je ukázána v SEQ ID NO:10.
28. 28. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje humanizovanou protilátku podle nároku 25
29. 29. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje humanizovanou protilátku podle nároku 28

    Seznam sekvencí