CZ20003284A3 - Vakcína - Google Patents

Abstract

Nové kombinované vakcíny, určené s výhodou pro podávání dospívajícím osobám, které obsahují virový antigen hepatitidy B a virový antigen herpes simplex a popřípadě další jeden nebo více následujících antigenu: antigen EBV, antigen hepatitidy A nebo inaktivovaný oslabený virus, antigen HPV, antigen VZV, antigen HCMV a antigen Toxoplaxma gondii. Vakcíny jsou formulovány s adjuvans, kterýmje preferenční stimulátor buněčné odpovědi typu TH1 jako je 3D-MPL a QS21.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových vakcín, způsobů jejich výroby a jejich použití v lékařství. Předkládaný vynález se zvláště týká kombinovaných vakcín pro podávání dospívajícím.

Dosavadní stav techniky

Primárním etiologickým agens vyvolávajícím herpes genitalis je HSV-2. HSV-2 a HSV-1 (činitele vyvolávající herpes labialis) jsou charakterizovány schopností indukovat jak akutní onemocnění, tak i vyvolat latentní infekci, primárně v neuronálních gangliových buňkách.

Odhaduje se, že herpes genitalis se vyskytuje v samotných USA u přibližně pěti milionů lidí spolu s 500 000 klinickými případy zaznamenanými každý rok (primární a recidivující infekce). Primární infekce se typicky vyskytuje po pubertě a je charakterizována lokalizovaným výskytem bolestivých kožních poškození, která přetrvávají po dobu přibližně dvou až tří týdnů. V průběhu následujících šesti měsíců po primární infekci dojde u 50 % pacientů k návratu onemocnění. Přibližně 25 % pacientů může projít 10 až 15 recidivami tohoto onemocnění každý rok. U pacientů s oslabenou imunitou je výskyt vysoké frekvence recidivy statisticky vyšší než u populace normálních pacientů.

Jak virus HSV-1, tak i HSV-2 mají na povrchu virové částice řadu glykoproteinových složek. Ty jsou známy jako gB, gC, gD a gE atd.

Vakciny pro prevenci infekcí hepatitidy B, které obsahují jeden nebo více antigenů hepatitidy B, jsou známy. Pro prevenci hepatitidy B

- 2 se používá například vakcína Engerix-B™ firmy SmithKline Beecham Biologicals. Tato vakcína obsahuje povrchový antigen hepatitidy B (konkrétně S-antigen o délce 226 aminokyselin popsaný v Harford a další, Postgraduate Medical Journal, 1987, 63 (dodatek 2), str. 65 5 70) a je formulována s použitím hydroxidu hlinitého jako adjuvans.

Stále existuje potřeba účinných kombinačních vakcín pro prevenci onemocnění, ke kterým je zvláště náchylná dospívající populace.

io Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje vakcínu, která obsahuje:

(a) virový antigen hepatitidy B (HBV); a (b) virový antigen herpes simplex (HSV) v kombinaci s adjuvans, kterým je preferenční stimulátor 15 buněčné odpovědi typu TH1.

Vakcína podle předkládaného vynálezu se zvláště prospěšně podává dospívajícím osobám, u kterých je zvláštní riziko infekce HBV a/nebo HSV.

Vakcína podle předkládaného vynálezu popřípadě dále obsahuje 20 jeden nebo více jiných antigenů, jak bude popsáno dále.

Bylo zjištěno, že u vakcín podle předkládaného vynálezu překvapivě nedochází k interferenci, tzn., že imunitní odpověď na každý antigen ve vakcíně podle vynálezu je v podstatě stejná jako imunitní odpověď získaná v případě, kdy se každý antigen podává individuálně spolu s adjuvans, kterým je preferenční stimulátor buněčné odpovědi typu TH1.

Příkladem vakciny, která může být použita pro prevenci infekcí virem hepatitidy A je vakcína Havrix™, rovněž od firmy SmithKline ······ * · ·· ·· • · · ·· ·· ·»·· ·· · 9 9 · 9 · • 9 9 9 ··>··· • · 9 · · · 9 9 ···· · · · · ··· 9· 9·

- 3 Beecham Biologicals. Je formulována s hydroxidem hlinitým jako adjuvans. Vakcína obsahuje oslabený kmen viru HM-175 hepatitidy A inaktivovaný formolem (formaldehydem); viz André a další (Prog. Med. ViroL, díl 37, str. 1 - 24).

Jak se zde používá, termín virový antigen hepatitidy A (HAV) označuje buď protein odvozený od viru hepatitidy A, nebo oslabený kmen HAV, popřípadě inaktivovaný například formaldehydem. Jestliže je antigenem HAV protein odvozený z viru hepatitidy A, může popřípadě jít o rekombinantní protein.

io WO-A-92 11291 popisuje imunogenní hybridní poiypeptid obsahující první polypeptidovou složku, kterou je povrchový antigen hepatitidy B kovalentně navázaný přes nativní atom síry v první polypeptidové složce na druhou polypeptidovou složku, jako je gD viru HSV.

Vakcína Twinrix™ je kombinace rekombinantního antigenu hepatitidy B s výše uvedeným inaktivovaným oslabeným virem hepatitidy A. Vakcína může být použita pro současnou ochranu proti hepatitidě A a hepatitidě B.

Evropský patent EP-B-0 339 667 (Chemo Šero) popisuje

2o obecnou myšlenku kombinace antigenu hepatitidy A a antigenu hepatitidy B pro výrobu kombinované vakciny. V tomto spisu se uvádí, že použité adjuvans není kritické: musí být pouze schopno zvýšit imunitní účinnost na požadovanou úroveň a nezpůsobovat žádné vedlejší účinky. Uvádí se, že může být použit hlinitý gel, zvláště gel hydroxidu hlinitého a gel fosforečnanu hlinitého.

Vynález poskytuje v dalším provedení vakcínu obsahující:

(a) virový antigen hepatitidy B (HBV);

(b) virový antigen herpes simplex (HSV); a (c) virový antigen hepatitidy A (HAV)

- 4 v kombinaci s adjuvans, kterým je preferenční stimulátor buněčné odpovědi typu TH1.

Taková vakcína je velmi prospěšná pro podávání dospívajícím osobám, u kterých může být zvláštní riziko infekce HBV a/nebo HSV a/nebo HAV.

Imunitní odpověď může být z širšího hladiska rozlišována na dvě extrémní kategorie, kterými jsou humorální, nebo buňkami zprostředkované imunitní odpovědi (tradičně charakterizované protilátkovými mechanismy ochrany, popřípadě mechanismy ochrany buněčnými efektory). Tyto kategorie odpovědí byly označovány jako odpovědi typu TH1 (buňkami zprostředkovaná odpověď) a imunitní odpovědi typu TH2 (humorální odpověď).

Extrémní imunitní odpovědi typu TH1 mohou být charakterizovány tvorbou cytotoxických haplotypově omezených T lymfocytů specifických pro antigen, a odpověďmi přirozených buněk zabíječů. U myší jsou odpovědi typu TH1 často charakterizovány vytvářením protilátek subtypu lgG2a, zatímco u lidí odpovídají protilátkám typu lgG1. Imunitní odpovědi typu TH2 jsou charakterizovány tvorbou širokého rozsahu imunoglobulinových isotypů včetně u myši lgG1, IgA a IgM.

Je možno předpokládat, že hnací silou, která stojí za vytvářením těchto dvou typů imunitních odpovědí, jsou cytokiny. Vysoké hladiny cytokinů typu TH1 mají sklon zvýhodňovat indukci imunitních odpovědí na daný antigen zprostředkovaných buňkami, zatímco vysoké hladiny cytokinů typu TH2 mají sklon zvýhodňovat indukci humorálních imunitních odpovědí na antigen.

Rozlišování imunitních odpovědí typu TH1 a TH2 není absolutní. Ve skutečnosti bude jednotlivec podporovat imunitní odpověď, která je popsána jako převážně TH1 nebo převážně TH2. Často je však pohodlné uvažovat o skupinách cytokinů z hlediska druhů popsaných u myších buněčných klonů CD4 + veT autory Mosmann a Coffman • ·

- 5 (Mosmann, T. R. a Coffman, R. L. (1989) TH1 and TH2 celíš: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, str. 145 - 173). Tradičně jsou odpovědi typu TH1 spojovány s produkcí cytokinů INF-γ a lL-2

T lymfocyty. Jiné cytokiny, často přímo uváděné v souvislosti s indukcí imunitních odpovědí typu TH1 nejsou produkovány T-buňkami, jako je například IL-12. Naopak odpovědi typu TH2 jsou spojovány se sekrecí IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 a tumorového nekrózního faktoru β (TNF-β).

Je známo, že pro stimulaci jakéhokoli z typů TH1 nebo TH2 io odpovědí cytokinů jsou zvláště vhodná určitá vakcínová adjuvans. Tradičně jsou nejlepšími ukazateli rovnováhy TH1:TH2 imunitní odpovědi po vakcinaci nebo infekci přímá měření produkce cytokinů TH1 nebo TH2 T lymfocyty in vitro po restimulaci antigenem a/nebo měření poměru lgG1:lgG2a antigenně specifických buněčných odpovědí.

Adjuvans typu TH1 je tedy činitelem, který stimuluje izolované populace T-buněk ke stimulaci vysokých hladina cytokinů typu TH1 při restimulaci antigenem in vitro, a indukuje imunoglobulinové odpovědi specifické pro antigen spojené s isotypem typu TH1.

Adjuvans, která jsou schopna preferenční stimulace buněčné odpovědi TH1 jsou popsána v mezinárodních patentových přihláškách No. WO 94/00153 a WO 95/17209.

Jedním takovým adjuvans je 3 De-O-acylovaný monofosforyllipid A (3D-MPL) Ten je znám ze spisu GB 2220211 (Ribi). Chemicky jde o směs 3 De-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4-, 5- nebo 6-acylovanými řetězci vyráběnou firmou Ribi Immunochem, Montana. Východná forma 3 De-O-acylovaného monofosforyllipidu A se popisuje v evropském patentu EP-B-0 689 454 (SmithKline Beecham

Biologicals SA).

S výhodou jsou částice 3D-MPL dostatečně malé, aby je bylo možno sterilně filtrovat membránou s velikostí pórů 0,22 pm (jak se

- 6 popisuje v evropském patentu No. 0 689 454). 3D-MPL bude přítoment v množství 10 pg až 100 pg, s výhodou 25 až 50 pg na dávku, zatímco antigen bude typicky přítomen v množství 2 až 50 pg na dávku.

Mezi další výhodná adjuvans patří QS21, netoxická frakce 5 čištěná HPLC z kůry Quillaja Saponaria Molina. Tato látka může být popřípadě smísena s 3 De-O-acylovaným monofosforyllipidem A (3DMPL), popřípadě spolu s nosičem.

Způsob výroby QS21 se popisuje v US patentu No. 5,057,540.

Již dříve (WO 96/33739) byly popsány nereaktogenní adjuvantní w formulace obsahující QS21. Bylo ukázáno, že tyto formulace obsahující QS21 a cholesterol jsou při formulaci spolu s jiným antigenem úspěšným TH1-stimulačním adjuvans. Tyto vakciny, které jsou také součástí předkládaného vynálezu, mohou obsahovat kombinaci QS21 a cholesterolu.

Mezi další adjuvans, která jsou preferenčními stimulátory buněčné odpovědi TH1, patří imunomodulační oligonukleotidy, například nemethylované sekvence CpG, jak se popisuje ve WO 96/02555.

Kombinace různých TH1-stimulujících adjuvans, jako například látek uvedených výše, mohou také podle předpokladů poskytnout adjuvans, které je preferenčním stimulátorem buněčné odpovědi TH1. Například QS21 může být formulován spolu s 3D-MPL. Poměr QS21 : 3D-MPL bude typicky řádově 1 : 10 až 10 : 1, s výhodou 1 : 5 až 5 : 1 a často v podstatě 1:1. Výhodné rozmezí prodosažení optimální synergie je 2,5 : 1 až 1 : 1 3D-MPL : QS21.

Ve vakcíně podle předkládaného vynálezu je také s výhodou přítomen nosič. Nosič může být ve formě emulze oleje ve vodě, nebo může jít o sůl hliníku, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

Výhodné emulze typu olej ve vodě obsahují metabolizovatelný 30 olej, jako je skvalen, a-tokoferol a Tween 80™. Tato emulze typu olej • ·

- 7 ve vodě může navíc obsahovat spán 85 a/nebo lecitin a/nebo trikaprylin.

Ve zvláště výhodném provedení jsou antigeny ve vakcíně podle předkládaného vynálezu kombinovány s 3D-MPL a kamencem (alum).

Typicky budou pro podávání člověku přítomny látky QS21 a 3DMPL ve vakcíně v množství 1 pg až 200 pg, jako je 10 až 100 pg, s výhodou 10 pg až 50 pg na dávku. Olej ve vodě bude typicky obsahovat od 2 do 10 % skvalenu, od 2 do 10 % α-tokoferolu a od 0,3 do 3 % Tweenu 80. S výhodou je poměr skvalen : ct-tokoferol roven io nebo menší než 1, protože tak se získají stabilnější emulze. Spán 85 může být přítomen také v množství 1 %. V některých případech může být výhodné, aby vakcíny podle předkládaného vynálezu dále obsahovaly stabilizátor.

Netoxické emulze typu olej ve vodě obsahují s výhodou netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, např. Tween 80, ve vodném nosiči. Vodným nosičem může být například fyziologický roztok s fosfátovým pufrem.

Zvláště účinná adjuvantní formulace obsahující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě se popisuje ve WO 95/17210.

Antigen HSV v prostředku podle vynálezu se s výhodou odvozuje od HSV-2, typicky glykoproteinů D. Glykoprotein D je umístěn na virové membráně a nachází se také v cytoplazmě infikovaných buněk (Eisenberg R. J. a další; J. of Virol., 1980, 35, 428 - 435). Obsahuje 393 aminokyselin včetně signálního peptidu a má molekulovou hmotnost přibližně 60 kD (60 000). Ze všech obalových glykoproteinů HSV je tento pravděpodobně charakterizován (Cohen a další; J. of Virology, 60, 157 - 166). Je známo, že in vivo má klíčovou úlohu při navazování viru na buněčné membrány. Navíc bylo ukázáno, že glykoprotein D je schopen vyvolávat in vivo neutralizační protilátky (Eing a další, J. Med. Virology 127: 59 - 65). Latentní virus HSV-2 • · · · · · · ···· • Β Β Β Β Β Β Β

Β Β · Β 9 9 9 9 9 9 • · 9 · Β · · 9

ΒΒΒΒ 9 999 499 99 99

- 8 však může být stále reaktivován a indukuje recidivu onemocnění přes přítomnost vysokého titru neutralizačních protilátek v séru pacienta.

Další provedení předkládaného vynálezu představuje zkrácený glykoprotein D HS2-2 o délce 308 aminokyselin, který obsahuje aminokyseliny 1 až 306 přirozeně se vyskytujícího glykoproteinu s přidaným asparaginem a glutaminem na C-konci zkráceného proteinu neobsahujícího oblast ukotvení na membránu. Tato forma proteinu zahrnuje signální peptid, který se odštěpí za získání maturního proteinu o délce 283 aminokyselin. Produkce takového io proteinu buňkami vaječníků čínského křečka byla popsána v evropském patentu EP-B-139 417 firmy Genentech.

Ve vakcínách podle předkládaného vynálezu se s výhodou používá zkrácená forma rekombinantního maturního glykoproteinu D HSV-2, která se označuje jako rgD2t.

Kombinace tohoto antigenu s adjuvans 3D-MPL byla popsána ve

WO 92/16231.

Virovým antigenem hepatitidy B (HBV) v prostředku podle vynálezu je typicky povrchový antigen hepatitidy B.

Výroba povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg) je dobře 20 dokumentována, viž například Harford a další, Develop. Biol. Standard 54, str. 125 (1983), Gregg a další, Biotechnology, 5, str. 479 (1987),

EP-A-0 226 846, EP-A-0 299 108 a tam uvedené odkazy.

Jak se zde používá, výraz „povrchový antigen hepatitidy B“ zkracovaný jako „HBsAg“ nebo „HBS“ zahrnuje jakýkoli antigen HBsAg nebo jeho část, které vykazují antigeničnost povrchového antigenu HBV. Je třeba rozumět, že navíc k sekvenci 226 aminokyselin Santigenu HBsAg (viz Tiollais a další, Nátuře, 317, 489 (1985) a tam uvedené odkazy) může antigen HBsAg jak je zde popsán v případě potřeby obsahovat veškerou nebo část sekvence pre-S, jak se popisuje ve výše uvedených odkazech a v EP-A-0 278 940. Termín φ · ··· · φ φ φφ φφ ·· φ φφ φφ φφφφ φφ φ φ φφφφ φ φ φ φ φφφφφφ φ φ φ φ φφφφ φφφφ φ φφφ φφφ φφ φ·

- 9 HBsAg, jak se zde uvádí, může také zahrnovat varianty, například typu „escape mutant“ popisované ve WO 91/14703. V dalším provedení může HBsAg obsahovat protein popisovaný v evropské patentové přihlášce No. 0 414 374 jako L*, tedy protein, jehož aminokyselinová sekvence obsahuje část sekvence aminokyselin velkého (large, L) proteinu hepatitidy B (subtyp ad nebo ay), který se vyznačuje tím, že se aminokyselinová sekvence tohoto proteinu skládá buď:

(a) ze zbytků 12 - 52, následovaných zbytky 133 - 145, následovaných zbytky 175 - 400 uvedeného proteinu L; nebo io (b) ze zbytku 12, následovaného zbytky 14 - 52, následovaných zbytky 133 - 145, následovaných zbytky 175 - 400 uvedeného proteinu L.

Termín HBsAg může také označovat polypeptidy popsané v EP 0 198 474 nebo EP 0 304 578.

Za obvyklých okolností bude HBsAg ve formě částic. Mohou obsahovat samotný S-protein nebo mohou být ve formě složených částic, například (L*, S), kde L* je jak definováno výše a S znamená Sprotein povrchového antigenu hepatidy B.

HBsAg může být adsorbován na fosforečnan hlinitý, jak se popisuje ve WO 93/24148.

Antigenem hepatitidy B (HBV), s výhodou používaným ve vakcíně podle vynálezu, je S-antigen HBsAg jak se používá v komerčním produktu Engerix-B™, SmithKline Beecham Biologicais).

Vakcína obsahující povrchový antigen hepatitidy B ve spojení 25 s 3D-MPL byla popsána v evropské patentové přihlášce EP-A0 633 784.

Virus Epstein-Barrové (EBV), který patří do skupiny herpesvirů, způsobuje infekční mononukleózu jako primární onemocnění u lidí. Postihuje převážně děti nebo mladé dospělé. Více než 90 % průměrné populace dospělých je infikováno EBV, který přetrvává po celou dobu

· 4 4 4 4

4 4 4

4

4 4

4

44444 4

- 10 života v periferních B-lymfocytech. Virus se po celou dobu života vytváří v příušní žláze a šíří se primárně výměnou slin jednotlivců šířících virus. Děti infikované virem EBV jsou z velké části bez příznaků nebo mají velmi mírné příznaky, zatímco u dospívajících a dospělých, kteří se infikovali, se vyvíjí typická infekční mononukleóza charakterizovaná horečkou, faryngitidou a adenopatií. Infikovaní lidé si udržují protilátky anti-EBV po zbytek života a jsou tak imunní vůči další infekci.

Navíc k infekčnímu působení bylo ukázáno, že virus EBV io transformuje lymfocyty na rychle se dělící buňky, a proto se předpokládá, že se účastní na vzniku několika různých lymfomů, včetně afrického Burkittova lymfomu (BL). EBV se také může účastnit vzniku karcinomu nosohltanu (NPC). Odhaduje se, že ve světě se vyskytuje 80 000 případů karcinomu nosohltanu, které převažují v populacích etnických Číňanů. Infekční mononukleóza je důsledek primární infekce EBV. Není to choroba ohrožující život, pokud nejsou přítomny další rizikové faktory.

Byly popsány čtyři proteiny virového obalu EBV tvořící tzv. komplex membránového antigenu. Ty se obvykle označují jako gp

220/350 nebo gp 250/350 nebo jednoduše jako gp 250 nebo 350 (viz

EP-A-151079). Jsou přesvědčivé důkazy, že gp 350 a gp 250 indukují tvorbu neutralizačních protilátek, a že protilátky proti gp 350 a gp 250 mají neutralizační schopnost. Tyto proteiny jsou tedy kandidáty na možnou vakcínu proti EBV. Pro další informace týkající se použití gp 250/350 pro prevenci a léčení onemocnění spojených s EBV viz EP 0 173 254.

Hlavní povrchový glykoprotein EBV gp 350/220 infikuje lidské cílové buňky interakcí s proteinem buněčné membrány CD21. Gp 350/220 je primárním cílem pro protilátky neutralizující EBV u lidí a bylo ukázáno, že některé formy gp 350/220 mají ochranné účinky proti onemocněním příbuzným s EBV. S výhodou obsahuje vakcína • · ··· · φ · · · ······ • · · · · · · · ···· · ··· ··· t» ·♦

- 11 podle předkládaného vynálezu gp 350 viru EBV, i když mohou být použity i jiné antigeny s ochrannými účinky.

Papilomaviry jsou malé DNA tumorové viry, které jsou vysoce druhově specifické. Dosud bylo popsáno více než 70 jednotlivých genotypů lidského papilomaviru (HPV). viry HPV jsou obecně specifické buď pro kůži (např. HPV-1 a -2) nebo povrchy sliznic (například HPV-6 a -11) a obvykle způsobují benigní tumory (bradavice), které přetrvávají po několik měsíců nebo let. Takové benigní tumory mohou být pro postižené jednotlivce obtížné, ale až na io málo výjimek neohrožují život.

Některé viry HPV se také spojují s rakovinným onemocněním. Nejsilnější pozitivní souvislost mezi HPV a rakovinou u člověka je souvislost, která existuje mezi HPV-16 a HPV-18 a rakovinou děložního hrdla. Rakovina děložního hrdla je nejčastějším maligním onemocněním v rozvojových zemích, přičemž každoročně se ve světě vyskytne přibližně 500 000 nových případů. Nyní je technicky možné aktivně bojovat proti infekcím HPV-16 a dokonce i již vyvinutému rakovinnému onemocnění s obsahem HPV-16 s použitím vakcín. Přehled očekávání pro preventivní a terapeutickou vakcinaci proti

HPV-16 je možno nalézt v Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293 - 306 a Hagenesee Μ. E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555 - 556, 559 - 564. Vakcína podle vynálezu obsahuje s výhodou hlavní protein kapsidy, protein L1.

Dosud byly izolovány a charakterizovány pomocí klonovacích systémů v bakteriích a v poslední době amplifikací PCR různé typy virů HPV. Molekulární organizace genomů HPV byla definována na komparativním základě s dobře charakterizovaným bovinním papilomavirem typu 1 (BPV1).

Ačkoliv se vyskytují menší variace, všechny popisované genomy virů HPV mají alespoň sedm časných genů, E1 až E7 a dva pozdní

- 12 44 44

4 4 1

4 4 4 ·· 4 4 geny L1 a L2. Navíc nese upstream regulační oblast regulační sekvence, které patrně řídí většinu transkripčních dějů genomu HPV.

Geny E1 a E2 se účastní replikace viru a kontroly transkripce a mají sklon k porušení integrací viru. Virové transformace se účastní

E6 a E7 a podle posledních důkazů také pravděpodobně E5.

U karcinomu děložního hrdla s účastí virů HPV jako je HPV 16 a 18 začíná onkogenní proces po integraci virové DNA. Integrace vede k inaktivaci genů kódující kapsidové proteiny L1 a L2 a vyvolá se trvalá nadměrná exprese dvou časných proteinů E6 a E7, která vede io k postupné ztrátě normální diferenciace buněk a vývoji karcinomu. Karcinom děložního hrdla je u žen běžný a vyvíjí se přes prekancerózní mezistupeň až k invazívnímu karcinomu, který často vede ke smrti. Mezistupně tohoto onemocnění jsou známé pod označením cervikální intraepiteliální neoplasie a podle vzrůstající vážnosti se označují stupni I až III.

Klinicky se infekce ženského anogenitálního traktu manifestuje jako ploché kondylomy děložního hrdla, jejichž charakteristickým znakem je koilocytóza postihující převážně povrchové a intermediální buňky skvamózního epitelia děložního hrdla.

Kilocyty, které jsou důsledkem cytopatického působení viru, se jeví jako vícejaderné buňky s čirým perinukleárním halo. Epitelium má zvětšenou tloušťku s abnormální keratinizací která je odpovědná za bradavičnatý vzhled poškození.

Tyto ploché kondylomy, pokud jsou pozitivní na sérotypy HPV 16 nebo 18, jsou vysoce rizikové faktory pro vývoj směrem k cervikální intraepiteliální neoplasii (CIN) a karcinomu in šitu (CIS), které jsou samy považovány za prekurzorová požkození invazivního cervikálního karcinomu.

Mezinárodní patentová přihláška No. WO 96/19496 popisuje varianty proteinů E6 a E7 lidského papilomaviru, zvláště fuzních · 4 4 4 4

4

4

- 13 4 4 4 4

4 44 proteinů E6/E7 s delecí v obou proteinech E6 a E7. Tyto deleční fuzní proteiny se uvádějí jako imunogenní.

Vakciny založené na HPV L1 se popisují ve WO 94/00152, WO 94/20137, WO 93/02184 a WO 94/05792. Taková vakcína může obsahovat antigen L1 jako monomer, kapsomer nebo částici podobnou viru. Tyto částice mohou dále obsahovat proteiny L2. Další vakciny HPV jsou založeny na časných proteinech, jako je E7 nebo fuzních proteinech, jako je L2-E7.

Ve vakcíně podle předkládaného vynálezu je výhodné používat io směsi obsahující buď protein E6 nebo E7 navázaný na imunologického fuzního partnera s epitopy T-buněk.

Ve výhodném provedení vynálezu je imunologický fuzní partner odvozen od proteinu D Haemophilus influenzae B. S výhodou obsahuje derivát proteinu D přibližně první 1/3 proteinu, zvláště přibližně prvních 100 až 110 aminokyselin N-konce.

Podle předkládaného vynálezu zahrnuje jedno provedení antigen nebo antigeny odvozené z HPV jak bylo popsáno výše. Vynález s výhodou zahrnuje fuzní proteiny zahrnující protein D - E6 HPV 16, protein D - E7 HPV 16, protein D - E7 HPV 18 a protein D 20 E6 HPV 18. Část proteinu D s výhodou zahrnuje první 1/3 proteinu D.

Proteiny podle předkládaného vynálezu se s výhodou exprimují v E. Coli. Ve výhodném provedení se proteiny exprimují s histidinovým přídavným řetězcem, který obsahuje mezi 5 až 9 a s výhodou 6 zbytků histidinu. Tyto zbytky jsou výhodné pro usnadnění čištění. Popis výroby těchto proteinů se úplně popisuje v související UK patentové přihlášce No. GB 9717953.5.

Ve výhodném provedení obsahuje vakcína podle vynálezu navíc virový antigen Varicella zoster (VZV). Vhodné antigeny VZV pro použití ve vakcíně zahrnují antigeny gpl-V popsané v Longnecker a další,

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 4304 - 4307 (1987).

»· »···

- 14 Ve výhodném provedení se používá gpl (viz Ellis a další, US patent 4,769,239 a evropský patent No. EP-B-0 405 867).

V dalším výhodném provedení obsahuje vakcína podle vynálezu navíc antigen lidského cytomegaloviru (HCMV). HCMV je lidský DNA virus patřící do skupiny herpes virů. HCMV je endemický ve většině světadílů. HCMV je odpovědný za vážné zdravotní potíže u dvou populačních skupin. HCMV je hlavní příčinou vrozených defektů u novorozenců. Druhou ohroženou populací jsou pacienti s oslabenou imunitou, jako jsou pacienti trpící infekcí HIV a pacienti io s transplantacemi. Klinické onemocnění způsobuje řadu příznaků včetně horečky, hepatitidy, pneumonitidy a infekční mononukleózy. Výhodný antigen pro použití ve vakcíně proti HCMV je gB685**, jak se popisuje ve WO 95/31555. Imunogeny pro použití ve vakcínách proti HCMV jsou také poskytovány proteinem pp65, což je protein matrix

HCMV popisovaný ve WO 94/00150 (City of Hope).

V jednom výhodném provedení obsahuje vakcína podle vynálezu navíc jak antigen VZV, tak i antigen HCMV, zvláště antigeny popisované výše.

V dalším výhodném provedení obsahuje vakcína podle vynálezu 20 navíc antigen Toxoplasma gondii. Toxoplasma gondii je obligátní intracelulární protozoální parazi odpovědný za toxoplasmózu u teplokrevných živočichů, včetně člověka. Ačkoli obvykle probíhá u zdravých jedinců bez příznaků, toxoplasmóza může způsobit vážné komplikace u těhotných žen a pacientů s oslabenou imunitou. Výhodný antigen pro použití ve vakcíně proti Toxoplaxma gondii· je SAG1 (známý také jako P30) popisovaný ve WO 96/02654 nebo Tg34 popisovaný ve WO 92/11366.

V jednom výhodném provedení obsahuje vakcína podle předkládaného vynálezu navíc buď antigen VZV nebo antigen HCMV

3o kombinovaný s antigenem Toxoplasma gondii, zvláště s antigeny popsanými výše.

• ·

- 15 ·· *··· • · * ·· • 4 9

4 4 9

9 9

994 4 499

44

9 4

4 4

4 9

9 9 9

99

Ve výhodném provedení je vakcína podle předkládaného vynálezu multivalentní vakcína, například tetra- nebo pentavalentní vakcína.

Vakciny podle předkládaného vynálezu jsou velmi účinné při 5 vyvolávání ochranné imunity i při velmi nízkých dávkách antigenu (například pouze 5 pg rgD2t).

Tyto vakciny poskytují vynikající ochranu proti primární infekci a stimulují, s výhodou jak specifickou humorální (neutralizační protilátky) imunitní odpověď, tak i imunitní odpověď zprostředkovanou io efektorovými buňkami (DTH).

Předkládaný vynález poskytuje v dalším provedení vakcínu popisovanou výše pro použití v lékařství, zvláště pro použití při léčení nebo prevenci infekcí Herpes simplex a virem hepatitidy B.

Vakcína podle předkládaného vynálezu bude obsahovat 15 imunoprotektivní množství antigenů a může být připravena běžnými způsoby.

Příprava vakcín se obecně popisuje v publikaci Pharmaceutical Biotechnology, díl 61, Vaccine Design - the subunit and adjuvant approach, ed. Powell a Newman, Plenům Press, 1995, New Trends and Developments in Vaccines, ed. Voliér a další, University Park Press, Baltimore, Maryland, USA, 1978. Zapouzdření do liposomů se popisuje například v Fullerton, US patent 4,235,877. Konjugace proteinů s makromolekulami se popisuje například v Likhite, US patent 4,372,945 a v Armor a další, US patent No. 4,474,757.

Množství proteinu v každé dávce vakciny se volí jako množství, které indukuje v typických vakcínách imunoprotektivní odpověď bez výrazných nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství bude záviset na konkrétním použitém imunogenu. Obecně se očekává, že každá dávka bude obsahovat 1 až 1000 pg proteinu, s výhodou 2 až 100 pg, nejvýhodněji 4 až 40 pg. Optimální množství u konkrétní vakciny je • · 9999 ··

9 9 »

9 9 ♦

9 9 ·

9 9 9

99 • 9 9 9 9 ·9

9 9 · • 9 9 9 9 9

9 9 9

9999 9 999 999

- 16 možno určit standardními studiemi, jejichž součástí je pozorování titrů protilátek a jiných reakcí pacienta. Po počáteční vakcinaci mohou pacienti dostat zesilující dávku v průběhu přibližně čtyř týdnů.

Navíc k vakcinaci osob vnímavých na virové infekce HSV nebo 5 HBV mohou být farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu pro imunoterapii pacientů trpících uvedenými virovými infekcemi.

V dalším provedení předkládaného vynálezu se poskytuje způsob výroby, přičemž tento způsob zahrnuje míšení herpetického io virového antigenu a virového antigenu hepatitidy B s adjuvans indukujícím odpověď TH1, například 3D-MPL, a s výhodou nosiče, například kamence (alum).

V případě potřeby mohou být přidány další antigeny v jakémkoli vhodném pořadí, čímž se získají multivalentní vakciny popisované v přihlášce.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Studie imunogenicity s kombinací gD + HBs

Předmětem této studie bylo ukázat uskutečnitelnost kombinace

HSV gD/HBV HBs ve formulaci AI(OH)₃/3D-MPL. Byly porovnávány imunitní odpovědi indukované u morčat imunizací těmito antigeny použitými samostatně nebo v kombinaci. HBs je zkratka pro povrchový antigen hepatitidy B, konkrétně protein S, jak byl popsán výše. gD je zkratka pro rgD₂t popsaný výše.

Protokol experimentu

Protokol experimentu byl následující. Skupina šesti samic morčat Hartley dostala intramuskulární injekci v den 0 a den 28 obsahující následující formulace:

······ · · · · ·· • · · · · · · ·*·« • · · · ···« • · · · ······ • · · · · · · · ···· · ··· ··· ·· ··

- 17 - skupina 1: HBs 5pg/AI(OH)₃ 125 pg/3D-MPL 12,5 pg

- skupina 2: gD 5pg/Ai(OH)₃ 125 pg/3D-MPL 12,5 pg

- skupina 3: HBs 5pg + gD 5 pg/AI(OH)₃ 125 pg/3D-MPL 12,5 pg

- skupina 4: HBs 5pg + gD 5 pg/AI(OH)₃ 125 pg/3D-MPL* s 12,5 pg * odlišná šarže 3D-MPL

Po 14 a 31 dnech po druhé imunizaci byly zvířatům odebrány vzorky krve. Humorální imunitní odpověď proti HSV gD a HBV HBs io byla vyhodnocována metodou ELISA v obou těchto časech.

Na HBs byly také vyhodnocovány hypersenzitivitní reakce zpožděného typu (DTH). Experiment spočíval v intradermální injekci 10 pg HBs v duplikátu. Vývoj reakcí DTH byl monitorován měřením tloušťky kůže v čase 0, 24 a 48 hod po injekci.

Výsledky

1. Odpovědi protilátek

Titry ELISA anti-gD jsou ukázány na obr. 1. Titry anti-gD ve skupině imunizované gD byly srovnatelné s titry indukovanými u zvířat imunizovaných kombinací gD + HBs. Přítomnost HBs ve formulaci neovlivnila indukci odpovědí protilátky anti-gD.

Podobně byly titry protilátky anti-HBs srovnávány u zvířat imunizovaných samotným HBs nebo v kombinaci s gD. Obr. 2 ukazuje, že u zvířat imunizovaných samotným HBs nebo imunizovaných kombinací HBs + gD byly pozorovány srovnatelné titry protilátky antiHBs.

Výsledky jsou ukázány v obr. 1 až 4, ze kterých lze vyvodit závěr, že v testované formulaci indukuje kombinace gD/HBs

- 18 srovnatelné odpovědi protilátek, jako odpovědi indukované stejnými antigeny použitými samostatně, a odpovědi DTH na HBs jsou srovnatelné s odpověďmi indukovanými samotným HBs. Nejsou tedy žádné významné rozdíly v odpovědích DTH na HBs u zvířat vakcinovaných HBs nebo HBs + gD. Přítomnost gD tedy neovlivnila odpověď DTH na HBs.

Příklad 2: Experiment PRQ30 s kombinací HBV/HSV

Předmětem této studie bylo vyhodnotit v modelu HSV na morčeti io ochrannou účinnost kombinace HSV gD + HBV HBs ve formulaci 3DMPL/hydroxid hlinitý (alum) ve srovnání se samotným gD ve formulaci 3D-MPL/hydroxid hlinitý. Formulace 3D-MPL/ hydroxid hlinitý obsahuje hydroxid hlinitý(10 % hmotnostních) s 3D-MPL (1 díl hmotnostní).

Protokol experimentu

Skupiny 12 samic morčat Hartley byly imunizovány následujícími formulacemi nebo ponechány bez ošetření.

Formulace gD + HBs/3D-MPL/alum	go (5 pg)	AI(OH)3 (62,5 pg)	3D-MPL (6,25 pg)
	+ HBs (5 pg)	+ AI(OH)3 (62,5 pg)	+ 3D-MPL (6,25 pg)
Formulace gD /3D-MPL/alum	gD (5 pg)	AI(OH)3 (125 pg)	3D-MPL (12,5 pg)

Zvířata byla imunizována intramuskulárně dvakrát ve dnech 0 a 28. Bylo jim intravaginálně podáno 10⁵ pfu viru HSV2 kmene MS (100 pl) v den 57 (1 měsíc po druhé imunizaci) a denně byla • · · · • · monitorována na klinické známky primárního (dny 4 až 12 po infekci) a recidivujícího (dny 13 až 39 po infekci) onemocnění. Indukovaná ochrana byla měřena podle několika kritérií popisovaných v tabulce 1 stejně jako křivkami kumulativního hodnocení.

Séra odebíraná ve dnech 14 a 28 po druhé imunizaci byla také testována na titry protilátek anti-gD metodou ELISA (vyjádřeno jako EU/ml); séra získaná v den 28 po druhé imunizaci byla rovněž testována na neutralizační aktivitu HSV („NEUTRA“; titry odpovídají převráceným hodnotám zředění séra poskytujícího stoprocentní w ochranu proti cytopatickým účinkům HSV2.

Výsledky

Sérologické výsledky

Údaje o imunogenicitě se uvádějí v následující tabulce a obr. 5.

Poměr Neutra/ELISA v den 28 po druhé imunizaci
Formulace	ELISA (GMT)	NEUTRA (GMT)	Poměr NEUTRA/ELISA
Formulace gD + HBS/3D- MPL/alum	6687	238	3,5 %
Formulace gD/3D- MPL/alum	7475	200	2,7 %

Podobné výsledky ELISA a neutralizačních titrů byly indukovány kombinací gD (5 pg) + HBs (5 pg) ve formulaci 3D-MPL/alum a formulaci gD/3D-MPL/alum.

• · · ·

- 20 - ...........

Ochrana proti primárnímu onemocnění

Jak je ukázáno na obr. 6 (křivky kumulativního hodnocení) a v tabulce 1 níže, formulace obsahující kombinaci gD + HBs/3DMPL/alum poskytovala stejně dobrou ochranu proti primárnímu onemocnění jako formulace samotný gD v 3D-MPL/alum.

Ochrana proti recidivujícímu onemocnění

Ochrana proti recidivě herpetického onemocnění je ukázána na obr. 7 (křivky kumulativního hodnocení) a v tabulce 2 níže. Kombinace w gD + HBs/3D-MPL/alum poskytovala dobrou ochranu proti recidivujícímu onemocnění stejně jako samotný gD ve formulaci 3DMPL/alum.

Ve skupinách gD + HBs a samotný gD došlo k podobnému počtu recidiv u zvířat. V průběhu pozorovacího období (den 13 a 39 po testovacím podání) došlo k více než jedné recidivě u přesně stejného počtu zvířat těchto dvou skupin. U zvířat s recidivami byla pozorována stejná vážnost poškození.

• · · · • · · · • · « · <N

Tabulka 1: Primární onemocnění

Primární onemocnění	Vážnost poškození*	c	CO	CM	O V
% proti kontrole	-96 %	-22 %
Medián	0,50	9,00	LD O
Index Pl **		25,0 - 96 %	50,0 - 91 %	587,5
Výskyt vnějších poškození 0/ /0		8,3	16,7	75,0
Výskyt vaginálních poškození %		Γ'- cd T“	0,0	CO co
Zvířata bez poškození		75,0	83,3	cd
Formulace i 1			gD/3D- MPL/alum	gD + HBs/3D- MPL/alum	Kontrola
CZ			’Τ- CM	V- cm	T- CM
Skupina			-	CM	CO

xz + 2 Q Q- cn

CD c __ »Φ CL

S ³ 'CD í= ω

CD >Φ c

c

0)

N

O ’</)

O

CL

N

Φ xa ro ro

JU.

>

N (0 cz ‘CD >

o >N

CD >

Z3

O ω

o

Φ .E o

CL

CM ω

>» c

Ό

O i_

CL

CZ

0)

N

O »c/a o

cl c

Φ o

o c

TZ o

XZ

-4Φ >o

O ω

O xa

Φ c

xf cs >»

JU.

‘>J xz o

Z3

CL

CZ >N

O >ω >φ cz >

CD v

O xa φ

cz co xf

Cm o

Φ xa o

T3 φ

>

CM — CD E φ

>

_CD >» xa

Q oa £

>

N

Z3

O >

•o φ

N

O

CL o

X3

Φ cz

LO o~ c

Φ

N

O bZ >(/)

O

CL c

‘CD c

cn

CD >

cz

Φ

N

O ></)

O

CL

N

Φ ω

c φ

N

O >W

O

CL

Έ

Φ

O o

c

TZ

O

X

	u. o	c Φ N O	CD CZ
LD	E CD	‘CD >
O	ω		už k_
		>ω	O
o	‘CD	o	N
	cz	CL	O
II	CD >	_CD	CL
Φ O	O N C	CD > O	C Φ N
	Z3		O
z—	E
vp	w >»	>(/) O
>	CD	>	CL
>> čé.	ro >o	Φ w	CD >»
(/)	δ	•4—1 CD	xa
>	£		Q
		>	CO
X	—	N

£ O

	CD
c	-4—>
Φ
O	ω
O	X
CZ tz	X
o XZ	+
c	Q
	oa
‘CD
E	o
X	CD
CD	CZ
E	xa
	E
CD	o
E
Z3 W	‘CD
C
II	CD
Φ o	> O N
Φ	’cz
i+—	Z3
.E	£
Έ	CD
‘CD	-4—·
E	CD >O
CL	O
X	E
Φ Ta c	2éC CD
*
*	LO

cz o

>>

c ’>w ><1) >

O

O

E *—I

CD

N >

CD

X

Έ ‘CD

TZ

O

CL

CD w

‘Φ c

CD >

O

N

C

ZZ >φ

CL za (Λ

Φ >

CM

Ξ co o CD >

O

CD

CZ)

CQ

X • · · · « • · * · » · · · » · · · • · · ·

Tabulka 2: Recidivující onemocnění

Recidivující onemocnění	Zvířata s recidivou	Trvání	c		xr	CD
Medián	4,00	3,50	I 6,00
Vážnost poškození *	c	LO	'N·	CD
% proti kontrole	-57 %	-21 %
Medián	3,00	5,50	7,00
více než 1 recidiva %		16,6	16,6	50
celkové poškození 0/ /0	Γ-- V“	33,3	75,0
s výskytem Pí % i	16,7	8,3	75,0
bez výskytu Pí %	25,0	25,0	0,0
Zvířata bez recidivy	celkem 0/ /0	58,3	66,7	25,0
s výskytem Pí %	8,3	co co	8,3
Formulace			gD/3D- MPL/alum	gD + HBs/3D- MPL/alum	Kontrola
c			CM	CN	CN

PÍ = výskyt primárního onemocnění

- 23 Příklad 3

Předmětem této studie je vyhodnotit sérologické imunitní odpovědi indukované u myši kombinační vakcínou obsahující HAV, HBs a gD formulované se solemi hliníku a 3D-MPL. Složka hepatitidy A použitá v tomto příkladu (a zkracovaná jako „HAV“) byla inaktivovaný kmen HM175, který se nalézá ve vakcíně Havrix.

Materiály a metody

Šarže antigen/3D-MPL:

HBs: Al: 4550 pg/ml, předadsorbovaný HBs: 227,62 pg/ml HAV: Al: 1380 pg/ml, HAV: 25230 EU/ml gD: 493 pg/ml

3D-MPL: 957 pg/ml

Postup formulace

Skupina 1: HBs AIPO₄/3D-MPL HBs/H₂O/NaCI/fenoxy/AIPO₄ 15 min + 3D-MPL 1 hod Skupina 2: gD AIOH₃/3D-MPI_

H2O/AIOH3 5 min + gD 15 min + 3D-MPL 30 min + PBS 15 min + fenoxy

Skupina 3: HAV AIOH₃/3D-MPL

H2O/NaCI/fenoxy 5 min + AIOH₃/HAV 30 min/3D-MPL

Skupina 4:

1. H₂O/NaCI/fenoxy 5 min + AIPO₄/HBs 5 min + 3D-MPL 30 min

2. gD/AIOH₃ 15 min + 3D-MPL 30 min • · · · * · ♦ « · 9

9 ·

- 24 Míchat 1 a 2 20 min + HAV 1 hod.

Odečítání sérologickych výsledků

Kvantifikace protilátek anti-HBs a anti-gD byla prováděna metodou ELISA s použitím HBs nebo gD jako antigenu v povlaku. Roztoky antigenu a protilátky byly použity v množství 50 μΙ na jamku. Antigen byl zředěn na konečnou koncentraci 1 pg/ml v PBS a byl adsorbován přes noc při 4 °C na jamky v 96 jamkových mikrotitračních destičkách (Maxisorb Immunoio plate, Nunc, Dánsko). Destičky byly potom inkubovány 1 hodinu při 37 °C s PBS obsahujícím 1% bovinní sérový albumin a 0,1% Tween 20 (saturační pufr). Do destiček potažených antigenem byla přidána séra v dvojnásobném zředění saturačním pufrem a byla inkubována 1 hod 30 min při 37 °C. Destičky byly čtyřikrát is promyty PBS s 0,1% Tweenem 20 a do každé jamky byl přidán anti-myší Ig konjugovaný s biotinem (Amersham, UK), zředěný v poměru 1/1000 v saturačním pufru a směs byla inkubována 1 hod 30 min při 37 °C. Po kroku praní byl na dalších 30 min při 37 °C přidán komplex streptavidin-biotinylovaná peroxidáza (Amersham, UK), ve zředění 1/5000 nebo 1/1000 v saturačním pufru (pro HBs, popřípadě anti-gD ELISA). Destičky byly promyty jako výše a inkubovány 20 min s roztokem o-fenylen-diaminu (Sigma) 0,04%, H₂O₂ 0,03% v 0,05M citrátovém pufru pH 4,5 s 0,1 % Tweenem 20. Reakce byla zastavena 2N H₂SO₄ a odečítána při 492/620 nm. Titry ELISA byly vypočteny z reference programem SoftmaxPro (s použitím rovnice o čtyřech parametrech) a vyjádřeny v EU/ml.

Kvantifikace protilátky anti-HAV byla prováděna testem Enzymun ELISA (Boehringer) podle protokolu výrobce.

- 25 • · * · · «· « • · · · · · • ·«···· • · ♦ · « · • •4 ··· · · · ·

Protokol experimentu

Skupiny sedmi myší Balb/C byly imunizovány intramuskulárně následujícími formulacemi (odpovídající 1/10 dávky pro člověka):

1. HBs (2 pg)/AIPO₄ (50 pg)/3D-MPL (5 pg)

2. gD (2 pg)/AI(OH)₃ (50 pg)/3D-MPL (5 pg)

3. HAV (72 EU)/AI(OH)₃ (50 pg)/3D-MPL (5 pg)

4. HAV (71 U)/AI(OH)₃ (5 pg)+HBs (2 pg)/AIPO₄ (40 pg)/3D-MPL (2,5 pg)+gD (2 pg)/AI(OH)₃ (5 pg)/3D-MPL (2,5 pg) io Zvířata byla imunizována dvakrát v den 0 a 21 50 pl vakcíny.

V různých časových odstupech po imunizaci byla odebírána séra (21 dnů po první imunizaci a 14 dnů po druhé imunizaci), která byla testována na titry protilátek anti-HAV, HBs a gD.

Výsledky

Jednotlivé údaje z času 21 dnů po první imunizaci a 14 dnů po druhé imunizaci jsou ukázány v tabulce 3 a shrnuty níže:

• ·· ·· • · · · · ·

Β · Β Β · • · · · Β Β

Β ΒΒΒΒ ••Β «Β ·»

- 26 Tabulka 3

	Odpověď anti-HBs (EU/ml)	Odpověď anti-HAV (mlU/ml)	Odpověď anti-gD (EU/ml)
14 dnů po 1 .imun.	14 dnů po 2.imun.	14 dnů po 1 .imun.	14 dnů po 2.imun.	14 dnů po 1 .imun.	14 dnů po 2.imun.
Skupina 1 DHB56A2:	HBs 20/PO4/3D-MPL 50
	659	127 282
	935	165 796
	979	118 574
	934	55 063
	1606	102 040
	879	90 388
	409	39 447
GMT	880	75015
Skupina 2 gD 20/OH/3D-MPL 50
					989	149 616
					1150	97 672
					564	61 866
					1087	100 172
					805	73 340
					1135	186 113
					598	122 633
GMT					871	106 123

- 27 Tabulka 3 - pokračování

Skupina 3 HAV 720/OH/3D-MPL 50
			20	20
			20	20
			20	41
			20	20
			20	37
			20	20
			20	20
GMT			20	25
Skupina 4 HAV 720/OH-HBs 20/PO4/3D-MPL 25-gD 20/OH/3D-MPL 25
	88	63 427	25	272	202	61 711
	336	72 765	20	28	1166	105 676
	395	78 781	20	498	730	65 277
	474	99 881	20	380	819	62 107
	890	112 439	20	20	395	76 378
	542	120 652	20	20	493	54 908
	1020	41 460	20	20	345	35 466
GMT	414	79 699	21	91	549	69 312

Sérologické výsledky HBs

Skupina	Titry anti-HBs ELISA (EU/ml)
	Po 1. imunizaci	Po 2. imunizaci
HBs AIPO4 3D-MPL	880	75 015
HAV AI(OH)3/HBs AIPO4 3D- MPL/gD AI(OH)3 3D-MPL	414	76 699

Β· ΒΒΒΒ

- 28 Sérologické výsledky gD

Skupina	Titry anti-gD ELISA (EU/ml)
	Po 1. imunizaci	Po 2. imunizaci
gD AI(OH)3 3D-MPL	871	106 123
HAV AI(OH)3/HBs AIPO4 3D- MPL/gD AI(OH)3 3D-MPL	549	69 312

Sérologické výsledky HAV

Skupina	Titry anti-HAV ELISA (mlU/ml)
	Po 1. imunizaci	Po 2. imunizaci
HAV AI(OH)3 3D-MPL	20	25
HAV AI(OH)3/HBs AIPO4 3D- MPL/gD AI(OH)3 3D-MPL	21	91

Závěry

V kombinované vakcíně a HBs vakcíně obsahující soli hliníku a 3D-MPL byly pozorovány srovnatelné titry protilátky anti-HBs.

V kombinované vakcíně a gD vakcíně obsahující soli hliníku a 3D-MPL byly pozorovány srovnatelné titry protilátky anti-gD.

- V kombinované vakcíně a HAV vakcíně obsahující soli hliníku a 3D-MPL byly pozorovány srovnatelné titry protilátky anti-HAV.

Zdá se tedy, že v případě, že jsou kombinovány HBs, gD a HAV ve vakcíně s obsahem solí hliníku a 3D-MPL, nedochází k interferenci.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje

   5 a) virový antigen hepatitidy B, neboli HBV; a

   b) virový antigen herpes simplex, neboli HSV ve spojení s adjuvans, kterým je preferenční stimulátor buněčné odpovědi typu TH1, přičemž antigen HBV a antigen HSV nejsou spolu kovalentně spojeny.
2. 2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e navíc obsahuje nosič.
3. 3. Vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se

   15 tím, že preferenční stimulátor buněčné odpovědi typu

   TH1 je zvolen ze skupiny adjuvans zahrnující: 3D-MPL, 3DMPL, kde velikost částic 3D-MPL je s výhodou menší než 100 nm, QS21, směs QS21 a cholesterolu, a oligonukleotid CpG.

   20
4. 4. Vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e preferenčním stimulátorem buněčné odpovědi TH1 je 3DMPL.
5. 5. Vakcína podle některého z nároků 1 až 4, v y z n a č u j i c i se tím, že antigenem hepatitidy B je povrchový antigen hepatitidy B.
6. 6. Vakcína podle některého z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že antigenem HSV je HSV2 gD nebo jeho zkrácená forma.

   5
7. 7. Vakcína podle některého z nároků 1až6, vyznačující se tím, že dále je přítomen antigen EBV.
8. 8. Vakcína podle nároku 7, vyznačující se tím, ž e antigenem EBV je gp 350.

   w
9. 9. Vakcína podle některého z nároků 1až6, vyznačující se tím, že dále je přítomen antigen hepatitidy A.
10. 10. Vakcína podle nároku 9, vyznačující se tím,

    15 že antigen HAV je odvozený z kmene HM-175.
11. 11. Vakcína podle některého z nároků 1až6, vyznačující se tím, že navíc je přítomen antigen lidského papilomaviru neboli HPV.
12. 12. Vakcína podle nároku 11, vyznačující se tím, ž e antigen HPV je zvolen z následující skupiny: L1, L2, E6, E7, protein D-E6, protein D-E7 nebo L2-E7.

    25
13. 13. Vakcína podle některého z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že nosič je zvolen ze skupiny hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a tokoferol a emulze typu olej ve vodě.

    *· ···«
14. 14. Vakcína podle některého z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že navíc obsahuje antigen VZV.

    5 15. Vakcína podle nároku 14, vyznačující se tím, že antigenem VZV je gpl.

    16. Vakcína podle některého z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že navíc obsahuje antigen o HCMV.

    17. Vakcína podle nároku 16, vyznačující se. tím, ž e antigenem HCMV je gB685** nebo pp65.
15. 15 18. Vakcína podle některého z nároků 1 až 17, vyznačující se tím, že navíc obsahuje antigen Toxoplasma gondii.
16. 19. Vakcína podle nároku 18, vyznačující se tím,
17. 20 že antigenem Toxoplasma gondii je SAG1 nebo TG34.

    20. Vakcína podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že obsahuje S antigen HBsAg a HSV2gDt a popřípadě navíc jeden nebo více EBV gp 350; VZV gpl;
18. 25 inaktivovaný kmen HAV HM-175; L1, L2, E6, E7, protein D-E6, protein D-E7 nebo L2-E7 viru HPV; gB685** nebo pp65 víru HCMV a antigeny SAG1 nebo TG34 Toxoplasma gondii.