CZ20003421A3 - DNA sekvence kódující protein asociovaný s RIP, protein kódovaný touto sekvencí a způsoby jeho použití - Google Patents

Abstract

Řešení popisuje nový protein ovlivňující nebo zprostředkující intercelulámí aktivitu RIP při drahách přenosu signálu vedoucích k zánětu, buněčnému přežívání nebo buněčné smrti. Dále popisuje DNA kódující uvedený protein ajeho použití.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně týká receptorů z TGF/NGF superrodiny a kontroly jejich biologických funkcí. Do TGF/NGF superrodiny receptorů patří receptory jako jsou p55 a p75 receptory pro faktor nekrosy nádorů (TNF-R, zde označované jako p55-R a p75-R) a FAS ligandové receptory (také označované FAS/APO nebo FAS-R a zde označované jako FAS-R) a jiné.

Přesněji se předkládaný vynález týká nových proteinů, které se váží na jiné proteiny, které se váží přímo nebo nepřímo na členy rodiny TNF/NGF receptorů a na jiné intracelulární modulační proteiny.

Ještě přesněji se vynález týká jednoho takového proteinu, který je zde označen jako RAP-2 (protein 2 asociovaný s RIP) a jeho izoforem, fragmentů a derivátů, stejně jako proteinů, které se váží na RAP-2.

RAP-2 se váže na RIP (protein interagující s receptorem) a může ovlivňovat funkci RIP a tak také ovlivňovat nebo zprostředkovat, přímo nebo nepřímo, funkci jiných proteinů, které se váží přímo nebo nepřímo na RIP. RAP-2 vazebné proteiny jsou modulátory/mediátory funkce RAP-2.

Dosavadní stav techniky

Faktor nekrosy nádorů (TNF-α) a lymfotoxin (TNF-β) (zde dále označuje TNF jak TNF-α, tak TNF-β) jsou multifunkční prozánětlivé cytokiny vytvářené zejména v mononukleárních fagocytech, které mají mnoho různých vlivů na buňky (Wallach,

4

D, 1986, v: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), str. 83-122, Academie Press, London; a Beutler and Cerami, 1987. Jak TNF-a, tak TNF-β zahajují své působení vazbou na specifické receptory na buněčném povrchu. Některé jejich účinky jsou patrně pro organismus příznivé: mohou například ničit nádorové buňky nebo buňky infikované viry a mohou posilovat antibakteriální aktivitu granulocytů. Tímto způsobem přispívá TNF k obraně organismu proti nádorům a infekčním agens a přispívá k hojení při poranění. Proto může být TNF použit jako protinádorové činidlo a v této aplikaci se váže na své receptory na povrchu nádorových buněk a tak spouští děje vedoucí ke smrtí nádorových buněk. TNF může být použit také jako antiinfekční činidlo.

Nicméně, jak TNF-α, tak TNF-β mají také škodlivé účinky. Existuje důkaz, že nadměrná produkce TNF-α může hrát hlavní patogenetickou úlohu při několika onemocněních. Například je známo, že účinky TNF-α na cévní systém jsou hlavní příčinou příznaků septického šoku (Tracey et al., 1986). U některých onemocnění může TNF způsobovat neúměrnou ztrátu hmotnosti (kachexii) tím, že potlačuje aktivitu adipocytů a způsobuje anorexii a proto byl TNF-α označován také jako kachexin. Bylo také popsáno, že je mediátorem poškození tkání při revmatických onemocněních (Beutler and Cerami, 1987) a že je hlavní mediátor poškození pozorovaného při reakcích štěpu proti hostiteli (Piquet et al., 1987). Dále je známo, že se TNF účastní zánětlivých procesů a mnoha jiných onemocnění.

Výše uvedené biologické účinky TNF zprostředkují a/nebo iniciují dva odlišné, nezávisle exprímované receptory, p55 a p75 TNF-R, které specificky váží TNF-α i TNF-β. Tyto dva receptory mají strukturálně odlišné intracelulární domény, což • · naznačuje, že přenášení signál odlišným způsobem (viz Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Loetscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al. , 1990; Smith et al., 1990; a Heller et al., 1990) . Nicméně, buněčné mechanismy, například různé proteiny a snad jiné faktory, které se účastní intracelulárního přenosu signálu z p55 a p75 TNF-R, nejsou dosud známy. Tento intracelulární přenos signálu, ke kterému dochází po vazbě ligandu, t.j. TNF (a nebp β) na receptor, je odpovědný za spuštění kaskády reakcí, které ve svém důsledku vedou k pozorované odpovědi buněk na TNF.

Výše uvedený cytocidní efekt TNF je, u většiny dosud studovaných buněk, spouštěn zejména p55 TNF-R. Protilátky proti extracelulární doméně (doméně vážící ligand) pp55 TNF-R mohou sami spouštět cytocidní efekt (viz EP 412486), který koreluje s účinností zesítění receptorů protilátkami, které je pravděpodobně prvním stupněm při přenosu intracelulárního signálu. Dále, mutační studie (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) ukázaly, že biologická funkce p55 TNFR závisí na integritě jeho intracelulární domény. Proto byla vyslovena hypotéza, že iniciace intracelulární signalizace vedoucí k cytocidnímu účinku TNF nastává v důsledku asociace dvou nebo více intracelulárních domén p55 TNF-R. Kromě toho, TNF (a a β) se vyskytují jako homotrimery a proto se soudí, že indukce intracelulární signalizace prostřednictvím p55 TNF-R probíhá díky schopnosti TNF vázat se na a způsobovat zesítění receptorových molekul, t.j. způsobovat agregaci receptorů.

Jiným členem TGF/NGF superrodiny receptorů je FAS receptor (FAS-R), který byl také označován jako FAS antigen, což je buněčný povrchový protein exprimovaný v mnoha tkáních, který vykazuje homologii s mnoha povrchovými buněčnými receptory, včetně TNF-R a NGF-R. FAS-R zprostředkuje buněčnou smrt ve formě apoptosy (Itoh et al., 1991) a zdá se, že slouží jako negativní selekční faktor pro autoreaktivní T lymfocyty, t.j.

že v průběhu zrání T lymfocytů zprostředkuje FAS-R apoptotickou smrt T lymfocytů rozpoznávajících vlastní antigeny. Také bylo zjištěno, že mutace FAS-R genu (lpr) způsobují lymfoproliferativní onemocnění u myší, která napodobují lidské autoimunitní onemocnění systémový lupus erythematodes (SLE) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). Ligand pro FAS-R se zdá být molekulou buněčného povrchu přítomnou, mimo jiné, na Tkiiier lymfocytech (nebo cytotoxických T lymfocytech - CTL), proto když dojde ke kontaktu takových CTL s buňkami nesoucími FAS-R, mohou CTL indukovat apoptosu buněk nesoucích FAS-R. Také byly připraveny monoklonální protilátky specifické pro FAS-R a tyto monoklonální protilátky byly schopné indukovat apoptosu buněk nesoucích FAS-R, včetně myších buněk transformovaných cDNA kódující lidský FAS-R (Itoh et al., 1991) .

Vynálezci objevili mnoho přístupů (viz Evropské patentové přihlášky č. EP 186833, EP 308378, EP 398327 a EP 412486) pro regulaci škodlivých účinků TNF pomocí inhibice vazby TNF na jejich receptory za použití anti-TNF protilátek nebo solubilních TNF receptorů, které soutěží s TNF o vazbu na TNFR buněčné membrány. Kromě toho, vzhledem k tomu, že vazba TNF na jejich receptory je nutná pro TNF-indukované účinky na buňku, pokoušeli se vynálezci (viz například EP 568925) modulovat vliv TNF pomocí modulování aktivity TNF-R.

Stručně, EP 568925 se týká způsobu pro modulování přenosu signálu a/nebo štěpení TNF-R, ve kterém mohou peptidy nebo jiné molekuly interagovat s receptorem samotným nebo s efektorovými proteiny interagujícími s receptorem, což • · • * · · • · · « • · · · · « · · · moduluje normální funkci TNF-R. V EP 568925 je popsaná konstrukce a charakterizace různých mutantů p55 TNF-R, které mají mutace v extracelulární, transmembránové a intracelulární doméně p55 TNF-R. Tímto způsobem byly identifikovány regiony v doménách p55 TNF-R, které jsou zásadní pro funkci receptorů, t.j. pro vazbu na ligand (TNF) a pro následný přenos signálu a intracelulární signalizaci, která nakonec vede k pozorovaným účinkům TNF na buňky. Kromě toho je také popsáno mnoho přístupů pro izolaci a identifikaci proteinů, peptidů nebo jiných faktorů, které se mohou vázat na různé regiony ve výše uvedených doménách TNF-R, kde tyto proteiny, peptidy a jiné faktory se mohou účastnit regulování nebo modulování aktivity TNF-R. Mnoho postupů pro izolaci a klonování DNA sekvencí kódujících takové proteiny a peptidy; pro konstrukci expresních vektorů pro produkci těchto proteinů a peptidů; a pro přípravu protilátek nebo jejich fragmentů, které interagují s TNF-R nebo s výše uvedenými proteiny a peptidy, které se váží na různé regiony TNF-R, je také uvedeno v EP 568925. Nicméně, EP 568925 nespecifikuje konkrétné proteiny a peptidy, které se váží na intracelulární domény TNF-R (například p55 TNF-R), ani nepopisuje kvasinkový dvou-hybridní postup pro izolaci a identifikaci takových proteinů nebo peptidů, které se váží na intracelulární domény TNF-R. EP 568925 také nepopisuje proteiny nebo peptidy, které se váží na intracelulární domény FAS-R.

Ačkoliv je známo, že receptory pro faktor nekrosy nádorů (TNF) a strukturálně příbuzné FAS-R, spouští v buňkách - po stimulaci ligandy produkovanými leukocyty, destrukční aktivity, které vedou k jejich vlastnímu poškození, je tento spouštěcí mechanismus dosud málo znám. Mutační studie ukazují, že FAS-R a p55 TNF receptorové (p55-R) signalizace vedoucí k cytotoxicitě se účastní různé regiony v jejich tftf· • tftftftf • · intracelulárních doménách (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993). Tyto regiony (smrtící domény) mají podobnosti sekvence. Smrtící domény FAS-R a p55-R mají tendenci k samoasociaci. Tato samoasociace jasně podporuje agregaci receptoru, která je nutná pro inicializaci signalizace (viz Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al. , 1995) a vysoká úrověň exprese receptorů může vést ke spuštění signalizace, které není závislé na ligandů (Boldin et al., 1995).

Podobně jako jiné děje indukované receptory probíhá indukce buněčné smrti TNF receptory a FAS-R prostřednictvím série interakcí protein-protein, které vedou od vazby ligandů na receptor k případné aktivaci enzymatických efektorových funkcí, které byly hodnoceny ve studiích neenzymatických interakcí protein-protein inicializujících signalizaci pro buněčnou smrt: vazba trimerních TNF nebo FAS-R ligandových molekul na tyto receptory, vedoucí k interakci jejich intracelulárních domén (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh and Nagata, 1993) zvyšují pravděpodobnost samovolné asociace motivů (smrtících domén (Boldin et al, 1995a) a indukují vazbu dvou cytoplasmatických proteinů (které se také váží jeden na druhý) na intracelulární domény receptorů - MORT-1 (nebo FAD) na FAS_R (Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) a TRADD na p55-R (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Ve kvasinkovém dvouhybridovém vyhledávacím testu byly identifikovány tři proteiny, které se váží na intracelulární doménu FAS-R a p55-R v regionu smrtící domény účastnící se indukce buněčné smrti prostřednictvím receptorů, přes hetero-asociaci homologních regionů a které jsou, nezávisle, také schopné spouštěn buněčnou smrt.Jedním z nich je protein MORT-1 (Boldin et al., 1995b), též známý jako FADD (Chinnaiyan et al., 1995), který

se specificky váže na FAS-R. Druhým je TRADD (viz též Hsu et al., 1995, 1996), který se váže na p55-R a třetím je RIP (viz též Stanger et al., 1995), který se váže jak n a FAS-R, tak na p55R. Kromě vazby na FAS-R a p55-R se tyto proteiny mohou také vázat na sebe navzájem, což umožňuje funkční komunikaci mezi FAS-R a p55-R. Tato vazba probíhá přes konzervovaný motiv sekvence, modul smrtící domény, který je společný receptorům a jejich asociovaným proteinům. Dále, ačkoliv bylo ve kvasinkovém dvouhybridovém testu prokázáno, že MORT-1 se spontánně váže na FAS-R na savčích buňkách, probíhá tato vazba pouze po stimulaci receptorů, což naznačuje, že se MORT-1 účastní na iniciaci dějů FAS-R signalizace. MORT-1 neobsahuje žádný motiv sekvence charakteristický pro enzymatickou aktivitu a proto se zdá, že jeho schopnost spouštět buněčnou smrt nespočívá ve vlastní aktivitě MORT-1 samotného, ale spíše v aktivaci nějakých jiných proteinů, na které se MORT-1 váže a které působí dále v signalizační kaskádě. Bylo prokázáno, že buněčná exprese MORT-1 mutantů neobsahujících N-koncovou část molekuly blokuje cytotoxickou indukci způsobenou FAS-APO1 (FAS-R) nebo p55-R (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al.,

1996), což naznačuje, že tento N-koncový region přenáší signál pro cytocidní efekt obou receptorů prostřednictvím interakcí protein-protein.

Proto se zdá, že motivy smrtící domény receptorů p55-R a FAS-R, stejně jak jejich tři asociované proteiny MORT-1, RIP a TRADD, jsou místy interakcí protein-protein. Tři proteiny, MORT-1, RIP a TRADD, interagují s intracelulárními doménami p55-R a FAS-R prostřednictvím vazby svých smrtících domén na domény receptorů, a pro RIP a TRADD také platí, že jejich domény také samovolně asociují (ačkoliv MORT-1 se odlišuje v tom, že jeho smrtící doména nepodléhá samovolné asociaci). Kromě toho, MORT-1 a TRADD se různě váží na FAS-R a p55-R a « · « • · ·

• · · · · také se váží na sebe navzájem. Dále, jak MORT-1, tak TRADD se účinně váží na RIP. Proto se zdá, že interakce mezi těmito třemi proteiny, MORT-1, RIP a TRADD, je významnou, složkou celkové modulace intracelulární signalizace zprostředkované těmito proteiny. Interference interakcí mezi těmito třemi intracelulárními proteiny povede k modifikaci efektů způsobených těmito interakcemi. Například, inhibice vazby TRADD na MORT-1 může ovlivňovat interakci mezi FAS-R-p55 TNFR. Podobně, inhibice RIP společně s výše uvedenou inhibici vazby TRADD na MORT-1 může dále ovlivňovat interakci mezi FASR-p55 TNF-R.

Monoklonální protilátky namířené proti smrtící doméně p55-R, přesněji proti vazebnému místu TRADD a RIP, mohou být také použity pro inhibici nebo prevenci vazby těchto proteinů a tak k modulaci interakcí mezi FAS-R a p55-R.

Nedávno bylo zjištěno, že kromě výše uvedených cytotoxických aktivit a jejich ovlivnění zprostředkovaného různými receptory a jejich vazebnými proteiny včetně FAS-R, p55-R, TRADD, RIP, MACH, Mch4 a G, se mnoho z těchto receptoru a jejich vazebných proteinů účastní také modulace aktivity jaderného transkripčního faktoru NF-κΒ, který je klíčovým mediátorem životaschopnosti a přežívání buněk a který je odpovědný za kontrolu exprese mnoha genů imunitní a zánětlivé reakce. Například bylo zjištěno, že TNF-α může v buňce indukovat dva různé druhy signálů, kdy jeden vyvolává buněčnou smrt a druhý chrání buňku před indukcí smrti tím, že indukuje genovou expresi prostřednictvím NF-κΒ (viz Beg and Baltimore, 1996; Wang et al., 1996; Van Antwerp et al., 1996). Také byly popsány podobné dvojité účinky pro FAS-R (viz odkaz na tento efekt, jak je uveden v Van Antwerp et al., 1996). Proto se zdá, že existuje křehká rovnováha mezi buněčnou smrtí a • · · · · přežíváním buněk po stimulaci různých typů buněk TNF-α a/nebo FAS-R ligandy, kde konečný efekt závisí na tom, která intracelulární dráha je stimulována silněji, kdy jedna vede ke smrti buňky (obvykle k apoptose), a druhá vede k přežívání buňky prostřednictvím aktivace NF-kb.

Dále předkladatelé vynálezu nedávno hodnotili možnou dráhu, kterou členové TNF/NGF receptorové rodiny aktivují NF-KB (viz Malinin et al., 1997 a odkazy uvedené v této práci; a související Izraelská patentová přihlášky č. IL 117800 a IL 119133). Stručně, zdá se že několik členů TGF/NGF receptorové rodiny je schopno aktivovat NF-KB prostřednictvím společného adaptorového proteinu, TRAF2. Nově objevená proteinkinasa označená jako NIK viz Malinin et al., 1997 a IL 117800 a IL 119133) je schopná vazby na TRAF2 a stimulace NF-κΒ aktivity. Skutečně bylo prokázáno (viz Malinin et al. a IL aplikace), že exprese v mutantních buňkách s deficitem NIK kinasy vede k tomu, že buňky nejsou schopny stimulovat NF-κΒ normálním endogenním způsobem a také k tomu, že buňky mají blokovanou indukci NF-κΒ aktivity TNF, buď prostřednictvím FAS-R, nebo TRADD, RIP a MOT-1 (což jsou adaptorové proteiny, které se váží na tyto p55-R a/nebo AFS receptory). Receptory p55-R, p75-R, FAS-R a jejich adaptorové proteiny MORT-1, TRADD a RIP se všechny váží na TRAF2, který svou vazebnou schopností k NIK jasně moduluje indukci NF-kB.

Z výše uvedených modulačních proteinů, které se účastní jemné rovnováhy mezi buněčnou smrtí a přežíváním buněk po stimulaci FAS-R a/nebo p55-R, se zdá, že významnou úlohu má protein RIP. RIP (viz Stanger et al., 1995; a také Martini et al., 1997) obsahuje smrtící doménu ve svém C-koncovém regionu, díky které může indukovat buněčnou cytotoxicitu • · nezávislým způsobem a nebo také prostřednictvím asociace smrtící domény se smrtícími doménami MORT-1, p55-R, FAS-R a TRADD. RIP obsahuje na svém N-terminélním regionu proteinkinasovou doménu a střední doménu, která pravděpodobně umožňuje vazbu s TRAF2 a tak se účastní indukce NF-KB. Podrobnosti týkající se charakteristik a sekvencí (DNA a aminokyselinových) RIP jsou uvedeny ve výše uvedených publikacích (zejména ve Stanger et al., 1995), které jsou zde uvedeny jako odkazy.

TNF je také jedním z cytokinů účastnících se iniciace a modulace protivirové obrany hostitele. Podobně, viry si vyvinuly expresi genů, jejichž proteiny regulují aktivity cytokinů a předpokládá se, že tyto virové proteiny regulující cytokiny navozují persistenci viru ve zvířecím hostiteli. Jedním z nejlépe prostudovaných příkladů takových proteinů je E3-17.7K ze skupiny C lidských adenovirů (Ad) typů 2 a 5, který působí jako silný antagonista cytolýzy zprostředkované TNF.

Za účelem izolace molekulových složek signalizační kaskády TNF, které jsou cílem pro E3-14.7K při virové infekci, byl nedávno izolován lidský E3-14.7K vazebný protein pomocí dvouhybridového skríningu (FIP-2 podle Fourteen K Interacting Protein, Li, Y et al., 1998). Bylo zjištěno, že FIP-2 je sám o sobě netoxický a pro zvrácení protektivního účinku E3-14.7K na cytotoxicitu indukuje nadměrnou expresi TNFR-I nebo RIP, bez vazby na kterýkoliv z výše uvedených proteinů. Bylo zjištěno, že FIP-2 má určitou homologii s RAP-2, proteinem podle předkládaného vynálezu. Stupeň celkové podobnosti mezi RAP-2 a FIP-2 je však velmi nízký, jak je vidět z celkového sestavení dvou aminokyselinových sekvencí (obr. 3). Homologie je významnější ve specifických regionech směrem k C-konci ♦ · · • · <

• · · · « • · • · · · · ♦ 9 · · 9 9 ·· ·· · * · » ♦ · 9 · * « ♦ **···♦ * · · · · · • · · ♦ 9 · · « proteinů, která vrcholí v podstatě identitou 30 C-koncových aminokyselin. Je zajímavé, že kromě výše uvedené C-koncové domény je domnělý motiv leucinového prstu ve FIP-2 ve značné míře zachován v RAP-2 (s výjimkou substituce Ile za Ala).

Podobná sekvence označená jako HYPL - kódující protein související s Huntingtonovou nemocí, která se zdá být vzdáleným homologem RAP-2 - byla nedávno uložena v GenBank pod názvem protein interagující s huntingtinem, HYPL (přírůstkové č. AF049614). Nicméně, práce popisující funkci tohoto protein nebyly dosud publikovány.

Nedávná publikace od Yamaoka, S: et al., 1998, popisuje identifikaci myšího homologu RAP-2. Myší homolog NEMO (esenciální modulátor NF-KB) byl identifikován při výzkumu klíčových molekul, které regulují aktivaci NF-κΒ signalizace. Byla charakterizována úplná buněčná varianta HTLV-1 Taxtransformovaných krysích fibroblastů, označená 5R, která byla nereaktivní pro všechny testované NF-KB aktivační podněty (LPS, PMA, IL-1, TNF) a byla provedena genetická komplementace tohoto variantního proteinu. Tak byla získána cDNA kódující NEMO 48 kD protein. Podle těchto údajů je tento protein nepřítomný v 5R buňkách, je součástí komplexu Ικ-B kinasy s vysokou molekulovou hmotností a je nutný pro jeho vznik. In vitro může NEMO homodimerizovat a přímo interaguje s ΙΚΚβ.

Izraelská patentová přihláška č. 120485 popisuje RIPasociovaný protein, označený jako RAP, který se specificky váže na RIP a inhibuje indukci NF-kB.

Izraelská patentová přihláška č. 122758 popisuje jiný RIPasociovaný protein, označený jako RAP-2, který má stejné nebo ·· 9·

• 9 9 · • * · · ·

9 9 · • 999· · · « «

99·· · ··«

I ♦ ·« podobné aktivity.

RAP-2 podle předkládaného vynálezu je také označován jako

303 nebo RAP-303 nebo RAT-303. Dále bude v této přihlášce označován jako RAP-2.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je nový protein RAP-2, včetně jeho izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů, který se váže na RIP protein (dále označovaný jako RIP) . RIP může přímo nebo nepřímo interagovat s intracelulárními mediátory zánětu, buněčné cytotoxicity nebo buněčné smrti, jako je p55-R a FAS-R a jejich asociované adaptorové nebo modulátorové proteiny, jako je například MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, G1 a jiné, a nové proteiny podle předkládaného vynálezu mohou proto prostřednictvím vazby na RIP ovlivňovat intracelulární přenos signálu iniciovaný vazbou FAS ligandů na jejich receptor a TNF na jeho receptor (p55-R), a takové nové proteiny podle předkládaného vynálezu jsou modulátory efektů působících na buňku zprostředkovaných p55-R a FAS-R. RIP také může interagovat s TRAF2 a tak může interagovat přímo nebo nepřímo s NIK a jako takový působí RIP jako modulátor zánětu a buněčného přežívání, které obsahují indukci NF-KB a proto jsou nové proteiny podle předkládaného vynálezu modulátory zánětů a buněčného přežívání souvisejícího s RIP. Podobně, prostřednictvím FAS-R, p55-R a jejich modulačních proteinů MORT-1 a TRADD, které jsou schopny indukovat NF-κΒ a buněčné přežívání buď přímo, nebo nepřímo vazbou na RIP nebo vazbou na TRAF2, na který se RIP váže, mohou být proteiny podle předkládaného vynálezu také mediátory procesů buněčného přežívání působící prostřednictvím společných nebo příbuzných drah intracelulární signalizace, ve kterých výše uvedené • · ···· *

proteiny působí tak, že indukují přežívání buňky. Podobně, protože se p75-R váže na TRAF2, na který se váže RIP, mohou být proteiny podle předkládaného vynálezu také modulátory RIPovlivněného zprostředkování aktivity zprostředkované p75-R.

Jiným předmětem předkládaného vynálezu jsou antagonisté (například protilátky, peptidy, organické sloučeniny nebo i některé izoformy) výše uvedených nových RAP-2 proteinů, izoforem, analogů, fragmentů a jejich derivátů, které mohou být použity pro inhibicí přenosu signálu, nebo přesněji, zánětlivé buněčné cytotoxicity nebo procesů zapojených do přežívání buněk.

Dalším předmětem vynálezu je použití nových RAP-2 proteinů, izoforem, analogů, fragmentů a jejich derivátů pro izolaci a charakterizací dalších proteinů nebo faktorů, které mohou být zapojeny do regulace aktivity receptoru, například jiných proteinů, které se mohou vázat na RAP-2 proteiny a které mohou ovlivňovat jejich aktivitu, a/nebo pro izolaci a identifikaci jiných receptoru účastnících se uvedené dráhy přenosu signálu, na které se tyto nové proteiny, analogy, fragmenty a deriváty váží a proto také ovlivňují jejich funkci.

Vynález také obsahuje RAP-2 vazebné proteiny, které mohou modulovat/zprostředkovat funkci RAP-2.

Ještě dalším předmětem vynálezu jsou inhibitory, které mohou být vloženy to buněk, kde se mohou vázat na nebo interagovat s RAP-2 a možnými izoformami RAP-2, kde tyto inhibitory mohou inhibovat aktivitu spojenou s RIP v procesech buněčné cytotoxicity a tak mohou, pokud je to žádoucí, zesilovat přežívání buněk, nebo mohou inhibovat aktivitu spojenou s RIP v procesech přežívání buněk a tak mohou, pokud • ♦

je to žádoucí, zesilovat buněčnou cytotoxicitu.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je použití výše uvedených RAP-2 proteinů, ízoforem a analogů, jejich fragmentů a derivátů, jako antigenů pro přípravu polyklonálních a/nebo monoklonálních protilátek k těmto substancím. Protilátky mohou být potom použity, například, pro přečišťování nových proteinů z různých zdrojů, jako jsou buněčné extrakty nebo transformované buněčné linie.

Dále mohou být tyto protilátky použity pro diagnostické účely, například pro identifikaci onemocnění spojených s abnormální funkcí buněčných procesů zprostředkovaných p55-R, FAS-R nebo jinými příbuznými receptory.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou farmaceutické prostředky obsahující nové RAP-2 proteiny, izoformy a analogy, jejich fragmenty a deriváty, stejně farmaceutické prostředky obsahující výše uvedené protilátky nebo jiné antagonisty.

V předkládaném vynálezu byl izolován nový protein RAP-2. RAP-2 může interagovat s nebo se vázat na RIP a proto je modulátorem nebo mediátorem intracelulární aktivity RIP. RIP se účastní modulování nebo zprostředkování intracelulárního přenosu signálu, například signalizačních drah spojených s buněčnou cytotoxicitou nebo buněčnou smrtí, ve kterých má RIP cytotoxickou aktivitu sám o sobě nebo ve spojení - přímém nebo nepřímém - s jinými proteiny asociovanými s buněčnou smrtí, jako jsou například MORT-1, TRADD, MACH, Mch4, Gl, p55-R a FAS-R, se kterými se RIP může asociovat nebo na které se může vázat přímo nebo nepřímo prostřednictvím motivu/modulu smrtící domény, který je přítomen v RIP a ve všech výše zmíněných proteinech; jinou signalizační dráhou je dráha zánětu, ·♦ w • ♦ * « · · ·♦ ♦« « · > « • * · · * · · « · • · · · ·· ·« buněčného přežívání nebo životaschopnosti, ve které může mít RIP aktivační úlohu, buď přímo, nebo nepřímo prostřednictvím kinasového motivu nebo domény přítomného v RIP a schopnosti RIP se vázat na TRAF2, který se může vázat na NIK, který se nakonec přímo účastní aktivace NK-κΒ, který má centrální význam při zánětu a přežívání buněk. Kromě toho, p55-R může také interagovat s TRADD a TRAF2 (prostřednictvím TRADD) a také se předpokládá jeho účast při aktivaci NK-κΒ a tak v dráze buněčného přežívání, a proto se může RIP, který se váže na nebo interaguje s FAS-R, TRADD a p55-K (přes TARDD), stejně jako s TRAF2, také účastnit na modulování zánětu a buněčného přežívání těmito proteiny. Proto je RIP modulátor nebo mediátor těchto signalizačních drah a podobně je nový RAP-2 podle předkládaného vynálezu RIP modulátor nebo mediátor těchto signalizačních drah.

RAP-2 byl izolován a klonován za použití kvasinkového dvouhybridového systému, byl sekvencován a charakterizován a zdá se, jak je podrobněji uvedeno dále, že RAP-2 je vysoce specifický RIP vazebný protein a proto specifický modulátor/mediátor RIP. RAP-2 se neváže na TRADD, MORT-1, p55R, p75-R a MACH. Dále se zdá, že RAP-2 neobsahuje charakteristický modul smrtící domény, což je v souladu se zjištěním, že RAP-2 neindukuje sám o sobě cytotoxicitu.

Jak je použit v předkládaném vynálezu, označuje termín RIP aktivita jeho aktivitu v modulaci/zprostředkování zánětu a buněčné smrti/přežívání. Tyto aktivity jsou zde uvedeny výše a dále, stejně jako ve všech výše uvedených publikacích a patentových přihláškách, jejichž obsah je zde v celém rozsahu uveden jako odkaz. Podobně, jak je zde použit, označuje termín RAP-2 aktivita modulování/zprostředkování RIP aktivity prostřednictvím specifické vazby na RIP, kde toto

«4 : :

4

4 ♦ 4 4 • 4 4

4 4

4 4 4 4

4

4444 4 modulování/zprostředkování RIP aktivity RAP-2 zahrnuje modulování/zprostředkování přenosu signálu při zánětu, buněčné smrti a buněčném přežívání, kterého se přímo nebo nepřímo účastní RAP-2 a v tomto smyslu může být RAP-2 považován za nepřímý modulátor/mediátor všech výše uvedených proteinů a snad i mnoha dalších, které se účastní zprostředkování přenosu signálu při zánětu, buněčné smrti a buněčném přežívání a na které se váže RIP, nebo s kterými RIP přímo nebo nepřímo interaguj e.

Vynález také popisuje dva nové vazebné proteiny pro RAP-2, které byly identifikované pomocí dvouhybridového skríningu za použití kompletní proteinové sekvence RAP-2 jako zachycovací molekuly.

Za použití kompletního RAP-2 proteinu jako zachycovací molekuly ve dvouhybridovém testu byl identifikován nový protein interagující s RAP-2 označený v předkládaném vynálezu jako klon č.10 (nebo protein kódovaný klonem č.10 nebo RATvazebný protein č.10 nebo RBP-10). Získaná sekvence cDNA byla dále rozšířena za použití běžných sekvencovacích metod směrem k 5' konci, pro znovuvytvoření částečného otevřeného čtecího rámce proteinu, kterému však chybí start-kodon.

Dvouhybridový test vazebného repertoáru klonu č.10 ukázal, že tento protein se neváže pouze na RAP-2, ale má také dosti silnou afinitu k TRAF2. Klon č.10 se, nicméně, neváže na RIP, TRADD, MORT1, MACH, TNFR-1, TIP60 a NIK, stejně jako na několik kontrolních proteinů (například lamin a cyklin D). Nemůže být nicméně vyloučeno, že vazba klonu č.10 na NIK může být zjištěna v savčích buňkách, vzhledem ke zvláštnostem chování NIK v kvasinkách. Bylo prokázáno, že klon č.10 se váže na RAP-2 v C-koncových 200 aminokyselinách RAP-2, tj.

44

4 4 4

4 4 4

4 9 9 • · · 4 ♦· 44 • · *

»· ♦ « · · t · « • ·« ·· • » 4449 « *

949 v regionu, který není nutně asociován s vazbou RIP, TIP60, NIK a ΙΚΚβ. Tato sekvence umožňuje, nepřesně, provedení několika kol prohledávání GenBank za účelem identifikace homologů klonu č.10. Jediným proteinem vykazujícím významný stupeň podobnosti s proteinem kódovaným klonem č.10 byl F40F12.5 - hypotetická molekula z C. elegans, jehož fyziologická role není známá.

Je zajímavé, že F40F12.5 vykazuje určitou podobnost s několika členy vysoce konzervované rodiny proteas-řízených ubiquitinem. Tyto enzymy neutralizují destruktivní účinky ubiquitinačního aparátu, který se účastní většiny dějů spojených s degradací proteinů v buňce. Zatímco ubiquitinligasy jsou odpovědné za navázání polyubiquitinového řetězce na protein určený pro degradaci, ubiquitin-proteasy brání účinnému rozvětvení rostoucího řetězce. Předpokládaná funkce F40F12.5 založená na podobnosti s výše uvedenými proteasami řízenými ubiquitinem je nicméně sporná a dosud nebylo zjištěno, zda má tento protein jakoukoliv enzymatickou aktivitu vzhledem k ubiquitinovým polymerům. Kromě toho, několik skutečností činí takovou koincidenci dosti nepravděpodobnou:

(a) zbytky, o kterých se předpokládá, že tvoří jádro katalytického regionu v jakékoliv podtřídě ubiquitin-proteas, nejsou konzervované ani v F40F12.5, ani v klonu č.10;

(b) s výjimkou svých katalytických míst nevykazují enzymy z rodiny proteas řízených ubiquitinem z různých druhů (od bakterií a člověka) v podstatě žádnou podobnost sekvence, zatímco F40F12.5 a klon č.10 vykazují určitý stupeň homologie.

Zdá se, že RAP-2 je specifický vazebný protein pro RIP a proto modulátor/mediátor intracelulární aktivity RIP. RAP-2 ·

9 ·

9

9 9

9999 »

• ·

999

999

9

9 vazebné proteiny mohou, prostřednictvím své schopnosti vazby na RAP-2, ovlivňovat nepřímo RIP a jsou proto také modulátory/mediátory intracelulární aktivity RIP.

Proto má RAP-2 jasně úlohu v modulování/zprostředkování přenosu signálu při zánětu, buněčném přežívání a/nebo buněčné smrti, kterých se přímo nebo nepřímo účastní RIP, zejména těch, které souvisejí s cytotoxicitou a zánětem způsobeným nebo indukovaným různými podněty včetně podnětů přenášených přes receptory TGF/NGF receptorové rodiny a snad i přes jiné receptory (pro schéma zapojení RIP - a tak i RAP-2 - do těchto intracelulárních dějů viz obr. 1 v Malinin et al., 1997).

RAP-2 může také sloužit jako inhibitor cytotoxicity a zánětu prostřednictvím toho, že je přítomen jako součást komplexu jiných proteinů, například RIP a proteinů navázaných na RIP, a jako takový může ovlivňovat cytotoxické a zánětlivé vlivy těchto jiných proteinů (například p55-R, FAS-R, MACH, Mch4, G1 a MORT), což ve svém důsledku vede k inhibici jejích cytotoxické aktivity nebo jejich aktivity při zánětu.

RAP-2 může také sloužit jako zesilovač nebo posilovač cytotoxicity a zánětu tím, že zesiluje aktivitu jiných proteinů, například RIP a jiných proteinů navázaných na RIP, jak byly uvedeny výše, kdy napomáhá navázání těchto proteinů na RIP, což zesiluje cytotoxickou aktivitu různých proteinů nebo zesiluje jejich zánětlivé účinky.

Podobně, analogickým způsobem může RAP-2 sloužit také jako inhibitor nebo zesilovač buněčného přežívání, jak bylo popsáno výše, tím, že ovlivňuje RIP v této dráze.

V souladu s tím poskytuje předkládaný vynález DNA sekvenci * * · • ·»φ<

• * φφφφ « • •φ φ φφ

φ φ • φ φ « φφ φ · • φ φ φ > · φφ kódující protein asociovaný s RIP (RAP-2, jeho izoformy, analogy nebo fragmenty, které jsou schopné vazby na RIP a ovlivnění nebo zprostředkování intracelulární aktivity RIP, kde uvedená intracelulární aktivita ovlivňuje/zprostředkuje zánět a/nebo smrt a/nebo přežití buňky.

Přesněji poskytuje předkládaný vynález DNA sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

(a) cDNA sekvenci odvozenou z kódujícího regionu přirozeného RAP-2 proteinu;

(b) DNA sekvenci schopnou hybridizace na sekvenci (a) za středně přísných podmínek, která kóduje biologicky aktivní RAP-2 protein; a (c) DNA sekvence, které jsou degenerované v důsledku degenerace genetického kódu vzhledem k DNA sekvencím definovaným v (a) a (b) a které kódují biologicky aktivní RAP2 protein.

Jiným specifickým provedením výše uvedené DNA sekvence podle předkládaného vynálezu je DNA sekvence obsahující alespoň část sekvence kódující alespoň jednu izoformu RAP-2 proteinu. Jiným provedením výše uvedené DNA sekvence je sekvence kódující RAP-2 protein, jak je uvedena na obr. 1. Ještě jiným provedením je DNA sekvence uvedená na obr. 2.

Předkládaný vynález poskytuje RAP-2 proteiny a jejich analogy, fragmenty nebo deriváty, kódované jakýmikoliv výše uvedenými sekvencemi podle předkládaného vynálezu, kde uvedené proteiny, analogy, fragmenty a deriváty jsou schopné vazby na RIP a ovlivnění/zprostředkování jeho biologické aktivity v intracelulárních drahách přenosu signálu k smrti/přežívání buněk.

♦ · ♦ • · · • *··· « • ·

Specifickým provedením vynálezu je RAP-2 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty. Sekvence RAP-2 proteinu, jak je odvozena z DNA sekvencí obr. 1 a 2, je uvedena na obr. 3.

Jiným provedením je jakákoliv ízoforma RAP-2 proteinu, jeho analogů, fragmentů a derivátů.

Předkládaný vynález také obsahuje replikovatelná expresní vehikula obsahující výše uvedenou DNA, kde tato replikovatelná expresní vehikula jsou schopná exprese ve vhodných eukaryotických nebo prokaryotických hostitelských buňkách; transformované eukaryotické nebo prokaryoticke hostitelské buňky obsahující taková replikovatelná expresní vehikula; a způsob pro produkci RAP-2 proteinu nebo jeho analogů, fragmentů nebo derivátů pomocí kultivace takových transformovaných hostitelských buněk za podmínek vhodných pro expresi uvedeného proteinu, jeho analogů, fragmentů nebo derivátů, za provedení post-translačních modifikací uvedeného proteinu, které jsou nutné pro získání uvedeného proteinu a extrahování uvedeného proteinu, jeho analogů, fragmentů nebo derivátů z kultivačního media uvedených transformovaných buněk nebo z buněčných extraktů uvedených transformovaných buněk. Výše uvedené definice zahrnují všechny ízoformy RAP-2 proteinu.

V jiném aspektu poskytuje předkládaný vynález také protilátky nebo jejich aktivní deriváty nebo fragmenty specifické pro RAP-2 protein a jeho analogy, fragmenty a deriváty podle předkládaného vynálezu.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje různá použití výše uvedených DNA sekvencí, mezi která patří:

(i) způsob pro ovlivnění intracelulárního přenosu signálu • · • · ·

• · • 4

4444

4444 9 ·· při zánětu, smrti a/nebo přežívání buněk, který je ovlivněn nebo zprostředkován RIP, který obsahuje ošetření uvedených buněk jedním nebo více RAP-2 proteiny, jeho izoformami, analogy, fragmenty nebo deriváty, které se mohou vázat na RIP, kde uvedené ošetření obsahuje vložení uvedených proteinů, jejich izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů ve formě vhodné pro jejich intracelulární přenos do uvedených buněk, nebo vložení DNA sekvence kódující uvedené proteiny, jejich izoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty ve formě vhodného vektoru nesoucího uvedené sekvence do uvedených buněk, kde uvedené vektory mohou zprostředkovat inserci uvedené sekvence do uvedených buněk tak, že uvedená sekvence je exprímovaná v uvedených buňkách;

(ii) způsob pro ovlivnění intracelulárního přenosu signálu při zánětu, smrti a/nebo přežívání buněk, který je zprostředkován ligandy TNF rodiny působícími na buňky prostřednictvím RIP proteinu, který je proveden podle způsobu uvedeného výše (i), kde uvedené ošetření obsahuje vložení uvedeného RAP-2 proteinu, jeho izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů ve formě vhodné pro jejich intracelulární přenos do uvedených buněk, nebo vložení DNA sekvence kódující uvedený Gl protein, jeho izoformy, analogy, fragmenty nebo deriváty, ve formě vhodného vektoru nesoucího uvedené sekvence do uvedených buněk, kde uvedené vektory mohou zprostředkovat inserci uvedené sekvence do uvedených buněk tak, že uvedená sekvence je exprímovaná v uvedených buňkách;

(iii) způsob podle způsobu (ii), kde uvedené ošetření buněk je provedeno transfekcí uvedených buněk rekombinantním zvířecím virovým vektorem, která se skládá z následujících kroků:

(a) konstrukce rekombinantního zvířecího virového vektoru • 4 •4 4

4 · ·« 4

4 nesoucího sekvenci kódující virový povrchový protein (ligand), který je schopen vazby na specifický buněčný povrchový receptor na povrchu buněk nesoucích FAS-R nebo p55-R a druhou sekvenci kódující protein vybraný z RAP-2 proteinu, jeho izoforem, analogů, fragmentů a derivátů, který je po expresi v uvedených buňkách schopen ovlivnit/zprostředkovat dráhy přenosu signálu při zánětu, smrti a/nebo přežívání buněk; a (b) infikování uvedených buněk uvedeným vektorem z kroku (a) ;

(iv) způsob pro ovlivnění intracelulárního přenosu signálu při zánětu, smrti a/nebo přežívání buněk, který je zprostředkován ligandy TNF rodiny působícími na buňky prostřednictvím RIP proteinu, který obsahuje ošetření buněk protilátkami nebo jejich aktivními fragmenty nebo deriváty podle předkládaného vynálezu, kde uvedené ošetření je provedeno aplikací vhodného prostředku obsahujícího uvedené protilátky, jejich aktivní fragmenty nebo deriváty k uvedeným buňkám, kde uvedený prostředek je připraven pro extracelulární aplikaci, pokud je alespoň část RAP-2 proteinu přítomná na extracelulárním povrchu, a kde uvedený prostředek je připraven pro íntracelulární aplikaci, pokud jsou uvedené RAP-2 proteiny lokalizovány zcela intracelulárně;

(v) způsob pro ovlivnění intracelulárního přenosu signálu při zánětu, smrti a/nebo přežívání buněk, který je zprostředkován ligandy TNF rodiny působícími na buňky prostřednictvím RIP proteinu, který obsahuje ošetření uvedených buněk oligonukleotidovou sekvencí kódující protismyslnou sekvenci alespoň k části sekvence RAP-2 proteinu podle předkládaného vynálezu, kde uvedená oligonukleotidová sekvence je schopná blokovat expresí RAP-2 proteinu;

• ·

·. ·· • * · « • · · ♦ • · ♦ « » · · « ·· »· (vi) způsob podle způsobu (ii) pro léčbu nádorových buněk nebo buněk infikovaných HIV nebo jiných buněk postižených onemocněním, který obsahuje:

(a) konstrukci rekombinantního zvířecího virového vektoru nesoucího sekvenci kódující virový povrchový protein, který je schopen vazby na specifický buněčný povrchový receptor na povrchu nádorových buněk nebo na specifický povrchový receptor na povrchu buněk infikovaných HIV nebo na receptor na jiných buňkách postižených onemocněním a sekvenci kódující protein vybraný z RAP-2 proteinu, jeho ízoforem, analogů, fragmentů a derivátů, který je po expresi v uvedených nádorových buňkách, buňkách infikovaných HIV nebo jiných buňkách postižených onemocněním schopen usmrtit uvedené buňky prostřednictvím působení na RIP protein; a (b) infikování uvedených buněk uvedeným vektorem z kroku (a) ;

(vii) způsob pro ovlivnění intracelulárního přenosu signálu při smrti a/nebo přežívání buněk, který je zprostředkován ligandy TNF rodiny působícími na buňky prostřednictvím RIP proteinu, který obsahuje použití ribozymové sekvence schopné interakce s buněčnou mRNA sekvencí kódující RAP-2 protein podle předkládaného vynálezu, která je vložena do uvedených buněk ve formě umožňující expresi uvedené ribozymové sekvence v uvedených buňkách a kdy uvedená ribozymové sekvence po expresi v uvedených buňkách interaguje s uvedenou buněčnou mRNA sekvencí a štěpí uvedenou mRNA sekvenci, což vede k inhibici exprese uvedeného RAP-2 proteinu v uvedených buňkách;

(viii) způsob vybraný z výše uvedených způsobů podle předkládaného vynálezu, ve kterém obsahuje uvedená sekvence kódující RAP-2 protein alespoň jednu z ízoforem, analogů, fragmentů a derivátů RAP-2 podle předkládaného vynálezu, které se mohou vázat na RIP;

(ix) způsob pro izolaci a identifikaci proteinů podle předkládaného vynálezu, které jsou schopné vazby na RIP protein, který obsahuje aplikaci kvasinkového dvouhybridového způsobu, ve kterém je sekvence kódující uvedený RIP protein nesena na jednom hybridním vektoru a sekvence z cDNA knihovny nebo z knihovny genomové DNA je nesena na druhém hybridním vektoru, kde tyto vektory jsou potom použity pro transformaci kvasinkových hostitelských buněk a pozitivní transformované buňky jsou izolovány a potom se provede extrakce uvedeného druhého hybridního vektoru za zisku sekvence kódující protein, který se váže na uvedený RIP protein.

(x) způsob podle jakéhokoliv ze způsobů (i)-(x), kde uvedený RAP-2 protein je jakoukoliv izoformou RAP-2 nebo jakýkoliv jeho analog, fragment nebo derivát;

(xi) způsob podle jakéhokoliv ze způsobů (i)-(x), kde se uvedený RAP-2 protein nebo jakákoliv z jeho izoforem nebo jakýkoliv jeho analog, fragment nebo derivát, účastní ovlivnění buněčných dějů zprostředkovaných nebo modulovaných jakýmkoliv jiným mediátorem nebo induktorem, na který se přímo nebo nepřímo váže uvedený RAP-2 protein, jeho izoforma, analog, fragment nebo derivát.

Předkládaný vynález také poskytuje farmaceutický prostředek pro ovlivnění drah přenosu signálu při zánětu, buněčné smrti a/nebo přežívání buněk zprostředkovaných efektem TNF působících na RIP protein nebo efektem jakýchkoliv jiných mediátorů nebo induktorů, kde uvedený prostředek obsahuje jako aktivní složku jednu z následujících složek:

(i) RAP-2 protein podle předkládaného vynálezu a jeho

9 9 • · · * · ··*· * »·♦ ·* • · « · • · • «

Φ* ♦

·» biologicky aktivní fragmenty, analogy, deriváty nebo jejich směsi;

(ii) rekombinantní zvířecí virový vektor kódující protein schopný vazby na povrchový buněčný receptor a kódující RAP-2 protein nebo jeho biologicky aktivní fragmenty nebo analogy podle předkládaného vynálezu;

(iii) oligonukleotidovou sekvencí kódující protismyslnou sekvenci k sekvenci RAP-2 proteinu podle předkládaného vynálezu, kde uvedená oligonukleotidová sekvence může být druhá sekvence rekombinantního zvířecího virového vektoru podle (ii).

Předkládaný vynález také poskytuje:

I. způsob pro ovlivnění drah přenosu signálu při zánětu, buněčné smrti a/nebo přežívání, které jsou modulovány/ zprostředkovány RIP nebo jakýmikoliv jinými mediátory nebo induktory nebo jakýmikoliv jinými induktory nebo inhibitory NF-κΒ v buňkách, kde uvedený způsob obsahuje ošetření uvedených buněk způsobem uvedeným ve způsobech (i)-(x) za použití RAP-2 proteinů, jejich izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů nebo za použití sekvencí kódujících RAP-2 proteiny, jejich izoformy, analogy nebo fragmenty, kde uvedené ošetření vede k aktivaci nebo inhibici uvedených dějů zprostředkovaných RIP a tím také dějů zprostředkovaných FAS-R nebo p55-R, nebo jiným uvedeným mediátorem nebo induktorem nebo jiným induktorem nebo inhibitorem NF-kB;

II. způsob uvedený výše, ve kterém je uvedený RAP-2 protein, jeho analog, fragment nebo derivát tou částí RAP-2 proteinu, která se specificky účastní vazby na RIP nebo na uvedený jiný mediátor nebo induktor nebo na jiný induktor nebo mediátor NF-κΒ, nebo kde uvedená sekvence kódující uvedený RAP2 protein kóduje tu část RAP-2 proteinu, která se specificky ·· «

• · • · • · • · • · ·· ··· • ·· ► · · ··· • ···· · ·· ·· účastní vazby na RIP nebo na uvedený jiný mediátor nebo induktor nebo na jiný induktor nebo mediátor NF-KB;

III. způsob uvedený výše, ve kterém je uvedený RAP-2 protein jakákoliv z izoforem RAP-2, kde uvedená izoforma je schopna způsobit zesílení efektů spojených s RIP;

IV. způsob uvedený výše, ve kterém je uvedený RAP-2 protein jakákoliv z izoforem RAP-2, kde uvedená izoforma je schopna způsobit inhibici efektů spojených s RIP nebo efektů spojených s jiným mediátorem nebo induktorem a proto také inhibici efektů spojených s FAS-R nebo p55-R nebo efektů jiných cytotoxických mediátorů nebo índuktorů;

V. způsob uvedený výše, ve kterém je uvedený RAP-2 protein, jeho izoforma, analog, fragment nebo derivát schopen zesilovat nebo inhibovat efekty spojené s RIP na dráhy přenosu signálu spojené se zánětem nebo s přežíváním buněk prostřednictvím přímé nebo nepřímé inhibice NK-KB nebo přímé nebo nepřímé aktivace JNK nebo p38 kinasy.

Izolace RAP-2 proteinů, jejich identifikace a charakterizace mohou být provedeny za použití jakýchkoliv standardních technik pro izolaci a identifikaci proteinů, například za použití kvasinkové dvouhybridové metody, metod afinitní chromatografie a jakýchkoliv dobře známých metod vhodných pro tento účel.

V ještě jiném aspektu vynálezu je RAP-2 protein samotný nebo jeho izoforma, fragment nebo derivát použit jako zachycovací činidlo ve kvasinkovém dvouhybridovém testu pro získání proteinů vážících se na tento protein.

• · • · • · ···« ·

Proteiny, které se váží na RAP-2, jeho izoformy, fragmenty nebo deriváty, jsou také součástí předkládaného vynálezu.

Další aspekty a provedení předkládaného vynálezu budou zřejmé z podrobného popisu vynálezu.

Je třeba si uvědomit, že termíny ovlivnění/zprostředkování efektů RIP, FAS-ligandů nebo TNF na buňky a jakékoliv jiné takové ovlivnění/zprostředkování použité v předkládaném vynálezu zahrnuje ovlivnění in vitro i in vivo a také inhibici nebo zesílení/zvýšení efektů.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 (A,B) (SEQ ID NO; 1) ukazuje nukleotidovou sekvenci

RAP-2, ve které jsou start a stop kodony podtrženy. Šipky ukazují začátek 1,5 kb klonu získaného ve dvouhybridovém skríningu;

Obr. 2 (A,B) (SEQ ID NO: 2) ukazuje nukleotidovou sekvenci klonu č. 41072 (viz příklad 1), ve které jsou start a stop kodony podtrženy.

Obr. 3A (/1,/2) ukazují odvozenou aminokyselinovou sekvenci lidské (20,4 kompletní a Human shrt) a myší (NEMO kompletní a Mouše part) sestřižených variant RAP-2 a B (/1,/2) ukazuje publikované sekvence FIP-2 přiřazené za použití softwarového balíčku dostupného od BCM Search Launcher (Baylor College of Medicíně, Houston, TX) . Homologické aminokyseliny jsou orámečkované, identické aminokyseliny jsou v šedých rámečcích. Hvězdičky v (B) označují domnělé motivy podobné leucinovému prstu (LZ) ve FIP-2.

• ·

Obr. 4 popisuje molekulární charakterizaci RAP-2. Je analyzován northernova hybridizace lidského MTN Blot I (Clontech) s DNA fragmentem RAP-2. V B je analyzována vazba RAP-2 na RIP, jak je popsáno podrobněji v příkladu 3. V C je detekována interakce NIK-RAP-2 stejně jako v (B), s tou výjimkou, že pro westernův přenos byly použity anti-FLAG protilátky a potom následovala imunoprecipitace s anti-His6. Šipky ukazují pozice imunoprecipitovaných proteinů.

Obr. 5 je grafické znázornění masivní inhibice aktivace NFkB a c-Jun způsobené různými podněty, které je dosaženo pomocí ektopické exprese RAP-2, jak je popsáno v příkladu 4. HEK-293T buňky byly dočasně transfektovány reportérovým plasmidem (HIVLTR-Luc nebo CMV-Luc pro NF-KB (A) a GAL4-Luc pro c-Jun (Β) aktivační testy) a expresním vektorem pro uvedený induktor a buň prázdným vehikulem (pcDNA3 - na obrázku označený samostatně) nebo plasmidem kódujícím kompletní RAP-2 (pcRAP-2 - na obrázku označený plus). Aktivace luciferasové aktivity reporterového genu je vyjádřena v relativních luciferasových jednotkách (RLU).

Obr. 6 ukazuje, že RAP-2 vykazuje podobné inhibiční chování vůči NF-KB a c-Jun při různých koncentracích. TRAF2 byl přechodně exprimován v HEK-293T buňkách společně s různými uvedenými množstvími buď pcRAP-2 (kódujícím) nebo pcRAP-2-a/s (protismyslným) konstruktem. Pro hodnocení aktivace NF-KB (A) a c-Jun (B) byly použity pHIVLTR-Luc a pGAL4-Luc reportérové plasmidy. Luciferasový test byl proveden způsobem popsaným pro obr. 5 v příkladu 4.

Obr. 7 ukazuje, že RAP-2 silně potencuje signálemindukovanou fosforylaci c-Jun bez interference s aktivací JNK1/2.

• · (A) celkové buněčné lyzáty HEK-293T buněk, transfektovaných uvedenými expresními konstrukty společně s buď ppcDNA3nosičem, který je na obr. označen znaménkem (-), nebo s pcRAP2 označeným na obr. znaménkem (+), byly analyzovány westernovým přenosem s anti-fosfo-Jun protilátkami, jak je popsáno v příkladu 5.Kontrolní membrána uvedená na dolním panelu byla re-sondována za použití protilátek proti celkovému c-Jun (NEB);

(B) aktivované JNK1/2 z HEK-293T buněk transfektovaných buď pcDNA3 nebo pcRAP-2, zpracované hrTNFa po delší dobu, byly analyzovány westernovým přenosem celkových lyzátů s protilátkami proti fosfo-JNK, jak je podrobně popsáno v příkladu 5.

(C) HEK-293T buňky byly současně transfektované prázdným vektorem, pcRAP-2 a pcRIP v různých kombinacích, spolu s HAJNKl-expresním plasmidem. Potom byl JNK1 imunitně vysrážen pomocí N-koncové HA-koncovky a jeho schopnost fosforylovat GST-Jun produkovaný v bakteriích byla stanovena v kinasovém testu in vitro. Produkty reakce byly analyzovány SDS-PAGE. GST-Jun je označen šipkou.

Obr. 8 ukazuje, že RAP-2 nesoutěží s NF-κΒ a AP-1 o vazbu na

DNA. HEK-293T byly transfektovány uvedenými proteiny samostatně (-) nebo společně s pcRAP-2 ( + ). Jaderné extrakty připravené z buněk byly současně inkubovány s oligonukleotidy značenými ³²P obsahujícími klasické rozpoznávací sekvence pro AP-1 (A) nebo NF-κΒ (B). Produkty reakce byly analyzovány nedenaturační PAGE.

Obr. 9 ukazuje, že RAP-2 ovlivňuje bazální hladiny NF-κΒ v

HEK-293T a HeLa buňkách dočasně transfektovaných variabilním množstvím buď RAP-2 (kódujícím) nebo RAP-2 protismyslným (a/s). Všechny úkony byly provedeny postupem popsaným pro obr.

• · · · • · · · ·· v příkladu 4.

Obr. 10 (A,B) (SEQ ID NO: 3) ukazuje částečnou nukleotidovou sekvenci klonu č.10.

Obr. 11 ukazuje funkční vlastnosti sériových deleci RAP-2.

V A je uvedeno schematické znázornění postupných C-koncových deleci v RAP-2. Všechny delece zachovávaly intaktní N-konec RAP-2, zatímco C-konce jsou znázorněny šipkami. Vazebný region pro RIP, NIK, ΙΚΚβ a TIP 60 je podtržený. Tři šrafované rámečky odpovídají domnělým motivům leucinového prstu. B ukazuje vliv nadměrné exprese delečních konstruktů popsaných v A na aktivaci NF-KB v HEK-293T buňkách prostřednictvím RelA, TRAF2 TNF a NIK za použití HIV-LTR luciferasového reporterového plasmidu pro NF-κΒ. Aktivace luciferasové aktivity reporterového genu je vyjádřena v relativních luciferasových jednotkách (RLU).

Obr. 12 ukazuje mapování funkčních a vazebných regionů RAP2.

(A) Různé deleční varianty RAP-2 byly testovány na svou schopnost vazby na uvedené proteiny v transfektovaných kvasinkách (liché sloupce) a v savčích HEK-293T buňkách (sudé sloupce). Dva sloupce nejvíce vpravo ukazují schopnost stejných delečních variant transfektovaných ve vysokých množstvích způsobem popsaným v příkladu 9 do HEK-293T buněk inhibovat aktivací NF-KB a potencovat hyperfosforylaci (c-Jun) v reakci na aplikaci TNF-α. Tloušťka křížků je úměrná intenzitě daného efektu. Hvězdičky označují, že pozorované účinky značených konstruktů na Rel-A stimulaci jsou odlišné (viz obr. 11B).

(B) Souhrnný graf představující lokalizaci vazebných (horní část) a funkčních (spodní část) regionů RAP-2, jak byla • · · • · • · ·

4*4* ·· ·· zjištěna z deleční analýzy uvedené na obr. (A), vzhledem ke skeletu proteinu. Šrafované částí jsou možné lokalizace hranic příslušných minimálních regionů.

Obr. 13 ukazuje, že ser-148 v RAP-2 je nutný pro jeho schopnost indukovat hyperfosforylaci c-Jun na ser-63.

Je uveden westernový přenos, ve kterém wt znamená přirozený typ, S148A označuje, že ser v pozici 148 byl nahrazen Ala a vektor je prázdný kontrolní vektor.

Předkládaný vynález se týká, v jednom aspektu, nových RAP-2 proteinů, které se mohou vázat na RIP protein a tak ovlivňovat nebo zprostředkovat íntracelulární aktivitu RIP, zejména tam, kde se RIP účastní drah přenosu signálu spojených se zánětem, smrtí a/nebo přežíváním buněk. Tak může RAP-2 inhibovat aktivitu RIP v dráze buněčné smrti/zánětu/přežívání, RAP-2 může zesilovat aktivitu RIP v dráze buněčné smrti/zánětu/přežívání, nebo může zesilovat aktivitu RIP v jedné z těchto drah a inhibovat jí v jiné z těchto drah.

Přesněji poskytuje předkládaný vynález nový protein RAP-2. RAP-2 byl sekvencován a charakterizován a bylo zjištěno, že RAP-2 je RlP-vazebný protein mající vysokou specificitu pro RIP, ale neváže se na mnoho proteinů, o kterých je známo, že se účastní drah přenosu signálu vedoucích k zánětu, buněčné smrti nebo přežívání buněk. RAP-2 také jasně nemá žádnou doménu společnou proteinům, které jsou aktivní v jedné z těchto drah, t.j. RAP-2 nemá motiv nebo modul smrtící domény, nemá kinasový motiv nebo doménu a nemá proteasový motiv nebo doménu. Sekvence RAP-2 je také jedinečná sekvence, jak bylo určeno ze srovnání se sekvencemi z mnoha databází, včetně GenBank, Human genom úroveň 1 a 'dbesť databází. Jak

4

4

4 je podrobněji uvedeno dále (a také ve všech citovaných odkazech a patentových přihláškách), účastní se RIP intracelulárních drah přenosu signálu vedoucích k zánětu, buněčné smrti a přežívání buněk. Proto může regulace nebo kontrola aktivity RIP regulovat některé nebo všechny tyto dráhy, kde tyto dráhy jsou spouštěny, například, vazbou TNF nebo FAS-ligandů na své receptory (pro TNF na p55-R). RIP může mít klíčový význam při určení toho, která dráha je aktivována ve větším rozsahu a toto je způsobeno jeho schopností vazby na mnoho cytotoxických proteinů majících smrtící domény a také na mnoho proteinů s kinasovou aktivitou. Proto mohou mít proteiny, jako je RAP-2 protein podle předkládaného vynálezu, které se mohou specificky vázat na RIP, význam při ovlivnění RIP aktivity a tak při ovlivnění rozsahu indukce jedné dráhy vzhledem k jiným drahám. Proto představuje RAP-2 protein podle předkládaného vynálezu významný modulátor nebo mediátor intracelulárního přenosu signálu.

Kromě kompletního RAP-2 proteinu podle předkládaného vynálezu byla klonována kratší cDNA o které bylo zjištěno, že je složena z bloků sekvence odvozených z několika vzdálených regionů kompletní cDNA, a která jasně pochází z alternativního sestřihu stejného genu. Myší protějšek lidského RAP-2 byl identifikován při podobné analýze myšího EST souboru. Bylo zjištěno, že částečná myší cDNA je v podstatě identická s lidským protějškem v kódujícím regionu.

Fyziologický význam interakce RIP-RAP-2 byl dále potvrzen v transfektovaných HEK-293T a HeLa buňkách. Nicméně, tvorba takových komplexů nevedla k enzymatické aktivitě RIP, jak je dokázán tím, že nadměrně exprimovaný RIP nefosforyluje RAP-2.

Transfekční pokusy na savčích HEK-293T buňkách také vedly • ♦ · • 9 9 • 9 9 9 • ·

9 9 9 ke stabilní tvorbě komplexu RAP-2-NIK.

RAP-2 se zdá být zásadním prvkem ve NF-KB a c-Jun drahách přenosu signálu, protože se váže na NIK, ΙΚΚβ a TIP60 (histoacetyltransferasa) a moduluje NF-κΒ a c-Jun - dependentní transkripci. Skutečně, zesílená ektopická exprese RAP-2 vede k inhibici NF-κΒ odpovědi, zatímco jeho depiece z buněk provedená pomocí protismyslného konstruktu - vede k zesílené transaktivaci NF-KB a c-Jun.

Také bylo zjištěno, že RAP-2 potencuje hyperfosforylaci cJun, která není zprostředkovaná JNK aktivitou. RAP-2 neinhibuje vazbu c-Jun a RelA na DNA. Vazebné a funkční domény RAP-2 byly identifi kovány analýzami sekvenčních delecí. Tyto studie ukázaly, že vazebný region pro RIP, NIK a TIP60 se překrývá a nachází se v aminokyselinách 95-264 RAP-2. Následné funkční efekty zprostředkované RAP-2 však byly lokalizovány na N-koncovou doménu proteinu, tvořenou aminokyselinami 1-264.

Z výše uvedených důvodů se zdá, že RAP-2 je zásadním prvkem v dráze oslabení signálu při stresové odpovědi: ektopická exprese kódujícího konstruktu inhibuje odpověď, zatímco exprese protismyslného konstruktu zesiluje odpověď. RAP-2 je také skutečně znám, v laboratoři předkladatelů vynálezu, jako RAT (RIP atenuátor) a může být proto také označován jako RAT a/nebo RAT-303 a/nebo klon 303.

Existence více sestřihových variant naznačuje, že - alespoň částečně - je čistý účinek RAP-2 za daných podmínek pravděpodobně závislý na přítomnosti některých bloků sekvence, které jsou nutné pro vazbu/zacílení/translokaci/modifikaci proteinu, v převažující izoformě. Například, pokud vazba RAP-2 an TIP60 umožňuje jadernou lokalizaci RAP-2, tak lze • · • ♦ • · • · předpokládat, že varianty RAP-2 s vystřiženými jadernými lokalizačními signály (NLS) budou defektní, nebo naopak, aktivní v inhibici NF-kB/AP-1. Analýza sekvence ukázala, že RAP-2 obsahuje několik seskupení pozitivně nabitých aminokyselin (E, K a R) charakteristických pro většinu známých NLS.

Vazba RAP-2 na RIP byla mapována na region RAP-2 proteinu, který začíná mezi aminokyselinami 117-218 a končí aminokyselinou 264. RIP vazebná doména v RAP-2 se nepřekrývá ani s vazebným místem pro ΙΚΚβ, ani pro NIK.

Vazba na TIP60, který je členem jaderných proteinů označovaných jako histon-acetyltransferasy, byla mapována na region mezi aminokyselinami 95-264. Region účastnící se homodimerizace byl lokalizován mezi aminokyseliny 217-264.

Získaná data naznačují, že všechny funkční efekty RAP-2 (konkrétně inhibice NF.kB a indukce c-Jun hyperfosforylace) se lokalizují do stejného regionu.

Protein kódovaný klonem č.10 se váže v regionu začínajícím mezi aminokyselinami 218-309 a končícím v aminokyselině 416 a proto může jeho vazebné místo obsahovat překrývající se regiony s vazebnými místy pro RIP, NIK, ΙΚΚβ a TIP60.

Dále, je možné, že region dostatečný pro účinné ovlivnění signalizace zprostředkované všemi ostatními induktory se lokalizuje do N-koncového segmentu proteinu.

Region tvořený aminokyselinami 95-416 má efekt, ačkoliv významně slabší ve srovnání s efektem způsobeným kompletním proteinem, který může být proto způsoben zesílenou agregací • φ » φ φ · • · ·· · · φ endogenního RAP-2.

Kromě toho, kromě RelA, mohou být všechny efekty indukované v našich pokusech zprostředkovány pouze přibližně 100 Nkoncovými aminokyselinami RAP-2. Skutečně I fragment obsahující aminokyseliny 1-102 zprostředkuje zřetelné účinky, ačkoliv slabší.

Na druhou stranu, suprese efektů zprostředkovaných RelA vyžaduje použití významně delší části RAP-2. Dosud jsme lokalizovaly hranice tohoto regionu mezi aminokyseliny 1-264, které jasně obsahují region mezi aminokyselinami 157-264 s určitými specifickými vazebnými vlastnostmi pro RelA.

Z výše uvedených pozorování se zdá, že:

(a) s výjimkou RelA není vazba RAP-2 na RIP, klon č.10 a nejpravděpodobněji NIK a TIP60 nutná pro funkci proteinu jako inhibitoru nadměrné exprese indukované NF-kB;

(b) efekt RAP-2 na nadměrnou expresí indukovanou aktivaci RelA je zprostředkován, alespoň částečně, jiným vazebným dějem. V podstatě všechny výše uvedené proteiny mohou přispívat k uvedené aktivitě, jak je zřejmé z dosud provedených pokusů.

Vzhledem k jedinečné schopnosti FAS-R a TNF receptorů způsobovat smrt buněk, stejně jako ke schopnosti TNF receptor spouštět jiné aktivity poškozující tkáně, může být porucha funkce těchto receptorů značně škodlivá pro organismus. Kromě toho bylo prokázáno, že jak nadměrná, tak deficitní funkce těchto receptorů přispívá k patologickým projevům různých onemocnění. Identifikace molekul, které se účastní na přenosu signálu z těchto receptorů, a objevení způsobů pro ovlivnění funkce těchto molekul, vytváří možnosti nových terapeutických přístupů k těmto onemocněním. Z hlediska předpokládané významné úlohy RIP při FAS-R a p55-R toxicitě, a proto předpokládané významné regulační úlohy RAP-2 u FAS-R a TNF prostřednictvím ovlivnění RIP se zdá značně významným vývoj nových léčiv, které by mohly blokovat cytotoxické funkce RIP, snad pomocí blokování vazby RAP-2 na RIP nebo jiné inhibice interakce mezi RAP-2 a RIP při těchto stavech, při kterých RAP-2 zesiluje cytotoxicitu zprostředkovanou RIP (jak bylo uvedeno výše, RIP je cytotoxický jak sám o sobě, tak ve spojení s jinými proteiny obsahujícími regiony smrtících domén).

Podobně, je také známo (viz výše), že FAS-R a p55-R se účastní aktivace NF-KB a tak přežívání buněk. Proto, pokud je žádoucí usmrcení buněk, například nádorových buněk, buněk infikovaných HIV a podobně, je žádoucí zesílit cytotoxické účinky FAS-R a p55-R (a jejich asociovaných proteinů, jako je například MORT-1, MACH, Mch4, Gl, TRADD), a zároveň inhibovat jejich aktivitu indukovat NF-kb. Proto pokud vede interakce nebo vazba RAP-2 na RIP k zesílení možné úlohy RIP v zesílení indukce NF-KB (pravděpodobně prostřednictvím TRAF2 a pravděpodobně prostřednictvím kinasové domény a/nebo střední domény RIP), potom je žádoucí blokování této interakce mezi RAP-2 a RIP pro inhibici, nebo alespoň zabránění zesílení, aktivace NF-kB a tak posunu rovnováhy efektů indukovaných TNFnebo FAS-ligandy na stranu cytotoxicity, což nakonec způsobí smrt buněk.

Podobně, v opačné situaci (vzhledem k situaci uvedené výše), ve které vazba RAP-2 na RIP způsobuje inhibici FAS-R a p55-R prozánětlivých nebo cytotoxických účinků a je žádoucí blokování těchto cytotoxických účinků (jak je tomu například při zánětech, různých autoimunitních onemocněních a podobně, při kterých je žádoucí vyšší přežívání buněk), je významné navrhnout léčiva, která budou zesilovat interakci mezi RAP-2 a RIP a tak zesilovat celkovou inhibici smrti buněk a budou posouvat rovnováhu ve prospěch přežívání buněk. Z výše uvedených skutečností je také jasné, že při ději, kdy interakce RAP-2 s RIP způsobuje inhibici funkce RIP v zesílení aktivace NF-KB a je žádoucí přežívání buněk, je tedy nutné blokovat tuto interakci mezi RAP-2 a RIP, což zesílí aktivitu RIP v zesílení aktivace NF-kB.

Z výše uvedeného popisu vyplývá, že RIP má klíčovou úlohu v rovnováze mezi indukcí nebo zprostředkováním signalizačních drah vedoucích k zánětu, buněčné smrti nebo přežívání buněk a proto že má RAP-2 stejně významnou úlohu, protože je modulátorem RIP. Ovlivnění interakce/vazby mezi RAP-2-RIP za použití různých léků, jak je uvedeno výše a dále, by mohlo umožnit dosažení posunu v drahách intracelulární signalizace od buněčné smrti k buněčnému přežívání a naopak, podle potřeby.

Předkládaný vynález se také týká DNA sekvence kódující RAP2 protein a RAP-2 proteinů kódovaných DNA sekvencí.

Dále se předkládaný vynález týká DNA sekvencí kódujících biologicky aktivní analogy, fragmenty a deriváty RAP-2 proteinu a analogů, fragmentů a derivátů kódovaných uvedenými sekvencemi. Příprava takových analogů, fragmentů a derivátů se provede standardními postupy (viz Sambrook et al., 1989), ve kterých mohou být v DNA sekvencích kódujících RAP-2 protein jeden nebo více kodonů deletovány, přidány nebo substituovány jinými kodony, za vzniku analogů obsahujících alespoň jednu aminokyselinovou změnu vzhledem k přirozenému proteinu.

* • » · ♦ ♦ · · · • · · · · • » · · ·♦ ♦· • ·

Z výše uvedených DNA sekvencí podle předkládaného vynálezu, které kódují RAP-2 protein, jeho izoformu, analog, derivát nebo fragment, vynález také obsahuje, jako jedno své provedení, DNA sekvenci schopnou hybridizace s cDNA sekvencí odvozenou z kódujícího regionu přirozeného RAP-2 proteinu, kde tato hybridizace je provedena za středně přísných podmínek, a kde hybridizovatelná DNA sekvence kóduje biologicky aktivní RAP-2 protein. Tyto hybridizovatelné DNA sekvence proto zahrnují DNA sekvence, které mají relativně vysokou homologii s přirozenou RAP-2 cDNA sekvencí a jako takové představují sekvence podobné RAP-2 sekvenci, kterými mohou být, například, přirozené sekvence kódující různé izoformy RAP-2, přirozené sekvence kódující proteiny náležící do skupiny sekvencí podobných RAP-2 sekvencím kódujícím proteiny mající aktivity RAP-2. Dále mohou tyto sekvence zahrnovat, například, nepřirozené, syntetické sekvence, které jsou podobné přirozeným RAP-2 cDNA sekvencím, ale které obsahují mnoho žádoucích modifikací. Takové syntetické sekvence proto zahrnují všechny možné sekvence kódující analogy, fragmenty a deriváty RAP-2, které všechny mají aktivity RAP-2.

Pro získání různých výše uvedených sekvencí podobných RAP-2 sekvencím mohou být použity standardní postupy pro vyhledávání a izolaci přirozených DNA nebo RNA vzorků z různých tkání, které využívají přirozené RAP-2 cDNA nebo její části jako sondy (viz například standardní postupy uvedené v Sambrook et al., 1989) .

Podobně, pro přípravu různých výše uvedených syntetických sekvencí podobných RAP-2 sekvencím kódujících analogy, fragmenty nebo deriváty RAP-2 může být použito mnoha standardních postupů, jak jsou uvedeny dále v popisu přípravy takových analogů, fragmentů a derivátů.

4 4 « « * 4 4 · · · · 4 4 ·

• 444 4 «

Termín polypeptíd nebo protein v podstatě odpovídající RAP-2 proteinu, ale také polypeptidy nebo proteiny, které jsou analogy RAP-2.

Analogy, které v podstatě odpovídají RAP-2 proteinu, jsou ty polypeptidy, ve kterých byla jedna nebo více aminokyselin aminokyselinové sekvence RAP-2 proteinu nahrazena jinou aminokyselinou, deletována a/nebo insertována, s podmínkou, že vzniklý protein vykazuje v podstatě stejnou nebo vyšší biologickou aktivitu jako RAP-2 protein, kterému odpovídají.

Pro dosažení toho, aby proteiny v podstatě odpovídaly RAP-2 proteinu, jsou změny v sekvenci RAP-2 proteinů, jako jsou jeho izoformy, relativně malé. Ačkoliv může být počet změn vyšší než 10, není výhodně přítomno více než 10 změn, ještě lépe není obsaženo více než 5 změn a nejlépe ne více než 3 takové změny. Ačkoliv může být pro objevení potenciálních biologicky aktivních proteinů v podstatě odpovídajících RAP-2 proteinu použita jakákoliv technika, je jednou takovou technikou běžná technika mutagenese provedená na DNA kódující protein, která vede k dosažení několika modifikací. Proteiny exprimované takovými klony mohou být potom vyšetřovány na svou schopnost vazby na RIP a na schopnost ovlivňovat aktivitu RIP v ovlivnění/zprostředkování intracelulárních drah přenosu signálu uvedených výše.

Konzervativní změny jsou ty změny, u kterých se předpokládá, že nebudou měnit aktivitu proteinu a které jsou obvykle testovány jako první, protože se nepředpokládá, že by měnily významným způsobem velikost, náboj nebo konfiguraci proteinu a tak jeho biologické vlastnosti.

♦ · 4 · · ♦· ·· • * · ·· ·· · > « · • · · · · · · 9

449449 4 4 49 49 4

9 4 4 4 9 4 4

4994 4 949 449 44 *9

Konzervativní substituce RAP-2 proteinů zahrnují analogy, ve kterých byl alespoň jeden aminokyselinový zbytek polypeptidu konzervativně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem. Takové substituce jsou výhodně provedeny podle následujícího seznamu uvedeného v tabulce IA, kde takové substituce mohou být určeny běžným experimentováním provedeným za účelem zisku modifikovaných strukturálních a funkčních vlastností syntetizované polypeptidové molekuly za současného zachování biologické aktivity charakteristické pro RAP-2 protein.

Tabulka IA

Původní zbytek

Ala

Arg

Asn

Asp

Cys

Gin

Glu

Gly

His

Ile

Leu

Lys

Met

Phe

Ser

Thr

Trp

Tyr

Val

Příklad substituce Gly; Ser Lys

Gin; His

Glu

Ser

Asn

Asp

Ala; Pro Asn; Gin Leu; Val Ile; Val Arg; Gin; Glu Leu; Tyr; Ile Met; Leu; Tyr Thr

Ser

Tyr

Trp; Phe Ile; Leu

Alternativně, jinou skupinou substitucí v RAP-2 proteinu jsou ty, při kterých je alespoň jeden aminokyselinový zbytek v polypeptidu odstraněn a na jeho místo je vložen jiný aminokyselinový zbytek podle tabulky IB. Typy substitucí, které mohou být provedeny v polypeptidu, mohou být založeny na analýze frekvencí aminokyselinových změn mezi homologními proteiny různých druhů, jak je například uvedena v tabulce 12, Schulz et al., G.E. Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York, NY, 1798, a na obr. 3-9, Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman and Co., San Francisko, CA 1983. Podle takové analýzy jsou zde konzervativní substituce definovány jako výměny v jedné z následujících pěti skupin:

Tabulka IB

1. Malé alifatické, nepolární nebo slabě polární zbytky: Ala, Ser, Thr (Pro, Gly);

2. Polární negativně nabité zbytky a jejich amidy: Asp, Asn, Glu, Gin;

3. Polární pozitivně nabité zbytky: His, Arg, Lys;

4. Velké alifatické nepolární zbytky: Met, Ile, Leu, Val, (Cys); a

5. Velké aromatické zbytky: Phe, Tyr, Trp.

Tři aminokyselinové zbytky uvedené v tabulce v závorkách mají speciální úlohu ve struktuře proteinů. Gly je jediný zbytek bez jakéhokoliv vedlejšího řetězce a tak způsobuje flexibilitu řetězce. Nicméně také způsobuje tendenci ke tvorbě sekundární struktury jiné než α-šroubovice. Pro, z důvodu své neobvyklé geometrie, významně omezuje tvar řetězce a obvykle podporuje tvorbu struktur podobných β-závitům, ačkoliv v » · φ φ

• φ φ · · • φ φ · φφ φφ některých případech může být Cys schopen účastnit se tvorby disulfidových vazeb, které jsou významné pro skládání proteinu. Povšimněte si, že Schulz et al., výše, slučuje skupiny 1 a 2. Povšimněte si také, že Tyr, vzhledem k jeho potenciálu pro tvorbu vodíkových vazeb, má významnou souvislost se Ser a Thr atd.

Konzervativní aminokyselinové substituce podle předkládaného vynálezu, jak jsou uvedeny výše, jsou známé v oboru a předpokládá se, že budou zachovávat biologické a strukturální vlastnosti polypeptidů po aminokyselinové substituci. Většina deleci a substitucí podle předkládaného vynálezu jsou takové, které nevyvolávají radikální změny v charakteristikách proteinové nebo polypeptidové molekuly. Charakteristiky označují jak změny v sekundární struktuře, například α-šroubovici nebo β-listu, tak změny v biologické aktivitě, například vazbě na RIP a/nebo zprostředkování účinků RIP na smrt buněk.

Příklady přípravy aminokyselinových substitucí v proteinech, které mohou být použity pro získání analogů RAP-2 proteinů pro použití v předkládaném vynálezu zahrnují jakékoliv známé metody, jak jsou uvedeny v U.S. patentu RE 33653, 4959314, 4588585 a 4737462 (Mark et al. ) ; 5116943 (Koths et al.); 4965195 (Namen et al.) ; 4879111 (Chong et al.); a 5017691 (Lee et al); a lysinem substituované proteiny uvedené v U.S. patentu č. 4904584 (Shaw et al.) .

Kromě konzervativních substitucí uvedených výše, které nemění významným způsobem aktivitu RAP-2 proteinu, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu konzervativní substituce nebo méně konzervativní a náhodnější změny, které vedou ke zvýšení biologické aktivity RAP-2 proteinů.

·· ♦ • · 9 9 •99

9999 ·

9999 9 9

9

99

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9

99

Pokud je potřeba stanovit přesný efekt substitucí nebo deíecí, může odborník v oboru hodnotit efekt takových substitucí a deíecí atd. rutinními vazebnými testy a testy na přežívání buněk. Vyšetřování za použití takových standardních testů nevyžaduje zbytečné experimentování.

Přijatelné analogy RAP-2 jsou takové analogy, které si uchovávají alespoň schopnost vazby na RIP a proto, jak bylo uvedeno výše, si uchovávají schopnost zprostředkovat aktivitu RIP na Íntracelulární dráhy přenosu signálu, jak byly uvedeny výše. Takovým způsobem mohou být připraveny analogy, které mají takzvaně dominantně-negativní efekt, konkrétně analogy, které jsou defektní buď ve vazbě na RIP, nebo v následném přenosu signálu nebo v jiných aktivitách následujících po takové vazbě. Takové analogy mohou být použity, například, pro inhibici vlivu RIP, nebo pro inhibici indukujícího vlivu RIP (přímého nebo nepřímého) na NF-κΒ, podle toho, které z těchto aktivit jsou hlavními aktivitami ovlivněnými interakcí RIP a RAP-2 (viz výše) , a tak mohou takové analogy soutěžit s přirozeným RAP-2 o vazbu na RIP.

Na genetické úrovni jsou tyto analogy obvykle připraveny místě cílenou mutagenesí nukleotidů v DNA kódující RAP-2 protein, čímž vzniká DNA kódující analog, a potom syntetizováním DNA a exprimováním polypeptidů v rekombinantní buněčné kultuře. Analogy typicky vykazují stejné nebo zvýšené kvalitativní biologické aktivity jako přirozený protein. (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,

Greene Publications and Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989 .

• ···· · • ♦ · · 4 9 4 4 ···· · ··· ··· 44 44

Příprava RAP-2 proteinu podle předkládaného vynálezu, nebo alternativní nukleotidové sekvence kódující stejný polypeptid, ale lišící se od přirozené sekvence z důvodů změn umožněných známou degenerací genetického kódu, může být provedena pomocí místně-specifické mutagenese DNA, která kóduje dříve připravený analog nebo přirozenou verzi RAP-2 proteinu. Místěcílená mutagenese umožňuje produkci analogů pomocí použití specifických oligonukleotidových sekvencí, které kódují DNA sekvenci s požadovanými mutacemi, stejně jako dostatečný počet sousedních nukleotidů, za zisku průměrové sekvence dostatečné velikosti a komplexity pro tvorbu stabilního duplexu na obou stranách delece, která má být přemostěna. Obvykle je použit primer délky přibližně 20 až 25 nukleotidů, s přibližně 5 až 10 komplementárními nukleotidy na každé straně sekvence, která je měněna. Obecně je technika místně-specifické mutagenese dobře známá v oboru, jak je uvedeno například v Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), jejichž objevy jsou zde uvedeny jako odkaz.

Jak je známo, techniky místně specifické mutagenese obvykle využívají fágové vektory, které existují jak v jednořetězcové, tak ve dvouřetězcové formě. Typické vektory použitelné při místně cílené mutagenesi jsou vektory jako je M13 fág, jak byl popsán v Messing et al., Third Cleveland Symposium on

Macromolecules and Rekombinant DNA, ed. A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), jejichž objev je zde uveden jako odkaz. Tyto fágy jsou snadno komerčně dostupné a jejich použití je odborníkům v oboru známé. Alternativně, plasmidové vektory, které obsahují jednořetězcovou fágovou sekvenci rozpoznávající počátek replikace (Veira et al., Meth. Enzymol. 153:3, 1987) mohou být použity pro získání jednořetězcové DNA.

Obecně, místně cílená mutagenese podle předkládaného tt » • · · · 9 9 4 9

4444 4 994 444 94 44 vynálezu je provedena nejprve tak, že je připraven jednořetězcový vektor obsahující ve své sekvenci DNA sekvenci, která kóduje příslušný polypeptid. Oligonukleotidový primer nesoucí požadované mutované sekvence je připraven synteticky automatizovanou syntézou DNA/oligonukleotidů. Tento primer je potom tepelně zpracován s jednořetězcovým vektorem obsahujícím proteinovou sekvenci a potom je zpracován enzymy polymerizujícími DNA, jako je Klenow fragment polymerasy I E. coli, které dokončí syntézu řetězce obsahujícího mutaci. Tak nese mutovaná sekvence a druhý řetězec požadovanou mutaci.

Tento heteroduplexní vektor je potom použit pro transformaci vhodných buněk, jako jsou E. coli JM101, a jsou vyselektovány klony obsahující rekombinantní vektory nesoucí mutované sekvence.

Po selekci takového klonu může být mutovaná sekvence RAP-2 proteinu odstraněna a může být umístěna do vhodného vektoru, obecně přenosového nebo expresního vektoru takového typu, který může být použit pro transfekci vhodného hostitele.

Také může být detekována, získána a/nebo modifikována - in vitro, in šitu a/nebo in vivo - gen nebo nukleová kyselina kódující RAP-2 protein, za použití známých technik amplifikace DNA nebo RNA, jako je PCR nebo chemická syntéza oligonukleotidů. PCR umožňuje amplifikaci (zvýšení počtu) specifických DNA sekvencí pomocí opakovaných reakcí s DNA polymerasou. Tato reakce může být použita jako náhrada za klonování; vše co je potřeba, je znalost sekvence nukleové kyseliny. Pro provedení PCR jsou navrženy primery, které jsou komplementární k vybrané sekvenci. Primery jsou potom generovány automatizovanou syntézou DNA. Protože primery mohou být navrženy tak, aby hybridizovaly na jakoukoliv část genu, mohou být vytvořeny takové podmínky, že mohou být tolerovány ·· ·· • ♦ · · • * · 9

9 9 9

9 9 · chyby v párování komplementárních baží. Amplifikace těchto chybových regionů může vést k syntéze mutovaných produktů, které vedou ke vzniku generace peptidů novými vlastnostmi (t.j. k místně cílené mutagenesi). Viz též Ausubel, výše, kap.

16. Také při spojení syntézy komplementární DNA (cDNA), využívající reverzní transkriptasy, s PCR, může být RNA použita jako výchozí materiál pro syntézu extracelulární domény prolaktinového receptoru bez klonování.

Dále, PCR primery mohou být navrženy tak, aby vkládaly nová restrikční místa nebo jiné vlastnosti, jako jsou terminační kodony, na konec genového segmentu, který je amplifikován.

Toto umístění restrikčních míst na 5' a 3' konce amplifikované genové sekvence umožňuje úpravu genových segmentů kódujících RAP-2 protein nebo jeho fragment tak, aby byly vhodné pro ligaci s jinými sekvencemi a/nebo klonovacími místy ve vektoru.

PCR a jiné způsoby amplifikace RNA a/nebo DNA jsou dobře známé v oboru a mohou být použity v předkládaném vynálezu bez zbytečného experimentování, podle popisu a návodu uvedeného v předkládaném vynálezu. Známé techniky amplifikace DNA a RNA zahrnují, ale nejsou omezeny na, polymerasovou řetězovou reakci (PCR) a podobné amplifikační procesy (viz například U.S. patenty č. 4683195, 4683202, 4800159, 1965188 (Mullis et al.; 4795699 a 4921794, Tábor et al.; 5142033 (Innis); 5122464 (Wilson et al.); 5091310 (Innis); 5066584 (Gyllensten et al.); 4889818 (Gelfand et al.); 4994370 (Silver et al. ); 4766067 (Biswas); 4656134 (Ringold); a Innis et al., ed., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) a RNA zprostředkovanou amplifikaci, která využívá protismyslnou RNA k cílové sekvenci jako templátu pro syntézu dvouřetězcové DNA (U.S. patent č. 5130238 (Málek et al.), s obchodním názvem tf tf • · • tf tf tf · tf · • · · • tftftftf « • · tftftftf · tf ·« tftf • · tf • · · • tf · • tf tf tftf tftf

NASBA); a imuno-PCR, která kombinuje použití DNA amplifikace se značením protilátkami (Ruzicka et al., Science 260: 487 (1993); Sáno et al., Scince 258: 120 (1992); Sáno et al., Biotechniques 9: 1378 (1991)), kde celé obsahy těchto patentů a publikací jsou zde uvedeny jako odkazy.

Analogickým způsobem mohou být připraveny biologicky aktivní fragmenty RAP-2 proteinů (například jakéhokoliv RAP-2 nebo jeho izoforem). Vhodné fragmenty RAP-2 proteinů jsou ty fragmenty, které si zachovávají vlastnosti RAP-2 a které mohou přímo nebo nepřímo ovlivňovat nebo zprostředkovat biologickou aktivitu RIP nebo jiných proteinů asociovaných s RIP. V souladu s tím mohou být připraveny fragmenty RAP-2 proteinu, které mají dominantně-negativní nebo dominantně-pozitivní efekt, jak byly definován výše pro analogy. Je třeba si uvědomit, že tyto fragmenty představují speciální třídu analogů podle předkládaného vynálezu, konkrétně, jsou definovanými částmi RAP-2 proteinů odvozenými od kompletní sekvence RAP-2 proteinu (například od jakéhokoliv RAP-2 nebo jeho izoforem), kde každá taková část nebo fragment má jakoukoliv z výše uvedených žádoucích aktivit. Takový fragment může být, například, peptid.

Podobně, deriváty mohou být připraveny standardní modifikací vedlejších skupin jednoho nebo více aminokyselinových zbytků RAP-2 proteinu, jeho analogů a fragmentů, nebo konjugací RAP-2 proteinu, jeho analogů nebo fragmentů, na jinou molekulu, například na protilátky, enzym, receptor atd., jak je dobře známo v oboru. Termín deriváty, jak je zde použit, zahrnuje deriváty, které mohou být připraveny z funkčních skupin přítomných jako vedlejší řetězce zbytků nebo N- nebo C-koncových skupin, za použití technik známých v oboru, a takové deriváty spadají do rozsahu

9 *

• · • ·

9 9

999 99 9

9 9 9

99999 · • 9 9

9999 9 999 9 předkládaného vynálezu. Deriváty mohou obsahovat chemické skupiny, jako je karbohydratové nebo fosfátové zbytky, s podmínkou, že taková frakce má stejnou nebo vyšší biologickou aktivitu jako RAP-2 proteiny.

Například, deriváty mohou obsahovat alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin vzniklé reakcí s amoniakem nebo primárními nebo sekundárními aminy, N.acylové deriváty nebo volné amino-skupiny aminokyselinových zbytků tvořené s acylovými skupinami (například s alkanoylovou nebo karbocyklickou aroylovou skupinou) nebo O-acylové deriváty volných hydroxylových skupin (například serylového nebo threonylového zbytku) tvořené s acylovými skupinami.

Termín derivát zahrnuje pouze ty deriváty, které nemění jednu aminokyselinu za jinou aminokyselinu z dvanácti běžných přirozených aminokyselin.

RAP-2 je protein nebo polypeptíd, t.j. sekvence aminokyselinových zbytků. Polypeptíd skládající se z delší sekvence, která obsahuje celou sekvenci RAP-2 proteinu, v souladu se zde uvedenými definicemi, spadá do rozsahu předkládaného vynálezu, pokud adice neovlivňují základní a nové charakteristiky vynálezu, t.j. pokud zachovávají nebo zvyšují biologickou aktivitu RAP-2 proteinu nebo mohou být odštěpeny za vzniku proteinu nebo polypeptidu, který má biologické aktivity RAP-2 proteinu. Předkládaný vynálezu tak zahrnuje, například, fúsní proteiny tvořené RAP-2 proteinem a jinými aminokyselinami nebo peptidy.

Nový RAP-2 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty, mají mnoho různých použití, jako například:

·· · • * 0 · · · • · · · • · « • ·· ·· ·

···· (i) RAP-2 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty mohou být použity pro ovlivnění funkce RIP ve drahách přenosu signálu vedoucích k zánětu, buněčné smrti nebo buněčnému přežívání, jak byly popsány výše. Například, pokud může RAP-2 ovlivňovat efekt RIP na aktivaci NF-KB, JNK (Jun kinasy) nebo p38 kinasy, tak mohou být oba takové účinky RAP-2 vedoucí k zesílení efektů RAP-2-RIP použity pro protinádorové, anti- a pro-zánětlivé, anti-HIV aplikace a podobně. V tomto případě mohou být RAP-2 protein, jeho analogy, fragmenty nebo deriváty, které ovlivňují zánět, zvyšují cytotoxické účinky, nebo blokují efekty vedoucí k přežívání buněk, vloženy do buněk za použití standardních postupů. Například, pokud je RAP-2 protein zcela intracelulární (jak se předpokládá) a má být vložen pouze do buněk, ve kterých je žádoucí efekt FAS-R ligandů nebo TNF nebo jiného cytotoxického proteinu zprostředkovaný RIP, tak je nutný systém pro specifické vložení tohoto proteinu do buněk. Jedním způsobem pro provedení tohoto vložení je. vytvoření rekombinantního zvířecího viru, například viru odvozeného od Vakcinie, do kterého byla vložena DNA pro následující dva geny: pro gen kódující ligand, který se váže na povrchové buněčné proteiny specificky exprimované buňkami, jako je například gpl20 protein viru HIV, který se specificky váže na některé buňky (CD4 lymfocyty a příbuzné leukemické buňky) nebo jakýkoliv jiný ligand, který se váže specificky na buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R, takže rekombinantní virový vektor je schopen vazby na takové buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R; a gen kódující RAP-2 protein. Tak způsobí exprese povrchového vazebného proteinu na povrchu viru specifické navázání viru na nádorové buňky nebo na jiné buňky nesoucí FAS-R nebo p55-R a potom je sekvence kódující RAP-2 protein vložena do buněk prostřednictvím viru a po expresi v buňkách vede k ovlivnění efektu FAS-R ligandů nebo TNF zprostředkovaného RIP nebo nezávislého na RIP.

·· ·* • · · · • · · · • · · · · • · · · • ·· ··

198:

• · · • ···· • · ···· ·

Konstrukce takových rekombinantních zvířecích virů je standardním postupem (viz například Sambrook ett al.,

Jinou možností je vložení sekvencí RAP-2 proteinu (například jakéhokoliv RAP-2 nebo jeho izoforem) ve formě oligonukleotidů, které mohou být absorbovány buňkami a exprimovány v buňkách.

(ii) Mohou být použity pro inhibici efektů FAS-R ligandu nebo TNF nebo příbuzných proteinů, které jsou zprostředkované RIP nebo nezávislé na RIP, například v případech, jako je tkáňové poškození při septickém šoku, reakce štěpu proti hostiteli nebo akutní hepatitida, při kterých je žádoucí blokování FAS-R ligandem nebo TNF indukovaného FAS-R nebo p55R spouštěného intracelulárního přenosu signálu nebo efektů nezávislých na RIP, nebo jinými proteiny zprostředkovaného přenosu signálu, a zároveň ze žádoucí posílení signalizačních drah vedoucích k přežívání buněk. V této situaci je možné, například, vložit do buněk - pomocí standardních technik oligonukleotidy mající protismyslnou kódující sekvenci pro RAP-2 protein, které účinně blokují translaci mRNA kódující RAP-2 protein a tak blokují jeho expresi a vedou k inhibici efektu FAS-R ligandu, TNF, RIP nebo jiných proteinů. Takové oligonukleotidy mohou být vloženy do buněk za použití výše uvedené přístupu využívajícího rekombinantní viry, kde druhá sekvence ve viru je oligonukleotidová sekvence.

Podobně, jak bylo uvedeno výše, v závislosti na charakteru interakce RAP-2-RIP, je možné způsoby (i) a (ii) uvedenými výše zesilovat nebo inhibovat signalizační dráhy vedoucí k zánětu nebo přežívání buněk.

Jinou možností je použití protilátek specifických pro RAP-2 protein pro inhibici jeho intracelulární signalizace.

• · • · · · • · · • · · · · ·

9

9999 9 9

Ještě jiným způsobem pro inhibici RlP-zprostředkovaných efektů nebo efektů nezávislých na RIP je nově vyvinutá ribozymová technika. Ribozymy jsou katalytické molekuly RNA, které specificky štěpí RNA. Ribozymy mohou být upraveny tak, aby štěpily zvolenou cílovou RNA, například mRNA kódující RAP2 protein podle předkládaného vynálezu. Takové ribozymy budou mít sekvence specifické pro mRNA pro RAP-2 protein a budou schopné interagovat s těmito sekvencemi (komplementární vazbou) a potom bude následovat štěpení mRNA, které povede ke snížení (nebo úplné ztrátě) exprese RAP-2 proteinu, kde úroveň snížení exprese je závislá na úrovni ribozymové exprese v cílových buňkách. Pro vložení ribozymú do zvolených buněk (například buněk nesoucích FAS-R nebo p55-R) může být použit jakýkoliv vhodný vektor, například plasmid, zvířecí virové (retrovirové) vektory, které jsou obvykle používány pro tento účel (viz (i) výše, kde virus obsahuje, jako druhou sekvenci, cDNA kódující vybranou ribozymovou sekvenci). (Pro přehled metod týkajících se ribozymú viz Chen et al., 1992; Zhao and Piek, 1993; Shore et al., 1993; Joseph and Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Baringa, 1993; Crisell et al., 1993 a Koizumi et al., 1993). Tento přístup je vhodný tehdy, když interakce RAP-2-RIP zvyšuje buněčnou cytotoxicity v situacích, ve kterých je žádoucí blokovat tuto cytotoxicitu, nebo kdy interakce RAP-2-RIP inhibuje aktivaci NF-κΒ ve stejné situaci, když je žádoucí blokovat tuto inhibici pro zvýšení takové aktivace NF-κΒ, t.j. v obou případech je žádoucí zvyšovat přežívání buněk, stejně jako ve (ii), výše.

(iii) RAP-2 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty mohou být také použity pro izolaci, identifikaci a klonování jiných proteinů stejné třídy, t.j. proteinů vážících se na RIP nebo na funkčně příbuzné receptory a proteiny účastnící se • · procesů intracelulárního přenosu signálu. V tomto použití může být využit výše uvedený kvasinkový dvouhybridový systém, nebo může být využit nově vyvinutý systém využívající southernovi hybridizace za málo přísných podmínek, po které následuje PCR klonování (Wilks et al., 1989). V publikaci od Wilks et al. je popsána identifikace a klonování dvou domnělých proteintyrosin kinas pomocí southernovi hybridizace za málo přísných podmínek, po které následuje klonování PCR založené na znalosti sekvence kinasového motivu, součásti kinasové sekvence. Tento přístup může být použit, v souladu s předkládaným vynálezem, za použití sekvence RAP-2 proteinu, pro identifikaci a klonování příbuzných RlP-vazebných proteinů.

(iv) Ještě jiným způsobem využití RAP-2 proteinu, jeho analogů, fragmentů a derivátů podle předkládaného vynálezu je jejich použití v metodách afinitní chromatografie pro izolování a identifikaci jiných proteinů nebo faktorů, které jsou schopné vazby na jiné proteiny nebo faktory účastnící se na procesech intracelulárního přenosu signálu. V této aplikaci může být RAP-2 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty individuálně navázán na matrice pro afinitní chromatografii a potom může být kontaktován s buněčnými extrakty nebo izolovanými proteiny nebo faktory podezřelými z toho, že se účastní na procesech intracelulárního přenosu signálu. Po afinitní chromatografii mohou být jiné proteiny nebo faktory, které se váží na RAP-2 protein, nebo na jeho analogy, fragmenty nebo deriváty podle předkládaného vynálezu, eluovány, izolovány a charakterizovány.

(v) Jak bylo uvedeno výše, RAP-2 protein, jeho analogy, fragmenty a deriváty podle předkládaného vynálezu mohou být také použity jako imunogeny (antigeny) pro produkci ··· · * · · · · · · • · · · · · · · · · ···· · · ······ · · · · ···· ···· · ··· · ·· · · ·· specifických protilátek namířených proti těmto antigenům. Tyto protilátky mohou být také použity pro přečištění RAP-2 proteinu (například RAP-2 nebo jakékoliv jeho izoformy) buď z buněčných extraktů nebo z transformovaných buněčných linií produkujících RAP-2 protein nebo jeho analogy nebo fragmenty.

Dále mohou být tyto protilátky použity pro diagnostické účely pro identifikaci onemocnění souvisejících s normální funkcí FAS-R ligandového nebo TNF systému zprostředkovaného RIP nebo nezávislého na aktivitě RIP, například nadměrných nebo snížených efektů indukovaných v buňce FAS-R ligandem nebo TNF zprostředkovaných RIP nebo efektů RIP samotného na buňku. Při takových onemocněních souvisejících s chybnou funkcí systému intracelulárního přenosu signálu, kterého se účastní RIP protein, nebo jiné, výše uvedené RlP-vazebné proteiny nebo RAP-2 protein samotný, mohou takové protilátky sloužit jako významný diagnostický prostředek.

Je třeba také uvést, že izolace, identifikace a charakterizace RAP-2 proteinu podle předkládaného vynálezu může být provedena za použití dobře známých vyšetřovacích technik. Například, jedna z těchto technik, kvasinkový dvouhybridový systém, jak je popsán dále, byla použita pro identifikaci RIP proteinu (viz Stanger et al., 1995) a následně různých RAP-2 proteinů podle předkládaného vynálezu (kromě jiných nových proteinů zmíněných výše a dále v souvisejících patentových přihláškách). Podobně, jak již bylo uvedeno, mohou být použity i jiné postupy, jako je afinitní chromatografie, DNA hybrídízace atd., stejně jako jiné v oboru dobře známé postupy, pomocí kterých může být provedena izolace, identifikace a charakterizace RAP-2 proteinu podle předkládaného vynálezu nebo izolace, identifikace a charakterizace dalších proteinů, faktorů, receptorů atd., které jsou schopné vazby na RAP-2 proteiny • 4 φ φ » · • · • · ·· podle předkládaného vynálezu.

Jak bylo uvedeno výše, RAP-2 protein může být použit pro generování protilátek specifických pro RAP-2 proteiny, například pro RAP-2 a jeho izoformy. Tyto protilátky nebo jejich fragmenty mohou být použity způsobem uvedeným podrobněji dále, kde v těchto aplikacích jsou tyto protilátky nebo jejich fragmenty specifické pro RAP-2 proteiny.

Na základě zjištění, že RAP-2 se specificky váže na RIP a proto je mediátorem/modulátorem RIP a tak může ovlivňovat/zprostředkovat aktivitu RIP v drahách přenosu signálu vedoucích k zánětu, buněčné smrti nebo buněčnému přežívání, kterých se účastní RIP nezávisle nebo společně s jinými proteiny (například FAS-R, p55-R, MORT-1, MACH, Mch4, G1 a TRADD v drahách vedoucích ke smrtí buněk, nebo s TRAF2 v drahách vedoucích k přežívání buněk) a proto je významné vyvinout léčiva, která mohou zesilovat nebo inhibovat interakcí RAP-2-RIP, podle potřeby a podle toho, které z těchto drah přenosu signálu jsou zesíleny/inhibovány interakcí RAP-2-RIP. Existuje mnoho onemocnění, při kterých mohou být taková léčiva značným přínosem. Mezi taková onemocnění patří například akutní hepatitida, při které akutní poškození jater odráží smrt jaterních buněk zprostředkovanou FAS-R ligandem; autoimunitně indukovanou buněčnou smrt, jako je smrt β Langerhansových buněk slinivky břišní, která je příčinou diabetů; smrt buněk při odhojení transplantátu (například ledvin, srdce nebo jater); smrt oligodendrocytů v mozku při roztroušené sklerose; a HlV-inhibovaná smrt Tlymfocytů, která způsobuje proliferaci HIV viru a proto AIDS.

Je možné, že RAP-2 nebo jedna nebo více z jeho možných izoforem může sloužit jako přirozený inhibitor RIP v jedné • ·

I» t»t · · ·· nebo více uvedených drahách a proto mohou být použity jako specifické inhibitory RIP. Podobně mohou být také vyšetřovány jiné substance, jako jsou peptidy, organické sloučeniny, protilátky atd., za účelem získání specifických léků, které mohou inhibovat interakcí RAP-2-RIP.

Příklad toho, jak mohou být peptidové inhibitory interakce RAP-2-RIP navrhovány a vyšetřovány, je založen na předchozích studiích peptidových inhibitorů ICE nebo ICE-podobných proteas, ICE specificity pro substrát a strategií pro analýzu epitopů pomocí peptidové syntézy. Bylo zjištěno, že minimálním požadavkem pro účinné štěpení peptidu ICE jsou čtyři aminokyseliny nalevo od místa štěpení se silnou preferencí pro kyselinu asparagovou v pozici Pl a s methylaminem napravo od Pl pozice (Sleath et al., 1990; Howard et al., 1991;

Thornberry et al., 1992). Dále bylo zjištěno, že fluorogenní subtrátový peptid (tetrapeptid) acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-a(4methyl-kumaryl-7-amid) (Ac-DEVD-AMC), odpovídající sekvenci v póly(ADP-ribosa)polymerase (PARP) je štěpen v buňkách krátce po FAS-R stimulaci, stejně jako v jiných apoptotických dějích (Kaufmann, 1989; kaufmann et al., 1993; Lazebník et al., 1994) a že je účinně štěpen CPP32 (člen CEEED3/ICE rodiny proteas) a MACH proteasami (a pravděpodobně také Gl-proteasami - viz například související IL 120367).

Protože se zdá, že Asp v pozici Pl substrátu je významný, mohou být tetrapeptidy obsahující Asp jako čtvrtý aminokyselinový zbytek a různé kombinace aminokyselin v prvních třech pozicích rychle vyšetřovány na vazbu na aktivní místo proteasy za použití - například - způsobu popsaného Geysenem (Geysen, 1985; Geysen et al., 1987), ve kterém je velké množství peptidů na pevných nosičích vyšetřováno na specifické interakce s protilátkami. Vazba MACH * · • · · · · proteas na specifické peptidy může být potom detekována za použití různých dobře známých detekčních metod, jako je radioaktivní značení G1 proteas a podobně. Bylo prokázáno, že tato Geysenova metoda umožňuje testování alespoň 4000 peptidů každý pracovní den.

Podobným způsobem může být analyzován přesný vazebný region nebo region homologie, který určuje interakci mezi RAP-2 a RIP, a mohou být vyhledávány peptidy, které blokují tuto interakci, například peptidy syntetizované tak, že mají podobnou sekvenci jako je sekvence vazebného regionu nebo sekvence komplementární k vazebnému regionu, které soutěží s přirozeným RAP-2 o vazbu na RIP.

Léky nebo peptidové inhibitory, které jsou schopné inhibovat zánětlivou nebo smrtící aktivitu RAP-2 inhibici interakce RAP-2-RIP mohou být také konjugovány s molekulami, které usnadňují jejich vstup do buňky, nebo mohou být v komplexu s takovými molekulami.

U.S. patent 5149782 popisuje konjugaci molekul, které mají být transportovány přes buněčnou membránu, s činidly splývajícími s membránami, jako jsou fusogenní polypeptidy, polypeptidy vytvářející iontové kanály, jiné membránové polypeptidy a mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, jako je například kyselina myristová nebo kyselina palmitová. Tato činidla mísící se s membránami vkládají molekulový konjugát do lipidové dvoj vrstvy buněčných membrán a usnadňují jejich vstup do cytoplasmy.

Low et al., U.S. patent 5108921, uvádí přehled dostupných metod pro transmembránový přenos molekul jako jsou, například, proteiny a nukleové kyseliny, pomocí mechanismu receptory • · zprostředkované endocytotické aktivity. Tyto receptorové systémy zahrnují systémy rozpoznávající galaktosu, mannosu, mannosa-6-fosfat, transferin, asialoglykoprotein, transkobalamin (vitamin B12), a-2 makroglobuliny, insulin a jiné peptidové růstové faktory, jako je epidermální růstový faktor (EGF). Low et al. uvádějí, že receptory pro nutriční sloučeniny, jako jsou receptory pro biotin a folát, mohou být výhodně použity pro zesílení transportu přes buněčnou membránu díky lokalizaci a četnosti receptorů pro biotin a folát na povrchových membránách většiny buněk a asociovaným receptory zprostředkovaným mechanismům transmembránového přenosu. Tak je komplex vytvořený mezi sloučeninou, která má být dopravena do cytoplasmy, a ligandem, jako je biotin nebo folát, kontaktován s buněčnou membránou nesoucí receptory pro biotin nebo folát za iniciace receptory zprostředkovaných mechanismů transmembránového přenosu, které umožní vstup vybrané sloučeniny do buňky.

Dále je v oboru známo, že fúzování vybrané peptidové sekvence se sekvencí vedoucího/signálního peptidu vytváří chimérický peptid, který může být transportován přes buněčnou membránu do cytoplasmy.

Jak bude odborníkům v oboru peptidu jasné, zahrnují peptidové inhibitory interakce RAP-2-RIP podle předkládaného vynálezu peptidomimetické léky nebo inhibitory, které mohou být také rychle vyšetřovány na vazbu na RAP-2/RIP proteasu za účelem vytvoření ješté stabilnějších inhibitorů.

Je třeba si také uvědomit, že stejné prostředky, jaké byly uvedeny výše pro usnadnění nebo zesílení transportu peptidových inhibitorů přes buněčné membrány, jsou také použitelné pro RAP-2 nebo jeho izoformy samotné, stejně jako * 9 · · • · · *

9 9 9 9 ·9 · • 9 9 9 9 pro jiné peptidy a proteiny, které vykazují jejich účinky intracelulárně.

Termín protilátka, jak byl použit výše, označuje polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), chimérické protilátky, anti-idiotypové protilátky (anti-Id) k protilátkám, které mohou být značené v rozpustné nebo navázané formě, stejně jako jejich fragmenty získané jakoukoliv známou technikou, jako je, například, enzymové štěpení, peptidová syntéza nebo rekombinantní technika.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populace protilátek získaná ze séra zvířat imunizovaných antigenem. Monoklonální protilátka obsahuje v podstatě homogenní populaci protilátek specifických k antigenům, kde tato populace obsahuje významně podobná vazebná místa pro epitop. Mab mohou být získány způsoby známými odborníkům v oboru. Viz například Kohler and Milstein, Nátuře, 256: 495-497 (1975); U.S. patent

č. 4376110; Ausubel et al., ed., Harlow and Lané ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory (1988); a Colligan et al., ed., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc., and Wiley Interscience N.Y. (1992-1996), kde obsahy těchto citací jsou zde uvedeny jako odkazy.

Takovými protilátkami mohou být imunoglobuliny jakýchkoliv tříd, včetně IgG, IgM, IgE, IgA, GILD a jakýchkoliv jejich podtříd. Hybridom produkující mAb podle předkládaného vynálezu může být kultivován in vitro, in šitu nebo in vivo. Produkce vysokých titrů mAb in vivo nebo in šitu umožňuje tuto v současnosti preferovanou metodu produkce.

Chimérické protilátky jsou molekuly, ve kterých pocházejí různé části od různých živočišných druhů, jako jsou molekuly, které mají variabilní region z myší mAb a lidský ··· ♦ · ·· · · * · · · ·· · · « ♦ • · · · · ♦ « · » ······ · · · · · · · • · · · 9 4 4 · ···· · ··· ·»· ·· ·· imunoglobulinový konstantní region. Chimérické protilátky jsou primárně použity pro snížení imunogenicity při aplikaci a pro zvýšení výnosu při přípravě, například, když má myší mAb vyšší výtěžek z hybridomů, ale vyšší imunogenicitu u člověka, tak se použije lidská/myší chimérická mAb. Chimérické protilátky a způsoby jejich produkce jsou v oboru známé (Cabílly et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984);

Boulianne et al., Nátuře 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., Evropská patentová přihláška 125023 (publikovaná 14.11.1984); Neuebrger et al., Nátuře 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., Evropská patentová přihláška 171496 (publikovaná 19.2.1985); Morrison et al., Evropská patentová přihláška 173494 (publikovaná 5.3.1986); Neuberger et al. , PCT přihláška WO 8601533 (publikovaná 13.3.1986); Kudo et al., Evropská patentová přihláška 184187 (publikovaná 11.6.1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al.,

Mezinárodní patentová přihláška č. WO 8702671 (publikovaná 7.5.1987); Liu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 34393443 (1987); Sun et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); a

Harlow and Lané, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, výše. Tyto citace jsou zde uvedeny ve své úplností jako odkazy.

Anti-idiotypová (anti-Id) protilátka je protilátka, která rozpoznává jedinečné determinaty obyčejně asociované s vazebným místem protilátky pro antigen. Id protilátka může být připravena imunizací zvířete stejného druhu a genetického typu (například myšího kmenu) jako je zdroj protilátek, ke kterému má být připravena anti-Id. Imunizované zvíře bude rozpoznávat a reagovat na idiotypové determinatny imunizační protilátky a bude produkovat protilátky k těmto idiotypovým determinantám (anti-Id protilátky). Viz, například, U.S.

•« · » · 4 • · · • 444· 4 patent č. 4699880, kde je zde uveden jako odkaz.

Anti-Id protilátka může být také použita jako imunogen pro indukci imunitní odpovědi v ještě jiném zvířeti, které potom produkuje takzvané anti-anti-Id protilátky. Anti-anti-Id protilátky mohou být epitopovš identické s původními mAb, které indukovaly anti-Id. Tak je možné pomocí použití protilátek k idiotypovým determinantám mAb identifikovat jiné klony exprimující protilátky identické specificity.

V souladu s tím mohou být mAb proti RAP-2 proteinům, jejich analogům, fragmentům a derivátům podle předkládaného vynálezu použity pro indukci anti-Id protilátek u vhodných zvířat, jako jsou BALB/c myši. Buňky sleziny od takových imunizovaných myší mohou být použity pro přípravu anti-Id hybridomů secernujících anti-Id mAb. Kromě toho mohou být anti-Id mAb navázány na nosič, jako je přílipkový hemokyanin (KLH) a mohou být použity pro imunizaci dalších BALB/c myší. Sérum od těchto myší bude potom obsahovat anti-anti-Id protilátky mající vazebné vlastnosti původních mAb specifických pro epitop výše uvedeného RAP-2 proteinu nebo jeho analogů, fragmentů a derivátů.

Anti-Id mAb mají proto své vlastní idiotypové epitopy, nebo idiotopy strukturálně podobné hodnoceným epitopům, jako je GRB protein-a.

Termín protilátka také zahrnuje jak intaktní molekuly, tak jejich fragmenty, jako jsou, například, Fab a F(ab')2, které se mohou vázat na antigen. Fab a F(ab')2 fragmenty neobsahují Fc fragment intaktní protilátky, jsou rychleji odstraňovány z cirkulace a mohou mít méně specifickou vazbu na tkáně než intaktní protilátka (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 « » • · · · · • 9 9 9 (1983)) .

Je třeba si uvědomit, že Fab a F(ab')2 a jiné fragmenty protilátek použitelné v předkládaném vynálezu mohou být použity pro detekci a kvantifikaci RAP-2 proteinu za použití metod popsaných pro intaktní protilátky. Takové fragmenty jsou obvykle připraveny proteolytickým štěpením, za použití enzymů jako je papain (pro přípravu Fab fragmentů) nebo pepsin (pro přípravu F(ab')2 fragmentů.

Protilátka je schopná vazby na molekulu, pokud může specificky reagovat s molekulou a tak vázat molekulu na protilátku. Termín epitop označuje tu část jakékoliv molekuly schopné vazby na protilátku, která může být také rozpoznávána protilátkou. Epitopy nebo antigenní determinanty se obvykle skládají z chemicky aktivních povrchových uskupení molekul jako jsou aminokyseliny nebo sacharidové vedlejší řetězce a mají specifické trojrozměrné strukturální charakteristiky, stejně jako specifický náboj.

Antigen je molekula nebo část molekuly, která se může vázat na protilátku a které může dále indukovat produkci protilátek schopných vazby na epitop antigenu u zvířete. Antigen může mít jeden nebo více než jeden epitop. Specifická reakce popsaná výše znamená, že antigen reaguje, vysoce selektivním způsobem, s příslušnou protilátkou a ne s jinými protilátkami, které mohou být vyvolány jinými antigeny.

Protilátky, včetně fragmentů protilátek, použitelné v předkládaném vynálezu, mohou být použity pro kvantitativní nebo kvalitativní detekci RAP-2 proteinu ve vzorku nebo pro detekci buněk, které exprimují RAP-2 protein podle předkládaného vynálezu. Toto může být provedeno za použití • * • · · (Λ

• · ·« · *·· imunofluorescenční techniky využívající fluorescentně značené protilátky (viz dále) spolu s světelnou mikroskopií, průtokovou cytometrií nebo fluorometrickou detekcí.

Protilátky (nebo jejich fragmenty) použitelné v předkládaném vynálezu mohou být použity histologicky, například v imunofluorescenční nebo imunoelektronové mikroskopii, pro detekci RAP-2 proteinu podle předkládaného vynálezu in šitu. Detekce in šitu může být provedena odběrem histologického vzorku od pacienta a aplikací značené protilátky podle předkládaného vynálezu k takovému vzorku. Protilátka (nebo její fragment) je výhodně aplikována nebo nanesena jako značená protilátka (nebo její fragment) na biologický vzorek. Pomocí takového postupu je možno určit nejen přítomnost RAP-2 proteinu, ale také jeho distribuci ve vyšetřované tkáni. Odborníkům v oboru bude jasné, že za použití předkládaného vynálezu mohou být různé histologické metody (jako jsou histologická barvení) modifikovány pro provedení takové detekce in šitu.

Takové testy na RAP-2 protein podle předkládaného vynálezu obvykle obsahují inkubaci biologického vzorku, jako je biologická tekutina, tkáňový extrakt, čerstvě získané buňky, jako jsou lymfocyty nebo leukocyty, nebo buňky, které byly inkubovány ve tkáňové kultuře, v přítomnosti detekovatelně značené protilátky schopné identifikace RAP-2 proteinu, a detekování takové protilátky jakoukoliv technikou známou v oboru.

Biologický vzorek může být zpracován s nosičem ve formě pevné fáze nebo s nosičem jako je nitrocelulosa, nebo s jiným nosičem, který umožňuje imobilizaci buněk, buněčných částic nebo rozpustných proteinů. Nosič může být potom propláchnut • * » · vhodným pufrem a potom může následovat aplikace detekovatelně značené protilátky podle předkládaného vynálezu, jak byla popsána výše. Pevný nosič může být potom podruhé promyt pufrem pro odstranění nenavázané protilátky. Množství značky na uvedeném pevném nosiči může být potom detekováno běžnými prostředky.

Termíny pevný nosič, nosič ve formě pevné fáze, nosič zahrnují jakékoliv nosiče schopné vázat antigen nebo protilátky. Mezi dobře známé nosiče patří -sklo, polystyren, polypropylen, polyethylen, dextran, nylonové amylasy, přirozené nebo modifikované celulosy, polyakrylamidy, gabro a magnetit. Pro účely předkládaného vynálezu může být nosič částečně rozpustný nebo nerozpustný. Materiál nosiče m ůže mít v podstatě jakoukoliv možnou strukturální konfiguraci, pokud je navázaná molekula schopna vazby antigenu nebo protilátky. Tak může být konfigurace nosiče sférická, jak je tomu u korálků, cylindrická, jak je tomu u vnitřního povrchu testovací zkumavky nebo u zevního povrchu tyčinky.

Alternativně může být povrch plochý, jak je tomu u listů, testovacích proužků atd.... Výhodnými nosiči jsou polystyrénové proužky. Odborníkům v oboru budou známé jiné vhodné nosiče pro navázání protilátky nebo antigenu, nebo budou schopni určit takové nosiče bez zbytečného experimentování.

Vazebná aktivita dané šarže protilátek podle předkládaného vynálezu, jak byly popsány výše, může být stanovena za použití dobře známých metod. Odborníci v oboru jsou schopni vybrat funkční a optimální testovací podmínky pro každé stanovení za použití běžných pokusů.

Test může také obsahovat další kroky, jako je promývání, míšení, třepání, filtrace a podobně, pokud jsou obvyklé nebo « * * * * · · · * • * •« ; ί nutné v určité situaci.

Jedním způsobem, kterým může být protilátka podle předkládaného vynálezu detekovatelné značena, je navázání protilátky na enzym a její použití enzymovém imunotestu (EIA). Tento enzym po expozici vhodnému substrátu reaguje s tímto substrátem takovým způsobem, že dojde ke vzniku chemické skupiny, která může být detekována, například spektrofotometricky, fluorometricky nebo vizuálně. Mezi enzymy, které mohou být použity pro detekovatelné značení protilátky, patří, například, malat-dehydrogenasa, stafylokoková nukleasa, delta-5-steroid-izomerasy, kvasinková alkohol-dehydrogenasa, α-glycerofosfat dehydrogenasy, triosafosfat-izomerasa, křenová peroxidasa, alkalická fosfatasa, asparaginasa, glukosaoxidasa, β-galaktosidasa, ribonukleasa, ureasa, katalasa, glukosa-6-fosfat dehydrogenasa, glukoamylasa a acetylcholin-esterasa. Detekce může být provedena kolorimetrickými metodami, které využívají chromogenní substrát pro enzym. Detekce může být také provedena vizuálním srovnáním rozsahu enzymatické reakce substrátu s podobně připravenými standardy.

Detekce může být provedena za použití mnoha dalších imunotestu. Například, pomocí radioaktivního značení protilátek nebo protilátkových fragmentů je možno detekovat RPTPasy pomocí radioimunotestu (RIA). Dobrý popis RIA je uveden v Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology, Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), zejména v kapitole nazvané An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniqiue, Chard, T., která je zde uvedena jako odkaz. Radioaktivní izotop může být detekován pomocí gama kamery nebo scintilační kamery nebo autoradiograficky.

• »

9 9 9 « · 9 9 ·9 9 * 9 ·

99 « » * * « · « «· • 99 9

9 999 9 ·

9 · « ·· · 9 99 9

Je také možné značit protilátky podle předkládaného vynálezu fluorescentními sloučeninami. Když je fluorescenčně značená protilátka vystavena působení světla správné vlnové délky, tak může být detekována díky fluorescenci. Mezi nejčastěji používané fluorescenčně značené sloučeniny patří fluorescein isothiokyanatan, rhodamin, fykoerythrin, pykokyanin, allofykokyanin, o-ftaldehyd a fluorescamin.

Protilátka může btý také detekovatelně značena za použití kovů emitujících fluorescenci, jako je 152E nebo jiné kovy lanthanidové řady. Tyto kovy mohou být navázány na protilátku pomocí skupin chelatujících kovy, jako je kyselina diethylentriaminpentaoctová (ETPA).

Protilátka může být také detekovatelně značena tím, že je navázána na chemiluminiscenční sloučeninu. Přítomnost protilátky navázané na chemiluminiscenční sloučeninu je potom stanovena detekcí přítomnosti luminiscence, která vzniká v průběhu chemické reakce. Příklady použitelných chemiluminiscenčních značících sloučenin jsou luminol, isoluminol, theromatický ester akridinia, imidazol, sůl akrinidia a oxalatový ester.

Podobně může být pro značení protilátky podle předkládaného vynálezu použita bíoluminíscentní sloučenina. Bioluminiscence je typ chemiluminiscence vyskytující se v biologických systémech, ve kterých katalytický systém zvyšuje účinnost chemiluminiscentní reakce. Přítomnost bioluminiscentního proteinu je stanovena detekcí přítomnosti luminiscence. Významnými bioluminiscentními sloučeninami pro účely značení jsou luciferin, luciferasa a aequorin.

• »

4 4

4 94 4

4 4

9 4

4 9.

4 4 * *

Molekula protilátky podle předkládaného vynálezu může být upravena pro použití v imunometrickém testu, který je také známý jako dvoumístný nebo sandwichový test. V typickém imunometrickém testu je určité množství neznačené protilátky (nebo fragmentu protilátky) navázáno na pevný nosič a přidá se určité množství značené rozpustné protilátky pro umožnění detekce a/nebo kvantifikace ternárního komplexu vytvořeného mezi protilátkou na pevné fázi, antigenem a značenou protilátkou.

Mezi typické a výhodné imunoterické testy patří postupné testy, ve kterých je protilátka navázaná na pevný nosič nejprve kontaktována s testovaným vzorkem pro extrakci antigenu ze vzorku pomocí tvorby binárního komplexu vytvořeného mezi protilátkou pevné fáze a antigenem. o vhodné inkubační periodě je pevný nosič promyt pro odstranění zbytku kapaliny, která obsahuje nezreagovaný antigen, a potom je kontaktována s roztokem obsahujícím neznámé množství značené protilátky (která účinkuje jako reportérové molekula). Po druhé inkubační době umožňující tvorbu komplexu značené protilátky s antigenem navázaným na pevný nosič prostřednictvím neznačené protilátky se pevný nosič promyje podruhé pro odstranění nenavázané značené protilátky.

V jiném typu sandwichového testu, který může být také použit s antigeny podle předkládaného vynálezu, se použije takzvaný simultánní a reversní test. Simultánní test obsahuje Eden inkubační krok, protože protilátka navázaná na pevný nosič a značená protilátka jsou obě přidány do testovaného vzorku ve stejný čas. Po dokončení inkubace se pevný nosič promyje pro odstranění zbytku kapalného vzorku a nenavázané značené protilátky. Přítomnost značené protilátky asociované s pevným nosičem se potom stanoví stejným způsobem, • 9 9 tf • · · • tftftftf « tftf tftf · tf tftftftf tftf· tftf tftf jako v běžném postupném sandwichovém testu.

V reversním testu se provede nejprve přidáni prvního roztoku obsahujícího značenou protilátku do testovaného kapalného vzorku, a potom se po vhodné inkubační době provede přidání neznačené protilátky navázané na pevný nosič. Po druhé inkubační době se pevná fáze promyje běžným způsobem pro odstranění volného zbytku kapalného vzorku a nenavázané značené protilátky. Přítomnost značené protilátky asociované s pevným nosičem se potom stanoví stejným způsobem, jako v běžném simultánním a postupném sandwichovém testu.

RAP-2 proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být produkovány jakoukoliv standardní technikou rekombinantní DNA (viz například Sambrook et al., 1989, a Ansabel et al., 19871995, výše), ve které jsou vhodné prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky dobře známé v oboru transformovány vhodnými prokaryotickými nebo eukaryotickými vektory obsahujícími sekvence kódující proteiny. V souladu s tím se předkládaný vynález také týká takových expresních vektorů a transformovaných hostitelů pro produkci proteinů podle předkládaného vynálezu. Jak bylo uvedeno výše, mezi tyto proteiny také patří jejich biologicky aktivní analogy, fragmenty a deriváty a proto mezi takové vektory patří i vektory kódující analogy a fragmenty těchto proteinů a mezi transformované hostitele patří i hostitelé produkující takové analogy a fragmenty. Deriváty těchto proteinů, produkované transformovanými hostiteli, jsou deriváty produkované standardní modifikací proteinů nebo jejich analogů nebo fragmentů.

Předkládaný vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících rekombinantní zvířecí virové vektory kódující

44 44

4 4 9 4 4

4 4 9 4

9 4 4 4 9

9 4 4 4

444 49 ♦ * «* * » 9 ♦ · • » » • ·»·» 4 t

4949 4 4

RAP-2 proteiny, kde tyto vektory také kódují virový povrchový protein schopný navázat se na povrchové proteiny specifických cílových buněk (například na nádorových buněk), pro umožnění vložení sekvencí pro RAP-2 proteiny do těchto buněk. Další farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují jako aktivní složku (a) oligonukleotidovou sekvenci kódující protismyslnou sekvenci k sekvenci RAP-2 proteinu, nebo (b) léky, které blokují RAP-2-RIP interakci.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují dostatečné množství aktivní složky pro dosažení požadovaného účinku. Dále mohou farmaceutické prostředky obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče, včetně přísad a pomocných činidel, která usnadňují zpracování aktivní složky na prostředek, který může být použit farmaceuticky a včetně přísad, které mohou stabilizovat takové prostředky pro podání jedinci, který potřebuje takovou léčbu, jak je vybrán odborníkem v oboru.

Předpokládá se, že RAP-2 protein a jeho izoformy nebo izotypy jsou exprimovány v různých tkáních ve značně odlišných množstvích a také se jiným profilem izotypů, stejně jako tomu je u různých jiných proteinů, které se účastní na intracelulárních drahách přenosu signálu, jak jsou popsány ve výše uvedených souvisejících patentových přihláškách. Tyto rozdíly mohou přispívat k tkáňově-specifickému charakteru reakce na Fas)APOl-ligandy a TNF. Stejně jako v případě jiných CED3/ICE homologů (Wang et al., 1994; Alnemri et al., 1995) předkladatelé vynálezu již dříve prokázali (ve výše uvedených patentových přihláškách), že izoformy MACH, které obsahují nekompletní CED3/ICE regiony (například MACHa3) mají inhibiční efekt na aktivitu současně exprimovaných MACHal nebo MACHa2 molekul; také bylo zjištěno, že blokují indukci buněčné smrti * * « • ♦ · « ♦ · ’ ···» · ·«· »·« ·» ♦»

Fas/APOl a p55-R. Exprese takových inhibičních izoforem v buňkách může tvořit mechanismus buněčné sebeobrany proti cytotoxicitě zprostředkované Fas/APOl a TNF. Také se předpokládá podobný inhibični účinek alespoň některých izoforem Gl (Gl je nově izolovaný nový Mch4- a snad MACHvazebný protein, který obsahuje MORT moduly a proteasovou doménu - viz související IL 120367). Značná heterogenita izoforem MACH a předpokládaná, analogická heterogenita izoforem Gl, která značně převyšuje heterogenitu pozorovanou u ostatních proteas CED3/ICE rodiny, umožňuje značně jemné ladění funkce aktivních izoforem MACH3, a analogicky také aktivních izoforem Gl. Proto, jak bylo uvedeno výše, RAP-2 proteiny nebo možné izoformy mohou mít různé účinky na různé tkáně s ohledem na jejich interakce s RIP a ovlivnění rovnováhy mezi aktivací drah buněčné smrti nebo přežití, jak byly popsány výše.

Je také možné, že některé z možných RAR-2 izoforem mají jiné funkce. Například, RAP-2 nebo některé izoformy RAP-2 mohou působit jako vazebná místa pro molekuly, které se účastní jiných, necytotoxických účinků Fas/APOl a TNF receptorů prostřednictvím interakce s RIP nebo nezávisle na RIP.

Vzhledem k jedinečné schopností Fas/APOl a TNF receptorů způsobovat zánět, buněčnou smrt, stejně jako ke schopnosti TNF receptorů spouštěn jiné aktivity poškozující tkáně, mohou být chybné funkce těchto receptorů zejména škodlivé pro organismus. Kromě toho bylo prokázáno, že jak nadměrná, tak snížená funkce těchto receptorů přispívá k patologickým projevů různých onemocnění (Vasalli, 1992; Nagata and Golstein, 1995). Identifikace molekul, které se účastní přenosu signálu od receptorů, a objevení způsobů pro ovlivnění

# · · · φ • φ · · • · ♦· aktivity těchto molekul, může vést k novým terapeutickým přístupům. Jiné aspekty předkládaného vynálezu budou popsány v následujících příkladech.

Vynález bude nyní popsán podrobněji v následujících příkladech a připojených výkresech.

Je třeba si uvědomit, že postupy:

(i) dvouhybridového vyhledávání a dvouhybridového testu exprese β-galaktosidasy; (ii) indukované exprese, metabolického značení a imunoprecipitace proteinů; (iii) vazby in vitro;

(iv) hodnocení cytotoxicity; a (v) northernova přenosu a analýzy sekvence (viz též Boldin et al., 1995b)2, 3 (viz též Boldin et al., 1996) a 4, dále, týkající se MORT-1 a MORT-1vazebného proteinu (například MACH), stejně jako nově izolovaného proteinu Gl (viz IL 120367), jsou také plně použitelné (s určitými modifikacemi) pro odpovídající izolaci, klonování a charakterizaci RAP-2 a jeho možných izoforem podle předkládaného vynálezu. Tyto postupy jsou proto konstruovány jako úplný popis stejných postupů použitých pro izolaci, klonování a charakterizaci RAP-2 podle předkládaného vynálezu, jak jsou podrobně popsány v souvisejících Izraelských patentových přihláškách č. 114615, 114986, 115319,

116588,117932 a 120367, stejně jako v příslušné PCT přihlášce č. PCT/US96/10521. Dále, NIK protein a jeho úloha v aktivaci NF-KB a tak v přežívání buněk a úloha TRAF2 při tomto přežívání buněk, například interakce mezi TRAF2 a RIP a jinými proteiny, byly popsány vynálezci v souvisejících IL 117800, IL 119133 a Malinin et al., 1997.

• · • · · ► ···« *« »· • 9 9 9 • · · * • · · · • · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Klonování a izolace RAP-2 protein, který se váže na RIP protein

Dvouhybridové vyhledávání, sekvencování a předběžné analýzy

Za použití dvouhybridového vyhledávání s RIP jako zachycovacím činidlem (viz například Fields and Song, 1989, WO/96/18641) v B-buněčné knihovně byl izolován klon o velikosti přibližně 1,5 kb. Tento 1,5 kb klon (viz šipku na obr. 1 a 2) byl použit pro prohledávání fágové knihovny cDNA, za zisku přibližně 2,0 kb klonu, jehož sekvence je uvedena na obr.1.

Pomocí EST párování se sekvencí 1,5 kb klonu byl získán EST fragment, který vytváří 3' konec I.M.A.G.E konsorcium klonu č. 41072 (Research Genetics Institute). Z tohoto klonu, který pochází z knihovny fetálního mozku, jsou publikovány pouze dva malé fragmenty sekvence a jeho 3' a 5' konce. Po získání klonu byl tento klon sekvencován a byl vyloučen, pokud tyto publikované fragmenty obsahovaly chyby, bylo zjištěno, že tento sekvencovaný klon (obr. 2) je identický s klonem podle obr. 1 a jeho kódujícím regionem, ale vykazoval odlišnosti v 5'-nekódujícím regionu. Proto se předpokládá, že obě cDNA jsou alternativně sestřiženými formami stejného genu.

Analýza sekvence ukázala, že podobně jako RAP neobsahuje RAP-2 protein smrtící doménu, neobsahuje MORT modul, neobsahuje proteasovou doménu jako proteiny ICE rodiny, neobsahuje kinasovou doménu, neobsahuje TRAF domény (pro různé domény přítomné v intracelulárních drahách přenosu signálu viz výše uvedené související patentové přihlášky a různé odkazy, φ φ « φ φ zejména Malinin et al., 1997). V dané sekvenci nebyly přítomné také žádné významné motivy, s výjimkou tří bloků podobných leucinovému prstu (LZ) rovnoměrně distribuovaných v kódujícím regionu proteinu. Tyto bloky byly označeny jako podobné, protože dva z nich obsahují substituce Leu za Val, Met nebo Ile. Ačkoliv se takové substituce považují obvykle za konzervativní, není jasné, zda takové substituce v doméně leucinového prstu umožňují zachování funkční aktivity proteinu, tj . vazby na jiné LZ. Vazebné studie ukázaly, že RAP-2 se váže na RIP a že RAP-2 není schopen vazby na TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R a MACH (v dosud provedených studiích). Tyto výsledky podporují skutečnost, že RAP-2 neobsahuje smrtící domény a MORT moduly.

Proto se zdá, že RAP-2 je specifický RlP-vazebný protein, který interaguje s/váže se na RIP velmi specifickým způsobem. Tak se zdá, že RAP-2 je specifický modulátor/mediátor intracelulární aktivity RIP, který má významnou úlohu v RIP ovlivnění/zprostředkování drah přenosu signálu vedoucích k zánětu a buněčné smrti/přežívání.

Stručně, klon RAP-2 byl získán pomocí dvouhybridového vyhledávání v lidské B-buněčné knihovně cDNA za použití kompletního RIP proteinu jako zachycovacího činidla. RIP sekvence byla dostupná z předchozích publikací (například Stanger et al., 1995) a je uvedena v GenBank databázi pod přírůstkovým č. U 25994 (lidská RIP sekvence) (také je uvedena myší RIP sekvence - pod přírůstkovým č. U 25995) . Podle této sekvence byly navrženy vhodné PCR-primery pomocí OLIGO4^(tra) softwaru a DNA fragment odpovídající kódující části RIP byl získán PCR za použití cDNA z celkové RNA knihovny lidských fibroblastů jako templátu (za použití standardních postupů). Tato kódující část RIP byla potom klonována do vektoru pGBT-9 (Clontech) a byla použita jako zachycovací činidlo, jak bylo uvedeno výše, ve dvouhybridovém vyhledávacím postupu. V tomto dvouhybridovém vyhledávání byl získán klon kódující RIPvazebný protein, který interaguje s RIP.

Tento klon byl použit pro prohledávání fágové cDNA knihovny a EST databanky. Jak je vidět z obr. 1 a 2, kódující sekvence dvou klonů jsou identické, zatímco 5'-nekódující regiony jsou odlišné. Tak byly pravděpodobně získány dvě alternativně sestřižené formy. Klony mají velikost přibližně 2,0 kb s ORF (otevřeným čtecím rámcem) velikosti přibližně 1,5 kb, který určuje molekulovou hmotnost proteinu samotného přibližně 50 kd. Odvozená aminokyselinová sekvence RAP-2 je uvedena na obr.

3.

Analýzy výše uvedených sekvencí RAP-2 klonu a sekvencí v ,dbest' databázi, Human Genome Databázi úrovně 1 a GenBank databázi ukázaly, že RAP-2 sekvence je jedinečná (nová) sekvence, protože žádná známá sekvence nevykazuje jakoukoliv významnou homologii s touto RAP-2 sekvencí. Po podání IL 123758, podle které tato přihláška nárokuje prioritu, Yamaoka S. et al., (1998), popsal charakterizaci myší cDNA kódující 48 kDa protein, který byl označen NEMO (podle esenciální modulátor NF-κΒ) (viz dosavadní stav techniky).

Další prohledávání databází (in silico) identifikovalo FIP2 - protein neznámé funkce, který původně klonovali Li, Y. et al. (1998, viz dosavadní stav techniky).

Jak je vidět z celkového sestavení RAP-2 a FIP-2 sekvencí (obr. 3), je stupeň celkové podobnosti dosti nízký (proto není překvapující, že sekvence nebyla identifikována při použití vyhledávání založeného na globálních algoritmech). Homologie

99

9 9 9

9 9 * · * 9

9 9 9

99

9

9 9 ·

9 9 ···· · ♦ · • ·· · · 9

I» * mezi RAP-2 a FIP-2 se zvyšuje směrem k C-koncům proteinů a vrcholí ve v podstatě identických C-koncových 30 aminokyselinách. Nicméně, kromě posledního regionu je v RAP-2 značně konzervován domnělý LZ-motiv FIP-2 (s výjimkou substituce Ile/Ala).

Také byla identifikována další kratší RAP-2 cDNA velikosti přibližně 0,5 kb (ID: 1469996), která byla potom označena jako human shrt. Varianta obsahuje bloky kódující sekvence odvozené od několika vzdálených regionů 1,5 kb kompletní cDNA a je pravděpodobně vzniklá v důsledku alternativního sestřihu stejného genu.

Byla provedena analýza northernovým přenosem v Multiple Tissue Norther blot (Clontech) s 0,9 kb BglII-fragmentem RAP-2 cDNA, která ukázala komplexní charakter RAP-2 mRNA. Bylo detekováno alespoň 5 různých mRNA, v rozsahu velikostí od < 1 kb do > 7 kb, s více nebo méně vyznačenou prevalencí 2,5 kb a 6 kb varianty (obr. 4A).

Příklad 2: Identifikace myšího RAP-2

Podobné prohledávání myšího EST souboru v TIGR odhalilo částečnou cDNA velikosti 1,6 kb (Mouše part. ID 761011, obr.

3), která pravděpodobně odpovídá myšímu RAP-2, protože je v podstatě identická (95%) s lidským protějškem v kódujícím regionu (viz obr. 3).

Nicméně, odlišnosti mezi lidským a myším RAP-2 a NEMO přesahují odlišnosti, které by mohly být přisouzeny mezidruhovým variacím. Skutečně, chybějící blok 7 aminokyselin (pozice 249 v 20.4) z myší RAP-2 a NEMO sekvence a inserce 3 aminokyselin (KLE v pozici 111) v otevřeném čtecím rámci NEMO

99 99

99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 • ···»·«

9 9 9 9 9

999 999 99 99 ·· · • · »

9 9 • 9999

9 ve srovnání s kompletní lidskou variantou a částečnou myší sekvencí jsou pouze nejviditelnějšími příklady (obr. 3). Tyto však mohou vést k funkčnímu ovlivnění aktivity proteinu.

Funkce popsané pro NEMO se skutečně zdají být opačné než funkce popsané pro lidský RAP-2, ačkoliv frakcionační analýza pro NEMO potvrdila, že je lokalizován v signalsomu.

Příklad 3: Vazba RIP na RAP-2 v savčích buňkách

Další důkaz biologického významu RIP-RAP-2 interakce byl získán v transfektovaných HEK-293T a HeLa buňkách. Kromě toho, tyto proteiny mohou být snadno současně vysráženy z buněčných lyzátů HEK-293 (ATCC č. CRL 1573) buněk transfektovaných způsobem uvedeným dále v každé dráze na obr. 4B a mohou být imunitně sráženy pomocí anti-FLAG mAb (Kodak). Imunokomplexy byly potom analyzovány na přítomnost HIS-RAP-2 pomocí běžného westernového přenosu s anti-His6 mAb (Sigma) (obr. 4B a data nejsou uvedena). Nicméně, tvorba takových komplexů nevede k RIP enzymatické aktivitě: v rozsahu, který jsme mohli ověřit imunokomplex-kinasovým testem in vitro nefosforyloval nadměrně exprimovaný RIP RAP-2 (není uvedeno).

Vazebné testy byly provedeny pro stanovení toho, zda se RAP-2 váže na jakýkoliv jiný známý intracelulární signalizační protein. V těchto testech byly proteiny TRADD, MORT-1, p55-R, p75-R, MACH testována na schopnost vazby na RAP-2. Nicméně, bylo zjištěno, že RAP-2 není schopen vazby na jakýkoliv z těchto proteinů. RAP-2 se také neváže na žádný z kontrolních proteinů, například na lamin, cyklin D.

Všechny výše uvedené výsledky naznačují, že nový RAP-2 protein pravděpodobně interaguje s RIP velmi specifickým způsobem a jako takový představuje specifický

· * · · · · · modulátor/mediátor RIP.

Příklad 4: RAP-2 interaguje s NIK a ovlivňuje transkripci závislou na NF-KB a c-Jun

Ačkoliv žádná interakce RAP-2-NIK nebyla detekována ve dvouhybridovém testu na kvasinkách (viz výše), transfekční pokusy s HEK-293T savčími buňkami naznačily stabilní tvorbu tohoto komplexu. NIK-RAP-2 interakce byla detekována způsobem jako v příkladu 3 s tou výjimkou, že anti-FLAG protilátky byly použity pro westernový přenos, po kterém následovalo imunosrážení s anti-His6 protilátkou (obr. 4C). Tento nesoulad mezi vazbou ve kvasinkách a v savčích buňkách nebyl překvapivý, protože kompletní NIK má tendenci ke ztrátě svých vazebných vlastností při expresi ve kvasinkách.

Z hlediska skutečnosti, že jak RIP, tak NIK jsou patrně nepostradatelné mediátory aktivace NF-KB indukované TNF jsme vyšetřovali to, zda je nadměrná exprese RAP-2 v buněčné kultuře schopna interferovat s touto určitou signální drahou. Počáteční sada pokusů byla provedena na HEK-293T buňkách dočasně transfektovaných reportérovými plasmidy obsahujícími luciferasový gen pod kontrolou HIV-LTR minimálního promotoru.

V podobném provedení bylo nejprve zjištěno, že RAP-2 snižuje, téměř na základní úroveň, aktivaci reporterového genu způsobenou jak nadměrnou expresí různých známých induktorů NFKB účastnících se na TNF-signalizaci (NIK, TRAF2, RIP, atd.), tak zevními podněty působícími na buňky (TNF a PMA, obr. 5A). HEK-293T buňky byly dočasně transfektované reportérovým plasmidem (HIVLTR-Luc nebo CMV-Luc pro NF-κΒ (5A) a GAL4-Luc pro c-Jun (5B) testy aktivace) a expresním vektorem pro příslušný induktor a buď prázdným vehikulem (pcDNA3) nebo plasmidem kódujícím kompletní RAP-2 (pcRAP-2). Skutečnost, že ·· • · t • ···· ♦ • · ···· · ·· ··

9 · • · · • · · • · · ··

RAP-2 může vykazovat své účinky stejně daleko ve dráze přenosu signálu jako RelA naznačuje, že část tohoto účinku proteinu může být společná různýma a jinak odlišným signálním drahám (viz dále). Ve stejnou dobu nebyla narušena KB-nezávislá (řízená časným promotorem CMV) transkripce luciferasy (obr.

5A) a proto předpokládáme, že možné generické narušení uspořádání základních mechanismů transkripce/translace RAP-2 může být vyloučeno. Tyto výsledky byly potom plně potvrzeny v HeLa buňkách (není uvedeno).

Nicméně, jak ukázaly titrační testy, skutečný fenomen je mnohem komplexnější. Bylo zjištěno, že když byl TRAF2 přechodně exprimován v HEK-293T buňkách společně s různými množstvími pcRAP-2, jak jsou uvedena na obr. 6, měnil RAP-2 výrazně své chování při nízkých koncentracích (okolo 20 ng/10⁶ buněk), kdy zesiloval transkripci NF-κΒ indukovanou TRAF2 (viz obr. 6A). Dále, nahrazením původního insertu insertem reverzní orientace bylo navrženo účinné vehikulum exprimující protismyslnou sekvenci RAP-2 a TRAF2 byl přechodně exprimován v HEK-293T buňkách spolu s různými uvedenými množstvími pcRAP2-a/s (protismyslných) konstruktů a byl analyzován efekt progresivní deplece RAP-2 a byl získán graf závislosti na koncentraci. Celkový trend grafu ukazuje, že reaktivita buněk je zhruba nepřímo úměrná množství transfektované RAP-2 DNA, s výjimkou charakteristické oblasti, která spadá do 'nulového bodu' a která náleží nominální, endogenní koncentraci proteinu (obr. 6). Je třeba uvést, že snížení exprese daného genu pomocí vložení protismyslné sekvence je pravděpodobně jemněji regulované, oproti nadměrné expresi. Technika protismyslných sekvencí neobsahuje artificiální produkci jakéhokoliv cizorodého proteinu v buňkách a proto podtrhuje validitu inhibiční kapacity RAP-2. Nicméně, je třeba si uvědomit, že

výše uvedený skok při nízkých koncentrací se promítá, nikoliv invertuje, do protismyslné poloviny grafu (obr. 6).

Pro hodnocení diverzity transkripčních systémů, ve kterých se může účastnit RAP-2, jsme dále studovali c-Jun, jaderný faktor, jehož úloha ve vzniku a udržování adekvátní odpovědi na stres se považuje za téměř stejně zásadní, jako úloha NF-kb. Za použití složek komerčního 'Path Detecť systému (Stratagene) jsme potvrdili podobný dvoj fázový účinek RAP-2 ve vztahu k několika známým aktivátorům AP-1 v HEK-293T a HeLa buňkách (viz obr. 5B a 6B).

Příklad 5: RAP-2 potencuje hyperfosforylaci c-Jun, bez ovlivnění aktivity JNK

Pro studium mechanismů takových významných vlivů na transkripci je zásadní stanovit přesnou hladinu, ve které je normální signalizace narušena. Je známo, že transaktivační potenciál c-Jun je regulován extracelulárním signálemindukovanou fosforylací dvou serinových zbytků (⁶³Ser a ⁷³Ser) na jeho amino-koncové aktivační doméně. JNK/SAPK proteinkinasy odpovědné za výše uvedenou fosforylací vytvářejí dosti odlišnou podskupinu MAP kinas a jsou sami aktivované fosforylací na Thr a Thr, která je zprostředkována dalšími předchozími kinasami s duální specificitou. Tak může být stav fosforylace vhodných míst v c-Jun a JNK použit jako markér odrážející aktivaci proteinu. Westernový přenos s lyzáty dočasně transfektovaných HEK-293T buněk ukázal, že přes narušení transkripce zprostředkované c-Jun zvyšuje RAP-2 znatelně fosforylací endogenního c-Jun na ⁶³Ser indukovanou různými podněty (viz obr. 7A). Celkové buněčné lyzáty HEK-293T buněk, transfektované uvedenými expresními konstrukty společně s buď pcDNA3-nosičem označeným na obr. 7 znaménkem (-), nebo s pcRAP-2 označeným na stejném obrázku znaménkem (+), byly analyzovány na SDS-PAGE, byly přeneseny na ECL-membránu a byly sondovány anti-f osfo-⁶³Ser-c-Jun Ab (NEB). Membrána uvedená na dolním panelu obr. 7A byla opětovně sondována protilátkami proti celkovému c-Jun pro kontrolu (NEB).

Celkové množství c-Jun zůstávalo - nicméně - nezměněno, s výjimkou elevace koncentrací c-Jun jako možného zdroje modifikace. Protilátky specifické pro fosforylovanou formu

JNK1/2 nedetekovaly jakékoliv významné zvýšení množství těchto aktivovaných kinas v reakci na nadměrnou expresi RAP-2, což naznačuje, že další fosforylace c-Jun nebyla důsledkem zesílení JNK aktivity indukovaného RAP-2 (obr. 7B). Aktivované

JNK1/2 z HEK-293T buněk transfektovaných buď pcDNA3 nebo pcRAP-2, ošetřených po delší časové období hrTNFa, byly 183 /185 detekovány westernovým přenosem lyzátů s fosfo-( Thr/ Tyr)JNK Ab (NEB), jak je uvedeno na obr. 7.

V dalším pokusu podporujícím předchozí zjištění produkoval in vitro test s imuno-vysráženou JNK1 a přečištěným GSDT-c-Jun jako substrátem v podstatě stejné výsledky (obr. 7C). HEK-293T buňky byly současně transfektovány prázdným vektorem, pcRAP-2 a pcRIP v různých vzájemných kombinacích spolu s HA-JNK1exprimujícím plasmidem. JNK1 byl potom imunosrážen prostřednictvím své N-koncové HA-koncovky a jeho schopnost fosforylovat bakteriálně produkovaný přečištěný GST-Jun byla stanovena inkorporací ³²P v kinasovém testu in vitro. Produkty reakce byly analyzovány SDS-PAGE, jak je uvedeno na obr. 7.

RAP-2 se stává fosforylovaným tehdy, když je RAP-2-IKK1 komples, imuno-vysrážený z transfektovaných HEK-293T buněk, inkubován za fosforylačních podmínek in vitro. Hledání funkční úlohy fosforylace RAP-2 ukázalo, že mutace jednoho šeřinu v tomto proteinu (v pozici 148) plně ruší aktivaci fosforylace Jun RAP-2. Jak je uvedeno na obr. 13, zatímco nadměrná exprese přirozeného RAP-2 vede k výraznému zvýšení fosforylace Jun, nadměrná exprese RAP-2(S148A) neovlivňuje fosforylaci Jun.

Efekt RAP-2 na NF-KB není, nicméně, ovlivněn touto mutací. Tato zjištění naznačují, že serin 148 RAP-2 je specificky obsažen v jeho vlivu na fosforylaci Jun.

Příklad 6: RAP-2 neinhibuje vazbu c-Jun a RelA na DNA

Protože pokusy popsané v příkladu 5 neodhalily cytosolový modulační cíl nadměrné exprese RAP-2 v signalizačních kaskádách NF-KB a AP-1, zkoumali jsme integritu jaderných procesů nutných pro transkripci. Test posunu elektromobility (EMSA) provedený s jadernými extrakty transfektovaných HEK293T buněk jednoznačně prokázal, že RAP-2 neinterferuje s vazbou c.Jun a RelA na oligonukleotidy odpovídající jejich klasickým rozpoznávacím sekvencím (obr. 8). Ve skutečnosti bylo pozorováno několikanásobné zesílení účinnosti tvorby komplexu DNA/AP1 v buňkách transfektovaných RAP-2. Dále, nebyla pozorována žádná interakce mezi RAP-2 a c-Jun/RelA, která by mohla vést k sterické obstrukci aktivačních domén cJun/RelA. Předpokládá se, že efekt vstupu RAP-2 do jádra je na úrovni dějů následujících po vazbě zesilovačů transkripce.

Příklad 7: RAP-2 interaguje in vivo s histonacetyltransferasou TIP60

TIP60 (GeneBank U 74667) náleží do nově popsané rodiny jaderných proteinů označovaných jako histon-acetyltransferasy (HAT). Enzymatická aktivita těchto proteinů je spojena se stavem chromatinové struktury v nukleosomálních komplexech.

HAT jsou často asociovány s některými prvky transkripčního • · · aparátu a jsou schopné ovlivňovat rychlost transkripce. HAT způsobují relaxaci chromatinu v blízkosti iniciačních míst prostřednictvím přenosu acetylových skupin na specifických lysinových zbytcích histonů, což umožňuje přístup různých faktorů k DNA. Jedná se o jedny z těch pomocných jaderných proteinů, které usnadňují komunikaci mezi vazebnými faktory pro zesilovače transkripce a RNA polymerasou II. Proto jsme zkoumali, zda může TIP60 tvořit komplex s RAP-2. Imunosrážení z HeLa buněk, po kterém následoval dvouhybridový test, ukázalo, že RAP-2 silně interaguje s TIP60 v obou systémech. Nicméně, nebyly jsme schopni pozorovat žádnou významnou alteraci efektů zprostředkovaných RAP-2 na NF-κΒ a c-Jun při současné expresi TIP60 v HEK-293T buňkách (není uvedeno).

Stejné chybění alterace bylo pozorováno v kontrolním pokusu, tj. stimulaci ± TIP60 (w/o RAP-2), což vede k závěru, že krátký čas odečítání (20-30 hodin po transfekci) pravděpodobně vylučuje šanci reportérové DNA na to, aby se stala chromatinizovaná, což neposkytuje dostatek času pro účinek HAT-podobných enzymů.

Příklad 8: Klon č. 10 - nové proteiny interagující s RAP-2

Za použití kompletního RAP-2 proteinu jako zachycovacího činidla ve dvouhybridovém vyhledávání B-buněčné knihovny cDNA jsme izolovali nový protein interagující s RAP-2, který byl označen jako klon č. 10 nebo protein kódovaný klonem č. 10 nebo RAT-vazebný protein č. 10 nebo RBP-10 (obr. 10). bylo zjištěno, že původní klon (přibližně 2,2 kb) kóduje polypeptid zřetelné molekulové hmotnosti 60 kDa. Nicméně, v této sekvenci jasně chybí předpokládaný ATG první kodon. I přes významnou délku byla získaná cDNA proto expandována dále směrem k 5'konci pro rekonstituci celého otevřeného čtecího rámce.

«« · · * · · · · • · · »t ·· « ♦ « · • · « · · ·«·« ······ · · · · ·· · • · · · ···· ···· · ··· ··· ·· ··

Dvouhybridový test vazebného repertoáru klonu č. 10 ukázal, že tento protein má, kromě RAP-2, dosti silnou afinitu pro TRAF2. Klon č. 10 se nicméně neváže na RIP, TRADD, MORTl,

MACH, TNFR-I, TIP60 a NIK, stejně jako na několik kontrolních proteinů (například laminin a cyklin). Nemůže být nicméně vyloučeno, že vazba klonu č.10 na NIK může být zjištěna v savčích buňkách, vzhledem ke zvláštnostem chování NIK v kvasinkách. Bylo prokázáno, že klon č.10 se váže na RAP-2 v C-koncových 200 aminokyselinách RAP-2, tj. v regionu, který není nutně asociován s vazbou RIP, TIP60, NIK a ΙΚΚβ.

Současná exprese klonu č.10 s TRAF-2 v savčích 293T buňkách bránila TRAF-2-zprostředkované aktivaci NF-κΒ, zatímco současná exprese klonu š.10 s NIK silně zvyšovala aktivaci NF-κΒ NIK. tato zjištění naznačují významnou regulační funkci klonu č.10. Pozorované odlišné modulační vlivy ukazují na pravděpodobnou existenci různých, nepřekrývajících se míst účinku proteinu na buňku.

Několika kol prohledávání GenBank za účelem identifikace homologu klonu č.10 vedlo k identifikaci F40F12.5 (přírůstkové č. S42834) - hypotetického proteinu z C. elegans, jehož fyziologická role není známá. Je zajímavé, že F40F12.5 vykazuje určitou podobnost s několika členy vysoce konzervované rodiny proteas-řízených ubiquitinem. Tyto enzymy neutralizují destruktivní účinky ubiquitinačního aparátu, který se účastní většiny dějů spojených s degradací proteinů v buňce. Zatímco ubiquitin-ligasy jsou odpovědné za navázání polyubiquitinového řetězce na protein určený pro degradaci, ubiquitin-proteasy brání účinnému rozvětvení rostoucího řetězce. Předpokládaná funkce F40F12.5 založená na podobnosti s výše uvedenými proteasami řízenými ubiquitinem je nicméně sporná a dosud nebylo zjištěno, zda má tento protein * « • 4 » 4 • 4 · · • · · • · · · · · • · «44 4 4 4 jakoukoliv enzymatickou aktivitu vzhledem k ubiquitinovým polymerům. Kromě toho, několik skutečností činí takovou koincidenci dosti nepravděpodobnou:

(a) zbytky, o kterých se předpokládá, že tvoří jádro katalytického regionu v jakékoliv podtřídě ubiquitin-proteas, nejsou konzervované ani v F40F12.5, ani v RBP-10;

(b) s výjimkou svých katalytických míst nevykazují enzymy z rodiny proteas řízených ubiquitinem z různých druhů (od bakterií až člověka) v podstatě žádnou podobnost sekvence, zatímco F40F12.5 a klon č.10 vykazují určitý stupeň homologie.

Příklad 9: Klon č.84: protein interagující s RAP-2

Další vazebný protein byl identifikován za použití kompletního RAP-2 proteinu jako zachycovacího činidla ve dvouhybridovém prohledávání B-buněčné cDNA knihovny a tento protein byl označen jako klon č.84.

Bylo zjištěno, že klon a.84 se specificky váže na kompletní RAP-2 a zároveň nevykazuje žádnou interakci s jakýmkoliv jiným analyzovaným proteinem včetně TRAF2, M0RT1, TRADD, RIP, NIK, TIP60 a laminu. Bylo zjištěno, že částečná 5' sekvence klonu č. 84 je identická se sekvencí dříve klonované cDNA kódující protein regulující buněčný růst CGR19, který byl identifikován jako transkript specificky zvýšeně exprimovaný v buňkách obsahujících p53 protein (Madden, S. et al., 1996, přírůstkové č. U66469). Analýza sekvence CGR19 vedla k identifikaci C3HC4motivu zinkového prstu (který je také označován jako RING prst) na jeho C-koncové doméně. Bylo zjištěno, že exprese CGR19 potlačuje růst několika buněčných linií. Účast CGR19 proteinu v NF-κΒ regulaci prostřednictvím vazby na RAP-2 může » · Φ 1 k · · I naznačovat modulaci regulační sítě buněčného cyklu prostřednictvím členů TNF-R rodiny.

Příklad 10: Strukturálně-funkční vztahy RAP-2

A. Vazebné regiony

Pomoci postupné deleční analýzy byly lokalizovány vazebné regiony v RAP-2 a byla identifikována vazebná místa pro RIP, NIK, TIP60, stejně jako samoasociační domény (obr. 11).

Vazba na RIP byla lokalizována do regionu RAP-2 proteinu, který začíná mezi aminokyselinami 177-218 a končí v aminokyselině 264.

Doposud nebylo zjištěno, že by se vazebná místa pro ΙΚΚβ (aminokyseliny 95-264) nebo NIK (aminokyseliny 1-264) překrývala s vazebným místem pro RIP v RAP-2 (Obr. 11).

Vazba na TIP60 je lokalizována do regionu mezi aminokyselinami 95-264. Chybění interakce u delečního fragmentu překlenujícího aminokyseliny 95-309 je nejpravděpodobněji způsobeno specifickou bránící konformací, která je umožněna touto delecí.

Podobný nesoulad ve vazbě na deleční fragmenty byl zaznamenán pro vazbu klonu č.10 a pro samoasociaci RAP-2. Oproti TIP60 však skutečnost, že se kompletní RAP-2 váže na deleční fragment obsahující aminokyseliny 218-416, stejně jako na deleční fragment obsahující aminokyseliny 1-264, naznačuje, že region účastnící se homodimerizace je lokalizován mezi aminokyselinami 217-264.

Protein kódovaný klonem č.10, s výše uvedenými výjimkami, se váže v regionu začínajícím mezi aminokyselinami 218-309 a končícím v aminokyselině 416 a tak může jeho vazebné místo obsahovat překrývající se regiony s vazebnými místy pro RIP,

NIK, ΙΚΚβ a TIP60 (obr. 11).

B. Funkční regiony

Podle našich dosavadních znalostí jsou všechny funkční efekty RAP-2 (konkrétně inhibice NF-κΒ a indukce c-Jun hyperfosforylace) lokalizovány na stejném regionu (obr. 11).

Dále, je možné, že region dostatečný pro účinné ovlivnění signalizace všemi induktory použitými v pokusech je lokalizován na N-koncovém segmentu proteinu.

Region tvořený aminokyselinami 95-416 má vliv, ačkoliv významně slabší ve srovnání s vlivem kompletního proteinu a proto může být důsledkem zesílené agregace endogenního RAP-2.

Dále, s výjimkou RelA mohou být efekty všech induktorů použitých v našich pokusech zprostředkovány pouze přibližně 100 N-koncovými aminokyselinami RAP-2. Dokonce i fragment obsahující aminokyseliny 1-102 zprostředkuje zřetelný efekt, i když o něco slabší (obr. 12B).

Na druhou stranu, úspěšná indukce RelA vyžaduje mnohem delší část RAP-2 proteinu. Doposud jsme mohli definovat hranice tohoto regionu mezi aminokyseliny 1 a 264, který obsahuje region mezi aminokyselinami 157 a 264, který má určité specifické vazebné vlastnosti spojené s RelA.

C. Vztahy vazby - funkce • ♦ • 9 » * • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 ««·· · « · · 9 9 9 9 · 9 9

Z výsledků uvedených na obr. 11 a 12 se zdá, že:

(a) s výjimkou RelA není vazba RAP-2 na RIP, klon č. 10 a s největší pravděpodobností na NIK a TIP60, nutná pro funkci proteinu jako inhibitoru nadměrné exprese indukované NF-kB.

(b) Efekt RAP-2 na RelA nadměrnou expresí indukovanou aktivaci je patrně zprostředkován, alespoň částečně, různými vazebnými ději. V podstatě všechny výše uvedené proteiny mohou přispívat k uvedené aktivitě, jak je zjištěno z dosud provedených pokusů.

Přesné místo interakce mezi RAP-2 a RIP musí být ještě určeno, protože se zdá, že toto místo je specifické pro RAP-2 a RIP a není společné s jinými proteiny, o kterých je známo, že interagují s RIP, jako je například MORT-1, TRADD, FAS-R a možná také TRAF2 (viz Malinin et al., 1997). Také se zdá (z analýzy sekvence a ze srovnání se sekvencemi v různých databázích, jak byly uvedeny výše), že RAP-2 neobsahuje smrtící doménu, MORT modul, proteasovou doménu (například ICE/CED3 motiv), kinasovou doménu/motiv ani TRAF domény.

Současně s tím analýza biologické aktivity také ukázala, že RAP-2 má následující charakteristiky:

(i) při nadměrné expresi RAP-2 silně inhibuje aktivaci NF-kB • TNF nebo nadměrnou expresí TRADD, RIP, TRAF-2, NIK nebo p65 podjednotky NF-KB;

(ii) RAP-2 potencuje hyperfosforylaci c-Jun, bez ovlivnění aktivity JNK;

(iii) RAP-2, jak ukazuje deleční analýza, nevyžaduje pro vazbu na RIP smrtící doménu RIP ani kinasovou aktivitu RIP;

(iv) podle výše uvedené deleční analýzy byl vazebný region • · * • · · ·· * ·

RAP-2 pro vazbu na RIP lokalizován do okolí N-koncového regionu velikosti přibližně 200 aminokyselin;

(v) RAP-2 se váže na NIK v transfektovaných savčích buňkách, ale ne ve kvasinkách.

Podle výše uvedených skutečností se proto zdá, že RAP-2 je vysoce specifický vazebný protein pro RIP a tak mediátor/modulátor RIP, který se pravděpodobně účastní intracelulární dráhy přenosu signálu zprostředkované RIP.

Podle výše uvedených skutečností se zdá, že RAP-2 se účastní na ovlivnění/zprostředkování aktivit RIP. Intracelulárně se jedná o účast RIP v dráze přežívání buněk (aktivace NF-KB, pravděpodobně prostřednictvím interakce s TRAF2) a o účast v signalizačních drahách vedoucích z zánětu a ke smrti buněk (nezávisle na jeho smrtící doméně nebo prostřednictvím interakce s jinými proteiny, jako je MORT-1, TRADD, p55-R, FAS-R a asociované proteasy, jako je MACH, Mch4, Gl a podobně). Pravděpodobné způsoby, kterými může RAP-2 ovlivňovat/zprostředkovat aktivitu RIP, jsou podrobněji uvedeny výše. Například může interakce RAP-2-RIP vést k zesílení dráhy buněčné smrti nebo buněčného přežití, nebo může vést k inhibici dráhy buněčné smrti nebo buněčného přežití, kde toto zesílení nebo inhibice pravděpodobně závisí na relativních aktivitách jiných prvků těchto dvou protikladných intracelulárních drah přenosu signálu. RAP-2 může také působit jako skladovací protein způsobující agregaci mnoha molekul RIP a jiných RIP- a RAP-2-vazebných proteinů, kde tyto agregáty mohou působit jak ve směru buněčné smrti, tak ve směru buněčného přežívání (nebo i obou), v závislosti na relativních aktivitách jiných prvků těchto dvou intracelulárních drah přenosu signálu v buňce.

• · · 44 4 4 ♦ 4 4 ♦ #4 4 4 4 4 • 4« * 4 « « 4 ·

444444 4 4 44 44 4 • 4 4 4 4 4 4 4 • « · 4 444 444 4« 44

Příklad 11: Příprava polyklonálních protilátek k RAP-2

Králíkům byla nejprve podána podkožní injekce 5 μρ čistého přípravku RAP-2 emulsifikovaného v kompletním Freundově adjuvans. 0 tři týdny později byla podána další podkožní injekce 5 μς přípravku RAP-2 v nekompletním Freundově adjuvans. Dvě další injekce RAP-2 ve formě roztoku v PBS byly podány v intervalu 10 dnů. Králíkům byla odebrána krev 10 dnů po poslední imunizaci. Vývoj koncentrace protilátek byl sledován radioimunotestem. I-značený RAP-2 se smísil s různými ředěními (1:50, 1:500, 1:5000 a 1:50000) králičího séra. Suspenze protein-G agarosových korálků (20 μΐ, Pharmacia) se přidala v celkovém objemu 200 μΐ. Směs se ponechala stát po dobu 1 hodiny při teplotě okolí, korálky se potom promyly 3krát a navázaná radioaktivita se odečítala. Králičí antisérum k lidskému leptinu se použilo jako negativní kontrola. Titr RAP-2 antiséra se měřil ve srovnání s titrem pro negativní kontrolu.

Příklad 12: Příprava monoklonálních protilátek k RAP-2

Samicím Balb/c myší (stáří 3 měsíce) byla nejprve podána injekce 2 μρ přečištěného RAP-2 v emulsi s kompletním Freundovým adjuvans a o tři týdny později byla podána podkožní injekce s nekompletním Freundovým adjuvans. Tři další injekce byly podány v 10-denních intervalech, podkožně v PBS. Konečná dosycovací dávka byla podána intraperitoneálně 4 a 3 dny před fúzí té myši, která vykazovala nejvyšší vazebný titr v IRIA (viz dále). Fúze se provedla za použití NSO/1 myelomové buněčné linie a lymfocytů připravených jak ze sleziny, tak z lymfatických uzlin zvířete. Fúzované buňky se umístily na mikrotitrační plotny a hybridomy byly selektovány v DMEM doplněném HAT a 15% koňským sérem. Hybridomy, u kterých byla ·· 99 > ♦ * 3 » « « ► » 9 4 » · · «

9 9 · potvrzena produkce protilátek k RAP-2, byly subklonovány technikou limitního ředění a byly injekčně aplikovány do Balb/c myší, které byly připraveny přistáném pro produkci ascitu. Izotypy protilátek byly definovány za použití komerčně dostupného ELISA kitu (Amersham, UK).

Vyšetřování na hybridomy produkující anti-RAP-2 monoklonální protilátky bylo provedeno následujícím způsobem: supernatanty hybridomů byly testovány na přítomnost anti-RAP-2 protilátek pomocí invertovaného radioimunotestu na pevné fázi (IRIA). ELISA plotny (Dynatech Laboratories, Alexandria, VA) byly potaženy Talon-přečištěným IL-18Bpa-His6 (10 gg/ml, 100 μΐ/jamku) . Po inkubaci přes noc při 4 °C se plotny promyly dvakrát PBS obsahujícím BSA (0,5% a Tween 20 (0,05%) a blokovaly se v promývacím roztoku po dobu alespoň 2 hodin při 37 °C. Přidaly se supernatanty kultur hybridomů (100 gg/jamku) a plotny se inkubovaly po dobu 4 hodin při 37 °C. Plotny se promyly 3-krát a na dobu 2 hodin při teplotě okolí se přidal konjugát kozí-anti-myší protilátka-křenová peroxidasa (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 μΐ/jamku). Plotny se promyly 4-krát a barva se vyvíjela za použití ABTS (kyseliny 2,2'-azino-bis(3-ethylbeznthiazolin-6-sulfonové) (Sigma) s H2O2 jako substrátem. Plotny byly odečítány automatickou ELISA čtečkou ploten. Vzorky vykazující OD alespoň 5-krát vyšší než OD negativní kontroly, byly považovány za pozitivní.

RAP-2 protilátky mohou být použity pro přečištění RAP-2 afinitní chromatografii.

Příklad 13: ELISA test

Mikrotitrační plotny (Dynatech nebo Maxisorb, Nunc) byly potaženy anti-RAP-2 monoklonální protilátkou (bezsérový • · •» · ** * • · ♦ * * v • ♦ ♦ • · » · • · · • · supernatant hybridomů nebo ascitická kapalina imunoglobulinů) přes noc při 4 °C. Plotny byly promyty PBS obsahujícím BSA (0,5%) a Tween 20 (0,05%) a byly blokovány ve stejném roztoku po dobu alespoň dvou hodin při 37 °C. Testované vzorky byly ředěny v blokovacím roztoku a byly přidány do jamek (100 μΐ/jamku) na dobu 4 hodin při 37 °C. Plotny byly potom 3-krát promyty PBS obsahujícím Tween 20 (0,05%) a potom bylo provedeno přidání králičího anti-RAP-2 séra (1:1000, 100 μΐ/jamku) a další inkubace přes noc při 4 °C. Plotny se promyly 3-krát a na dobu 2 hodin při teplotě okolí se přidal konjugát kozí-anti-myší protilátka-křenová peroxidasa (HRP, Jackson Labs, 1:10000, 100 μΐ/jamku). Plotny se promyly 4-krát a barva se vyvíjela za použití ABTS (kyseliny 2,2'-azino-bis(3-ethylbeznthiazolin-6-sulfonové) (Sigma) s H2O2 jako substrátem. Plotny byly odečítány automatickou ELISA čtečkou ploten.

Po úplném popisu vynálezu bude odborníkům v oboru jasné, že vynález může být prováděn v širokém rozmezí ekvivalentních parametrů, koncentrací a podmínek, bez odchýlení se od duchu a rozsahu předkládaného vynálezu a bez zbytečného experimentování.

Ačkoliv byl vynález popsán ve smyslu jeho určitých provedení, existují jeho další modifikace. Vynález zahrnuje jakékoliv variace, použití nebo adaptace, které sledují principy vynálezu a zahrnuje takové odchylky od předkládaného popisu, které mohou být způsobeny běžnou praxí v oboru, kterého se vynález týká, a které odpovídají obecným rysům uvedeným v následujících patentových nárocích.

Všechny citace, včetně odborných článků nebo abstraktů, • ΦΦΦΦ Φ » 9 9 9 9 9 9 • · · · · · · 9 ··»· · ♦·♦ ♦*· ΦΦ «φ publikovaných nebo odpovídájících U.S. nebo jiných patentových přihlášek, udělených U.S. nebo jiných patentů nebo jakýchkoliv jiných citací, jsou zde cele obsaženy jako odkazy, včetně všech dat, tabulek, obrázků a textu uvedených citací. Dále, celé obsahy citací citovaných v citacích v předkládaném vynálezu jsou zde také obsaženy jako odkazy.

Odkazy na známé techniky, běžné techniky, známé kroky technik nebo běžné kroky metod žádným způsobem neobsahují jakýkoliv aspekt, popis nebo provedení předkládaného vynálezu.

Uvedený popis specifických provedení tak úplně popisuje obecný charakter vynálezu, že jiní mohou, za použití znalostí v oboru (včetně odkazů zde citovaných), snadno modifikovat a/nebo upravovat vynález pro různé aplikace takových specifických provedení, bez zbytečného experimentování, bez odchýlení se od obecného konceptu předkládaného vynálezu.

Proto takové adaptace a modifikace spadají do významu a rozsahu ekvivalentů popsaných provedení. Je třeba si uvědomit, že frazeologie a terminologie zde použitá slouží pro popis a nikoliv pro omezení a měla by být interpretována odborníkem v oboru v souvislosti s uvedeným popisem v kombinaci s znalostmi v oboru.

φ φ • φ φ · » » «

Odkazy:

Alnemri, E.S. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:4312-4317.

Barinaga, M. (1993) Science 262:1512-1514.

Beg, A.A. and Baltimore, D. Science 274:782-784.

Beidler, J. et al., (1995) J. Biol. Chem. 270:16526-16528.

Berger, J. et al., (1988) Gene 66:1-10.

Beutler, B. and Cerami, C. (1987) NEJM: 316:379-385.

Bigda, J. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:445-460.

Boldin, M.P. et al. (1995a) J. Biol. Chem. 270:337-341.

Boldin, M.P. et al. (1995b) J. Biol. Chem. 270:7795-7798.

Boldin, M.P. et al. (1996) Cell 85:803-815.

Brakebusch, C. et al. (1992) EMBO J„ 11:943-950.

Brockhaus, M. et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:3127-3131. Cantor, G.H. et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:10932-6.

Cerreti, D.P. et al. (1992) Science 256:97-100.

Chen, C.J. et al. (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:271-3.

Chinnaiyan et al. (1995) Cell 81:505-512.

Chinnaiyan et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:4961-4965.

Cifone, M.G. et al. (1995) EMBO J. 14:5859-5868.

Clement, M.V. et al. (1994) J. Exp. Med. 180:557-567.

Criseil, P. et al., (1993) Nucleic Acids Res. (England) 21 (22):5251-5.

• ♦ « ♦ · 94

4 4 9 9 94 4 4 9 9

4 4 4 · 4 4 9 4 • 4444 · · * 94 9 4 4

4 4 4 4 9 4 4 • •94 9 994 449 44 44

Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., Struhl, K., Albright, L.M., Coen, D.M. & Varki, A., eds.), (1994) pp. 8.1.1-8.1.6 and 16.7-16.7.8, Greene Publishing Associates, Inc. and Wiley & Sons, Inc., New York.

Dirks, W., et al., (1993) Gene 128:247-249.

Durfee, T. et al. (1993) Genes Dev. 7:555-569.

Eischen, C.M. et al. (1994) J. Immunol. 153:1947-1954.

Ellis, H.M. et al. (1986) Cell 44:817-829.

Enari, M. et al. (1995) Nátuře 375:78-81.

Engelmann, H. et al. (1990) J. Biol. Chem., 265:1531-1536.

Faucheu, C. et al. (1995) EMBO J. 14:1914-1922.

Femandes-Alnemri, T. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:30761-30764.

Fernandes-Alnemri, T. et al. (1995) Cancer Res. 55:2737-2742.

Femandes-Alnemri, T. et al. (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:7464-7469.

Field, J. et al. (1988) Mol. Cell Biol. 8:2159-2165.

Fields, S. and Song, O. (1989) Nátuře, 340:245-246.

Frangioni, J.V. and Neel, B.G. (1993) Anal. Biochem. 210:179-187.

Geysen, H.M. (1985) Immunol. Today 6:364-369.

Geysen, H.M. et al. (1987) J. Immunol. Meth. 102:259-274.

Gossen, M. and Boujard, H. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551.

Grell, M. et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24:2563-2566.

• · *

44 • 9

4444

449 *

• ·* · • · * • · · • « * ··

Heller, R.A. et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 87:6151-6155. Henkart, P.A. (1996) Immunity 4:195-201.

Hohmann, H.-P. et al. (1989) J. Biol. Chem., 264:14927-14934. Howard, A.D. et al. (1991) J. Immunol. 147:2964-2969.

Hsu, H. et al. (1995) Cell 81:495-504.

Hsu, H. et al. (1996) Cell 84:299-308.

Itoh, N. et al. (1991) Cell 66:233.

Itoh, N. and Nagata, S. (1993) J. Biol. Chem. 268:10932-7.

Joseph, S. and Burke, J.M. (1993) J. Biol. Chem. 268:24515-8. Kamens, J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:15250-15256.

Kaufmann, S.H. (1989) Cancer Res. 49:5870-5878.

Kaufmann, S.H. (1993) Cancer Res. 53:3976-3985.

Kischkel, F.C. et al. (1995) EMBO J. 14:5579-5588.

Koizumi, M. et al. (1993) Biol. Pharm. Bull (Japan) 16 (9):879-83. Kumar, S. et al. (1994) Genes Dev. 8:1613-1626.

Kumar, S. (1995) Trends Biochem Sci. 20:198-202.

Lazebník, Y.A. et al. (1994) Nátuře 371:346-347.

Leithauser, F. et al. (1993) Lab Invest. 69:415-429.

Li, Y. etal. (1998) Mol Cell Biol 18:1601-1610

Loetscher, H. et ai. (1990) Cell, 61:351-359.

Los, M. et al. (1995) Nátuře 375:81-83.

• · φ φφφ • · φ φ « · φ φ • ΦΦΦ φ φ φ · φ φ φ φφφ φ φφ φ φ φφ φφφ» • φφφφ φ φ φ φ φ · • φφφφ φφφ φφ φφ

Madden, S.L. et al. (1996) Cancer Res 56:5384-5390.

Malinin, N.L. et al. (1997) Nátuře 385:540-544.

Martin, S.J. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:6425-6428.

Mashima, T. et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 209:907-915. Miller, B.E. et al. (1995) J. Immunol. 154:1331-1338.

Milligan, C.E. et al. (1995) Neuron 15:385-393.

Miura, M. et al. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92:8318-8322.

Munday, N.A. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:15870-15876.

Muranishi, S. et al. (1991) Pharm. Research 8:649.

Musti AM, et al. (1997) Science 1997 275:400-402 Nagata, S. and Golstein, P. (1995) Science 267, 1449-1456.

Natoli, G. et al. (1997) J. Biol. Chem. 272, 26079-26082

Nicholson, D.W. et al. (1995) Nátuře 376:37-43.

Nophar, Y. et al. (1990) EMBO J, 9:3269-3278.

Piquet, P.F. et al. (1987) J. Exp. Med., 166:1280-89.

Ray et al. (1992) Cell 69:597-604.

Ruggiero, V. et al. (1987) Cell Immunol. 107:317-325.

Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Schall, T.J. et al. (1990) Cell, 61:361-370.

Schlegel, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:1841-1844.

tf *

♦ tftf ♦ tf • · tf • · · · · ♦ tf · • « · • tf · • · tf ··

Schulze-Osthoff, K. et al. (1994) EMBO J. 13:4587-4596.

Shimayama, T. et al., (1993) Nucleic Acids Symp. Ser. 29:177-8

Shore, S.K. et al. (1993) Oncogene 8:3183-8.

Sleath, P.R. et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:14526-14528.

Smith, C.A. et al, (1990) Science, 248:1019-1023.

Song, H.Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22492-22495.

Srinivasula, S.M. et al. (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93:14486-14491.

Stanger, B.Z. et al. (1995) Cell 81:513-523.

Tartaglia, L. A. et al. (1993) Cell, 74:845-853.

Tewari, M. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:3255-3260.

Tewari, M. et al. (1995a) J. Biol. Chem. 270:18738-18741.

Tewari, M. et al. (1995b) Cell 81:1-20.

Thomberry, N.A. et al. (1992) Nátuře 356:768-774.

Thornberry, N.A. et al. (1994) Biochemistry 33:3934-3940.

Tracey, J.T. et al. (1987) Nátuře, 330:662-664.

Van Antwerp, D.J. et al. (1996) Science 274:787-789.

Vandenabeele, P. et al. (1995) Trends Cell Biol. 5:392-400.

Vassalli, P. (1992) Ann. Rev. Immunol. 10:411-452.

Wallach, D. (1984) J. Immunol. 132:2464-9.

Wallach, D. (1986) In: Interferon 7 (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academie Press, London. Wallach, D. et al. (1994) Cytokine 6:556.

·♦· ·

9 9

9 9

9 9

Wang, L. et al. (1994) Cell 78:739-750.

Wang, C.-Y et al., (1996) Science 274:784-787.

Watanabe-Fukunaga, R. et al. (1992) Nátuře, 356:314-317.

Watanabe, F.R. et al. (1992) J. Immunol. 148:1274-1279.

Weitzen, M. et al. (1980) J. Immunol. 125:719-724.

Wilks, A.F. et al. (1989) Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 86: 1603-1607. Wong et al. (1994) J. Immunol. 152:1751-1755.

Xue, D. et al. (1995) Nátuře 377:248-251.

Yamaoka S, et al. (1998) Cell 93:1231-1240.

Yonehara, S. et al. (1989) J. Exp. Med. 169:1747-1756.

Yuan, J. et al. (1993) Cell 75:641-652.

Zaccharia, S. et al. (1991) Eur. J. Pharmacol. 203:353-357.

Zhao, J.J. and Piek, L. (1993) Nátuře (England) 365:448-51.

·* » • · · • * · • ···· • ♦ *♦· · 9 • · · »· ··· • 9 9 9

9 9 9 * · · · 9

9 9 9

99

Seznam sekvencí <110> Wallach, David

Kovalenko, Andrei

Yeda Research and Devolopment Co., Ltd.

<120> Modulátory funkce receptorů z rodiny TGF/NGF receptorů a jiné proteiny <130> TNF/NGF receptory <14 0>

<141>

<150> 123758 <151> 1998-03-19 <150> 126024 <151> 1998-09-01 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2009 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1

CSuCígolCCc ttcggagcgc cacggactct ccgccLcaga gagtctccrc	GLgtgggcct cggcccccta gctgacaccc cggtgcagcc tggcgaagcc	gsgaggccca ccagcgttca c:;cccctct caccgctggc agccacgccg	gcaaccgcgg cag~ccgccg tggacgaaca ccggcagcag caccěgccc“	accgcgaaac ctcccacccc C o u r C ·- s_ r. a tcaggaccc	tgcgaccttt tctcacgrct gaagaaccaa actgggcgaa cgctcctgag	60 120 2 4 0 ť Λ Τ'
gCCCČCCgGC	gccgcctgga	ggagaatcaa	gaccccccag	a t g c c a t c c g	gcagagcaac	c c
cagatcccgc	gggagcgctg	cgaggagccc	ctgcaccccc	a a g c c a g c c a	aagggaggag	/ 'j o
aaggagtccc	ccacgcgeaa	gctccaggag	gccaggaaac	tggtggagag	actcggccrg	/ c o.
cacaaccccc	a t c t ga a g a g	ccacaaccac	cacgcc cc ~c	cccaccccca	gcacctcaag	Z •-id
-		·* ” ·		---1 ~
agacgccagc	agcagacggc	cgagcacaag	ccctccgcga	aagcccaggc	gacgtccttc	600
cccggggagc	tgcaggagac	ccagagccgc	““gg^gcc_g	ccaccaagca	atgccaggct	6 50
ccggaggccc	gggcccgggc	ggccaacgag	caggcgcggc	a c c c c g a c a g	tgagcgcgag	7 20

gcgctacagc	agcagcacac	cgtgcaggtg	gaccagccgc	gcacgcaggg	ccagagcgtg
caggccgcgc	tccccatgga	gcgccaggcc	gccrcggagg	agaagaggaa	gctggcccag
ttgcacctgg	cccaccacca	cctcttccaa	gaataccaca	ac ca ca cca a	cagcaccg-g
c-gggcagtc	agcggaagcg	accaacocac	ccggaagarc	L-caaacagca	actccagcag
gccgaggagg	ccccggcgcc	caaacaggag	gtgatcgata	agccgaagga	gcaggccgag
cagcacaaga	tcgtgacgga	gaccgtcccg	gtgctgaagc	cccaagcgga	tatctacaag

O' O'

4

4444 4

444

gcggactccc	aggccgacag	gcaggcccgg
caggagcagc	tggaccagcc	gcagagggag
tcggccagca	tcgaggacat	gaggaagcgg
cccacccccg	cctacctctc	CLCLCCCCtg
gaggagccac	ctgacccctg	etgtcccaag
ctgcagatac	atgccat gga	gcgcattgag
ccgsggsccz	ccccgggacc	gcgcagtctg
atgaagggc-	gggtggccac	aaccgggatg
cggcacccca	ege cc ca g c—	gttaattccg
ccgatcacgc	ctgactcgcč	gctctctttg
cgagcraacc	CCtCCCtCuC	cctccacccg
gccctcaggg	agaacCgccc	cccctggcag
CaCCCaCCCg	cccgctgccg	rgccctggga
tetcctttcg	ggccgcatgc	tattccattt·
cactattgac	ggacacctcc	gttgtttccc
akaaaaatcc	tcg—gcacca	53585.3353

gagaagctgc	ccgagaagaa	ggacctcctg	114 0
tacagcaaac	cgaaggccag	ctgtcaggag	1200
catgtcgagg	ccccccaggc	ccccttgccc	1260
gccctgccca	gccagaggag	gagccccccc	1320
tgccagtatc	aggcccctca	tatggacacc	1380
tagggccgqc	cagtgcaagg	ccactgcc^g	144 0
cgctttcctc	ccccgcctgc	ctagcccaga	1500
ccacctggag	ccccacccag	gagctggccg	1560
ctggtcccct	cctctggggc	agatgcggcc	1620
ttcccttctg	tccgctcgaa	ccacttgcct	1680
gcactgggga	agccaagaac	ggggcctggg	1740
agctgggtgg	cagctcttcc	t cccaccgaa	1800
gtgctgccct	cccaccatgc	acaccggtgc	1860
tgcagccaga	ccgatgtgta	tttaaccagt	1920
atctttttgt	caccatrnaac	artggcmtag	198 0 2009

<210> 2 <211> 2034 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2

tcctactcct	cccccccccc	cactccgcgc
ccagtccaga	gacacacccc	gttcsccaaa
tctccggaaa	tgcctcacac	aLag~tzgac
cacctccgga	agagccaacc	gtgtcsgatg
caggacgcac	cgggcgaaga	gtctcctctg
gaacagggcg	ctcetgagae	zzzczagzaz
cgccacccgg	cagcagcaac	cagattcttg
ÍÍCC33GCC8	gccagaggga	ggacaacgag
aaaccggcgc	agagaccccg	cctggagaag
ccgcgggagg	cggagcaccc	caagacatgc
gtgaaageee	aggtgacgcc	cttgctcgcg
gccgccacca	aggaacgcca	gcctctggag
cggcagcccg	agagcgagcg	cgaggcgctg
ccgcecacec	agggceagag	cgtggaggcc
gaggagaaga	ggaagccggc	ccagttgcag
gaeaaeeaea	ccaagagcag	zgzggzgggc
gaceccaaac	agcagcccca	gcaggccgag
gataagetea	aggaggagge	cgagcagcac
aagccecagg	cggacaccca	caaggcgcac

crgcccgaga	agaaccagcc	zztccaggag
aaacccaaee	c ca g ccccca	ggagtcggcc
gaggcccccc	aggccccccc	gccccccgcc
cceagecaga	ggaggagccc	ccccgaggag
tatcagacee	ccgacacgga	cactctgcag
cggccagcgc	aaggccaccg	cctgccgagc

tccgacccca	ccccctgcgt	gagcactcc <.	60
cttgaccgcc	ccctaccgag	crtccttsss l.	12 0
agccagcccc	cgccctgttg	gazgaataag	180
gcgcagceea	ccggtggccc	ggeageaga	24 0
gggaagccag	ccatgctgca	cctcccttcs	300
tgcccgggac	cacaatcaag	acccccgaga	360
cgggagctgc	egaagggagc	tttctgcatt	420
ucccccaccc	ccaagtc cca	ggaggccagg	480
cccgacccga	agaggeacaa	ggagcaggct	540
cagcagcaca	cggctgagga	caaggcctcu	600
gagccgcagc	agagccacag	tcccttcgag	660
ggtcgcgccc	ccgcggccag	cgagcaggcg	720
cagcaccacc	acagcgtgca	cgtggaccag	780
gcgccccgca	cggaccgcca	ccccccctcc	840
gcggcccacc	accagccccc	ccaagaatac	900
agtgagcgea		ccacctccaa	960
gaggcccccc	aggccaaaca	gcaggtgatc	1020
aagaccgcca	tccagaccct	tccggtgctg	1080
ccccagcccc	agaggcaggc	ccgggagaag	114 0
cacc-gcacc	acccgcacoxg	ccactacacc	1200
aggacccagc	acacgaggaa	gccccatgtc	12 60
cctgcccacc	cccccccccc	cccggccctg	1320
ccacccgacc	cccgcccccc	caagtgccaa	138 0
atacacgcca	cggagcgcac	tgactaggcc	1440
acgcgcccgg	caccgcgcag	tctgcgcttt	1500

100

cctctcccgc	ctgcctagcc	caggatgaag	qqczqqqzqa	ccacaacccg	··*♦ · aargccacct	15 6V
ggagccccac	ccaggagctg	cccgcggcac	cttacgctcc	agctgtccat	tccgctggtc	1620
ccctcttttg	gggtagatgc	caccccgatc	aagcccgact	cgctgctcct	t gttcccfc	1680
tctgtctgct	cgaaccactt	gcctcgggct	aatccctccc	ccccccccca	cccggcactg	1740
aggaagtcaa	gastggggcc	cggggcuccc	agggaaaact	gctccccccg	gcagagctag	1800
gtggcagctc	tíCCÍCCCcC	cggacaccga	cccgcccgct	gccgcgcccc	gggagtgctg	1860
ccctcttacc	atgcacacgg	gtgccctcct	tttgggctgc	acgccatccc	aaattgcagc	1920
cagaccgatg	c gc auccaac	cagtcactac	tgatggacat	ctgggttctt	tcccatcttt	1980
ttattaccat	maatarcggc	mcagakaaaa	atccttgcgc	actaaaaaaa	a a a a	2034

9 • ·

9 9 9 <210> 3 <211> 2116 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gccacgaagg cccagaccct gaccgtcctt cactgaccac cgagaacaga ttccactctt ccaatggaag tattcgccac agcccacttt taaacactgc acccgtccaa gagagtccac gtctagaagc gggctca:

gctgaagtta ggactgaatg ggaacctcca cccaacacct gctggatcgg tcagccacc agtgtgcagg ccgtacgga agaaggcgcc gcttgtgaa agccggtctc caatcaagac tgagcgccgc aa gaagcagcga agaaaacacc ccaccaaaaa gggaaagaag aaaggcaccc tetkgcttat tckgccccta aaaaagaaac gacgccagaa ctaatcctcc gagaacacac tacctgaaaa ggcggaggcc tctcgaatac cecgccccac caggccaaaa cgcacaaeac ttggcgttcc cacaacccag ccgcagagcc accaccacgc cacccaaaaa acc~cccccc agacagcgcc ggacacgcgg cggacaccag ccggaaaaac acccgaacac ccccaaccac cgggagatcg gagacacgg·: gcacagaaac aagccacca tcccccccgg acagcaccc: agccmcccmc gscccagaa·: wcyccctcca cccccagga; acacgcgcca cgcacccagí gaaaggcaaa eaaaecegac ccccgcccac g gc cc a c c g c aacccccccc ctcaaaaacc aagggccact gccccgtccc c a c c wc w kwg cgacacg uc c gcaccaggac cacaccccaa cgccacccct cacccgccag ccgaccaccc ccccggaatc agggcccgca aageagetet aaacacaacc cgcacccccc gccgcccctg cgacccggga ~ c ggag agc a aaccccaagg gcccaacaac gccagagtcc cggcaatgga aaccgcctct caccaccacc taccacccag ctccgccagc cctcggccac aggagaaccc aagcgcccgc gaggcacccg ccacgcccga c c c c c a g tggaaaaaga acaacCcccg nggacaccgg mmacccaaga gcgccacaaa ttacccccga ggccagaacc accaaacccc aacggcctcc agacgccccg acacacaaca acc gca cagcgcc gccacaa tcaacca cc:

ccccgaagac ccgcgcacca gag^a-g-ac ctaacgrrgc

Zqzczzzqzq cczqcczccz

u.c i~c<sCc<s<stg ccagtccgca gccccccggg teetttccac tggactgcaa gcacttcacc ccccaggccu cacttggagg argcccggag kcacccagac ccccacccca gccaccgagg aaccaccaaa acaaaaaga ~ cccgctaaaa cacggaaaaa caccaacagc acccggaaaa gacccacccg gcaagaacoc caacacccaa ccccaaagac ggagtcaccc caaccacgac aatggcccaa gccccctgga agaccgccc *_ aaacaaccgg a c cc c a c c cg gcgacgaccc accacccaac cccgtgaact atgcccaaca acggaagagc aacccacacg ggggtaatcc ccggaagacg cgcgccccga ccaccaccgc caacttaagt acaacgactg tcaaccccac gaccccaaag a. c a c a a a c u g

120 ISO 240 300 360 4 20 4 80 540 600 660 720 780

ccgaggaaaa	840
cccgaggaac	900
a ·_ a L.cay	if Ou
aacgagaaag	1020
aacccgaaat	1080
gsctttaaac	114 0
aagacaccce	1200
taegaegate	12 60
gcccaccctc	1320
tc accccgac	1380
cccgctetet	1440
rcagcctggc	1500
caatccccca	1560
agaccctcsa	1620
gc gacgccat	1680
ggctcatcgg	1740
gagctggcag	1800
cccagaaaag	18 60
aagaagcacc	1920

44

4 4 · « · « » • 4 4 · • · · *

44 »· ♦

	101	4 4 4 4 9 4 9 44 94 4 4 444 4 4	• 4 4 9 4 • • ·
írgcacccta	G£3gC|Ig~C	ttgtgttggt	tttttaagaa	Gt Ct3Sá~ G5	sge~ a11 a 31	1980
acctgaagct	tt35gtt.33G	tgcattgatc	atatgatatt	rttggaagca	u3C33lul33	2040
attatggaag	tG~3S3GCCG	cttttagtcc	attgagaatg	LcSatSaSLg	tgtcttctet	2100
5í(jCcač.S£a	333333					2116

• 9

Claims (38)

1. Patentové nároky

   1. DNA sekvence kódující protein asociovaný s RIP (RAP-2), jeho izoformy, fragmenty nebo analogy, kde uvedený RAP-2, jeho izoformy, fragmenty nebo analogy jsou schopné vazby na RIP.
2. 2. DNA sekvence podle nároku 1 kódující RAP-2, jeho izoformy, fragmenty nebo analogy, které jsou schopné ovlivňovat nebo zprostředkovat Íntracelulární aktivitu RIP.
3. 3. DNA sekvence podle nároku 1 nebo 2 vybraná ze skupiny skládající se z:

   (a) DNA sekvence odvozené z kódujícího regionu přirozeného

   RAP-2 proteinu;

   (b) DNA sekvencí schopných hybridizace na sekvenci (a) za středně přísných podmínek, které kódují biologicky aktivní

   RAP-2 protein; a (c) DNA sekvencí, které jsou degenerované v důsledku degenerace genetického kódu vzhledem k sekvencím definovaným v (a) a (b), které kódují biologicky aktivní RAP-2 protein.
4. 4. DNA sekvence podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 obsahující sekvenci uvedenou na obr. 1.
5. 5. DNA sekvence podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4 obsahující sekvenci uvedenou na obr. 2.
6. 6. DNA sekvence podle nároku 4 nebo 5 kódující RAP-2 protein, jeho izoformu, analog nebo fragment, která obsahuje alespoň část sekvence znázorněné na obr. 3.
7. 7. Replikovatelné expresní vehikulum obsahující DNA sekvenci podle jakéhokoliv z nároků l-β, volitelně operativně navázanou • · · · « ♦ « · · • « « · • ·· 99 β

   r

   103 • t · » · · na kontrolní sekvence, promotory nebo jiné DNA sekvence umožňující expresi ve správné orientaci.
8. 8. Replikovatelné expresní vehikulum podle nároku 7, které může být exprimováno v eukaryotických hostitelských buňkách.
9. 9. Replikovatelné expresní vehikulum podle nároku 7, které může být exprimováno v prokaryotických hostitelských buňkách.
10. 10. Transformované eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky obsahující replikovatelné expresní vehikulum podle jakéhokoliv z nároků 7-9.
11. 11. RAP-2 protein, jeho izoforma, fragment, funkční analogy nebo deriváty kódované DNA sekvencí podle jakéhokoliv z nároků 1-6, kde uvedený RAP-2, jeho izoforma, fragment, analogy nebo deriváty jsou schopné vazby na RIP.
12. 12. RAP-2 protein podle nároku 11, který je schopen ovlivňovat nebo zprostředkovat intracelulární aktivitu RIP ve drahách intracelulárního přenosu signálu vedoucích k zánětu, buněčnému přežívání nebo buněčné smrti, ve kterých se RIP účastní přímo nebo nepřímo prostřednictvím asociace s jinými intracelulárními modulátory nebo mediátory těchto drah.
13. 13. RAP-2 protein, jeho izoforma, fragment, analogy nebo deriváty podle nároku 11, kde uvedený protein, jeho izoforma, fragment, funkční analogy nebo deriváty obsahující alespoň část aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 3.
14. 14. Způsob výroby RAP-2 proteinu, jeho izoformy, fragmentu, analogů nebo derivátů podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13 vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci

    104 ·· · · · ·· ·· ·>·· ···· ···· ··« · · ···· • ···· · · ·«···· • · « · ···· ··»· · ··· ··· ·· ·· transformovaných hostitelských buněk podle nároku 9 za podmínek vhodných pro expresi uvedeného proteinu, izoformy, analogu, fragmentu nebo derivátu, provedení posttranslačních modifikací nutných pro získání uvedeného proteinu, izoformy, analogu, fragmentu nebo derivátu a izolaci uvedeného proteinu, izoformy, analogu, fragmentu nebo derivátu.
15. 15. Protilátky nebo jejich aktivní fragmenty specifické pro RAP-2 protein, izoformu, fragment analog nebo derivát podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13.
16. 16. Způsob pro ovlivnění nebo zprostředkování intracelulárních dějů ovlivněných/zprostředkovaných RIP ve drahách intracelulárního přenosu signálu vedoucích k zánětu, buněčnému přežívání nebo buněčné smrti, ve kterých se RIP účastní přímo nebo nepřímo prostřednictvím jiných intracelulárních modulátorů nebo mediátorů těchto drah vyznačuj ící se t i m, že obsahuje ošetření uvedených buněk jedním nebo více RAP-2 proteiny, izoformami, analogy, fragmenty nebo deriváty podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13, které jsou schopny vazby na RIP a ovlivnění nebo zprostředkování uvedené intracelulární aktivity RIP, kde uvedené ošetření buněk obsahuje vložení jednoho nebo více proteinů, izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů do uvedených buněk ve formě vhodné pro jejich intracelulární přenos, nebo vložení DNA sekvence kódující jeden nebo více proteinů, izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů do uvedených buněk ve formě vhodného vektoru obsahujícího uvedenou sekvenci, kde uvedený vektor je schopen provést inserci uvedené sekvence do uvedených buněk takovým způsobem, že uvedená sekvence je exprimována v uvedených buňkách.
17. 17. Způsob pro ovlivnění RIP ovlivněných/zprostředkovaných

    105 • · účinků na buňku podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedené ošetření buněk obsahuje vložení DNA sekvence kódující uvedený RAP-2 protein, izoformu, analog, fragment nebo derivát do uvedených buněk ve formě vhodného vektoru obsahujícího uvedenou sekvenci, kde uvedený vektor je schopen provést inserci uvedené sekvence do uvedených buněk takovým způsobem, že uvedená sekvence je exprimována v uvedených buňkách.
18. 18. Způsob podle nároku 16 nebo 17 vyznačující se tím, že uvedeným ošetřením buněk je transfekce uvedených buněk rekombinantním zvířecím virovým vektorem, která obsahuje kroky:

    (a) konstrukci rekombinantního zvířecího virového vektoru nesoucího sekvenci kódující virový povrchový protein (ligand), který je schopen vazby na. specifický buněčný povrchový receptor na povrchu buněk nesoucích FAS-R nebo p55-R a druhou sekvenci kódující protein vybraný z RAP-2 proteinu, jeho izoforem, analogů, fragmentů a derivátů podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13, který je po expresi v uvedených buňkách schopen ovlivnit/zprostředkovat aktivity RIP; a (b) infikování uvedených buněk uvedeným vektorem z kroku (a) .
19. 19. Způsob pro ovlivnění RIP ovlivněných/zprostředkovaných účinků na buňku vyznačující se tím, že obsahuje ošetření uvedených buněk protilátkami nebo jejich aktivními fragmenty podle nároku 15, kde uvedené ošetření spočívá v aplikaci vhodného prostředku obsahujícího uvedené protilátky, jejich aktivní fragmenty nebo deriváty k uvedeným buňkám, kdy pokud je RAP-2 protein nebo jeho části přítomen na extracelulárním povrchu uvedených buněk, tak je uvedený prostředek připraven pro extracelulární aplikaci, a pokud jsou

    106 • · · · · uvedené RAP-2 proteiny intracelulárně, tak je uvedený prostředek připraven pro intracelulární aplikaci.
20. 20. Způsob pro ovlivnění RIP ovlivněných/zprostředkovaných účinků na buňku vyznačující se tím, že obsahuje ošetření uvedených buněk oligonukleotidovou sekvencí kódující protismyslnou sekvenci pro alespoň část DNA sekvence kódující RAP-2 protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6, kde uvedená oligonukleotidová sekvence je schopná blokovat expresi RAP-2 proteinu.
21. 21. Způsob podle nároku 20 vyznačující se tím, že uvedená oligonukleotidová sekvence je vložena do uvedených buněk prostřednictvím viru podle nároku 18, kde uvedená druhá sekvence uvedeného viru kóduje uvedenou oligonukleotidovou sekvenci.
22. 22. Způsob pro léčbu buněk infikovaných HIV nebo jiných buněk postižených onemocněním vyznačující se tím, že obsahuj e:

    (a) konstrukci rekombinantního zvířecího virového vektoru nesoucího sekvenci kódující virový povrchový protein, který je schopen vazby na specifický buněčný povrchový receptor na povrchu nádorových buněk nebo na specifický povrchový receptor na povrchu buněk infikovaných HIV nebo na receptor na jiných buňkách postižených onemocněním a sekvenci kódující protein vybraný z RAP-2 proteinu, jeho izoforem, analogů, fragmentů a derivátů podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13, který je po expresi v až uvedených nádorových buňkách, buňkách infikovaných HIV nebo jiných buňkách postižených onemocněním schopen zesílit zabíjení buněk přímo nebo nepřímo ovlivněné/zprostředkované RIP; a (b) infikování uvedených nádorových buněk nebo buněk • 9

    4 9

    4 94 9 99 4 4

    107 infikovaných HIV nebo buněk postižených jiným onemocněním uvedeným vektorem z kroku (a) ;
23. 23. Způsob pro ovlivnění RIP účinků na buňky vyznačující se tím, že obsahuje použití ribozymové techniky, ve které je vektor kódující ribozymovou sekvenci schopnou interakce s buněčnou mRNA sekvencí kódující RAP-2 protein podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13 vložen do uvedených buněk ve formě umožňující expresi uvedené ribozymové sekvence v uvedených buňkách, a kde uvedená ribozymová sekvence po expresi v uvedených buňkách interaguje s uvedenou buněčnou mRNA sekvencí a štěpí uvedenou mRNA sekvenci, což vede k inhibici nadměrné exprese uvedeného RAP-2 proteinu v uvedených buňkách.
24. 24. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 16 až 23 vyznačující se tím, že uvedený protein je alespoň jedním z RAP-2 ízoforem, analogů, fragmentů a derivátů.
25. 25. Farmaceutický prostředek pro ovlivnění účinků RIP na buňku vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku alespoň jeden RAP-2 protein podle jakéhokoliv z nároků 11 a 13, jeho biologicky aktivní fragment, analog, derivát nebo směs uvedených substancí.
26. 26. Farmaceutický prostředek pro ovlivnění účinků RIP na buňku vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku rekombinantní zvířecí virový vektor kódující protein schopný vazby na povrchový buněčný receptor a kódující alespoň jeden RAP-2 protein, izoformu, aktivní fragmenty, analogy podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13.

    108 ··· ·· ·· ♦ ·· · ··· · · · · · · ······ · · · · · · · • · · · · · · · ···· · ··· ··· ·· ··
27. 27. Farmaceutický prostředek pro ovlivnění účinků RIP na buňku vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku oligonukleotidovou sekvenci kódující protismyslnou sekvenci k DNA sekvenci pro RAP-2 protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 6.
28. 28. Způsob pro ovlivnění procesů ovlivněných/zprostředkovaných přímo nebo nepřímo RIP vyznačující se tím, že obsahuje ošetření uvedených buněk jedním nebo více RAP-2 proteiny, izoformami, analogy, fragmenty nebo deriváty podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13, které jsou schopny vazby na RIP, kde uvedené ošetření buněk obsahuje vložení jednoho nebo více proteinů, izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů do uvedených buněk ve formě vhodné pro jejich intracelulární přenos, nebo vložení DNA sekvence kódující jeden nebo více proteinů, izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů do uvedených buněk ve formě vhodného vektoru obsahujícího uvedenou sekvenci, kde uvedený vektor je schopen provést inserci uvedené sekvence do uvedených buněk takovým způsobem, že uvedená sekvence je exprimována v uvedených buňkách.
29. 29. Způsob pro ovlivnění procesů ovlivněných/zprostředkovaných přímo nebo nepřímo RIP, které obsahují inhibici NF-κΒ a aktivaci JNK a p38 kinasy vyznačující se tím, že obsahuje ošetření uvedených buněk jedním nebo více RAP-2 proteiny, izoformami, analogy, fragmenty nebo deriváty podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13, které jsou schopny vazby na RIP, kde uvedené ošetření buněk obsahuje vložení jednoho nebo více proteinů, izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů do uvedených buněk ve formě vhodné pro jejich intracelulární přenos, nebo vložení DNA sekvence kódující jeden nebo více proteinů, izoforem, analogů, fragmentů nebo derivátů do uvedených buněk ve formě vhodného vektoru obsahujícího • 4 • ♦ · · • · · ·

    4 4 9 9 9

    9 9 9 9

    109 uvedenou sekvenci, kde uvedený vektor je schopen provést inserci uvedené sekvence do uvedených buněk takovým způsobem, že uvedená sekvence je exprimována v uvedených buňkách.
30. 30. Fragment podle jakéhokoliv z nároků 11 až 13, kterým ej peptid.
31. 31. DNA sekvence kódující vazebný protein pro RAP-2, jeho izoformy, fragmenty nebo analogy, kde uvedený vazebný protein pro RAP-2, jeho izoformy, fragmenty nebo analogy jsou schopné vazby na RAP-2.
32. 32. DNA sekvence podle nároku 32, která kóduje protein schopný ovlivňovat/zprostředkovat funkci RAP-2.
33. 33. DNA sekvence podle nároků 32 nebo 33, která obsahuje sekvenci uvedenou na obr. 10.
34. 34. Vazebný protein pro RAP-2 schopný vazby na RAP-2 a/nebo ovlivnění/zprostředkování funkce RAP-2.
35. 35. Způsob pro izolaci a identifikaci proteinů schopných vazby na RAP-2 vyznačuj ící se tím, že obsahuje použití kvasinkové dvouhybridové techniky, ve které je sekvence kódující uvedený RAP-2 obsažena v jednom hybridním vektoru a sekvence z cDNA knihovny nebo knihovny genomové DNA je obsažena ve druhém hybridním vektoru, kde tyto vektory jsou použity pro transformaci kvasinkového hostitele a pozitivní transformanty jsou izolovány a potom je provedena extrakce uvedeného druhého hybridního vektoru, která vede k zisku sekvence kódující protein, který se váže na RAP-2.
36. 36. Vazebný protein pro RAP-2, kterým je protein kódovaný

    110 • · • · · · · · ·· klonem 10.
37. 37. Způsob pro ovlivnění/zprostředkování funkce RAP-2 vyznačující se tím, že obsahuje ošetření buněk jedním nebo více vazebnými proteiny pro RAP-2.
38. 38. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že vazebné proteiny pro RAP-2 jsou vybrány ze skupiny zahrnující protein kódovaný klonem 10 a CGR 19.