CZ20003536A3

CZ20003536A3 - Způsob snížení interference kasulární polysacharidové složky

Info

Publication number: CZ20003536A3
Application number: CZ20003536A
Authority: CZ
Inventors: Claude Artois; Heyder Koen De; Pierre Desmons; Nathalie Garcon; Roland Mainil
Original assignee: Smithkline Beecham Biologicals S. A.
Priority date: 1998-03-25
Filing date: 1999-03-22
Publication date: 2001-08-15
Also published as: CA2325436A1; WO1999048525A8; DE69932709T2; ES2270590T3; NZ506604A; AR014762A1; PL343065A1; CN1295481A; TR200002737T2; AU3417299A; NO20004758L; ATE335509T1; WO1999048525A1; IL137999A0; DE69932709D1; KR20010034630A; HUP0101323A1; JP2002507581A; ZA200004956B; NO20004758D0

Description

Způsob snížení interference kapsulární polysacharidové složky

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu snížení interference kapsulární polysacharidové složky v konjugované vakcínš Haemophilus influenzae B (Hib) v kombinační vakcíně, která obsahuje DTPa, jde o velmi dobře známou „trivalentní kombinační vakcínu, kterou tvoří toxoid Diphthería (DT), toxoid tetanu (TT) a acelulární složky Pertussis [typicky jde o detoxifikovaný toxoid Pertussis (PT) a vláknitý hemaglutinin (FHA) a popřípadě ještě pertactin (PRN) a/nebo aglutinin 1+2], uvedená kombinace se běžně dodává například jako vakcina.INFANRIX-DTPa™ (SmithKline Beecham Biologicals), obsahující DT, TT, PT, FHA a PRN antigeny. Vynález se rovněž týká kombinačních vakcin, získaných uvedeným způsobem.

Dosavadní stav techniky

Vakciny, které využívají polysacharidy, jsou známé. Jde například o vakcínu Hib pro prevenci infekce Haemophilus influenzae B, která je založena na kapsulárním polysacharidu (PRP) H. influenzae B, konjugovaném s nosným proteinem. Polysacharidem je polymer ribózy, ribitolu a fosfátu. Příkladem nosného proteinu může být toxoid záškrtu nebo tetanu nebo protein zevní membrány N. meningitidis. Tyto polysacharidy byly popsány např. v US 4365170, US 4673574, EP 208375,

EP 477508 a EP 161188.

······ · · · ·· · • · · ··· · · · · • · ···· ·· · • · ·· ···♦·«· · · • · ··· ···

..... .. . .· ··

Je žádoucí podávat takovou konjugovanou vakcínu s dalšími antigeny nebo vakcínami současně, což může zahrnovat větší počet injekcí. Problémy, které jsou s tím spojeny zahrnují složitější podávání a větší celkový objem injekcí. To je specifický problém v případě podávání vakciny malým dětem. Jak pro malé děti, tak pro ošetřujícího lékaře by bylo žádoucí podat všechny nezbytné antigeny v jedné injekci s běžným objemem, takže by očkování bylo méně bolestivé, účinnější a snadněji proveditelné.

Z uvedených důvodů bylo navrhováno kombinovat vakciny, obsahující polysacharidový konjugát s dalšími vakcínami, například DTPa k získání kombinačních vakcin. Mimo to bylo navrhováno také zařazení dalších antigenů pro prevenci některých chorob, jako jsou hepatitida B nebo dětská obrna. Kombinační vakcina, obsahující antigen proti hepatitidě B a antigeny proti záškrtu, tetanu a černému kašli (HepB, DTPa) byla popsána v mezinárodních přihláškách WO 93/24148 a WO 97/46255.

Bylo však zjištěno, že jednoduché míšení složek v kombinační vakcíně je komplikováno skutečností, že ne všechny antigeny je možno účinně mísit. Je známo, že může dojít ke snížení imunogenity antigenů při jeho smísení s dalšími složkami ve srovnání s antigenitou v případě, že je antigen podán jako takový. Je například známo, že při kombinaci DTPa s Hib bez pomocného prostředku dochází ke snížení titru protilátek proti polysacharidové složce Hib (WO 97/00697). Mimo to se v uvedené přihlášce prokazuje, že v případě, že Hib se adsorbuje na hydroxid hlinitý, dochází k významnému snížení titru protilátek proti polysacharidové složce. Tyto výsledky prokazují, že ·· · · · · · · · · • · ···· · · · • · ·· ······· · · • · ··· · · ·

..... ·· · ·· ·· existuje interference mezi hydroxidem hlinitým ve vakcíně DTPa a mezi Hib. Aby bylo možno minimalizovat tuto interferenci, bylo navrhováno předem adsorbovat vakcínu Hib na fosfát hlinitý.

V mezinárodní přihlášce WO 96/37222 se popisuje tentýž problém. V tomto případě je antigenita Hib stabilizována adsorbcí této vakcíny a dalších složek DTPa na pomocný prostředek na bázi hliníku s nábojem v nulovém bodu nižším než 7,2, použitelný je například fosfát nebo hydroxid hlinitý, k nimž byly přidány anionty. Avšak v případě, že se užije fosfát hlinitý, může dojít ke zvýšené desorpci jiných antigenů z kombinační vakcíny, které působí lépe v případě, že jsou adsorbovány na hydroxid hlinitý jako pomocný prostředek. V případě, že se užije hydroxid hlinitý a anionty, zejména ve formě povlaku, může tedy vznikat uvedený další problém.

Další problém, který se týká jak jednovazných, tak kombinačních vakcín, je stálost antigenů v průběhu času. Vakciny v roztoku mohou v průběhu času ztrácet imunogenitu svých antigenních složek, například degradací antigenu nebo oddělením antigenu od pomocného prostředku, na nějž byl antigen adsorbován. Obecně je žádoucí dosáhnout co nejvyšší adsorbce antigenu na pomocný prostředek a udržet tuto úroveň po celou dobu skladování. I když je možno lyofilizované vakcíny v případě potřeby před použitím rozpustit, je výhodné, aby i rozpuštěná vakcína byla stálá a aby tedy roztok byl účinný po delší dobu a nedocházelo tak ke zbytečnému plýtvání. Ideálně by měla být vakcína v roztoku zcela stálá. Tímto způsobem by bylo možno výrobu vakcíny zlevnit ve srovnání s cenou lyofilizované vakcíny, mimo to se také sníží nutný počet

• · · · · · · · · • · · » · · • · · · · · • · · · · ··· • · · · · ···· · ·· · dalších manipulací v ordinaci, například rozpouštěním, při němž může dojít k různým chybám. .

Vynález bude dále podroběji popsán v souvislosti s přiloženým výkresem.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn graf, který znázorňuje vylučování vakcíny s obsahem „lehkého hydroxidu hlinitého (šarže 21750 a 21751) a „veškerého fosfátu hlinitého (šarže 21752) s Hib nebo bez této látky z plic myší s pertusí, srovnáno se standardní běžně dodávanou vakcínou DTPa, která je naznačena čtvercovými symboly.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří způsob snížení interference kapsulární polysacharidové složky konjugované vakcíny Haemophilus influenzae B ve vakcíně, obsahující DTPa, postup spočívá v tom, že se (i) zvolí jeden nebo větší počet antigenů pro adsorbci na hydroxid hlinitý jako pomocný prostředek, (ii) hydroxid hlinitý se předem nasytí zvoleným antigenem tak, aby již nebyl k dispozici přebytek hydroxidu hlinitého, (iii) zvolí se Hib s jedním nebo větším počtem dalších antigenů pro adsorbci na fosfát hlinitý, (iv) Hib a další antigeny se adsorbují na fosfát hlinitý, (v) všechny antigeny se kombinují ve vakcíně.

Vynález se tedy týká obecného postupu, kterým je možno připravit kapalné kombinační vakcíny tak, aby byl • · · · · · ···· • φ ···· · · · • · ·· ······· · · • · · · · ··· 2 ···· · ·· · ·· ·· odstraněn svrchu popsaný problém interference a současně bylo dosaženo maximální stálé adsorbce každého antigenu na pomocný prostředek na bázi hliníku, na němž je antigenita největší. Tímto způsobem je možno antigeny pertuse v kombinační vakcíně podle vynálezu uchovat v jejich nejúčinnější formě. Mimo to je tímto způsobem možno dosáhnout velmi dobré stálosti získaných vakcin. Imunogenita polysacharidové složky Hib v kombinační vakcíně je udržena a je v kapalném stavu stálá po značně dlouhou dobu. Vakcíny jsou tedy použitelnější zejména v případě aplikace dětem.

Specificky se vynález týká postupu, při němž je možno užít hydroxid hlinitý jako pomocný prostředek pro kombinační vakcinu DTPa-Hib, aniž by při tom došlo v průběhu času k interferenci se složkou Hib v kapalném prostředku, současně není nezbytné přidávat anionty tak, jak tomu je v případě postupu podle WO 96/37222. Vzhledem k tomu, že nedojde k přidání aniontů, je stálost všech adsorbovaných antigenů maximální a postup je tedy kompatibilní s dalšími postupy optimalizace adsorpce antigenu na pomocný prostředek na bázi hliníku v kombinační vakcíně, zvláště optimalizací jejich adsorpce (a minimalizací následné desorpce) v průběhu času v kapalném prostředku, zvláště výhodné je v tomto případě použití důkladně promytého fosfátu hlinitého.

Pod pojmem „předběžné nasycení se rozumí, že antigeny, které vyžadují adsorpci na hydroxid hlinitý, jsou na tuto látku předem adsorbovány, takže již nezbývá žádný přebytek hydroxidu hlinitého, který by mohl vyvolat významnou interferenci s Hib, a to neadsorbovaným nebo adsorbovaným na fosfát hlinitý ve výsledné kombinační • · vakcíně. Nastává tedy určitý časový odstup před smísením antigenů, adsorbovaných na hydroxidu hlinitém s dalšími antigeny vakcíny. S výhodou by mělo být dosaženo úplné adsorpce na hydroxid hlinitý, k čemuž je zapotřebí přibližně 10 minut při teplotě místnosti. Toto předběžné nasycení hydroxidu hlinitého vede k minimalizaci jakékoliv interference s antigenem Hib, která by byla způsobena hydroxidem hlinitým jako pomocným prostředkem. Příznakem této interference v kombinované vakcíně může být vyvločkování nebo shlukování hydroxidu hlinitého. Čím je toto vyvločkování větší, tím větší je pravděpodobnost interference. Mimo to předběžné nasycení hydroxidu hlinitého antigeny má tu další výhodu, že se na pevnou dávku antigenů musí použít nižší množství hydroxidu hlinitého, což může potenciálně snížit vznik místní reakce, spojované s hydroxidem hlinitým.

Je nutno uvést, že i když svrchu uvedený postup je nejvýhodnější, je možno jej uskutečnit také tak, že složka Hib není při přidávání k vakcíně vázána na pomocný prostředek.

Podle dalšího provedení vynálezu se tedy vynález týká postupu, při němž je možno kombinovat Hib bez pomocného prostředku nebo adsorbovaný na fosfát hlinitý v kombinační vakcíně při minimálním poklesu její imunogenity. Tento postup probíhá tak, že se (i) zvolí jeden nebo větší počet antigenů pro adsorpci na hydroxid hlinitý jako pomocný prostředek, (ii) hydroxid hlinitý se předem nasytí zvoleným antigenem, (iii) zvolí se jeden nebo větší počet dalších antigenů pro adsorpci na fosfát hlinitý, • · « · · · · · · « · · · · · · • · · · · · · • · « · ······· • « · · · · γ ···· · .· · (iv) tyto další antigeny se adsorbují na fosfát hlinitý, (v) všechny antigeny ve vakcíně se smísí, (vi) v případě potřeby se před použitím přidá Hib bez pomocného prostředku nebo adsorbovaný na fosfát hlinitý.

Pod pojmem „DTPa se rozumí vakcína, která byla svrchu uvedena. Její složky DT, TT, PT, FHA a PRN jsou známé. Složkou PT může být složka, zpracovaná na toxoid chemicky nebo geneticky, například podle EP 515415, mimo to je v EP 427462 a WO 91/12020 popsán způsob výroby antigenu pertusa. Složka PT může být popřípadě rekombinantní, například podle EP 306318, EP 322533, EP 396964, EP 322115 a EP 275689. Složky DT a TT mohou také být rekombinantní. V typických případech se složky PT, FHA, PRN, HBsAg (povrchový antigen hepatitidy B) a Hib užijí v množství 8 až 25 mg/0,5 ml vakciny. Složky DT, TT a IPV (inaktivovaná trivalentní vakcína polioviru) budou typicky obsaženy v množství přibližně 15 až 25 Lf (flokulační jednotky), 10 Lf a 40/8/32 (typ I/II/III) DU na 0,5 ml vakciny.

S výhodou je nosným proteinem, použitým v konjugátu Hib toxoid záškrtu, toxoid tetanu, protein záškrtu Crm₁₉7 nebo protein zevní membrány bakterie, například

N. meningitidis. Syntéza konjugátu kapsulárního polysacharidu Haemophilus influenzae typ B, PRP a toxoidu tetanu, TT je popsána v WO 97/00697.

Polysacharidový konjugát může být připraven jakýmkoliv známým způsobem. Vazba může být například uskutečněna jako thioetherová vazba. Při tomto postupu se polysacharid aktivuje působením l-kyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroboritanu, CDAP, za vzniku • · kyanátového esteru. Takto aktivovaný polysacharid je možno vázat přímo nebo přes vmezeřenou skupinu na aminoskupinu nosného proteinu. S výhodou se kyanátový ester váže na hexandiamin a pak se tento polysacharid váže na nosný protein při vytvoření thioetherové vazby. Konjugáty tohoto typu jsou popsány například v WO 93/15760 (Uniformed Services University).

Konjugáty je možno připravit také přímou reduktivní aminaci podle US 4365170 (Jennings) a US 4673574 (Anderson). Další postupy jsou popsány v EP 161188, EP 208375 a EP 477508.

Další postup zahrnuje vazbu polysacharidu, aktivovaného bromkyanem a derivatizovaného hydrazidem kyseliny adipové, ADH, na nosný protein karbodiimidovou kondenzací. Konjugace tohoto typu je popsána v publikaci Chu C. a další, Infec. Immunity, 1983, 245, 256.

Kromě antigenů DTPa a Hib může kombinační vakcina obsahovat ještě další antigeny, které se s výhodou volí ze skupiny povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg), inaktivovaný virus hepatitidy A, antigeny polioviru, například inaktivovaný trivalentní poliovirus IPV, kapsulární polysacharid N. meningitidis A a jeho proteinové konjugáty, kapsulární polysacharid N. meningitidis C a jeho proteinové konjugáty, kapsulární polysacharid Streptococcus pneumoniae a jeho proteinové konjugáty, proteiny Streptococcus pneumoniae, proteiny vnější membrány Moraxella catarrhalis, bílkoviny vnější membrány Haemophilus influenzae a proteiny vnější membrány N. meningitidis B.

·· ·

Antigen HBsAg bude s výhodou adsorbován na fosfát hlinitý podle WO 93/24148. Způsoby adsorpce antigenů DTPa a Hib na pomocné prostředky na bázi hliníku jsou známé a byly popsány například ve WO 93/24148 a WO 97/00697.

Vhodné složky pro použití v těchto vakcínách se běžně dodávají, podrobnosti je možno získat od World Health Organísation. Například složkou IPV může být poliovakcína inaktivovaná Salk. Povrchový antigen hepatitidy B může být tvořen antigenem „S, tak jak tomu je ve vakcině Engerix-B™ (SmithKline Beecham Biologicals). Inaktivovaný virus hepatitidy A může být tvořen běžně dodávanou vakcínou Havrix™ (SmithKline Beecham Biologicals), jde o usmrcenou atenuovanou vakcínu, odvozenou od kmene viru HM-175.

Přidání lyofilizovaného nebo kapalného Hib (bez pomocného prostředku nebo ve formě, adsorbované na fosfát hlinitý) k roztoku ostatních složek kombinační vakciny může být provedeno těsně před použitím nebo před distribucí výrobcem. V každém z těchto případů by měla imunogenita složky Hib zůstat stálá a nevyvolávat interferenci. Složku Hib je možno přidávat jako takovou nebo ve směsi s dalšími složkami, které nejsou vázány na hydroxid hlinitý.

Příprava vakcín je obecně popsána v souhrnné publikaci Vaccine Design - The Subunit and adjuvant approach Ed Powell and Newman: Pellum Press. S výhodou je kombinační vakcína podle vynálezu určena pro podávání dětem.

0 · ·« · 00 0 « · ·

0 0 · · · 0 0 0· * ·000 0· ·

0 00 0 0 · 0 0 · 0 · 0 • · «00 «··

2Q ···· · .. · ·· ·♦

Množství konjugátu antigenu v každé dávce vakcíny se volí jako množství, které vyvolává imunoprotektivní odpověď bez významnějších nepříznivých vedlejších účinků. Toto množství se bude měnit v závislosti na specifických použitých imunogenních látkách. Obvykle bude každá dávka pravděpodobně obsahovat 1 až 1000 mikrogramů konjugovaného polysacharidu, vyjádřeno jako množství polysacharidu, s výhodou 2 až 100 a zvláště 4 až 40 mikrogramů této látky. Optimální množství pro určitou vakcínu je možno ověřit standardními pokusy včetně sledování titru protilátek a dalších odpovědí u očkovaných jedinců. Po počáteční vakcinaci je možno jednou nebo dvakrát přeočkovat v intervalech 4 týdny nebo v delších intervalech.

Ve výhodném provedení vynálezu se poměr fosfátu hlinitého k hydroxidu hlininému v pomocných prostředcích, vyjádřeno jako relativní množství iontů trojmocného hliníku v kombinační vakcíně pohybuje v rozmezí 1:1 až 20:1, s výhodou 2:1 až 14:1 a zvláště 1,5:1 až 14:1. Je výhodné adsorbovat složku PRN na hydroxid hlinitý vzhledem k tomu, že bylo prokázáno, že při úplné adsorpci antigenu na hydroxid hlinitý je kombinace stálá v širokém rozmezí pH, kdežto při adsorpci na fosfát hlinitý dochází ke zhoršené adsorpci při pH vyšším než 5,1. Po 24 hodinách adsorpce při pH 6,1 je možno prokázat méně než 10 % neadsorbovaného PRN pří použití hydroxidu hlinitého, avšak přibližně 50 % neadsorbovaného PRN při použití fosfátu hlinitého. Vzhledem k tomu, že konečné pH, určené předpisy WHO pro vakcíny DT? je v rozmezí 6 a 7, je důležité adsorbovat PRN na hydroxid hlinitý pro dosažení co nejvyšší účinnosti. Bylo prokázáno, že PRN je jednou z ♦ * ···· · ... .. .

nejdůležitějších složek ve vakcíně proti pertusi, přičemž snížení adsorpce snižuje odpověď T-buněk a tím i účinnost celé vakciny.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se adsorbují všechny antigeny kombinační vakciny na fosfát hlinitý za předpokladu, že pertactin je adsorbován na hydroxid hlinitý. Tato kombinační vakcína je vakcína typu „všech složek vázaných na fosfát hlinitý. Pertactin, vázaný na hydroxid hlinitý se v tomto případě mísí s výhodou s neadsorbovaným inaktivovaným antigenem polioviru před míšením s antigeny, adsorbovanými na fosfát hlinitý, čímž je možno dále zajistit předběžné nasycení hydroxidu hlinitého. Příklad tohoto postupu je popsán v příkladu 1.

Stejného postupu je možno využít také pro svrchu popsaný způsob, při němž se přidává Hib v formě, adsorbované na pomocný prostředek, kterým je fosfát hlinitý nebo ve volné formě bez pomocného prostředku.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se všechny antigeny v kombinační vakcíně adsorbují na hydroxid hlinitý za předpokladu, že HBsAg a Hib jsou adsorbovány na fosfát hlinitý. Tato kombinační vakcína využívá přístupu s „lehkým hydroxidem hlinitým.

Antigeny, adsorbované na hydroxid hlinitý se s výhodou mísí před přidáním HBsAg, adsorbovaného na fosfát hlinitý. S výhodou se HBsAg mísí s dalšími antigeny před přidáním Hib, adsorbovaného na fosfát hlinitý. Příklad tohoto postupu je uveden v příkladu 2. V případě, že celkové množství pomocného prostředku ve formě hlinitých solí není dostatečné pro vznik pomocného účinku, je možno • · • · • · « ♦ · · • ······♦ · • · · · · • · · · · · přidat volný fosfát hlinitý po smísení všech antigenů, aniž by při tom došlo ke snížení výhodných účinků podle vynálezu.

Tentýž postup je také možno použít při svrchu popsaném způsobu, při němž se přidává Hib před použitím bez pomocného prostředku nebo ve formě, adsorbované na fosfát hlinitý. V takovém případě by měl být jakýkoliv volný fosfát hlinitý ke kombinační vakcíně přidán ještě před přidáním Hib.

Podle dalšího výhodného provedení vynálezu se užívá kombinace fosfátu hlinitého a lehkého hydroxidu hlinitého. V takových hybridních prostředcích se vybrané antigeny spolu s pertactinem adsorbují na hydroxid hlinitý, avšak nikoliv v tak velkém množství, jako při použití postupu s lehkým hydroxidem hlinitým. I v tomto případě je hydroxid hlinitý předběžně nasycen antigenem tak, aby bylo sníženo riziko interference s Hib. S výhodou jsou všechny antigeny kombinační vakciny adsorbovány na fosfát hlinitý za předpokladu, že pertactin, toxoid záškrtu, toxoid pertuse a vláknitý hemaglutinin jsou adsorbovány na hydroxid hlinitý. Také v tomto případě je možno použít Hib bez pomocného prostředku nebo adsorbovaný na fosfát hlinitý. S výhodou se mísí pertactin, toxoid záškrtu, toxoid pertuse a filamentózní hemaglutinin, adsorbované na hydroxidu hlinitém s neadsorbovaným inaktivovaným antigenem polioviru před smísením s antigeny, adsorbovanými na fosfátu hlinitém. Příklad tohoto postupu je uveden v příkladu 3.

··· · • ·· · ·«· ·· • · ♦ · · ♦ · • 4 · · · 4 4

44 4444499 · • · · · · · • ·· 4 449

Je dále nutno uvést, že jeden nebo větší počet antigenů, zvolených pro předběžné nasycení hydroxidu hlinitého jako pomocného prostředku již může být adsorbován na jiný pomocný prostředek, s výhodou fosfát hlinitý. Tyto prostředky tvoří další výhodné provedení vynálezu. Také v tomto případě je veškerý použitý hydroxid hlinitý předem nasycen antigeny k minimalizaci rizika interference s Hib. V těchto prostředcích by měl být Hib přidán k vakcíně před použitím bez pomocného prostředku nebo ve formě, adsorbované na fosfát hlinitý.

S výhodou jsou všechny antigeny kombinační vakcíny adsorbovány na fosfát hlinitý za předpokladu, že pertactin, toxoid pertuse a filamentózní hemaglutinin jsou adsorbovány na hydroxid hlinitý, toxoid záškrtu, které byl předem adsorbován na fosfát hlinitý se rovněž smísí s volným hydroxidem hlinitým před smísením s ostatními antigeny. Příklad tohoto postupu je uveden v příkladu 4.

Fosfát hlinitý, použitý k provádění způsobu podle vynálezu je s výhodou „velmi důkladně promyt před adsorpcí antigenů, takže obsah volných fosfátových iontů je snížen na hodnotu nižší než 10 mM, s výhodou nižší než 3 mM a zvláště nižší než 2,5 mM nebo ještě nižší. Takto zpracovaný fosfát hlinitý by měl být sterilizován, s výhodou v autoklávu ještě před absorpcí antigenů. Bylo prokázáno, že při použití takto zpracovaného fosfátu hlinitého je možno zlepšit úroveň adsorpce Hib a HBsAg na fosfát hlinitý a současně je možno zabránit desorpci všech antigenů v kombinační vakcíně DTPa-Hib a tím zlepšit i stálost antigenů. V příkladové části přihlášky je popsán také způsob promývání fosfátu hlinitého .

·· · 0

Vzhledem k nepříznivému účinku fosfátových aniontů v roztoku by měl být jakýkoliv pufr, užitý v kombinační vakcíně ke stabilizaci pH kationtové povahy. S výhodou se užívá směs monohydrátu a monochloridu L-histidinu.

V dalším provedení se vynález týká kombinační vakciny, získané způsobem podle vynálezu.

Jde zejména o kombinační vakcínu, která obsahuje konjugovaný kapsulární polysacharid Haemophilus influenzae B (Hib) a DTPa, přičemž v této vakcíně je Hib adsorbován na fosfát hlinitý a jakýkoliv volný hydroxid hlinitý nezpůsobuje podostatnější interferenci s Hib.

Promývání fosfátu hlinitého může být použito i nezávisle ke zvýšení adsorpce antigenů na fosfát hlinitý a ke snížení následné desorpce v kombinační vakcíně, která obsahuje DTPa, způsob se provádí tak, že se (i) fosfát hlinitý jako pomocný prostředek promývá až do snížení koncentrace volných fosfátových iontů na hodnotu 3 mM nebo nižší, s výhodou nižší než 1 mM, (ii) promytý fosfát hlinitý se sterilizuje, (iii) zvolí se antigeny, které mají být adsorbovány na fosfát hlinitý, (iv) tyto antigeny se adsorbují na promytý fosfát hlinitý, (v) v případě potřeby se antigeny smísí za vzniku kombinační vakciny.

Fosfátové ionty se s výhodou odstraní opakovaným odstředěním a ředěním, tak jak bude popsáno v příkladu 8, nebo diafiltrací, následující ještě po ultrafiltraci, • · obvykle prováděné výrobcem fosfátu hlinitého. Sterilizace takto promytého pomocného prostředku ve stupni (ii) se s výhodou provádí v autoklávu.

Kombinační vakcína podle vynálezu může obsahovat DTPa a fosfát hlinitý jako pomocný prostředek, přičemž tento fosfát, hlinitý je s výhodou promyt až do snížení volných fosfátových iontů až na koncentraci 3 mM nebo nižší.

Vynález se rovněž týká imunogenního prostředku, tvořeného fosfátem hlinitým jako pomocným prostředkem a antigenem, v němž byl fosfát hlinitý promyt až do koncentrace volných fosfátových iontů nižší než 3 mM nebo ještě nižší.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava vakcíny s použitím téměř všech antigenů, vázaných na fosfát hlinitý

K přípravě tekuté kombinační vakcíny DTPa-Hib-HBsAg-IPV byly použity následující složky, uvedené množství představuje jednu dávku vakcíny.

1) 8 μρ PRN, předem adsorbovaného na 0,05 mg hydroxidu hlinitého (Superfos), se smísí s 40/8/32 DU IPV bez pomocného prostředku (1/2/3), směs se míchá 1 hodinu při teplotě místnosti. Povlak IPV na hydroxidu hlinitém je stálý, hydroxid hlinitý je nasycený antigenem v konečné • ··· »111

4 4 • · « * · • · ·· kombinační vakcíně.

2) 17 Lf DT, 10 Lf TT, 25 μς PT, 25 μς FHA a 10 μς HBsAg, předem adsorbované na 0,17, 0,1, 0,05, 0,05 a 0,2 mg důkladně promytého fosfátu hlinitého (Superfos) se smísí s PRN ze stupně (1) v průběhu jedné hodiny při teplotě místnosti.

3) 10 μς Hib (PRP, konjugovaný na toxoid tetanu), předem adsorbovaného na 0,12 mg důkladně promytého fosfátu hlinitého (Superfos) se přidá ke směsi ze stupně (2) a směs se míchá 15 minut při teplotě místnosti.

4) Směs se upraví na 10 mM kationtového pufru, tvořeného směsí monohydrátu a monochloridu L-histidinu a pH se upraví na 6,1 ± 0,1. Histidin má pKa v blízkosti požadovaného výsledného pH 6,1 a vzhledem ke své kationtové povaze nevyvolává desorpci antigenu.

5) 5 mg/ml 2-fenoxyethanolu se přidá ke směsi,.která se pak míchá 60 minut při teplotě místnosti.

6) Směs se upraví na pH 6,1 ± 0,1 (podle WHO musí mít vakcíny DT a DTP pH v romezí 6 a 7) . Výsledný objem směsi byl 0,5 ml, obsah chloridu sodného byl 140 mM.

7) Kombinační vakcína se uloží na alespoň 2 týdny při -teplotě místnosti před použitím na schopnost vyvolat imunitní reakci. Poměr fosfátu hlinitého k hydroxidu hlinitému, vyjádřeno jako relativní množství trojmocných hlinitých iontů v kombinační vakcíně je 14:1.

DT, TT, PT, FHA, PRN, HBsAg a Hib se adsorbují na pomocné prostředky při pH 5,1 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 5,1 ± ± 0,1, 5,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 5,5 ± 0,1 a 5,1 ± 0,1.

Příklad 2: Příprava vakcíny při použití převážné části antigenů, vázaných na hydroxid hlinitý.

···· • o e • € · · • · · · · • · · ··· • · · ·· ·

Tekutá vakcina DTPa-Hib-HBsAg-IPV byla připravena následujícím způsobem, množství je uvedeno pro jednu dávku vakcíny.

1) 25 Lf DT, 10 Lf TT, 25 gg PT, 25 μς FHA, 8 μς PRN a 40/8/32 Du IPV (typ 1/2/3), předem adsorbované na 0,1, 0,025, 0,005, 0,005, 0,05 a 0,01 mg hydroxidu hlinitého (Superfos), vyjádřeno jako množství trojmocného hlinitého iontu se smísí v průběhu jedné hodiny při teplotě místnosti. Při použitém množství hydroxidu hlinitého byl tento pomocný prostředek nasycen antigeny.

2) 10 μς HBsAg, předem absorbovaného na 0,2 mg nepromytého fosfátu hlinitého (Superfos) se smísí se směsí ze stupně (1) a míchá jednu hodinu při teplotě místnosti.

3) 10 μg Hib (PRP, konjugovaný s toxoidem tetanu), předem adsorbovaného na 0,12 mg důkladně promytého fosfátu hlinitého (Superfos) se přidá ke směsi ze stupně (2) a směs se míchá 15 minut při teplotě místnosti.

5) 5 mg/ml 2-fenoxyethanolu se přidá ke směsi, která se pak míchá 60 minut pří teplotě místnosti.

6) Směs se upraví na pH 6,1 ± 0,1 (podle WHO musí mít vakcíny DT a DTP pH v romezí 6 a 7). Výsledný objem směsi byl 0,5 ml, obsah chloridu sodného byl 140 mM.

7) Kombinační vakcina se uloží na alespoň 2 týdny při teplotě místnosti před použitím na schopnost vyvolat imunitní reakci. Poměr fosfátu hlinitého k hydroxidu • · · · • · · φ φ · · φ φ φ φφ φφφφ φφφ φ φ ΦΦΦΦΦΦΦ·· · ·

-1Λ ·· ······ hlinitému, vyjádřeno jako relativní množství trojmocných hlinitých iontů v kombinační vakcíně -je 1,7:1.

DT, TT, PT, FHA, PRN, HBsAg, IPV a Hib se adsorbují na pomocné prostředky při pH 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6, 1 ± ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 5,5 ± 0,1, 6,1 ± 0,1 a 5,1 ± 0,1.

Příklad 3: Příprava hybridní vakciny s částí antigenů, adsorbovaných na hydroxid hlinitý a částí antigenů, adsorbovaných na fosfát hlinitý

Kombinační vakcina DTPa-Hib-HBsAg-IPV byla připravena následujícím způsobem, množství představují jednu dávku vakciny.

1) 25 Lf DT, 25 gg PT, 25 μg FHA a 8 μg PRN, předem adsorbované na 0,1, 0,05, 0,05 a 0,05 mg hydroxidu hlinitého (Superfos) se smísí s 40/8/32 DU IPV bez pomocného prostředku (typ 1/2/3).

2) 10 Lf TT a 10 pg HBsAg, předem adsorbované na 0,25 a 0,2 mg nepromytého fosfátu hlinitého (Superfos), vyjádřeno jako množství trojmocného kationtů hlinitého se smísí se směsí z předchozího stupně a míchá se 15 minut při teplotě místnosti.

3) Směs se upraví na 10 mM kationtového pufru, tvořeného směsí monohydrátu a monochloridu L-histidinu a pH se upraví na 6,1 ± 0,1. Histidin má pKa v blízkosti požadovaného výsledného pH 6,1 a vzhledem ke své kationtové povaze nevyvolává desorpci antigenů.

4) 5 mg/ml 2-fenoxyethanolu se přidá ke směsi, která se pak míchá 60 minut při teplotě místnosti.

5) Směs se upraví na pH 6,1 ± 0,1 (podle WHO musí mít vakciny DT a DTP pH v romezí 6 a 7). Výsledný objem směsi • · • · · · · byl 0,5 ml, obsah chloridu sodného byl 140 mM.

6) Kombinační vakcina se uloží na alespoň 3 týdny při teplotě 4 °C před použitím na schopnost vyvolat imunitní reakci.

7) Ke směsi z předchozího stupně se před použitím přidá 10 μς Hib (PRP, konjugovaný s toxoidem tetanu) .

DT, TT, PT, FHA, PRN a HBsAg se adsorbují na pomocné prostředky při pH 6,1 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 6,1 ± ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, a 5,3 ± 0,1.

Příklad 4: Příprava vakcíny se směsí antigenů vázaných na fosfát hlinitý i hydroxid hlinitý

Připraví se kombinační vakcina DTPa-Hib-HBsAg-IPV, množství odpovídají jedné dávce vakcíny.

1) 25 Lf DT se adsorbuje na 0,15 mg nepromytého fosfátu hlinitého (Superfos), vyjádřeno jako množství hlinitých iontů. Materiál se přidá k 0,1 mg hydroxidu hlinitého (Superfos) a směs se míchá více než 30 minut pří teplotě místnosti. Pak se pH upraví na 6,1 ± 0,1.

2) 25 μρ PT, 25 μρ FHA a 8 μρ PRN, předem adsorbované na 0,05, 0,05 a 0,05 mg hydroxidu hlinitého (Superfos) se smísí s DT z předchozího stupně a s 40/8/32 DU IPV bez pomocného prostředku (typ 1/2/3).

3) 10 Lf TT a 10 μρ HBsAg, předem adsorbované na 0,1 a 0,2 mg nepromytého fosfátu hlinitého (Superfos), vyjádřeno jako množství hlinitých iontů se smísí se směsí z předchozího stupně a míchá 15 minut pří teplotě místnosti.

4) Směs se upraví na 10 mM kationtového pufru, tvořeného směsí monohydrátu a monochloridu L-histidinu a pH se

• · · · upraví na 6,1 ± 0,1. Histidin má pKa v blízkosti požadovaného výsledného pH 6,1 a vzhledem ke své kationtové povaze nevyvolává desorpci antigenů.

5) 5 mg/ml 2-fenoxyethanolu se přidá ke směsi, která se pak míchá 60 minut při teplotě místnosti.

6) Směs se upraví na pH 6,1 ± 0,1 (podle WHO musí mít vakciny DT a DTP pH v romezí 6 a 7). Výsledný objem směsi byl 0,5 ml, obsah chloridu sodného byl 140 mM.

7) Kombinační vakcina se uloží na alespoň 3 týdny při teplotě 4 °C před použitím na schopnost vyvolat imunitní reakci.

8) 10 gg Hib (PRP, konjugovaný s toxoidem tetanu) se přidá ke směsi z předchozího stupně těsně před použitím.

DT, TT, PT, FHA, PRN a HBsAg se adsorbují na pomocné prostředky při pH 5,4 ± 0,1, 5,7 ± 0,1, 6,1 ± 0,1, 6,1 ± ± 0,1, 6,1 ± 0,1 a 5,3 ± 0,1.

Příklad 5: Měření interference při klinických zkouškách s kombinační vakcinou

Dále uvedené klinické zkoušky se týkají problému interference, který byl zjištěn při měření titrů protilátek proti PRP v kombinačních vakcinách, které obsahují DTPa, běžně adsorbovaný na přebytek hydroxidu hlinitého a mimo to Hib.

Seronegativní zdraví dobrovolníci ze skupiny dětí byli imunizováni třemi dávkami kombinační vakciny, která byla podávána podle dále uvedeného schématu. Kladné výsledky byly definovány jako titr protilátek, statisticky významně vyšší než u kontrol. Titry byly vyjadřovány jako mlU/ml.

• · • ·

4 4 444 4444 • 4 4444 44 4

4 44 4444444 4 4

4 444 444

44444 44 4 44 444

PRP - Hib	6.09(94.4)	0.95(50.0)	5.01(95.0)	3.1(80.8)	9.67(96.2)

		T	o	CM	rc
		—	o		CM
*0			o	C\	O

<			sC·	tc	ur
5Λ	<		74.	tA	5\
	z	—	rc	TC	ur








	__	Ub		^3-
ř—	CJ	T7*	C-	M3 .	—
é—	—





			—	—

	cm	co	rc	cm ic-
i—	r~,		c-	°=	3s
b	—		~~		c-i




					--¹
		__,		_z	s^Z
	oo		cm	Ό	ur
z	—-	—	fM	ri	—
	r—,		—	tr.	co
—	—		““		o




		S—-	*
				-_,
<	uc	r*	UC	oc	——
cm		c-		c
X	co	Γ*7	-3“	——	r-'
	—		CM	CM



			·—>

		—	—“	—	rc
			S^^Z
	r·*	.·ζ	rc	CM

·—			oo		m3
a.	¹·Μ^Γ	C-l
			*
		*	*		-ť—-
			*
		<-»


<D 0	«#·	X	X	X	X
cd	r±		f*	X	2
C	X		r-	JX.	CL
		5J	o	b)	U
n	-r	X	X	X
	S	cc		53	i

0	t—	f—	L_	—	—
	<·			'r\	rr
				• ·

• ·

Výsledky jsou vyjádřeny jako geometrický průměr titrů (GMT) v mlU/ml. Pro protilátky -proti PRP znamená číslo v závorkách procento jednotlivců s hodnotou GMT vyšší než 1,0. Výsledky prokazují, že problém interference Hib je možno zmírnit při použití téměř všech antigenů, vázaných na fosfát hlinitý, aniž by při tom došlo k ovlivnění účinnosti dalších antigenů v kombinační vakcíně.

Ve svrchu uvedené tabulce jsou použity následující symboly:

* - Jde o titr protilátek proti PRP (Hib) - DPTa na jedné paži a Hiberix™ (PRP, konjugovaný s toxoidem tetanu bez pomocného prostředku, SmithKline Beecham Biologicals) na druhé paži. DTPa byla adsorbována na 500 mikrog/ml hydroxidu hlinitého.

** - DTPaHepB v kombinaci s Hiberix™. Lyofilizovaný Hib byl před podáním rekonstituován ve vakcíně DTPa-HepB.· DTPa byla adsorbována na 1000 mikrog/ml hydroxidu hlinitého. HepB - HBsAg byly adsorbovány na fosfát hlinitý a pak smíseny s DTPa podle WO 93/24148.

*** - Šlo o veškeré antigeny, vázané na fosfát hlinitý, přičemž Hib byl použit bez pomocného prostředku. DTPa-HepB byly adsorbovány na fosfát hlinitý s výjimkou pertactinu, který byl adsorbován na hydroxid hlinitý. Byl použit postup podle příkladu 1 s tím rozdílem, že nebyl přidán Hib. Lyofilizovaný Hib bez pomocného prostředku (Hiberix™) byl přidán před použitím do výsledné vakcíny DTPa-HepB.

Svrchu uvedená skupina tří pokusů byla provedena na skupině 18 dětí. Jednotlivci byli očkováni ve věku 3, 4 a 5 měsíců, byla podána dávka 0,5 ml.

• · ·

» · ·····*· t - DTPaHepB v kombinaci s Hiberix™.-Lyofilizovaný Hib byl před podáním přidán do vakcíny DTPa-HepB. Vakcina DTPa byla adsorbována na 500 mikrog/ml hydroxidu hlinitého. HepB-HBsAg byly adsorbovány na fosfát hlinitý a pak smíseny s DTPa podle WO 93/24148.

tt - Všechny antigeny byly vázány na fosfát hlinitý, Hib byl přidán bez pomocného prostředku. DTPa-HepB byly vázány na fosfát hlinitý až na pertactin, který byl adsorbován na hydroxid hlinitý. Byl použit způsob podle příkladu 1 s tím rozdílem, že nebyl přidán Hib.

Lyofilizovaný Hib bez pomocného prostředku (Hiberix™) byl přidán před použitím až k výsledné vakcíně DTPa-HepB

Svrchu uvedená skupina dvou pokusů byla provedena v Turecku na skupině 30 jednotlivců. Děti byly očkovány ve věku 3, 4 a 5 měsíců dávkou 0,5 ml.

Příklad 6: Vylučování vakcin různého typu z plic u myší

Vakcíny na bázi hydroxidu hlinitého a vakcíny na bázi fosfátu hlinitého bez Hib byly podrobeny zkouškám krátce po výrobě tak, aby bylo možno zjistit jejich vylučování z plic ve srovnání s běžně dodávanou vakcínou DTPa (INFANRIX™ - SmithKline Beecham Biologicals). Mimo to bylo zkoumáno přidání Hib bez pomocného prostředku k uvedeným vakcínám a účinek tohoto přidání na účinnost vakcíny.

Zkoušky byly prováděny při použití dvou schémat imunizace při použití čtvrtiny dávky, užívané u člověka. Imunizované myši byly infikovány Bordetella pertussis a množství bakterií v CFU/plíce bylo měřeno v průběhu času ♦ · • · · ··· ···· • · · · · * 9 9 9 • · · · ····«·· * ·

Δ ·· ·♦···· ····· ·· * ·« ··« po provedeném očkování.

Výsledky jsou zřejmé z obr. 1. Při infekci zvířat je možno prokázat, že výsledky jsou ekvivalentní pro oba typy použitých vakcín (s nebo bez přidání Hib bez pomocného prostředku), přičemž výsledky odpovídají klasickým vakcínám DTPa.

Příklad 7: Studie na imunogenitu vakcín s antigeny, vázanými na hydroxid hlinitý a na fosfát hlinitý u mladých krys

K pokusům na imunogenitu složky Hib ve vakcínách s antigeny, vázanými na hydroxid hlinitý a na fosfát hlinitý byly použity krysy ve stáří 7 dnů. Pokusy byly provedeny s 1/10 lidské dávky v objemu 50 μΐ, vakcína byla podávána podkožně podle schématu 0-14-28 (den 0 byl 7. den po narození) krevní vzorky byly odebrány ve dni 42. Do skupiny bylo zařazeny vždy 24 až 30 zvířat. Hib adsorbovaný na fosfát hlinitý byl přidán k tekuté vakcíně z příkladů 1 a 2 dva týdny před pokusem nebo byl přidán těsně před očkováním. Pak byl měřen geometrický průměr titru protilátek (GMT) proti PRP.

Výsledky prokazují, že titry PRP v případě obou typů vakcín byly ekvivalentní, nanejvýš docházelo k minimální interferenci v srovnání s titry, naměřenými po podání monovalentní vakciny Hib, adsorbované na fosfát hlinitý.

Příklad 8: Příprava promytého fosfátu hlinitého jako pomocného prostředku

K promytí fosfátu hlinitého byl roztok fosfátu • · · ·

2ο

hlinitého odstředěn 10 minut při 3500 otáčkách za minutu, supernatant byl uložen. Usazenina bylg znovu uvedena do suspenze ve 150 mM NaCl. Tyto stupně byly opakovány 3 až 4krát. Výsledný materiál byl zfiltrován přes filtr s průměrem otvorů 100 Lim k odstranění shluků a fosfát hlinitý byl sterilizován v autoklávu. Sterilní pomocný prostředek byl uložen až do použití při teplotě 4 °C. Takto promytý fosfát hlinitý je stálý nejméně 45 dnů při teplotě místnosti.

K uvedenému účelu byl užit fosfát hlinitý (Superfos). Produkt, dodávaný výrobcem obsahuje až 5 mM volných fosfátových iontů. Při důkladném promytí je možno snížit koncentraci fosfátových iontů až na méně než 0,5 mM, tato koncentrace se zvýší na 1 mM v případě inkubace 7 dnů při teplotě 37 °C. Při promytí fosfátu hlinitého s následnou sterilizací v autoklávu se může koncentrace volného fosfátu zvýšit až na 2,0 až 3,0 mM.

Výsledky:

Vliv promytí fosfátu hlinitého na adsorpci antigenů je uveden v následující tabulce II. H = hodiny, RT = teplota místnosti.

• · · · · · • · · • · · · · ·

Tabulka II

Antigen	Dávka	Doba	Pomocný	PO₄ v	O, O
(adsor bovaný)	(j edn. mg/Al)	adsorpce	prostř.	supern.	absorpce
DT	25 Lf/ 0,25	4 8H RT pH 5,1	nepromyt	4,5 mM	70
DT	25 Lf/ 0,25	24H RT pH 5,1	promyt	0,5 mM	93
DT	25 Lf/ 0,25	24H RT pH 5,1	promyt a autokl.	1,8 mM	90
TT	10 Lf/ 0,10	48H RT pH 5,7	nepromyt	4,5 mM	84
TT	10 Lf/ 0,10	24H RT pH 5,7	promyt a autokl.	1,8 mM	99
Hib (na TT)	10 ^ig/ 0,12	16H RT pH 5,1	nepromyt	4,5 mM	92
Hib (na TT)	10 μς/ 0,12	16H RT pH 5,1	promyt a autokl.	1, 8 mM	100
HBsAg	10 μ9/ 0,02	48H RT pH 5,5	promyt	0,33 mM	97,4
HBsAg	10 pig/ 0,02	48H RT pH 5,5	promyt a autokl.	0,85 mM	96,7
HBsAg	10 μς/ 0,02	48H RT pH 5,5	nepromyt	1,73 mM	95,6
HBsAg	10 μς/ 0,02	48H RT pH 5,5	přidání PO₄	6,66 mM	85, 3

Jak je z výsledků zřejmé, zlepšuje použití promytého fosfátu hlinitého adsorpci všech antigenů, zvláště DT a TT. Je rovněž zřejmé, že po přidání volných •4 ·· Φ Φ • · ·· · · · · » · · · • · ΦΦΦ· Φφφ

Φ Φ · Φ ·····«· « « • · Φ · φ Φφφ

..... ...

fosfátových aniontů při adsorpci dojde k významnému poklesu adsorpce HBsAg.

Příklad 9: Vliv neadsorbovaných antigenů a volného fosfátu na desorpci PRN

PRN má být adsorbován na hydroxid hlinitý tak, aby došlo ke stálé adsorpci antigenů při pH 6,1 za současného udržení účinnosti, jak bylo popsáno svrchu. V případě použití malého množství pomocného prostředku, který má být předem nasycen antigenem, je důležité zjistit stálost antigenů v kombinační vakcině, aby bylo možno prokázat, zda hydroxid hlinitý je skutečně přesycen. V následující tabulce je uveden vliv smísení PRN, předem adsorbovaného na hydroxid hlinitý (8 μς na 10 μρ nebo 50 pg hlinitých iontů) s jednou dávkou antigenů, který nebyl předem adsorbován nebo s fosfátem hlinitým na 7 dnů při teplotě 4 °C a při pH 6,1. Konečné koncentrace antigenů byly ekvivalentní jejich koncentraci v typických kombinačních vakcínách. Množství PRN v supernatantu v procentech bylo měřeno zkouškou ELISA. Množství PRN bylo měřeno v supernatantu i v usazenině (k desorpci PRN bylo použito 500 mM fosfátových aniontů a pak bylo měřeno množství uvolněného PRN. Výsledek byl vypočítán v procentech.

Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce III. Z této tabulky je zřejmé, že hydroxid hlinitý je při použití 8 Lig PRN na 10 Lig hydroxidu hlinitého v kombinační vakcině přesycen, je však stálý při použití 50 μς tohoto pomocného prostředku.

• · • φ • φφ · · · Φ··

ΦΦ·· · φ

Tabulka III

Druhý antigen	%PRN v	%PRN v	%-PRN v	%PRN v
(neadsorbov.)	supernat.	supernat.	supernat.	supernat.
	10 μς	10 μς	50 μρ	50 μς
	A1-4°C	A1-37°C	A1-4°C	A1-37°C
PRN	<0,1	/	/	/
PT	<0, 1	<0,1	/	/
FHA	<0,1	<0,1	/	/
HBsAg	3,8	0,2	/	/
Hib	4,4	62	0,4	0,3
IPV	7,5	56	<0,1	1,6
TT	5,2	62	/	/
DT	28	80	/	/
1 mg/ml nepromytého A1PO₄	/	44	/	/

Je zřejmé, že při přidání volného fosfátu hlinitého dochází k určité desorpci PRN. V tomto případě je možno tento účinek omezit použitím promytého fosfátu hlinitého.

Claims

PATENTOVÉ NÁRO

1. Způsob snížení interference kapsulární polysacharidové složky konjugované vakcíny Haemophilus influenzae B ve vakcíně, obsahující DTPa, vyznačující se tím, že se (i) zvolí jeden nebo větší počet antigenů pro adsorbcí na hydroxid hlinitý jako pomocný prostředek, (ii) hydroxid hlinitý se předem nasytí zvoleným antigenem tak, aby již nebyl k dispozici přebytek hydroxidu hlinitého, (iii) zvolí se Hib s jedním nebo větším počtem dalších antigenů pro adsorbci na fosfát hlinitý, (iv) Hib a další antigeny se adsorbují na fosfát hlinitý, (v) všechny antigeny se kombinují ve vakcíně.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že Hib, adsorbovaný na fosfát hlinitý se přidá před použitím k ostatním antigenům v kombinační vakcíně.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačuj ící se t í m, že kombinační vakcína mimo to obsahuje jeden nebo větší počet antigenů ze skupiny povrchový antigen hepatitidy B, HBsAg, inaktivovaný virus hepatitidy A, ínaktívovaný poliovirus, kapsulární polysacharid

N. meningitidis A, kapsulární polysacharid N.

meningitidis C, kapsulární polysacharid Streptococcus pneumoniae, proteiny Streptococcus pneumoniae, proteiny vnější membrány Moraxella catarrhalis, proteiny vnější membrány Haemophilus influenzae a proteiny vnější membrány N. meningitidis B.

• · · *· 9 ·· · ♦·» 9 9 9 · • · · 9 9 · 9 9 9 • · 999 ···· 9 9 · ·

7Π · · ·«· 9 9 9

-J V ···· · 99 « ·· *»·
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že kombinační vakcína obsahuje-.povrchový antigen hepatitidy B, adsorbovaný na fosfát hlinitý.
5. Způsob podle některého z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že poměr fosfátu hlinitého k hydroxidu hlinitému jako pomocnému prostředku je v rozmezí 1:1 až 20:1.
6. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že všechny antigeny v kombinační vakcíně jsou adsorbovány na fosfát hlinitý za předpokladu, že pertactin je adsorbován na hydroxid hlinitý.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že pertactin, adsorbovaný na hydroxid hlinitý se mísí s neadsorbovaným inaktivovaným antigenem polioviru před smísením s antigeny, adsorbovanými na fosfát hlinitý.
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že všechny antigeny kombinační vakciny jsou adsorbovány na hydroxid hlinitý za předpokladu, že HBsAg a Hib jsou adsorbovány na fosfát hlinitý.
9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že antigeny, adsorbované na hydroxid hlinitý se mísí před přidáním antigenů HBsAg, adsorbovaného na fosfát hlinitý, přičemž Hib, adsorbovaný na fosfát hlinitý se přidává až po přidání antigenů HBsAg.

• 0 0 · 0

0 ·

0 · 0000000

0 0* ·

0 0 0 0 0
10. Způsob podle nároku 8a 9, vyz-.načuj ící se t í m, že se ke kombinační vakcíně přidá další množství volného fosfátu hlinitého.
11. Způsob snížení interference kapsulární polysacharidové složky v konjugované vakcíně Haemophillus influenzae B, Hib v kombinační vakcíně, obsahující DTPa, vyznačující se tím, že se (i) zvolí jeden nebo větší počet antigenů pro adsorpcí na hydroxid hlinitý jako pomocný prostředek, (ii) hydroxid hlinitý se předem nasytí zvoleným antigenem, (iii) zvolí se jeden nebo větší počet dalších antigenů pro adsorpcí na fosfát hlinitý, (iv) tyto další antigeny se adsorbují na fosfát hlinitý, (v) všechny anrigeny ve vakcíně se smísí s Hib bez pomocného prostředku.
12. Způsob snížení interference kapsulární polysacharidové složky v konjugované vakcíně Haemophillus influenzae B, Hib v kombinační vakcíně, obsahující DTPa, vyznačující se tím, že se (i) zvolí jeden nebo větší počet antigenů pro adsorpcí na hydroxid hlinitý jako pomocný prostředek, (ii) hydroxid hlinitý se předem nasytí zvoleným antigenem, (iii) zvolí se jeden nebo větší počet dalších antigenů pro adsorpcí na fosfát hlinitý, (iv) tyto další antigeny se adsorbují na fosfát hlinitý, (v) všechny anrigeny ve vakcíně se smísí, (ví) v případě potřeby se před použitím přidá Hib bez pomocného prostředku nebo adsorbovaný na fosfát hlinitý.

• · ·«·· • v *

• · · • · · · • ···· · · • · ·
13. Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že kombinační vakcína mimo to obsahuje jeden nebo větší počet antigenů ze skupiny povrchový antigen hepatitidy B, HBsAg, inaktivovaný virus hepatitidy A, inaktivovaný poliovirus, kapsulární polysacharid

N. meningitidis A, kapsulární polysacharid N.

meningitidis C, kapsulární polysacharid Streptococcus pneumoniae, proteiny Streptococcus pneumoniae, proteiny vnější membrány Moraxella catarrhalis, proteiny vnější membrány Haemophilus influenzae a proteiny vnější membrány N. meningitidis B.
14. Způsob podle nároku 12,vyznačující se tím, že kombinační vakcína obsahuje povrchový antigen hepatitidy B, adsorbovaný na fosfát hlinitý.
15. Způsob podle některého z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že poměr fosfátu hlinitého k hydroxidu hlinitému jako pomocnému prostředku v kombinační vakcíně je 1:1 až 20:1.
16. Způsob podle některého z nároků 12 až 15, vyznačující se tím, že všechny antigeny kombinační vakcíny jsou adsorbovány na fosfát hlinitý za předpokladu, že pertactin je adsorbován na hydroxid hlinitý a Hib se přidává bez pomocného prostředku nebo adsorbovaný na fosfát hlinitý.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že pertactin, adsorbovaný na hydroxid hlinitý se mísí s neadsorbovaným inaktivovaným antigenem polioviru před smísením s antigeny, adsorbovanými na fosfát • 0 0000 00 0 0« 0 ** 0 000 0000 ·· ·«·· 00 0 • · 0· 0000·«· 0 0 o; · · 00 0 φ·· •Od 00000 00 0 000 hlinitý.
18. Způsob podle některého z nároků 12 až 15, vyznačující se tím, že všechny antigeny kombinační vakcíny jsou adsorbovány na fosfát hlinitý za předpokladu, že pertactin, toxoid záškrtu, toxoid pertuse a filamentózní hemaglutimin jsou adsorbovány na hydroxid hlinitý a Hib se přidává bez pomocného prostředku nebo ve formě, adsorbované na fosfát hlinitý.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že se pertactin, toxoid záškrtu, toxoid pertuse a filamentózní hemaglutimin, adsorbované na hydroxid hlinitý mísí s neadsorbovaným inaktivovaným antigenem polioviru před smísením s antigeny, adsorbovanými na fosfát hlinitý.
20. Způsob podle některého z nároků 12 až 15, vyznačující se tím, že všechny antigeny kombinační vakcíny jsou adsorbovány na hydroxid hlinitý za předpokladu, že HBsAg je adsorbován na fosfát hlinitý a Hib se přidává bez pomocného prostředku nebo adsorbovaný na fosfát hlinitý.
21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se t i m, že se antigeny, adsorbované na hydroxid hlinitý smísí před přidáním antigenu HBsAg, adsorbovaného na fosfát hlinitý.
22. Způsob podle nároků 20 a 21, vyznačuj ící se t i m, že se před přidáním Hib bez pomocného prostředku před použitím vakcíny přidává ještě volný fosfát hlinitý.

•φ · ·« φ φ φ φφφφ φφφ φ φ φ φφφφφφφ φ φ • φ φ φφφ φφ φ φφ φφφ
23. Způsob podle některého z nároků-12 až 22, vyznačující se tím, že se jeden nebo větší počet antigenů, zvolených pro předběžné nasycení hydroxidu hlinitého předem adsorbuje na fosfán hlinitý.
24. Způsob podle některého z nároků vyznačující se tím, vakcíně jako pufr užije L-histidin.

1 až 24, že se v kombinační
26. Kombinační vakcína, získatelná způsobem podle některého z nároků 1 až 25.
27. Způsob očkování proti záškrtu, tetanu, pertusi a infekci H. influenzae typ B, vyznačující se tím, že se podává farmaceuticky účinné množszví kombinační vakciny podle nároku 26.