CZ20003773A3

CZ20003773A3 - DNA konstrukt, izolovaná molekula nukleové kyseliny, homologně rekombinantní buňka a její použití, způsob pozměnění exprese endogenního FSH beta genu a způsob produkce FSH beta

Info

Publication number: CZ20003773A3
Application number: CZ20003773A
Authority: CZ
Inventors: Douglas A. Treco; Michael W. Heartlein; Richard F. Selden
Original assignee: Transkaryotic Therapies, Inc.
Priority date: 1998-05-07
Filing date: 1999-05-05
Publication date: 2001-04-11
Also published as: US6200778B1; HUP0101961A2; IL139432A0; ZA200005746B; KR20010052279A; AR016262A1; EP1075514A1; RU2229309C2; NZ507459A; AU3881799A; AU766620B2; JP2002513566A; US20010034044A1; TWI225517B; NO20005587D0; CN1308673A; PL343732A1; CZ299611B6; CA2328506A1; NO20005587L

Description

DNA KONSTRUKT, IZOLOVANÁ MOLEKULA NUKLEOVÉ KYSELINY,

HOMOLOGNĚ REKOMBINANTNÍ BUŇKA A JEJÍ POUŽITÍ, ZPŮSOB POZMĚNĚNÍ

EXPRESE ENDOGENNÍHO FSIip GENU A ZPŮSOB PRODUKCE FSIip

Oblast techniky

Tento vynález se týká genomické DNA.

Dosavadní stav techniky

Běžné přístupy k léčbě onemocnění pomocí terapeutických proteinů zahrnují podávání proteinů, produkovaných in vitro i genovou terapii. Produkce proteinu in vitro obecně zahrnuje začlenění exogenní DNA, kódující protein, který je předmětem zájmu, do vhodných hostitelských buněk v kultuře. Na druhé straně genová terapie zahrnuje podávání geneticky upravených buněk, plasmidů nebo virů, které obsahují sekvenci, kódující terapeutický sledovaný protein, pacientovi.

Určité terapeutické proteiny mohou být také produkovány žádoucím pozměněním exprese svých endogenních genů a to pomocí genových technik. Toto je možno nalézt např. v US patentu č. 5 641 670, 5 733 761 a 5 272 071, ve WO 91/06666, WO 91/06667 a WO 90/11354. Všechny zmíněné odkazy jsou zde začleněny.

Podstata vynálezu

Předmětný vynález je založen na identifikaci a sekvenování genomické DNA v pozici 5' ke kódujícím sekvencím genu pro lidský folikulostimulační hormon β (,pSH3“). Tato DNA může být použita např. v DNA konstruktu, který po začlenění do genomu savčí buňky pomocí homologní rekombinace, pozměňuje (např. zvyšuje) expresi endogenního FSHP genu v této buňce. „Endogenní Ρ8Ηβ gen“ znamená genomickou („tzn. chromozomální“) kopii genu, který kóduje FSHp. Konstrukt obsahuje určující sekvenci, včetně nově odhalené 5' nekódující sekvence nebo sekvence od ní odvozené, a transkripční regulační sekvenci. Transkripční regulační sekvence se výhodněji sekvenčně odlišuje od transkripční regulační sekvence endogenního FSIip genu. Určující sekvence řídí integraci regulační sekvence do oblasti, která je v rámci sekvencí cílového genu, kódujících FSH3 nebo upstream (po směru transkripce) vůči nim. Regulační sekvence bude operativně připojena k endogenní kódující sekvenci. Pod pojmem

„operativně připojena“ je míněno to, že regulační sekvence může řídit expresi sekvence, kódující endogenní Ι·'8ΓΙβ. Konstrukt může dále obsahovat selekční značkový gen, který usnadňuje selekci buněk, které mají stabilně začleněný konstrukt a/nebo jinou kódující sekvenci, operativně připojenou na promotor.

V jednom provedení DNA konstrukt obsahuje: (a) určující sekvenci, (b) regulační sekvenci, (c) exon a (d) místo sestřihu donoru. Určující sekvence řídí integraci sebe samé a prvků (b) až (d) do oblasti, která je v rámci sekvencí, kódujích FSH3, cílového genu nebo v upstream pozici vůči nim. Jakmile je prvek (b) začleněn, může řídit transkripci prvků (c) a (d) a všech kódujících sekvencí endogenního genu, které jsou v downstream pozici. V konstruktu je exon většinou v 3' pozici k regulační sekvenci a místo sestřihu donoru je na 3' konci exonu.

V jiném provedení DNA konstrukt obsahuje: (a) určující sekvenci, (b) regulační sekvenci, (c) exon, (d) místo sestřihu donoru, (e) intron a (ť) místo sestřihu akceptoru, přičemž určující sekvence řídí začlenění sebe samé a prvků (b) až (f) tak, že prvky (b) až (f) jsou v rámci endogenního genu nebo v upstream pozici vůči němu. Regulační sekvence poté řídí produkci transkriptu, který neobsahuje pouze prvky (c) až (f), ale také sekvence, kódující Ι’811β. Výhodněji jsou intron a místo sestřihu akceptoru umístěny v konstruktu v downstream pozici od místa sestřihu donoru.

Určující sekvence je homologní s předem vybraným cílovým místem vgenomu, se kterým má proběhnout homologní rekombinace. Obsahuje alespoň 20 (např. alespoň 30, 50, 100 nebo 1000) bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze sekvence s identifikačním číslem 4 (SEQ ID číslo 4), která odpovídá nukleotidům-7454 až -1417 genomické sekvence lidského FSHp (číslováno vzhledem k místu počátku translace) nebo SEQ ID číslo 5, která odpovídá nukleotidům -696 až -155 v genomické sekvenci lidského FSHp. Pod pojmem „homologní“ je míněno to, že určující sekvence je identická nebo dostatečně podobná se svým genomickým cílovým místem, takže určující sekvence a cílové místo mohou v lidské buňce podstoupit homologní rekombinaci. Malé procento chybně spojeným párů bází je přijatelné do té míry, pokud může homologní rekombinace probíhat s užitečnou frekvencí. Pro usnadnění homologní rekombinace má určující sekvence výhodněji délku alespoň asi 20 (např. alespoň 50, 100, 250, 400 nebo 1000) párů bází („bp“). Určující sekvence může také zahrnovat genomické sekvence z oblasti, která je vně oblasti, pokryté SEQ ID číslo 4 nebo 5 a to do té míry, dokud zahrnuje alespoň 20 nukleotidů z jedné ze 2 oblastí. Další určující sekvence mohou například pocházet ze sekvence, ležící mezi SEQ ID číslo 4 a sekvencí pro zahájení transkripce FSI IjS genu.

Vzhledem k polymorfismu, který může existovat v genetickém místě ΓΈΗβ, se mohou v nukleotidovém složení jakéhokoliv daného genomického cílového místa v jakýchkoliv daných • · savčích druzích vyskytovat minoritní variace. Určující sekvence, které odpovídají těmto polymorfním variantám SEQ ID číslo 4 nebo 5 (konkrétně lidským polymorfním variantám) jsou v rámci rozsahu tohoto vynálezu.

Po homologní rekombinaci je regulační sekvence konstruktu začleněna do předem vybrané oblasti chromozómu buňky, která je v upstream pozici ke kódující sekvenci FSHP genu. Vzniklá nová transkripční jednotka, obsahující regulační sekvenci pocházející z konstruktu, pozměňuje expresi cílového FSHp genu. Takto produkovaný FSHp protein může být z hlediska sekvence identický s FSHP proteinem, který je kódován nepozměněným endogenním genem, nebo může ve srovnání s divokým FSHP proteinem obsahovat další substituované zbytky nebo zbytky s menším počtem aminokyselin a to vzhledem ke změnám, které jsou začleněny jakožto výsledek homologní rekombinace.

Pozměněná exprese genu zahrnuje aktivování (nebo přimění k expresi) genu, který je obvykle v získané buňce klidný (tzn. v podstatě není exprimován), zvýšení nebo snížení hladiny exprese genu a změnu průběhu regulace genu a to takovou, že průběh se liší od průběhu v získané buňce. „Získaná buňka“ znamená buňku před homologní rekombinaci.

V rozsahu předmětného vynálezu je rovněž způsob použití předmětného DNA konstruktu pro pozměňování exprese endogenního FSHP genu v savčí buňce. Tento způsob zahrnuje následující kroky: (i) začlenění DNA konstruktu do savčí buňky, (ii) setrvání buňky v takových podmínkách^ které umožňují homologní rekombinaci mezi konstruktem a genomickým cílovým místem, které je homologní s určující sekvencí, a jejíž cílem je produkovat homologně rekombinantní buňku a (iii) setrvání homologně rekombinantní buňky v takových podmínkách, které umožňují expresi sekvence, kódující FSI Ιβ pod kontrolou regulační sekvence, pocházející z konstruktu. Alespoň část genomického cílového místa je v pozici 5 ' ke kódující sekvenci endogenního FSIΙβ genu. To znamená, že genomické cílové místo může obsahovat kódující sekvenci i 5' nekódující sekvenci.

Vynález se také věnuje transfektovaným nebo infikovaným buňkám, ve kterých konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k endogennímu iniciačnímu kodónu ATG v jedné nebo obou alelách endogenního FSHP genu. Tyto transfektované nebo infikované buňky, také označované jako homologně rekombinantní buňky, mají pozměněný průběh exprese FSHp. Tyto buňky jsou konkrétně užitečné pro produkci FSHP in vitro a pro dodávání FSHP prostřednictvím genové terapie. Způsoby přípravy a použití těchto buněk jsou vynálezem rovněž pokryty. Buňky mohou pocházet z obratlovců jako jsou např. savčí buňky (např. lidské buňky, buňky primáta jiného než člověk, kravské, prasečí, koňské, kozí, ovčí, kočičí, psí, králičí, myšší, buňky z morčete, křečka nebo potkana).

Předmětný vynález se dále týká způsobu produkce savčího FSH3 proteinu in vitro nebo in vivo a to pomocí začlenění výše popsaného konstruktu do genomu hostitelské buňky prostřednictvím homologní rekombinace. Homologně rekombinantní buňka je poté ponechána v takových podmínkách, kdy dochází k transkripci, translaci a příležitostně sekreci Γ8Ι Ιβ proteinu.

Vynález se také věnuje izolovaným nukleovým kyselinám, obsahujícím sekvenci alespoň 20 (např. alespoň 30, 50, 100, 200 nebo 1000) bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 4 nebo alespoň 20 (např. alespoň 30, 50, 100 nebo 200) bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo podobně velkou část ze sekvence identické se SEQ ID číslo 4 nebo 5 až na polymorfhí variace nebo jiné minoritní variace (např. méně než 5 % sekvence), která nezabraňuje homologní rekombinaci s cílovou sekvencí. V jednom provedení zahrnuje izolovaná nukleová kyselina podle vynálezu blok bezprostředně po sobě následujících

100 bp SEQ ID číslo 4 nebo 5. Například, izolovaná DNA může obsahovat nukleotidy 1 až 100,

101 až 200, 201 až 300, 301 až 400, 401 až 500, 501 až 600, 601 až 700, 701 až 800, 801 až 900, 901 až 1000, 1001 až 1100, 1101 až 1200, 1201 až 1300, 1301 až 1400, 1401 až 1500, 1501 až 1600, 1601 až 1700, 1701 až 1800, 1801 až 1900, 1901 až 2000, 2001 až 2100, 2101 až 2200, 2201 až 2300, 2301 až 2400, 2401 až 2500, 2501 až 2600, 2601 až 2700, 2701 až 2800, 2801 až 2900, 2901 až 3000, 3001 až 3100, 3101 až 3200, 3201 až 3300, 3301 až 3400, 3401 až 3500, 3501 až 3600, 3601 až 3700, 3701 až 3800, 3801 až 3900, 3901 až 4000, 4001 až 4100, 4101 až 4200, 4201 až 4300, 4301 až 4400, 4401 až 4500, 4501 až 4600, 4601 až 4700, 4701 až 4800, 4801 až 4900, 4901 až 5000, 5001 až 5100, 5101 až 5200, 5201 až 5300, 5301 až 5400, 5401 až 5500, 5501 až 5600, 5601 až 5700, 5701 až 5800, 5801 až 5900, 5901 až 6000 nebo 5939 až 6038 ze SEQ ID číslo 4 nebo její komplement. Izolovaná nukleová kyselina podle vynálezu může příležitostně zahrnovat nukleotidy 1 až 100, 101 až 200, 201 až 300, 301 až 400, 401 až 500 nebo 443 až 542 ze SEQ ID číslo 5. Tyto bloky SEQ ID číslo 4 nebo 5 a jejich komplementy jsou také užitečné jako určující sekvence v konstruktech předmětného vynálezu.

V izolované DNA není sekvence bezprostředně po sobě následujících nukleotidů připojena na sekvenci, kódující celý I SI 1β nebo alespoň není připojena ve stejné konfiguraci (tzn. oddělená stejnou sekvencí) jako to je v jakémkoliv nativním genomu. Termín „izolovaná DNA“, jak je zde používán, tedy neoznačuje chromozóm nebo velký kus genomické DNA (který by mohl být začleněn do kosmidu nebo kvasinkového uměle sestrojeného chromozómu), který neobsahuje pouze celou sekvenci SEQ ID číslo 4 nebo 5 nebo část, ale také neporušenou sekvenci, kódující FSH3 a všechno, co leží mezi sekvencí kódující FSF$ a sekvencí odpovídající SEQ ID číslo 4 nebo 5, jak to existuje v genomu buňky. Sem patří, ale neznamená • · »· · » · • * to omezení v žádném směru, DNA (i) která je začleněna do plasmidu nebo viru nebo (ii) která existuje jako samostatná molekula nezávislá na jiných sekvencích např. fragment produkovaný pomocí polymerázové řetězové reakce („PCR“) nebo působením restrikční endonukleázy. Izolovaná DNA výhodněji neobsahuje sekvenci, která kóduje neporušený prekurzor FSIIfS (tzn. FSHp doplněný o svůj endogenní sekreční signální peptid).

Vynález rovněž zahrnuje izolovanou DNA, obsahující vlákno, které obsahuje sekvenci, jejíž délka je alespoň 100 (např. alespoň 200, 400 nebo 1000) nukleotidů a která hybridizuje buď za vysoce nebo středně stringentních podmínek se SEQ ID číslo 4 nebo 5 nebo s komplementem SEQ ID číslo 4 nebo 5. Sekvence není připojena na sekvenci kódující FSH3 nebo alespoň není připojena ve stejné konfiguraci jako se to vyskytuje vjakémkoliv nativním genomu. Pod pojmem středně stringentní podmínky je míněna hybridizace při 50 °C v Churchově pufru (7% SDS, 0,5% NaHPOt, 1 M EDTA, 1% hovězí sérový albumin) a promytí při 50 °C v 2x SSC. Vysoce stringentní podmínky jsou definovány jako hybridizace při 42 °C v přítomnosti 50% formamidu; první promytí při 65 °C roztokem 2x SSC, obsahujícím 1% SDS, následuje druhé promytí při 65 °C roztokem 0,lx SSC.

Vynález rovněž zahrnuje izolovanou DNA obsahující vlákno, které obsahuje sekvenci, (i) jejíž délka je alespoň 100 (např. alespoň 200, 400 nebo 1000) nukleotidů a (ii) která vykazuje alespoň 80% (např. alespoň 85%, 90%, 95% nebo 98%) sekvenční totožnost se stejně dlouhým úsekem ze SEQ ID číslo 4 nebo 5 nebo z jejich komplementu. Sekvence není připojena na sekvenci kódující FSI-Ιβ nebo alespoň není připojena ve stejné konfiguraci jako se to vyskytuje v jakémkoliv nativním genomu.

Jestliže konkrétní polypeptidová molekula nebo molekula nukleové kyseliny vykazuje specifickou procentuální totožnost nebo konzervativitu s referenčním polypeptidem nebo molekulou nukleové kyseliny, pak jsou procentuální totožnost nebo konzervativita určeny pomocí algoritmu podle Myerse a Millera CABIOS (1989), který je součástí programu ALIGN (version 2.0) nebo pomocí jeho ekvivalentu s použitím délky mezery 12 a mezerou 4, přičemž tyto parametry jsou nutné. Všechny ostatní parametry jsou nastaveny na své předem dané pozice. Přístup do ALIGN je snadno dostupný např. na Internetu http://wwt\<2. igh. cnrs.fr/bin/align-guess.cgi.

Vynález se také zabývá způsobem dodání ΙΝΗβ jedinci (např. savci jako je člověk, primátu jinému než člověk, krávě, praseti, koni, koze, ovci, kočce, psovi, králíkovi, myši, morčeti, křečkovi nebo potkanovi). Toto je realizováno poskytnutím buňky, jejíž endogenní FSHp gen byl zde popsaným způsobem aktivován a implantováním buňky do zvířete, kde buňka vylučuje FSHp. Ve vynálezu je rovněž zahrnut způsob produkce FSH[3, který zahrnuje poskytnutí buňky, jejíž endogenní FSI-Ιβ gen byl zde popsaným způsobem aktivován a • · • · kultivování této buňky in vitro za takových podmínek, které umožňují buňce exprimovat a vylučovat FSHfi.

Izolovaná DNA podle předmětného vynálezu může být použita například jako zdroj upstream primeru pro PCR pro použití (je-li kombinován s vhodným downstream primerem) při získávání regulačních a/nebo kódujících oblastí endogenního FSH3 genu nebo jako hybridizační próba pro indikaci přítomnosti chromozómu 11 v preparátu lidských chromozómů. Také může být použita při pozměňování exprese endogenního ISlip genu v buňce obratlovce, což je popsáno níže.

Pokud není definováno jinak, jsou všechny technické a vědecké termíny, které se zde vyskytují, používány ve stejném smyslu jako je běžně znám odborníkům v dané oblasti techniky, kterým je tento vynález určen. Exemplární způsoby a materiály jsou popsány níže, ale při zkoušení nebo testování předmětného vynálezu mohou být také použity způsoby a materiály podobné nebo stejné jako jsou ty, které jsou zde popsány. Všechny publikace, patentové přihlášky, patenty a jiné zde zmiňované odkazy jsou zde začleněny. V případě sporu bude předložená specifikace včetně definicí kontrolována. Materiály, způsoby a příklady jsou pouze ilustrativní a nejsou zamýšleny jako jakýmkoliv způsobem limitující.

Další znaky a výhody vynálezu budou patrné z následujícího podrobnějšího popisu a z nároků.

Předmětný vynález je založen na objevu nukleotidového složení sekvencí upstream ke kódující sekvenci lidského FSH3 genu.

FSlip je gonadotropin, který hraje podstatnou roli v existenci a vývoji oocytů a spermatozoí v běžné fyziologii reprodukce. FSH je tvořen 2 podjednotkami, a a β, přičemž druhá zmíněná podjednotka je odpovědná za biologickou specifitu FSH.

Lidský FSHfi gen kóduje prekurzorový protein o 129 aminokyselinách, který obsahuje 16 aminokyselinový signální peptid. Gen obsahuje tři exony a 2 introny, přičemž exon je nekódující exon. Genomická mapa lidského FSH3 genu je ukázána na obr. 1. Mapa je sestrojena na základě publikovaných sekvencí (HUMFSHBQ1, GenBank přístupová čísla M54912, M38644, M21219 a M18536), které odpovídají třem samostatným genomickým segmentům (obr. 1). První segment je 720 bp dlouhý a obsahuje 530 bp nepřepisovaných upstream sekvencí, exon 1 (63 bp; nekódující) a 127 bp intronu 1. Druhý segment začíná v pozici -152 a končí v pozici +367 (pokud není uvedeno jinak, jsou všechny zde uvedené pozice vztahovány k translačnímu iniciačnímu místu). Tento segment zahrnuje 146 bp intronu , exon 2 (165 bp) a 208 bp intronu 2. Třetí segment obsahuje 102 bp intronu 2 a exon 3 a přesahuje o 1480 bp translační stop kodón.

• 9

Specifické sekvence v 5' pozici vůči kódující sekvenci FSHfí a jejich použití při pozměňování exprese endogenního FSIip genu.

Pro získání genomické DNA, obsahující upstream sekvenci FSHfi genu, byla testována genomická knihovna lidského leukocytu v lambda EMBL3 (Clontech katalogové # HLIOOód). Testování bylo provedeno s oligonukleotidovou próbou o 40 bp, BETA2. Tato pochází z 23 bp exonu 1 a 17 bp intronu 1 a má následující sekvenci:

5' TTGGCATCTACCGTTTTCAAGTGGTGACAGCTACTTTTGA 3' (SEQ ID číslo 3)

Pomocí radioznačené próby BETA2 byl testován přibližně 1 milion rekombinantních fágů. Byl izolován 1 fágovýplak označený jako klon 8-1-1-1.

Fragment z fágu 8-1-1-1 o velikosti 7,6 kb, získaný HindlII-Kpnl, byl subklonován do pBluescript Π SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) s cílem produkovat plasmid, který obsahuje asi 6,6 kb z upstream sekvencí, exon 1, intron 1, exon 2 a 9 bp intronu 2 (obr. 2). Plasmid byl označen pHFB2.

Plasmid pHFB2 byl sekvenován metodou podle Sangera. Soubory sekvenčních dat byly porovnány. Cílem bylo získat úplnou sekvenci inzertu fága 8-1-1-1. Tato nukleotidová sekvence (SEQ ID číslo 1) je ukázána na obr. 3.

Bylo zjištěno, že inzert obsahuje oblast o 7 622 bp FSH3 genu, začínající v pozici -7 454 (obr. 3). Sekvence, obsahující pozice -7 454 až -1 417 (6 038 bp z upstream sekvence; SEQ ID číslo 4) a pozice -696 až -155 (542 bp intronu 1; SEQ ID číslo 5), nebyly dosud publikovány.

Pro pozměnění exprese endogenního FSHfí genu, byl použit obecný přístup, naznačený na obr. 4. Nukleotidy 3860 až 5784 ze SEQ ID číslo 4 sloužily jako první (5') určující sekvence, zatímco SEQ ID číslo 5 sloužila jako druhá (3') určující sekvence. DNA fragmenty, obsahující tyto sekvence, byly subklonovány do plasmidů s cílem produkovat konstrukty pGA308, pGA301 a pGA307, které jsou zobrazeny na obr. 5 až 7. Každý z těchto plasmidů obsahuje asi 3,2 kb 5' určující sekvence a asi 0,5 kb 3 určující sekvence.

Buňky HT-1080 byly samostatně transfektovány každým plasmidem a byla provedena selekce na G418. Po přibližně 14 dnech, byly spočítány kolonie rezistentní vůči G418 v destičkách se 6 jamkami. V mediu v každé jamce byla testována exprese GA-FSH pomocí ELISA. Buňky, vykazující produkci GA-FSH, byly trypsinovány a spočítány. Buňky byly poté naředčny a umístěny do destiček s 96 jamkami, aby došlo k namnožení klonů. Po asi 2 týdnech, • · • · byla pomocí ELISA u buněčných populací testována produkce GA-FSH. Kolonie, u kterých byla zjištěna produkce GA-FSH, byly namnoženy v kultuře a skladovány nebo dále analyzovány. Tab. 1 shrnuje frekvenci aktivace endogenního genu a jiné údaje, získané zvýše uvedeného postupu klonování.

Buňky, transfektované pGA308 byly detailněji studovány. Obr. 8 naznačuje rozsah produkce FSH, které bylo dosaženo v buňkách HT1080 transfektovaných pGA308. Buňky byly kultivovány médiu s různými koncentracemi methotrexátu. Sloupec, označený jako „0,2 (klonovaný)“ představuje produkci FSH u buněčné linie klonované limitujícím ředěním buněk, rezistentních k 0,2 μΜ methotrexátu. Výsledky, vynesené do grafu na obr. 8, jasně naznačují, že vyšší koncentrace methotrexátu mohou vést ke zisku buněčných linií, které produkují alespoň 50 μg/10⁶ buněk za 1 den.

• · • 4444 • · 4 • 4 4 4 • · · • · · • 4 · »4 44

průměrná	produkce	Cd W CG to	M >« a a Λ Ό O δβ	za 24 h.)	465	450	CM <r>

o	43 o	43 u	Λ
o & >	^v>> a « >	u ca > o	fl >o >«	inií	í“^ r—i	20	Ό
o	O	a	a
*	o	o	a
cel	.a	Ξ	U2
<υ o						\D	6989/
0 «J >	O ca > ♦£				1267	1035:
4J
U	ca				1—^

				Cd
^k^i >		°a -a	υ o ca	SH
O 43	>s o	ca a	£	to	co	co	Tj-
O	au	S a	2 ca	a a 4»
				W)
+4		Λ
>CJ O a. ►	*a	υ fl toJ fl Φ toJ	00 rH Tř ϋ		8012	1068	7474
O		ΖΛ N <U	λ		CO	CO	ΓΊ
o

a
ca
>	a				1—	r-	00
o					o	o	o
-w	g				co	CO	co
«2 í*«	M				<	<	<
ca				o	o	o
ta	a.				a.	o.	a,
05

• · • 4·· • · · »· ·· • · • · • · ·

Obecná metodologie

Pozměnění exprese endogenního FSl ip

Pomocí výše popsaných upstream FSHp sekvencí je možno pozměnit expresi endogenního lidského FSHP genu a to způsobem, který je obecně popsán v US patentu č. 5 641 670. Jedna možná strategie je ukázána na obr. 4. V této strategii je konstrukt sestrojen tak, aby zahrnoval první určující sekvenci homologní s prvním cílovým místem v upstream pozici vůči genu, amplifikační značkový gen, selekční značkový gen, regulační oblast, CAP místo, exon, nespárované místo sestřihu donoru a druhou určující sekvenci, odpovídající druhému cílovému místu v downstream pozici vůči prvnímu cílovému místu a terminaci buď v rámci sekvence, kódující Ι’8Ηβ nebo upstream k ní. V této strategii spolu v chromozómu první a druhé cílové místo před homologní rekombinací bezprostředně sousedí, avšak tato konfigurace není nutná (viz níže). Homologně rekombinantní buňky budou produkovat prekurzor mRNA, který odpovídá exogennímu exonu a místu sestřihu donoru a jakékoliv sekvenci mezi místem sestřihu donoru a transkripční terminační sekvencí FSHjl genu včetně FSHji intronů, exonů a 3' nepřeložené oblasti (obr. 4). Výsledkem sestřihu je mRNA, ve které je exogenní exon fúzován s exonem 2 endogenního Γ8Ηβ genu. Translací mRNA vzniká prekurzor FSHp.

Mohou být také použity jiné přístupy. Například první a/nebo druhé cílové místo může být v prvním intronu FSH3 genu. Příležitostně může být DNA konstrukt sestrojen tak, aby obsahoval, od 5' ke 3' konci, první určující sekvenci, amplifikační značkový gen, selekční značkový gen, regulační oblast, CAP místo, exon, místo sestřihu donoru, intron, místo sestřihu akceptoru a druhou určující sekvenci. Pro tuto strategii je 5' konec druhého cílového místa výhodněji menší než 40 bp upstream k běžnému translačnímu iniciačnímu místu ΓΝΙΙβ. Důvodem je vyloučení nežádoucích startovních kodónů ATG. Prekurzor mRNA, produkovaný z homologně rekombinovaného místa, bude zahrnovat exogenní exon, exogenní místo sestřihu donoru, exogenní intron, exogenní místo sestřihu akceptoru a jakékoliv sekvence mezi exogenním místem sestřihu akceptoru a transkripčním terminačním místem endogenního I SI Ιβ genu. Výsledkem sestřihu tohoto transkriptu bude mRNA, která může být přeložena s cílem produkovat prekurzor lidského 1*8Ηβ, který má buď běžnou signální sekvenci pro sekreci PSI 1β nebo geneticky modifikovanou sekreční signální sekvenci. Velikost exogenního intronu a tedy i pozice exogenní regulační oblasti vzhledem ke kódující oblasti genu se může lišit a to z toho důvodu, aby byla optimalizována funkce regulační oblasti.

• «· · ·· ·♦ ·♦ • · · · · · • · · · · • · · · · · • · · · ·

V jakékoliv strategii aktivace spolu nemusí první a druhé cílové místo bezprostředně sousedit nebo dokonce ani nemusí být blízko sebe. Jestliže spolu bezprostředně nesousedí, měla by být část běžné upstream oblasti genu FSH3 a/nebo část kódující oblasti po homologní rekombinaci odstraněna.

V případě potřeby může být produkt aktivovaného FSHf) genu produkován v takovém typu buňky, který exprimuje gen pro α-podjednotku lidského glykoproteinu (FSHa), jehož produkt tvoří heterodimer s produktem FSH3 genu. Tímto typem může být přirozeně se vyskytující buněčný kmen nebo buněčná linie. Příležitostně může být gen pro a-podjednotku lidského glykoproteinu (Genbank sekvence HUMGLYCA1) exprimován spolu s produktem FSH3 genu, přičemž tato společná exprese je uskutečněna expresí genu pro a-podjednotku lidského glykoproteinu nebo cDNA pod kontrolou příslušného promotoru nebo aktivací genu α-podjednotky lidského glykoproteinu prostřednictvím zde popisovaných postupů.

Například, sekvence kódující α-podjednotku glykoproteinu může být začleněna do DNA konstruktu. Tato kódující sekvence je umístěna pod transkripční kontrolou regulační sekvence, jejíž nukleotidové složení je buď totožné nebo odlišné od té části regulační sekvence, která je odpovědná za řízení exprese endogenního FSIip genu. Obr. 5 až 7 znázorňují příklady těchto konstruktů.

DNA konstrukt

DNA konstrukt podle vynálezu zahrnuje alespoň určující sekvenci a regulační sekvenci. Může také příležitostně obsahovat exon; nebo exon a nepárované místo sestřihu donoru; nebo exon, místo sestřihu donoru, intron a místo sestřihu akceptoru. Exon, je-li přítomen, je v 3' pozici k regulační sekvenci a nepárované místo sestřihu donoru je na 3' konci exonu. Intron a místo sestřihu akceptoru, jestliže jsou přítomny, jsou v 3' pozici k místu sestřihu donoru. Dále zde může být více exonů a intronů (s odpovídajícími místy sestřihu donoru a akceptoru) předcházejících (tzn. 5') k exonu, který přesahuje o nepárované místo sestřihu donoru. DNA v konstruktu je označována jako exogenní, protože není původní částí genomu hostitelské buňky. Exogenní DNA může mít sekvence odlišné nebo identické s částmi endogenní genomické DNA, přítomné v buňce před transfekci nebo infekcí virovým vektorem. Zde používaný pojem „transfekce“ znamená začlenění plasmidu do buňky chemickým nebo fyzikálním způsobem jako je srážení fosforečnanem vápenatým nebo chloridem vápenatým, transfekce zprostředkovaná DEAE-dextranem, lipofekce, elektroporace, mikroinjekce, mikroprojektilace nebo zachycení pomocí biolistiku. ,,Infekce“, jak je zde používána, znamená začlenění virové nukleové kyseliny • ·

« ·*♦· ·· · · • · · · • · · • · do buňky pomocí infekce virem Různé prvky, obsažené v DNA konstruktu podle vynálezu, jsou podrobněji popsány níže.

DNA konstrukt může také zahrnovat cis-pracující nebo trans-pracující virové sekvence (např. signály pro sbalování), čímž je umožněno dopravení konstruktu do jádra buňky prostřednictvím infekce virovým vektorem Jestliže je to nezbytné, může být DNA konstrukt uvolněn během různých stupňů životního cyklu viru jako je intergrace zprostředkovaná integrázou v retrovirech nebo episomový způsob. Uvolnění může být doprovázeno odpovídajícími delecemi nebo mutacemi virových sekvencí jako je delece oblasti kódující integrázu v retrovirovém vektoru. Další podrobnosti týkající se konstrukce a použití virových vektorů je možno nalézt v Robbins a kol. Pharmacol. Ther. 80:35 až 47, 1998 a v Gunzburg a kol., Mol. Med. Today 1:410 až 417, 1995, které jsou zde začleněny jako odkaz.

Určující sekvence

Určující sekvence umožňují homologní rekombinaci žádoucí sekvence do zvoleného místa v genomu hostitele. Určující sekvence jsou homologní (tzn. schopny homologně se rekombinovat) se svými odpovídajícími cílovými místy v genomu hostitele.

Kružnicový DNA konstrukt může používat jedinou určující sekvenci nebo dvě nebo více samostatných určujících sekvencí. Lineární DNA konstrukt může obsahovat dvě nebo více samostatných určujících sekvencí. Cílové místo, se kterým je daná určující sekvence homologní, může být v exonu a/nebo intronu FSIip genu, v upstream pozici a v pozici bezprostředně sousedící s oblastí, kódující FSHp nebo v upstream pozici a v pozici vzdálené od oblasti, kódující FSIip.

První ze dvou určujících sekvencí v konstruktu (nebo celá určující sekvence v případě, že je v konstruktu pouze jedna určující sekvence) pochází alespoň částečně z nově odhalených oblastí genomu, upstream k sekvencím, kódujícím FSIΙβ. Tato určující sekvence obsahuje část SEQ ID číslo 1, např. alespoň 20 po sobě jdoucích nukleotidů ze sekvence, odpovídající pozicím -7 454 až -1 417 (SEQ ID číslo 4) nebo pozicím -696 až -155 (SEQ ID číslo 5). Druhá z určujících sekvencí v konstruktu může zaměřit oblast genomu upstream ke kódující sekvenci (tzn. také obsahuje část SEQ ID číslo 4 nebo 5) nebo zaměří exon nebo intron genu.

Určující sekvence může(mohou) dále zahrnovat sekvenci, pocházející z dříve odhalené oblasti FSI Ιβ genu včetně těch, které jsou zde popsány. Dále může zahrnovat také oblasti v upstream pozici, které nejsou strukturálně charakterizovány, ale mohou být odborníkem v dané oblasti zmapovány.

• ·« ·· ♦ · ·· ·· · ···*

Fragmenty genomu, které mohou být použity jako určující sekvence, mohou být identifikovány pomocí své schopnosti hybridizovat s próbou, obsahující celou nebo pouze část SEQ ID číslo 4 nebo 5. Tato próba může být vytvořena pomocí PCR s použitím primerů, odvozených od SEQ ID číslo 1.

Regulační sekvence

Regulační sekvence DNA konstruktu mohou obsahovat jeden nebo více promotorů (např. konstitutivní, tkáňově-specifický nebo indukovatelný promotor), zesilovače, podpůrné oblasti při připojování („scaffold-attachment region“) nebo místa pro připojení na matrici, negativní regulační prvky, vazebná místa pro transkripční faktor nebo kombinace těchto prvků.

Regulační sekvence může pocházet z genomu eukaryotní (např. savčí) buňky nebo z genomu viru. Užitečné regulační sekvence zahrnují, aniž by to znamenalo nějaké omezení, takové sekvence, které regulují expresi genů časné a pozdní fáze SV40, cytomegalovirových genů a zejména adenovirových genů pozdní fáze. Také zahrnují regulační oblasti, pocházející z genů, kódujících myšší metallothionein-I, elongační faktor-la, kolagen (např. kolagen Ial, kolagen Ia2 a kolagen IV), aktin (např. γ-aktin), imunoglobulin, HMG-CoA reduktázu, glyceraldehydfosfátdehydrogenázu, 3-fosfoglycerátkinázu, kolagenázu, stromelysin, fibronektin, vimentin, plasminogenový aktivátor inhibitor I, tbymosin β4, tkáňové inhibitory metaloproteinázy, ribosomální proteiny, molekuly hlavního histokompatibilitního komplexu a lidské leukocytové antigeny.

Regulační sekvence výhodněji obsahuje vazebné místo pro transkripční faktor jako je TATA Box, CCAAT Box, API, Spi nebo vazebné místo NF-kB.

Značkové geny

V případě potřeby může konstrukt zahrnovat sekvenci, kódující žádoucí polypeptid, operativně připojenou na svůj vlastní promotor. Příkladem tohoto může být selekční značkový gen, který může být použit pro usnadnění identifikace sledovaného případu. Amplifikacní značkový gen může být také použit pro usnadnění selekce buněk, které mají současně amplifikované i přesahující DNA sekvence. Buňky, obsahující amplifikované kopie amplifikačního značkového genu, mohou být identifikovány prostřednictvím růstu v přítomnosti činidla, které selektuje expresi amplifikačního genu. Aktivovaný endogenní FSHp gen bude většinou amplifikován spolu s amplifikačním selekčním značkovým genem. Buňky, obsahující ·»·· • · 9

99 ·· · 9 · ·

9 9 9 9

9 9 9 9 9 « 9 9 9 9

999 ·· 99 více kopií aktivovaného endogenního genu, mohou produkovat velmi vysoké hladiny FSH3 a jsou tudíž užitečné pro produkci proteinu in vitro a pro genovou terapii.

Selekční a amplifíkační značkové geny spolu nemusí bezprostředně sousedit. Amplifikačním značkovým genem a selekčním značkovým genem může být stejný gen. Jeden nebo oba značkové geny mohou být umístěny v intronu DNA konstruktu. Vhodné amplifíkační a selekční značkové geny jsou popsány v US patentu č. 5 641 670.

Exogenní exon

DNA konstrukt může dále obsahovat exon, tzn. DNA sekvenci, která je kopírována do RNA a je přítomna ve zralé molekule mRNA. Exon v konstruktu je zde označován jako exogenní exon nebo exon, pocházející z konstruktu. Exogenní exon může být nekódující jako první exon lidského ESI 1β genu a fakticky může být sekvenčně identický s dalším exonem. Příležitostně exogenní exon kóduje jeden nebo více aminokyselinových zbytků nebo částečně kóduje aminokyselinový zbytek (tzn. obsahuje jeden nebo dva nukleotidy kodóuu). Jestliže exon obsahuje kódující sekvenci, měl by být DNA konstrukt sestrojen tak, že po transkripci a sestřihu bude čtecí rámec vznikající mRNA uvnitř rámce s kódující oblastí cílového FSHP genu. To znamená, že exogenní exon je sestřižen na endogenní exon tak, že nedochází ke změně příslušného čtecího rámce té části mRNA, pocházející z endogenního exonu.

Začlenění kódujícího exonu do konstruktu umožňuje produkci fuzního proteinu, který obsahuje jak sekvenci endogenního FSH3 proteinu tak i sekvenci exogenního proteinu. Tento hybridní protein může kombinovat strukturální vlastnosti, enzymatické vlastnosti nebo vlastnosti související s vazbou bgandu nebo receptoru, dvou nebo více proteinů do jednoho polypeptidu. Například exogenní exon může kódovat buněčnou membránovou kotvu, signální peptid pro zvýšení buněčné sekrece, vedoucí sekvenci, enzymatickou oblast, oblast pro vazbu kofaktoru nebo epitopový cíl pro usnadnění přečištění FSH3 hybridního proteinu, produkovaného z rekombinantního genového místa.

Místo sestřihu donoru

Exogenní exon přesahuje na svém 3' konci o místo sestřihu donoru. Místo sestřihu donoru je sekvence, která řídí sestřih jednoho exonu RNA transkriptu na místo sestřihu akceptoru jiného exonu RNA transkriptu. První exon většinou leží v pozici 5' ke druhému exonu a místo sestřihu donoru, které se nachází na 3' konci prvního exonu, je párováno s místem

9999 ·*

99

9 9 9 • 9 · 9 • 9 ·> *

9 9 9

99 • 9 * · · • 9 · ·

999 999 »*· 9499 sestřihu akceptoru na 5' straně druhého exonu. Místa sestřihu donoru mají charakteristickou shodnou sekvenci reprezentovanou (A/C)AGGURAGU (kde R značí purin), přičemž GU ve čtvrté a páté pozici jsou nezbytné (Jackson, Nucleic Acids Research 19: 3715 až 3798, 1991). První tři báze shodného místa sestřihu donoru jsou poslední tři báze exonu: tzn. nejsou vystřiženy. Místa sestřihu donoru jsou funkčně definována svou schopností ovlivňovat odpovídající reakci při sestřihu mRNA.

Například, místo sestřihu donoru může být umístěno v pozici bezprostředně sousedící a současně 3' k ATG kodónu a to tehdy, když pro exogenní exon není požadováno, aby byly jeden nebo více zasahujících nukleotidů přítomny v rámci s druhým exonem zacíleného genu. Jestliže exogenní exon kóduje jednu nebo více aminokyselin v rámci s kódující sekvencí zacíleného genu, může být místo sestřihu donoru výhodněji umístěno v pozici bezprostředně sousedící s exogenní kódující sekvencí na její 3' straně.

Místo sestřihu donoru, přesahující exogenní exon, je v konstruktu nespárováno tzn. v samotném konstruktu není žádné další místo sestřihu akceptoru, které by bylo downstream k místu sestřihu donoru, na které by bylo místo sestřihu donoru sestřiženo. Následná homologní rekombinace do cílového místa upstream k sekvenci, kódující FSHP, což je nepárované místo sestřihu donoru v konstruktu, je funkčně spárováno s endogenním místem sestřihu akceptoru endogenního exonu z FSHp. Výsledkem zpracování transkriptu, produkovaného z homologně rekombinovaného FSHP genu, je sestřih exogenního exonu namísto sestřihu akceptoru endogenního exonu.

Konstrukt podle vynálezu může také zahrnovat místo sestřihu akceptoru. Toto místo, ve spojení s místem sestřihu donoru, řídí sestřih jednoho exonu na jiný exon. Místa sestřihu akceptoru mají charakteristickou sekvenci reprezentovanou (Y)ioNYAG (SEQ ED číslo 7), kde Y značí jakýkoliv pyrimidin a N značí jakýkoliv nukleotid (Jackson, Nucleic Acids Research 19:3715 až 3798, 1991).

Introny

DNA konstrukt může také obsahovat intron. Intron je sekvence jednoho nebo více nukleotidů, ležící mezi místem sestřihu donoru a místem sestřihu akceptoru a je sestřihem z molekuly prekurzoru RNA odstraněn za vzniku zralé mRNA.

CAP místo

DNA konstrukt může také příležitostně obsahovat CAP místo. CAP místo je specifické transkripční startovní místo, které je spojeno s regulační oblastí, která jej využívá. Toto CAP místo je umístěno v takové pozici vůči regulační sekvenci v konstruktu, že po homologní rekombinaci regulační sekvence řídí syntézu transkriptu, která začíná v CAP místě. Příležitostně není v konstruktu zahrnuto žádné CAP místo a transkripční aparát bude hledat odpovídající místo v zacíleném genu, které bude využito jako CAP místo.

Další prvky DNA

Konstrukt může někdy obsahovat sekvence, které negativně ovlivňují strukturu nebo stabilitu RNA nebo proteinu, produkovaného homologní rekombinaci.

DNA konstrukt může příležitostně zahrnovat bakteriální počátek replikace a bakteriální značky rezistence vůči antibiotiku nebo jiné selekční značky, které umožňují rozmnožování plasmidu ve velkém měřítku v bakterii nebo v jakémkoliv jiném hostitelském systému, který je vhodný pro klonování.

Všechny výše popsané prvky DNA konstruktu jsou operativně připojeny nebo funkčně umístěny. To znamená, že po homologní rekombinaci mezi konstruktem a cílovou genomickou DNA, může regulační sekvence řídit produkci primárního RNA transkriptu, která začíná v CAP místě (příležitostně zahrnutém v konstruktu) a zahrnuje (i) sekvenci odpovídající exonu a místu sestřihu donoru z konstruktu, jestliže jsou přítomna, a (ii) sekvenci ležící mezi tímto místem sestřihu donoru a transkripčním stop místem endogenního genu. Druhá zmíněná sekvence může zahrnovat regulační oblast endogenního FSHP genu i sekvence sousedící s touto oblastí, které nejsou běžně přepisovány. V operativně připojené konfiguraci řídí místo sestřihu donoru sledovaného konstruktu sestřih k místu sestřihu akceptoru, přesahujícího jeden z exonů endogenního FSIip genu tak, že žádoucí protein může být ze zcela sestřiženého zralého transkriptu produkován. Místo sestřihu akceptoru může být endogenní, takže sestřih je řízen na endogenní exon. V jiném provedení, kde je místo sestřihu akceptoru zahrnuto ve sledovaném konstruktu, odstraňuje sestřih exogenní intron, začleněný sledovaným konstruktem.

Uspořádání prvků v DNA konstruktu může být různé. Jestliže je konstruktem kružnicový plasmid nebo virový vektor, pak může být vzájemné uspořádání prvků ve vznikající struktuře například: určující sekvence, plasmidová DNA (složená ze sekvencí použitých pro selekci • · • · · · · · · · · ·

9 99 9 9 · • · · · · · · * · ♦ · 9 9 9

9 · 9 ·

9·· 999 ··· ···· 99 a/nebo replikaci sledovaného plasmidu v mikrobiálním nebo jiném vhodném hostiteli), selekční značka(y), regulační sekvence, exon, nespárované místo sestřihu donoru.

Jestliže je konstrukt lineární, pak může být uspořádání například: první určující sekvence, selekční značkový gen, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru a druhá určující sekvence; nebo první určující sekvence, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, selekční značkový gen a druhá určující sekvence. Uspořádání prvků může také být: první určující sekvence, selekční značka, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, intron, místo sestřihu akceptoru, příležitostně vnitřní ribozomální vstupní místo a druhá určující sekvence.

Příležitostně může uspořádání být: první určující sekvence, první selekční značkový gen, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, druhá určující sekvence a druhý selekční značkový gen; nebo první určující sekvence, regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru, první selekční značkový gen, druhá určující sekvence a druhý selekční značkový gen. Výsledkem rekombinace mezi určujícími sekvencemi, přesahujícími první selekční značku, s homologními sekvencemi v genomu hostitele je intergrace první selekční značky, zatímco druhá selekční značka integrována není. Žádoucí transfektované nebo infikované buňky jsou takové buňky, které jsou stabilně transfektovány nebo infikovány první, ale nikoliv druhou selekční značkou. Tyto buňky mohou být selektovány během růstu v médiu, které obsahuje činidlo pro selekci exprese první značky a jiné činidlo pro druhou značku. U transfektovaných nebo infikovaných buněk, které mají nevhodně začleněný sledovaný konstrukt mechanismem jiným než je homologní rekombinace, lze očekávat, že budou exprimovat druhý značkový gen a budou tedy v selekčním médiu usmrceny.

Značka pro pozitivní selekci je někdy v konstruktu zahrnuta proto, aby byla umožněna selekce buněk, obsahujících amplifikované kopie této značky. V tomto provedení může být uspořádání složek konstruktu například: první určující sekvence, amplifikační značka pro pozitivní selekci, druhá selekční značka (příležitostná), regulační sekvence, exon, místo sestřihu donoru a druhá určující DNA sekvence.

Různé prvky konstruktu mohou být získány z přirozených zdrojů (např. genomická DNA) nebo mohou být produkovány pomocí genového inženýrství nebo pomocí syntetických technik. Regulační oblast, CAP místo, exon, místo sestřihu donoru a příležitostný intron a místo sestřihu akceptoru konstruktu mohou být izolovány jako kompletní jednotka např. z genu lidského elongačního faktoru-la (Genbank sekvence HUMEF1A) nebo z časné fáze cytomegaloviru (Genbank sekvence HEHCMVP1). Tyto komponenty mohou být také izolovány z jednotlivých genů.

• ·

Transfekce nebo infekce a homologní rekombinace

DNA konstrukt podle vynálezu může být začleněn do buňky jako je primární, sekundární nebo nesmrtelná buňka, jako jediný DNA konstrukt nebo jako samostatné DNA sekvence, které jsou začleněny do chromozomální nebo jaderné DNA transfektované nebo infikované buňky. DNA může být začleněna jako lineární dvouvláknová (s nebo bez jednovláknových oblastí na jednom nebo obou koncích), jednovláknová nebo kružnicová molekula. DNA konstrukt nebo jeho RNA ekvivalent mohou být také začleněny jako virová nukleová kyselina.

Jestliže je konstrukt začleněn do hostitelských buněk ve dvou samostatných DNA fragmentech, pak tyto dva fragmenty sdílejí sekvenční homologii DNA (překryv) na 3' konci jednoho fragmentu a na 5' konci druhého, zatímco jeden nese první určující sekvenci a druhý nese druhou určující sekvenci. Po začlenění do buňky mohou tyto dva fragmenty podstoupit homologní rekombinaci za vzniku jediné molekuly s první a druhou určující sekvencí, přesahující oblast překryvu mezi dvěma původními fragmenty. Molekula produktu je poté ve formě, která je vhodná pro homologní rekombinaci s cílovými místy buňky. Mohou být použity více než dva fragmenty, přičemž každý žních je sestrojen tak, aby došlo k homologní rekombinaci jednoho s druhým za vzniku konečného produktu, vhodného pro homologní rekombinaci s cílovými místy buňky, jako je to popsáno výše.

Jestliže DNA konstrukt podle vynálezu sám o sobě neobsahuje selekční značku, může být transfektován nebo infikován spolu s jiným konstruktem, který tuto značku obsahuje. Plasmid může být před transfekci nebo infekcí štěpen na jednom nebo více místech restrikčním enzymem za vzniku lineární molekuly nebo molekuly, obsahující mezery (gapy). Vzniklé volné konce DNA zvyšují frekvenci žádoucích výsledků homologní rekombinace. Na volné DNA konce může být dále působeno exonukleázou, jejíž výsledkem jsou přečnívající 5' nebo 3' konce jednovláknové DNA (např. o délce alespoň 30 nukleotidů a výhodněji délce 100 až 1000 nukleotidů). Důvodem je zvýšit frekvenci žádoucích výsledků homologní rekombinace. V tomto provedení budou výsledkem homologní rekombinace mezi určující sekvencí a genomickým cílem dvě kopie určujících sekvencí, přesahujících prvky, které jsou obsaženy v začleněném plasmidu.

DNA konstrukty mohou být transfektovány do buněk (výhodněji in vitro) pomocí různých fyzikálních nebo chemických postupů včetně elektroporace, mikrobyektování, bombardování mikroprojektilem, srážení fosforečnanem vápenatým, lipozómového dodávání nebo tranfekce prostřednictvím polybren- nebo DEAE -dextranu.

• ·

• · » · · • · · ♦ · · * • c • β • · · · « ·

Transfektovaná nebo infikovaná buňka je udržována v takových podmínkách, které umožňují homologní rekombinaci, jako je to popsáno ve stavu techniky {viz např. Capecchi, Science 24:1288 až 1292, 1989). Pod pojmem „transfektovaná buňka“ je míněna buňka, do které (nebo do jejíhož předka) byla způsoby jinými než je použití virového vektoru, začleněna molekula DNA. Pod pojmem „infikovaná buňka“ je míněna buňka, do které (nebo do jejíhož předka) byly začleněny molekula DNA nebo RNA použitím virového vektoru. Mezi viry, o kterých je známo, že mohou být použity jako vektory patří adenovirus, virus jemu podobný, Herpes virus, virus příušnic, virus dětské obrny, lentivirus, retrovirus, virus Sindbis a viry neštovic jako je virus kanárských neštovic. Je-li homologně rekombinantní buňka udržována v podmínkách, které jsou dostatečně vhodné pro průběh transkripce DNA, bude regulační oblast, začleněná DNA konstruktem, pozměňovat transkripci FSHp genu.

Homologně rekombinantní buňky (tzn. buňky, které podstoupily žádoucí homologní rekombinaci) mohou být identifikovány testováním a výběrem fenotypu nebo analýzou FSH3 genu v supematantu kultury pomocí enzymoimunoanalýzy (ELISA). Komerčně dostupné soupravy pro ELISA pro detekci FSH3 genu jsou dostupné od Accurate Chemical and Scientific (Westbury, NY). Homologně rekombinantní buňky mohou být identifikovány také pomocí Southern nebo Nothem blotů nebo pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR).

Termín „primární buňky“ ve smyslu, ve kterém jsou zde používány, zahrnuje (i) buňky přítomné v suspenzi buněk, izolovaných z tkáně obratlovců (před jejich rozetřením na misku, tzn. spojené s nosičem tkáňové kultury jako je miska nebo baňka), (ii) buňky přítomné v explantátu tkáňové kultury, (iii) buňky rozetřené poprvé a (iv) buněčné suspenze odvozené z těchto rozetřených buněk. Primární buňky také mohou být buňky, přirozeně se vyskytující u lidí nebo zvířat.

Sekundární buňky jsou takové buňky, které se vyskytují ve všech následujících krocích kultivace. To znamená, když jsou poprvé rozetřené primární buňky odstraněny z kultivační nádoby a znovu rozetřeny (pasážovány), jsou zde označeny jako sekundární buňky a stejně tak i všechny buňky v následných pasážích. Kmeny sekundárních buněk obsahují sekundární buňky, které byly jednou nebo vícekrát pasážovány. Sekundární buňky většinou vykazují omezený počet populačních zdvojení v kultuře a kontaktem inhibované, závisle narůstající přilnutí (závislé přilnutí není aplikováno na buňky, které jsou množeny v suspenzní kultuře). Primární a sekundární buňky nejsou učiněny nesmrtelnými.

Nesmrtelné buňky jsou takové buněčné linie (na rozdíl od kmenů buněk, u nichž je označení „kmen“ rezervováno pro primární a sekundární buňky), které vykazují zřetelně neomezenou životnost v kultuře.

• * · • · · · Φ • · ·

Buňky, vybrané pro transfekci nebo infekci, mohou spadat do 4 typů kategorií: (i) získané buňky, které neprodukují nebo neobsahují více než stopová množství FSH3 proteinu, (ii) buňky, které produkují nebo obsahují protein, ale v množstvích jiných než která jsou požadována (jako jsou množství menší než je hladina, která je fyziologicky běžná pro typy získaných buněk), (iii) buňky, které produkují protein v množství, které je fyziologicky běžné pro získaný typ buněk, ale buňky budou množeny nebo bude zvýšen jejich obsah nebo produkce a (iv) buňky, u kterých je žádoucí změnit průběh regulace nebo indukce genu, kódujícího protein.

Primární, sekundární a nesmrtelné buňky, které mají být transfektovány nebo infikovány způsobem, který je předmětem vynálezu, mohou být získány z různých tkání a zahrnují všechny odpovídající typy buněk, které mohou být udržovány v kultuře. Mezi vhodné primární a sekundární buňky patří například fibroblasty, keratinocyty, epitelové buňky (např. epitelové buňky mléčné žlázy, střevní epitelové buňky), endotelové buňky, gliové buňky, neurální buňky, prvky krve (např. lymfocyty, buňky kostní dřeně), svalové buňky a prekurzory těchto somatických buněčných typů. Mají-li být homologně rekombinantní buňky použity v genové terapii, jsou primární buňky získány výhodněji zjedince, jemuž by měly být podávány transfektované nebo infikované primární nebo sekundární buňky. Primární buňky však mohou být získány od dárce (tzn. jedince jiného než je příjemce) stejného druhu.

Mezi příklady nesmrtelných lidských buněčných linií, užitečných pro produkci proteinu nebo pro genovou terapii, patří, ale nejsou tím nijak limitovány, ovariální karcinomové buňky 2780AD (Van der Blick a kol., Cancer Res. 48: 5927 až 5932, 1988), A549 (sbírka American Type Culture Collection („ATCC) CCL 185), BeWo (ATCC CCL 98), melanomové buňky Bowes (ATCC CRL 9607), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL 120.1), COLO201 (ATCC CCL 224), COLO205 (ATCC CCL 222), COLO 320DM (ATCC CCL 220), COLO 320HSR (ATCC CCL 220.1), Daudiho buňky (ATCC CCL 213), Detroit 562 (ATCC CCL 138), buňky HeLa a jejich deriváty (ATCC CCL 2, 2.1 a 2.2), HCT116 (ATCC CCL 247), buňky HL-60 (ATCC CCL 240), buňky HT1080 (ATCC CCL 121), IMR-32 (ATCC CCL 127), buňky Jurkat (ATCC TIB 152), buňky leukémie K-562 (ATCC CCL 243), karcinomové buňky KB (ATCC CCL 17), KG-1 (ATCC CCL 246), KG-la (ATCC CCL 246.1), LS123 (ATCC CCL 255), LS174T (ATCC CCL CL-188), LS180 (ATCC CCL CL-187), MCF-7 buňky nádoru prsu (ATCC ΒΊΉ 22), buňky MOLT-4 (ATCC CRL 1582), buňky Namalwa (ATCC CRL 1432), NCI-H498 (ATCC CCL 254), NCI-H508 (ATCC CCL 253), NCI-H548 (ATCC CCL 249), NCIH716 (ATCC CCL 251), NCI-H747 (ATCC CCL 252), NCI-H1688 (ATCC CCL 257), NCIH2126 (ATCC CCL 256), buňky Ráji (ATCC CCL 86), RD (ATCC CCL 136), RPMI 2650 (ATCC CCL 30), buňky RPMI 8226 (ATCC CCL 155), SNU-C2A (ATCC CCL 250.1), SNU4 · ·

9

99 9

9 ·

C2B (ATCC CCL 250), SW-13 (ATCC CCL 105), SW48 (ATCC CCL 231), SW403 (ATCC CCL 230), SW480 (ATCC CCL 227), SW620 (ATCC CCL 227), SW837 (ATCC CCL 235), SW948 (ATCC CCL 237), SW1116 (ATCC CCL 233), SW1417 (ATCC CCL 238), SW1463 (ATCC CCL 234), T84 (ATCC CCL 248), buňky U-937 (ATCC CRL 1593), WiDr (ATCC CCL 218) a WI-38VA13 sublinie buněk 2R4 (ATCC CCL 75.1), stejně tak jako heterohybridomové buňky, produkované fúzí lidských buněk a buněk jiných druhů. Kmeny sekundárních lidských fibroblastů jako je WI-38 (ATCC CCL 75) a MRC-5 (ATCC CCL 171) mohou být rovněž použity. Primární, sekundární nebo nesmrtelné lidské buňky stejně jako primární, sekundární nebo nesmrtelné buňky z jiných druhů mohou být dále použity pro produkci proteinu in vitro nebo pro genovou terapii.

Buňky, exprimujicí FSHp

Homologně rekombinantní buňky podle předmětného vynálezu exprimují FSH3 v žádoucích hladinách a jsou užitečné pro produkci FSHp in vitro i pro genovou terapii.

Genová terapie

Homologně rekombinantní buňky podle předmětného vynálezu jsou užitečné jako populace homologně rekombinantních buněčných linií, jako populace homologně rekombinantních primárních nebo sekundárních buněk, jako homologně rekombinantní klonovací kmeny nebo linie buněk, jako homologně rekombinantní heterogenní buněčné kmeny nebo linie a jako směsi buněk, ve kterých je přítomna alespoň jedna reprezentativní buňka jedné ze čtyř výše uvedených kategorií homologně rekombinantních buněk. Tyto buňky mohou být použity při dodávání za účelem léčby neplodnosti, pro zvýšení plodnosti u lidí nebo zvířat nebo pro léčbu jakýchkoliv jiných stavů, který lze léčit pomocí FSHp.

Homologně rekombinantní primární buňky, klonovací kmeny buněk nebo heterogenní buněčné kmeny jsou podávány jedinci, u něhož je léčen abnormální nebo nežádoucí stav nebo je u něj prováděna prevence a to v dostatečném množství a odpovídajícím způsobem. Cílem je exprimovat nebo učinit dostupným protein nebo exogenní DNA ve fyziologicky odpovídajících hladinách. Fyziologicky odpovídající hladina je taková, která je přibližně stejná jako hladina, při které je produkt v těle běžně produkován nebo které vede ke zlepšení abnormálního nebo nežádoucího stavu. Jsou-li buňky syngenní s ohledem na imunokompetentního příjemce, mohou • 4 být podávány nebo implantovány intravenózně, intraarteriálně, podkožně, intraperitonálně, intraomentálně, prostřednictvím subrenální kapsule, intratekálně, intrakraniálně nebo intramuskulámě.

Jestliže buňky nejsou syngenní a příjemce je imunokompetentní, mohou být homologně rekombinantní buňky, které mají být podávány, uzavřeny do jedné nebo více semipermeabilních bariérových forem. Vlastnosti, související s permeabilitou prostředku, jsou takové, že buňky po implantování do subjektu nemohou opustit prostředek, ale terapeutický protein může volně procházet a může opustit bariérový prostředek a vstoupit do místa, obklopujícího implant nebo může vstoupit do systemického oběhu. Toto je uvedeno např. v US patentu č. 5 641 670, 5 470 731, 5 620 883, 5 487 737 a US patentové přihlášce s názvem „Delivery of Therapeutic Proteins“ (autoři vynálezu: Justin C. Lamsa a Douglas A. Treco), podané 16. dubna 1999, přičemž všechny jsou zde začleněny jako odkaz. Bariérový prostředek může být implantován v jakémkoliv vhodném místě: např. intraperitonálně, intratekálně, podkožně, intramuskulámě, v ledvinové kap suli nebo omentu.

Bariérové prostředky jsou konkrétně užitečné a umožňují, aby byly implantovány homologně rekombinantní nesmrtelné buňky, homologně rekombinantní buňky zjiných druhů (homologně rekombinantní xenogeneické buňky) nebo buňky z nebistokompatibilního dárce (homologně rekombinanntí allogeneické buňky) s cílem léčit daný subjekt. Prostředky zadržují buňky ve fixní pozici in vivo, čímž chrání buňky od imunitního systému hostitele. Bariérové prostředky také umožňují odpovídající krátkodobou (tzn. přechodnou) terapii a to proto, že umožňují správné odstranění buněk, jestliže je léčba z jakéhokoliv důvodu zastavena. Transfektované nebo infikované xenogeneické a allogeneické buňky mohou také být pro krátkodobou genovou terapii použity bez bariérového prostředku. V tomto případě bude dodáván FSHP, produkovaný buňkami, in vivo do té doby, dokud budou buňky hostitelským imunitním systémem odmítány.

Pro tyto účely může být použita řada syntetických, polosyntetických nebo přírodních filtračních membrán včetně celulózy, acetátu celulózy, nitrocelulózy, polysulfonu, difluoridu polyvinylidenu, polymerů polyvinylchloridu a polymerů polyvinylchloridových derivátů. Bariérové prostředky mohou být využity ktomu, aby mohly být pro genovou terapii u bdí použity primární, sekundární nebo nesmrtelné buňky zjiných druhů.

« t · ······ r · · · · · · ······· · · ··

Jiná provedení

Mělo by být zřejmé, že ačkoliv byl vynález popsán pomocí podrobnějšího popisu, je tento popis zamýšlen jako ilustrativní a nijak neomezuje rozsah vynálezu, který je definován rozsahem připojených nároků.

Jiné aspekty, výhody a modifikace jsou v rámci rozsahu následujících nároků.

Přehled obrázků ve výkresech

Obr. 1 je schematické znázornění ukazující genomickou strukturu lidského FSHP genu.

Obr. 2 je schematické znázornění ukazující genomickou oblast lidského FSHP genu (nahoře) obklopenou inzertem (dole) plasmidu pHFB2. 3 sloupce uprostřed představují genomické oblasti genu, jehož sekvence byly publikovány.

Obr. 3 reprezentuje částečnou sekvenci (SEQ ID číslo 1) lidského FSHP genu včetně 7454 nukleotidů ze sekvence 5 ' k iniciačnímu kodónu ATG. Rovněž je ukázána částečná polypeptidová sekvence (SEQ ID číslo 2), kódovaná kódující sekvencí. Publikované sekvence jsou podtrženy. „SD“ a „SA“ značí místo sestřihu donoru a místo sestřihu akceptoru. „Zralý“ znamená počátek zralého FSHP proteinu.

Obr. 4 je schematické znázornění ukazující konstrukt podle vynálezu. Konstrukt obsahuje první určující sekvenci (1); amplifikační značkový gen (AM); selekční značkový gen (SM); regulační sekvenci; CAP místo; sekvenci identickou s prvním nekódujícím exonem lidského FSHP genu; nepárované místo sestřihu donoru (SD) a druhou určující sekvenci (2). Černé bloky představují kódující DNA a tečkované bloky představují nepřeložené sekvence.

Obr. 5 až 7 jsou schematická znázornění zobrazující tři konstrukty podle vynálezu. Konstrukty se Uší velikostí úseku aldoláza 5' UTS, mzertovaného do plasmidu. Tyto konstrukty zahrnují sekvenci, kódující α-podjednotku glykoproteinu (tzn. FSHa), připojenou k promotoru cytomegaloviru („CMV“). Zkratky, používané v obrázku jsou: „UTS“ pro nepřeloženou sekvenci; „amp“ pro ampicilin; „Ori“ pro počátek replikace; „SD“ pro místo sestřihu donoru; „USV TK“ pro gen thymidinkinázy herpes simplex viru; „DHIR“ pro dibydrofolátreduktázu; „HBV“ pro virus hepatitidy B a „hGH“ pro lidský růstový hormon.

Obr. 8 je sloupcový graf produkce FSH v buňkách HT-1080, transfektovaných pGA308 (obr. 5) a selektovaných růstem v přítomnosti různých koncentrací methotrexátu.

Obr. 9 znázorňuje SEQ ID číslo 4, sekvenci upstream k transkripčnímu startovnímu místu lidského FSHp.

• · « · · · · · ·· ·· • · · · · * · ··· • ··· · « · · · • · · » « ♦ · · · • · · ♦ · · · ··· ··· ··· ···· ··

Obr. 10 znázorňuje SEQ ID číslo 5, sekvenci upstream k transkripčnímu startovnímu místu lidského Ε8Ηβ.

Obr. 11 je znázornění první určující sekvence (SEQ ID číslo 6), použité v konstruktu podle vynálezu.

Obr. 12 je znázornění druhé určující sekvence (SEQ ID číslo 5), použité v konstruktu podle vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Produkce proteinu

Homologně rekombinantní buňky podle tohoto vynálezu mohou být použity pro produkci FSIip in vitro. Buňky jsou udržovány v takových podmínkách, které jsou popsány ve stavu techniky a jejichž výsledkem je exprese proteinů. FSHQ protein může být přečištěn z buněčných lyzátů nebo z buněčných supematantů. Farmaceutický prostředek, obsahující FSH3 protein, může být dodán člověku nebo zvířeti prostřednictvím vhodných farmaceutických cest, známých v dané oblasti techniky (např. orálně, intravenózně, intramuskulámě, intranazálně, pulmonálně, transmukozálně, intradermálně, transdermálně, rektálně, intratekálně, podkožně, intraperitonálně nebo intralesionálně). Orální podávání může vyžadovat použití strategie pro ochranu proteinu před degradací v trávicím traktu: např. enkapsulaci vpolymemích mikrokapsulích.

Příklad 2

Jiným typem prostředku, který může být použit v genové terapii podle vynálezu, je kolagenová matrice, kterou lze implantovat a ve které jsou zabudovány buňky. Tento prostředek, který může obsahovat kuličky, na které se buňky přichytí, je popsán vWO 97/15195, který je zde zahrnut jako odkaz.

Počet buněk potřebných pro podávanou dávku nebo implantaci závisí na několika faktorech včetně hladiny exprese proteinu, velikosti a podmínkách hostitelského organismu a na omezeních, souvisejících s postupem implantování. Obvykle se počet buněk, implantovaných do dospělého člověka nebo podobně velkého jedince, pohybuje v rozmezí 1.10⁴ až 5.10¹⁰ a výhodněji 1.10⁸ až 1.10⁹. V případě potřeby mohou být implantovány v několika místech pacienta buď v jednou okamžiku nebo v průběhu období měsíců nebo let. Dávka může být v případě potřeby opakována.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA konstrukt, který pozměňuje po začlenění do genomu savčí buňky prostřednictvím homologní rekombinace expresi endogenního FSHP genu v buňce, obsahuje určující sekvenci, obsahující alespoň 50 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 a transkripční regulační sekvenci.
2. DNA konstrukt podle nároku 1, který dále obsahuje exon a místo sestřihu donoru.
3. DNA konstrukt podle nároku 2, který v pozici downstream k místu sestřihu donoru dále obsahuje intron a místo sestřihu akceptoru.
4. DNA konstrukt podle nároku 1, který dále obsahuje selekční značkový gen.
5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která obsahuje alespoň 50 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.
6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 5, která obsahuje alespoň 100 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.
7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 5, která obsahuje alespoň 200 bezprostředně po sobě následujících nukleotidů ze SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.
8. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 5, která obsahuje SEQ ID číslo 5 nebo její komplement.
9. Izolovaná molekula DNA, obsahující řetězec, který obsahuje nukleotidovou sekvenci (i) jejíž délka je alespoň 400 nukleotidů a (ii) hybridizuje se SEQ ID číslo 5 nebo jejím komplementem a to po inkubaci při 42 °C v přítomnosti 50% formamidu; první promytí při 65 °C roztokem 2 x SSC, obsahujícím 1% SDS a druhé promytí pň 65 °C roztokem 0,1 x SSC.
10. Izolovaná molekula DNA podle nároku 9, jejíž nukleotidová sekvence má délku alespoň 1000 nukleotidů.

• ·
11. Izolovaná molekula DNA, obsahující řetězec, který obsahuje nukleotidovou sekvenci, která (i) má délku alespoň 100 nukleotidů a (ii) sdílí alespoň 80% sekvenční totožnost s fragmentem SEQ ID číslo 5, který je stejně dlouhý jako nukleotidová sekvence.
12. Izolovaná molekula DNA podle nároku 11, jejíž nukleotidová sekvence má délku alespoň 200 nukleotidů.
13. Izolovaná molekula DNA podle nároku 11, jejíž nukleotidová sekvence má délku alespoň 400 nukleotidů.
14. Izolovaná molekula DNA podle nároku 11, jejíž nukleotidová sekvence má délku alespoň 1000 nukleotidů.
15. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 1, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci sgenomickou DNA upstream k iniciačnímu kodónu ATG sekvence, kódující endogenní FSI Ιβ.
16. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 2, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci s genomickou DNA upstream k iniciačnímu kodónu ATG sekvence, kódující endogenní Ι^;81Ιβ.
17. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 3, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci sgenomickou DNA upstream k iniciačnímu kodónu ATG sekvence, kódující endogenní FSIίβ.
18. Homologně rekombinantní buňka stabilně transfektovaná DNA konstruktem podle nároku 4, přičemž DNA konstrukt podstoupil homologní rekombinaci sgenomickou DNA upstream k iniciačnímu kodónu ATG sekvence, kódující endogenní FSH3.
19. Způsob pozměnění exprese endogenního FSI Ιβ genu v savčí buňce in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje začlenění DNA konstruktu podle nároku 1 do buňky;

• · setrvání buňky v takových podmínkách, které umožňují homologní rekombinaci mezi konstruktem a genomickým cílovým místem, homologním s určující sekvencí s cílem produkovat homologně rekombinantní buňku; a setrvání homologně rekombinantní buňky v takových podmínkách, které umožňují expresi sekvence, kódující FSHP a to pod kontrolou transkripční regulační sekvence.
20. Použití buňky podle nároku 15 pro výrobu léku pro dodání FSHj3 jedinci prostřednictvím implantování buňky do jedince, přičemž buňka vylučuje Ι'8Ηβ.
21. Použití buňky podle nároku 16 pro výrobu léku pro dodání FSI1β jedinci prostřednictvím implantování buňky do jedince, přičemž buňka vylučuje I'S ΙΤβ.
22. Použití buňky podle nároku 17 pro výrobu léku pro dodání FSHj3 jedinci prostřednictvím implantování buňky do jedince, přičemž buňka vylučuje Ι^;8Ηβ.
23. Použití buňky podle nároku 18 pro výrobu léku pro dodání Ε8Ηβ jedinci prostřednictvím implantování buňky do jedince, přičemž buňka vylučuje Ε8Ι1β.
24. Způsob produkce FSE^, vyznačující se tím, že zahrnuje poskytnutí buňky podle nároku 15; a kultivaci buňky in vitro za takových podmínek, které umožňují buňce exprimovat a vylučovat Κ8Ι1β.
25. Způsob produkce FSF$, vyznačující se tím, že zahrnuje poskytnutí buňky podle nároku 16; a kultivaci buňky in vitro za takových podmínek, které umožňují buňce exprimovat a vylučovat FSF$.
26. Způsob produkce PSI Ιβ, vyznačující se tím, že zahrnuje poskytnutí buňky podle nároku 17; a kultivaci buňky in vitro za takových podmínek, které umožňují buňce exprimovat a vylučovat PS ΙΙβ.

• 9

9 999 ·

9 9 9

9 999

9 9

99 ··

9 9 9

9 9 9

9 9 9 • 9 9 9

99 99
27. Způsob produkce FSH3, vyznačující se tím, že zahrnuje poskytnutí buňky podle nároku 18; a kultivaci buňky in vitro za takových podmínek, které umožňují buňce exprimovat a vylučovat FSH3-