CZ20003831A3 - Přípravek obsahující L-karnitin nebo alkanoyl Lkarnitinu a NADH a/nebo NADPH - Google Patents

Abstract

Je popsán přípravek obsahující L-karnitin nebo alkanoyl-Lkarnitin nebo jejich farmakologicky přijatelnou sůl a NADH a/nebo NADPH vhodný jako doplňková strava pro jedince mající vyčerpávající fyzickou zátěž nebo pro asthenické jedince ajako léčivo k léčbě chronického námahového syndromu a Parkinsonovy choroby

Description

Přípravek obsahující L-karnitin nebo alkanoyl-L-karnitin a NADH a/nebo NADPH

Oblast techniky

Předložený vynález se týká přípravku, který působí jak na metabolismus, tak na energetický výkon kosterního svalstva a svalovou koordinaci a koordinaci na centrální úrovni umocněním účinků jak periferního svalstva, tak na úrovni centrálního nervového systému. Přípravek může být připraven ve vhodné formě a působit jako dietní doplněk, nebo jako skutečný medikament v závislosti na tom, zda jde o podpůrné či preventivní nebo přísně terapeutické působení na určitého jedince, pro kterého je přípravek určen a na kterého má působit.

Dosavadní stav techniky

Jako dietní doplněk nebo preventivní preparát může být přípravek podle vynálezu zvláště vhodný jak pro usnadnění adaptace kosterního svalstva jedince zabývajícího se prodlužovanou tělesnou činností, tak proti vnímání svalové únavy a vyčerpanosti, kterou znají astheničtí jedinci i bez jakékoliv formy více či méně intenzívní fyzické zátěže.

Kdokoliv, kdo se zabývá sportovními činnostmi, a to ať už profesionálně nebo amatérsky, přeje si dosáhnout v krátkém časovém období a potom udržet co nejdéle kosterní svalstvo maximálně adaptované na intenzívní fyzickou činnost. Vyhledávání tohoto optimálního stavu dobré tělesné kondice může vést k nepatřičnému používání drog, zvláště steroidů. Je dobře známo, že tyto přípravky mohou zlepšit syntézu proteinů a následně posilovat růst svalové hmoty více, než by se dosáhlo cvičením nebo dietou. Používání těchto přípravků je jak nelegální, tak neoddiskutovatelně škodlivé, pokud se to provádí v profesionálním sportu.

• · · · · ·

Jediný způsob k dosažení výše uvedeného spočívá správně v podstoupení patřičných tréninkových programů v kombinaci s vhodnou dietou posílenou přídavkem patřičných dietních doplňků.

Termínem „asthenie“ se míní prolínající se soubor nespecifických symptomů, typických v podmínkách stresového života běžně se vyskytující ve většině městských aglomerací a zástavbách a týká se široké populace bez ohledu na takové faktory jako je věk a sociální původ, a tato asthenie je charakterizována nedostatkem nebo ztrátou síly svalů se snadnou únavností a neodpovídajícími reakcemi na podněty.

Pokud se používá přísně jako terapeutická látka, je jedním ze zvláštních aplikací přípravku podle tohoto vynálezu léčba syndromu chronické únavy a Parkinsonovy choroby a syndromu podobnému spontánnímu parkinsonismu způsobeného podáváním nepovolených přípravků.

Syndrom chronické únavy (CFS) oficiálně poprvé popsaný v roce 1988 v Annals of International Medicine je onemocněním charakterizovaným takovým stupněm únavnosti, který je nevysvětlitelný žádnou jinou příčinou, často intenzivnější než se vyskytuje u velmi vážných onemocnění jako jsou nádorová onemocnění a AIDS a oslabující do té míry, že působí více než 50 % snížení pracovní schopnosti a běžných sociálních vztahů trvajících více než 6 měsíců.

Podle kritéria uvedeného v Annals of International Medicine (prosinec 1994) musí mít pacient pro tuto diagnosu čtyři z následujících osmi symptomů přetrvávající po dobu delší než 6 měsíců:

1. neuropsychologické poruchy jako je ztráta paměti, nadměrná vzrušivost, mentální zmatení, potíže při přemýšlení a při koncentraci;

2. faringitidu;

3. hmatné, měkké cervikální nebo axiliární lymfatické uzliny;

• ·

4. svalovou bolest;

5. migrující athralgii bez otoků kloubů;

6. nediferencovanou bolest hlavy typu, charakteru a závažnosti odlišných od jakékoliv bolesti hlavy, se kterými se pacient setkal již dříve;

7. poruchy spánku charakterizované nespavostí (insomnií) nebo hypersomnií nebo ospalostí;

8. nediferencovanou únavností a neklidností trvající 24 hodin nebo více po fyzické zátěži na takové úrovni, která byla dříve snadno tolerovatelná.

Je dobře známo, že na Parkinsonovu chorobu se obecně nahlíží jako na spontánní stav, a že symptomy parkinsonismu mohou pocházet od zneužívání takových přípravků jako jsou fenothiazin, butyrofenony a reserpin. Až dosud byl parkinsonismus narkomanů aplikujících si tyto drogy studován pomocí sloučenin podobných meperidinu, které syntézou poskytovaly MPTP a MPPP.

1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP nebo NMPTP) a 1-methyl-4fenyl-propoxypiperidin (MPPP) selektivně rozkládá dopaminergické neurony v Substantia nigra a vyvolává jak u lidí tak u primátů jiný syndrom než syndrom, který co se týká klinických, patologických a biochemických příznaků a jejich farmakologické odezvy, je úplně podobný spontánní Parkinsonově chorobě.

Podobnost mezi spontánní Parkinsonovou chorobou a parkinsonismem vyvolaným MPTP je tak velká, že lze předpokládat (Burns, et al.: The neuroxoxicity of 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine in monkey and man. Can. J. Neur. Sci., 11, č. 1 (supplement), 166-168, únor 1984), že tento vyvolaný parkinsonismus „může být více než jen model. Parkinsonismus vyvolaný MPTP naznačuje zdánlivě toxickou příčinu Parkinsonovy choroby“.

Alternativní prováděná terapie Parkinsonovy choroby je založena na působení levo- dopa (L-dopa) [tj. kyselina (-)-3-(3,4-dihydroxyfenyl)-2-aminopropanová;

• · · · · · pozn. překl.] - metabolického prekurzoru dopaminu, který sám o sobě není schopen překročit rozhraní mezi krví a mozkovými buňkami [blood-brain barrier].

Jelikož je levo-dopa značně metabolizována dříve, než je schopna dosáhnout místa účinku v mozku, musí být podávána ve velmi vysokých dávkách. L-dopa je proto podáván v kombinaci s karbidopa, inhibitorem dopadekarboxylázy, která zabraňuje systematickému metabolismu levo-dopa dříve, než tento dosáhne mozku.

Pokud se levo-dopa podává samotná, mohou nastávat vedlejší účinky jako anorexie, nausea a zvracení a orthostatická hypotenze, čemuž lze odpomoci současným podáváním karbidopa.

Po několikaměsíční terapii L-dopa, a to i v kombinaci s dekarboxylačním inhibitorem může docházet k častým komplikačním vedlejším účinkům: dyskinetickým pohybům tváře, trupu a údů. Náběh takových pohybů ve většině případů indikuje, že dávky léčiva dosáhly kritické prahové hodnoty, která se nesmí překročit.

U výše uvedených patologických stavů se tedy ukazuje velmi zřetelně nutnost podpůrné nebo preventivní nebo terapeutické látky, která by byla hlavně netoxická a bez vedlejších účinků, a kterou by bylo možno bezpečně používat v širokém rozmezí a to jak u případů vyžadujících jednoduše patřičnou doplňkovou stravu, tak při nástupu počátečních symptomů.

Podstata vynálezu

Těchto mnohačetných cílů - vyrobení podpůrné, preventivní a přísně terapeutické látky - lze dosáhnout přípravkem podle vynálezu, který, jak bude dále podrobně popsáno, sestává z nové kombinace obsahující jako základní složku L-karnitin nebo nižší C₂ až C₆ alkanoyl-L-karnitin nebo jejich farmakologicky přijatelné sole a

- 5 nikotinamid- adenindinukleotid (NADH) nebo prekurzor NADH a/nebo redukovanou formu nikotinamidadenindinukleotid fosfátu (NADPH).

Během uplynuvších desetiletí od doby tohoto základního objevu (Fritz, I.B.: The metabolic consequences of the effects of carnitine on long-chain fatty acid oxidation. Vydal F.C. Gran, New York, Academie Press, str. 39 - 63, 1968), že Lkarnitin je jedinečným ve své vitální fyziologické roli jako přenašeč mastných kyselin s dlouhým řetězcem procházející vnitřní mitochondriální membránou do mitochondriální matrice, která je místem jeho oxidace, a od doby, kdy bylo poprvé zjištěno, že primární nedostatek L-karnitinu (Engel a Angelini, Science, 179, 899 902, 1973) je příčinou vážných, někdy - i když vzácně - smrtelných forem myopathie (akumulační lipidové myopathie), byl v našich znalostech patologických následností primárního a sekundárního nedostatku L-karnitinu a naopak terapeutické a nutriční hodnoty při jeho exogenním přísunu, učiněn velký pokrok.

Karnitin je přítomný ve všech biologických tkáních v relativně vysokých koncentracích jako volný karnitin a v malých koncentracích ve formě acylkarnitinů, které jsou metabolickými produkty reverzibilní reakce:

acyl CoA + karnitin θ acylkarnitin + CoASH katalyzované třemi skupinami enzymů, tj. transferázami, které se navzájem liší hlavně svou vynikající specificitou na reakční substráty; jde o: karnitinacetyltransferázovou (CAT) skupinu, jejíž substrátem jsou acylové skupiny s krátkým řetězcem (jako je acetyl a propionyl); karnitinoktanoyltransferázovou (COT) skupinu, jejíž substrát sestává z acylových skupin se středním řetězcem; a karnitinpalmitoyltransferázovou (CPT) skupinu, jejíž substrát má acylové skupiny s dlouhým řetězcem.

Důležitá role karnitinu v intermediálním metabolismu se zvláštním zřetelem na jeho omezenou syntézu slouží k vysvětlení, jakým způsobem může nastat • · · · · ·

44 nedostatek karnitinu jakožto sekundární jev u různých patologických funkcí týkajících se různých orgánů a systémů. Rozšíření klinického spektra se odrazilo ve zvýšeném počtu terapeutických příležitostí na které tato přirozená sloučenina působí; celý rozsah a velikost těchto účinků se projevily, když bylo pozorováno, že náhradní terapie L-karnitinem dramaticky převrací klinický obraz pacientů trpících akumulovanou lipidovou myopatií. Food and Drug Administration (FDA Podávání potravy a léčiv) nejen že udělil L-karnitinu status „ochranného léčiva“ („orphan drug“), ale pojal ho do svého seznamu přípravků „zachraňujících život“.

Pokroky v našich znalostech patologických aspektů primárního a sekundárního nedostatku karnitinu byly doprovázeny velmi rychlým zvýšením počtu vědeckých a patentových publikací zaměřujících se hlavně na L-karnitin a ve značně menším rozsahu na některé acylkarnitiny.

Omezujíc se na částečnou rešerši v patentové oblasti uvádíme, že použití Lkarnitinu bylo navrženo v kardiovaskulární oblasti k léčbě srdečních arytmií a kongestivního selhání .srdce (US 4,656,191), myokardiální ischemii a myokardiální anoxii (US 4,649,159); v oblasti špatného metabolismu lipidů, k léčbě hyperlipidemie a hyperproteinemie (US 4,315,944) a k normalizaci abnormálního poměru HDL : LDL - VLDL (US 4,255,449); v oblasti celkové parenterální nutriční výživy (US 4,254,147 a US 4,320,145); v nefrologii proti myasthenii a atakům svalových křečí způsobených ztrátami karnitinu v dialyzátu chronických uremických pacientů podstupujících pravidelnou hemodialýzu (US 4,272,549); proti toxickým účinkům způsobeným protinádorovými přípravky jako je adriamycin (US 4,400,371 a US 4,713,370) a halogenovanými anestetiky jako je halothan (US 4,780,308); při léčbě ucpaných cév (US 4,415,589); proti zhoršení velkého počtu biochemických a dalších parametrů u starších jedinců (US 4,474,812); k normalizaci triglyceridů a úrovně nádorového nekrotického faktoru (TNF-a) pacientů s AIDS a u asymptomatických HlV-positivních pacientů (US 5,631,288).

• · «· · · • · · · · • · · · · • · · · · * • · · · · • · · · · · ·

Použití L-karnitinu bylo také navrženo v kombinaci s dalšími aktivními složkami jako je kombinace L-karnitinu s koenzymem Q10 se širokým spektrem metabolických a atherosklerotických účinků (US 4,599,232).

Co se týká alkanoyl-L-karnitinů, je použití acetyl-L-karnitinu známo z léčby onemocnění centrálního nervového systému, zvláště Alzheimerovy choroby (US 4,346,107) a z léčby diabetické neuropathie (US 4,751,242), kde byl propionyl-Lkarnitin navržen k léčbě periferní vaskulopathie (US 4,343,816) a kongestivního selhání srdce (US 4,194,006).

Komplexní je rovněž účinek působený nikotinamidadenindinukleotid koenzymem (NADH), jehož úloha v energetické úrovni je známa.

Jeho funkce v respiračním řetězci je nezbytná pro transport elektronů v mitochondriálním systému a při vytváření ATP. Z vnitřního mitochondriální matrice byly izolovány dvě NADH dehydrogenázy. Jedna o nižší molekulové hmotnosti (m. hm. = 78000), která je patrně podjednotkou většího komplexu (m. hm. nad 300000) a je považována za přirozeně se vyskytující funkční formu systému.

Různé komplexy situované uvnitř mitochondriální membrány vytvářejí řetězec oxidativních systémů známých pod označením cytochrom a koenzym Q10, umožňujíc tak elektronům přenos ze systému s nižším potenciálem do systému s vyšším potenciálem za použití kyslíku a za tvorby ATP. Jde ve skutečnosti o respirační řetězec, který plyne z oxidativní fosforylace, která vede od NADH k tvorbě ATP.

NADH společně s cytochromem a komplexy koenzymu Q10 jsou prvky nezbytnými k transformaci energie na ATP, a NADH nacházející se na počátku tohoto řetězce je hlavním prvkem tohoto procesu.

Enzymatická funkce NADH není již dále detekovatelná při tvorbě ATP v reakcích energetického typu, avšak NADH se také ukázal jako látka, která působí jako koenzym nezbytný pro chinodihydroxypteridin reduktázu (DHPR), aby pokračovala biosyntéza H4-biopterinu.

Jako způsob zvýšení koncentrace L-dopa a tím i dopaminu, kterého je nedostatek u takových onemocnění jako je parkinsonismus, byla nedávno navržena možnost stimulace biosyntézy H4-biopterinu a zvýšení jeho koncentrace v mozku, protože bylo pozorováno, že jeho nedostatek je prvkem způsobujícím parkinsonovou neuropathii. Zatímco L-dopa může působit jako prekurzor dopaminu, a tím se sám metabolicky transformovat na tuto pozdější látku, nestane se tak v případě tyrosinu, který může být také považován za prekurzor schopný vést ke tvorbě Ldopa bez přítomnosti tyrosinhydroxylázy. U jedinců s parkinsonismem bylo ve skutečnosti zjištěno snížení koncentrace tohoto enzymu na úrovni substantia nigra. Snížení koncentrace hydroxytyrosinu je navíc provázeno silným snížením koncentrace H4-biopterinu, koenzymu nezbytného k syntéze hydroxytyrosinu. Jelikož H4-biopterin neproniká rozhraním mezi krví a mozkovými buňkami, a podávání H4-biopterinu nemá tudíž význam, jeví se naproti tomu vhodné sáhnout ke stimulaci tvorby H4-biopterinu podáváním koenzymu nezbytného pro aktivitu chinodihydroxypteridin reduktázy (DHPR) působící tvorbu H4-biopterinu, tedy funkci, o které je známo, že ji provádí NADH. Podávání NADH tudíž aktivuje DHPR, což vede k tvorbě nezbytného H4-biopterinu, aktivujícího tyrosinhydroxylázu, takže se dosáhne nové syntézy dopa.

Klinické testy založené na intravenózním podávání NADH pacientům trpícím Parkinsonovou chorobou potvrdily platnost těchto zde uváděných teoretických úvah a u léčených jedinců ukázaly značné zlepšení Parkinsonových symptomů.

Většinou bylo při orálním podávání NADH v gastrointestinálních tobolkách se zpožděným uvolňováním tak, aby se předešlo jejich styku s kyselým prostředím

4

- 9 žaludku, které by vedlo k rapidnímu snížení úrovně NADH, dosaženo porovnatelných výsledků.

O klinickém zlepšení Alzheimerovy choroby a syndromu chronické únavy (CFS) při podávání NADH bylo také referováno (Birkmayer, J.G., Annals Clin. Lb. Sel., 26, 1, 1996).

Na základě výše uvedených charakteristik sloučenin byla sledována možná interakce mezi těmito sloučeninami provedením série testů s kombinací Lkarnitinu nebo jeho alkanoyl derivátů a NADH a/nebo NADPH. Při provádění těchto testů s novými kombinacemi byly pozorovány překvapivé synergické interakce mezi složkami těchto kombinací, které nebylo možno na základě našich farmakologických znalostí o L-karnitinu nebo jeho alkanoylderivátů a NADH a NADPH předpovědět.

Přípravek podle vynálezu sestává z následujících složek v kombinaci:

(a) L-karnitin nebo alkanoyl-L-karnitin, u kterého má přímý nebo rozvětvený řetězec alkanoylové skupiny 2-8, lépe 2-6 atomů uhlíku, nebo jedna z jejich farmakologicky přijatelných solí;

(b) NADH a/nebo NADPH nebo prekurzor NADH; a (c) farmakologicky přijatelný excipient.

Prekurzorem NADH byl přednostně nikotinamid.

Hmotnostní poměr (a) ku (b) byl obecně v rozmezí od 1 : 0,01 do 1:1a přednostně se pohybuje v rozmezí od 1 : 0,05 do 1 : 0,5, takže hmotnostní poměr může být například 1 : 0,1.

Alkanoyl-L-karnitin se má vybírat přednostně ze skupiny sestávající z acetyl-Lkarnitinu, propionyl-L-karnitinu, butyryl-L-karnitinu, valeryl-L-karnitinu a isovalerylL-karnitinu. Zvláště se dává přednost acetyl-L-karnitinu a propionyl-L-karnitinu.

* * · · · · * · ······

- 10 Pro účely předloženého vynálezu se acetyl-L-karnitinem, propionyl-L-karnitinem, butyryl-L-karnitinem, valeryl-L-karnitinem a isovaleryl-L-karnitinem míní sloučeniny ve formě vnitřně komplexních solí.

Farmakologicky přijatelnou solí L-karnitinu nebo alkanoyl-L-karnitinu se míní jakákoliv sůl těchto sloučenin s kyselinou, která nedává vznik nežádoucím toxickým nebo vedlejším účinkům. Tyto kyselinyjsou farmakologům a odborníkům ve farmacii dobře známy.

Mezi příklady takových solí, které však nikterak neomezují jejich výčet patří: chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselý aspartát, citrát, kyselý citrát, vínan, fosfát, kyselý fosfát, fumarát, kyselý fumarát, glycerofosfát, glukofósfát, mléčnan, maleinát, kyselý maleinát, orotát, šťavelan, kyselý šťavelan, síran, kyselý síran, trichloracetát, trifluoracetát a methansulfonát.

Seznam farmakologicky přijatelných solí schválených FDA lze nalézt v Int. J. Pharm., 33, 201 -217, 1986, který je zde uveden jako odkaz.

Přípravek podle vynálezu může dále obsahovat vitaminy, koenzymy, minerální látky a antioxidanty.

V jednotkové dávkové formě obsahuje přípravek podle vynálezu například 100 500 mg (a) L-karnitinu nebo alkanoyl-L-karnitinu nebo ekvivalentní množství jedné z jejich farmakologicky přijatelných solí a takové hmotnostní množství (b) NADH nebo NADPH, aby hmotnostní poměr (a): (b) byl v rozsahu od 1 : 0,01 do 1 : 1, přednostně od 1 : 0,02 do 1 : 0,2.

Pro jednoduchost zde budou dále uvedeny pouze kombinace L-karnitinu a NADH, avšak musí se rozumět, že rovnocenně účinné k dosažení účinků podle tohoto vynálezu jsou i kombinace L-karnitinu a NADPH nebo výše uvedených alkanoyl-Lkarnitinů a NADH a/nebo NADPH.

• · ’ · 99 99 9 9 9 9 9 9 • ! · ···«· * · · · 9 9 9 9 9 9 ⁹ · · · ♦ » * · ··· ··· »«· ···· ·« ··

- 11 Toxikologické zkoušky

Je známo, že karnitin a NADH mají pouze omezenou toxicitu a jsou dobře tolerovány. Tyto vynikající charakteristiky byly potvrzeny intravenózním podáváním jak krysám, tak myším v kombinacích až do 100 mg.kg'¹ L-karnitinu a 5 mg.kg'¹ NADH. V prodloužené toxikologické zkoušce (30 dnů) bylo dobře tolerováno orální podávání kombinace 250 mg.kg'¹ L-karnitinu a 10 mg.kg'¹ NADH a u pokusných zvířat nebyla zjištěna mortalita ani toxicita nebo intolerance. Krevní rozbor a histologické zkoušky provedené na různých orgánech na konci zkoušky nevykázaly při porovnávání s kontrolními zvířaty žádné abnormality, a tak se potvrdila dobrá snášenlivost studované kombinace.

Zkouška na zvýšení koncentrace svalových enzymů po prodlouženém zatížení K vyhodnocení závislosti účinku karnitinu a NADH rovněž tak jako kombinace obou na koncentraci mitochondriálních enzymů obsažených v namáhaných svalech, byly provedeny zkoušky ke stanovení, zda může být u svalu gastrocnemia krys při prodlužovaném zatížení zvýšena aktivita těchto mitochondriálních enzymů jako odezva na vyšší energetickou spotřebu vyžadovanou prodlouženou svalovou zátěží v porovnání s kontrolními zvířaty. K tomuto účelu byla skupina krys chovu Wistar vystavena svalovému cvičení jejich umístěním na přístroj Rotaroid (Basilej, Como, Itálie) při rychlosti 20 m.min'¹ po dobu 120 minut každý den (Benzi, G., J. Appl. Physiol., 38, 565, 1975). Aktivita svalových enzymů byla stanovena po sedmi nebo po třiceti denním cvičení následnou izolací a homogenizací svalu gastrocnemius u všech krys (Oscai, L.B., J. Biol. Med., 245, 6968, 1971). Zkoumanými enzymy byly citrát syntetáza, isocitrát dehydrogenáza a jantarát dehydrogenáza.

Výsledky získané touto zkouškou ukázaly, že kombinace karnitinu a NADH byla schopná vybuzení velmi významného zvýšení enzymové aktivity již pouze po sedmi dnech cvičení, zatímco v případě samotného karnitinu či NADH při porovnání s kontrolními zvířaty nenastaly žádné změny v tomto pozorovacím období.

Silný synergický účinek těchto cvičení.

- 12 dvou látek byl ještě znatelnější po třicetidenním

Podávaná látka	Den	Citrát syntetáza	Isocitrát	Jantarát
	cvičení		dehydrogenáza	dehydrogenáza
Kontrolní	0	20,9±1,4	2,25±0,31	3,70±0,22
Kontrolní	7	22,1±1,6	2,30±0,20	3,90±0,19
Kontrolní	30	29,9±2,1	3,33±0,20	5,20±0,30
Karnitin 250 mg.kg'1	0	20,8±0,95	3,05±0,19	3,35±0,35
Karnitin 250 mg.kg'1	7	22,6±1,9	2,85±0,31	3,85±0,45
Karnitin 250 mg.kg1	30	30,1 ±0,95	2,98±0,16	4,90±0,33
NADH 10 mg.kg1	0	21,5±1,4	2,35±0,29	3,60±0,21
NADH 10 mg.kg1	7	30,5+2,5	3,65±0,55	4,15±0,45
NADH 10 mg.kg1	30	33,6±2,1	3,55±0,36	5,40±0,45
Karnitin 250 mg. kg1 -U	0	21,4±1,9	2,15±0,18	3,80±0,22
T NADH 10 mg.kg1
Karnitin 250 mg.kg1 _L	7	47,7±3,92	5,1 ±0,29	7,15±0,30
1 NADH 10 mg.kg1
Karnitin 250 mg.kg'1	30	75,9±3,51	6,3±0,5	9,25±0,65

NADH 10 mg.kg (*) Enzymatická aktivita je vyjádřena jako gmol substrátu použitého na min.g'¹ hmotnosti tkáně.

Zkouška zvýšení koncentrací ATP v papilárním svalu králíků po hypoxii Tyto zkoušky byly použity ke stanovení, zda L-karnitin a NADH čí kombinace obou jsou schopny uchovat koncentraci ATP v papilárním svalu králíka po podrobení hypoxii, o níž je známo, že vede k vyčerpání této energetické sloučeniny. Zkoušky byly provedeny na králících z Nového Zélandu, kteří

·· ♦· • ♦ · · • · · · • · · · • · « · • · · ·

- 13 obdrželi injekce jak L-karnitinu (100 mg.kg'¹), tak NADH (10 mg.kg'¹) jednotlivě, rovněž tak jako obě látky v kombinaci, a to každý den po tři po sobě jdoucí dny.

Jiná skupina zvířat sloužila jako kontrolní skupina a nedostávala žádné přípravky. Na konci třetího dne podávání byla všechna zvířata utracena, jejich srdce byla vyjmuta a připraveny řezy papilárního svalu měřící 1 mm v průměru s tloušťkou

4,5 mm. Tkáně takto izolované byly promyty v termostatované lázni roztokem 100 % nasyceným O₂. Pokusná hypoxie byla potom provedena zavedením 100 % N₂ namísto O₂ do lázně. Obsah ATP v papilárním svalu byl stanoven za použití metody popsané Strehlerem, B.L. (Strehler, B.L., Methods in Enzymology III, New York, Acad. Press, 871, 1957). Analýza byla provedena na vzorcích tkáně udržované za normálního propírání po dobu 90 min. a po hypoxii trvající také 90 min.

Tyto zkoušky ukázaly, že koncentrace ATP byly podstatně sníženy jak u kontrolních zvířat, tak u zvířat na něž bylo působeno samotným karnitinem nebo samotným NADH. U zvířat na něž bylo působeno kombinací karnitinu a NADH byla zjištěna naopak úplná ochrana proti snížení koncentrace ATP působenou hypoxii.

Tyto zkoušky byly tudíž schopné ukázat schopnost kombinace L-karnitinu a NADH chránit ATP přítomný v papilárním svalu před snížením koncentrace vyvolávané hypoxii, které nebylo dosaženo samotným L-karnitinem nebo samotným NADH; toho bylo dosaženo překvapivě při jejich kombinaci.

Podávaná látka	Koncentrace ATP (mol.g'1 tkáně)
před hypoxii	po hypoxii
Kontrolní	1,54±0,31	0,40±0,051
Karnitin 100 mg.kg'1	1,65+0,28	0,55±0,031
NADH 10 mg.kg'1	1,60±0,30	0,65±0,044
Karnitin 100 mg.kg1 +	1,90±0,37	1,52±0,061
NADH 10 mg.kg'1

- 14 * ·9 99 ·· ·· · · 9 9 9 · • · · 9 9 · * · · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 « • •• 9999 ·· «·

Zkouška schopnosti L-karnitinu a NADH stimulovat tvorbu dopaminu.

Tyto zkoušky byly provedeny na kulturách buněk neuroblastomů s koncentrací buněk v rozmezí od 15 - 30 do 60 milionů inkubovaných s 200 pg.ml'¹ NADH nebo s 2 mg.ml'¹ L-karnitinu nebo s oběma složkami v kombinaci.

Tvorba dopaminu vyvolaná NADH a L-karnitinem byla zkoušena vysokotlakou kapalinovou chromatografií Mayerovou metodou (Mayer, G.S., Strong, R.F., Current separation, 4, 44, 1982) upravenou Jonssonem a Kellerem (Jonsson, G., Holman, H., Adams, R.N., Central adrenaline neurones. Ed. De Fuxe - Pergamon Press, 59, 1980; Keller, R., Oke, A., Mefford, I., Life Sciences, 19, 995, 1976). Výsledky těchto zkoušek ukazují, že přídavek NADH k buněčné kultuře vyvolá efektivně zvýšení tvorby dopaminu odpovídající počtu přítomných buněk.

Značně větší zvýšení lze získat, pokud se k L-karnitinu, který sám způsobí pouze velmi slabý efekt, přidá roztok NADH. Synergický efekt lze tedy pozorovat i v této zkoušce.

Procento zvýšení syntézy dopaminu v buněčných kulturách neuroblastomů inkubovaných s NADH nebo s karnitinem jako funkce počtu inkubovaných buněk (v milionech)

Podávaná látka	Počet	%	Počet	%	Počet	%
	buněk	zvýšení	buněk	zvýšení	buněk	zvýšení
NADH 100 pg.ml'1	(miliony) 15	4,5	(miliony) 30	31,5	(miliony) 60	45,5
NADH 200 pg.mí'1	15	11,8	30	40,6	60	55,6
Karnitin 1 mg.ml'1	15	-	30	2,1	60	5,6
Karnítin 2 mg.ml'1	15	-	30	3,3	60	6,6
NADH 100 pg.ml'1	15	6,6	30	45,2	60	50,6
+Karnitin 1 mg.ml'1 NADH 200 pg.ml'1	15	18,4	30	56,4	60	70,5

+Karnitin 2 mg.ml'¹

MPTP (1-methyl-4-fenyl-1,2,3,6-tetrahydropyriclinová) zkouška.

Využití MPTP jako neurotoxinu aktivního hlavně v úrovni neuroskeletálního systému může být významným pokusným modelem ve studii parkisonismu a jeho biochemické a klinické patogeneze.

Jak u opic, tak u myší vyvolávají vysoké dávky MPTP (40 mg.kg'¹) hypokinetické a bradykinetické symptomy typické pro Parkinsonovu chorobu doprovázené znatelným snížením dopa a jeho metabolitů. V těchto zkouškách bylo sledováno, zda postižení chování a pohyblivosti vyvolané u myší MPTP, rovněž tak jako koncentrace dopaminu, lze upravovat a korigovat podáváním samotného NADH nebo L-karnitinu nebo obou látek v kombinaci.

Pro tyto zkoušky byly použity černé myši chovu C57 BE/6 o tělesné hmotnosti 20 g; jedna skupina těchto myší byla chována jako kontrolní a druhé skupině bylo injikováno subkutálně dvakrát po 40 mg.kg'¹ MPTP ve 24 hodinovém intervalu. Tři týdny po vstříknutí MPTP byla vyhodnocena pohyblivost všech zkoumaných zvířat včetně kontrolních. Po třech týdnech byla také provedena zkouška na dopa. Bezprostředně před započetím zkoušky pohyblivosti byly podány jak NADH, tak karnitin; pohyblivost byla sledována v boxu z plexiskla překříženého v různých výškách dvěma infračervenými svazky postupem popsaným Archerem (Archer, T., Fredrikson, A., Psychopharmacology, 88, 141, 1986).

Snížení pohyblivosti vyvolané MPTP vykázalo více než 80 % kontrolních myší a snížená pohyblivost o 60 % a 70 % byla zjištěna u samotného NADH a samotného L-karnitinu, zatímco při kombinaci obou látek se pohyblivost navrátila prakticky na původní úroveň (20 % snížení). Zajímavé byly také hodnoty koncentrací dopa v příčně pruhovaném svalu, která byla snížena o 90 % u kontrolních myší, které dostaly MPTP, avšak téměř normální úroveň se projevila u myší, které přípravky dostaly. Opět i u těchto zkoušek se účinek samotného Lkarnitinu ukázal jako zanedbatelný a u NADH byl rovný 40 %; kombinace navrátila dopa na úroveň velmi blízkou koncentracím běžně v tkáních přítomných.

- 16 • 4 44 * 4 4 4 * 4 · 4 • 4 4 4 • 4 4 4

44

Některé příklady přípravků podle vynálezu jsou uvedeny dále:

(1)	Vnitřní komplexní sůl L-kamitinu NADH	mg mg	200 5
(2)	Vnitřní komplexní sůl L-karnitinu	mg	200
	NADH	mg	10
(3)	Vnitřní komplexní sůl acetyl-L-karnitinu	mg	250
	NADH	mg	5
(4)	Vnitřní komplexní sůl acetyl-L-karnitinu	mg	500
	NADH	mg	10
(5)	Vnitřní komplexní sůl propionyl-L-karnitinu	mg	250
	NADH	mg	5
(6)	Vnitřní komplexní sůl L-karnitinu	mg	200
	NADH	mg	5
	Koenzym Q10	mg	20
	Pyridoxin	mg	3
	Selen	mg	20
	Zinek	mg	2
(7)	Vnitřní komplexní sůl L-karnitinu	mg	200
	NADH	mg	5
	Koenzym Q10	mg	20
	Taurin	mg	10
	Inosin	mg	100
	Kreatin	mg	100
	Kyselina pyrohroznová	mg	10

Claims (12)

1. Patentové nároky

   1. Přípravek vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) L-karnitin nebo alkanoyl-L-karnitin, jehož alkanoylová skupina má přímý nebo rozvětvený řetězec se 2 až 8, lépe 2 až 6 uhlíkovými atomy nebo jejich farmakologicky přijatelná sůl;

   (b) redukovanou formu nikotinamidadenin dinukleotidu (NADH) nebo jeho prekurzoru, a/nebo redukovanou formu nikotinamidadenin dinukleotidfosfátu (NADPH); a (c) farmakologicky přijatelný excipient.
2. 2. Přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že prekurzorem NADH je nikotinamid.
3. 3. Přípravek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr (a) :

   (b) je v rozmezí od 1 : 0,01 do 1 : 1.
4. 4. Přípravek podle nároku 3 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr (a) : (b) je v rozmezí od 1 : 0,02 do 1 : 0,2.
5. 5. Přípravek podle nároku 4 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr (a):(b) je 1:

   0,1.
6. 6. Přípravek podle nároků 1 až 5 vyznačující se tím, že alkanoyl-L-karnitin je vybrán ze skupiny skládající se z acetyl-L-karnitinu, propionyl-L-karnitinu, butyrylL-karnitinu, valeryl-L-karnitinu a isovaleryl-L-karnitinu.
7. 7. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že farmakologicky přijatelné sole jsou vybírány ze skupiny obsahující: chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselý aspartát, citrát, kyselý citrát, vínan, fosfát, kyselý fosfát, fumarát, kyselý fumarát, glycerofosfát, glukofosfát, mléčnan, maleinát, • ·

   - 18 kyselý maleinát, orotát, šťavelan, kyselý šťavelan, síran, kyselý síran, trichloracetát, trifluoracetát a methansulfonát.
8. 8. Přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že dále obsahuje vitaminy, koenzymy, minerální látky a antioxidanty.
9. 9. Přípravek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že jednotková dávková forma obsahuje 100 až 500 mg (a) L-karnitinu nebo alkanoylkarnitinu nebo ekvivaklentní množství jejich farmakologicky přijatelné sole a takové množství (b) NADH, prekurzoru NADH nebo NADPH, aby hmotnostní poměr (a) : (b) byl v rozmezí od 1 :0,01 do 1 : 1.
10. 10. Přípravek podle nároku 4 vyznačující se tím, že jednotková dávková forma obsahuje 100 až 500 mg (a) L-karnitinu nebo alkanoylkarnitinu nebo ekvivalentní množství jejich farmakologicky přijatelné sole a takové množství (b) NADH, prekurzoru NADH nebo NADPH, aby hmotnostní poměr (a); (b) byl v rozmezí od 1 :0,02 do 1 : 0,2.
11. 11. Přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že je ve formě vhodné pro orální podávání a ve formě doplňkové stravy.
12. 12. Přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že je ve formě léčiva pro orální nebo parenterální podávání.