CZ20003851A3 - Oslabený mutovaný kmen Salmonella a vakcína proti břišnímu tyfu - Google Patents

Abstract

Popisují se oslabené mutované kmeny Salmonella typhi stabilně exprimující Vi antigen a dále vakcína proti břišnímu tyfu obsahující tyto mutované kmeny; tato vakcína může být použita také jako živý vektor, nebo DNA vakcína.

Description

OSLABENÝ MUTOVANÝ KMEN feřALMONELÝ A VAKCÍNA PROTI BŘIŠNÍMU TYFU

OBLAST TECHNIKY

Navrhovaný vynález popisuje oslabené mutanty Salmonely, které na svém povrchu stabilně exprimují antigen Vi, stejně tak jako očkovací vakcíny proti břišnímu tyfu obsahující tuto substanci, živé vektorové vakcíny obsahující tuto substanci a na DNA založené vakcíny obsahující tuto substanci

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Antigen Vi

Antigen Vije kapsulámí polysacharid, který byl prvně popsán v publikaci: Felix et al., Lancet, 227:186-191 (1934). Tento kapsulámí polysacharid je exprimován Salmonelami jako je např. Salmonela typhi, Salmonela paratyphi C a Salmonela dublin, stejně jako v Citrobacter freundii. Strukturálně je Vi antigen lineární polymer kyseliny P-4,2-deoxy-2N-acetylgalaktouronové s variabilní O-acetylací (Daniels et al., Infect. Imun., 57:3159-3164 (1989)). Přítomnost tohoto antigenu na povrchu Salmonely typhi je in vitro přímo úměrné snížení lýzy sérem, aktivací komplementu a fagocytózy (Looney et al., J. Lab., Clin. Med., 108:506-516 (1986)). Antigen Vi může tedy sloužit jako štít chránící Salmonelu typhi proti imunitnímu systému.

Chromozomální oblast viaB a regulace exprese Vi antigenu

Tři vzdálené chromozomální lokusy, viaA, viaB a ompB, jsou s největší pravděpodobností nezbytné pro expresi Vi antigenu (Johnson et al., J. Bacteriol., 90: 302-308 (1965) a Snellings et al., J. Bacteriol., 145:1010-1017 (1981)). Z těchto je lokus viaB vždy přítomen u kmenů pozitivních na Vi antigen a pravděpodobně kóduje geny kódující enzymy nezbytné pro syntézu antigenu Vi ( Hashimoto et al., J. Bacteriol., 175:4456-4465 (1993), Virlogeux et al., Microbiol., 141:3039-3047 (1995)). Lokus viaB se skládá z 11 otevřených čtecích rámců (ORF) (obr. 1A), z nichž geny vipA a vipB kódují enzymy které syntetizují nukleotidový cukr polysacharidů Vi a 5 vex genů (vexA-E) které jsou s největší pravděpodobností zodpovědné za translokaci Vi antigenu (hashimoto et al., (1993) viz výše). První otevřený čtecí rámec viaB oblasti, tzn. VipR (obr. 1A), je pozitivní transkripční regulátor vlastní exprese a stejně tak exprese vipA, vipB, orf4, vipC a pravděpodobně dalších posměmých genů od vipR ( Hashimoto et al., J. Bacteriol., 178:1430-1436 (1996)). Navíc promotor protisměru od vipR také kontroluje transkripci vipA a

vipB (kódujících strukturní jednotky Vi antigenu), tvoříc operon uvnitř oblasti viaB. Další chromozomální oblast, operon ompB, obsahuje ompR - envZ geny a hraje důležitou roli v expresi Vi antigenu jako transkripční regulátor viaB (Pickard et al., Infect Immun., 62:39843993 (1994)). Oblast ompR - envZ tvoří část adaptivních mechanismů Escherichia coli na podmínky vysoké osmolarity. U Salmonely typhi je Vi antigen osmoticky regulován a ompR je nezbytný pro jeho expresi (Pickard et al., viz výše).

Vztah mezi expresí Vi antigenu a imunoprotekcí

Kapsulární polysacharid Vi ze Salmonely typhi je virulentní faktor a ochranný antigen u lidí * (Felix et al., (1934) viz výše). Přečištěná forma Vi polysacharidů je licencovaná parenterální tyfoidní vakcína, která zajišťuje přijatelný stupeň ochranné imunizace po inokulaci jednou ii dávkou, přičemž ochrana je zajištěna sérovými protilátkami třídy IgG (Acharya et al., New England Journal of Medicine, 317:1101-1104 (1987) a Klungman et al., Lancet 2:1165-1169 (1987)). Naopak oslabený kmen Salmonely typhi Ty21a, jako licencí chráněná orální vakcína, neexprimuje Vi antigen a tím pádem nevyvolává vznik sérových protilátek proti Vi antigenu, přesto vakcína obsahující Ty21a je schopna zajistit dostatečnou úroveň ochrany (Wahdan et al., J. Infect. Dis., 145:292-296 (1982) a Levine et al., Lancet, 1:1049-1052 (1987a)). Obecně se má za to, že buňkami zprostředkované imunitní mechanismy zajistí v tomto případě dostatečnou ochranu. Několik nových oslabených kmenů Salmonely typhi exprimujících in vitro antigen Vi nebylo schopno po aplikaci do živého organismu zvýšit produkci sérových protilátek proti Vi antigenu pokud byly podány jako orální vakcíny, přesto jsou schopny vyvolat vysoké titry O a H protilátek (Tacket et al., J. Infect Dis., 163:901-904 (1991), Tacket et al., Vaccine., 10:443-446 (1992a), Tacket et al., Infect. Immun., 65:452-456 (1997)). Nejpravděpodobnějším vysvětlením tohoto fenoménu je, že exprese Vi antigenu je silně regulována osmotickými stimuly (Pickard et al., viz výše). Je pravděpodobné, že exprese antigenu je přerušena, pokud bakterie není v extracelulárně v krvi nebo v jiné tělní tekutině (např. žluči).

V navrhovaném vynálezu je postulováno, že pokud je exprese Vi antigenu dostatečná, vede to < k dostatečné stimulaci sérových protilátek třídy IgG proti Vi antigenu a tím k celkovému zlepšení ochrany proti břišnímu tyfu. V navrhovaném vynálezu je také postulováno, že stabilní exprese zlepší imunitní odpověď na cizorodý antigen exprimovaný živým oslabeným kmenem

Salmonely obsaženým ve vakcíně a DNA - vakcíně.

• · • · »··· «4

Cílová populace břišního tyfu

Břišní tyfus je velmi vzácná choroba v moderních průmyslových zemích, kde obyvatelstvo je zásobováno ošetřenou, bakteriologicky testovanou vodou a kde kanalizace likviduje lidský fekální odpad. Naproti tomu v méně rozvinutých zemích , kde obyvatelstvo tyto vymoženosti postrádá, je břišní tyfus často endemická a z hlediska veřejné zdravotní perspektivy obvykle představuje nej důležitější enterickou chorobu dětí školního věku (Levine et al., Pediatr. Infect. Dis. J. 8:374-381 (1989a)). Systematický klinický, epidemiologický a bakteriologický dozor na břišní tyfus ve vztahu k testům navrhovaných vakcín, byl ustanoven s vysokou přesností k incidenci břišního tyfu v mnoha populacích ( Levine et al., Lancet, 336:891-894 (1990), Black et al., Vaccine, 8: 81-84 (1990), Levine et al., (1987a) viz výše, Ferreccio et al, J. Infect. Dis., 159:766-769 (1989) a Simjunek et al., Lancet, 338:1055-1059 (1991)). Odhalená míra incidence byla daleko vyšší než bylo předpokládáno z výsledků nesystematického dozoru.

Systematický dozor také ukazuje překvapivou frekvenci klinicky ještě mírných, ale bakteremicky tyfoidních infekcí mezi dětmi a batolaty v endemických oblastech (Ferreccio et al, J. Pediatr., 104:899-901 (1984)).

Kromě dětí školního věku v méně rozvinutých zemích, jsou dalšími skupinami se zvýšeným rizikem břišního tyfu turisté a kliničtí mikrobiologové. Mezi turisty ze Spojených států, je riziko nejvyšší v zemích podle pacifického pobřeží Jižní Ameriky a na Indickém subkontinentě (Ryan et al., Rev. Infect. Dis., 11:1-8 (1989) a Matieu et al., Arch. Intern. Med., 154:1713-1718 (1994). Navíc, kliničtí mikrobiologové, včetně těch z rozvinutých zemí, jsou vystaveni zvýšenému množství Salmonely typhi v pracovním prostředí a tím představují vysoce rizikovou skupinu (Blaser et al, J. Clin. Microbiol., 13:855-858 (1981)).

Multirezistentní kmeny Salmonely typhi

Přibližně od roku 1990, se občas začaly objevovat sporadické případy a lokalizované epidemie břišního tyfu na Středním východě, v severovýchodní Africe a jižní a jihovýchodní Asii. Tyto epidemie byly způsobeny kmeny Salmonely typhi nesoucími plazmidem kódované geny zajišťující jim rezistenci k trimethoprim sulfamethoxazolu, stejně jako rezistenci k chloramfenikolu (Gupta et al., Pediatr Infect. Dis., 13:124-140 (1994) a Rowe et al., Lancet, 336:1065-1066 (1990)). Terapie proti těmto kmenům pak vyžaduje použití chinolonových antibiotik, jako je například orálně podávaný ciprofloxacin nebo třetí generace cefalosporinů jako je parenterálně podávaný ceftriaxon. Tato antibiotika jsou však pro země třetího světa příliš drahá. Oproti dříve objeveným kmenům rezistentním na antibiotika, které způsobily dříve lokálně ohraničené sporadické epidemie, jako např. v Mexiku od 1972 do 1973 (Olarte et al., • ·

Antimicrob. Agents Chemother., 4:597-601 (1973)) a v Peru v letech 1979 až 1981 (Goldstein et al., J. Infect. Dis., 2:261-266 (1986)) a které v podstatě vymizely a rezistentní kmeny byly nahrazeny kmeny citlivými, multirezistentní kmeny Salmonely typhi které se objevily na Středním východě a Indickém subkontinentu okolo roku 1990 jsou stále dominantními kmeny v této oblasti. Navíc se tyto kmeny rozšířily a staly se dominantními i v severovýchodní Africe (Mikhail et al., Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 83:120 (1989)) a v jihovýchodní Asii (Vinh et al., Antimicrob. Agents Chemother., 40:958-961 (1996)).

Zdá se, že Salmonela typhi vykazující rezistenci k dříve použitelným antibiotikům se stala součástí života. Je tedy třeba vzít na vědomí, že břišní tyfus není už choroba snadno a levně léčitelná orálně podávanými antibiotiky. Navíc zdravotnické autority namohou nadále zakládat program kontroly břišního tyfu na dřívějších léčebných postupech. Komplikace s břišního tyfuou vedoucí ke smrti pacientů jsou stále častější zejména kvůli neodpovídající, zpožděné a nevhodné therapii antibiotiky (Singh, Indián Pediatr., 28:329-332 (1991) Bhutta, Ann. Trop. Paediatr., 16:299-306 (1996) a Gupta, viz výše).

Toto rozšíření rezistentních kmenů Salmonely typhi představuje značné zdravotní riziko v celé řadě méně rozvinutých zemí a proto se dostává opět do popředí otázka vývoje vylepšené orálně aplikovatelné vakcíny. Tato imunoprevence může být použita u dětí v oblastech s vysokým výskytem této choroby, konkrétně v oblastech kde kmeny Salmonely typhi jsou silně rezistentní k antibiotikům, stejně tak pro turisty a klinické mikrobiology.

Dříve používané vakcíny proti břišnímu tyfu

A.Inaktivovaná parenterální vakcína obsahující celé buňky

Tepelně inaktivovaná, fenolem fixovaná vakcína obsahující celé buňky byla vyvinuta na konci

19. století (Wright et al., Br. Med. J., 1:256-258 (1897), Pfeifer et al., Dtsch. Med. Wochescr. 22:735-737 (1896)) a prokázala v náhodném testovacím souboru pokusů, sponzorovaných Světovou Zdravotnickou Organizací (WHO) v 60-tých letech, že je schopna zajistit přiměřenou ochranu (51 až 67 % účinnost vakcíny) která vydrží až 7 let (Ashcroft et al., Am. J. Hyg., 79:196-206 (1964), Ashcroft et al., Lancet, 2:1056-1060 (1967), Yugoslav Typhoid Commission, Bull. WHO, 30:623-630 (1964) a Hejfec, Bull. WHO, 34:321-339 (1966). Bohužel tato vakcína je zcela nevhodná neboť způsobuje zcela nevhodnou reakci v nepřijatelně vysoké míře a tedy se nikdy nemůže stát v širokém měřítku používanou vakcínou (Levine, Typhoid Feaver Vaccines, In: Vaccines, 2nd Ed., Ed. Plotkin et al., Philadelphia, PA, W. B. Saunders (1994)). V kontrolních testech, se přibližně u 25 % procent probandů, kteří obdrželi tepelně • · φ · · « · · · 9 Φ · · Φ • · · Φ Φ ΦΦΦΦ • ΦΦΦ · ······

5··· ·· · · · · ···· ·Φ ··· ΦΦ·· ·· ·Φ inaktivovanou, fenolem fixovanou vakcínu obsahující celé buňky, vyvinula choroba se systémovými příznaky a asi 15 % nebylo schopno po vakcinaci pracovat nebo absolvovat školu (Ashcroft et al., (1964) viz výše, Yugoslav Typhoid Commission (1964) viz výše a Hejfac, viz výše).

Z těchto důvodů byla tato vakcína nahrazena dvěma novějšími vakcínami, orálně aplikovatelnou vakcínou obsahující živý kmen Ty21a (Vivotif®) a parenterálně aplikovatelnou vakcínu obsahující přečištěný kapsulární polysacharid Vi (TyphiViM®) (Levine et al., viz výše). Tyto dvě nové vakcíny zajišťují ochranu srovnatelnou s výše popisovanou vakcínou obsahující celé buňky, jsou však daleko lépe tolerované.

B. Parenterálně aplikovatelná vakcína obsahující Vi polysacharid

Jak bylo uvedeno výše v polovině třicátých let byl objeven antigen Vi, polysacharidová kapsle na Salmonele typhi (Felix et al., (1934 viz výše). Bylo také zjištěno, že tento antigen je přítomen na většině bakteriálních kmenů izolovaných z krve pacientů trpících břišním tyfem a je to pravděpodobně virulentní faktor Salmonely typhi u myší. Jeho přítomnost chrání antigen 0 od aglutinace 0 antisérem (Felix et al., J. Hyg. Cambridge, 49:92-109 (1951) a Felix et al., J. Hyg. 35:421-427 (1935)). Bylo zjištěno, že protilátky proti Vi antigenu hrají významnou roli v ochraně proti břišnímu tyfu a bylo doporučeno, aby fenolem inaktivované parenterální vakcíny proti břišnímu tyfu obsahující celé buňky byly nahrazeny alkoholem inaktivovanými parenterálními vakcínami obsahujícími celé buňky. Důvodem je to že takto ošetřené vakcíny lépe zachovávají strukturu Vi antigenu a tím dávají vzniknout vyššímu titru protilátek proti Vi antigenu u zvířat i u lidí (Felix, BMJ, 1:391-395 (1941)).

Přesto v náhodných klinických testech v Jugoslávii, tepelně inaktivované a fenolem fixované vakcíny obsahující celé buňky jsou podstatně efektivnější než alkoholem inaktivo váná vakcína (Yugoslav Typhoid Commission, Bull. WHO, 26:357-369 (1962)). Ze stejného důvodu byly dále testovány acetonem inaktivované parenterální vakcíny obsahující celé buňky (Landy et al., Am. J. Public Health, 44:1572-1579 (1954)). Ve dvou nezávislých klinických testech, které proběhly v šedesátých letech v Guayaně a Jugoslávii, acetonem inaktivované parenterální vakcíny obsahující celé buňky vykázaly nej lepší míru ochrany než všechny dříve testované vakcíny (Yugoslav Typhoid Commission, (1962) viz výše). Bylo také potvrzeno že tyto výjmečně dobré charakteristiky acetonem inaktivované parenterální vakcíny obsahující celé buňky jsou dané lépe zachovaným Vi antigenem (Wong et al., J. Infect. Dis., 125:360-366 (1972)), nebo vyšším titrem protilátek proti H antigenu který tato vakcína zajišťuje.

I • · · · • · · • · · · • · · ···· ··

Klíčovým problémem bylo přečištění Vi antigenů pomocí nedenaturačních technik (Levine et al., Infect. Immun., 12:1290-1294 (1975) a Robbins et al., J. Infect. Dis., 150:436-449 (1984)).

Byla testována imunogenicita dvou přípravků obsahující nedenaturovaný Vi antigen, připravených v National Institutes of Health (Bethesda, Maryland) a v Institut Merieux, (Lyon, Francie) (Tacket, Vaccine, 6:307-308 (1988)). Oba dva prostředky indukovaly vysoké titry protilátek proti Vi antigenů u asi 90 % příjemců. Navíc bylo prokázáno, že protilátky proti Vi antigenů vyvolané vakcínou vydrží po dobu alespoň 3 let (Tacket et al (1988) viz výše). Hladina protilátek podobná té vyvolané parenterální vakcínou obsahující přečištěný Vi antigen je v přírodě pozorovatelná pouze u chronických přenašečů tyfu. Naopak, většina pacientů zotavujících se po prodělání břišního tyfu nemá v krvi tak vysoký titr peotilátek (Lanata et al., Lancet, 2:441-443 (1983), Losonsky et al., J. Clin. Microbiol., 25:2266-2269 (1987)).

Dva náhodné, kontrolní klinické testy proběhly aby byla zjištěna účinnost a bezpečnost vakcín obsahujících přečištěný Vi antigen v Institut Merieux. Obě vakciny byly dobře tolerovány (Acharya et al., viz výše, Klugman et al., viz výše). V Nepálu byla do svalu očkována jedna dávka obsahující 25 pg Vi antigenů a tato dávka zajistila 72 % ochranu po dobu alespoň 17 měsíců proti v kultuře ověřeným kmenům břišního tyfu u dospělých i dětí (Klugman et al., viz výše).

Podobných výsledků bylo dosaženo v klinických testech v Jižní Africe u školáků, kde stejná dávka Vi antigenů zajistila 64 % ochranu po dobu alespoň 21 měsíců proti v kultuře ověřeným kmenům břišního tyfu (Klugman et al., viz výše).

Kromě lepší účinnosti a bezpečnosti u dětí i dospělých, výhodou vakciny obsahující přečištěný Vi antigen je to že zaručuje přiměřenou ochranu i po jediné dávce. Její nevýhodou oproti oslabené vakcíně obsahující Ty21a, je nezbytnost parenterální nebo intramuskulámí aplikace.

C. Dříve používané oslabené kmeny sloužící jako živá orální vakcína

1. Na Streptomycinu závislé kmeny Salmonely typhi

První slibné kmeny použitelné jako živé orálně aplikovatelné vakciny proti břišnímu tyfu byly kmeny Salmonely typhi závislé na Streptomycinu (SmD) vyvinuté na konci šedesátých a začátku sedmdesátých let (Du Pont et al., Antimicrob. Agents Chemother., 10:236-239 (1970) a Levine et al., J. Infect. Dis., 133:424-429 (1976)). Pokud byly podávány v několika oddělených dávkách obsahujících asi 10^!° jednotek tvořících kolonii (cfu) na jednu dávku, byly tyto SnD kmeny dobře organismem tolerovány a vykazovaly asi 80 % ochranu před experimentální nákazou u dobrovolníků (DuPont et al., viz výše). Pokud však byli dobrovolníci imunizováni lyofilizovaným preparátem který byl předem rozpuštěn ve vodě aby byl podáván v tekuté formě,

nebylo dosaženo žádné ochrany (Levine et al., (1976) viz výše). Díky tomu byly další testy s SmD kmeny zastaveny.

2, Kmen Ty21a, patentovaná orálně aplikovatelná vakcína obsahující živé buňky

Ty21a, oslabený kmen Salmonely typhi, který je bezpečný a může sloužit jako orálně aplikovatelná vakcína obsahující živé buňky, byl připraven na počátku sedmdesátých let chemickou mutagenezi pathogenního kmenu Salmonely typhi Ty2 (Germanier et al., J. Infect. Dis., 141:533-558 (1975)). Charakteristickou mutací v tomto bakteriálním kmenu o které se uvažuje jeko o mutaci zodpovědné za oslabení je inaktivace galE (který kóduje UDP-galaktóza4-epimerázu, což je enzym účastnící se syntézy lipopolysacharidů), a neschopností tvořit Vi polysacharid. Zatímco Ty21a je velmi dobře tolerován, což bylo ověřeno vplacebem kontrolovaných klinických testech (Gilman et al., J. Infect. Dis., 136:717-723 (1997), Wahdan et al., (1982) viz výše, Wadhan et al., Bull. WHO, 58:469-474 (1980)), není dosud jasné která z mutací je zodpovědná za stabilní, silně oslabený feno typ této vakcíny. Výsledky ze tří placebem kontrolovaných studií, které využívaly aktivních přežívacích technik pro stanovení reaktogenicity Ty21a u dospělých a dětí prokázaly, že nepříznivá reakce není pozorována častěji u příjemců vakcíny ve srovnání s příjemci placeba, pro žádný symptom nebo příznak. Podobně v rozsáhlých testech, které probíhaly asi na 530 000 dobrovolnících školního věku v Chile, 32 000 dobrovolnících školního věku v Egyptě a asi 20 000 dětech a dospělých v Indonésii nebylo možno identifikovat žádné příznaky škodlivého vlivu této vakcíny (Ferreccio et al., (1984), viz výše, Levine et al., (1987a) viz výše, Simunjuntak et al., viz výše, Wahdan et al., (1982), viz výše a Wadhan et al., (1980) viz výše).

Kontrolní testy s vakcínou Ty21 a ukazují, že tato forma vakcíny, počet podaných dávek a časový protokol aplikace podstatně ovlivňují míru ochrany, které může být dosaženo (Black et al., viz výše, Ferreccio et al., (1984) viz výše, Levine et al., (1987a) viz výše, Wadhan et al., (1980), viz výše). V prvních náhodných, placebem kontrolovaných klinických testech s Ty21a v Alexandrii v Egyptě, 6 až 7 leté děti obdržely tři dávky lyofilizované vakcíny, která byla resuspendována v rozpouštědle (vždy těsně před aplikací) (Wadhan et al., (1980) viz výše). Pro neutralizaci žaludečních kyselin, děti, několik minut před orální aplikací vakcíny nebo placeba, spolkly 1,0 g tabletu NaHCCL. Během tří let přežívání, Ty21a zajistila 96 % ochranu před potvrzenou nákazou břišním tyfem (Wadhan et al., (1982) viz výše).

Novější lékové formy, které jsou komerčně dostupné od poloviny osmdesátých let, obsahují lyofilizovanou vakcínu v entericky potažených, kyselině vzdorujících kapslích. V náhodných klinických placebem kontrolovaných testech v Santiagu de Chile tyto entericky podávané ·· · ·» ·· ·· φ φφ φ φ φφφφ φ φ «φφφφ φφ φ φφφφφφ φφφ φφ φφφφ φφφφ φφ φφφ φφφφ φφ φφ vakcíny ve třech dávkách v intervalu jednoho týdne, zajistily 67 % účinnost po dobu prvních tří let po aplikaci (Levine et al., (1987a) viz výše), a 63 % ochranu po následujících sedm let. Čtyři dávky Ty21a v entericky potažených kapsulích podávané po osmi dnech vykazují daleko lepší míru ochrany než dávky tři (Ferreccio et al., (1984), viz výše). Když byl kmen Ty21a patentován Americkým úřadem pro potraviny a léčiva na konci roku 1989, bylo doporučeno dávkování ve 4 dávkách podaných každá jiný den, jiné státy stále používaly imunizační protokol o 3 dávkách. Nedostatkem této vakcíny, je neznalost molekulární podstaty jejího oslabení, slabší imunogenicita a nejpodstatnější nevýhodou je potřeba alespoň tří oddělených dávek tak aby byla zajištěna dostatečná ochrana. Další nevýhodou Ty21a vakcíny je to že neindukuje tvorbu sérových protilátek IgG proti Vi antigenu.

3. Korelace ochrany po imunizaci oslabenou vakcínou

Ačkoliv patentované orální vakcíny obsahující živé buňky kmene Ty21a jsou jen slabě imunogenní a vyžadují podání tří až čtyřech oddělených dávek, jejich účinnost je překvapivě dlouhodobá a trvá po dobu 5 až 7 let. Výsledky dvou imunologických technik potvrdily korelaci dosažené ochrany pomocí různých forem a různých imunizačních protokolů pomocí Ty21a v klinických testech. Jedná se o sérokonverzi sérových protilátek IgG proti antigenu 0 (Levine et al., Rev. Infect, Dis., 1 l(supl 3):S552-S567 (1989b)) a stanovení množství buněk v trávicím traktu sekretujících protilátky IgA proti antigenu 0 (ASCs) detekovaných mezi mononukleárními buňkami periferní krve (PBMCs) (Kantele, Vaccine, 8:321-326 (1990), Tacket et al., Infect Immun., 60:536-541 (1992b, Van de Verg et al., Infect Immun., 58:2002-2004 (1990)). Identifikace těchto výsledků jako imunologické korelace ochrany přináší neocenitelný nástroj použitelný v předběžných klinických testech, když jsou hodnoceny vlastnosti nových oslabených kmenů Salmonely typhi použitelných jako orální vakcíny.

V. Nové generace oslabených kmenů Salmonely typhi použitelné jako orální vakcíny

Vědci z laboratoří po celém světě hledají nové vhodné kmeny pro použití ve vakcínách, které budou dobře tolerované, jako je Ty21a, ale daleko imunogennější aby jediná orální dávka této nové vakcíny byla schopna zajistit dostatečnou ochrannou imunitu. Nakonec byly připraveny některé vhodné kmeny připravené inaktivací genů kódujících různé biochemické dráhy, regulační systémy, haet shock proteiny, regulační geny a pravděpodobné virulentní faktory (Curtis et al, Infect. Immun., 55:3035-3043 (1987), viz výše, Edwards et al., J. Bacteriol., 170:39991-3995 (1984), Hohman et al., J. Infect. Dis., 173:1408-1414 (1996a), Hone et al., Infect Immun., 56:1326-1333 (1988), Hone et al., Vaccine, 9:810-816 (1991), Levine et al, J.

Biotechnol., 44:193-196 (1996)). Jedním z pokusů bylo i zvýšit imunogenicitu kmene Ty21a obnovením jeho schopnosti exprimovat na povrchu Vi antigen (Cryz et al., Infect Immun., 57:3863-3868 (1989) a Tacket et al (1991), viz výše). Relativní potenciál oslabení byl stanovován obvykle podáním kmenů Salmonely typhimurium nesoucí tyto mutace myším a porovnávání výsledků s izogenním divokým kmenem. Mutace zavedené do různých rekombinantních variant kmenů Salmonely typhi, které byly nakonec podávány lidem při klinických testech jako možné nové vakcíny jsou shrnuty v Tabulce 1.

Mutovaný gen	Kmen vakcíny	Rodičovský divoký kmen	Klinický fenotyp	Imunologický fenotyp
galE, via	EX462	Ty2	neoslabený	imunogenní
aroA, purA	541 Ty	CDC1080	příliš oslabený	málo imunogenní
aroA, purA, Vi	543Ty	CDC1080	příliš oslabený	málo imunogenní
aroC, aroD	CVD 908	Ty2	oslabený	imunogenní
aroC, aroD, htrA	CVD 908-htrA	Ty2	oslabený	imunogenní
cya,crp	X3927	Ty2	nedostatečně oslabený	imunogenní
cya, crp, cdt	X4073	Ty2	oslabený	imunogenní
phoP / phoQ	Ty800	Ty2	oslabený	imunogenní

Významé závěry a výsledky klinických testů s nej důležitějšími oslabenými kmeny Salmonely typhi které hrají důležitou roli ve vývoji dalších živých vakcín jsou shrnuty dále.

A. Vi⁺ Ty21a kmen

Varianta kmene Ty21a byla připravena zavedením viaB (kódujícím strukturální geny nezbytné pro syntézu polysacharidů Vi) z divokého kmene Ty2 do genomu kmene Ty21a a tím bylo dosaženo exprese kapsulárního polysacharidů Vi (Cryz et al., viz výše). Vzniklý Vi⁺ Ty21a kmen byl podáván dospělým jedincům v Severní Americe v jedné dávce v kapalné suspenzi obsahující 5,0 xlO⁵, 5,0 xlO⁷, 5,0 xlO⁹ cfu v pufru, přičemž další testovaná skupina dostala 3 dávky po 5,0 xlO⁹ cfu v pufru (vždy každý druhý den) (Tacket et al., (1991) viz výše). Kmen Vi⁺ Ty21a byl velmi dobře tolerovaný a u většina subjektů, které obdržely tři dávky byl patrný nárůst sérových IgG a slizničních IgA protilátek proti O antigenu Salmonely typhi. U žádného z testovaných jedinců, však nebyl detekovatelný nárůst sérových anti-Vi protilátek IgG, ani nárůst počtu buněk sekretujících slizniční IgA anti-Vi protilátky (Tacket et al., (1991) viz výše).

·· ·· • · · · • · ·

• · · • · · • · ·

Β. ΕΧ462

Pokus ο konstrukci nové varianty kmene Ty2 za použití technik rekombinantní DNA, kdy cílem bylo vytvoření nové oslabené varianty tak aby bylo dosaženo podobného efektu jakého dosáhla chemická mutageneze při vzniku kmene Ty21a (Hone et al., (1988) viz výše).

Konkrétně se jednalo o deleční mutaci v galE, tak aby bylo zabráněno tvorbě Vi polysacharidů, ale ostatní mutace které jsou přítomné v kmeni Ty21a a jsou výsledkem nespecifické chemické mutageneze už použity nejsou. Vzniklý kmen EX462, byl zcela nedostatečně oslaben a u několika příjemců způsobil symptomy podobné břišnímu tyfu. Tato pozorování dokazují, že kombinace mutace v galE a neschopnost vytvářet Vi antigen samy o sobě, nejsou hlavním důvodem oslabení kmene Ty21a.

C. Kmeny 541 Ty a 543Ty

Koncept přípravy auxotrofních mutací Salmonely s inaktivovánými geny kódujícími enzymy účastnící se biosyntetických drah aromatických aminokyselin, byl velmi polularizován (Edwards et al., viz výše a Hoiseth et al., Nátuře, 292:238-239 (1981)). Tyto mutace učiní Salmonelu nutričně závislou na substrátech (kyselina paraaminobenzoová a 2,3-dihydrooxybenzoát) které nejsou v savčí tkéni dostupné v dostatečném množství, následkem čehož, je vakcína živá, ale je zcela potlačena její schopnost množit se.

Prototypy aroA', kmeny 541Ty a 543Ty (Vi' varianta 541Ty) byly připraveny zCDC1080, divokého kmene získaného z Centra pro kontrolu chorob (Edwards et al., viz výše). Patogenicita kmene CDC1080 nebyla nikdy přímo testována na dobrovolnících. Většina ostatních dobrovolníků vycházela při pokusech konstruovat novou vakcínu z divokého kmene Ty2, původního kmene z něhož je odvozena vakcína Ty21a (Germanier et al., viz výše). Pathogenicita kmene Ty2 byla stanovena na dobrovolnících (Hornick et al., N. Engl. J. Med., 283:686-691 a 739-746 (1970)).

Kmeny 541 Ty a 543Ty také nesou deleční mutaci v purA, která vede ke specifické závislosti na dodávky adeninu (nebo látek adenin obsahujících jako je např. adenosin) (edwards et al., viz výše). Třetí mutací je mutace vhisG, vedoucí k závislosti na dodávkách histidinu, což neovlivňuje virulenci, ale zajišťuje to další biochemický znak, pomocí kterého je možno rozeznat kmen vakcíny od divokých kmenů Salmonely typhi.

Kmeny 541Ty a 543Ty jsou v podstatě velmi dobře tolerované v dávkách do 5,0 x 10^1θ cfu ve fázi 1, nicméně jsou méně imunogenní než Ty21a při stimulaci protilátkové odpovědi (Levine et al., J. Clin. Invest., 79:888-902 (1987b)). Například pouze u 11% jedinců byly detekovatelné sérové protilátky IgG třídy proti 0 antigenu (Levine et al., (1987b) viz výše).

• ·· ♦ ·

D. Kmen CVD908

Jeden kmen vakcíny byl otestován jako vysoce imunogenní po podání jedné dávky orálně ve fázi 1 klinických testů u lidí, pokud byly aplikovány čerstvě sebrané buňku kmene CVD908 (Tacket et al., (1992b), viz výše a Tacket et al., (1992a) viz výše), které nesou přesnou deleční mutaci v aroC a aroD (Hone et al., (1991) viz výše). Tato CVD908 vakcína byla první geneticky připravená vakcína Salmonely typhi, která byla dostatečně imunogenní, dobře tolerovaná a naznačovala že existuje možnost připravit živou, orálně aplikovatelnou vakcínu podávanou v jediné dávce. Při velmi dobře tolerované dávce 5,0 x 10⁷ cfu, 92 % jedinců jimž byla tato vakcína aplikována prokázalo IgG 0 protilátkovou serokonverzi a vykazovalo i aktivaci imunitního systému na střevní sliznici (IgA ASCs) (Tacket et al., (1992a) viz výše).

1. Buňečná imunitní odpověď po imunizaci oslabenou vakcínou CVD908

Klinické testy s CVD908 byly charakteristické intenzivním testováním buňkami zprostředkované imunitní reakce (CMI) (Stein et al., J. Immunol., 155:3987-3993 (1995) a Sztein et al., J. Infect Dis., 170:1508-1517 (1994)). Pokud je kmen CVD908 podán zdravému dospělému jedinci, indukuje buněčnou imunitní odpověď proti antigenům Salmonely typhi, včetně cytokinové produkce a proliferativní reakce na tepelně a fenolem inaktivované buňky Salmonely typhi a přečištěné bičíky (Sztein et al., (1994) viz výše).

Jelikož Salmonela typhi je vnitrobuněčný patogen, odborníci se domnívají, že reakce cytotoxických lymfocytů může hrát důležitou roh při potlačení progrese tyfové infekce zničením buněk infikovaných Salmonelou typhi. Techniky pro stanovování cytotoxické aktivity byly použity pro ověření zda imunizace dospělých dobrovolníků oslabenou Salmonelou typhi CVD908 vyvolává cytotoxickou reakci u krevních buněk schopných likvidovat Epstain-Barr virem (EBV) transformované autologní B-lymfocyty infikované divokým typem Salmonely typhi (Sztein et al., (1995) viz výše). Cytotoxická aktivita byla stanovena za použití mononukleárních buněk z periferní krve izolovaných před a poté 14 a 29 dní po první imunizaci. Mononukleární buňky z periferní krve byly použity buď okamžitě v CTL technice nebo byli in vitro namnoženy po dobu 6 až 8 dní v přítomnosti Salmonelou typhi infikovanými Epstain-Barr virem (EBV) transformovanými autologními buňkami, před měřením CTL reakce. Při použití této techniky , CTL efektorové buňky lyžují Epstain-Barr virem (EBV) transformované autologní buňky infikované Salmonelou typhi. Specifická CTL aktivita byla pozorována u mononukleárních buněk z periferní krve 14 dní po imunizaci a následujících 7 až 8 dní množení v in vitro v přítomnosti Salmonelou typhi infikovanými Epstain-Barr virem (EBV) ···· ·« ·· 99 ·· • · · · ·

9 9 9 9

4 4 · * >

• · · 9 · ··· 9· ·· transformovanými autologními buňkami. Mononukleární buňky z periferní krve izolované 29 dní po imunizaci vykazují srovnatelnou nebo vyšší CTL aktivitu než byla pozorovaná u buněk izolovaných 14 dní po imunizaci. Efektorové buňky jsou standardní populací CD8⁺, MHC-I, cytotoxických lymfocytů (Sztein et al., (1995) viz výše). Pozorování, že imunizace oslabenými kmeny Salmonely typhi vyvolávají zvýšení cirkulujících CD8⁺ cytotoxických efektorových buněk, schopných zabíjet autologní buňky infikované Salmonelou typhi podporuje domněnku, že cytotoxická reakce hraje klíčovou úlohu v potlačení progrese infekce břišního tyfu likvidací buněk infikovaných bakteriemi.

2. Nevýhody použití oslabeného vakcinačního kmene CVD908

Možnou nevýhodou pozorovanou v první fázi klinických pokusů je, že asi 50 % jedinců, kterým byla orálně aplikována vakcína v množství 5,0 10⁷ cfu a 100 % jedinců kterým byla orálně o

aplikována vakcína v množství 5,0 10 cfu vykazovalo silné příznaky vakcinemie, přičemž organismy vakcíny byly izolovány z krevních vzorků odebíraných jednou nebo vícekrát mezi dny 4 až 8 po aplikaci. Krevní vzorky byly odebírány systematicky u těchto jedinců po hodině po aplikaci vakcíny a poté vždy 2, 4, 5, 7, 8, 10, 14, 20, 27 a 60 den. Žádný z krevních vzorků nebyl pozitivní před 4 dnem a po 8 dni. Vakcinémie se zdála být bez klinických následků (tzn. nebyla spojena s horečkou) a byla pouze krátkodobá a spontánně vymizela bez použití antibiotik. Přesto možné následky vakcinace tímto oslabeným kmenem Salmonely typhi ve velké populaci, kde je pravděpodobnost výskytu jedinců s narušenou imunitou, nebyly zhodnoceny.

Další nevýhodou vakcinace pomocí kmene CVD908 je vznik horečky u malého procenta jedinců po aplikaci vysoké dávky vakcíny (Tacket et al., (1992a), viz výše).

Jako alternativa byly do genomu kmene CVD908 zavedeny další mutace, které měly zachovat jeho dobrou tolerovatelnost a vysokou imunogenicitu, ale měly potlačit vznik vakcinemie nebo horečky.

E. CVD908 - htrA

Bylo zjištěno, že inaktivací htrA genu kódujícího stresový protein, který je zárověň serinovou proteázou, oslabí divoký kmen Salmonely tyhimurium na myším modelu (Chatfield et al., Microbial Pathogenesis, 12:145-151 (1992a)). Navíc myši imunizované orálně pomocí Salmonely typhimurium nesoucí mutaci v htrA byly chráněny proti následné infekci lethální dávkou Salmonely typhimurium (Chatfield et al., (1992a) viz výše). Do htrA kmene CVD908 byla tedy zavedena deleční mutace , čímž vznikl nový kmen CVD908 - htrA (Levine et al., (1996) viz výše). Jedna dávka bakterií kmene CVD908 - htrA byla orálně aplikována třem • 4 • ·4 • 44 · • 4

4 ·

4

4 4 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

4 4 4

44 skupinám jedinců , kteří dostali 5,0 x 10⁷ (N=7), 5,0 x 10⁸ (N=7), 5,0 x 10⁹ (N=7) cfu (Tacket et al., (1997) viz výše). Kmen CVD908 - htrA byl velmi dobře tolerován, stejně jako rodičovský CVD908 kmen. Pouze u jednoho z 22 jedinců se objevila slabě zvýšená teplota, která byla zjištěna rutinními testy a nebyla provázena žádnými dalšími poruchami nebo komplikacemi.U dvou z 22 testovaných jedinců se objevil průjem (Tacket et al., (1997) viz výše).

Imunitní reakce byla vinikající, 20 z 22 jedinců (91 %) mělo podstatně zvýšené sérové IgG protilátky proti antigenu a buňky produkující protilátky IgA ve střevě proti antigenu 0, byly detekovatelné u 100 % testovaných jedinců. Tyto imunologické nálezy jsou v podstatě shodné s výsledku fáze 1 klinických testů u jedinců imunizovaných srovnatelnými dávkami kmene CVD908 (Tacket et al., (1992a) viz výše). Podstatným rozdílem byla nepřítomnost vakcinémie. Zatímco v případě kmene CVD908 byla vakcinémie detekovatelná u 10 z 18 jedinců, kteří dostali 5,0 x 10⁷ nebo 5,0 x 10⁸ cfu, u žádného z 22 jedinců kterým bylo podáno 5,0 x 10⁷'⁹ cfu dobře tolerované, vysoce imunogenní vakcíny obsahující CVD908-htrA (p< 0,001) (levine et al., (1987b) viz výše, Tacket et al., (1992a), viz výše a Tacket et al., (1997) viz výše). Kmen CVD908 - htrA také vyvolává silnou buňkami zprostředkovanou imunitní reakci, která je srovnatelná s reakcí na kmen CVD908 (Tacket et al., (1992a), viz výše a Tacket et al., (1997) viz výše). Díky těmto vinikajícím údajům byl kmen CVD908 - htrA připuštěn do fáze 2 klinických testů, tak aby bylo možno ověřit klinickou použitelnost a imunigenicitu na větší skupině jedinců, včetně dětí.

F. Kmeny s mutacemi v genech cya, crp nebo cya, crp, cdt

U Salmonely, geny cya (kóduje adenylát cyklázu) a crp (cyklický AMP receptorový protein) představují důležité regulační systémy, které ovlivňují mnoho genů a operonů (Curtiss et al., Dev. Biol. Stand., 82:23-33 (1994)). Kmen Salmonely typhi nesoucí deleční mutace v genech cya a crp jsou vzhledem k rodičovským divokým kmenům oslabené a orální imunizace těmito kmen u myší ochránila imunizované jedince proti infekci virulentními kmeny Salmonely typhimurium (Curtis et al., (1987) viz výše).

Byl připraven nový kmen vakcíny X , což je cya', crp' dvojitý mutant kmene Ty2 Salmonely typhi (Curtis et al., (1994) viz výše). Ve fázi 1 klinických testů, bylo prokázáno, že kmen X³⁹²⁷ , je sice vzhledem k divokému kmeni oslabený, ale přesto je oslaben nedostatečně na to aby mohl sloužit jako živá orálně podávaná vakcína u lidí, neboť u některých jedinců se po podání projevily příznaky tyfu spojené s vysokými horečkami (Tacket et al., (1992b), viz výše). U některých jedinců se projevila i vakcinémie (Tacket et al., (1992b), viz výše).

• 4

4· ·· • 4 4 • 4

44*4 ·· ·· *·

4 4 4 · « 4 4 4

4 4 · · ·

4444

Pro dosažení vyššího stupně oslabení, do genomu dvojitého mutantního kmene X³⁹²⁷ byla zavedena třetí deleční mutace a to do genu cdt (Curtis et al., (1994) viz výše). Gen cdt ovlivňuje prostup Salmonely z lymfoidních tkání střeva do hlouběji umístěných orgánů retikuoendotheliálního systému, jako jsou játra, slezina a kostní dřeň (Kelly et al., Infect Immun., 60:4881-4890 (1992)). Vzniklý kmen X⁴⁰⁷³ s trojitou mutací v cya', crp, cdt byl podán dospělým jedincům v Severní Americe, s pufrem v jediné dávce obsahující 5,0 χ 10⁵, 5,0 χ 10⁶, 5,0 χ 10⁷, 5,0 χ 10⁸ cfu (Tacket et al., (1997) viz výše). Tento kmen byl dobře tolerován, kromě jednoho pacienta, který dostal 5,0 x 10⁷cfu a projevila se u něj diarea (Tacket et al., (1997) viz výše). U žádného z testovaných jedinců se neprojevila vakcinémie. Všech 5 jedinců, kteří dostali 5,0 χ 10⁸ cfu mělo podstatně zvýšené sérové protilátky třídy IgG proti 0 antigenu a stejně tak buňky střevní sliznice produkující slizniční IgA proti 0 antigenu (Tacket et al., (1997) viz výše).

G. Kmeny s mutacemi v phoP/phoQ

Byly připraveny dva nové kmeny Salmonely typhi nesoucí deleční mutanty v phoP/phoQ (Hohman et al., (1996a) viz výše, Hohman et al., Vaccine, 14:19-24 (1996b)). Kmen Ty445, který nese deleční mutaci v aroA, byl zhodnocen jako příliš oslabený a pouze minimálně imunogenní (Hohman et al., (1996b) viz výše). Naopak kmen Ty800, odvozený od Ty2, nesoucí deleční mutace pouze v phoP/phoQ, byl obecně dobře tolerovaný a imunogenní, pokud byl podáván v dávkách od 10⁷ cfu do 10ⁱ⁰ cfu v první fázi klinických testů, malému počtu jedinců 11 (Hohman et al., (1996b) viz výše). Ve vyšších dávkách se u 1 ze tří jedinců objevila diarea. Je těžké porovnávat imunitní reakci jedinců imunizovaných kmeny CVD908-htrA a X⁴⁰⁷³, neboť některé imunologické testy byly odlišné a i pokud byla pro testování použita stejná technika (např. technika detekce ASC produkujících IgA proti 0 antigenu) rozdíly mohou být dané rozdílnou technikou mezi dvěma laboratořemi.

H. Shrnutí

Kmen CVD908 je dobře tolerovaný, ale způsobuje vakcinémii u přibližně 50 % jedinců imunizovaných dávkou 10⁷ cfu. Slabá, ale prokazatelná diarea byla pozorována u přibližně 10 % jedinců imunizovaných kmenem CVD908-htrA, Ty800 nebo X⁴⁰⁷³. Imunitní reakce na kmen X⁴⁰⁷³ se zdá být slabší než jaká byla pozorovaná po orální imunizaci CVD908, CVD908-htrA a Ty800 (viz tabulka 1). Existují tedy čtyři oslabené kmeny Salmonely typhi s ukončenou fází 1 klinických testů, přičemž každý z kmenů má svoje nevýhody a zájmem je připravit další nové oslabené kmeny vhodné pro vakcinaci. Navíc žádný z těchto kmenů neindukuje tvorbu sérových protilátek proti Vi polysacharidů.

·· ·<

« Φ · * • · « φ φ · · • · ·

Φ··Φ ·· ·· Φ·

φ. 9 9 Φ • Φ Φ · • · · · • Φ · Φ φ· ♦ ·

VI. Použití oslabených kmenů Salmonely jako živých vektorů pro expresi cizorodých genů kódujících ochranné antigeny jiných patogenů a předkládání těchto antigenů imunitnímu systému

Živé vektory sloužící jako vakcíny, nazývané také „nosiče“ nebo „živé systémy pro expresi antigenů“ představují široké pole zájmu vakcinologie (Levine et al, Microecol. Ther., 19:23-32 (1990); Morris et al, Gastroenterol., 103:699-702 (1992); Barletta et al, Res. Microbiol., 141:931-940 (1990), (Dougan et al, Para. Immunol., 9:151-160 (1987); Curtiss et al, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 146:35-49 (1989)). V těchto systémech jsou živé virové, nebo bakteriální vakcíny mogifíkovány tak aby na svém povrchu exprimovaly ochranné antigeny cizího patogenního mikroorganismu a předložili je imunitnímu systému, tak aby vyvolali ochrannou imunitní reakci. Živé bakteriální vektory, které byly testovány jsou kromě jiných i oslabené kmeny Salmonely (Levine et al (1990), viz výše; Morris et al, viz výše; Dougan et al, viz výše; and Curtiss et al (1989), viz výše), Bacille Calmette Guerin (Barletta et al, viz výše), Yersinia enterocolitica (Van Damme et al, Gastroenterol., 103:520-531 (1992)), V. cholerae Ol (Viret et al, Mol. Microbiol., 7:239-252 (1993)), and E. coli (Hale, Res. Microbiol., 141:913-919 (1990)). Každá má některé výhody či nevýhody.

Oslabené kmeny Salmonely typhi jsou zajímavé jako živé vektory pro člověka, neboť je možné je podávat orálně, kolonizují lymfoidní tkáně asociované s trávicím traktem, stejně jako retikuloendotheliální systém, vyvolávají široké spektrum imunitních reakcí (včetně sérových protilátek, mukózního slgA, různé buňkami mediované imunitní reakce včetně klasické CTL a různých forem protilátkami mediované buněčné cytotoxicity) (Conry et al, Gene Therapy, 2:5965 (1995), Cox et al., J. Virol., 67:5664-5667 (1993); Davis et al, Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 93:7213-7218 (1996a); Davis et al, Vaccines, 96:111-116, Brown et al, (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996b); Tacket et al (1992a), supra; Gonzalez et al, J. Infect. Dis., 169:927-931 (1994); Sztein et al (1994), supra). Navíc Salmonela je snadno geneticky manipulovatelná a již řada cizorodých antigenů byla vnesena do jejího genomu. Theoreticky, orálně aplikovatelné vakcíny proti různým infekčním chorobám mohou být připraveny stabilním zavedením a expresí cizorodých genů kódujících ochranné antigeny u dobře tolerovaných a vysoce imunogenních kmenů Salmonely typhi (Levine et al., (1990) viz výše).

VII. Salmonela s mutacemi v metabolické dráze purinu

A. Starší zprávy o kmenech Salmonely s mutacemi v metabolické dráze purinu

Mutace v genech purA a purB u Salmonely (tím je přerušena syntéza nukleotidů obsahujících adenin) (viz obr. 2) způsobí tak silné oslabení (McFarland et al., Microb. Pathogen., 3:129-141 (1987)), že tyto kmeny se stávají neúčinné při vyvolávání ochranné imunitní reakce u zvířat (0'Callagham et al., Infect Immun., 56:419-423 (1988)) a jsou jen slabě imunogenní u lidí (Levine et al., (1987b) viz výše). Naopak mutace v v některém z genů kódujících proteiny standartní purinové metabolické dráhy (tzn. purF, purG, purC, purHD), které přerušují biosyntézu obou purinových nukleotidů (viz obr. 2) nebo v genech guaB nabo guaA, které přerušují biosyntézu guaninových nukleotidů (viz obr. 2) byly popsány jako podstatně méně oslabující (McFarland et al., viz výše), tyto kmeny indukují smrt u myší při tak nízkých dávkách jako je 10² cfu (McFarland et al., viz výše).

Výše uvedená pozorování naznačují, že:

i) mutace ovlivňující enzymy standartní metabolické dráhy purinů jsou jen mírně oslabující (McFarland et al., viz výše).

ii) Mutace ovlivňující syntézu adeninových nukleotidů jsou příliš oslabující (tzn. purA, purB) (McFarland et al., viz výše, O'Callagham et al., viz výše, Levine et al., (1987b) viz výše), nicméně mutace ovlivňující syntézu nukelotidů obsahujících guanin, jsou jen minimálně oslabující (McFarland et al., viz výše).

B. Nepředpokládané a jedinečné pozorování podle navrhovaného vynálezu

V souvislosti s výše uvedenými závěry, bylo nepředpokladatelně objeveno, že specifická gua auxotrofie u Salmonely typhi zajistí vysokou míru oslabení. Toto oslabení je dáno, částečně, sníženou invazivitou (vlastnost, která nebyla nikdy dříve u jiných kmenů Salmonely oslabených mutacemi v metabolických drahách popsána) stejně jako sníženou mírou intracelulární replikace mutant Salmonely typhi označených jako ÁguaB-A. Tento objev byl nečekaný, neboť Salmonela dublin a Salmonela tyhimurium nesoucí inzerční Tn5 mutace ovlivňuje syntézu guaninovývh nukleotidů a byla popsána jako jen minimálně oslabená (McFarland et al., viz výše. Dalším nečekaným prvkem bylo, že kromě vysokého stupně oslabení mutant ÁguaB-A Salmonely typhi kmene CVD915 zde popisovaný byl vysoce imunogenní na myším modelu. Toto pozorování je nečekané, vzhledem k dřívějším výsledkům, kde silně oslabené kmeny s mutacemi inaktivujícími purA a purB, byly velmi slabě imunogenní (Edwards et al., viz výše). Dalším nečekaným objevem bylo, že kmen CVD915 indukuje velmi silnou imunitní reakci na rekombinantní antigeny exprimované na jeho povrchu. Toto pozorování je nečekané, vzhledem k dřívějším výsledkům, kde silně oslabené kmeny byly jen slabé živé vektory pro heterologní rekombinantní antigeny (Tackete et al (1997, viz výše).

• ·

Kmen CVD915 je navíc schopen doručit eukaryotický expresní vektor k^vodující rekombinantní cizorodý antigen (DNA-vakcína) a vyvolat nepředpokladatelně sinou imunitní reakci. Možnost doručení eukaryotického expresního vektoru ve formě plazmidu bylo popsáno pro oslabené kmeny vektorů Shigella (Sizemore et al., Science, 270:299-302 (1995)) a pomocí oslabených vektorů Salmonela typhimurium (Darji et al., Cell, 91:765-775 (1997)). Bakterie druhu Shigella je invazivní organismus a její úspěšnost v doručování DNA vakcín je dán pravděpodobně její schopností sekundárně opustit fagozóm (Sansonetti et al., Infect Immun., 51:461-469 (1986)). Salmonela však fagozóm neopouští. Proto zde uváděná pozorování jsou nepředpokladatelná a jedinečná v současném stavu techniky.

Navrhovaný vynález popisuje jedinečný způsob jak si geneticky upravená oslabená Salmonela typhi uchová stabilní expresi Vi antigenů. Mutanty Salmonely podle navrhovaného vynálezu jsouoslabené zejména mutacemi v metabolických drahách týkajících se syntézy guaninu de novo.

PODSTATA VYNÁLEZU

Předmětem navrhovaného vynálezu je popsat oslabené kmeny Salmonely, které stabilně exprimují na svém povrchu Vi antigen.

Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je popsat způsob dosažení stabilní exprese Vi antigenů.

Dalším předmětem navrhovaného vynálezu popsat kmey Salmonely s oslabené mutacemi v de novo syntetických drahách guaninu.

Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je popsat způsob zavedení delečních mutací do genů gueB a guaA u Salmonely.

Dalším předmětem navrhovaného vynálezu popsat orálně nebo intranasálně (tzn. slizniční) aplikovatelné vakciny proti břišnímu tyfu.

Dalším předmětem navrhovaného vynálezuje popsat nové kmeny Salmonely, které mohou sloužit jako živé vektory pro cizorodé geny, klonované z jiných patogenů tak, aby tato exprese a příslušná imunizace zvedla ochrannou imunitní reakci proti těmto patogenům, ze kterých jsou cizorodé antigeny odvozené.

Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je popsat kmeny Salmonely, které jsou použitelné jako živé vektory pro dopravování DNA-vakcín.

Tyto a další předměty navrhovaného vynálezu, které jsou uvedeny v detailním popisu mají jedno společné, všechny využívají oslabených mutantů Salmonely, které stabilně exprimují na svém povrchu Vi antigen.

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obrázky 1A a 1B ukazují viaB operon a schématicky znázorňují záměnu divokého typu osmotický regulovaného promotoru vipR ve viaB operonu za sacB-Neo kazetu (obr. 1A) a záměnu sacB-Neo kazety inzercí silného stabilního promotoru P_tac tak aby byla zajištěna silná stabilní exprese Vi antigenů (obr 1B).

Obrázek 2 ukazuje biosyntetickou dráhu purinu de novo a souvislost s aromatickou metabolickou dráhou. V obrázku 2, přerušované Šipky ukazují dráhy, u kterých jednotlivé kroky nejsou znázorněny. Enzymy jsou představovány svými geny. Písmena v horním indexu představují zvolené kmeny s mutací v genu účastnícím se této reakce. Představované kmeny jsou: a: purF1741::TnlO S. dublin SL5437 (McFarland et al, supra); b: purG876::TnlO S. dublin SL5436 (McFarland et al, supra); c: purC882::TnlO S. dublin SL5435 (McFarland et al, supra); d: purH887::TnlO S. dublin SL2975 (McFarland et al, supra); e: AguaB-A S. flexneri 2a CVD 1204 a AguaB-A, wire S. flexneri 2a CVD 1205 (Noriega et al, Infect. Immun., 64:3055-3061 (1996)) a ÁguaB-A Salmonella typhi CVD 915 (present invention); f: aroD25::TnlO S. flexneri Y SFL114 (Lindberg et al, (1990) supra), SFL124 (Li et al, supra), S. flexneri 2a 1070 (Kamell et al (1995) supra); g: ÁaroC, ÁaroD S. typhi CVD 908 (Hone et al (1991), supra); h: hisG46 DEL407, aroA554::Tnl0 S. typhimurium SL3261 (Hoiseth et al, supra); i: ÁaroA S. flexneri 2a CVD 1201 a AaroA, wire CVD 1203 (Noriega et al, Infect. Immun., 62:5168-5172 (1995); and j: ÁaroA, AhisG, ApurA S. typhi 541 Ty (Levine et al (1987b), supra).

K obrázku 2, jsou uvedeny následující zkratky:

PRPP: 5-fosforibosyl-l-3-pyrofosfát; PRA: 5 - fosforibosylamin; GAR 5'-fosforibosyl-l-glycinamid; FGAR: 5'-fosforibosyl-N-formylglycinamid; FGAM: 5'-fosforibosyl-N-formylglycinamidin; AIR: 5'-fosforibosyl-5-aminoimidazole; CAIR: 5'-fosforibosyl-5-aminoimidazole-4karboxylát; SAICAR : 5'-fosforibosyl-4-(N sukcinokarboxamide)-5-aminoimidazol; AICAR: 5'fosforibosyl-4~karboxamid-5-aminoimidazol; FAICAR: 5'-fosforibosyl-4-karboxamid-5 formamidoimidazol; IMP: inosiniková kyselina; Hx: hypoxanthin; G: guanin; and A: adenin.

Obrázky 3A až 3G ukazují sekvenci DNA kódující geny guaA a guaB u Escherichia coli (guaA a guaB geny Escherichie coli (sekvence č:l) (GenBank No. M10101-M10102), (Thomas et al, Gene, 36:45-53 (1985); Tiedeman et al, J. Biol. Chem., 260:8676-8679 (1985); Tiedeman et al, Nucleic Acids Res., 13:1303-1316 (1985)), která je silně homologní s geny guaA a guaB u druhu Salmonela stejně jako některá restrikění místa pro endonukleázy použitelná při přípravě delečních mutant podle navrhovaného vynálezu.

• ·

4

Obrázek 4 schématicky znázorňuje orientaci guaB-A operonu, stejně jako umístění restrikční ch míst pro endonukleázy použitelná při přípravě delečních mutant podle navrhovaného vynálezu. Operon guaB-A je znásoben pomocí PCR a fůzí segmentů guaB-A operonu pomocí PCR dojde k nahrazení AguaB-A alely. Je také ukázáno, že klonováním arsenitového operonu (ars) ve středu AguaB-A alely vede ke vzniku AguaB-A::P_tac-ars kazety. Tato deleční kazeta je poté klonována do sebevražedného plasmidu a zaměměna za divoký typ guaB-A alely u kmene Salmonely typhi Ty2, což vede ke vzniku kmene AguaB-A Salmonely typhi označeného jako CVD915.

Obrázek 5 je chchématické znázornění konstrukce pcDNA3/tetC (DNA vakcína kódující fragment C tetanového toxinu pod kontrolou lidského cytomegalovirového promotoru (CMV)) Obrázek 6 ukazuje protilátko vou reakci u myší proti fragmentu C tetanového toxinu po intranasální imunizaci kmenem AguaB-A CVD915 exprimujícím fragment C tetanového toxinu , nebo nesoucím eukaryotní expresní kazetu kódující fragment C tetanového toxinu.

Obrázek 7 ukazuje proliferativní reakci myších lymfocytů proti fragmentu C tetanového toxinu po intranasální imunizaci kmenem AguaB-A CVD915 jako takovým, nebo jako expresním vektorem fragmentu C tetanového toxinu nebo nesoucím eukaryotní expresní kazetu kódující fragment C tetanového toxinu.

Obrázek 8 ukazuje proliferativní reakci myších lymfocytů proti bičíkům Salmonely typhi po intranasální imunizaci kmenem AguaB-A CVD915 jako takovým, nebo jako expresním vektorem fragmentu C tetanového toxinu nebo nesoucím eukaryotní expresní kazetu kódující fragment C tetanového toxinu.

Obrázek 8 ukazuje protilátkouvou odpověď myších lymfocytů proti bičíkům Salmonely typhi po intranasální imunizaci kmenem AguaB-A CVD915 nebo kmeny AaroC, AaroD, AhtrA Salmonely typhi CVD908-htrA.

Obrázek 8 ukazuje protilátkouvou odpověď proti Salmonela typhi LPS u myší po po intranasální imunizaci kmenem AguaB-A CVD915 nebo kmeny AaroC, AaroD, AhtrA Salmonely typhi CVD908-htrA.

Navrhovaný vynález popisuje oslabené kmeny Salmonely pro použití, kromě jiného, jako orálně aplikovatelné vakcíny proti břišnímu tyfu, jako živé vektory a DNA vakcíny exprimující cizorodé antigeny. Jak je zde používán termín „cizorodý antigen“ popisuje jakýkoliv antigen cizí Salmonele.V navrhovaném vynálezu ja také popisována oslabená mutanta Salmonely, přičemž tato mutanta se vyznačuje stabilní expresí Vi antigenu.

Je vhodné, aby chromozomální genom Salmonely byl modofikován substitucí ve vysoce regulovaném vipR promotoru pomocí silného náhradního promotoru a tím byla zajištěna stabilní

exprese Vi antigenu v oslabených kmenech . Konkrétní silný promotor, který je použit v navrhovaném vynálezu, není nijak omezen. Příkladem takových použitelných silných promotorů mohou být např. P_tac (de Boer et al, Proč. Nati. Acad. Sci., 80:21-25 (1983)), Pi_ac (De Boer et al, supra), P_trc (De Sutter et al, Gene, 141: 163-170 (1994)) , P_Oi_ac and Pi_pp (De Sutter et al, supra; Guisez et al, Protein Expr. Purif., 2:249-258 (1998))

Konkrétní kmen Salmonely typhi použitý jako výchozí kmen v navrhovaném vynálezu není nijak omezen.

V dále uvedených příkladech je jako vakcína proti Salmonele typhi použit divoký kmen Ty2.

Ty2 je vysoce virulentní kmen Salmonely dostupný z řady zdrojů, jako je např. CVD Centrum pro kontrolu chorob (CDC), Walter Reed Army Institute of Research, sbírky University of the Healthy Sciences, Pasterův institut v Paříži a Imperiál College (Anglie).

Pro přípravu vhodných oslabených vakcín byly použity i jiné kmeny Salmonely typhi, jako jsou např: kmen CDC 1080 (Levine et al., (1987b) viz výše), který byl získán ze Standford University nebo z CDC a kmen ISP1820 (Hone et al., (1991) viz výše), který je možno získat z Centra pro vývoj Vakcín, University of Maryland.

V navrhovaném vynálezu je většinou chromozomální genom Salmonely typhi upraven delecí nebo jinou modifikací guaB-A operonu a tím zablokováním biosyntézy guaninových nukleotidů de novo. Lépe pak, rámcově definováno, nepolární mutací v guaB-A operonu je vhodné inaktivovat metabolickou dráhu enzymu IMP dehydrogenázy (kódováno genem guaB) a GMP syntázy (kódováno genem guaA). Následkem těchto dvou mutací, je Salmonela neschopna syntézy GMP de novo a tím následně i GDP a GTP nukleotidů (viz obr. 2), coč podstatně omezuje její množení v tkáních savců.

In vitro nejsou mutanty Salmonely AguaB-A podle navrhovaného vynálezu schopny růst v minimálním médiu pokud není doplněno guaninem. V tkáňových kulturách byl u mutant Salmonely ÁguaB-A zjištěn prudký pokles její invazivity. Tyto mutanty Salmonely ÁguaB-A jsou schopné v jisté míře získat guanin z tkání savčího hostitele. Jeho asimilace do Salmonely vyžaduje však před defosforylací na nukleosid periplasmatickými nukleotidázami jeho inkorporaci jako prekursoru nukleotidu do metabolické dráhy guaninu. Neboť tento nukleotid je dostupný v prostředí savčí tkáně, oslabení kneme díky zablokování syntézy guaninu de novo je dáno nenefektivitou alternativních drah guaninu nebo z důvodů dosud neznámých.

Gen guaA, kódující GMP syntázu je veliký 1575 bp (viz obr 3A až 3G). Velikost intracistronové inaktivační delece u guaA mutant může být v rozsahu od 1 do 1575 bp. Lépe pak od 100 do 1575, pokud delece je v příslušném čtecím rámci. Tato delece může být také provedena tak, že • 4

44· · 4 4 přesahuje guaA gen, tzn. extracistronická delece po směru guaA může také ovlivnit transkripci tohoto genu a tím ho inaktivovat. Toto však není nejvhodnější varianta.

Gen guaB, kódující IMP dehydrogenázu je veliký 1533 bp (viz obr 3A až 3G). Velikost intracistronové inaktivační delece u guaB mutant může být v rozsahu od 1 do 1533 bp. Lépe pak od 100 do 1533 bp, pokud delece je v příslušném čtecím rámci. Tato delece může být také provedena tak, že přesahuje guaB gen, tzn. extracistronická delece po směru guaB může také ovlivnit transkripci obou genů (guaA a guaB) a tím je inaktivovat. Toto však není nejvhodnější varianta.

Delece mohou být provedeny v guaA genu za použití 2 vhodných restrikčních míst uvnitř guaA genu, příkladem mohou být místa pro Seal nebo AccI a EcoRV nebo Sáli, Smál, Sphl nebo Xmal (obr 3A až 3G a 4) nebo mířenou mutagenezí pomocí oligonukleotidů (Sandbrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Eds., Cold Spring Harbor Publications (1989)).

Delece mohou být provedeny v guaB genu za použití 2 vhodných restrikčních míst uvnitř guaB genu, příkladem mohou být místa pro Bell, BsmI, PvuII, Scall, SspI nebo XhoII (obr 3A až 3G a 4) nebo mířenou mutagenezí pomocí oligonukleotidů (Sandbrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Eds., Cold Spring Harbor Publications (1989)).

Navíc jakákoliv kombinace delečních míst umístěných zároveň v genech guaB a guaA může být použita pro získání požadované delece podle navrhovaného vynálezu, příkladem mohou být AccII, AflII, Ahall, Alwl, Asul, Bani, BcnI, Bspl286, BspMII a Ddel (obr 3A až 3G).

Inaktivace genů guaA a/nebo guaB může být také dosaženo inzercí cizorodé DNA za použití výše uvedených restrikčních míst, nebo mířenou mutagenezí pomocí oligonukleotidů (Sandbrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Eds., Cold Spring Harbor Publications (1989)), tak aby byla porušena transkripce genů guaA a/nebo guaB. Typická velikost této inzerce, která inaktivuje geny guaA a guaB, může být od 1 bp do 100 kbp, ačkoliv nejvhodnější jsou inzerce menší než 100 kbp. Tatí inzerce může být provedena kdekoliv v oblasti kódující guaA nebo guaB geny a nebo v promotoru.

Jiné způsoby inaktivace genů guaA a/nebo guaB jsou přenos delečně nebo inzerčně inaktivo váných guaA a/nebo guaB genů z jiného mikroorganismu do genomu Salmonely, transpozóneb vyvolané delece, a nepřesným odstraněním DNA inzerce. Poslední dva způsoby jsou spíše techniky vnášení delecí přesahujících geny guaA a guaB a tedy nejsou nejvhodnější. Mutace v gua podle navrhovaného vynálezu jsou použitelné pro vývoj nepatogenních variant Salmonely typhi použitelných jako orálně aplikovatelné vakcíny.

Vhodné kmeny Salmonely použitelné jako vakcíny mohou být připraveny, např. přidáním dalších oslabujících mutací, poškozením exprese produktů lokusu aro. Toho může být dosaženo

9 delecí části alespoň jednoho aro genu (aroA, aroC, aroD) v chromozómu Salmonely, čímž se kmen stává závislým na PABA, na substrátu, který není dostupný v savčích buňkách, jako je např. kmen Salmonely typhi CVD908 (Hone et al., (1991) viz výše).

V jiné variantě, jsou výše popsané faktory navrhovaného vynálezu spojeny ve vakcíně proti břišnímu tyfu, ketrá obsahuje:

(A) farmaceuticky efektivní množství mutantů Salmonely typhi, kde tyto mutanty stabilně exprimují na svém povrchu Vi antigen (B) farmaceuticky přijatelný nosič, nebo ředidlo

V další variantě podle navrhovaného vynálezu jsou výše popsané faktory spojeny v živé vakcíně, která obsahuje:

(A) farmaceuticky efektivní množství mutantů Salmonely typhi, kde tyto mutanty stabilně exprimují na svém povrchu Vi antigen a kde tato mutanta kóduje a exprimuje cizorodý antigen pod kontrolou prokaryotního promotoru (tzn. bakteriální exprese cizorodého antigenů) (B) farmaceuticky přijatelný nosič, nebo ředidlo

Cizorodý antigen, který je vložen do Salmonely jako do živého vektoru není pro předmět navrhovaného vynálezu nijak podstatný. Oslabené kmeny Salmonely podle navrhovaného vynálezu mohou být použity jako živé vektory pro imunizaci proti enterickým patogenům (TZN. bakteriím, virům atd.), patogenům přenášeným pohlavním stykem, patogenům akutních chorob respiračního traktu nebo pato genů procházejících sliznici a způsobujících systémová onemocnění (např. meningokok). Může být také použit proti různým typům parazitárních onemocnění, jako je Plasmodium falciparum, leishmania, Entamoeba histolytica a Cryptosporidium. Příklady antigenů patogenů střevního traktu, které mohou být exprimovány na živých kmenech Salmonely podle navrhovaného vynálezu jsou:

(a) fimbriální kolonizační faktor enterotoxigenní Escherichie coli a zejména podjednotka B tepelně nestabilního enterotoxinu (která nezpůsobuje střevní sekreci, ale vyvolává neutralizační antitoxin) (b) fímbrální antigen a/nebo intimin enterohemorhagické Escherichie coli zároveň s B podjednotkou Shiga toxinu 1 enbo 2 (nebo mutantního Shiga toxinu 1 nebo 2) (c) 0 antigen Shigelly a invazivní plasmid Shigelly VirG (d) neutralizační antigeny rotavirů (e) ureáza, kolonizační antigeny a jiné ochranné antigeny z Helicobactera pylori (f) inaktivovaný toxin Clostridia difficile nebo z něj odvozené antigeny na · · · · · · · ···· ·· ······· ··

Příklady antigenů pohlavně přenášených chorob, které mohou být exprimovány na živých kmenech Salmonely podle navrhovaného vynálezu jsou:

(a) pili a vnější membránové proteiny Nesserie gonorrhoae (b) proteiny z Chlamidie trachomatis.

Příklady antigenů patogenů způsobujících akutní choroby respiračního traktu, které mohou být exprimovány na živých kmenech Salmonely podle navrhovaného vynálezu jsou:

(a) mutantní diptheria toxin s náhrazenou NAD vazebnou doménou, který postrádá toxickou aktivitu a vyvolává tvorbu neutralizačního antitoxinu (b) antigeny Bordetely pertussis včetně fůzního proteinu obsahující zkrácenou SI podjednotku pertussis toxinu fúzovanou s fragmentem C tetanového toxinu, mutantní pertussis toxin, vláknitý hemaglutinin a pertactin (c) F a G glykoproteiny respiračního syncytiálního viru (d) kapsulární polysacharid Haemophilu influenza typu b (e) kapsulární polysacharid skupiny A a C zNeisseria meningitidis a vnější membránové proteiny zeskupiny B Neisseria meningitidis.

Příklady antigenů z parazitů, které mohou být exprimovány na živých kmenech Salmonely podle navrhovaného vynálezu jsou:

(a) cirkumsporozoidový protein (CSP), antigen-1 jaterní fáze (LSA-1), SSP-2 (také známý jako TRAP) a Exp-1 z Plasmodia falciparum, (b) erythrocytární antigen nepohlavní fáze z Plasmodium falciparum, včetně MSP-1, MSP-2, SERA, AMA-1 a SREHP, (c) anigen pohlavní fáze z Plasmodia falciparum, jako je Pfs25 a gp63 z Leishmanií (d) na serin bohatý protein z Entamaeba histolytica (SREHP).

V další variantě, jsou výše popsané faktory navrhovaného vynálezu spojeny ve DNA vakcíně, ketrá obsahuje:

(A) farmaceuticky efektivní množství mutantů Salmonely typhi, kde tyto mutanty stabilně exprimují na svém povrchu Vi antigen a obsahují plasmid, který kóduje a exprimuje, za použití eukaryotního promotoru v eukaryotních buňkách, cizorodý antigen (B) farmaceuticky přijatelný nosič, nebo ředidlo

Detailní popis konstrukce a použití DNA vakcín je popsáno v US patentové přihlášce č. 08/433 790, podané 3. května 1995, kteráje zde uvedena jako citace.

Konkrétní cizorodý antigen, který bude použit v DNA vakcíně podle navrhovaného vynálezu není podstatný pro navrhovaný vynález. Příklady mohou být z celého širokého spektra antigenů z patogenů jako jsou chřipka (JUStewicz et al, J. Virol., 69:7712-7717 (1995); Fynan et al, Int. J.

Immunopharmacol., 17:79-83 (1995)), lymfocytický virus choriomeningitidy (Zarozinski et al, J. Immunol., 154:4010-4017 (1995)), lidský virus získaného selhání imunity (Shiver et al, Ann. NY. Acad. Sci., 772:198-208 (1995)), virus hepatitidy typu B (Davis et al, Vaccine, 12:15031509 (1994)), virus hepatitidy typu C (Lagging et al, J. Virol., 69:5859-5863 (1995)), virus vztekliny (Xiang et al, Virology, 209:569-579 (1995)), Schistosoma (Yang et al, Biochem. Biophys. Res. Commun.,212:1029-1039 (1995), Plasmodium (Sedegah et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 91:9866-9870 (1994) amykoplasma (Barry et al, Nátuře, 377:632-635 (1995)). Rozhodnutí, zda exprimovat cizorodý anigen v Salmonele (za použití prokaryotního promotoru v živé vakcíně) nebo v buňkách napadených Salmonelou (za použití eukaryotního promotoru v DNA vakcíně) závisí na tom, který ze systémů vyvolává lepší imunitní reakci požadovaného typu při testech na zvířatech nbeo v klinických studiích a/nebo může záviset na glykosilaci antigenů a jestli tato glykosilace je podstatná pro vyvolání ochranné imunitní reakce a/nebo může záviste na správném tercální konformaci antigenů, která může být dosažena pouze v jednom expresním systému.

Ve vakcínách podle navrhovaného vynálezu, farmaceuticky efektivní množství mutant podle navrhovaného vynálezu , jaké je třeba podávat, může záviset na věku, váze, pohlaví jedince a způsobu aplikace. Obecně, imunogenní dávka by měla být asi 10² cfu až asi 10^1θ cfu. Lépe pak od 10⁶ cfu do 10⁹ cfu pro orální aplikaci, kdy je vakcína podávána ve formě kapsulí, nebo resuspendována v pufru aby byly oslabené bakterie chráněny před kyselým pH v žaludku. Pro intranasální aplikaci ve formě kapek nebo aerosolu je optimální dávka 10² cfu až 10⁷ cfu. Konkrétní farmaceuticky přijatelné nosiče nejsou podstatné pro navrhovaný vynález, a jedná se o konvenční látky a prostředky používané v současném stavu techniky.

Příkaldem může být např: pufry chránící proti kyselému pH v žaludku, jako je citrátový pufr (pH = 7,0) obsahující sacharózu bikarbonátový pufr (pH = 7,0) samotný (Levine et al., (1987b) viz výše a Black et al., viz výše) nebo bikarbonátový pufr (pH - 7,0) obsahující kyselinu askorbovou, laktózu a je možné přidat i aspartam (Levine et al., Lancet, 11:467-470 (1988)). Příkladem nosičů mohou být proteiny, např. sebrané z mléka, cukry, např. sacharóza, nebo polyvinylpyrrolidon.

Mutované kmeny podle navrhovaného vynálezu mohou být skladovány při -70 °C pokud jsou v Luria médiu (DIFCO) obsahujícím 30 % až 50 % hmotnosti glycerolu.

Následující příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci a nemohou být v žádném případě brány jako limitace navrhovaného vynálezu.

* · « · « « 44 44 · · 4 4

444 4 ♦ 4444

44·· · 4·····

ÁC ··· · 4 4 4 4 4

4444 4· 444 4444 44 ··

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1. Konstrukce ÁguaB-A deleční kazety pJWlOl

DNA segmenty obshující 5' konec guaB genu a 3' konec guaA genu byly namnoženy pomocí PCR za použití genomové DNA Salmonely typhi kmene Ty2 jako templátu a poté fúzovány v druhé PCR reakci, čímž vznikla ÁguaB-A alela (obr. 4). Způsob použitý pro konstrukci alely ÁguaB-A je stejný jako ten který byl použit pro konstrukci ÁguaB-A alely u ÁguaB-A u kmene CVD 1204 Salmonely flexneri 2a (Noriega et al., (1996) viz výše a US patentová přihláška č. 08/629 600 podaná 9. dubna 1996 (nepřijata), která je zde uvedena jako citace).

V první PCR reakci (obr. 4) primery použité pro namnožení 5' konce alely guaB-A byly:

'-CGAGCTCGCGAGCTCGGTAAAGTACCAGTGACCGGAAGCTGGTTGCGT-3' (sekvence č. 2) a

-GGGCCCGGGGGATCCTCAACCGACGCCAGTCACGATACGAGTTGTACAGAT-3' (sekvence č. 3) a primery použité pro namnožení 3' konce ÁguaB-A alely byly:

-TGAGGATCCCCCGGGCCCGGCTACGCGCAGGTTGAAGTCGTAAACGACAGC-3' (sekvence č. 4) a '-GCTCTAGAGCTCTAGAGCTCATTCCCACTCAATGGTAGCTGGCGGCTT-3' (sekvence č. 5).

Do interních primerů (sekvence č. 3 a 4) byly zavedeny stop kodóvy ve čtecím rámci (TGA a TCA) proti směru dvou jedinečných restrikčních míst (Apal a BamHI) (podtržena) která byla přidána pro zavedení cizorodých genů do chromozomální ÁguaB-A alely. Tento stop signál zabrání translační fůzi ÁguaB s ÁguaA produkty nebo ÁguaB produkty s produkty cizorodých genů inzertovaných do ÁguaB-A alely. Navíc je do těchto interních primerů zavedena sekvence, která slouží jako homologní region (tlustě) se kterám budou fúzovat 5' a 3' PCR produkty v druhé PCR reakci (a tak vytvoří ÁguaB-A alelu) (obr. 4).

V druhé PCR reakci 5' a 3' segmenty byly fúzovány pomocí extrémních primerů (sekvence č. 2 a 5) a výsledné fůzní produkty byly namnoženy ve stejné reakci. V této reakci patřičná homologní oblast (Apal - BamHI) po ochlazení efektivně fúzují a 5' a 3' segmenty, které v tuto chvíli mohou sloužit jako vlastní primery a/nebo templáty pro Taq polymerázu, v závislosti se kterým z řetězců DNA renaturují. Pro dosažení této fůze, je PCR program upraven tak aby prvních 15 cyklů dosahovalo renaturační teploty (1 °C / 8 sekund od 40 °C do 50 °C + 50 °C po dobu 2 minut) následováno 15 cykly renaturační teploty 55 °C při které je nová ÁguaB-A alela namnožena. Jednalo se tedy o 900 bp guaB-A operonu které nebyly namnoženy a tím vznikl mutantní operon ÁguaB-A (obr. 4).

• ·

Extrémní primery (sekvence č. 2 a 5) bylynavrženy tak aby zavedly jedinečná restrikční místa (Sstl a Xbal) (podtrženo), které byly použity pro klonování AguaB-A alely do jedinečného restrikčního místa v teplotně citlivém, na pSCIOl založeném (Blomfield et al., Mol. Microbiol., 5:1447-1457 (1991)) sebevražedném plasmidu pFM307A, čímž vznikl plasmid pFM307:: AguaB-A. Plasmid FM307A (6,3 Kbp) byl připraven náhradou 4,3 Kbp Nael - Nael fragmentu obsahujícího gen cam (rezistence k chloramfenikolu) vpIB307 (Blomfield et al., Mol. Microbiol., 5:1447-1457 (1991)) za 3,8 Kbp BamHI - BamHI fragment (tupě zakončený Klenowovou polymerázou) obsahující SacB — Kan kazetu (přinášející rezistenci k kanamycinu a sacharózovou selekci) zpIB279 (Blomfield et al., Mol. Microbiol., 5:1447-1457 (1991)). Navíc bylo vhodné vložit jiný než antibiotikový selekční znak do středu AguaB-A alely atk aby bylo možno:

(i) usnadnit výměnu AguaB-A alely za velmi silnou alelu guaB-A u kmene Ty2 (ii) zavést selekční znak který umožní identifikaci této vakcíny v klinice

Proto byl 5,0 Kbp operon R faktoru R773 zajišťující rezistenci k arseniku (ars) izolován jako HindlII fragment z pUMl (Chen et al., J. Bacteriol., 161:758-763 (1985)) (laskavě věnovaný Dr. Rosenem zWayne State University, Detroit, MI) a klonován pod regulaci P_tac promotoru v pKK223-3 (Pharmacia, Piscatway, NJ). Poté byl tupě zakončený P_tac-ars Nael-Dral segment klonován do Apal místa (tupě zakončeno T4 polymarázou) AguaB-A alely v pFM307::AguaBA. čímž vzniká pJWlOl (obr 4).

B. Sebevražedná delece kazetou nesené mutace

Plazmid pJWlOl byl použit pro vnesení pFM307::AguaB-A do divokého kmene Salmonely typhy Ty2 pomocí homologní rekombinace jak popisuje Blomfield et al., viz výše, Noriega et al., (1995) viz výše a Noriega et al., (1996) viz výše, s tou výjimkou,že v kultivačním médiu byl během celého postupu přítomen arsenitanu sodný (SIGMA).

C. Testování mutantů pomocí DNA sond a PCR

Nové bakteriální klony byly ponechány růst při 37 °C přes noc na rastrovaných miskách s Luria agarem, doplněným 6,0 μΜ aresenitanem sodným nebo na minimálním médiu. Kolonie rostoucí na arsenitanem doplněném L agaru, ale ne na minimálním médiu byly přeneseny na filtrační papír typu 541 (Whatman, Maidstone, Anglie) a blotovány jak popisuje Gicquelais et al., J. Clin. Microbiol., 28:2485-2490 (1990) a testovány pomocí γΡ³² značených 40 bp oligonukleotidů: 5'-GGGCGGCCTGCGCTCCTGTATGGGTCTGACCGGCTGTGGT-3' (sekvence č. 6) odpovídající deletované části guaB-A alely divokého typu (negativní sonda). Klony, které ··· ·*·· ·· e· • · · · • · · · • · « · nehybridizovaly s γΡ³² značenými 40 bp oligonukleotidy byly sebrány. Klony Salmonely typhi AguaB-A nejsou schopné růst na minimálním médiu pokud není doplněno 10 mg guaninu/1. Deleční mutace guaB-A operonu a P_tac-ars inzerce do AguaB-A alely byly potvrzeny technikou hybridizace na Southern blotu s P³² značenými sondami pro AguaB-A operon, ars operon a výše popsanými guaB-A negativními sondami. Jeden AguaB-A klon Salmonely typhi byl náhodně zvolen a označen CVD915. Kmen CVD915 byl odeslán do American Type Cell Culture Collection 4. května 1998, pod ATCC číslem 202115.

Kmen CVD915 roste na médiu doplněném 6,0 μΜ arsenitanem sodným, kde žádný z kmenů jako je Ty2, ani jiné kmeny Salmonely, Shigelly nebo Escherichi coli, které byly testovány, nerostou.

PŘIKLAD 2. Invazivita a intarcelulární růst v tkáňových kulturách

Invazivita a intracelulární růst byl testován pomocí gentamycinové techniky, která proběhla při lehké modifikaci podle techniky dříve popsané vTartera et al., Infect Immun., 61:3084-3089 (1993). Zjednodušeně, jednoduchá vrstva buněk Henle407 na 24 - jamkové destičce byla infikována v tripletech divokým kmenem Ty2, AguaB-A CVD915, AaroC, AaroD CVD908, nebo AaroC, AaroD, AhtrA CVD908 - htrA v poměru 50:1 po dobu 90 minut a poté byly všechny bakterie, které zůstaly mimo buňky, zabity gentamycinem po dobu 30 minut, buňky byly promyty (tento časový okamžik byl označen jako čas = 0) a poté byly buňky dále inkubovány s 20 pg/ml gentamycinu. V čase 0 h, 4 h a 22 h byly testované vzorky lyžovány sterilní vodou a a ředící řadě byly inkubovány přes noc při 37 °C na LB agaru doplněném 10 μg guaninu na litr. Výsledky jsou znázorněny v Tabulce 2 níže.

Invazivita a intracelulární růst na Henle407 buňkách

	Intracelulární cfua
kmen	genotyp	0 hodin	4 hodiny	22 hodin
Ty2	divoký typ	6,7 x 103	3,1 x 104	8,8 x 104
CVD915	AguaB-A	3,3 x 102	2,9 x 102	2,5 x 102
CVD908	AaroC, AaroD	5,8 x 102	1,3 x 103	3,5 x 103
CVD908-htrA	AaroC, AaroD, AhtrA	1,3 x 103	3,4 x 103	1,3 x 103

^a jednotky tvořící kolonie » · · · · · · ♦ · oo · · · * · * ·

Ζδ ·«·« ·· *·· ···· ·*

Jak ukazuje tabulka 2 výše, kmen CVD915 měl invazivní schopnost a intracelulámí růst značně nižší než jaký vaykazuje divoký kmen Ty2 a srovnatelný s hodnotami kmene CVD908-htrA. To je jak ukazuje Tabulka 2, ve dvou různých experimentech, , divoký kmen Salmonely typhi Ty2 efektivně napadá Henle407 buňky a namnoží se v nich více na třináctinásobek za 22 hodin. Kmen AaroC, AaroD CVD908 má značně slabší intracelulámí proliferaci, tzn. šestinásobek za 22 hodin.

Jak je také vidět z tabulky 2, kmen AguaB-A CVD915 má výrazně nižší míru invazivity na Henle buňky, než divoké rodičovské kmeny CVD908 a CVD908-htrA a jeho vnitrobuněčný růst, který je nulový je stejný jako u CVD-htrA mutanty.

PŘÍKLAD 3: Srovnání bezpečnosti vakcíny kmene Ty21A, CVD908 a CVD915

Oslabení kmene Salmonely typhi AguaB-A CVD915 bylo ověřeno vzhledem k divokému kmeni Ty2 a dalším oslabeným kmenů, za použití techniky hog-mucinu u myší (Powe et al., J. Biolog. Standar., 8:79-85 (1980)). Myši byly intraperitoneálně infikovány 0,5 ml roztoku obsahujícího různé kmeny v desítkové ředící řadě a 10 % hog mucinu. Poté byla dalších 72 hodin sledována úmrtnost myší a LD50 jednotlivých skupin byla spočtena analýzou jejich lineární regrese. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3.

kmen	LD50 v cfu
Ty2	1,4 x 102
CVD908	4,4 x 106
CVD915	7,7 x 107
Ty21a	1,9 x 10x

Jak ukazuje tabulka 3 výše, kmen CVD915 má zjištěnou LD50 o více než 5 řádů vyšší než hodnota, která byla stanovena pro divoký kmen Ty2 a mezi hodnotami zjištěnými pro kmeny AaroC, AaroD CVD908 a chemicky mutovaný, neinvazivní kmen Ty21a.

PŘÍKLAD 4: Použití kmene CVD915 jako živého vektoru pro doručení cizorodého proteinu a plazmidu DNA vakcíny pro expresi cizorodého antigenu v eukaryotických buňkách

Myší model intranasální imunizace s geneticky upravenými AaroC, AaroD kmeny Salmonely typhi (CVD908) nesoucími fragment C tetanového toxinu (fragment C z TT) byl popsán v Galen • 9 ·· ·· • v · • 9 9 ·

9 9

9999 99

999 9999

99

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9» 99 et al., Vaccine 15:700-708 (1997). Konstrukty, které byly použity pro tento test jako plazmidy přenášené kmenem CVD908, kódující nefůzovaný fragment C tetanového toxinu pod kontrolou anaerobně aktivovatelného prokaryotického promotoru odvozeného od nirB nebo silného promotoru lpp. Bylo zjištěno, že:

(i) intranasální imunizace myší tímto konstruktem, vede k vysokému titru neutralizačních sérových protilátek proti tetanovému toxinu (ii) imunizované myši byly poté zcela chráněny před 150 % lethální dávky tetanového toxinu, která zabila všechny kontrolní myši (iii) buňky získané z sleziny a z cervikálních lymfatických uzlin intranasálně imunizovaných myší 6 týdnů po imunizaci vykazovaly silnou proliferativní reakci na Salmonelu typhi (Hd bičíky a fenolem inaktivované celé buňky Salmonely typhi), stejně jako na fragment c tetanového toxinu, nebo celý tetanový toxin.

Tato zjištění byla rozšířena dále testováním imunogenicity u myší s novými oslabenými kmeny Salmonely typhi nesoucími plazmidy obsahující geny kódující cizorodé antigeny (tzn. fragment C tetanového toxinu) pod kontrolou prokaryotického nebo eukaryotického promotoru.

A. Imunitní reakce vyvolaná imunizací oslabenými kmeny Salmonely typhi nesoucími prokaryotické a eukaryotické expresní vektory kódující fragment C tetanového toxinu Pozorování, že imunitní reakce může být vyvolána přímou imunizací plazmidovou DNA (Ulmer et al., Science, 259:1475-1749 (1993)), vedlo ktomu, že některé vektory znukleových kyselin kódující cizorodé antigeny, začaly být testovány jako potenciální vakcíny. Použití DNA vakcín vede k vyvolání silné jak protilátkové, tak buněčné imunitní reakce, při použití plazmidů kódujících řadu virových antigenů, jako jsou NP nebo chřipkový virus typu A (Ulmer et al, viz výše). Díky těmto starším objevům některé nukleové kyseliny kódující cizorodé proteiny bély testovány jako možné vakcíny. DNA vakcinace byla velmi intenzivně testivána zejména s antigeny chřipkového viru. Byla prokázána ochranná imunitní reakce u myší (Fynan et al, Proč. Nati. Acad. Sci., U.S.A., 90:11478-11482 (1993a); Justewicz et al (1995), supra; Justewicz et al, Virol., 224:10-17 (1996)), fretek (Webster et al, Vaccine, 12:1495-1498 (1994)), kuřat (Fynan et al, DNA Cel 1 Biol., 12:785-789 (1993b); Fynan et al (1993a), supra) a primátů (Donnelly et al, Nat. Med., 1:583-587 (1995)) po intramuskulámí, nebo epidermální (gene gun) imunizaci eukaryotickým expresním vektorem kódujícím antigeny chřipkového viru. Imunitní reakce proti některým dalším antigenům jiných virů (Cox et al, supra; Davis et al (1996a), supra, Donnelly et al, supra; Lagging et al, supra; Wang et al, Virol., 211:102-112 (1995); Zarozinski et al, supra); parazitů (Doolan et al, J. Exp. Med., 183:1739-1746 (1996); Gardner et al, J. Pharm: Sci., • ·

85:1294-1300 (1996); Hoffman et al, Vaccine, 12:1529-1533 (1994); Sedegah et al, supra; Yang et al, supra); baktérií (Anderson et al, Infect. Immun., 64:3168-3173 (1996); Barry et al, supra; Huygen et al, Nat. Med., 2:893-898 (1996); Luke et al, J. Infect. Dis., 175:91-97 (1997); Tascon et al, Nat. Med., 2:888-892 (1996)); nádorových buněk (Conry et al, Cancer Res., 54:1164-1168 (1994); Conry et al (1995), supra; Wang et al, Human Gene Therapy, 6:407-418 (1995)) byla rovněž vyvolána DNA vakcínou na různých zvířecích modelech. Tyto studie pomáhají pochopit povahu imunitní reakce vyvolané DNA vakcínou. Například silná protilátková odpověď byla vyvolána u myší proti povrchovým antigenům viru Hepatitidy B (HbsAg) po aplikaci jedné dávky plazmidu kódujícího tento antigen (Davis et al., Hum. Mol. Genet., 2:1847-1851 (1993), Michel et al., Proč Nati. Acad. Sci., USA, 92:5307-5311 (1995)). V těchto studiích byl maximální titr IgG protilátek pozorovatelný 4 až 8 týdnů po imunizaci a setrvává na této hladině po dobu 6 měsíců. U DNA vakcíny kódující tento antigen bylo také prokázáno, že je efektivní pro indukci protilátkové odpovědi a MHC I cytotoxické odpovědi u myší, které normálně nereagují na přečištěný HbsAg (Davis et al., (1996b), viz výše a Schrimback et al, J. Virol., 69:5929-5934 (1995)). Tedy, alespoň v případě HbsAg byla u DNA vakcíny prokázána schopnost překonat genetické omezení u myší a vyvolat lepší preventivní imunitní reakci, než parenterální aplikací přečištěného proteinu.

Tetanový toxin (TT) je silný neurotoxin syntetizovaný Clostridiem tetani. Ochranná imunita proti tetanu u lidí a u zvířat odpovídá titru neutralizačních protilátek v séru (Bizzini, Clostridium tetani, Gyles et al., (Eds), Iowa State University Press, Ames, IA, str. 97-105 (1993) a Habig et al., Vaccines and Immunotherapy, Cryz (Ed), Pergamon, New York, pages 13-19 (1991)). Tedy dobré ochranné imunitní reakce je možno dosáhnout parenterální imunizací inaktivovaným tetanovým toxinem nebo jeho netoxickými deriváty. Stanovení účinnosti této vakcíny je dobře zavedený postup a je popsán v European and British Pharmacopoeias (Coster et al., Lancet, 345:949-952 (1995) a Sanchez et al, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 89:542-545 (1995)). Hladina protilátek proti tetanovému toxinu je tradičně stanovena pomocí techniky neutralizace toxinu u myší. V posledních letech byly vyvinuty ELISA testy, které jsou rychlejší a levnější a dobře odpovídají výsledkům neutralizačního testu (Manghi et al., J. Immunol. Methods, 168:1724 (1994), Melville-Smith, Diptheria and Tetanus Antitoxins, Wreightt et al., (Eds.), ELISA in the Clinical Laboratory Service, London, str. 136-147 (1990)). Titr protilátky proti toxinu je v séru normálně stanoven v IU/ml (kde 0,1 IU/ml lidského séra je dostatečné množství pro ochranu proti napadení tetanovým toxinem) pro srovnání s mezinárodním standardem anti-TT séra (WHO). Účinnost vakcíny (vyjádřená v IU/ml) může být tedy porovnána pro různé druhy vakcín. V současné době, je vakcína proti tetanu připravena pomocí formaldehydové inaktivace • ·

tetanového toxinu z Clostridia tetani, což je velmi zdlouhavá a technicky náročná práce. Proto je žádoucí hledat další možné detoxifíkované varianty tetanového toxinu pro vakcinace. TT se skládá z 15 kDa proteinu obsahujícího 50 kDa lehký řetězec (L) disulfidicky navázaný na těžký (H) řetězec (Helting et al., J. Biol. Chem., 252:187-193 (1977a) a Nieman et al., Molecular Biology of Clostridial Neurotoxins, Alouf Ed., Sourcebook of Bacterial Protein Toxins, Academie Press, London (1991)). Toxicita tohoto proteinu je dána lehkým řetězcem, na zinku závislou proteázou (Schiavo et al., EMBO J. 11:3577-3583 (1992)), která zabrání uvolnění inhibitoru z neuronu proteolýzou synaptobrevinu (Schiavo et al., Nátuře (London), 359:832-835 (1992)). Těžké (H) řetězce iniciují průnik toxinu presynaptickou membránou (Helting et al, J. Biol. Chem. 252:194-197 (1977b) Morris et al., J. Biol. Chem., 255:6071-6076 (1980)). Štěpení molekyly toxinu pomocí papainu dá vzniknout 50 kDa polypeptidu, který odpovídá Cterminálnímu konci H-řetězce a 100 kDa molekule, která odpovídá L řeyězci připojenému na Nterminální konec H řetězce (Helting et al, (1977a) viz výše). Tento 50 kDa polypeptid označovaný jako TT fragment C (FC) je netoxický, ale váže gangliosidy (Halpern et al., (1980) viz výše, Moris et al., (1980 viz výše) a más schopnosti vázat některé proteiny (Schiavo et al, FEBS. Lett. 290:227-230 (1991)). V dřívějších studiích, byla vakcinace zvířat s FC získaným proteolýzou nativního toxinu, prokázána jako protektivní proti následnému podání lethální dávky tetanového toxinu (Helting et al, (1977a) viz výše). Navíc studie s monoklonálními protilátkami prokázaly, že neutralizační epitopy leží na této molekule (Kenimer et al., Infect. Immun. 42:942948 (1983)). Molekula FC byla tedy vhodným kandidátem pro přípravu alternativních vakcín proti tetanovému toxinu.

Poslední výsledky ukazují, že intramuskulární imunizace palsmidem kódujícím fragment C tetanového toxinu pod kontrolou (Helting et al, (1977a) viz výše) promotoru/enhanceru (pcDNA3/tetC) indukuje tvorbu vysokého titru sérových protilátek proti fragmentu C, stimuluje proliferativní reakci a produkci interferonu γ. Navíc bylo prokázáno, že tyto myši jsou rezistentní k lethální dávce tetanového toxinu (Anderse et al., viz výše).

Ve snaze dále zjistit, zda imunogenicita a ochranná kapacita pcDNA3/tetC může být ještě více optimalizována, byla odstatrována série pokusů s doručováním tohoto konstruktu do buněk hostitele pomocí oslabených knemů Salonely typhi. Jednalo by se o zcela nový transportní systém pro DNA vakcíny proti bakteriálním a jiným infekčním chorobám.

Popis těchto pokusů, včetně popis konstrukce pcDNA3/tetC je popsán dále.

• · • ·

1. Gen kódující fragment C tetanového toxinu

Sekvence genu kódujícího tetanový toxin je dobře popsaná v současném stavu techniky (Eisel et al, EMBO J., 5:2495-2502 (1986); Fairweather et al, J. Bacteriol., 165:21-27 (1986); Fairweather et al, Nucleic. Acids Res., 14:7809-7812 (1986)). Plazmidové vektory kódující nativní podobu fragmentu C pod kontrolou P_tac byly již dříve prokázány, jako schopné indukovat v malém množství tvorbu FC u Escherichie coli (3 až 4 % tep) (Makoff et al., Bio/Technology, 7:10431046 (1989)). Za účelem zvýšení míry exprese byl kodónový přepis sekvence kódující fragment C (je bohatý na A a T) optimalizován pro Escherichii coli. Výsledný z 99 % umělý gen kódující fragment C (tetC) zvýšil míru exprese (11 až 14 % tep) v Escherichii coli (Makoff et al., Nucleic Acids Res., 17:10191-10202 (1989)). To vedlo k testování dalších expresních systémů s úmyslem zvýšit míru exprese a vyprodukovat větší množství fragmentu C pro očkování. Přípravky obsahující rekombinantní fragment C izolovaný z kvasinek (Clare et al., Biotechnology (NY), 9:455-460 (1991) Romanos et al, Nucleic Acids Res., 19:1461-1467 (1991)) a hmyzích buněk v kultuře (Charles et al., Infect immun., 59:1627-1632 (1991)), byly také uznány za efektivní a schopné indukovat ochrannou imunitu proti tetanovému toxinu po parenterální imunizaci. Je zajímavé, že stejně jako v případě Escherichie coli, nativní gen Clostridia tetani kódující fragment C nemohl být exprimován v Sacharomycetes cerevisiae a musel být exprimován gen s optimalizovanou kodónovou sekvencí zpTETtacll5. Umělý fragment C, který byl v zápisu kodónů optimalizován pro expresi v Escherichii coli se zdá být náhodně optimalizován i pro expresi v eukaryotních buňkách.

2. Konstrukce pTETnirl5

Stabilně vysoká míra exprese cizorodého antigenu in vivo, může být narušena některými událostmi jako je ztráta kódujícího plazmidu, nebo neschopností předložit tento antigen imunitnímu systému. Proto se používá několika postupů, které stabilizují plazmid in vivo. Jednou z těchto možností je použít in vivo indukovatelné promotory, jako je např. nirB promotor. Tento promotor pochází původně z Escherichia coli, kde kontroluje expresi operonu kódujícího např. NADH-dependentní nitrát reduktázu, gen nirB. Jeho exprese je indukována nitráty a mění se s tlakem kyslíku v prostředí a maximální aktivity dosahuje v anaerobním prostředí. Byly připraveny modifikované verze nirB promotoru, které indukují expresi, pokud bakterie roste v atmosféře s omezeným přísunem kyslíku, nebo pokud in vitro vstoupí do eukaryotické buňky. Byly připraveny homologní Col-El plazmidy exprimující fragment C s nirB a nebo tac promotory. Tyto kmeny vykazovaly vysokou schopnost indukovat ochrannou reakci proti tetanovému toxinu po orální imunizaci. Dvě dávky kmene stač promotorem zajistily • · ·· · · · · · ·· « · · · ··· · · ·· · • · · · · ···· • · · · · ······ ··· · · ···· ···· ·» ··· ···· ·· ·· kompletní ochranu, zatímco kmeny snírB promotorem indukovaly dostatečnou ochrannou imunitní reakci již po první dávce. Z toho vyplývá, že nirB konstrukt je lepší a stabilnější in vivo než tac konstrukty (Chatfield et al., Biotechnology, 10:888 (1992b)).

3. Konstrukce pcDNA3/tetC

Konstrukce a charakterizace plazmidu pcDNA3/tetC byla provedena podle návodu uvedeného v Anderson et al., viz výše, která je zde uvedena jako reference.

4. Imunizace Salmonelou typhi CVD915 nesoucí pcDNA3/tetC nebo pTETnirl5

Jak je uvedeno výše, studie probíhaly, aby byla prověřena schopnost oslabených řetězců Salmonely typhi doručovat prokaryotické a eukaryotické expresní vektory kódující cizorodé antigeny, např. fragment C tetanového toxinu, savčímu imunitnímu systému a tak indukovat ochrannou imunitní reakci. Pro srovnání tohoto systému s tradiční imunizací „nahou“ DNA byla srovnávána vyvolaná imunitní reakce i pro samostatný pcDNA3/tetC plazmid.

Plazmidy pcDNA3/tetC a pTETnirl5 byly pomocí elektroporace zavedeny do CVD915. Struktura přečištěných plazmidů byla potvrzena dělením produktů štěpení restrikčních endonukleáz na agarózovém gelu: pcDNA3 a pcDNA3/tetC pomocí HindlII a Xbal a pTETnirl5 s EcoRI a BamHI. Exprese fragmentu C byla potvrzena SDS-page elektroforézou a imunoblotingem. Bakteriální vzorky byly namnoženy do stacionární fáze a 1,0 ml alikvoty byly sebrány centrifugací a rozpuštěny v 200 μΐ SDS pufru. Tyto vzorky byly poté použity pro SDSpage elektroforézu a Western bloting. Myší monoklonální protilátka proti fragmentu C a křenovou peroxidázou značená kozí protilátka proti myšímu imunoglobulinu byly použity pro detekci. Každý vzorek byl použit v koncentraci asi 1,0 x 10⁸ cfu/jamku.

Pro imunizaci byla použita intranasální cesta jak pro živý vektor CVD915 nesoucí oba plazmidy CVD915- pcDNA3/tetC a CVD915- pTETnirl5. Pro imunizaci čistým plazmidem byla použita intramuskulámí aplikace (pcDNA3/tetC).Myši kmene Balb/C byly imunizovány podle schématu uvedeného v tabulce 4:

skupina	počet myší	imunogen	způsob imunizace	první dávka	druhá dávka
1	10	CVD915- pcDNA3/tetC	intranasálně	5,9 x 109 cfu	11 x 109 cfu
2	10	CVD915-pTETnirl5	intranasálně	5,0 x 10y cfu	6,3 x 109 cfu
3	10	CVD915	intranasálně	6,5 x 109 cfu	5,25 x 109 cfu
4	10	pcDNA3/tetC	intramuskulámě	98 pg	95 pg
5	5	PBS	intranasálně	25 pl	5,0 μΐ

5. Protilátkové odpověď

Zvířatům byla odebírána krev z retroorbitální žíly podle následujícího protokolu:

(a) před imunizací (b) 14 dní po imunizaci 36 dní po imunizaci (c) 14 dní po podání druhé dávky 28 dní po podání druhé dávky 42 dní po podání druhé dávky dní po podáni druhé dávky (utracení zvířat)

Celkové množství protilátek proti fragmentu C v séru bylo stanoveno pomocí ELISA techniky. Zjednodušeně, pro pokrytí ELISA destiček byl použit rekombinantní fragment C v koncentraci 4,0 pg/ml. Séra byla naředěna dvojkovou řadou na osm koncentrací. Množství protilátek vyjádřené jako IU bylo srovnáno s dřívější kalibrací standartního séra. Standartní sérum bylo připraveno imunizací myší adsorbovaným tetanovým toxoidem čtyřikrát po sobě v intervalu dvou týdnů. Séra byla smíchána a titrována v in vivo neutralizačním testu u myší podle postupu popsaném v European Pharmacopoeia. Hodnota mezinárodních neutralizačních jednotek byla stanovena podle Mezinárodních standardů pro tetanový antitoxin. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 6.

Jak ukazuje obr.6, ačkoliv pomocí CVD915- pcDNA3/tetC byla indukována tvorba protilátek poněkud vyšší, velmi vysoké titry sérových protilátek proti fragmentu C (1000 až 2000 násobně výše než je ochranná hladina protilátek proti tetanovému toxinu u lidí) byly pozorovány po imunizaci a jedné sekundární dávce CVD915-pTETnirl5 tak CVD915-pcDNA3/tetC konstruktů. Pozorovaná hladina sérových protilátek proti fragmentu C dosahovala až 20 IU/ml což odpovídá konci ředící řady asi 1:50 000. Naopak relativně nízké množství protilátek proti fragmentu C (asi 50-ti násobek ochranné hladiny protilátek proti tetanovému toxinu u lidí, bylo pozorováno po imunizaci čistým plazmidem pcDNA3/tetC. Množství protilátek proti fragmentu C dosáhlo maxima 50-tý den po první imunizační dávce a zůstalo na této hladině alespoň 92 dní poté, což byl poslední sledovaný časový úsek. Žádná reakce nebyla zjištěna u myší imunizovaných samotným kmenem CVD915.

6. Buňkami zprostředkovaná imunitní reakce: proliferační technika dní po imunizaci, byly připraveny směsi suspenzí buněk z cervikálních lymfatických uzlin, mezenterických lymfatických uzlin a sleziny z 5 až 7 myší ze všech výše uvedených skupin.

Byla také připarvena buněčná suspenze z ingvinálních lymfatických uzlin izolovaných z myší imunizovaných pouze čistým plazmidem pcDNA3/tetC. Byly získány následující průměrné výtěžky:

cervikální lymfatické uzliny: mezenterické lymfatické uzliny: ingvinální lymfatické uzliny slezina:

6.6 x 10⁶ buněk/myš 10,1 x 10⁶ buněk/myš

1.6 x 10⁶ buněk/myš

52,5 x 10 buněk/myš

Pro měření proliferační aktivyty byly buňky přeneseny do kompletního RPMI média (RPMI obsahující 10 % (v/v) fetálního telecího séra, glutamin a antibiotika) a inkubovány v nožství 2,0 x 10⁵ buněk/jamku v tripletech v 96 jamkových destičkách v nepřítomnosti nebo v přítomnosti antigenu. Pro tuto studii byly použity následující rozpustné antigeny: hovězí sérový albumin (BSA), fragment C tetanového toxinu a vysoce přečištěné bičíky ze Salmonely typhi v koncentracích 0,02, 0,2 a 2,0 pg/ml. Po pěti dnech inkubace při 37 °C v 5 % CO2 byl ke kultuře přidán H thymidin a po 18 hodinách byla kultura harvestována.

Míra inkorptorace thymidinu byla stanovena měřením v kapalném scintilátoru. Výsledky uvedené na obrázcích 7 a 8 Jsou uvedeny jako stimulační index (S.I.).

Jak ukazuje obrázek 7, imunizace pomocí CVD915(pTETnirl5) a CVD915 (pcDNA3/tetC) konstruktů, stejně jako pomocí čistého plazmidu pcDNA3/tetC indukuje vznik aktivovaných lymfoidních buněk, které proliferují v reakci na fragment C tetanového toxinu. Tato proliferativní reakce byla pozorována u buněčné populace izolované z cervikálních lymfatických uzlin a sleziny, ne však u buněk izolovaných z mezenterických lymfatických uzlin. Specifická proliferativní reakce byla také pozorována proti tetanovému toxinu. Žádný nárůst proliferativní aktivity proti fragmentu C nebo tetanovému toxinu (> 3 S.I.) nebyl pozorovatelný u buněk izolovaných z myší imunizovaných CVD915 nebo PBS.

Jak ukazuje obrázek 8, proliferativní reakce na bičíky Salmonely typhi byly pozorovány u buněčných populací izolovaných z myší imunizovaných CVD915, CVD915(pTETnirl5) a CVD915 (pcDNA3/tetC) konstrukty. Jak je ukázáno na obrázku 8, tato reakce byla pozorovatelná u všech populací izolovaných z myší imunizovaných CVD915 a u lymfoidních buněk izolovaných z myší imunizovaných CVD915(pTETnirl5) a CVD915 (pcDNA3/tetC) konstrukty. Podstatně nižší proliferativní reakce byla pozorována u splenocytů a buněk z mezenterických lymfatických uzlin izolovaných z myší imunizovaných CVD915(pTETnirl5) a CVD915 (pcDNA3/tetC) konstrukty. Díky technickým obtížím, nejsou uvedena žádná data týkající se proliferativní reakce na bičíky Salmonely typhi u myší imunizovaných samotným plazmidem pcDNA3/tetC. Je zajímavé, že u buněk izolovaných z igvinálních lymfatických uzlin • · myší imunizovaných i.m. samotným plazmidem pcDNA3/tetC nebyla prokázána žádná specifická proliferativní reakce na žádný z testovaných antigenů. U žádné z testovaných skupin nebyla pozorována proliferativní reafkce na BSA.

7. Porovnání sérových protilátek třídy IgG proti Salmonelovému LPS a proti bičíkům Salmonely typhi indukovaných intranasální imunizací CVD915 a CVD908-htrA

Jedním z nej důležitějších parametrů při vývoji nové vakcíny je porovnat vyvolanou imunitní reakci (např. CVD915) vzhledem k zatím nejlepší navrhované vakcíně (např. CVD908-htrA) pro kterou je dostupné co největší množství experimentálních dat. Skupina 10 myší kmene Balb/C byla imunizována intranasálně 10^1θ cfu z oslabeného kmene CVD915 nebo CVD908htrA, dvojí dávkou po 36 dnech. Před imunizací byla myším odebrána krev (den 0) a ve dnech 35, 55 a 95 (pouze CVD915). Titr protilátek proti LPS a proti bičíkům byl stanoven pomocí ELISA techniky jak popisuje Tacket et al (1977), viz výše. Zkráceně, ELISA destičky byly potaženy 5,0 μg jednotlivých antigenů, a vzorky sér byly testovány v 8 ředěních dvojkovou řadou. Titr protilátek byl stanoven jako ELISA jednotky/ml, které jsou definované jako převrácený ředící poměr který má absorbanci 0,5 při 492 nm. Výsledky jsou zobrazeny jako obr. 9 a 10.

Jak ukazují obr. 9 a 10 v případě LPS i bičíků ze Salmonely byly v obou případech naměřeny velmi blízké hodnoty titru specifických protilátek.

PŘÍKLAD 5. Příprava oslabených kmenů Salmonely typhi stabilně exprimujících Vi antigen

A. Příprava kmenů Salmonely typhi (CVD916 a CVD909), které stabilně exprimující Vi antigen Aby byla exprese Vi antigenů změněna na stabilní místo osmoticky regulované, bylo třeba se zaměřit na promotor vipR (obr. 1 A). Je pravděpodobné, že produkty vipR a ompR-envZ dosahují své regulační aktivity vazbou na protisměrnou oblast vipR (Hashimoto et al., (1996) viz výše). Díky tomu je možno, jak popisuje navrhovaný vynález, náhradou vipR promotoru za jiný silný promotor, např. P_tac, potlačit supresivní vliv vipR promotoru a tím dosáhnout kontroly nad expresí Vi antigenů. Promotor P_tac je u druhu Salmonela stabilní neboť tyto organismy postrádají laql. Stabilní exprese Vi antigenů u kmenů příbuzných CVD915 a CVD908-htrA byla proto zajištěna tímto způsobem.

V první fázi, byla do vipR zavedena delece a zároveň byla vložen pozitivně nebo negativně selekční znak, např. sacB-neo kazeta, která nahradila promotorovou oblast vipR (obr. 1 A). Konkrétně, segment o 601 bp těsně proti směru -35 oblasti promotoru vipR byla namnožena z genomové DNA divokého kmene Salmonely typhi Ty2 za použití primerů:

'-GGGGGAGCTCAATTCTGCAAACCAGCCCTGTACCATCAAGTTCATA-3' (sekvence č. 7) a '-CCTCATCCCGGGCCCGAGTCCACCTGCACAATTCATTGTTTGTACCTATC-3' (sekvence č.8).

Těchto prvních namnožených 601 bp (segment A) bylo klonováno za použití pGEM-T kitu Vector System (Promega, Madison, WI) což dalo vzniknout pGEM-T::fragment A konstruktu. Tento systém zahrnuje otevřený plazmid (pGEM-T) s 3'-T přesahem do inzerčního místa, což zlepšuje efektivitu ligace PCR produktů. Konstrukt pGEM-T::fragment A je poté rozstřižen Sstl a BamHI a vklonován do Sstl a BamHI míst proti směru P_tac v pBS::P_tac (tento plazmid je získán vklonováním promotoru P_tac do BamHI - EcoRI místa pBluescript (Stratagen)), čímž vznikne pBS:: segment A-P_tac.

Zároveň segment 770 bp segment vipR (včetně iniciačního kodónu vipR) (segment B) byl namnožen ze stejné genomové DNA kmene Ty2, za použití primerů: 5'-GCAGGTGGATCCGGGCCCGGGATGAGGTTTCATCATTTCTGGCCTCCGAATGAT ATC-3' (sekvence č. 9) a

5'-ATCCTTGAATTCGGGGGATCCTACTAAAATTTTATATTTACAAAGTTAATTCTAG GT-3' (skvence č. 10). S těmito primery byla zavedena jedinečná restrikční místa Sstl, EcoRI, BamHI a Smál (podtržena) pro účely klonování. Namnožený segment B byl nejprve vklonován do pGEM-T, za použití pGEM-T kitu Vector System čímž vznikl pGEM-T::segment B. Tento plazmid byl naštěpen EcoRV a Sáli a vzniklý fragment byl klonován do EcoRV a Sáli míst na pBS::segment A-P_tac těsně po směru od P_tac. Vzniklý plazmid nazvaný pBS::P_tac-vipR, obsahuje segment A-P_tac-segment B, a je vněm vnesena delece 167 bp, v -35, -10 a vribozomální vazebné oblasti vipR promotoru. Při konstrukci pBS::P_tac-vipR, byla delece ve vipR promotoru efektivně nahrazena 257 bp inzercí obsahujícíc -35, -10 a ribozomální vazebnou oblast tac promotoru.

Zároveň byla připravena další kazeta inzercí sacB-neo mezi segment A a segment B, jak jsou popsány výše. Původní fragmenty A a B byly fúzovány PCR za použití obou fragmentů jako templátů a oligonukleotidů podle sekvence č.7 a 10 jako primerů, jak popisuje Noriega et al., (1996) viz výše. Vzniklý namnožený fúzovaný fragment A-B byl klonován do pGEMT::fragment A - fragment B. Sekvence sacB-neo byla získána štěpením pIB729 pomocí Smál (Blomfield et al., viz výše) a vložena do Smál místa na pGEM-T::fragment A - fragment B. Vzniklý plazmid byl označen pGEM-T: :vipR::sacB-neo. Tento plazmid byl naštěpen Sstl, což efektivně vyjmulo vipR::sacB-neo alelu, která byla poté vklonována do Sstl místa sebevražedného vektoru pJG14, čímž vznikl pJG14::vipR::sacB-neo. Plazmid pJG14 je teplotně citlivý, pSCIOl původu, chloramfenikolem selektovatelný, sebevražedný plazmid (Galen et al., 96th General Meeting, American Society for Microbiology, Abstract, page 529-H260 (1996)). Navíc, Sstl štěpená vipR::sacB-neo alela byla vklonována do Sstl místa sebevražedného vektoru pKINÍ701 (Hone et al., (1991) viz výše), čímž vznikl pKT::vipR::sacB-neo. Kmen CVD915 Salmonely typhi byl transfekován elektroporací pJG14::vipR::sacB-neo. Zároveň byl kmen CVD908-htrA transfekován elektroporací pKT::vipR::sacB-neo. Mezi pJG14::vipR::sacB-neo a vipR genem Salmonely typhi kmene CVD915 došlo khomologní rekombinaci, za použití techniky popsané v Noriega et al., (1996, viz výše, a mezi pKT::vipR::sacB-neo a vipR genem Salmonely typhi kmene CVD908-htrA, za použití techniky popsané v(Hone et al., (1991) viz výše), s tou výjimkou, že mutanty s dvojitým cross-overem byly odstraněny izolací kanamycin rezistentních, chloramfenikol senzitivních klonů. Vzniklé kmeny, příbuzné kmenů Salmonely typhi CVD915 a CVD908-htrA, neexprimovaly Vi antigen díky inzerci/deleci ve vipR alele.

Ve druhé fázi byl stabilní P_tac promotor nahrazen za sacB-neo inzercí v vipR lokusu nových mutant kmenů Salmonely typhi CVD915 a CVD908-htrA (obr. 1B). Konkrétně byl P_tac-vipR segment v pBS::P_tac-vipR klonován do BamHI - EcoRI místa pJG14, čímž vznikl pJG14::P_tacvipR. Plazmid pJG14::Pt_ac-vipR byl poté použit pro záměnu P_tac za sacB-neo kazetu u nových mutant kmenů Salmonely typhi CVD915 a CVD908-htrA pomocí homologní rekombinace, jak je popsána výše. Oddělení mutant s dvěma cross-overy bylo provedeno pomocí negativní selekce při použití toxicity sacharózy dané sacB, a obrácenou selekcí rezistence ke kanamycinu. Vzniklý kmen odvozený od CVD915 byl označen CVD916 a byl uložen v American Type Culture Collection v květnu 1998, pod ATCC číslem 202116. Nový kmen odvozený od CVD908-htrA byl označen CVD909 a byl uložen v American Type Culture Collection v květnu 1998, pod ATCC číslem 202117.

Genotypizační potvrzení P_tac inzerce v obou kmenech bylo provedeno pomocí PCR, které potvrdilo jeho inzerci na správném místě.

B. Stabilní exprese Vi antigenu kmeny CVD916 a CVD909

Fenotypizace stabilní exprese Vi antigenu na nových kmenech byla provedena pomocí aglutinace baktérií rostoucích při různé osmolaritě v přítomnosti komerční anti-VI protilátky (Difco). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5, dále.

Tabulka 5. Aglutinace pomocí specifického anti-Vi séra

NaCI	kmen
CVD915	CVD916	CVD908-htrA	CVD909	Ty2
0,17 M	+++	+++	+++	+++	+++
0,3 M	+++	+++	+++	+++	+++
0,5 M	-	+++	+/-	+++	-
0,6 M	-	+++	-	+++	-
0,7 M	-	+++	-	+++	-

Jak je uvedeno v tabulce 5, divoký kmen Salmonely typhi Ty2 a oslabené kmeny CVD915 a CVD908-htrA, exprese Vi antigenů je vysoce závislá na osmolaritě média (dáno koncentrací NaCI). Naopak exprese Vi antigenů v kmenech CVD916 a CVD909 je vysoká, stabilní a změny osmolarity se na ní vůbec neprojevují.

PŘÍKLAD 6. Imunitní reakce na stabilně exprimovaný Vi antigen

Pokusné skupiny 6 týdnů starých myší kmene Balb/C byly imunizovány intranasálně 1,0 x 1O¹⁰ cfu kmene CVD915 nebo CVD916. Myším byla odebírána krev před a 30 dní po imunizaci a jejich séra byla až do testování zamražena při -20 °C. Pomocí ELISA techniky byl stanoven titr protilátek proti LPS a bičíkům Salmonely v séru imunizovaných myší, stejně, jak popisuje Tacket et al., (1997) viz výše. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6 dále.

Tabulka 6. Geometrický průměr titru sérových IgG protilátek protiantigenům Salmonely typhi po imunizaci jednou dávkou kemnů CVD915 a CVD916

	Specifické IgG protilátky proti
	Vi	LPS	H
kmen	den 0	den 30	den 0	den 30	den 0	den 30
CVD915	21	46	19	640	20	197
CVD916	26	* 109	17	747”	21	_ Ht 320

* p = 0,033 ** p = nevýznamné

Jak ukazuje tabulka 6, imunizace pomocí kmene CVD916 indukuje tvorbu protilátek proti Vi antigenu v takové míře, která je podstatně vyšší, než v případě kmene CVD915. Imunitní reakce proti jiným antigenům Salmonely typhi (LPS a H) byla podobná u obou porovnávaných kmenů. Výsledky dokazují, že stabilní exprese Vi antigenu zlepšuje imunitní reakci proti tomuto antigenu, aniž by ovlivnila imunitní reakci proti jiným anti genům přítomným na buňkách Salmonely typhi.

Přestože navrhovaný vynález je popsán velmi detailně s odkazy na konkrétní varianty navrhovaného vynálezu, každému odborníkovi v současném stavu techniky musí být jasné, zeje možno provést celou řadu modifikací, aniž by se vybočilo z rámce navrhovaného vynálezu.

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Oslabený mutovaný kmen Salmonely stabilně exprimující Vi antigen a jehož vipR promotor je nahrazen silným stabilním promotorem, tak aby byla zajištěna stabilní a stálá exprese viaB.
2. 2. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 1, kdy tento mutant je mutovaný kmen Salmonely typhi.
3. 3. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároků 1 a 2, kdy vipR promotor tohoto mutovaného kmene je nahrazen promotorem ze skupiny P^, P^, P_Oi_ac a Pi_pp, takovým způsobem, že to zajistí stabilní expresi viaB.
4. 4. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároků 1 a 2, kdy tento mutovaný kmen je neschopen vyrábět de novo nukleotidy obsahující guanin, díky mutaci v guaB-A operonu.
5. 5. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 4, kdy výše popsaná mutace v guaA-B operonu je deleční mutace a je umístěna buď v guaA genu, guaB genu nebo zároveň v genech guaA i guaB.
6. 6. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 5, kdy výše popsaná deleční mutace a je umístěna zároveň v genech guaA i guaB.
7. 7. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 6, kdy fenotyp tohoto mutovaného kmene je aro‘.
8. 8. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 2, kdy tento mutovaný kmen Salmonely typhi je odvozen od rodičovského kmene Salmonely typhi CVD915 (ATCC č. 202115).
9. 9. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 2, kdy tento mutovaný kmen Salmonely typhi je kmen Salmonela typhi CVD916 (ATCC č. 202116) nebo kmen Salmonela typhi CVD909 (ATCC č. 202117).
10. 10. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 1, kdy tento mutovaný kmen kóduje a exprimuje cizorodý antigen.
11. 11. Oslabený mutovaný kmen Salmonely podle nároku 1, kdy tento mutovaný kmen obsahuje plazmid, který kóduje a exprimuje cizorodý antigen v eukaryotické buňce.

    ·< ·· • ·· ·* ·· ·· · · · · · · • · · · · · • ······ • · · · · · ··«*··· · · ··
12. 12. Vakcína proti břišnímu tyfu, která obsahuje:

    (A) farmaceuticky efektivní množství oslabené mutované Salmonely typhi, která na svém povrchu stabilně exprimuje Vi antigen a jejíž vipR promotor je nahrazen silným stabilním promotorem, tak aby byla zajištěna stabilní a stálá exprese viaB (B) farmaceuticky přijatelné rozpouštědlo, nebo nosič
13. 13. Vakcína podle nároku 12, kde vipR promotor tohoto mutovaného kmene je nahrazen promotorem ze skupiny P_tac, P_trc, Poiac a Pi_pp, takovým způsobem, že to zajistí stabilní expresi viaB.
14. 14. Vakcína podle nároků 12 nebo 13, kde tento mutovaný kmen je neschopen vyrábět de novo nukleotidy obsahující guanin, díky mutaci v guaA-Β operonu.
15. 15. Vakcína podle nároku 14, kde výše popsaná mutace v guaA-Β operonu je deleční mutace a je umístěna buď v guaA genu, guaB genu nebo zároveň v genech guaA i guaB.
16. 16. Vakcína podle nároku 15, kde výše popsaná deleční mutace a je umístěna zároveň v genech guaA i guaB.
17. 17. Vakcína podle nároku 16, kde fenotyp tohoto mutovaného kmene je aro'.
18. 18. Vakcína podle nároku 12, kde tento mutovaný kmen Salmonely typhi je odvozen od rodičovského kmene Salmonely typhi CVD915 (ATCC č. 202115).