CZ20004159A3 - Kombinace vhodná pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu a její použití - Google Patents

Abstract

Kombinace vhodná pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu, která obsahuje i) imunogen zaměřený proti růstu tohoto nádoru a ii)jedno nebo více chemotherapeutických činidel pro jeho léčbu. Použití této kombinace pro výrobu přípravku pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká kombinace vhodné pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu a jejího použití pro výrobu farmaceutického přípravku. Při léčení pomocí kombinace podle vynálezu dochází k neutraliozaci peptidových hormonů stimu1jících růst v kombinaci s chemotherapií.

Dosavadní stav techniky

Gastrin je peptidový hormon, který se vyskytuje ve dvou zralých formách, jako tetratriacontagastrin (G34) a heptadekagastrin (G17), a je syntetizován a secernován specializovanými buňkami, které se vyskytují v antru žaludku. V buňkách produkujících gastrin jsou tyto gastrinové hormony postratslačně zpracovávány ze společné prekursorové molekuly označované jako preprogastrin, která obsahuje signální peptid. Signální peptid pre je odstraněn v endoplasmatickém retikulu buněk, což vede ke vzniku progastrinového peptidu, který je buňkami dále zpracováván za vzniku zralých gastrinů G34 a G17 před tím, než je secernován do krevního řečiště (Dickinson, 1991) (úplné Odkazy jsou uvedeny v části Odkazy před patentovými nároky) . Obě zralé formy G34 a G17 jsou amidované na svých karboxy-koncích (-NH2) . U člověka byly zjištěny mnohé formy G17, které vznikají v důsledku různého zpracování prekursorové molekuly, a každá z nich má různé biologické aktivity (Dickinson, 1995, a Ciccotosto et al.,

1995). Při post-translačním zpracování gastrinu je to zralá karbóxy-terminálně amidovaná forma, která se váže na specifický buněčný receptor, takzvaný CCK-B/gastrinový receptor, prostřednictvím karboxy-konce peptidu (Kopin et al.,

1992) .

• · • ·

Gastrinové hormony jsou secernovány do cirkulující krve a váží se na specifické buňky v žaludku, konkrétně na enterochromafinním buňkám podobné buňky (ECL) a na parietální buňky, které nepřímo nebo přímo ovlivňují produkci žaludeční kyseliny. Historicky byly oba gastrinové hormony asociovány se stimulací sekrece kyseliny v žaludku (Edkins, J.S., 1905). V posledních letech byly nahromaděny důkazy, že gastrin působí také jako trofický faktor v gastrointestinálním traktu (Johnson, L., 1997) a že podporuje růst nádorů gastrointestinálního traktu (Watson et al., 1989, Dickinson, C.J., 1995), stejně jako nádorů mino gastrointestinální trakt, včetně malobuněčného karcinomu plic (Rehfeld et al., 1989).

Několik typů nádorů, včetně kolorektálního adenokarcinomu a adenokarcinomů žaludku, pankreasu a hepatocelulárního karcinomu, obsahuje CCK-B/gastrinové receptory na svých plasmatických membránách a nádorové buňky reagují na gastrin významnou proliferaci (Rehfeld, J.F., 1972, Upp et al., 1989 a Watson et al., 1993). Zvýšené plasmatické koncentrace celkového gastrinu se vyskytují u pacientů s kolorektálním karcinomem, a vysoká množství hormonálního prekursoru progastrinu byla detekována v mnoha kolorektálních karcinomech pomocí antiséra proti gastrinu (Ciccotosto et al., 1995). Nověji bylo zjištěno, že mnoho z těchto nádorových buněk také secernuje gastrin a tak způsobuje autonomní proliferační stimulaci (Van-Solinge et al., 1993, Nemeth et al., 1993, a Seva et al., 1994).

Peptidové hormony G17 a G34 se váží na CCK-B/gastrinové receptory na buněčných membránách normálních buněk. Nicméně, bylo zjištěno, že G17, ale ne G34, stimuluje gastrindependentní nádorové buňky. Zejména sérový G17 má potenciál endokrinně stimulovat růst kolorektálních nádorů prostřednictvím CCK-B/gastrinových receptorů na nádorových • ·· · · ···· • · · ·· · · ···· ···· · · · · · · • · · · · ······ • · · · · ···· • ·· ·· ··· · ·· · · ·· buňkách (Watson et al., 1993). Zejména se předpokládá účast G17 ve stimulaci růstu kolorektálních adenokarcinomů z důvodu zvýšené afinity CCK-B/gastrinových receptorů na nádorových buňkách, ve srovnání s jinými typy gastrinu (Rehfeld, 1972, a 1993). Bylo zjištěno, že CCK-B/gastrinové receptory jsou exprimovány ve vysoce afinitní formě na 56,7% lidských primárních kolorektálních nádorů (Upp et al., 1989).

Mnoho studií ukázalo, že kromě toho, že jsou schopné reagovat na exogenní gastrin, jsou buňky lidských kolorektálních a žaludečních nádorů schopné produkovat gastrin a jeho prekursory (Ciccotosto et al., 1995; Finley et al., 1993; Kochman et al., 1992; Nemeth et al., 1993; Van Solinge et al., 1993), a tak autokrinně stimulovat růst. Produkce gastrinu v nádorových buňkách se liší od produkce v endokrinních G buňkách. Přesněji, tyto nádorové buňky obsahují vyšší poměr prekursorového progastrinu spolu s nižšími koncentracemi zralého peptidu. Předpokládá se, že tento abnormální poměr je způsoben trvalým neregulovaným uvolňováním gastrinu spolu s omezenou aktivitou peptidoglycin-ci-amidující monoxygenasy (Ciccotosto et al., 1995; Kelly, 1985). Tak vede neregulované uvolňování gastrinu k abnormální produkci a sekreci různých molekulových forem hormonu. Konkrétně, buňky nádoru tlustého střeva nezpracovávají gastrin účinně, což vede k menší konversi gastrinu na zralé peptidy a tak k produkci většinou nekompletního nebo aberantního gastrinu (Dickinson, 1993, a Rehfeld et al., 1993). Kromě toho, zvýšené koncentrace gastrinu v kolorektálních nádorech jsou částečně způsobeny aberantní expresí genu pro gastrin v buňkách kolorektálních nádorů (Hoosein et al., 1990, Baldwin et al., 1992 a Finley et al., 1993). V těchto buňkách byly identifikovány peptidy podobné gastrinu (Hoosein et al., 1988, Watson et al., 1991) a bylo potvrzeno, že se jedná o prekursory gastrinu (Van Solinge et al., 1993, a Nemeth et al., 1993).

··· ·· «· ···« • · · · · · 9 · 9 ·

Přítomnost amidovaného G17 (G17-NH2) v některých kolorektálních nádorech (Ciccotosto et al., 1995; Van Solinge et al., 1993) dokazuje, že některé nádory si zachovávají intaktní dráhu zpracování, protože amidace gastrinu probíhá pouze v sekrečních granulích (Varro et al., 1994). Endogenně produkovaný gastrin působí také jako autokrinní růstový faktor, protože byla pozorována inhibice bazálního růstu kolorektální buněčné linie pomocí anti-gastrinové protilátky (Hoosein et al., 1988). Toto bylo potvrzeno ve druhé studii, ve které byla pomocí northernova přenosu zjištěna přítomnost gastrinové mRNA v některých buněčných liniích a radioimunotest ukázal gastrinu-podobnou imunoreaktivitu v supernatantu buněčných kultur (Hoosein et al., 1990). Gastrinové peptidy mají také parakrinní úlohu (Watson et al., 1991b), která byla potvrzena v pokusech (Finley et al., 1993) ukazujících gastrinovou imunoreaktivitu především v subpopulacích maligních kolorektálních slizničních buněk.

Po vazbě G17 na jeho receptor vznikne komplex G17/receptor, který stimuluje růst buněk prostřednictvím druhých poslů regulujících funkce buněk (Ullrich et al., 1990). vazba G17 na CCK-B/gastrinové receptory vede k aktivaci fosfatidylinositolové dráhy, k aktivaci proteinkinasy C s následným zvýšením nitrobuněčné koncentrace vápníkových iontů a k indukcí c-fos a c-jun protoonkogenů prostřednictvím mitogenem-aktivované proteinkinasy, o které se předpokládá, že se účastní regulace buněčné proliferace (Tadisco et al.,

1995). Kromě toho, vazba gastrinu na CCK-B/gastrinové receptory je spojena s následným zvýšením fosforylace tyrosinkinasou, ppl25FADK (fokální adhesní kinasa), která může mít také úlohu v přenosu mitogenních signálů (Tanaguchi et al., 1994) .

• · • · ·

Kolorektální nádory zůstávají špatným onemocněním pro léčbu, protože za poslední roky bylo dosaženo pouze malých zlepšení přežití. Chirurgie je účinnou léčbou pro primární onemocnění, ale je neúčinná pro léčbu zbytkového onemocnění, které je často přítomné. Radioterapie po chirurgické výkonu je obvykle doporučována pro pacienty s nádory konečníku pro snížení rizika recidivy onemocnění. Chemoterapie 5fluorouracilem (5-FU) je nejčastější účinnou terapií po chirurgickém zákroku u pacientů s pokročilejšími kolorektálními karcinomy. Nicméně, bylo prokázáno, že terapie 5-FU má pouze malý přínos pro pacienty, protože 5-FU je vysoce toxický a terapie je nákladná a nezdá se, že by - samostatně nebo v kombinaci s jinými cytotoxickými léky - významně prodlužovala přežití. Ve většině případů neodpovídají okultní nebo inoperabilní kolorektální nádory dobře na chemoterapii a ozáření a jsou potřeba nové způsoby léčby, které doplní dosavadní postupy.

Nedávno několik studií ukázalo, že adjuvantní kombinovaná chemoterapie 5-FU a leukovorinem zvyšuje účinnost 5-FU u pacientů s pokročilými kolorektálními karcinomy. Leukovorin je derivát kyseliny listové, také známý jako kyselina folinová, citrovorum faktor nebo kyselina 5-formyl-5,6,7,8tetrahydrolistová. Studie ukázaly, že u pacientů se stadiem Dukes C může kombinovaná terapie 5-FU/leukovorin snížit mortalitu o 10-15% (Moertel, 1994). Ve stejné skupině pacientů vedla kombinovaná intravenosní a intraperitoneální terapie 5-FU/leukovorinem k nesignifikantnímu trendu ke zlepšení přežívání bez známek onemocnění a celkového přežívání (Scheithauer et al., 1995). U pokročilého onemocnění může stejná kombinace léků zlepšit přežívání (Taylor, 1993), které bylo 13,5 měsíců (medián) ve skupině léčené kombinací ve srovnání s 7,5 měsíci ve skupině léčené 5-FU (Petrioli et al., 1995). Nicméně, tato kombinovaná chemoterapie není bez významné morbidity a způsobuje závažné nežádoucí účinky včetně stomatitidy, průjmu a myelosuprese (Mahhod et al., 1991; Erlichman et al., 1988; Pietnelli et al., 1989), což vyvolává otázku kvality života, zejména u pacientů s pokročilým onemocněním.

Mnoho vysoce afinitních antagonistů CCK-B/gastrinových receptorů bylo testováno na terapeutický účinek jak in vitro, tak in vivo, na mnoha experimentálních nádorech gastrointestinálního traktu. Například bylo prokázáno že, proglumid, derivát kyseliny glutamové (Seva et al., 190; Harrison et al., 1990; a Watson et al., 1991a); benzotript, N-acylový derivát tryptofanu; L365260, derivát aspercillinu (Bock et al., 1989) a CI-988, molekula, která napodobuje Ckoncovou pentapeptidovou sekvenci CCK (Hughes et al., 1990), účinně neutralizují efekty exogenního gastrinu na růst gastrointestinálních nádorů jak in vitro, tak in vivo (Watson et al., a Romani et al., 1994).Nicméně, tyto antagonisté mají významné toxické nežádoucí účinky a chybí jim specificita, protože blokují působení všech potenciálních ligandů receptorů, jako je G34 a CCK, na normálních buňkách. Nově byly také popsány vysoce účinné a selektivní molekuly antagonizující CCK-B/gastrinové receptory, jako je YM022 (Yuki et al., 1997) a YF476 (Takinami et al., 1997).

Proglumid a benzotript byly důkladně testovány v preklinických studiích. Hlavním problémem těchto sloučenin je jejich nedostatečná účinnost, která vyžaduje dosažení relativně vysokých koncentrací proo odstranění G17 (Watson et al., 1992a; Watson et al., 1992b). I přesto inhibují proglumid a benzotript bazální a gastrinem-stimulovanou proliferaci mnoha buněčných linií (Seva et al., 1990; Watson et al.,

1991a). Kromě toho, proglumid zvyšuje přežívání xenotransplantovaných myší nesoucích gastrin-sensitivní buňky

Ί « · · · · 9 9 ···· • · · · · 9 9 9 9

9 9 9 · ·«···« • · · · · · ·· · ··· 9· 999 ··· ·· ·* myších střevních nádorů MC26 na 39 dnů ve srovnání s 25 dny pro kontrolní zvířata.

Z důvodu nízké specificity této třídy činidel antagonizujících gastrin pro gastrin/CCK-B receptor se předpokládá, že inhibice růstu je také indukována působením nezávislým na gastrinových receptorech. Kromě toho, buněčné receptory, které rozpoznávají a váží gastrin neváží všechny testované inhibitory (Seva et al., 1994). Proto platí, že pokud nedojde k úplné inhibici vazby gastrinu na receptory v autokrinní růstové kaskádě, mohou být antagonisté gastrinu neschopni blokovat tento mechanismus stimulace růstu.

Proto existuje potřeba nových terapeutických přístupů, jak pro samostatnou terapii, tak pro kombinované terapeutické strategie s chemoterapií. Kombinovaná léčba může zvýšit terapeutický index a/nebo snížit nutné dávky chemoterapie, což omezí nepříznivé nežádoucí účinky.

Terapeutický způsob selektivní imunologické neutralizace biologické aktivity gastrinového hormonu bude účinným prostředkem pro kontrolu a nebo prevenci patologických změn vznikajících v důsledku nadměrné produkce gastrinového hormonu, které jsou spojeny s kolorektálními karcinomy.

Související U.S. patenty č. 5023077; 5468494; 5607676; 5609870 a 5622702 popisují imunogeny a imunogenní prostředky použitelné pro kontrolu koncentrace G17 a G34 u pacientů pomocí tvorby anti-gastrinových protilátek a také popisují použití takových prostředků pro léčbu žaludečních a dvanáctnikových vředů a nádorů indukovaných gastrinem.

Předkládaný vynález se týká použití anti-G17 imunogenu a imunogenních prostředků popsaných v patentech č. 5023077;

5468494; 5607676; 5609870 a 5622702 v kombinované terapii s ···· ·· ·* ·· ·· ··· chemoterapeutickými činidly pro léčbu kolorektálních karcinomů závislých na gastrinu.

Popsaný způsob protinádorové terapie má vůči dosavadním způsobům léčby kolorektálních karcinomů několik výhod. AntiG17 imunizace, v kombinaci s chemoterapeutickými činidly, jako je 5-FU a leukovorin, zvyšuje terapeutické účinky v kontrole nebo inhibici růstu kolorektálních nádorů, ve srovnání s chemoterapií samotnou.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je kombinace vhodná pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje

i) imunogen zaměřený proti růstu tohoto nádoru a ii) jedno nebo více chemotherapeutických činidel pro jeho léčbu.

Předmětem vynález je dále kombinace uvedená výše pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu u pacienta.

Konečně je předmětem vynálezu také použití kombinace uvedené výše pro výrobu přípravku pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu.

•ttt 9·

Předkládaný vynález poskytuje kombinovanou terapii pro léčbu nádorů, která obsahuje imunologickou neutralizaci peptidových hormonů a faktorů podporujících dělení buněk v kombinaci s chemoterapií. Přesněji, předkládaný vynález poskytuje způsob léčby nádorů závislých na gastrinu, jako je kolorektální karcinomy. Způsob obsahuje kombinovanou terapii obsahující anti-G17 imunizaci pacienta, který potřebuje terapii, spolu s podáním jednoho nebo více chemoterapeutických činidel. Anti-G17 imunizace pro léčbu nádorů závislých na gastrinu je překvapivě účinná ve vyvolání tvorby anti-G17 protilátek, i přes známé myelosupresivní účinky použitých chemoterapeutických činidel.

Anti-Gl7 imunizace obsahuje aktivní nebo pasivní imunizaci pacienta anti-Gl7 imunogenem proti hormonu G17, která má za cíl kontrolu koncentrací G17 u pacienta. V důsledku indukce anti-G17 protilátek u pacienta je hormon G17 neutralizován in vivo a jeho fyziologické účinky jsou inhibovány, což inhibuje růst G17-dependentních nádorových buněk.

Dále, anti-Gl7 imunizace v kombinaci se standardní chemoterapií zvyšuje účinnost léčby kolorektálních karcinomů, ♦ · ♦ • · * • · 0 • · ·

protože při použití kombinace mohou být použity nižší dávky chemoterapeutických činidel, což snižuje jejich toxické účinky na normální tkáně. Kromě toho může být zlepšena kvalita života pacienta a doba jeho přežití.

Ve výhodném provedení způsob obsahuje aktivní imunizaci savce s nádorem závislým na gastrinu pomocí anti-Gl7 imunogenu, v kombinaci s podáním jednoho nebo více chemoterapeutických činidel, jako je 5-fluorouracil, leukovorin, levamisol, cis-platina, faktor nekrosy nádorů a proglumid. Anti-G17 imunogen může být podán pacientovi při zahájení terapie a potom v určených intervalech. Anti-G17 protilátky tvořené u pacienta po imunizaci se mohou vázat na G17 a mohou neutralizovat G17 v jeho zralé, amidované, stejně jako prekursorové formě, například G17-Gly, in vivo, a mohou bránit vazbě G17 na jeho receptory, což brání růstu gastrindependentních nádorových buněk. Titry anti-G17 protilátek tvořených u imunizovaného pacienta mohou být sledovány v předem určených intervalech za použití standardních technik. Dále, chemoterapeutická činidla mohou být podána ve standardních dávkách nebo v nižších dávkách, podle potřeb pacienta.

V jiném provedení vynález poskytuje způsob léčby nádorů závislých na gastrinu, který obsahuje pasivní imunizaci savce s nádorem závislým na gastrinu pomocí anti-G17 protilátek, v kombinaci s podáním jednoho nebo více chemoterapeutických činidel, jako je 5-fluorouracil, leukovorin, levamisol, cisplatina, faktor nekrosy nádorů a proglumid. Ve výhodném aspektu tohoto provedení vynálezu mohou být protilátky chimérické, humanizované nebo lidské monoklonální protilátky, které mohou být připraveny metodami dobře známými v oboru. Protilátky mohou být podány pacientovi při zahájení terapie a potom v určených intervalech, podle potřeb pacienta.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 je graf ukazující časový průběh titrů sérových protilátek po imunizaci krys 500 pg/ml krysím anti-G17 (1-9)-DT imunogenem.

Obr. 2 je graf ukazující vliv léčby 5-FU/leukovorinem v dávce 30 mg/kg na titry anti-G17(1-9) protilátky u krys imunizovaných imunogenem podle předkládaného vynálezu.

Obr. 3 je Scatchardův graf ukazující vliv léčebných cyklů 30 mg/kg 5-FU/leukovorinu na průměrné hodnoty leukocytů u BDIX krys.

Obr. 4 je sloupcový graf ukazující medián hmotnosti nádoru u neléčených krys, krys léčených anti-G17(1-9)-DT a DT-samotným.

Obr. 5 je sloupcový graf ukazující medián hmotnosti nádoru u krys léčených 30 mg/kg 5-FU/leukovorinem; 30 mg/kg 5FU/leukovorinem a DT imunogenem; 30 mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT; 25 mg/kg 5-FU/leukovorinem a DT imunogenem;

mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT; 20 mg/kg 5FU/leukovorinem a DT imunogenem; 20 mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT; 12,5 mg/kg 5-FU/leukovorinem a DT imunogenem; a 12,5 mg/kg 5-FU/leukovorinem a anti-G17(1-9)-DT.

Předkládaný vynález poskytuje způsob pro léčbu nádorů, zejména kolorektálních karcinomů závislých na gastrinu, pomocí kombinované terapie obsahující imunizaci pacienta anti-G17 imunogenem a léčbu pacienta chemoterapeutickými činidly, jako je 5-FU a leukovorin. Překvapivě bylo zjištěno, že kombinovaná terapie anti-G17 imunizací/5-FU/leukovorinem je účinnější než dřívější způsoby léčby kolorektálních karcinomů. Chemoterapeutická činidla použitá v kombinované terapii neinhibuji významně produkci anti-G17 protilátek u imunizovaných pacientů a pro léčbu nádorů mohou být použity nižší dávky chemoterapeutických činidel. Kromě toho, titry anti-G17 protilátek vyvolaných imunizací jsou účinné pro neutralizaci všech forem G17 hormonu.

Ve výhodném provedení způsob obsahuje aktivní imunizaci pacienta s kolorektálním karcinomem závislým na gastrinu pomocí podání anti-G17 imunogenního prostředku spolu s podáním chemoterapeutických činidel. Následné dosycovací anti-G17 imunizace mohou být podány v případě potřeby, jak je určeno analýzou titrů sérových anti-G17 protilátek po imunizaci u pacienta, za použití standardních technik a standardního radiologického hodnocení nádorů. Anti-G17 imunizace může být také provedena u pacienta před chirurgickým odstraněním nádoru.

Anti-G17 imunogeny obsahují přirozené nebo syntetické peptidové fragmenty N-koncových aminokyselin G17 jako imunogenní část imunogenu. Tento peptidový fragment je konjugován s imunogenním nosičem, jako je difterický toxoid (DT). Ve výhodném provedení tohoto aspektu vynálezu obsahuje anti-G17 imunogen amino-koncové aminokyseliny G17 od pozice 1 do pozice 9, které mají aminokyselinovou sekvenci pyroGlu-GlyPro-Trp-Leu-Glu-Glu-Glu-Glu, který je konjugovaný s difterickým toxoidem. Mezi další vhodné imunogenní proteinové nosiče patří hovězí sérový albumin, přílipkový hemokyanin, hemokyanin a tetanický toxoid.

Imunogeny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat prodloužení nebo oddělující peptidovou sekvenci, která vysunuje imunogenní peptid z proteinového nosiče a která

• · ·	♦ ·	··	··
• · ·	• ·	• ·	•	•	•	•
• · ··	•	•	•	•	•	•
						•
• · ·	•	•	•	•	•	•
• · · · *	···	• · ·	• ·		·«

zvyšuje jeho kapacitu vazby na lymfocytární receptory. Vhodnou oddělující peptidovou sekvencí je aminokyselinová sekvence SSPPPPC (SEQQ ID NO: 2 v seznamu sekvencí). Nicméně, mohou být použity I jiné oddělující peptidy. Ve výhodném provedení tohoto aspektu vynálezu je oddělující peptidová sekvence navázána na karboxylový konec imunogenního peptidu. Imunogeny podle předkládaného vynálezu jsou připraveny standardními technikami a jsou popsány v U.S. patentech č. 5023077;

5468494; 5607676; 5609870; 5688506 a 5622702, jejichž objevy jsou zde uvedeny jako odkazy. Po imunizaci vyvolávají imunogeny podle předkládaného vynálezu tvorbu vysoce afinitních, neutralizačních protilátek pro inhibici působení G17 ve zralé a prekursorové formě na růst nádorů u imunizovaných zvířat. Produkované anti-G17 protilátky se váží na a neutralizují zralý a prekursorový G17, což brání vazbě G17 na receptory na nádorových buňkách a v konečném důsledku inhibuje růst nádorových buněk. Imunogeny vyvolávají vznik protilátek, které neutralizují jak karboxy-amidovaný, tak glycinem-prodloužený G17, a nemají žádnou zkříženou reaktivitu s G34 nebo CCK.

Prostředky, ve kterých jsou imunogeny pro aktivní imunizaci podány pro léčbu nádorů závislých na gastrinu pacientům, mohou být v různých formách. Mezi tyto formy patří, například, solidní, semi-solidní a kapalné dávkové formy, jako jsou prášky, kapalné roztoky, suspenze, čípky a injekční nebo infusní roztoky. Výhodná forma závisí na vybraném způsobu podání a terapeutické aplikaci. Prostředky obsahují imunogeny podle předkládaného vynálezu a vhodné farmaceuticky přijatelné složky a mohou obsahovat jiná medicinální činidla, nosiče, pomocné přísady atd., které mohou být smíseny za použití standardních způsobů. Výhodně jsou prostředky ve formě dávkových jednotek. Dávka aktivní sloučeniny podaná pro imunizaci nebo jako lék při jedné aplikaci nebo za určitý čas • · závisí na léčeném jedinci, způsobu a formě podání a na úvaze ošetřujícího lékaře.

Při léčbě gastrointestinálních nádorů je pacientovi podána dávka v rozsahu 0,001 až 2 mg imunogenního prostředku. Účinná dávka imunogenního prostředku je schopna vyvolat imunitní odpověď u pacienta, která spočívá v tvorbě účinných titrů protilátek pro vazbu a neutralizaci zralého a prekursorového G17 během 1-3 měsíců po imunizaci. Po imunizaci a chemoterapii, například 5-FU/leukovorinem, u pacienta s kolorektálním karcinomem, se účinnost terapie na růst nádoru hodnotí standardními klinickými postupy, jako je ultrazvukové vyšetření a vyšetření magnetickou rezonancí (MRI), pro detekci přítomnosti a velikosti nádoru. Titry anti-G17 protilátky mohou být také sledovány z vzorků krve od pacienta.

Pokud je to nutné, měla by být pro udržení účinného titru protilátek podána dosycovací dávka. Účinná léčba kolorektálního adenokarcinomu závislého na gastrinu a jiných karcinomů závislých na gastrinu, jako je karcinom žaludku, jater, slinivky břišní a malobuněčný karcinom plic, pomocí způsobu podle předkládaného vynálezu by měla vést k inhibicí růstu nádoru a zmenšení velikosti nádoru.

Pro pasivní imunizaci jsou anti-G17 protilátky podány pacientovi intravenosně za použití farmaceuticky přijatelného nosiče, jako je salinický roztok, například fosfatem-pufrovaný salinický roztok.

Chemoterapeutická činidla jsou podána v dávkách doporučovaných ve standardních režimech a mohou být podána při zahájení terapie současně s anti-G17 imunogenem, před imunizací nebo po imunizaci. V některých případech může být výhodné podání chemoterapeutického činidla jak před, tak po • · • tftf · · tftftftf •tftf tf tf . · tftftf • tftf · tf·· tftftf • tf · · tftftf tf • tf tftftf «tftf tftf tftf imunizaci. Další série chemoterapie mohou být také podány, podle potřeb pacienta, jak jsou zhodnoceny MRI a ultrazvukem.

Následující pokusy byly provedeny pro prokázání účinků kombinované terapie podle předkládaného vynálezu na kolorektální karcinomy.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Následující pokusy byly provedeny pro určení potenciálního klinického přínosu anti-G17(1-9)-DT. Cíle studie byly následuj ící:

(a) stanovit dlouhodobý efekt specifické anti-G17(1-9)-DT imunizace krys na histologický nález v Gl traktu krys;

(b) zhodnotit vliv kombinace 5-FU/leukovorin na titry protilátek proti anti-G17(1-9)-DT; a (c) stanovit terapeutický účinek kombinace anti-G17(1-9)-DT a 5-FU/leukovorinu na krysím modelu.

Buněčná linie

DHDK12 je krysí buněčná linie epitelového nádoru tlustého střeva (Martin, 1983). Buněčná linie byla kultivována v RPMI 1640 kultivačním mediu (Gibco, Paisley, Scotland) obsahujícím 10% fetální telecí sérum (FCS, Sigma, Poole, UK) ve zvlhčovaném prostředí při 37 °C a 5% CO2.

Imunogen

Anti-G17(1-9)-DT imunogen se skládal z aminokyselinových zbytků 1-9 G17 navázaných na svém karboxylovém konci na oddělovací peptid SSPPPPC (SEQ ID NO: 1 v seznamu sekvencí), «· 9 · ·· • · · * · ···· ··· ♦ · · « * · • · ♦ · «····» • · · · · · · · • ·· ··· ··· ·· ·· který byl potom konjugován na DT. Imunogen použitý v těchto pokusech byl upraven tak, aby byl specifický pro krysí G17, pomocí nahrazení lidského G17 epitopu amino-koncovými 9 aminokyselinami krysího G17 navázanými prostřednictvím oddělovacího peptidu na difterický toxoid (DT). Antisérum proti krysímu anti-G17(1-9)-DT bylo označeno jako anti-krysí G17(1-9)-DT.

Pokusná zvířata

Samci a samice BDIX krys byly získány od Cancer Studies Unit, University of Nottingham, UK, a byly stáří 6-10 týdnů, hmotnosti 340-420 g. Krysy byly chovány v párech za cyklů 12 hodin světla a 12 hodin tmy při 25 °C a 50% vlhkosti.

Před každým pokusem byla zvířata rozdělena do skupin se stejnou distribucí hmotnosti. Velikost skupin byla 6-13 zvířat. UK Coordinatig Committee for Cancer Research (UKCCCR) schválila všechny pokusy na zvířatech.

Imunizace

Krysí anti-G17(1-9)-DT se rozpustil v sterilním salinickém roztoku (0,9%), pH 7,3, v koncentraci 1 mg/ml. Adjuvantní, nor-muramylový peptid (Penisula Labs, Belmont, CA, USA) byl přidán do roztoku konjugátu za dosažení konečné koncentrace konjugátů mezi 200 a 500 gg/ml. Vodný roztok byl připraven s olejovým vehikulem (montanide ISA 703; AMS Seppic lne., Paris, France) v poměru 1:2 (obj./obj.) emulgací. Po umístění do skleněné injekční stříkačky, která byla napojena na druhou stříkačku prostřednictvím troj čestného kohoutu, byla směs 40krát vytlačena a natáhnuta do stříkačky, za zisku emulse. Pro kontrolní krysy byla stejným způsobem připravena emulse obsahující DT peptid a muramyl-dipeptid. 200 μΐ emulse (50 • ·· · 9

9999

9 4 9 9 · 4 4 4 « • · 0 4 0 • 949 00 «0

Hg/krysu) bylo podáno s.c. injekcí (na pravém boku pokusných zvířat). Zvířata byla imunizována buď jedinou injekcí, nebo opakovaně v 21-denních intervalech, jak je popsáno dále.

Cytotoxická léčba

Krysám bylo intravenosně podáno 12,5 a 25 mg/kg 5fluorouracilu (5-FU, David Bull Labs., Warwick, UK) a 12,5-25 mg/kg leukovorinu (Lederle Labs., Gosport, Hants, UK) v den 1, 3 a 5 v cyklu, který byl opakován po 4 týdnech během testovaného období (Asao, 1992). Cytotoxická kombinace byla podána krysám před nebo po anti-G17(1-9)-DT imunizaci (200 Hg/kg).

Iniciace nádorového růstu

DHDK 12 buňky byly suspendovány ve sterilním fosfátem pufrovaném salinické roztoku (PBS, Oxoid, Hants, UK) v koncentraci buněk 2,5 x 10⁷/ml. Krysy byly uvedeny do anestesie pomocí intraperitoneální injekce 1 ml Hypnormu (0,315 ng/ml fentanylcitratu a 10 mg/ml fluanisolu; Jannsen, Berrse,

Belgium), Hypnovelu (5 ng/ml midazolamu; Roche, Basel, Switzerland) a sterilní destilované vody v poměru 1:1:5. Po subkutánní injekci na pravém boku bylo 200 μί buněčné suspenze injikováno do svaloviny břišní stěny a chirurgická incise byla uzavřena klipy. Každá pokusná skupina se skládala z 6 až 13 zvířat.

Stanovení koncentrací specifických protilátek u krys imunizovaných krysím anti-G17(1-9)-DT

Pro získání vzorků krve pro analýzu byla krysám odebírána krev z ocasu v různých časech pokus a na konci pokusu byla při terminální anestesii odebrána krev punkcí srdce. Sérové

* 0* 0	• 00	• 0
* · 0	• ·	0 ·	• 0	0 ·
• 09«	•		• ' 0	0 ·
0 · · 0	•	0	0 0 0	0 0
• · ·	•	•	0 0	0 0
>00 00	000	000	00	00

koncentrace protilátek proti krysímu G17 byly stanoveny enzymovým imunosorbentním testem (ELISA). Konjugát krysího G17-hovězího sérového albuminu (BSA) byl rozpuštěn na koncentraci 2 pg/ml v O,1M glycinovém pufru (pH 9,5) a byl vnesen v množství 25 pl na jamku do 96-jamkových Immunolon U ploten (Dynatech Labs., Sussex, UK). Jamky byly inkubovány přes noc při 4 °C, potom byl neadsorbovaný konjugát odstraněn a jamky byly promyty pufrem (0,9% salinický roztok, 0,5% Tween20 (Sigma), 0,02% NaN3 (Sigma), pH 7,3). Tento pufr byl použit pro všechny výplachy a ředění činidel. Sérum bylo zpracováváno při 10-násobných sériových ředěních, od ředění 1:100.

Pozitivní kontrolou bylo anti-krysí-G17(1-9)-DT antisérum od předem imunizovaných zvířat a negativními kontrolami byly normální krysí sérum a sérum od zvířat imunizovaných pouze DT. Všechna kontrolní séra byla použita ve stejných ředěních jako testovaná séra. Naředěná séra byla přidána do jamek ve 25 pl alikvotách za přítomnosti nebo nepřítomnosti 25 pl/jamku krysího G17-BSA v koncentraci 100 pg/ml (jako rozpustného inhibitoru). Základním kontrolám bylo podáno pouze 25 pl testového pufru. Plotny byly inkubovány po dobu 60 minut při teplotě okolí a potom byly promyty testovacím pufrem. Kozí anti-krysí imunoglobulin (H+L)-biotin (Zymed, San Francisco,

CA, USA) byl přidán do jamek v ředění 1:500, 50 pl/jamku a byla provedena inkubace po dobu 60 minut ve tmě při teplotě okolí.

Po promytí se přidala avidin-alkalická fosfatasa (Zymed) v ředění 1:100 (50 pl/jamku) a plotny se inkubovaly po dobu 60 minut při teplotě okolí. Po dalším promytí se do jamek přidal p-nitrofenylfosfatový (pNPP) substrát (Sigma) v množství 50 pl/jamku a po 5-minutovém vyvíjení se odečítala absorbance při 405 nm. Rozdíl absorbance mezi neošetřeným sérem a sérem inkubovaným s krysím G17-BSA byl vypočítán jako specifická absorbance.

• ·

Stanovení počtu leukocytů

Heparinizovaná krev od krys byly během pokusu odebírána z ocasu a na konci pokusu punkcí srdce. Počet leukocytů byl analyzován v Hematology Department na University Hospital, Nottingham, za použití FACScan.

Histologie

Po utracení dlouhodobě anti-G17(1-9)-DT-imunizovaných krys byly odebrány representativní oblasti žaludku, tlustého střeva a rekta od imunizovaných krys a věkově odpovídajících kontrol a byly fixovány ve formalinu. Řezy byly potom ponořeny do parafinu a za použití mikrotomu byly připraveny 4 gm řezy. Tyto řezy byly barveny hematoxylinem a eosinem a byly vyšetřovány histopatologem, který neměl žádné údaje o léčebných skupinách.

Rychlost proliferace buněk krypt

Jednu hodinu před utracením zvířat byl intraperitoneálně injikován vincristin (2 mg/kg, Sigma) pro indukci zástavy buněčného cyklu v metafázi v střevním epitelu před hodnocením proliferace buněk krypt tlustého střeva (CCPR). Byl určen počet buněk v metafázi na kryptu. Tlusté střevo a rektum byly vyjmuty z každé krysy, byly podélně rozstřiženy a jejich sliznice byly fixovány v Carnoysově roztoku. Krypty byly opatrně rozdrceny pod disekačním mikroskopem a byl stanoven počet buněk v metafázi (při 25-násobném zvětšení).

Statistické analýzy

Výsledky testů in vivo byly analyzovány Mann-Whitney neparametrickým testem za použití SPSS statistického balíčku pro IBM PC.

• · • ·

99 9 9

Studie dlouhodobé anti-G17(1-9)-DT samců krys bylo imunizováno krysím anti-G17(1-9)-DT imunogenem způsobem popsaným výše a jejich protilátkové titry byly měřeny po dobu 34 týdnů po jediné imunizaci. V tuto dobu byla zvířatům podána druhá dosycovací injekce krysího antiG17(l-9)-DT. Výsledky jsou uvedeny na obr. 1. Obr. 1 ukazuje titry protilátek od krys imunizovaných 500 μρ/τηΐ krysího antiG17(l-9)-DT v závislosti na čase do 40 týdnů. Každý bod představuje jedno zvíře. Titry protilátek byly měřeny pomocí ELISA, jak byl popsán výše, za použití ředění séra 1:100. Imunizace jsou znázorněny šipkou. Po primární imunizaci odpověděli 4 z 5 krys na krysí anti-G17(1-9)-DT imunogen. Protilátky byly, po této jediné injekci, detekovatelné v týdnu 7 u 3 z 5 krys a v týdnu 9 u 4 z 5 krys. Po počátečním vzestupu protilátek následoval druhý vzestup mezi 15-20 týdnem, a potom titry protilátek postupně klesaly a dosáhly nuly v týdnu 34. V tuto dobu obr. 1 také ukazuje, že po druhé imunizaci krysím anti-Gl7(1-9)-DT měly všechny krysy detekovatelné titry protilátek proti krysímu G17 během 1-2 týdnů po imunizaci.

Příklad 2: Histologická analýza krys dlouhodobě imunizovaných anti-G17(1-9)-DT

Vzorky z žaludku, tlustého střeva a rekta byly histologicky vyšetřovány po barvení hematoxylinem a eosinem, jak je popsáno v příkladu 1. Tyto vzorky byly srovnávány se vzorky od kontrolních krys odpovídajícího věku a pohlaví. Všechny hodnocené oblasti Gl traktu byly identické u krys léčených anti-G17(1-9)-DT a věkově odpovídajících kontrol s hlediska délky klků/krypt/výšky sliznice. V žaludku měly buňky podobné enterochromafinním buňkám (ECL) podobný vzhled a počet v obou

skupinách zvířat. Nicméně, byly patrné určité známky granulaci v G buňkách žaludeční sliznice krys léčených anti-G17(1-9)-DT.

Příklad 3: Rychlost proliferace buněk krypt (CCPR) střevního epitelu krys dlouhodobě imunizovaných anti-Gl7(1-9)-DT

CCPR epitel tlustého střeva a titry protilátek proti krysímu G17 byly analyzovány způsobem popsaným výše. Tabulka I ukazuje výsledky získané od 4 z 5 hodnocených krys srovnávající CCPR a titry protilátek proti krysímu G17. Průměr CCPR pro kontrolní krysy byl 18,93 (standardní odchylka 3,2) a pro krysy imunizované anti-G17(1-9)-DT byl 23,7 (standardní odchylka 7,9). Nebyl pozorován statisticky významný rozdíl v CCPR mezi krysami imunizovanými anti-G17(1-9)-DT a kontrolními krysami odpovídajícího věku. Tyto výsledky naznačují, že rychlost dělení buněk v kryptách střevního epitelu je stejná pro kontrolní krysy i krysy imunizované anti-G17(1-9)-DT.

• ·

Tabulka 1: Srovnání titrů protilátek proti G17:DT s proliferaci buněk krypt v tlustém střevu

Krysa	Specifická absorbance pro anti-krysí G17:DT protilátky (ředění 1:1000)	Rychlost proliferace buněk krypt (průměr metafází/kryptu za 2 hodiny po podání vincristinu
Kontrola 1	0	21, 9
Kontrola 2	0	19, 4
Kontrola 3	0	14,4
Kontrola 4	0	20, 0
Imunizovaná krysa 1	0,280	29,7
Imunizovaná krysa 2	0,340	30, 3
Imunizovaná krysa 3	0,415	13, 6
Imunizovaná krysa 4	0, 420	21,1

Příklad 4: Vliv pre- a post-cytotoxické léčby na titry protilátek vyvolaných anti-G17(1-9)-DT

Krysám byl intravenosně podán poměr 1:1 5-FU/leukovorinu v dávce 30 mg/kg, jak je popsáno v příkladu 1, před nebo po imunizaci anti-G17(1-9)-DT. Každá skupina se skládala z 6 samců a 6 samic a průměrné titry protilátek byly měřeny ELISA technikou za použití ředění séra 1:100. Titr protilátek u každé krysy byl měřen ze vzorku krve způsobem popsaným v příkladu 1.

Obr. 2 ukazuje vliv pre- a post-cytotoxické léčby cyklů 30 mg/kg 5-FU/leukovorinu na titry protilátek vyvolaných imunizací anti-G17(1-9)-DT (500 gg/ml). V tomto obrázku jsou data uvedena následovně: žádná cytostatika, 7 imunizací;

« · · • ·

99 imunizace před 4 cykly cytostatické léčby; -Ο-, 1 imunizace před 4 cykly cytostatické léčby; -Δ-, 1 cytostatické léčba před 4 imunizacemi (2 cytotoxické léčbě během imunizací); -ffi-, 2 cytostatické léčby před 4 imunizacemi;

cytostatické léčby před 3 imunizacemi; 4 cytostatické léčby před 2 imunizacemi .

Obr. 2 ukazuje průměr 6 samic a 6 samců na skupinu. Standardní odchylky jsou přibližně 10% průměru. Nebyl pozorován žádný významný vliv na titry protilátek způsobený předléčením kombinací 5-FU/leukovorin pro titry protilátek ani pro dobu vzestupu jejich hladin, ve srovnání s neléčenými krysami imunizovanými anti-G17(1-9)-DT. Maximální počet hodnocených léčebných cyklů byl 4 cytotoxické terapie následované 2 imunizacemi.

Obr. 3 ukazuje vliv léčby na průměrný počet leukocytů u BDIX krys.

Vliv cytotoxické léčby 30 mg/kg 5-FU/leukovorinem na průměrný počet leukocytů (WBC) u BDIX krys, kterým byly podány cykly cytotoxické léčby před 2 imunizacemi, je uveden na obr. 3. Jak je uvedeno na tomto obrázku, je patrné významné snížení počtu WBC u representativních hodnocených krys po cytotoxické léčbě (p<0,005, Students' t-test). Počty se snižovaly s počtem cyklů cytotoxické léčby, což ukazuje na určitou myelosupresi. Nicméně, nebyl zaznamenám žádný vliv na protilátkovou odpověď na anti-G17(1-9)-DT u těchto krys, jak je uvedeno na obr. 2.

Příklad 5: Vliv kombinované terapie 5-FU/leukovorinem a antiGl7(l-9)-DT na růst DHDK12 nádorů in vivo • · · « · ·

Vliv kombinované terapie 5-FU/leukovorinem (12,5-30 mg/kg) a krysím anti-G17(1-9)-DT (200 gg/ml) na růst DHDK12 buněčné linie nádoru tlustého střeva krys ve svalové vrstvě břišní stěny BDIX krys byl testován srovnáním s nádory u kontrolních zvířat, jak bylo popsáno v předešlých příkladech, na konci léčby byla zvířata utracena a jejich nádory byly excidovány a zváženy za použití standardních postupů. Každá skupina se skládala z 10/12 krys smíšeného pohlaví. Jsou uvedeny mediány hmotnosti nádorů s rozsahy hodnot čtvrtiny proměnné nad sloupci. Statistické hodnocení bylo provedeno za použití MannWhitleyova U neparametrického testu, jak je popsán v příkladu 1.

Obr. 4 a 5 ukazují vliv anti-G17(1-9)-DT imunizace na medián konečné hmotnosti nádorů od BDIX krys, kterým byly implantovány DHDK12 nádorové buňky do svaloviny břišní stěny. Tento způsob implantace vede ke vzniku dobře vaskularizovaných nádorů vhodných pro léčbu podávanou do cirkulace (Watson,

1996). Již dříve bylo prokázáno, že krysí anti-G17(1-9)-DT snižuje konečnou hmotnost DHDK12 nádorů o 56,5%, je-li podán v dávce 500 gg/ml (Watson, 1996) . V těchto pokusech prováděných za účelem detekce jakéhokoliv přínosu kombinované terapie s 5FU/leukovorinem byla dávka anti-G17(1-9)-DT snížena na 200 μg/ml, což vedlo ke významné inhibici nádorového růstu o 25,7%, jak je uvedeno na obr. 4. Obr. 4 ukazuje data pro nádory excidované od neléčených kontrolních krys, krys imunizovaných anti-G17(1-9)-DT a krys imunizovaných DT. Po 50 dnech měly neléčené krysy nádory s mediánem hmotnosti 4,43 g. Krysy imunizované DT měly medián hmotnosti nádorů 4,7 g, což není statisticky významně odlišné od hmotností nádorů neléčených krys, ale což je významně vyšší než medián hmotnosti nádorů od krys imunizovaných anti-G17(1-9)-DT (3,49 g, p=0,034, Mann Whitney).

·· ·· ♦ · · · • · · « • · · · • * · ·

Obr. 5 ukazuje, že 5-FU/leukovorin samostatně, podané v dávce 30 mg/kg, významně snižují medián hmotnosti nádorů na 1,01 g (p=0,0106 ve srovnání s neléčenými kontrolními krysami). Když byly krysy léčeny stejnou cytotoxickou dávkou 5-FU/leukovorinu společně s imunizací DT, nebyl medián hmotnosti nádorů významně odlišný (0,945 g).

Kombinace 5-FU/leukovorinu (30 mg/kg) a imunizace krysím anti-G17(1-9)-DT vedla k mediánu hmotnosti nádorů 0,68 g, což není statisticky významně odlišné od skupiny léčené 5FU/leukovorinem/DT (p=0,27). Kombinace 5-FU/leukovorinu (25 mg/kg) a imunizace DT vedla k mediánu hmotnosti nádorů 0,96 g, oproti mediánu hmotnosti nádorů 0,68 ve skupině léčené imunizací anti-G17(1-9)-DT v kombinaci s 5-FU/leukovorinem, což není statisticky významně odlišné (p=0,409). Když byla dávka 5-FU/leukovorinu snížena na 20 mg/kg, tak vedla kombinace 5-FU/leukovorinu/DT k mediánu hmotnosti nádorů 1,23 g. Medián hmotnosti nádorů byl významně snížen na 0,71 g při kombinování 20 mg/kg 5-FU/leukovorinu s anti-G17(1-9)-DT imunizací (p=0,027, Mann Whitney).

Obr. 5 nakonec ukazuje, že dávka 12,5 mg/kg 5FU/leukovorinu v kombinaci s anti-G17(1-9)-DT imunizací (p=0,015, Mann Whitney) snižuje medián hmotnosti nádorů z 1,34 na 0,41 g. Byly srovnávány kombinace 5-FU/leukovorin/DT a nebyly zjištěny žádné statisticky významné rozdíly mezi antiG17(l-9)-DT podaným v kombinaci s 12,5, 20 nebo 30 mg/kg 5FU/leukovorinu.

Vzhledem k omezenému přínosu kombinované chemoterapie 5FU/leukovorinem jak u pokročilých stavů, tak při adjuvantním podání (Moertel, 1994; Scheithauer, 1995; Taylor, 1993;

Petrioli, 1995) by měly být nové terapeutické modality podány buď společně s 5-FU/leukovorinem pro zvýšení terapeutického

indexu (a snad sníženi dávek chemoterapeutických činidel pro omezení toxicity), nebo jako druhá linie léčby po selhání chemoterapie. Takové nové léčebné modality musí být vhodné pro takové použití. Imunoterapie v kombinaci s chemoterapií se dříve považovala za problematickou z důvodu myelosuprese spojené s podáním chemoterapeutických činidel, jako je například 5-FU/leukovorin (Mahood, 1991). V předkládaných studiích však myelosuprese u krys indukovaná kombinací 5FU/leukovorinu (30 mg/kg), podanou podle Asao et al. v maximálních tolerovaných dávkách, neovlivňovala titry a časy vzniku protilátek proti krysímu G17:DT po imunizaci antiG17(l-9)-DT imunogenem.

Ve studiích terapie 5-FU/leukovorinem v kombinaci s antiG17(l-9)-DT bylo dosaženo potenciace dávek 20 mg/kg a 12,5 mg/kg. Dávka 20 mg/kg byla při kombinaci s anti-G17(1-9)-DT stejně účinná jako maximální tolerovaná dávka a dávka 12,5 mg/kg vykazovala trend k vyššímu terapeutickému účinku.

Příčina tohoto trendu není známá, ale může jí být to, že tato dávka cytostatika působí na imunitní systém méně než vyšší dávky, což může přispět k celkové zánětlivé reakci na nádor. 5-FU/leukovorin podané podaný v kontinuálních cyklech vykazuje efekt všechno nebo nic na nádorový růst, protože snížení dávky na 1 mg/kg nezpůsobuje žádnou inhibici růstu. Terapeutický efekt může být titrován postupněji snížením počtu toxických cyklů (Watson, osobní sdělení). Proto mohou být v kombinační terapii podle předkládaného vynálezu podány nižší než obvyklé dávky 5-FU/leukovorinu, což sníží nežádoucí účinky léku, za současného dosažení účinného usmrcování nádorových buněk, protože imunitní systém je při takové léčbě minimálně narušen. Tak je zesílen inhibiční efekt imunizace anti-G17(l9)-DT na růst. Tyto charakteristiky kombinované terapie jsou neočekávané z hlediska myelosupresivních účinků chemoterapeutických činidel.

Dále, z důvodu nepřítomnosti nežádoucích účinků pro pacienta je imunizace anti-G17(1-9)-DT pravděpodobně dlouhodobou léčbou, jak je doloženo dobou, po kterou byly po jediné imunizaci přítomny protilátky u krys. První imunizace byla účinná z 80%, z hlediska indukce anti-gastrinových protilátek, a druhá imunizace byla účinná ve 100% s okamžitým vzestupem titrů protilátek. Ačkoliv může být potenciace chemoterapie provedena jedinou injekcí anti-G17(1-9)-DT, u většiny pacientů za nepřítomnosti nežádoucích účinků, naznačuje charakter anti-G17(1-9)-DT imunizace a rychlost odpovědi po dosycovací dávce, že je vhodný režim více dávek. I přes dobu, po kterou zůstávají anti-krysí-G17 protilátky v cirkulaci se zdá, že nemají škodlivé účinky na GI trakt, jak bylo hodnoceno jednoduchým histologickým vyšetřením. Dále, index proliferace buněk krypt sliznice v tlustém střevu neukázal významný vliv na jejich růst.

Příklad 6: Léčba lidských pacientů s nádorem tlustého střeva kombinací 5-FU/leukovorinu a anti-G17(1-9)-DT

Již dříve bylo uvedeno, že imunizace anti-G17(1-9)-DT samotná je hodnotnou a bezpečnou terapeutickou volbou pro léčbu nádorů závislých na gastrinu. Kombinace anti-G17 imunogenu a 5-FU/leukovorinu podle předkládaného vynálezu zvyšuje účinnost protinádorové léčby, zejména při léčbě karcinomu tlustého střeva, a patrně redukuje dávky chemoterapeutických činidel v kombinaci, což snižuje nežádoucí účinky cytostatické léčby jakéhokoliv z chemoterapeutických činidel, které jsou v současnosti používány. Kombinace imunogenu s chemoterapeutickými činidly podle předkládaného vynálezu mohou být také použity jako druhá linie terapie u pacientů, kteří nereagují na chemoterapii samotnou.

• ·» * »· · 0 · · • ··♦ 0 • 0 ♦ 0 · • · · * ··· 0· ··· *

Kolorektální nádory u člověka nebo pacienti s nádory tlustého střeva jsou léčeni kombinací chemoterapie a imunoterapie.

Přesněji, pacienti s kolorektálními karcinomy reagujícími na gastrin nebo s karcinomy tlustého střeva mohou být léčeni současným podáním 5-FU/leukovorinu a anti-Gl7 imunogenního prostředku nebo anti-G17 protilátek.

Konkrétně, výhodná imunoterapie poskytuje imunogenní prostředek obsahující aminoterminální G17(1-9):DT konjugát ve farmaceuticky přijatelném nosiči, který může obsahovat adjuvans pro další stimulaci imunitní odpovědi.

Výhodný imunoterapeutický režim může začít před, během nebo po chemoterapii, v závislosti na klinických okolnostech. Například, pro pacienta s objemným nádorem může být výhodné začít léčbu několika cykly chemoterapie pro zmenšení objemu nádoru a potom zahájit imunoterapii.

Alternativně, u pacienta s malým nádorem nebo po kurativním chirurgickém zákroku může být imunoterapie zahájena před nebo během chemoterapie.

Dávky při aktivní imunizaci mohou být v rozsahu mezi 300 gg a 1200 gg anti-G17 imunogenu, podle stavu imunity pacienta (nebo kapacity imunitní odpovědi). Injekce mohou být podány ve dny 1, 7 a 14 nebo 1, 14 a 21 nebo 1, 14 a 28 a 56. Všechny protokoly podání vedou k dosažení podobných titrů protilátek. Akcelerované protokoly imunizace snad umožní časnější nástup imunitní odpovědi.

• ·

Ve výhodném způsobu anti-gastrinové terapie jsou dosycovací dávky podávány každých 6 měsíců po počáteční imunizaci, bez ohledu na použitý protokol.

Ještě jinou výhodnou metodou pro účinnou neutralizaci G17, GlyG17 a G17-HN2 je pasivní imunizace anti-G17 protilátkami, výhodně v přečištěné formě. Přesněji, 10-1000 μg anti-G17(1-9) protilátek je podáno před, během a/nebo po cyklech chemoterapie, za účelem kontroly gastrinové aktivity. Pasovní imunizace může být podávána denně, jednou týdně nebo jednou za dva týdny. Mohou být použity jiné protokoly, podle účinnosti léčby.

Další terapeutickou kombinací je počáteční pasivní imunizace před a/nebo během prvního cyklu chemoterapie, po které následuje aktivní imunizace popsaná výše.

Používá se mnoho chemoterapeutických režimů. Tyto známé režimy, ačkoliv zde nejsou uvedeny, nejsou vyloučeny z kombinované léčby podle předkládaného vynálezu. Jedním výhodným chemoterapeutickým režimem je bolusová i.v. dávka 425 mg/m 5-FU s i.v. infusí leukovorinu (kyseliny listové, FA, 20 2 mg/m ) ve dny 1-5 s opakováním za 4 týdny.

Jiným výhodným režimem je 200 mgm² FA během 2 hodin a potom 5-FU i. v. bolusovou dávkou 4 00 mg/m² + 5-FU 600 mg/m² během 22 hodin ve dny 1 a 2, s opakováním za 2 týdny.

Ještě jiným výhodným režimem je kontinuální i.v infuse 5-FU (250-300 mg/m ) po dobu 4-6 týdnů, po kterých následuje 2týdenní pauza.

• ·

99

Odkazy:

ASAO T, TAKAYUKI A, SHIBATA HR, BATIST G and BRODT P. Eradication of Hepatic Metastases of Carcinoma H-59 combination chemoimmunotherapy with Liposomal Muramyl Tripeptide, 5-Fluorouracil, and Leucovorin. Cancer Research 52: 6254-6257, 1992 BALD WIN G. Binding of the progastrin fřagments to the 78kDa gastrin-binding protein. FEBS Ze// 1995; 359: 97-100.

ERLICHMAN C, FINE S, WONG A, ELHAKEIM T. A randomized trial of fluorouracil and folinic acid in patients with metastatic CRC. J Clin Oncol 1988; 6: 496-475.

MAHOOD DJ, DOSE AM, LOPNIZ CC. Inhibition of Fluorouracil stomatitis by oral cryotherapy. J Clin Oncol 1991; 9: 449-452.

MAKISHEMLA R, LARKIN D, MICHAELI D, GAGINELLA TS. Active immunization against gastrin-17 with an N-terminal derived immunogen inhibits gastrin and duodenal lesions in rats. Gastroenterol 1995; 106: A824.

MARTIN F, CAIGNARD A, JEANNIN JF, LECLERC A, MARTIN M. Selection of trypsin of 2 sublines of rat colon cancer cells forming Progressive or regressive tumors. Int J Cancer 1983; 32: 623-627.

MOERTEL GG. Chemotherapy CRC. NEJM1994; 330: 1136-1142.

PETRIOLIR, LORENZIM, AQUINO A, MARSELI S, FREDIANIB, PALAZZUOLI V, MARZOCCA G. Treatment of advanced colorectal cancer with high-dose intensity folinic acid and 5-Fluorouracil plus supportive care. Eur J Cancer 1995; 31A: 2105-2108.

PIETNELLIN, DOUGLAS HO, HARRAVA L . The modulation of Fluorouracil with leucovorin in metastatic CRC: a prospective randomized phase III trial. JClin Oncol 1989; 7: 1419-1426.

SCHEITHAUER W, KORNEK G, ROSEN H, SEBESTA C, MARCELL A, KWASNY W, KARALL M, DEPISCH D. Combined intraperitoneal plus intravenous chemotherapy after curative resection for colonic adenocarcinoma. Eur J Cancer 1995; 31A: 1981-1986.

SEVA C, DICKINSON CJ, SAWADA M, YAMADA T. Characterization of the glycineextended gastrin (G-gly) receptor on AR4-2J cells. Gastroenterol 1995; 108: A742.

TAYLOR, I. Chemotherapy, radiotherapy and immunology of colorectal neoplasia. Current opinion in Gastroenterology 1993; 9: 28-33

WATSON SA and STEELE RJC. Gastrin receptors in gastrointestinal tumors. WG Landes

Company, Austin, USA, 1993.

• ··

WATSON SA, MICHAELI D, GRIMES S, MORRIS T, ROBINSON G, VARRO A, JUSTIN

TA, HARDCASTLE JD. Gastrimmune raises antibodies that neutralize amidated and glycineextended gastrin-17 and inhibit the growth of colon cancer. Cancer Res 1996; 56: 880-885.

tf • tftf • * · • · • tf • tf tftf » · ♦ » • ♦ · ♦ • · · * • tftf · ♦ tf ·«

Seznam sekvencí <110> Apthon Corporation <120> Kombinovaná terapie pro léčbu nádorů <130> 1102865-0034 <140> US <141> 1999-05-14 <150> US 60/085687 <151> 1998-05-15 <160> 2 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Lidský nebo syntetický peptid <220>

<221> MOD_RES <222> (1) <223> kyselina pyroglutamová <400> 1

Glu Gly Pro Trp Leu Glu Glu Glu Glu 1 5 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Arteficiální sekvence <220>

<223> Popis arteficiální sekvence: Syntetický peptid <400> 2

Ser Ser Pro Pro Pro Pro Cys

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kombinace vhodná pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu, vyznačující se tím, že obsahuje

   i) imunogen zaměřený proti růstu tohoto nádoru a ii) jedno nebo více chemotherapeutických činidel pro jeho léčbu.
2. 2. Kombinace podle nároku 1, vyznačující se t i m, že imunogen zahrnuje imunogen obsahující peptid proti gastrinu G17.
3. 3. Kombinace podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že peptid proti gastrinu G17 je konjugován k s difterickým toxoidním nosičem.
4. 4. Kombinace podle nároku 2, vyznačující se t i m, že imunogen obsahující peptid proti gastrinu G17 zahrnuje peptid proti gastrinu G17, proteinový nosič a oddělovací peptid vhodný pro oddálení peptidu proti gastrinu G17 od proteinového nosiče a pro zvýšení jeho kapacity pro vazbu lymfocytových receptorů.
5. 5. Kombinace podle nároku 2, 3 nebo 4, vyznačující se tím, že peptid proti gastrinu G17 vykazuje sekvenci SEQ ID NO: 1.
6. 6. Kombinace podle kteréhokoliv z nároků 2 až 5, vyznačující se tím, že chemoterapeutické činidlo nebo činidla jsou zvolena ze souboru sestávajícího z 5-fluorouracilu, leukovorinu, levamisolu, cisplatiny, faktoru nekrosy nádorů a proglumidu.

   ···· ·· • · ·· • ·
7. 7. Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky vhodný nosič.
8. 8. Kombinace podle kteréhokoliv z předchozích nároků pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu u pacienta.
9. 9. Kombinace podle nároku 6 obsahující jako chemotherapeutická činidla 5-fluorouracil a leukovorin pro použití při léčení kolorektálního nádoru závislého na gastrinu u pacienta.
10. 10. Použití kombinace podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro výrobu přípravku pro použití při léčení nádoru závislého na gastrinu.