CZ2000420A3

CZ2000420A3 - Stirlingův motor se zvýšenou účinností má přemisťovací píst (5), posuvný v prvním válci (4) a na něm upevněné první nahřívací komoře (1) a pracovní píst (14), posuvný v druhém válci (15) a na něm upevněné druhé nahřívací komoře (16). Klikové hřídele (9, 11) pístů (5, 14) se nachází v mechanické skříni (6), jsou navzájem různoběžné a jsou spojeny prostřednictvím Hookova kloubu (10), přičemž nahřívací komory (1, 16) jsou spojeny prostřednictvím alespoňjednoho spojovacího potrubí (17) přímo. Regenerátor (2) a chladič (3) jsou výhodně uspořádány mimo spojovací potrubí (17), na kanálu (4') situovaném na prvním válci (4). Pro doplňování médiaje z mechanické skříně (6) vyvedeno vyrovnávací potrubí (19) ústící do pracovního prostoru, opatřené jednosměrným ventilem (18).

Info

Publication number: CZ2000420A3
Application number: CZ2000420A
Authority: CZ
Inventors: Librada Maria Canedo; Fernando Espliego; Rose Isabel Fernandez-Chimeno; Jose Luis Fernandez-Puentes; Julia Peres-Baz; Francisco Romero
Original assignee: Instituto Biomar S. A.
Priority date: 1998-08-04
Filing date: 1998-08-04
Publication date: 2000-07-12

Abstract

Je popsána makrolidová sloučenina vzorce I, v němž R znamená atom vodíku nebo substituent. Tyto makrolidové sloučeniny se vyrábějí kultivací kmene Micromonospora sp. ES25-008, který je dostupný pod přístupovým číslem CECT3333, a případnou následující hydrolýzou. jsou také popsány farmaceutické prostředky, které obsahují uvedenou makrolidovou sloučeninu ajejich použití pro léčení savčích rakovin.

Description

Makrolidová sloučenina, způsob její výroby a její použití

Oblast techniky

Předložený vynález nové makrolidové sloučeniny, která je isolována z kultivačního prostředí nového mořského mikrobiálního organismu. Předložený vynález se dále týká způsob výroby této nové sloučeniny aerobní fermentací za regulovaných podmínek, její isolace, jejího čistění, derivátů této sloučeniny a také dalších aspektů založených na objevu protinádorové a dalších aktivit.

Dosavadní stav techniky

Makrolidy, nazývané oligomyciny a homooligomyciny, jsou známy z J. Antibiotics 1993, 46, 1344 až 1341, J. Antibiotics 1992, 45, 171 až 179, a J. Antibiotics 1996, 49,1275 až 1277.

Pro léčení některých lidských nádorů, díky skutečnosti, že velký počet nádorových buněčných linií, včetně těch, které mají MDR fenotyp, není účinně léčen žádným léčivem, jsou stále ještě potřeba nové antiproliferační sloučeniny.

Ještě jiným předmětem tohoto vynálezu je získat farmaceutické prostředky pro podávání pacientovi, který potřebuje léčení takovou účinnou sloučeninou.

Mikrobiální výrobky jsou zajímavé, protože jejich průmyslová výroba je v dnešní době dobře proveditelná. Jiným předmětem tohoto vynálezu je tedy výroba účinné sloučeniny a její isolace a vyčištění z výsledného fermentačního živného prostředí, její hydrolýza na aglykonovou sloučeninu a derivatizace na příbuzné sloučeniny.

·· ·· ·· ···· ·· ··

4 4 4 · · · · · · · ··· · · · ···· • · · · · 4 444 44 4

44 4444 4444

4444 44 44 ·* 44 44

Podstata vynálezu

Tento vynález poskytuje sloučeninu se strukturou podobnou makrolidu, označenou IB-96212, následujícího vzorce

Je popsán také způsob získávání IB-96212. Výhodný způsob se vyznačuje tím, že zahrnuje kultivaci takového kmenu mikroorganismu, který je schopen produkovat IB-96212 ve vodném živném prostředí s asimilovatelnými zdroji uhlíku a dusíku a solemi za regulovaných aerobních podmínek pň ponoření. Výsledné živné r

prostředí, ať nevyčištěné nebo částečně vyčištěné, které má protinádorovou aktivitu, ► je také částí tohoto vynálezu. Součenina IB-96212 může být isolována a vyčištěna z kultivačního živného prostředí. Tato sloučenina a fermentační živné prostředí vykazují zajímavou aktivitu na několik lidských rakovinových buněk, mezi nimi citlivých a vůči mnoha léčivům resistentních (MDR) buněk leukemie. IB-96212 dále vykazuje antibiotickou aktivitu na některé grampositivní bakterie.

• · · · · <

Z této sloučeniny IB-96212 se může hydrolýzou odstranit trideoxycukr, identifikovaný jako L-rhodinosa, čímž se získá aktivní aglykonová sloučenina IB-96212B, která má jádro 26-členného makrolidového kruhového systému rodičovské IB-96212.

Tento vynález tedy dále poskytuje sloučeninu IB-96212B vzorce

IB-96212B má aktivitu srovnatelnou s aktivitou rodičovské IB-96212.

Ve sloučenině IB-96212 může být trideoxycukr, který jsme identifikovali jako L-rhodinosu, sám derivatizován nebo může být tento cukr nahrazen. V obou případech se získávají další deriváty sloučeniny IB-96212, které mají v poloze cukru jinou skupinu než je L-rhodinosa. Obecněji - tento vynález poskytuje sloučeninu obecného vzorce • · • · ♦ · · · • · · · · · ·· ·· ·· ··

v němž R znamená atom vodíku nebo skupinu substituentu.

Pro ilustraci - R znamená atom vodíku nebo skupinu vybranou ze sacharidové skupiny, uhlovodíkovou skupinu, acylovou skupinu, heterocyklickou skupinu nebo nějaký jiný vhodný substituent. Povaha skupiny substituentu není rozhodující. Sacharidová skupina s výhodou znamená mono-, di- nebo tri-sacharid, kterým může být deoxysacharid. Uhlovodíková skupina může znamenat alkyl, cykloalkyl, aryl, aralkyl nebo alkylaryl, zvláště alkyl s 1 až 6 atomy uhlíku, cykloalkyl se 4 až 8 atomy uhlíku, fenyl, naftyl nebo benzyl. Heterocyklická skupina může znamenat 4- až 8-členný kruh s 1 až 4 heteroatomy, zvláště pak 5 nebo 6-členný kruh s 1 nebo 2 heteroatomy vybranými z atomu kyslíku, síry a dusíku. Uhlovodíková skupina, acylová skupina nebo heterocyklická skupina může být sama substituována, například 1, 2 nebo 3 substituenty vybranými z alkylu s 1 až 6 atomy uhlíku, alkoxyskupiny s 1 až 6 atomy uhlíku, atomu halogenu, hydroxylu, aminové skupiny nebo jiných skupin.

• · • · • · ···· · · · ···· ··· ·· · · · · · • · · · · · · · · · · · • · · ···· ···· ···· ·· ·· ·· ·· ··

Výhodnou kulturou pro získání IB-96212 je nový kmen označený ES25-008. Jeho chemické, biochemické a morfologické vlastnosti ukazují, že patří do rodu Micromonospora a je taxonomicky klasifikován jako MiciOmonospora sp.

Jak je shora popsáno, bylo zjištěno, že sloučeniny IB-96212 a IB-96212B jsou účinné pro inhibování proliferační aktivity některých lidských a myších buněk leukémií resistentních na více léčiv (MDR) stejně jako na citlivé buněčné linie a také na jiné lidské nádory. Tedy i jiné sloučeniny shora uvedeného obecného vzorce si budou uchovávat tuto aktivitu.

V tomto odstavci budou stručně popsány obrázky.

Obrázek 1 je HPLC chromatogram vyčištěné IB-96212.

Obrázek 2 je ultrafialové spektrum (UF) vyčištěné IB-96212.

Obrázek 3 je infračervené (IČ) spektrum vyčištěné IB-96212.

Obrázek 4 je ¹H NMR spektrum vyčištěné IB-96212.

Obrázek 5 je ¹³C NMR spektrum vyčištěné IB-96212.

Obrázek 6 je hmotnostní spektrum vyčištěné IB-96212.

Obrázek 7 je HMBC NMR spektrum IB-96212 v acetonu-d₆.

Obrázek 8 je COSY NMR spektrum IB-96212 v acetonu-d₆.

Obrázek 9 je HMQC 132MHz NMR spektrum IB-96212 v acetonu-d₆.

Obrázek 10 ukazuje NMR korelace IB-96212B.

Obrázek 11 je hmotnostní spektrum IB-96212B.

Obrázek 12 je HMBC 60ms NMR spektrum IB-96212B v acetonu-d₆.

Obrázek 13 je HMBC 110ms NMR spektrum IB-96212B v acetonu-d₆.

Obrázek 14 je COSY NMR spektrum IB-96212B v acetonu-d₆.

Obrázek 15 je HMQC 145MHz NMR spektrum IB-96212B v acetonu-d₆.

V další části bude tento vynález popsán podrobně.

• 4 ·

Produkující organismus: Mikrorganismem používaným pro produkci IB-96212 a tedy pro IB-96212B je s výhodou Micromospora sp. kmen ES25-008, kultura, která je uložena ve Španělské sbírce typů kultur na Universitě ve Valencii, Španělsko, pod přístupovým číslem CECT 3333. Toto uložení bylo provedeno podle Budapešťské dohody. Datum uložení je 4. srpen 1997. Organismus byl isolován z neidentifikované mořské houby. Taxonomické způsoby zde popsané jsou uvedeny v tabulce 1. Všechny kultury byly inkubovány při 27 °C a výsledky byly zaznamenávány týdně do 21 dnů.

Tabulka 1

1. Medium pro studie morfologie kolonií:

ISP medium č. 2, 3, 5 a 6: Shirling B.E. a Goblieb D.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1966, 16, 313.

ATCC medium č. 172: ATCC katalog.

Czapek Agar Difco

Bennet Agar, Waksman S.A.: The Actinomycetes 1961, //, 331.

1,5% (hmotn.) vodný agar, Luedemann G.M.: osobní sdělení.

Všechna media byla doplněna 50 % hmotn. ASW.

2. Studie fysiologických vlastností:

ISP medium č. 1, Shirling B.E. a Goblieb D.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1966, 16, 313.

Resistence na NaCI: ATCC 172 s 0, 2, 4, 7 a 10 % hmotn. NaCI.

Využití uhlíku: ISP-9, Shirling B.E. a Goblieb D.: Int. J. Syst. Bacteriol. 1966,

16, 313.

3. Studie chemického složení:

Analýza mastných kyselin. Van der Auwera a spol.: J. Microbiol. Methods 1986, 4, 265.

Analýza cukru celé buňky. Guerrant G.O. a Moss C.W.: Anal. Chem. 1984, 56, 633.

Organismus je popsán následujícím způsobem.

Morfologie: Po 21 dnech při 28 °C byl pozorován růst v ISP2 a živném mediu 172 doplněném umělou mořskou vodou (ASW). Na různých studovaných mediích bylo pozorováno několik odstínů oranžové. Nebylo vytvořeno žádné vzdušné medium. Substrát mycelia byl rozvětven. Vyskytují se isolované koncové spory na substrátu mycelia. Spory byly kulovité. V některých mediích byl detegován nadměrný růst hmotnosti mycelia a po alespoň 14 dnech inkubace.

Fysiologické vlastnosti: Žádný difungovatelný pigment nebyl vytvořen kmenem ES25-008 ani na pevném ani v kapalném mediu. Resistence vůči NaCI byla nad 4 % hmotn. Optimální rozmezí teploty kultivace bylo mezi 25 a 35 °C. Organismus rostl na glukose, sacharose, xylose a mannose jako jediném zdroji uhlíku. Růst na rafinose, inositolu, galaktose, fruktose, melibiose, ethanolu, glycerolu a rhamnose byl negativní. Růst na mannitolu byl pochybný.

Chemické složení buněk: Aminokyseliny: Meso-2,6-Diaminopimelová kyselina byla přítomna v hydrolyzátu celých buněk kmene ES25-008.

Mastné kyseliny: Složení FAME je uvedeno v tabulce 2.

··

I · · 1

I · · 4

Tabulka 2

13:0	i-14:0	14:0	i-15:0	n-15:0	15:0
<1	<1	<1	8,21	1,00	1,09

i-16:1	i-16:0	16:1	16:0	i-17:1	i-17:0	n-17:0
<1	35,07	<1	<1,12	<3,18	3,39	3,18

17:1	17:0	i-18:1	i-18:0	cis-18:1	18:0
29,49	7,88	1,44	<1	2,30	<1

Cukry: Sestava cukrů celé buňky ukazovala na přítomnost xylosy, ribosy a glukosy, když byla provedena analýza plynovou chromatografií. Arabinosa byla detegována ve stopových množstvích. Tato sestava zařazuje tento kmen do D skupiny podle Lechevaliera M.P. a spol.: J. Bacteríol. 1971, 105, 313. Dalšími detegovanými cukry jsou: mannosa, galaktosa, m-inositol a mannosamin. Dalšími buněčnými složkami byl polyalkohol arabitol a kyselina muramová. Nebyla detegována madurosa.

Na základě předcházejících vlastností byla tato kultura určena jako druh rodu Micromonospora bez podobnosti k jakémukoliv známému typu kmenů tohoto druhu dostupného v mezinárodních sbírkách. Nejbližší příbuznost podle chromotografické analýzy mastných kyselin byla k Micromonospora chalcea ATCC 31395 s pouze 80% podobností.

I když uložený kmen je zřetelně výhodný, předložený vynález není omezen nebo limitován na tento kmen nebo organismus. Záměrem autorů předloženého

4· ···· vynálezu je zahrnout do rozsahu tohoto vynálezu jakékoliv jiné IB-96212 produkující organismy, kmeny nebo mutanty.

Fermentace: Micromonospora sp. ES25-008, jestliže je kultivována za regulovaných podmínek ve vhodném mediu, poskytuje antibiotikum IB-96212. Tento kmen je kultivován ve vodném živném mediu za aerobních a mesofilních podmínek, s výhodou mezi 24 a 35 °C a pň pH v rozmezí od 6,0 do 8,0. Pro kultivaci organismu se mohou používat rozmanitá kapalná media, užitečná media jsou ta, která obsahují asimilovatelný zdroj uhlíku, jako je škrob, dextrin, cukerná melasa, glycerol, glukosa, sacharosa a podobné, asimilovatelný zdroj dusíku, jako jsou proteiny, proteinové hydrolyzáty, odtučněná masa, comsteep a podobné, a užitečné zdroje aniontů a kationtů, jako je sodík, hořčík, draslík, amonium, síran, chlorid, fosforečnan, uhličitan a podobné. Mohou se přidávat také stopové prvky. Provzdušňování se s výhodou dosáhne dodáváním vzduchu do fermentačního media. Míchání je zajištěno mechanickým rychloběžným míchadlem. Bylo zjištěno, že konvenční fermentační tanky jsou dostatrcně vhodné pro kultivování tohoto organismu. Pro zvýšení produkce a pro zabránění pěnění může být potřeba přidání živin a regulace pH stejně jako protipěnivých činidel v různých stupních fermentace.

Vyžadované stupně, které jsou potřebné pro produkci IB-96212 výhodným organismem, jsou:

Začít se zmrazeným nebo lyofilizovaným myceliem. Získat hmotu mycelia kultivováním původních buněk v kultivačních baňkách s kultivačním mediem obsahujícím některé shora popsané přísady za mesofilních teplot a za aerobních podmínek. Tento stupeň může být několikrát podle potřeby zopakován. Isolovaný materiál se použije jako inokulum pro naočkování jednoho nebo několika fermentačních tanků příslušným kultivačním mediem, jestliže je to žádoucí, tyto tanky se mohou použít také jako inokulum a tento stupeň se může, jestliže je to potřeba, několikrát zopakovat nebo může sloužit jako produkční stupeň, podle toho, jaký objem živného prostředí je • · 0 0

0·· 90

9 0 0 0

0· 0 9 0 0

0 0 9 0

0900 09 99

0000

9» 90

9 0 9 9

0 0 9 0

0 0 9 0 9

0 0 0 0

00 90 potřeba. Někdy může být produkční medium jiné než medium, které se použije jako inokulum.

V tabulce 3 jsou popsána typická media, která se mohou používat pro vyvinutí inokula a pro produkci IB-96212.

Tabulka 3

medium pro inokulum	medium pro produkci
glukosa	4g	glukosa	5g
škrob	20 g	škrob	20 g
hovězí extrakt	3g	sojová moučka	15g
kvasinkový extrakt	5g	kvasinkový extrakt	5g
trypton	5g	trypton	2g
CaCO₃	4g	CaCO₃	4g
NaCI	4g	NaCI	4g
Na₂SO₄	1 9	Na₂SO₄	ig
KCI	0,5 g	KCI	0,5 g
MgCI₂	2g	MgCI₂	2g
K2HPO₄	0,5 g	K2HPO₄	0,5 g
vodovodní voda do	1000 ml	vodovodní voda do 1000 ml

Produkci IB-96212 lze sledovat testováním celé živné kultury na buněčné linie myší leukemie P-388 nebo HPLC.

Isolace IB-96212: Antibiotickou IB-96212 lze isolovat z koláče mycelia extrakcí vhodnou směsí rozpouštědel, jako je směs chloroform/methanol/voda. Aktivita se koncentruje v dolní vrstvě. Extrakty ze dvou zopakovaných extrakcí lze spojit a odpařit ve vakuu dosucha.

♦· ··»· » · ·

I · · (

00

Oddělení a vyčištění IB-96212 ze surového aktivního extraktu se může povádět použitím příslušné kombinace konvenčních chromatografických technik.

Frakcionace se sleduje protinádorovou aktivitou frakcí nebo TLC zviditelněnou vanilinem v koncentrované kyselině sírové nebo analytickou HPLC s diodovým detektorem. HPLC analýza se provádí za teploty místosti (Waters RCM 8x10, SC18 10 cartridge) s mobilní fází methanol:voda v poměru 98:2, průtokovou rychlostí 2 mm/min a vynesením při 225 nm. Za těchto podmínek je retenční doba IB-96212 3,64 min, jak ukazuje obrázek 1.

Na základě podrobné analýzy jejích různých spektrálních vlastostí lze čistou sloučeninu identifikovat jako IB-96212 (viz data reprodukovaná na obrázcích 2 až 6).

UF spektrum ukazuje absorpci při 225 nm, jak popisuje obrázek 2.

Infračervené absorpční spektrum v KBr je uvedeno na obr. 3 doprovázejících výkresů.

¹H a ¹³C NMR spektra jsou uvedena na obr. 4 a 5.

FAB-MS spektrum vykazuje maximum (M+Na)‘ při 1021 a je uvedeno na obr.

6.

¹H NMR data pro IB-96212 jsou souhrnně uvedena v následující tabulce:

9999

9 9

9999 99 » 9 9 9

9 9 9

9 9 ’ • 9 9 9

99 polohaÓH [int mult, J(Hz)]

11 12

21

5.80 (1H, d, 15,5)

6.74 (1H, dd, 10,5,15,5)

2,37 (1H, dt, 6,5,10,0)

3,62 (1H, d, 9,0)

1,73 (1H, m)

4,02 (1H, d, 9,0)

3,62 (1H, d, 9,0)

54 (1H)

4,07 (1,H, dd, 4,5, 8,5)

3,46 (1H)

3,78 (1H, dd, 1,5, 6,5)

1,82 (1H,m)

1,98 (1H,m)

2,19 (1H, m)

5,42 (1H, ddd, 3,5,10,5,14,5) 6,03 (1H, dd, 10,5,14,5)

6,01 (1H, dd, 10,5,14,5)

5,16 (1H, dd, 10,0,14,5)

2,26 (1H, dt, 10,0)

1,40 (1H, m)

1.64 (1H, m)

0,98 (1H, m)

1,58 (1H, m)

3,92 (1H, d, 10,5)

1,95 (1H,m)

4.81 (1H, dd, 5,0, 11,5)

1.75 (1H)

1,40 (1H,m)

1,75 (1H,m)

1,49 (1H, m)

1.65 (1H, m)

1,49 (1H,m)

3.82 (1H, d, 10,5)

1.66 (1H, m)

3,52 (1H)

1,35 (1H, m)

1,68 (1H, m) ·· ·· ·· ···· ·· ·· ···· ·· · · · · ♦ • · · ·· · · · · · • 4 444 4 444 44 4 • 44 4444 · · · 4 ···· 44 »· 44 ·· 44

35	0,94 (3H, t, 7,5)
36	1,13 (3H, d, 6,5)
37	0,77 (3H, d, 7,0)
38	1,40 (1H, m)
	1,64 (1H, m)
39	1,42 (1H, m)
	1,54 (1H, m)
40	0,91 (3H, t, 7,0)
41	0,96 (3H, d, 6,5)
42	1,25 (1H, m)
	1,42 (1H,m)
43	3,68 (1H, m)
44	1,08 (3H, d, 6,5)
45	0,75 (3H, d, 7,0)
46	0,92 (3H, d, 7,0)
47	0,78 (3H, d, 6,0)
48	0,82 (3H, d, 7,0)
5-OH	4,21 (1H, s)
7-OH	4,90 (1H,s)
9-OH	3,50 (1H, s)
10-OH4.50 (1H, d, 4,5)

11- OH 3,53 (1Η, s)

12- OH3.75 (1H,s)

13- OH4.43 (1H, d, 6,5)

33-OH3,38 (1H, d, 6,0)

43-OH3,39 (1H, d, 6,0)

1' 4,54 (1H,dd, 1,5,7,7)

2' 1,43 (1H, m)

2,09 (1H, dt, 2,0, 8,5) 3’ 1,46 (1H,m)

1,93 (1H,m)

4' 3,15 (1H, septet, 5,0)

5' 3,31 (1H, dq, 2,5,6,0)

6' 1,24 (3H,d, 6,0)

4'-0H 4,04 (1H,d, 5,0) ¹ H NMR data pro IB-96212B jsou souhrnně uvedena v následující tabulce:

polohaδ_Η [int mult, J(Hz)]

11 12

21

5,80 (1H, d, 15,5)

6.75 (1H, dd, 10,0, 15,5) 2,45(1H,dt, 6,5,10,0)

3,65 (1H)

1.75 (1H, m)

3,94 (1H, d, 8,0)

3.62 (1H)

3.63 (1H)

4,14 (1H, d, 6,5)

3,50 (1H)

3,78 (1H, široký s)

1,85 (1H, m)

2,10 (1H,m)

2,22 (1H,m)

5.45 (1H, ddd, 3,5,10,5,14,5) 6,01 (1H, dd, 10,0,14,5) 6,08(1H, dd, 10,0,14,5)

5,18 (1H, dd, 10,5,14,5)

2,35 (1H,dt, 10,0)

1.46 (1H, m)

1,65 (1H, m)

1,02 (1H, m)

1,60 (1H,m)

3,96 (1H, d, 10,5)

1,93 (1H,m)

4,90 (1H, dd, 5,5,11,5)

1,75 (1H)

1,40 (1H, m)

1,77 (1H, m)

1,50 (1H,m)

1,65 (1H, m)

1,52 (1H,m)

3,84 (1H, d, 10,0)

1,68 (1H,m)

3,55 (1H, m)

1,37 (1H,m)

1,70 (1H, m)

0,95 (3H, t, 7,5)

1,14 (3H,d, 6,5)

0,85 (3H, d, 7,0)

1,45 (1H,m)

1,59 (1H,m)

1,35 (1H,m)

1,55 (1H, m)

0,88 (3H, t, 7,0)

0,98 (3H, d, 6,5)

1,25 (1H,m)

1,45 (1H,m)

3,80 (1H,m)

1,08 (3H)

0,78 (3H, d, 7,0)

0,93 (3H, d, 7,0)

0,80 (3H, d, 6,0)

0,83 (3H, d, 7,0)

5-OH

7-OH

9- OH

10- OH

11- OH

12- OH

13- OH4.24 (1H, široký s) 33-OH 3,40 (1H, d, 6,4)

43-OH 3,43 (1H, d)

1’

2'

3'

4'

5'

6'

4'-OH ¹³C NMR data (polohy 5_C) pro IB-96212 a IB-96212B jsou souhrnně uvedena v následující tabulce:

poloha	IB-96212	IB96212B
1	165,2	165,3
2	122,7	122,5
3	150,7	150,7
4	42,5	42,0
5	80,8	80,6
6	36,4	36,5
7	77,5	78,6
8	83,5	74,0
9	71,6	73,0
10	69,1	71,0
11	70,9	72,1
12	76,7	77,5
13	68,0	70,6
14	34,0	34,3
15	39,2	39,2
16	131,6	131,5
17	133,1	133,2
18	132,1	132,3
19	137,5	137,5
20	41,8	41,2
21	33,1	33,1
22	32,2	31,7
23	68,9	68,7
24	36,7	37,0
25	76,7	76,6
26	38,7	38,8
27	99,1	99,1
28	33,1	32,8
29	28,8	28,8
30	31,7	31,7
31	74,1	74,2
32	39,9	39,9
33	73,6	73,6
34	28,8	28,8
35	9,7	9,7
36	18,4	18,2
37	4,5	4,9
38	38,0	38,4
39	17,2	17,2

4

4 4 4

44 4 44 44 44 44 44

40	15,2	15,2
41	15,0	15,1
42	46,9	46,7
43	65,3	65,4
44	24,8	24,8
45	6,7	6,5
46	12,4	12,3
47	18,2	18,1
48	9,8
1'	104,4
2'	31,0
3'	31,9
4'	71,4
5'	77,6
6'	18,7

Původně byla na základě dat z obrázků 1 až 6 navržena struktura, která je uvedena v naší prioritní anglické patentové přihlášce, ale vzhledem k dalším datům dále uvedených obrázků jak pro IB-96212 tak pro IB-96212B jsme IB-96212 připsali strukturu následujícího vzorce

···· ·· ·· ·· ·· ··

Cukerný substituent může být odstraněn hydrolýzou, takže se získá sloučenina IB-96212B vzorce

Cukr v IB-96212 může být derivatizován konvenčním způsobem nebo může být sloučenina IB-96212B konvenčním způsobem derivatizována tak, že se cukr nahradí jinou skupinou substitutentu, čímž se získá sloučenina obecného vzorce

-^OH

O OH • · · ·

9999 99 99 99 99 99 v němž R může znamenat různou skupinu, podle toho, jak je to žádoucí.

Biologická aktivita: Sloučenina IB-96212 vykazuje dobrou antibakteriální aktivitu na Micrococcus lutens a jistou aktivitu na Staphylococcus aureus a Bacillus subtilis, ale ve vyšších koncentracích. Antimikrobiální aktivita sloučeniny IB-96212 byla studována inkubováním vybraných kmenů s různými koncentracemi IB-96212 v kapalném Mueller-Hintonově mediu při 35 °C.

IB-96212 a IB-96212B vykazují dobrou protinádorovou aktivitu na některé savčí nádorové buněčné linie. Protinádorová aktivita byla detegována in vitro kultivováním nádorových buněk podle metodologie popsané Bergeronem a spol.: Biochem. Biophys. Res. Commun. 1984, 121, 848, a Schroederem a spol.: J. Med. Chem. 1981, 24, 1078. Byla pozorována aktivita na některé lidské nádory, jako je leukemie, karcinom tlustého střeva, NSC plicní karcinom, melanom a podobné.

Některé nádory byly citlivější než jiné. Například bylo zjištěno, že buňky leukemie a MDR buňky leukemie byly alespoň stokrát citlivější než karcinom tlustého střeva.

Aktivita in vivo byla vyhodnocována na skupinách myších samiček s P388, injekcí QD 1-5 i.p., což poskytuje výsledky uvedené v tabulce 4.

• · · ·

00 0 ¢0 0

0 0 0

0000 00 00 00 00 00

Tabulka 4

injekční mg/kg	tělesná hmotn.	změna	den	doba
dávka celkem	den 0 den 5	hmotn.	úmrtí	přežití
IB-96212 0,02 0,1	21,6±0,5 22,6±0,5	0,8	2,6,10,	8,2±3,8
			10,13
IB-96212 0,01 0,05	20,6+1,0 21,7±0,7	1,1	9,11, 13,13,14	12,0±1,8
IB-96212 0,005 0,025	22,0±1,2 22,9±0,6	0,8	10,10, 11,11,13	11,0±1,1
POS	21,0±1,2 21,4±1,1	0,5	8,8,8,8,	8,4±0,5
			8,9,9,9

Předložený vynález se týká také farmaceutických prostředků, které jako účinnou složku obsahují sloučeninu IB-96212 nebo IB-96212B nebo jiný derivát daného obecného vzorce stejně jako způsobů jejich přípravy.

Mezi příklady farmaceutických prostředků patří jakákoliv pevná látka (tablety, pilulky, tobolky, granule atd.) nebo kapalina (roztoky, suspenze nebo emulze) s vhodným prostředkem pro orální, místní nebo parenterální podávání a mohou obsahovat čistou sloučeninu nebo prostředky potřebují být sterilní, jestliže se podávají parenterálně.

Přesná dávka farmaceutického prostředku IB-96212, IB-96212B nebo derivátu se bude měnit podle příslušného prostředku, způsobu aplikace a příslušných míst, hostitele a nádoru, který je léčen. V úvahu se vezmou také další faktory, jako je věk, tělesná hmotnost, pohlaví, dieta, doba podávání, rychlost vylučování, stav hostitele, • · • · · · · « · « • · · · · · ·«·· kombinace léčiv, reakční citlivost a intenzita onemocnění. Podávání se může provádět kontinuálně nebo periodicky v rámci maximální tolerované dávky.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález bude dále ilustrován s odkazem na následující příklady, které napomáhají pochopení předloženého vynálezu, ale které nejsou konstruovány jako jeho omezení. Všechna uváděná procenta znamenají procenta hmotnostní, pokud není jinak uvedeno. Všechny teploty jsou vyjádřeny ve stupních Celsia. Všechny inkubace jsou prováděny při 28 °C a baňky jsou třepány v orbitální třepačce. Všechna media a příjemci jsou sterilní a všechny způsoby kultivace jsou aseptické.

Příklad 1

Zásobní kultura: Celá živná půda čisté kultury Micromonospora sp. ES25-008 je uchovávána zmrazená ve 20% glycerolu.

Inokulum: Zmrazená kultura nebo dobře vyrostlá šikmá kultura (5 % obj.) se použije pro naočkování 100 ml shora popsaného očkovacího media ve 250mt kultivační baňnce. Baňka se inkubuje 48 hodin. 500 ml stejného media ve 2I Erlenmeyerově baňce se inkubuje 10 % inokula prvního stupně. Baňka se inkubuje 48 hodin.

Fermentace: 2,5 litry inokula druhého stupně se inkubuje 50 I již popsaného produkčního media v 171 fermentačním tanku. Fermentace se provádí 96 hodin při 400 otáčkách za minutu a průtoku vzduchu 0,5 V/V.M. Produkce sekundárního metabolitu se monitoruje testem celého živného media na P-388 nebo HPLC.

• · * · · 0 · · · · 00 0 0 ···· ·· 9 9009

0 0 99 9 000*

000 0 00« 00 0

0000 *0 00 00 00 0*

Příklad 2

Isolace: 10 I celé isolované živné půdy se zfiltruje, aby se oddělila biomasa a další pevné látky. Koláč mycelia se dvakrát extrahuje směsí rozpouštědel (2,4 I, chloroform:methanol:voda, 2:1:1). Aktivita se koncentruje v dolní vrstvě. Organické rozpouštědlo se zahustí a ve vakuu se odpaří dosucha. Získá se 450 mg surového extraktu.

Extrakt se chromatografuje na silikagelu, eluce směsí hexanu s ethylacetátem. Směsí hexanu s ethylacetátem (30:70) se eluuje 44mg frakce s protinádorovou aktivitou. Dalšího vyčištění se dosáhne chromatografií na koloně silikagelu. Aktivita byta eluována směsí chloroformu s methanolem (92:8). Získá se tak 19 mg suchého materiálu. Poslední čištění se provede chromatografií na koloně C18 s převrácenými fázemi, eluce směsí methanolu s vodou (90:10). Získá se 12 mg čistého IB-96212.

Příklad 3

Hydrolýza na IB-96212B: 31 mg IB-96212 se rozpustí ve 3 ml směsi chloroformu s methanolem (1:1). Přidá se 10 ml 15% roztoku kyseliny sírové a směs se udržuje na teplotě varu pod zpětným chladičem 3 hodiny. Reakční směs se zředí 15 ml vody a extrahuje se dvakrát 25 ml chloroformu. Získá se 30 mg reakčního produktu, který se analyzuje chromatografií na silikagelu a eluuje se směsí chloroformu s methanolem v poměru 96:4. Jako produkt hydrolýzy se získá 20 mg aglykonu.

Příklad 4

Biologická aktivita: Použitými protinádorovými buňkami byly P-388 (suspenzní kultura lymfatického neoplasmu z myší DBA/2), A-549 (monovrstvá kultura lidského makrocytického plicního karcinomu), HT-29 (monovrstvá kultura lidského karcinomu tlustého střeva), MEL-28 (monovrstvá kultura lidského melanomu) a další uvedené buněčné linie.

99 • ♦ ♦ « · • · 9

9 9

P-388 buňky se vysejí do 16mm jamek v množství 1.10⁴ buněk na jamku v 1 ml podílech MEM 5FCS obsahujících uvedenou koncentraci léčiva. Oddělená řada kultur bez léčiva se vyseje jako kontrola růstu, aby se zajistilo, že buňky zůstaly v exponenciální fázi růstu. Všechna stanovení byla provedena v dvojím provedení. Po třech dnech inkubace při 37 °C v 10 % (hmotn.) atmosféře oxidu uhličitého s vlhkostí 98 % hmotn. byly jamky obarveny 0,1% (hmotn.) krystalovou violetí. Hodnota IC50 byla vypočtena srovnáním růstu v jamkách s léčivem s růstem v kontrolních jamkách bez léčiva.

V tabulce 5 jsou uvedeny aktivity vyjádřené jako IC50- v mcg/ml.

Tabulka 5

sloučenina	P-388 P388MDR	MIEL8226	A-549	HT-29	MEL-38	CV1
IB-96212	0,0001	0,001	0,0005	1,00	1,00	1,00	0,0002
IB-96212B	0,001			1	1.2	1	0,001
cis-platina	2,5	2,5		2,5	5	2,5
adriamycin	0,02	1		0,002 0,05	0,02
taxol	0,2	>2		0,002 0,002	0,002
etopoxid	0.1	10		0,1	1	0,5

Antimikrobiální aktivita sloučeniny IB-96212 byla studována inkubováním testovaných mikroorgamismů s IB-96212 v kapalném Mueller-Hintonově mediu při 35 °C. Hodnota MIC byla stanovena objevením se zakalení v inkubačním mediu po 24 hodinách inkubace s IB-96212. V tabulce 6 jsou tyto výsledky uvedeny. IB-96212 vykazuje baktericidní aktivitu proti grampositivním bakteriím.

4 4 • 44 4 4 4

44

4 4

Tabulka 6

mikrorganismus	MIC (pg/ml)
Escherichia coli	>100
Klebsiella pneumoniae	>100
Pseudomonas aeruginosa	>100
Staphylococcus aureus	100
Bacillus subtilis	100
Micrococcus luteus	0,4

Předložený vynález byl podrobně popsán včetně jeho výhodných provedení. Odborníci v oblasti techniky si však uvědomí, že na základě předloženého popisu lze provádět modifikace a/nebo zlepšení.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Makrolidová sloučenina obecného vzorce v němž R znamená atom vodíku nebo skupinu substituentu.
2. Makrolidová sloučenina podle nároku 1, v němž R znamená atom vodíku nebo skupinu vybranou ze sacharidové skupiny, uhlovodíkové skupiny, acylové skupiny nebo heterocyklické skupiny.
3. Makrolidová sloučenina podle nároku 1, kterou je sloučenina označovaná zde jako IB-96212 vzorce
4 4 ··*· • · 44

4 4 4 4 ·· 4 4 4 4 4 • 44 44 « 4444

4 4 · 4 4 4 444 44 4

4 44 4*44 4444

4444 44 44 44 44 4 4 nebo sloučenina označovaná zde jako IB-96212B vzorce

O OH • · *· · Φ 9999 ·· ·φ • · · · ·· · ····

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 · ·»· 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 ·* 99 99 99

4. Makrolidová sloučenina označovaná zde jako IB-96212, při čemž obrázek 1 znamená HPLC chromatogram vyčištěné IB-96212, obrázek 2 znamená ultrafialové spektrum (UF) vyčištěné IB-96212, obrázek 3 znamená infračervené (IČ) spektrum vyčištěné IB-96212, obrázek 4 znamená protonové NMR (¹H) spektrum vyčištěné IB-96212, obrázek 5 znamená uhlíkové NMR (¹³C) spektrum vyčištěné IB-96212 a obrázek 6 znamená hmotnostní spektrum vyčištěné IB-96212.
5. Způsob výroby makrolidové sloučeniny IB-96212 podle nároku 3 nebo 4, vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci takového kmene mikroorganismu, který je schopen produkovat sloučeninu IB-96212 ve vodném výživném mediu za regulovaných podmínek.
6. Způsob výroby makrolidové sloučeniny IB-96212 podle nároku 5, vyznačující se t í m, že dále obsahuje isolaci a vyčištění makrolidové sloučeniny IB-96212 ze živného prostředí.
7. Způsob výroby makrolidové sloučeniny IB-96212 podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že mikrorganismem produkujícím IB-96212 je v podstatě čistý kmen kultury ES25-008, který je dostupný pod přístupovým číslem CECT-3333 z Colección Espaňola de Cultivos Tipo.
8. Způsob výroby makrolidové sloučeniny IB-96212B podle nároku 3, vyznačující se t í m, že zahrnuje hydrolýzu sloučeniny IB-96212 podle nároku 3.
9. Způsob výroby makrolidové sloučeniny podle nároku 1, v němž R neznamená atom vodíku, vyznačující se tím, že zahrnuje derivatizaci sloučeniny podle nároku 1, v němž R znamená atom vodíku.

99 99 • *9 9

9 9 9

9 9 9

9 9 9

9999 9·

99 9»99

9 9 9

9 9 9

9 9 V 9

99 99

99 99 • 9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9

99 99
10. Použití makrolidové sloučeniny podle nároku 1 pro léčení savčích rakovin, které jsou citlivé na tuto sloučeninu.
11. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje makrolidovou sloučeninu podle nároku 1.
12. Protinádorový farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje makrolidovou sloučeninu IB-96212 nebo IB-96212B v takovém množství, které je účinné proti jednomu nebo více savčím rakovinovým nádorům.
13. Kmen Micromonospora sp. ES25-008, který je dostupný pod přístupovým číslem CECT-3333.