CZ20004324A3

CZ20004324A3 - Hybridní polypeptidy

Info

Publication number: CZ20004324A3
Application number: CZ20004324A
Authority: CZ
Inventors: Shawn Barney; Kelly I Guthrie; Gene Merutka; Mohmed K Anwer; Dennis M Lambert
Original assignee: Trimeris
Priority date: 1999-05-20
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2001-06-13

Abstract

Zesilující peptidové sekvence odvozené od různých proteinových sekvencí retrovirálního obalu (gp41), které zlepšují farmakokinetické vlastnosti základního polypeptidu, na který jsou navázány. Hybridní polypeptidy obsahující zesilující peptidové sekvence navázané na základní polypeptid, mají zlepšené farmakokinetické vlastnosti, jako je zvýšený poločas. Způsoby zlepšení farmakokinetických vlastností základního polypeptidu navázáním zesilujících peptidových sekvencí na základní polypeptid. Farmaceuticky použitelné polypeptidy, které mohou být použity například jako léčebná nebo preventivní látka při léčení AIDS apod.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zesilujících (enhancerových) peptidových sekvencí původně odvozených od různých proteinových sekvencí retrovirálního obalu (gp41), které zesilují farmakokinetické vlastnosti jakéhokoli základního (core) polypeptidu, ke kterému jsou připojeny. Vynález je z části založen na objevu, že polypeptidy obsahující zesilující peptidové sekvence navázané na základní polypeptid, mají zlepšené farmakokinetické vlastnosti, jako je zvýšený poločas. Vynález se dále týká nových antifuzogenních a/nebo antivirálních peptidů, včetně peptidů obsahujících tyto zesilující peptidové sekvence a způsobů použití těchto peptidů. Vynález se dále týká způsobů zlepšení (zesílení) farmakokinetických vlastností jakéhokoli základního polypeptidu prostřednictvím navázání zesilujících peptidových sekvencí na základní polypeptid. Základní polypeptidy použitelné při provádění vynálezu mohou zahrnovat jakýkoli farmakologicky použitelný polypeptid, který může být například použit jako léčebná nebo preventivní látka. V neomezujícím provedení je vynález ukázán na příkladu, ve kterém je hybridní polypeptid obsahující například základní polypeptid HIV připojený k zesilujícím peptidovým sekvencím prokázán jako silný, necytotoxický inhibitor infekce HIV-1, HIV-2 a SIV. Navíc byly zesilující peptidové sekvence podle vynálezu navázány na základní polypeptid respiračního syncytiálního viru (RSV) a základní polypeptid receptorů luteinizačního hormonu (LH-RH). V každém případě bylo zjištěno, že hybridní polypeptid má zlepšené farmakokinetické vlastnosti a hybridní polypeptid RSV vykazoval významnou anti-RSV aktivitu.

« · » 4 * *· « · • · · · · · · • · ·· ·· · · ·

Dosavadní stav techniky

Polypeptidové produkty mají širokou oblast použití jako léčebné a/nebo preventivní látky pro prevenci a léčení onemocnění. Mnoho polypeptidů je schopno řídit biochemické nebo fyziologické procesy a tím buď předcházet onemocnění nebo poskytnout zmírnění příznaků spojených s onemocněním. Například polypeptidy jako virové nebo bakteriální polypeptidy byly úspěšně použity jako vakcíny pro prevenci patologických onemocnění. Navíc byly peptidy úspěšně používány jako léčebné látky pro léčbu příznaků onemocnění. Tyto peptidy patří do různých kategorií, jako například hormony, enzymy, imunomodulátory, sérové proteiny a cytokiny.

Aby se u polypeptidů projevily jejich patřičné biologické a terapeutické účinky na cílová místa, polypeptidy musí být v těchto místech působení přítomny ve vhodných koncentracích. Navíc musí být obecně zachována jejich strukturální integrita. Proto je formulace polypeptidů jako léčiv pro terapeutické použití řízena chemickou povahou a vlastnostmi polypeptidů, jako je jejich velikost a komplexnost, jejich konformační požadavky, a jejich často komplikované profily stability a rozpustnosti. Farmakokinetické vlastnosti jakéhokoli konkrétního peptidu s léčebnými účinky jsou závislé na biologické dostupnosti, distribuci a vylučování uvedeného peptidu z organismu.

Protože mnoho biologicky aktivních látek jako jsou peptidy a proteiny se v těle rychle rozkládá, je kritické vyvíjet účinné systémy pro udržování stabilní koncentrace peptidu v krevním oběhu pro zvýšení účinku těchto peptidů a pro minimalizaci výskytu a vážnosti nepříznivých vedlejčích účinků.

Podstata vynálezu za

Předkládaný vynález se prvé týká zesilujících • * • ·

- 3 (enhancerových) peptidových sekvencí původně odvozených od různých proteinových sekvencí retrovirálního obalu (gp41), tj. HIV-1, HIV-2 a SIV, které zesilují farmakokinetické vlastnosti jakéhokoli základního (core) polypeptidu, s kterým jsou spojeny. Vynález je založen na překvapivém výsledku, že totiž pokud jsou popisované zesilující peptidové sekvence spojeny s jakýmkoli základním polypeptidem, získané hybridní polypeptidy mají zlepšené farmakokinetické vlastnosti, včetně například zvýšení poločasu a snížené rychlosti vylučování z organismu ve srovnání se samotným základním polypeptidem. Předkládaný vynález se dále týká těchto hybridních polypeptidu a základních polypeptidu, a nových peptidů, které mají antifuzogenní aktivitu, antivirovou aktivitu a/nebo schopnost modulovat intracelulární procesy, které se týkají peptidových struktur se stočenou šroubovicí (coiled-coil). Mezi tyto peptidy patří peptidy, které obsahují zesilující peptidové sekvence.

Základní polypeptidy mohou zahrnovat jakékoli peptidy, které mohou být zaváděny do živého systému, například jakékoli peptidy schopné fungovat jaké léčebná, preventivní nebo zobrazující činidla použitelná pro léčení nebo prevenci onemocnění, nebo pro diagnostické nebo prognostické metody, včetně metod zobrazování in vivo. Mezi takové peptidy patří například růstové faktory, hormony, cytokiny, angiogenní růstové faktory, polypeptidy extracelulární matrice, receptorové ligandy, látky s agonistickými, antagonistickými nebo inverzně agonistickými účinky, látky s cílenými účinky na peptidy, jako jsou zobrazovací činidla nebo cytotoxické látky s cílenými účinky, nebo polypeptidy, které mají antifuzogenní a/nebo antivirální účinky a peptidy nebo polypeptidy, které fungují jako antigeny nebo imunogeny, včetně například virových a bakteriálních polypeptidu.

Vynález se dále týká způsobů zesílení farmakokinetických vlastností jakéhokoli základního polypeptidu pomocí spojení základního peptidu se zesilujícími peptidovými sekvencemi za vytvoření hybridních polypeptidů.

• · ······ ·· · ··· ·· · ···· ·*· ··· ··· ······· · ··· · · ··· · ·· · e ·· ···

- 4 Předkládaný vynález se ještě dále týká způsobu použití popisovaných polypeptidů včetně hybridních polypeptidů obsahujících zesilující peptidové sekvence. Například způsoby podle vynálezu zahrnují způsoby snížení nebo inhibice virové infekce, například HIV1, HIV-2, RSV, spalniček, chřipky, parainfluenzy, infekce virem Epstein-Barrové a virem hepatitidy a/nebo fúze buněk indukované viry. Zesilující peptidové sekvence podle vynálezu mohou být navíc použity pro zvýšení poločasu in vitro nebo ex vivo základního polypeptidů, na který byly zesilující peptidové sekvence navázány; zesilující peptidové sekvence mohou například zvýšit poločas navázaných základních polypeptidů v buněčné kultuře nebo buňkách nebo vzorcích tkáně.

Vynález je demonstrován na příkladech, ve kterých se ukazuje, že hybridní polypeptidy obsahující základní polypeptid HIV připojený k zesilující peptidové sekvenci mají značně zlepšené farmakokinetické vlastnosti a působí jako silné, necytotoxické inhibitory infekce HIV-1, HIV-2 a SIV. Vynález je dále ukázán na příkladech, ze kterých vyplývá, že hybridní polypeptidy obsahující základní polypeptid RSV nebo polypeptid luteinizačního hormonu, mají značně zlepšené farmakokinetické vlastnosti. Navíc měl hybridní polypeptid RSV významnou anti-RSV aktivitu.

1. Definice

Peptidy, polypeptidy a proteiny jsou zde definovány jako organické sloučeniny obsahující dvě nebo více kovalentně spojených aminokyselin, tedy spojených například peptidovými amidovými vazbami. Mezi peptidy, polypeptidy a proteiny mohou také patřit peptidy obsahující nepřirozené aminokyseliny a jakékoli modifikace a další aminoskupiny a karboxylové skupiny, jak bude dále popsáno. Termíny „peptid“, „polypeptid“ a „protein“ se zde tedy používají zaměnitelně.

·«····· · ··· · · • · · · · · ··· ··· · ·· ·· ·· ···

- 5 Peptidové sekvence jsou podle předkládaného vynálezu definovány jednopísmenovými symboly pro zbytky aminokyselin podle následujícího klíče:

A (alanin)

R (arginin)

N (asparagin)

D (kyselina asparagové)

C (cystein)

Q (glutamin)

E (kyselina glutamová)

G (glycin)

H (histidin)

I (isoleucin)

L (leucin)

K (lysin)

M (methionin)

F (fenylalanin)

P (prolin)

S (serin)

T (threonin)

W (tryptofan)

Y (tyrosin)

V (valin)

X (jakákoli aminokyselina) „Zasilující peptidové sekvence“ (enhancer peptide sequences) jsou definovány jako peptidy s následujícími konvenčními (consensus) ··· · ·· ·· ·· ···

- 6 aminokyselinovými sekvencemi: „WXXWXXXI“, „WXXWXXX“, „WXXWXX“, „WXXWX“, „WXXW“, „WXXXWXWX“, „XXXWXWX“, „XXWXWX“, „XWXWX“, „WXWX“, „WXXXWXW“, „WXXXWX“, „WXXXW“, „IXXXWXXW“, „XXXWXXW“, „XXWXXW“, „XWXXW“, „XWXWXX“, „XWXWX“, „XWXW“, „WXWXXXW“, „XWXWXXXW“, „XWXWXXX“, nebo „XWXXXW“, kde X může být jakákoli aminokyselina, W znamená tryptofan a I znamená isoleucin. Jak je diskutováno dále, zesilující peptidové sekvence podle předkládaného vynálezu také zahrnují peptidové sekvence, které jsou jinak stejné jako dohodnuté aminokyselinové sekvence, ale obsahují substituce, inzerce nebo delece aminokyselin, které však nesnižují schopnost peptidu zesilovat farmakokinetické účinky základního peptidu, na který jsou navázány, vzhledem k farmakokinetickým účinkům samotného základního polypeptidu.

„Základní polypeptid“ (core polypeptide), jak se zde používá, označuje jakýkoli polypeptid, který může být zaveden do živého systému, a představuje tedy biologicky aktivní molekulu, například jakýkoli polypeptid, který může fungovat jako farmakologicky využitelný peptid pro léčení nebo prevenci onemocnění.

„Hybridní polypeptid“, jak se zde používá, označuje jakýkoli polypeptid zahrnující amino-, karboxy-, nebo amino- a karboxykoncovou zesilující peptidovou sekvenci a základní polypeptid. Zesilující polypeptidová sekvence je typicky navázána přímo na základní polypeptid. Je třeba rozumět, že zesilující peptid může být také navázán na mezilehlou aminokyselinovou sekvenci přítomnou mezi zesilující peptidovou sekvencí a základním peptidem.

Termíny „antifuzogenní“ a „antimembránová fúze“, jak se zde používají, označují schopnost peptidu inhibovat nebo snižovat množství fúzí mezi dvěma nebo více strukturami, například buněčnými membránami nebo virovými obaly nebo pilusy, vzhledem k množství membránových fúzí, které probíhají mezi strukturami bez přítomnosti

tohoto peptidu.

„Antivirální“, jak se zde používá, označuje schopnost peptidu inhibovat virovou infekci buněk například prostřednictvím buněčné fúze nebo infekce volným virem. Tato infekce může zahrnovat fúzi membrán, ke které dochází v případě virů s obalem, nebo jakoukoli fúzi, jíž se účastní virová struktura a buněčná struktura, například fúzi virového pilusu a bakteriální membrány v průběhu konjugace bakterií.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1. Hybridní polypeptidy. Zesilující peptidové sekvence odvozené z domnělých N-koncových a C-koncových interaktivních oblastí jsou znázorněny jako navázané na obecný základní polypeptid. Konzervované zesilující peptidové sekvence jsou vystínovány. Je třeba zdůraznit, že označené zesilující peptidové sekvence mohou být použity buď jako -koncové, C-koncové nebo - a C-koncové adice. Navíc mohou být zesilující peptidové sekvence přidány k základnímu polypeptidu v dopředně nebo reverzní orientaci, jednotlivě nebo v jakékoli možné kombinaci, pro zesílení farmakokinetických vlastností peptidu.

Obr. 2A. Zesilující peptidové sekvence odvozené od různých proteinových sekvencí obalu (gp41), reprezentující N-koncovou interaktivní oblast pozorovanou u všech dosud publikovaných izolovaných sekvencí HIV-1, HIV-2 a SIV. Poslední sekvence „WXXWXXXI“ reprezentuje dohodnutou sekvenci.

Obr. 2B. Varianty zesilující peptidové sekvence odvozené od různých proteinových sekvencí obalu (gp41), reprezentující Ckoncovou interaktivní oblast pozorovanou u všech dosud publikovaných izolovaných sekvencí HIV-1, HIV-2 a SIV. Poslední sekvence „WXXXWXWX“ reprezentuje dohodnutou sekvenci.

Obr. 3. Srovnání titrů HIV-1 ve tkáních virem HIV-1 9320 infikovaných myší SCID-HuPBMC, přičemž měření byla prováděna pomocí hladin P24 v testech společné kultivace s HuPBMC. Obrázek ukazuje srovnání inhibice viru polypeptidy T20 a T1249 in vivo.

Obr. 4A - 4B. Farmakokinetický profil v plazmě polypeptidů T1249 proti kontrole základního polypeptidů T1387 v krysách CD po i.v. injekci do 2 hod (obr. 4A) a do 8 hod (obr. 4B). Polypeptid T1387 je základní polypeptid a polypeptid T1249 je základní polypeptid navázaný na zesilující polypeptidové sekvence.

Obr. 5. Farmakokinetický profil v plasmě polypeptidů T1249 proti kontrolnímu polypeptidů T20 v krysách CD po i.v. podání. Polypeptid T1249 je hybridní polypeptid základního polypeptidů (T1387) navázaného na zesilující peptidové sekvence T20: n = 4; T1249: n = 3.

Obr. 6. Porovnání aktivity a cytotoxicity Anti-HIV-1 /IIIb sloučenin T20/T1249.

Obr. 7. Přímá vazba polypeptidů T1249 na gp41-konstrukt Μ41Δ178. ¹²⁵I-T1249 byl čištěn HPLC do maximální specifické aktivity. Je ukázána saturační vazba na Μ41Δ178 (fuzní protein s ektodoménou gp41 postrádající aminokyselinovou sekvenci T20) imobilizovaný na mikrotitračních destičkách v koncentraci 0,5 mg/ml.

Obr. 8. Časový průběh asociace/disociace T1249. Výsledky ukazují, že ¹²⁵I-T1249 a ¹²⁵l-T20 mají podobné vazebné afinity 1 2 nM. Počáteční rychlosti přírůstku a úbytku pro ¹²⁵I-T1249 byly podstatně nižší než odpovídající hodnoty pro I-T20. Disociace navázaného radioligandu byla měřena po přidání neznačeného peptidu na konečnou koncentraci 10 μΜ v 1/10 celkového objemu testu.

Obr. 9. Kompetice pro vazbu T1249 na Μ41Δ178. Neznačené T1249 a T20 byly titrovány v přítomnosti jediné koncentrace buď ¹²⁵lT1249 nebo ¹²⁵l-T20. Ligand byl přidán ihned po neznačeném peptidu • · • · · · · · · • · · • · · ·

- 9 k zahájení inkubace.

Obr. 10A - 10B. Farmakokinetický profil v plasmě hybridních RSV polypeptidů T1301 (10A) a T1302 (10B) proti T786 v krysách CD.

Obr. 11A. Test snížení počtu plaků. Hybridní polypeptid T1293 je schopen inhibovat infekci RSV s koncentrací IC₅o 2,6 pg/ml.

Obr. 11B. Test snížení počtu plaků ukazuje schopnost hybridních RSV polypeptidů T1301, T1302 a T1303 inhibovat infekci RSV.

Obr. 12A a 12B. Farmakokinetický profil v plasmě hybridního polypeptidu luteinizačního hormonu T1324 proti T1323 u samců krys CD. Polypeptid T1323 je základní polypeptid luteinizačního hormonu a polypeptid T1324 je hybridní polypeptid obsahující základní polypeptid navázaný na zesilující peptidové sekvence.

Obr. 13. Hybridní polypeptidové sekvence odvozené od různých základních polypeptidů. Sekvence základních polypeptidů jsou ukázány vystínované. Nestínované amino- a karboxykoncové sekvence představují zesilující peptidové sekvence.

Obr. 14 A - B. Spektra cirkulárního dichroismu (CD) pro T1249 v roztoku (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem, pH 7) samostatně (10 μΜ při 1 - C; obr. 14A) a v kombinaci s peptidem o délce 45 zbytků z vazebné domény gp41 HR1 (T1346); plné čtverce () znázorňují teoretické spektrum předpovězené pro „model bez interakce“, zatímco skutečná spektra CD jsou znázorněna plnými kroužky (·).

Obr. 15. Elektroforéza na polyakrylamidovém gelu ukazující ochranu T1249 gp41-konstruktu Μ41Δ178 před štěpením proteinázou K; dráha 1: primerový markér; dráha 2: neštěpený Μ41Δ178; dráha 3: Μ41Δ178 inkubovaný s proteinázou K; dráha 4: neštěpený T1249; dráha 5: T1249 inkubovaný s proteinázou K; dráha 6: Μ41Δ178 inkubovaný s T1249; dráha 7: inkubace T1249 a Μ41Δ178 před přídavkem proteinázy K.

- 10 Obr. 16 A - C. Farmakokinetické vlastnosti polypeptidu T1249 u albinotických krys Sprague-Dawley; obr. 16A: Farmakokinetické vlastnosti polypeptidu T1249 při podání jedné dávky kontinuální podkožní infuzí; obr. 16B: Farmakokinetické vlastnosti v plasmě polypeptidu T1249 podávaného podkožní injekcí (s.c.) nebo intravenózní injekcí (i.v.); obr. 16C: Kinetická arialýza T1249 v lymfě a plasmě po intravenózním podání.

Obr. 17 A - B. Farmakokinetické vlastnosti polypeptidu T1249 v opicích cynomolgus; obr. 17A: Farmakokinetické vlastnosti v plasmě při jediné dávce 0,8 mg/kg polypeptidu T1249 subkutánní (s.c.), intravenózní (i.v.) nebo intramuskulární (i.m.) injekcí; obr. 17B: Farmakokinetické vlastnosti subkutánně podaného T1249 při třech různých dávkách (0,4 mg/kg, 0,8 mg/kg a 1,6 mg/kg).

Podrobný popis vynálezu

Budou popsány peptidové sekvence označované jako zesilující peptidové sekvence odvozené od různých proteinových sekvencí retrovirálního obalu (gp41), které jsou schopny zesilovat farmakokinetické vlastnosti základních polypeptidů, na které jsou navázány. Tyto zesilující peptidové sekvence mohou být použity při způsobech zlepšení farmakokinetických vlastností jakéhokoli základního polypeptidu navázáním zesilujících peptidových sekvencí na základní polypeptid za vytvoření hybridního polypeptidu se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi ve srovnání se samotným základním polypeptidem. Poločas základního peptidu, na který jsou jedna nebo více zesilujících peptidových sekvencí navázané, může být také zvýšen in vitro. Například navázané zesilující peptidové sekvence mohou zvyšovat poločas základního polypeptidu, jestliže jsou přítomny v buněčné kultuře, tkáňové kultuře nebo vzorcích tkáně pacienta, jako jsou buňky, tkáně nebo jiné vzorky.

• · · · · · ·

Základní polypeptidy hybridních polypeptidů podle vynálezu zahrnují jakýkoli peptid, který může být zaveden do živého systému, například peptid, který může fungovat jako léčebná nebo preventivní látka použitelná pro léčení nebo prevenci onemocnění, nebo jako zobrazovací látka využitelná pro zobrazování struktur in vivo. Jsou zde popisovány také peptidy včetně peptidů obsahujících zesilující peptidové sekvence, které vykonávají antifuzogenní a/nebo antivirální aktivity. Dále jsou popisovány způsoby použití těchto peptidů včetně způsobů snížení nebo inhibice virové infekce a/nebo fúze buněk indukované viry.

1. Hybridní polypeptidy

Hybridní polypeptidy podle vynálezu zahrnují alespoň jednu zesilující peptidovou sekvenci a základní polypeptid. S výhodou zahrnují hybridní polypeptidy podle vynálezu alespoň dvě zesilující peptidové sekvence a základní polypeptid, přičemž alespoň jeden zesilující peptid je přítomný v hybridním peptidu na aminovém konci vzhledem k základnímu peptidu a alespoň jedna zesilující peptidová sekvence je v hybridním polypeptidů přítomná na karboxylovém konci základního polypeptidů.

Zesilující peptidové sekvence podle vynálezu obsahují peptidové sekvence odvozené původně z různých proteinových sekvencí retrovirálního obalu (gp 41), včetně sekvencí HIV-1, HIV-2 a SIV, a specifické variace nebo modifikace těchto sekvencí popsané níže. Základní polypeptid může obsahovat jakoukoli peptidovou sekvenci, s výhodou jakoukoli peptidovou sekvenci, která může být zavedena do živého systému, včetně například peptidů použitelných pro terapeutické, profylaktické nebo zobrazovací účely.

Typicky bude mít hybridní polypeptid délku v rozmezí od přibližně 10 do přibližně 500 aminokyselinových zbytků, přičemž výhodné je rozmezí přibližně 10 až 100 aminokyselinových zbytků, • · · · · ·

”*- 1*2 a nejvýhodnější je rozmezí délek přibližně 10 až přibližně 40 aminokyselin. I když si autoři nepřejí být vázáni jakoukoli konkrétní teorií, struktura proteinu obalu je taková, že se domnělá oblast ašroubovice umístěná na C-konci proteinu, pravděpodobně asociuje s leucinovou zipovou oblastí umístěnou v N-koncové oblasti proteinu. Uspořádání N-koncové a C-koncové zesilující peptidové sekvence oblaastí gp41 pozorované ve všech dosud zveřejněných izolovaných sekvencích HIV-1, HIV-2 a SIV identifikovalo dohodnuté aminokyselinové sekvence.

Konkrétně byly identifikovány následující dohodnuté aminokyselinové sekvence představující dohodnuté zesilující peptidové sekvence (dohodnuté sekvence jsou uvedeny níže v dopředných a reverzních orientacích, protože uvedené zesilující peptidové sekvence mohou být použity buď v dopředně nebo v reverzní orientaci): „WXXWXXXI“, „WXXWXXX“, „WXXWXX, „WXXWX“, „WXXW“, „WXXXWXWX“, „XXXWXWX“, „XXWXWX“, „XWXWX“, „WXWX“, „WXXXWXW“, „WXXXWX“, „WXXXW“, „IXXXWXXW“, „XXXWXXW“, „XXWXXW“, „XWXXW“, „XWXWXXXW“, „XWXWXXX“, „XWXWXX“, „XWXWX“, „XWXW“, „WXWXXXW“ nebo „XWXXXW“, kde X může být jakákoli aminokyselina, W znamená tryptofan a I znamená isoleucin. Dopředně orientace konvenčních aminokyselinových sekvencí jsou ukázány v obr. 1 a 2.

Typicky bude mít zesilující peptidová sekvence délku přibližně 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 nebo 30 aminokyselinových zbytků, přičemž výhodná je délka přibližně 4 až přibližně 20 zbytků, výhodnější je délka přibližně 4 až přibližně 10 zbytků a nejvýhodnější je délka přibližně 6 až přibližně 8 zbytků.

Ve výhodném provedení vynálezu mohou obsahovat zesilující peptidové sekvence, které mohou být použity ke zlepšení farmakokinetických vlastností získaných hybridních polypeptidu, ·· · ♦ ···· ·· · ··· · - · · · ··· ······· · · · · · · • · «··· ··· •••£2 _ .........

specifické zesilující peptidové sekvence zznázorněné v obr. 2, 13, a tabulce 1 níže. Mezi nejvýhodnější zesilující peptidové sekvence patří sekvence obsahující následující aminokyselinové sekvence: „WQEWEQKI“ a „WASLWEWF“. Jako příklad a bez omezení uvádí tabulka 1 níže aminokyselinové sekvence, které představují výhodná provedení zesilujících peptidových sekvencí podle vynálezu. Je třeba rozumět, že i když je dále znázorněna pouze dopředná orientace těchto sekvencí, do rozsahu předkládaného vynálezu také spadá reverzní orientace těchto sekvencí. Jestliže je například dále znázorněna dopředná orientace zesilující peptidové sekvence „WMEWDREI“, je také zahrnuta její reverzní orientace, tj. „IERDWEMW“.

Tabulka 1

WMEWDREI

WQEWERKV

WQEWEQKV

MTWMEWDREI

NNMTWMEWDREI

WQEWEQKVRYLEANI

NNMTWQEWEZKVRYLEANI

WNWFI

WQEWDREISNYTSLI

WQEWEREISAYTSLI

WQEWDREI

WQEWEI

WNWF

WQEW

WQAW

WQEWEQKI

WASLWNWF ► · · · · ·

WASLFNFF

WDVFTNWL

WASLWEWF

EWASLWEWF

WEWF

EWEWF

IEWEWF

IEWEW

EWEW

WASLWEWF

WAGLWEWF

AKWASLWEWF

AEWASLWEWF

WASLWAWF

AEWASLWAWF

AKWASLWAWF

WAGLWAWF

AEWAGLWAWF

WASLWAW

AEWASLWAW

WAGLWAW

AEWAGLWAW

DKWEWF

IEWASLWEWF

IKWASLWEWF

DEWEWF

GGWASLWNWF

GGWNWF

V dalším výhodném provedení zahrnují konkrétní zesilující peptidové sekvence podle vynálezu zesilující peptidové sekvence znázorněné na obr, 2, 13 a v tabulce 1, které vykazují konzervativní substituce aminokyselin v jedné, dvou nebo třech polohách, přičemž • · *···«· ·« · • J · ·· · ···· ······· · · · · · · • · · · · · ··· ··· · ·· ·· ·· ···

- 15 uvedené substituce nesnižují schopnost zesilující peptidové sekvence zlepšovat farmakokinetické vlastnosti hybridního polypeptidů, vzhledem k odpovídajícímu základnímu polypeptidů.

Tyto substituce nejvýhodněji vedou k zesilujícím peptidovým sekvencím, které spadají do jedné z konvenčních zesilujících peptidových sekvencí. Substituce jako takové se obecně provádějí na zbytcích aminokyselin odpovídajících polohám „X“ znázorněným v konvenčních aminokyselinových sekvencích uvedených výše a v obr. 1 a 2. „Konzervativní substituce“ označují substituce zbytky aminokyselin s podobným nábojem, velikostí a/nebo hydrofobními/hydrofilními vlastnostmi, jako má substituovaný aminokyselinový zbytek. Tyto vlastnosti aminokyselin jsou odborníkům v oboru dobře známy.

Předkládaný vynález dále poskytuje zesilující peptidové sekvence obsahující aminokyselinové sekvence z obr. 1, 2, 13 a tabulky 1, které jsou jinak stejné, ale uvedené zesilující peptidové sekvence obsahují adice jedné nebo více aminokyselin (obecně ne více než 15 aminokyselinových zbytků v délce), delece (například zkrácení na aminovém nebo karboxylovém konci) nebo nekonzervativní substituce, které však nesnižují schopnost získaného zesilujícího peptidu zvyšovat farmakokinetické vlastnosti základních polypeptidů, které jsou k němu připojeny, vzhledem k základním peptidům bez těchto zesilujících peptidových sekvencí.

Počet adicí není obecně větší než přibližně 15 aminokyselinových zbytků a mohou zahrnovat adice přibližně 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 nebo 15 za sebou následujících aminokyselinových zbytků. Celkový počet zbytků aminokyselin přidaných k původnímu zesilujícímu peptidu není s výhodou vyšší než přibližně 15 aminokyselinových zbytků, výhodněji není vyšší než přibližně 10 aminokyselinových zbytků a nejvýhodněji není vyšší než přibližně 5 aminokyselinových zbytků.

» · · · • ·

Delece jsou s výhodou delece ne více než celekm přibližně 3 aminokyselinových zbytků (buď následujících nebo nenásledujících za sebou), výhodnější jsou delece s výhodou 2 aminokyselinových zbytků a nejvýhodnější jsou delece jednoho aminokyselinového zbytku. Obecně se budou delece týkat zbytků aminokyselin odpovídajícím zbytkům označeným „X“ konvenčních sekvencí zesilujících peptidů.

Zsilující peptidové sekvence podle vynálezu také zahrnují konkrétní zesilující peptidové sekvence znázorněné na obr. 2, 13 a v tabulce 1, obsahující jednu, dvě nebo tři substituce nekonzervativních aminokyselin, přičemž výhodné jsou dvě takové substituce a nejvýhodnější je jedna taková substituce. Označení „nekonzervativní“ substituce se týká substitucí aminokyselinovými zbytky, které nemají podobný náboj, velikost a/nebo hydrofobní/hydrofilní vlastnosti jako nahrazovaný aminokyselinový zbytek. Tyto vlastnosti aminokyselin jsou odborníkům v oboru dobře známé.

Navíc nemusí být substituce aminokyselin, a v některých provedeních s výhodou nejsou, omezeny na geneticky kódované aminokyseliny. Peptidy mohou samozřejmě obsahovat geneticky nekódované aminokyseliny. Navíc k přírodně se vyskytujícím geneticky kódovaným aminokyselinám mohou být zbytky aminokyselin v peptidech nahrazeny v přírodě se vyskytujícími nekódovanými aminokyselinami i syntetickými aminokyselinami.

Některé běžně používané aminokyseliny, které poskytují použitelné substituce, zahrnují bez omezení β-alanin (β-Ala) a jiné omega-aminokyseliny jako je 3-aminopropionová kyselina, 2,3-diaminopropionová kyselina (Dpr), 4-aminomáselná kyselina atd.; a-aminoisomáselná kyselina (Aib); ε-aminohexanová kyselina (Aha); δaminovalerová kyselina (Ava); N-methylglycin nebo sarkosin (MeGly); ornithin (Orn); citrullin (Cit); t-butylalanin (t-BuA); t-butylglycin (t-BuG); N-methylisoleucin (Melle); fenylglycin (Phg); cyklohexylalanin (Cha);

• * · · · · • · · » » · ·«· ·*····· · « · · · · • · ······» ♦ · · · ·* ·· ·· ···

- 17 norleucin (Nle); naftylalanin (Nal); 4-chlorfenylalanin (Phe(4-CI)); 2fluorfenylalanin (Phe(2-F)); 3-fluorfenylalanin (Phe(3-F)); 4fluorfenylalanin (Phe(4-F)); penicillamin (Pen); kyselina 1,2,3,4-tetrahydroisochinolin-3-karboxylová (Tic); β-2-thienylalanin (Thi); methioninsulfoxid (MSO); homoarginin (hArg); N-acetyllysin (AcLys); kyselina 2,4-diaminomáselná (Dbu); kyselina 2,3-diaminomáselná (Dab); p-aminofenylalanin (Phe(pNH₂)); N-methylvalin (MeVal); homocystein (hCys), homofenylalanin (hPhe) a homoserin (hSer); hydroxyprolin (Hyp), homoprolin (hPro), N-methylované aminokyseliny a peptoidy (N-substituované glyciny).

I když budou ve většině případů aminokyseliny peptidu substituované L-enantiomery aminokyselin, substituce nejsou na tyto L-enantiomerní aminokyseliny omezeny. V definici „mutovaných“ nebo „změněných“ forem jsou tedy také zahrnuty situace, kdy je Laminokyselina nahrazena identickou D-aminokyselinou (např. L-Arg -> D-Arg) nebo D-aminokyselinou stejné kategorie nebo subkategorie (např. L-Arg -> D-Lys) a naopak.

Je třeba rozumět, že předkládaný vynález zahrnuje také analogy peptidů, ve kterých je jedna nebo více amidových vazeb popřípadě nahrazena vazbou jinou než amidovou, s výhodou substituovaný amid nebo isoster amidu. I když tedy budou zbytky aminokyselin v peptidech obecně popisovány z hlediska aminokyselin, a výhodná provedení vynálezu jsou ukazována na příkladech peptidů, odborníkům v oboru bude zřejmé, že v provedeních obsahujících neamidové vazby se týká termín „aminokyselina“ nebo „zbytek“ jiných bifunkčních skupin nesoucích skupiny podobné strukturou postranním řetězcům aminokyselin. Navíc mohou být tyto zbytky aminokyselin blokované nebo neblokované.

Dále může být jedna nebo více amidových vazeb nahrazena peptidomimetickými nebo amidomimetickými skupinami, které výrazně neinterferují se strukturou nebo aktivitou peptidů. Vhodné * ·*··«« 0 · 9 ··· ·· « «·.· • * * ·»· ««· • »♦!»»« I ··· * « * * · · · · ··· ^β·* · · · ·· » · · · ·

- 18 amidomimetické skupiny se popisují například v Olson a další, 1993, J. Med. Chem. 36: 3049.

Zasilující peptidové sekvence mohou být použity pro zlepšení farmakokinetických vlastností základního polypeptidu ve formě buď Nkoncových, C-koncových, nebo - a C-koncových adicí. I když je výhodné, aby byly zesilující peptidové sekvence používány v párech, tj. aby výhodné hybridní polypeptidy obsahovaly zesilující peptidové sekvence jak na aminovém, tak i na karboxylovém konci, hybridní polypeptidy mohou obsahovat také jediný zesilující peptid, přičemž tento peptid je přítomen buď na aminovém nebo na karboxylovém konci hybridního polypeptidu. Navíc mohou být zesilující peptidy použity buď v dopředně nebo reverzní orientaci nebo v jakékoli možné kombinaci navízány na základní polypeptid. Je třeba poznamenat, že jakýkoli ze zesilujících peptidů může být zaváděn buď na N-konci nebo C-konci základního polypeptidu. Ještě dále mohou být v N-, C-, nebo a C-koncových polohách hybridních polypeptidů zaváděny vícečetné zesilující peptidové sekvence. Vícečetné zesilující peptidové sekvence mohou být navázány přímo jedna na druhou stejnými druhy vazeb jako se používají pro vazbu zesilující peptidové sekvence na základní polypeptid (viz níže). Navíc může být mezi jednu nebo více vícečetných zesilujících peptidových sekvencí vložena aminokyselinová sekvence stejného druhu, jak se popisuje níže. Vícečetné zesilující peptidové sekvence budou typicky obsahovat od 2 do přibližně 10 jednotlivých zesilujících peptidových sekvencí (se stejnou nebo rozdílnou aminokyselinovou sekvencí), přičemž přibližně 2 až 4 tyto sekvence budou výhodné.

Je třeba rozumět, že základní polypeptid je obecně navázán na zesilující peptidy prostřednictvím peptidové amidové vazby, ačkoli pro spojení zesilujících peptidových sekvencí se základními polypeptidy mohou být použity i jiné vazby než jsou vazby amidové. Tyto vazby jsou dobře známé odborníkům v oboru a patří mezi ně například jakákoli vazba uhlík-uhlík, esterová vazba nebo chemická vazba φφφφ Φ

- 19 • φ φφφφ ·· · • » * φφφφ • » · » 9 · • · ΦΦΦΦ φ

Φ·Φφ Φ Φ · ·· ΦΦ ΦΦ ΦΦΦ fungující tak, aby spojila zesilující peptidové sekvence podle vynálezu se základním peptidem.

Typicky je zesilující peptidová sekvence navázána přímo na základní polypeptid. Zesilující peptidová sekvence může být také navázána na vložené aminokyselinové sekvence přítomné mezi zesilující peptidovou sekvencí a základním polypeptidem. Vložené aminokyselinové sekvence mohou mít typicky rozmezí velikostí od přibližně 1 do přibližně 50 aminokyselinových zbytků, přičemž výhodné jsou délky přibližně 1 až přibližně 10 aminokyselinových zbytků. Stejné druhy vazeb popisovaných pro spojení zesilujícího peptidu se základním polypeptidem mohou být použity pro spojení zesilujícího peptidu s vloženým peptidem.

Jak je diskutováno v případě zesilujících peptidových sekvencí výše, základní a vložené aminokyselinové sekvence nemusí být omezeny na geneticky kódované aminokyseliny, ale mohou obsahovat jakoukoli aminokyselinu a modifikace vazeb popisované výše.

Aminové a/nebo karboxylové konce získaného hybridního polypeptidů mohou obsahovat aminoskupinu (-NH2), popřípadě karboxylovou (-COOH) skupinu. Alternativně může být aminový konec hybridního polypeptidů například hydrofobní skupina, včetně bez omezení skupin karbobenzyl, dansyl, t-butoxykarbonyl, dekanoyl, naftoyl nebo jiné uhlohydrátové skupiny; acetylová skupina; skupina 9fluorenylmethoxykarbonyl (FMoc); nebo modifikovaný zbytek aminokyseliny, který se nevyskytuje v přírodě. Alternativně může karboxylový konec hybridního polypeptidů obsahovat amidovou skupinu; skupinu t-butoxykarbonyl; nebo modifikovaný zbytek aminokyselin, který se nevyskytuje v přírodě. Jako neomezující příklad aminových a/nebo karboxylových konců může získaný hybridní polypeptid obsahovat jakoukoli z modifikací aminových a/nebo karboxylových konců uvedených v peptidech z obr. 13 nebo tabulky 2 níže.

······· · ··· · · • · ···· ··· •·* _Λ · ·· ·· ·· ···

- 20 Hybridní polypeptid typicky obsahuje aminokyselinovou sekvenci, která se nevyskytuje v přírodě. To znamená, že aminokyselinová sekvence hybridního polypeptidu se typicky neskládá výlučně z aminokyselinové sekvence nebo fragmentu endogenního, v přírodě se vyskytujícího polypeptidu. Navíc nemá hybridní polypeptid obsahovat pouze polypeptid vyskytující se v přírodě s úplnou délkou.

Základní polypeptidy mohou obsahovat jakýkoli polypeptid, který lze zavést do živého systému, například jakýkoli polypeptid, který může fungovat jako farmakologicky využitelný polypeptid. Tyto základní polypeptidy mohou být například použitelné pro léčení nebo prevenci onemocnění, nebo pro použití v diagnostických nebo prognostických metodách, včetně metod zobrazování in vivo. Dolní limit velikosti základního polypeptidu je typicky přibližně 4 až 6 aminokyselinových zbytků. Teoreticky neexistuje žádný horní limit velikosti základního polypeptidu, protože takový základní polypeptid může obsahovat jakýkoli polypeptid vyskytující se v přírodě nebo jeho fragment, nebo jakýkoli modifikovaný nebo syntetický polypeptid. Typicky má však základní polypeptid délku v rozmezí od přibližně 4 až 6 aminokyselin do přibližně 494 až 500 aminokyselin, přičemž výhodná jsou rozmezí přibližně 4 až přibližně 94 až 100 aminokyselinových zbytků a nejvýhodnější jsou rozmezí přibližně 4 až přibližně 34 až 40 aminokyselinových zbytků.

Příklady možných základních polypeptidů poskytovaných výlučně jako příklady a nikoli jako omezení, zahrnují bez omezení růstové faktory, cytokiny, terapeutické polypeptidy, hormony, např. insulin, a peptidové fragmenty hormonů, inhibitory nebo látky zesilující účinek cytokinů, peptidové růstové a diferenciační faktory, interleukiny, chemokiny, interferony, faktory stimulující tvorbu kolonií, angiogenní faktory, receptorové ligandy, agonistické, antagonistické nebo inverzně agonistické látky, peptidové látky s cílenými účinky a proteiny extracelulární matrice jako je kolagen, laminin, fibronektin a integrin, pokud uvádíme pouze některé. Navíc mohou možné základní peptidy • · *···«· ·· · • · · ·· « ···· ·«····· · ··· · · ···_· ·· ·· ·· ···

- 21 zahrnovat virové nebo bakteriální polypeptidy, které mohou fungovat buď přímo nebo nepřímo jako imunogeny nebo antigeny, a mohou být tedy použitelné při léčení nebo prevenci patologických stavů.

Reprezentativní příklady hybridních polypeptidů, které obsahují základní polypeptidy odvozené od virových proteinových sekvencí, jsou ukázány v obr. 13, kde jsou sekvence základních polypeptidů stínovány. Základní polypeptidy také bez omezení zahrnují polypeptidy uvedené v US patentu No. 5,464,933, US patentu No. 5,656,480 a WO 96/19495, které se uvádějí ve své úplnosti odkazem.

Sekvence základního polypeptidu mohou dále obsahovat bez omezení polypeptidové sekvence uvedené v tabulce 2 níže. Je třeba poznamenat, že peptidy uvedené v tabulce 2 zahrnují hybridní polypeptidy navíc k základním polypeptidům. Sekvence hybridních polypeptidů budou však zřejmé ve světle koncových zesilujících peptidových sekvencí jako částí hybridních polypeptidů.

Tabulka 2

No. Sekvence

GIKQLQARILAVERYLKDQ

NNLLRAIEAQQHILLQLTVW

NEQELLELDKWASLWNWF

YTSLIHSLIESSQNQQEK

Ac-VWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWG-NH₂

QHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ

LRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV

VQQNNLLQARIEAQQHLLQLTVWGIKQL

RQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLT

MTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQ

VVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLL • ······ ·· • · · · · · ·

VVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLL

LLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNY

Ac-VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNG-NH₂

Ac-LLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNY-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-IELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMAST

-NH₂

Ac-IELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKY-NH₂

Ac-ENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTEL-NHz

Ac-DAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQST-NH₂

Ac-CNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL-NH₂

Ac-SNIKENKCHGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL-NH₂

Ac-ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGV-NH₂

Ac-SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNG-NH₂

Ac-VLHLEGEVNKIKSALLSTHKAVVSLSNGVSVLTSK-NH₂

Ac-ARKLQRMKQLEDKVEELLSKNYHYLENEVARLKKLV-NH₂

Ac-RMKQLEDKVEELLSKNYHYLENEVARLKKLVGER-NH₂

Ac-VQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQL-NH₂

Ac-LRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLOARILAV-NH₂

Ac-QHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-RQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLT-NH₂

Ac-MTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQ-NH₂

Ac-AKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSS-NH₂

Ac-AAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSS-NH₂

Ac-AKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVA-NH₂

Ac-GTIALGVATSAQITAAVALVEAKQARSD-NH₂

Ac-ATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEA-NH₂ • · ···· ··

- 23 • · ·· ·· ···

Ac-AAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKA-NH₂

Ac-IEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVA-NH₂

Ac-IRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDY-NH₂

Ac-AVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNKEIV-NH₂

Ac-ARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGI-KQLARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQ-NH₂

Ac-MTWMEMDREINNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQE-LLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-WMEWDREINNYTSLIGGSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH₂

Ac-INNYTSLIGGSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH₂

Ac-INNYTSLIGGSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH₂

Ac-EWDRENNYTSLIGSLIEESQNQQEKNEQEGGC-NH₂

Ac-QSRTLLAGIVQQQCLLDVVKRQQELLR-NH₂

Ac-NNDTWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKN-myelqklnswd-nh₂

Ac-WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEK-NH₂

Ac-VDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQK-NH₂

Ac-ITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF-NH₂

Ac-SSESFTLLEQWNNWKLQLAEQWLEQINEKHYLEDIS-NH₂

Ac-DKWASLWNWF-NH₂

Ac-NEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-EKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-NQQEKKEQELLELDKWASLWWWF-NH₂

Ac-ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-NDQKKLMSNNQIVRQQSYSIMSIIKEE-NH₂

Ac-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-VSKGYSALRTGWYTSVITIELSNIKEN-NH₂

Ac-VVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLL-NH₂

Ac-VNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSK-NH₂

Ac-PIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLVFIR-NH₂

Ac-NLVYAQLQFTYDTLRGYINRALAQIAEA-NH₂

Ac-LNQVDLTETLERYQQRLNTYALVSKDASYRS-NH₂

Ac-ELLVLKKAQLNRHSYLKDSDFLDAALD-NH₂

Ac-LAEAGESSVTEDTEREDTEEEREDEEE-NH₂

Ac-ALLAEAGEESVTEDTEREDTEEEREDEEEENEART-NH₂

Ac-ETERSVDLVAALLAEAGEESVTEDTEREDTEEERE-NH₂

Ac-EESVTEDTEREDTEEEREDEEEENEART-NH₂

Ac-VDLVAALLAEAGEESVTEDTEREDTEEE-NH₂

Ac-NSETERSVDLVAALLAEAGEESVTE-NH₂

Ac-DISYAQLQFTYDVLKDYINDALRNINMDA-NH₂

Ac-SNVFSKDEIMREYNSQKQHIRTLSAKVNON-NH₂

Biotin-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Dig-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Biotin-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Dig-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-VLHQLNIQLKQYLETQERLLGNRIAARQLLQIWKDVA-NH₂

Ac-LWHEQLLNTAQRAGLQLQLQLINQALAVREKVLIRYDIQK-nh₂

Ac-LLDNFESTWEQSKELWEQQEISIQNLHKSALQEYW-NH₂

Ac-LSNLLQISNNSDEWLEALEIEHEKWKLTQWQSYEQF-NH₂

Ac-KLEALEGKLEALEGKLEALEGKLEALEGKLEALEGK-NH₂

Ac-ELRALRGELRALRGELRALRGELARALRGK-NH₂

Ac-ELKAKELEGEGLAEGEEALKGLLEKAAKLEGLELLK-NH₂ • ·»···· ·· • · · · * · ·

100

101

102

103

104

105

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

Ac-WEAAAREAAAREAAAREAAARA-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNAF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNENEQELLELDKWASLANWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLQLDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNQQELLQLDKWASLWNWF-NH₂

Ac-RMKQLEDKVEELLSKNYHLENEVARLKKLVGER-NH₂

Ac-QQLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKNQ-NH₂

Ac-NEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIQSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-INFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRK-NH₂

Ac-INFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKS-NH₂

Ac-NFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSD-NH₂

Ac-FYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDE-NH₂

Ac-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL-NH₂

Ac-DPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH-NH₂

Ac-LVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHN-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-FPSDEFDASISQVNEKINQWLAFIRKSDELLHNVN-NH₂

Ac-PSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNA-NH₂

Ac-SDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAG-NH₂

Ac-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH₂

Ac-EFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKS-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-DASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTT-NH₂

Ac-ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSN-NH₂

Ac-SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNG-NH₂ • · ······ »· • · · · · « ··· ······· · ··· · » • · · · · · ·«· *•-*26* - ** ** ·* ··*

Ac-GVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGY-NH₂

Ac-VAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVS-NH₂

Ac-AVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSV-NH₂

Ac-VSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVL-NH₂

Ac-SKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLT-NH₂

Ac-KVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTS-NH₂

Ac-VLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSK-NH₂

Ac-LHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKV-NH₂

Ac-HLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVL-NH₂

Ac-LEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLD-NH₂

Ac-EGEVNKINSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDL-NH₂

Ac-GEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLK-NH₂

Ac-EVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKN-NH₂

Ac-VNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNY-NH₂

Ac-NKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYI-NH₂

Ac-KIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYID-NH₂

Ac-IKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDK-NH₂

Ac-KSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQ-NH₂

Ac-SALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQL-NH₂

Ac-ALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLL-NHs

Ac-YTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYK-NH₂

Ac-TSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKN-NH₂

Ac-SVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNA-NH₂

Ac-VITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAV-NH₂

Ac-ITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVT-NH₂

Ac-TIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTE-NH₂

Ac-IELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTEL-NH₂

Ac-ELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQ-NH₂

- 27 Ac-LSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQL-NH₂

Ac-SNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL-NH₂

Ac-NIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLM-NH₂

Ac-IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQ-NH₂

Ac-KENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQS-NH₂

Ac-EKKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELDLLMQST-NH₂

Ac-LLDNFESTWEQSKELWELQEISIQNLHKSALQEYWN-NH₂

Ac-ALGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRD-NH₂

Ac-LGVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDT-NH₂

Ac-GVATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTN-NH₂

Ac-VATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNK-NH₂

Ac-ATSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKA-NH₂

Ac-TSAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAV-NH₂

Ac-SAQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQ-NH₂

Ac-AQITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQS-NH₂

Ac-QITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSV-NH₂

Ac-ITAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQ-NH₂

Ac-TAAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQS-NH₂

Ac-AAVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSS-NH₂

Ac-AVALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSI-NH₂

Ac-VALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIG-NH₂

Ac-ALVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGN-NH₂

Ac-LVEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNL-NHs

Ac-VEAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLI-NH₂

Ac-EAKQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIV-NH₂

Ac-KQARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAI-NH₂

Ac-QARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNL!VAIK-NH₂

Ac-ARSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKS-NH₂

Ac-RSDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSV-NH₂

Ac-SDIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQ-NH₂

Ac-DIEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQD-NH₂

Ac-IEKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDY-NH₂

Ac-EKLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYV-NH₂

Ac-KLKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVN-NH₂

Ac-LKEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNK-NH₂

AC-KEAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNKE-NH2

AC-EAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNKEI-NH2

AC-AIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNKEIV-NH2

AC-IRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKSVQDYVNKEIV-NH2

AC-YTPNDITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKE-NH2

AC-TPNDITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEW-NH2

AC-PNDITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWI-NH2

AC-NDITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIR-NH2

AC-DITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRR-NH2

AC-ITLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRS-NH2

AC-TLNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSN-NH2

AC-LNNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQ-NH2

AC-NNSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQK-NH2

AC-NSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKL-NH2

AC-VALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDS-NH2

AC-ALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSI-NH2

AC-LDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIG-NH2

AC-DPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGN-NH2

AC-PIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNW-NH2

AC-IDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWH-NH2

AC-DISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWIQ-NH2 ······· · ··· · · • · · · · · ···

.........

Ac-ISIELNKAKSDLEESKEWRRSNQKLDSIGNWHQS-NH₂

Ac-SIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQSS-NH₂

Ac-IELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQSST-NH₂

Ac-ELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWHQSSTT-NH₂

Ac-ELRALRGELRALRGELRALRGELRALRGELRALRGK-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQQKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELNKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEQSQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIQESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIQQSQNQQQKNQQQLLQLNKWASLWNWT-NH₂

Ac-EQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-QELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-ELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-LLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-LELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-ELDKWASI_WNWF-NH₂

Ac-WASLWNWF-NH₂

Ac-ASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLANAA-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQQLLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIQSLIEESQNQQEKNQQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-EAAAREAAAREAAARLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-PSLRDPISAEISIQALSYALGGDINNKYLEKLGYSG-NH₂

Ac-SLRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGG-NH₂

Ac-LRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGD-NH₂

Ac-RDPISAEISIQALSYALGGDINKVI_EKLGYSGGDL-NH₂

Ac-DPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLL-NH₂

Ac-PISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLG-NH₂

Ac-ISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGI-NH₂

Ac-SAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGIL-NH₂

Ac-AEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILE-NH₂

Ac-EISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILES-NH₂

Ac-ISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESR-NH₂

Ac-SIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRG-NH₂

Ac-IQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGI-NH₂

Ac-QALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIK-NH₂

Ac-ALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIKA-NH₂

Ac-LSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIKAR-NH₂

Ac-PDAVYLHRIDLGPPISLERLDYGTNLGNAIAKLED-NH₂

Ac-DAVYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDA-NH₂

Ac-AVYLHRIDLGPPISLERLDVGTHLGNAIAKLEDAK-NH₂

Ac-VYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKE-NH₂

Ac-YLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKEL-NH₂

Ac-LHRIDLGPPISLERLDVGTHLGHAIAKLEDAKELL-NH₂

Ac-HRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLE-NH₂

Ac-RIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLES-NH₂

Ac-IDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESS-NH₂

Ac-DLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSD-NH₂

Ac-LGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDO-NH₂

Ac-GPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDOI-NH₂

Ac-PPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQIL-NH₂

Ac-PISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILR-NH₂

Ac-ISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQIRS-NH₂

Ac-SLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSW-NH₂

Ac-LERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSMK-NH₂

Ac-EWIRRSNQKLDSI-NH₂ • · · I • · »· · · · · « • · · · <

• · · · ·

- 31 Ac-LELDKWASLANAF-NH₂

Ac-LELDKWASLFNFF-NH₂

Ac-LELDKWASLANWF-NH₂

Ac-LELDKWASLWNAF-NH₂

Ac-ELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTSTSA-NH₂

Ac-TELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTSTS-NH₂

Ac-STELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTST-NH₂

Ac-ISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLTS-NH₂

Ac-DISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKLT-NH₂

Ac-LDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVKL-NH₂

Ac-NLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNVK-NH₂

Ac-GNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVNV-NH₂

Ac-TGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKVN-NH₂

Ac-VTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDKV-NH₂

Ac-IVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLDK-NH₂

Ac-VIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKLD-NH₂

Ac-QVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSKL-NH₂

Ac-SQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNSK-NH₂

Ac-DSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESNS-NH₂

Ac-LDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEESN-NH₂

Ac-ILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEES-NH₂

Ac-SILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLEE-NH₂

Ac-ISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKLE-NH₂

Ac-NISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDKL-NH₂

Ac-KNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALDK-NH₂

Ac-QKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNALD-NH₂

Ac-YQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNAL-NH₂

Ac-TYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISNA-NH₂

298 Ac-ATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSISN-NH₂

299 Ac-DATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSIS-NH₂

300 Ac-FDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNSI-NH₂

301 Ac-EFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVNNS-NH₂

302 AC-GEFDATYQKNISILDSQVIVTGHLDISTELGHVNN-NH2

303 Ac-SGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNVN-NH₂

304 Ac-LSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGNV-NH₂

305 Ac-RLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELGN-NH₂

306 AC-LRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELG-NH2

306 Ac-LRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTELG-NH₂

307 AC-TLRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTEL-NH2

308 AC-ITLRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDISTE-NH2

309 Ac-GITLRLSGEFDATYQKNISILDSQVIVTGNLDIST-NH₂

310 Ac-TATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQFNNT-NH₂

311 Ac-ITATIEAVHEVTDGLSOLAVAVQKMQQFVNDOFNH-NH₂

312 Ac-SITATIEAVHEVTDGLSOLAVAVGKMQQFVNDQFH-NH₂

314 Ac-KESITATIEAVHEVIDGLSQLAVAVGKMQQFVNDQ-NH₂

315 Ac-LKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVND-NH₂

316 AC-RLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFVN-NH2

317 Ac-LRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQFV-NH₂

318 Ac-ILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQF-NH₂

319 AC-NILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQQ-NH2

320 Ac-ANILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKMQ-NH₂

321 Ac-AANILRLKESITATIEAVHEVTDGLSQLAVAVGKM-NH₂

322 Ac-HKCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGV-NH₂

323 Ac-KCDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVK-NH₂

324 Ac-CDDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKL-NH₂

325 Ac-DDECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLS-NH₂ ······· · ··· · · • · · · · · ··· ··· · ·· ·· ·· ···

- 33 Ac-DECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSS-NH₂

Ac-ECMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSM-NH₂

Ac-CMNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMG-NH₂

Ac-MNSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGV-NH₂

Ac-NSVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVY-NH₂

Ac-SVKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQ-NH₂

Ac-VKNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI-NH₂

Ac-KNGTYDYPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQIL-NH₂

Ac-AFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-VVLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNL-NH₂

Ac-VLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLR-NH₂

Ac-LAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRA-NH₂

Ac-AGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRAS-NH₂

Ac-GAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASL-NH₂

Ac-AALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLE-NH₂

Ac-ALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLET-NH₂

Ac-LGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETT-NH₂

Ac-GVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTN-NH₂

AC-VATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQ-NH2

Ac-ATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNAQ-NH₂

AC-TAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAI-NH2

AC-AAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIE-NH2

AC-AQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEA-NH2

Ac-QITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAI-NH₂

Ac-ITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIR-NH₂

AC-TAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQ-NH2

AC-AGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQA-NH2

AC-GIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAG-NH2 • · ·

Ac-IALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQ-NH₂

Ac-ALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQE-NH₂

Ac-LHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEM-NH₂

Ac-HQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMI-NH₂

Ac-QSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMIL-NH₂

Ac-SMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAAGQEMIL-NH₂

Ac-MLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAV-NH₂

Ac-LNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQ-NH₂

Ac-NSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQG-NH₂

Ac-SQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGOEMILAVQGY-NH₂

Ac-QAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGOEMILAVQGVQ-NH₂

Ac-AIDNLRASLETTNQAIEAIROAGQEMILAVQGYQD-NH₂

Ac-IDHLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDY-NH₂

Ac-DNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYI-NH₂

Ac-NLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYIN-NH₂

Ac-LRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYINN-NH₂

Ac-RASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGYQDYINNE-NH₂

Ac-YTSVITIELSNIKENKUNGTDAVKLIKQELDKYK-NH₂

Ac-TSVITIELSNIKENKUNGTDAVKLIKQELDKYKN-NH₂

Ac-SVITIELSNIKENKUNGTDAVKLIKQELDKYKNA-NH₂

Ac-SNIKENKUNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLL-NH₂

Ac-KENKUNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQS-NH₂

Ac-CLELDKWASLWNWFC-NH₂

Ac-CLELDKWASLANWFC-NH₂

Ac-CLELDKWASLFNFFC-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLFNFF-NH₂

Ac-RMKQLEDKVEELLSKNYHLENELELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-KVEELLSKNYHLENELELDKWASLWNWF-NH₂ • · • · « ·>

* » · · * «·· ··· · ·· ·· ·« ···

- 35 Ac-RMKQLEDKVEELLSKLEWIRRSNQKLDSI-NH₂

Ac-RMKQLEDKVEELLSKLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-ELEALRGELRALRGELELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-LDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSI-NH₂

Ac-CNEQLSDSFPVEFFQV-NH₂

Ac-MAEDDPYLGRPEQMFHLDPSL-NH₂

Ac-EDFSSIADMDFSALLSQISS-NH₂

Ac-TWQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQ-NH₂

Ac-WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQK-NH₂

Ac-QEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNWYELQKL-NH₂

Ac-EWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLN-NH₂

Ac-WERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS-NH₂

Ac-ERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSW-NH₂

Ac-RKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWD-NH₂

Ac-KVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDV-NH₂

Ac-VDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVF-NH₂

Ac-DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFG-NH₂

Ac-FLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGN-NH₂

Ac-LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNW-NH₂

Ac-LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFGNWF-NH₂

Ac-NEQSEEKENELYWAKEQLLDLLFNIFNQTVGAWIMQ-NH₂

Ac-QQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKD-NH₂

Ac-QQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQ-NH₂

Ac-QQLLDVVKRQQELLRLTVWGPKNLQTRVTAIEKYLKDQ-NH₂

Ac-DERKQDKVLVVQQTGTLQLTLIQLEKTAKLQWVRLNRY-NH₂

Ac-QQQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKY-NH₂

Ac-QQLLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYL-NH₂

Ac-QLLDWKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLK-NH₂

Ac-LLDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKD-NH₂

Ac-LDVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQ-NH₂

Ac-DVVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQA-NH₂

Ac-VVKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQ-NH₂

Ac-VKRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQACL-NH₂

Ac-KRQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLN-NH₂

Ac-RQQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNA-NH₂

Ac-QQELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNA-NH₂

Ac-QELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNAWG-NH₂

Ac-ELLRLTVWGTKNLQTRVTAIEKYLKDQAQLNAWGC-NH₂

Ac-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGPKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-SELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAK-NH₂

Ac-ELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKS-NH₂

Ac-LEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSS-NH₂

Ac-EIKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSE-NH₂

Ac-IKRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSEN-NH₂

Ac-KRYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSEND-NH₂

Ac-RYKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDR-NH₂

Ac-YKNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRL-NH₂

Ac-KNRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLR-NH₂

Ac-NRVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRL-NH₂

Ac-RVASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLL-NH₂

Ac-VASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLL-NH₂

Ac-ASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLK-NH₂

Ac-SRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ-NH₂

Ac-RKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQM-NH₂

Ac-KCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMC-NH₂

Ac-CRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCP-NH₂ • « • · · · • ♦ 9 ···«··« «·· · , „ * * ···«»*„ ·*· * ·· ·♦ ·· ···

- 37 Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPS-NH₂

Ac-AKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSL-NH₂

Ac-KFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLD-NH₂

Ac-FKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDV-NH₂

Ac-KQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVD-NH₂

Ac-QLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDS-NH₂

Ac-LLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSI-NH₂

Ac-LQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSII-NH₂

Ac-QHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIP-NH₂

Ac-HYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPR-NH₂

Ac-YREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRT-NH₂

Ac-REVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTP-NH₂

Ac-EVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPD-NH₂

Ac-VAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDV-NH₂

Ac-AAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVL-NH₂

Ac-AAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLH-NH₂

Ac-AKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHE-NH₂

Ac-KSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHED-NH₂

Ac-SSENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDL-NH₂

Ac-SENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLL-NH₂

Ac-ENDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLN-NH₂

Ac-NDRLRLLLKQMCPSLDVDSIIPRTPDVLHEDLLNF-NH₂

Ac-PGYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGML-NH₂

Ac-GYRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLP-NH₂

Ac-YRWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPV-NH₂

Ac-RWMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVC-NH₂

Ac-WMCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCP-NH₂

Ac-MCLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPL-NH₂ •» » • ’ ^ř · * · · · ^r ' · 4 « » ·* * ’ * ‘ · Λ » · .

' í * · · · » » • * * · · « »9 «· · · ·

- 38 Ac-CLRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLI-NH₂

Ac-LRRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIP-NH₂

Ac-RRFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPG-NH₂

Ac-RFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGS-NH₂

Ac-FIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSS-NH₂

Ac-IIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSST-NH₂

Ac-IFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTT-NH₂

Ac-FLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTS-NH₂

Ac-LFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTST-NH₂

Ac-FILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTG-NH₂

Ac-ILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGP-NH₂

Ac-LLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPUPGSSTTSTGPC-NH₂

Ac-LLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCR-NH₂

Ac-LCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRT-NH₂

Ac-CLIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTC-NH₂

Ac-LIFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCM-NH₂

Ac-IFLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMT-NH₂

Ac-FLLVLLDYQGMLPVCPLIPGSSTTSTGPCRTCMTT-NH₂

Ac-PLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT-NH₂

Ac-LLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTT-NH₂

Ac-LVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTV-NH₂

Ac-VLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVC-NH₂

Ac-LQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCL-NH₂

Ac-QAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLG-NH₂

Ac-AGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQ-NH₂

Ac-GFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVLCGQN-NH₂

Ac-FFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVLCGQNS-NH₂

Ac-FLLTRILTIPQSLDSWWTSLHFLGGTTVCLGQNSQ-NH₂ ·· *···

Ac-LLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVLCGQNSQS-NH₂

Ac-LTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVLCGQNSQSP-NH₂

Ac-FWNWLSAWKDLELKSLLEEVKDELQKMR-NH₂ nnllraieaqqhllqltvw-nh₂

Ac-CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLIKDQ-nh₂ ytslihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂ c₁₃h₂₇co-ytslihslieesqnqqekneqelleldkwasl-wnwf-nh₂

Ac-AVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKUNGTDA-NH₂

Ac-SISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVS-NH₂

Ac-DQQIKQYKRLLDRLIIPLYDGLRQKDVIVSNQESN-NH₂

Ac-YSELTNIFGDNIGSLQEKGIKLQGIASLYRTKITEI-NH₂

Ac-TSITLQVRLPLLTRLLNTQIYRVDSTSYNIQNREWY-NH₂

Ac-VEIAEYRRLI_RTVLEPIRDALNAMTQNIRPVQSYA-NH₂

Ac-SYFIVLSIAYPTLSEIKGVIVHRLEGVSYNIGSQEW-NH₂

Ac-LEKAIRDTNKAVQSVQSSIGNLIVAIKS-NH₂ nnllraieaqqhllqltvwgikqlqarilaverylkdq-nh₂ nnllraieaqqhllqltvwgikqlqarilaverylkdq-nh₂

CKQEPIDKELYPLTSL

YPKFVKQNTLKLAT

OYIKANQKFIGITE ngoigkdpnrdily

Ac-RPDVY-OH

CLELDKWASLWNWFC-(cyklický)

Ac-NNLLRAIEAQQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-CGGYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-PLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGT-NH₂

Ac-LLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTT-NH₂

Ac-LVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTTV-NH₂

Ac-VLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTTVC-NH₂

Ac-LQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTTVCL-NH₂

Ac-QAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTTVCLG-NH₂

Ac-AGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTTVCLGQ-NH₂

Ac-GFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTTVCLGQN-NH₂

Ac-FFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNPLGGTTVCLGQNS-NH₂

Ac-FLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQ-NH₂

Ac-LLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQS-NH₂

Ac-LTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGTTVCLGQNSQSP-NH₂

Ac-LELDKWASLWNWA-NH₂

Ac-LELDKWASAWNWF-NH₂

Ac-LELDKWASLWNWA-NH₂

Ac-DELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-KSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-IRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-AFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFI-NH₂

Ac-YAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKE-NH₂

Ac-SVIEKMNTQFEAVGKEFGNLERRLENLNKRMEDGFL-NH₂

Ac-VWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRMQL-NH₂

Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGGC-NH₂

Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNNQELLELDKWASL-NH₂

Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNNQELLE-NH₂

Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNNQELLE-NH₂

Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNNQELLELD-kwaslwnwf-nh₂

Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQLLDSIGNWH-NH₂

Ac-NQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKIFI-NH₂

Ac-QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKIF-NH₂

Ac-SQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKI-NHs

Ac-ESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-NH₂

Ac-EESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYI-NH₂

Ac-IEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWY-NH₂

Ac-LIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWLW-NHz

Ac-SLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNWL-NH₂

Ac-HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITNW-NH₂

Ac-IHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNITN-NH₂

Ac-LIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNIT-NH₂

Ac-SLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI-NH₂

Ac-TSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFN-NH₂

Ac-NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW-NH₂

Ac-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-NH₂

Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW-NH₂

Ac-EINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH₂

Ac-REINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS-NH₂

Ac-DREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA-NH₂

Ac-WDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKW-NH₂

Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-NH₂

Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-NH₂

Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂

Ac-TWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH₂

Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂

Ac-NMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH₂

Ac-NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-NH₂

Ac-WNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ-NH₂

Ac-IWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNE-NH₂

Ac-QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKN-NH₂

Ac-EQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEK-NH₂

Ac-LEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQE-NH₂

Ac-SLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQ-NH₂

Ac-KSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQ-NH₂

Ac-NKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQN-NH₂

Ac-SLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRK-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQQQQEKQEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNA-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSD-NH₂

Ac-ASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-ISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-QVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-NEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-KINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

-43 Ac-NQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-FWNWLSAWKDLELYPGSLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-CGGNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-CGGYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ

Ac-EKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQYGV-NH₂

Ac-QEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQYG-NH₂

Ac-QQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQY-NH₂

Ac-IQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYIQ-NH₂

Ac-QIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQYG-NH₂

Ac-AQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQY-NH₂

Ac-QAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWLDFTSWVRYIQ-NH₂

Ac-QQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYL-NH₂

Ac-VQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERY-NH₂

Ac-IVQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVER-NH₂

Ac-GIVQQQNHLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVE-NH₂

Ac-SGIVQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAV-NH₂

Ac-RSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTV-NH₂

Ac-GARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQL-NH₂

Ac-GSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQH-NH₂

Ac-EGSTMGARSMTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQ-NH₂

Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSENORLRLL-NH₂

Ac-AKFKQLLQHYREVAAAKSSENORLRLLL-NH₂

Ac-KFKQLLQHYREVAAAKSSENORLRLLLK-NH₂

- 44 Ac-FKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQ-NH₂

Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSENORLRLLKQMCPS-NH₂ dkwasi_wnwf-nh₂

Biotin-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-YDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQALAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-YDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLENV-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEEINQSLAFIRKSDELLENV-NH₂

Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLENV-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVHEEINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-SNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQ-NH₂

Ac-WSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEES-NH₂

Ac-SWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEE-NH₂

Ac-ASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIE-NHz

Ac-NASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLI-NHz

Ac-WNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSL-NH₂

Ac-PWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHS-NH₂

Ac-VPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLIH-NH₂ ······· · ··· · · • · · · · · ··· ··· · ·· ·· ·· ···

-45 Ac-AVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSLI-NH₂

Ac-TAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTSL-NH₂

Ac-TTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTWMEWDREINNYTS-NH₂

Ac-AAASDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-VFPAAAFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEKIAAALAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSAAAIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFAAASDELLHNV-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKAAALLHNV-NH₂

Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEAAANV-NH₂

Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-AAAAIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQQQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKQ-NH₂

A,c-QIWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKQ-NH₂

Ac-NKSLEQWNNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQQ-NH₂

Ac-FDASISQVNEKINQSLAFIEESDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-ACIRKSDELCAL-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKDEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQDQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKDEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKDEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ ······· · ··· · · • · · · · · ··· • · · · ·· · · ·· ···

- 46 Ac-LEANITQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH₂

Ac-LEANISASLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH₂

Ac-LEANISALLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH₂

Ac-LEANITASLEQAQIQQEKNMYELQKLNSWDVFTNWL-NH₂

Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMUPS-NH₂

Ac-Abu-DDE-Abu-MNSVKNGTYDRPKYEEESKLNRNEIKGVKL-nh₂

Ac-WQEWEQKVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL-NH₂

Ac-DEYDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLW-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASL-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS-NH₂

Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL

-averylkdq-nh₂

Ac-DREÍNNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN-WF-NH₂

Ac-NNMTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-DK-NH₂

Ac-YTSLIHSL1EESQNQQEKNEQELLELDKWASLWAAA-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLAAAKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQAAAELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKAAAELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQAAANEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESAAAQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIAAAQNQQEKAAAELLELDKWASLWNWF-NH₂ ······· · * · · · · • · ···· ··«.

··· · ·· ·· ·· ···

- 47 Ac-YTSLIHAAAEESQNQQEKAAAELLELDKWASLWNWF-NH

Ac-YTSAAASLIEESQNQQEKAAAELLELDKWASLWNWF-NH

Ac-EIWNNMTWMEWDRENEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-YISEYNEENQSLAFIRKADELLENVDKWASLWNWF-NH₂

Ac-TSVITIELSNIKENKANGTDAKVKLIKQELDKYKH-NH₂ ytslihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwfmg-nh₂

Ac-NEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Biotin-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL-NH₂

Biotin-PLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLH-NH₂

Biotin-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Biotin-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGK-NH₂

Biotin-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-VYPSDEFDASISQVQEEIQQALAFIRKADELLEQV-NH₂

Ac-NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-INNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-EINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLHSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI-NH₂

Ac-YTSLHSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFIT-NH₂

Ac-YTSLHSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-ITN-NH₂

Ac-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN-AGK-NH₂ • * ······ ·· · *·· ♦· » ···· ······· · ..: * z • · ····««» ··· · ·· ·· .· ...

- 48 Ac-NYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFN-NH₂

Ac-NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFNI-NH₂

Ac-KCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDV-DSIIPRTPD-NH₂

Ac-RAKFKQLLQHYREVAAAKSSEMDRLRLLLKQMCPSLDVDSI-IPRTPD-NH₂ vypsdeydasisqvmeemqalayiaaadellenv-nh₂ ydasisqvneeinqalayirkadell-nh₂

Ac-M-NIe-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂

Ac-KNGTYDRPKYEEESKLNRNEIKGVKLSSMGVYQI-NH₂

Ac-VTEKIQMASDNINDLIQSGVNTRLLTIQSHVQNYI-NH₂ qnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂

Ac-QNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ lwnwf-nh₂ elleldkwaslwnwf-nh₂ ekneqelleldkwaslwnwf-nh₂ slieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNW

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN tslihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂ slihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂ lihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂ ihslieesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂

Ac-AAVALLPAVLLALLAPSELEIKRYKNRVASRKCRAKFKQLL-qhyrevaaak-nh₂ «««···· « ··« 9 · • · · · · · 9 9 9

-*49 - ** ** ** ***

Ac-AAVALLPAVLLALLAPCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDR-lrlllkqmcp-nh₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNNNIERDWEMWTMNNWIQ-NH₂ vypsdeydasisqvneeinqalayirkadellenv-nh₂

Ac-LMQLARQLMQLARQMKQLADSLMQLARQVSRLESA-NH₂

Ac-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂

Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂

Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂

Ac-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLE-NH₂

Biotin-W-NIe-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂

Ac-YLEYDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂

Ac-IKQFINMWEQEVGKAMYA-NH₂

Ac-IRKSDELL-NH₂

Dekanoyl-IRKSDELL-NH₂

Acetyl-Aca-Aca-IRKSDELL-NH₂

Ac-YDASISQV-NH₂

Ac-NEKINQSL-NH₂

Ac-SISQVNEEINQALAYIRKADELL-NH₂

Ac-QVNEEINQALAYIRKADELL-NH₂

Ac-EEINQALAYIRKADELL-NH

Ac-NQALAYIRKADELL-NH₂

Ac-LAYIRKADELL-NH₂ fdasisqvnekinqalafirksdell-nh₂

Ac-W-Nie-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂

Ac-ASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCP-sldvds-nh₂

Ac-WLEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-NH₂ « 9 « Λ 9

- 50 Ac-YVKGERIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSL-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQSLAYIRKADELLHNV-NH₂

AC-YDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH2

AC-YDASISQVNEEINQALAYIRKADELLE-NH2

AC-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKAAELLHNV-NH2

Dekanoyl-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQLLAYIRKLDELLENV-NH₂

Ac-DEYDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-SNDQGSGYAADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKTNT-NH₂

Ac-ESTQKAFDGITNKVNSVIEKTNTQFEAVGKEFGNLEKR-NH₂

Ac-DGITNKVNSVIEKTNTQFEAVGKEFGNLEKRLENLNK-NH₂

Ac-DSNVKNLYDKVRSQLRDNVKELGNGAFEFYHK-NH₂

Ac-RDNVKELGNGAFEFYHKADDEALNSVKNGTYDYPKY-NH₂

Ac-EFYHKADDEALNSVKNGTYDYPKY-NH₂

AC-AAVALLPAVLLALLAPAADKESTQKAFDGITNKVNS-NH2

Ac-AAVALLPAVLLALLAPAADSNVKNLYDKVRSQLRDN-NH₂

AC-KESTQKAFDGITNKVNSY-NH2

AC-IKETNTQFEAVGKEFGNLER-NH2

AC-RLENALNKRVEDGFLDVWTYNAELLVALENE-NH2

Ac-SNVKNLYDKVRSQLRDN-NH₂

AC-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2

AC-WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE-NH2

AC-MEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH2

AC-MEWDREINNYTSLIHSL1EESQNQQEKNEQE-NH2

AC-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELE-NH2

AC-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH2

Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH₂

Ac-YTKFIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YMKQLADSLMQLARQVSRLESA-NH₂

Ac-YLMQLARQMKQLADSLMQLARQVSRLESA-NH₂

Ac-YQEWERKYDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL-NH₂

Ac-WMAWAAAINNYTSLHSLIEESONOQEKNEQEEEEE-NH₂

Ac-YASLIAALIEESQNQQEKNEQELLELAKWAALWAWF-NH₂ [Ac-EWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEGGC-NH₂] dimer

Ac-YDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH₂

Blotinyl-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH₂

Ac-YTSLI-OH

Fmoc-HSLIEE-OH

Fmoc-SQNQQEK-OH

Fmoc-NEQELLEL-OH

Fmoc-DKWASL-OH

Fmoc-WNWF-OH

Ac-AKTLERTWDTLNHLLFISSALYKLNLKSVAQITLSI-NH₂

Ac-NITLQAKIKQFINMWQEVGKAMYA-NH₂

Ac-LENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDN-NH₂

Ac-LENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNVKELGNG-NH₂

Ac-TLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNVKELGNGAFEF-NH₂

Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH₂

Biotinyl-SISQVNEEINQALAYIRKADELL-NH₂

Biotinyl-SISQVNEEINQSLAYIRKSDELL-NH₂

Ac-SISQVNEEINQSLAYIRKSDELL-NH₂

Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIEKSNQELDSIGNWE-NH₂

Ac-IDISIELKNAKSDLEESKEWIKKSNQELDSIGNWH-NH₂

Ac-IDISIELNKAKSDLEEAKEWIKKANQKLDSIGNWH-NH₂

- 52 1027 Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIKKANQKLDSIGNWH-NH₂

1028 Ac-IDISIELNKAKSDLEEAKEWIKKSNQKLDSIGNWH-NH₂

1029 Biotinyl-NSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKL-NH₂

1030 Biotinyl-ALDPHIDISIELNKAKSDLEESKEWIKKSNQKLDSI-NH₂

1031 desaminotyrosin-NSVALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWlKK-SNQLK-NH₂

1032 desaminotyrosin-ALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWlKK-SNQKLDSI-NH₂

1033 Ac-YDASISQVNEEINQALAFIRKADEL-NH₂

1034 Ac-YDASISQVNEEINQSLAYIRKADELL-NH₂

1035 Biotinyl-YDASISQVNEEINQALAYIRKADELL-NH₂

1036 Biotinyl-YDASISQVNEEINQSLAFIRKSDELL-NH₂

1037 Ac-YDASISQVNEEINQSLAFIRKSDELL-NH₂

1038 Ac-WLEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQEL-NH₂1039Biotinyl-IDISIELNKAKSDLEESKEWIRRSNQKLDSIGNWH-NH₂

1044 Ac-YESTQKAFDGITNKVNSVIEKTNTQFEAVGKEFGNLEKR-NH₂

1045 Biotin-DEYDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

1046 Ac-MEWDRElNNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL-NH₂

1047 Ac-WQEWEQKVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYEL-NH₂

1048 Ac-WOEWEQKVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNEYEL-NH₂

1049 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYEL-NH₂

1050 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNMYEL-NH₂

1051 Ac-WQEWEQKVRYLEANISQSLEQAQIQQEKNEYELQLK-NH₂

1052 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQLK-NH₂

1053 Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQLK-NH₂

1054 Ac-IDISIELNKAKSDLEESKEWIEKSNQKLDSIGNWH-NH₂

1055 Ac-EFGNLEKRLENLNKRVEDGFLDVWTYNAELLVALENE-NH₂

1056 Ac-EDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDK-vrmql-nh₂ • ·

- 53 Ac-SISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂ desaminoTyr-SISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-SISQVNEKINQSLAYIRKSDELL-NH₂

Ac-QQLLDVVKRQQEMLRLTVWGTKNLQARVTAIEKYLKDQ-NH₂

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWFC

Ac-FDASISQVNEKINQSLAYIRKSDELL-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWA lndol-3-acetyl-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂ lndol-3-acetyl-DEFDESISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂ lndol-3-acetyl-DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂ lndol-3-acetyl-DEFDESISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂ lndol-3-acetyl-DEFDESISQVNEKIEESLQFIRKSDELL-NH₂ lndol-3-acetyl-GGGGGDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLNH₂

2-Naftoyl-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂ desNH₂Tyr-DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL -NH₂ biotin-ALDPIDISIELNKAKSDLEESKEWRRSNQKLDSI-NH₂

Ac-YDASISQVNEKIHQALAYlRKADELLHHVNAGKST-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEKINQALAYIRKADELLHNV-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEKINQSLAYIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-WGWGYGYG-NH₂

Ac-YGWGWGWGF-NH₂

Ac-WQEWEQKVRYLEANITALQEQAQIQAEKAEYELQKL-NH₂

Ac-WQEWEQKVRYLEAEITALQEEAQIQAEKAEYELQKL-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWAS

Ac-VWPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-SKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSDWGV-NH₂

Ac-LSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSDWG-NH₂

- 54 Ac-DLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSDW-NH₂

Ac-EDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSD-NH₂

Ac-IEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTS-NH₂

Ac-GIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWT-NH₂

Ac-IGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWW-NH₂

2-Naftoyl-PSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVN-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEKINQALAYIRKADELLENV-NH₂

Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQALAFIRKADELLENV-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELLENV-NH₂

Biotinyl-YDASISQVNEKINQSLAFIRESDELL-NH₂

Ac-AIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKW-NH₂

Ac-AAIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGK-NH₂

Ac-DAAIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGG-NH₂

Ac-PDAAIGIEDLSKNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLG-NH₂

Ac-NITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQWI-NH₂

Ac-KNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRQW-NH₂

Ac-TKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWRG-NH₂

Ac-WTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGWR-NH₂

Ac-DWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTGW-NH₂

Ac-HDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWTG-NH₂

Ac-PHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWWT-NH₂

Ac-EPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNWW-NH₂

Ac-IEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDNDNW-NH₂

Ac-AIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKITPDQGDNDN-NH₂

Ac-AAIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDND-NH₂

Ac-DAAIEPHDWTKNITDKIDQIIHDFVDKTLPDQGDN-NH₂

Ac-LSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIFF-NH₂

Ac-GLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPIF-NH₂

1113 Ac-VGLSPTVWLSVTWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLPI-NH₂

1114 Ac-FVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLLP-NH₂

1115 Ac-WFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPLL-NH₂

1116 Ac-QWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFLPL-NH₂

1117 Ac-VQWFVGLSPTVWLSVTWMMWYWGPSLYSILSPFLP-NH₂

1118 Ac-FVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPFL-NH₂

1119 Ac-PFVQWFVGLSPTVWLSVIWMMWYWGPSLYSILSPF-NH₂

1120 Ac-VPFVQWFVGLSPTVWLSVTWMMWYWGPSLYSILSP-NH₂

1121 Ac-LVPFVQWFVGLSPTVWLSVTWMMWYWGPSLYSILS-NH₂

1122 H-NHTTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL-DKW-OH

1123H-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-AVERYLKDQ-OH

1124 Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIREADELLENV-NH₂

1125 Ac-VFPSDEFDASISQVNEKINQSLAYIREADELLENV-NH₂

1126 Ac-DEFDASISQVNEKINQSLAYIREADELL-NH₂

1127 Ac-NEQELLELDKWASLWNWFGGGGDEFDASISQVNEKINQ-SLAFIRKSDELL-NH₂

1128 Ac-LELDKWASLWNWFGGGGDEFDASISQVNEKINQSLAFIR-ksdell-nh₂

1129 2-Naftoyl-EGEGEGEGDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

1130 Ac-ASRKCRAKFKQLLQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSL-DV-NH₂

1131 2-Naftoyl-GDEEDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

1132 2-Naftoyl-GDEEDASESQVNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

1133 2-Naftoyl-GDEEDASESQQNEKINQSLAFIRKSDELL-NH₂

1134 2-Naftoyl-GDEEDASESQQNEKQNQSLAFIRKSDELL-NH₂

1135 2-Naftoyl-GDEEDASESQQNEKQNQSEAFIRKSDELL-NH₂

- 56 Ac-WGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-YTSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLGGWNWF-nh₂

Ac-YTSLIHSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLGGWA-slwnwf-nh₂

2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

2-Naftoyl-GDEEDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

2-Naftoyl-GDEEDESISQVQEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

2-Naftoyl-GDEEDESISQVQEKIEESLLFIRKSDELL-NH₂

Biotin-GDEYDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

2-Naftoyl-GDEYDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-YTSLIHSLIDEQEKIEELAFIRKSDELLELDKWNWT-NH₂ vypsdeydasisqvneeinqalayirkadellenv-nh₂

Ac-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGSKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂ gggvypsdeydasisqvneeinqalayirkadellenv-nh₂

Ac-NNLLRAIEAQQHLLQLTVWGEKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

Ac-PTRVNYILIIGVLVLAbuEVTGVRADVHLL-NH₂

Ac-PTRVNYILIIGVLVLAbuEVTGVRADVHLLEQPGNLW-NH₂

Ac-PEKTPLLPTRVNYILIIGVLVLAbuEVTGVRADVHLL-NH₂

AhaGGGVYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

Ac-YTSLIHSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-YTSLGGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSOELL-NH₂

Ac-DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLGGWASLWNWF-NH₂

Ac-DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLGGWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKSLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWNWF-NH₂

- 57 1163 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-KASLWNWF-NH₂

1164 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-SLWNWF-NH₂

1165 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESONQQEKNEQELLELD-KLWNWF-NH₂

1166 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-WNWF-NH₂

1167 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-WASLWN-NH₂

1168 Ac-MTWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK-WASL-NH₂

1169 (Pyr)HWSY(2-naftyl-D-Ala)LRPG-NH₂

1170 Ac-WNWFDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLWNWF-NH₂

1171 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKYASLYNYF-NH₂

1172 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKYAYLYNYF-NH₂

1173 2-Naftoyl-AcaAcaAcaDEFDESISQVNEKIEESLAFiRKSDELLAca-AcaAcaW-NH₂

1174 2-Naftoyl-AcaAcaAcaGDEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELLG-AcaAcaAca W-N H₂

1175 2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFIRESDELL-NH₂

1176 2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFIEESDELL-NH₂

1177 Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

1178 Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

1179 Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

1180 Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

1181 Ac-WQEWEHQVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

1182 Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

1183 Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQEWEQKVNYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-VNalPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

Ac-VNalPSDENalDASISQVNEEINQALAYRIKADELLENV-NH₂

Ac-VNalPSDEYDASISQVNEEINQALANallRKADELLENV-NH₂

Ac-VYPSDEFDASISQVNEKINQSLAFiREADELLFNFF-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLFNFF-NH₂

Ac-YTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSUTALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH₂

Ac-YTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWASLWEWF-NH₂

Naftoyl-Aua-Aua-Aua-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAua-Aua-Aua-W-NH₂

Ac-WAAWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQEAAQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQEWAAKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQAAEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQEWEAAVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQEWEQAARYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQEWEAAVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-NH₂

Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKLGGG-gwaslwnf-nh₂

2-Naftoyl-GDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELT-NH₂

- 59 2-Naftoyl-GDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELT-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDASISQTNEKTNQSLAFIRKSDELT-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELT-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDEEISQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELT-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDASASQANEKANQSLAFARKSDELA-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKIEESLAFTRKSDELL-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDESISQVNEKTEESLAFIRKSDELL-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDESISQTNEKlEESLAFIRKSDELI_-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDESTSQVNEKIEESLAFIRKSDELL-NH₂

Ac-WNWFDEFDESTSQVNEKIEESLAFIRKSDELLWNWF-NH₂

Ac-WNWFDEFDESTSQTNEKIEESLAFIRKSDELLWNWF-NH₂

Ac-WNWFDEFDESTSQTNEKTEESLAFIRKSDELLWNWF-NH₂

Ac-LOAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLRFLGGTTVAL-NH₂

Ac-YTNLIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWSWF-NH₂

Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWA-SLWNWF-NH₂

Ac-NNMTWQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL-DKWASLWNWF-NH₂

Ac-WNWFIEESDELLWNWF-NH₂

2-Naftoyl-GFIEESDELLW-NH₂

Ac-WFIEESDELLW-NH₂

2-Naftoyl-GENFFIEESDELLFNFF-NH₂

2-Naftoyl-GESDELW-NH₂

Ac-WNWFGDEFDESISQVQEEIEESLAFIEESDELLGGWNWF-NH₂

Ac-WNWFIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWV-NH₂

- 60 Ac-YTSLITALLEQAQIQQEENEYELQELDEWASLWEWF-NH₂

Ac-YTSLINSLGGDFEDESISQVNEELEESLAFIEESDELLGGWA-SLWNWF-NH₂

2-Naftoyl-GDEFDESISQVQEEIEESLAFIEESDELL-NH₂

H-QARQLLSSIMQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARI-LAVERYLKDQ-OH

Ac-CPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR-NH₂

Ac-GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYGFRHQNSC-NH₂

Ac-LNFLGGT-NH₂

Ac-LDSWWTSLNFLGGT-NH₂

Ac-ILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT-NH₂

Ac-GFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH₂

Ac-WNWFITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH₂

Ac-WQEWEQKVRYLEANITALLEQAQIQQEKIEYELQKL-NH₂

Ac-NIKENKANGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLM-NH₂ (FS) -YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NHz

2-Naftoyl-GWNWFAcaDEFDESTSQVQEEIEESLAFIEESDELL-AcaWNWF-NH₂

AC-WNWFGDEFDESISQVNEKIEESLAFIEESDELLGWNWF-NH2 Ac-WNWFGDEFDESISQVNEKIEESLAFIEESDELLGWNWF-NH₂Ac-WNWF- Aca-DEFDESTSQVNEKlEESLAFIRKSDELLAca-WNWF-NH₂ • · ·

- 61 1259 Ac-WNWF-Aca-DEFDESTSQVNEKIEESLAFIRKSDELL-Aca-WNWF-NH₂

1260 Ac-EESQNQQEKNEQELLELDKWA-NH₂

1261 EESQNQQEKNEQELLELDKWA

1262 Ac-CGTTDRSGAPTYSWGATDVFVLNNTRPPLGNWFG-NH₂

1263 Ac-GVEHRLEAACNWTRGERADLEDRDRSELSP-NH₂

1264 Ac-CVREGNASRAWVAVTPTVATRDGKLPT-NH₂

1265 Ac-CFSPRHHWTTQDANASIYPG-NH₂

1266 Ac-LQHYREVAAAKSSENDRLRLLLKQMCPSLDVDS-NH₂

1267 Ac-WQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKNEYELOKLDEW-aslwewf-nh₂

1268 Ac-CWQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE-waslwewfc-nh₂

1269 Ac-WQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKHEYELOKLDEW-ewf-nh₂

1270 Ac-CWQEWDREISNYTSLITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEW-ewfc-nh₂

1271 Ac-GQNSQSPTSNHSPTSAPPTAPGYRWA-NH₂

1272 Ac-PGSSTTSTGPARTALTTAQGTSLYPSA-NH₂

1273 Ac-PGSSTTSTGPARTALTTAQGTSLYPSAAATKPSDGNATA-nh₂

1276 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF

-nh₂

1276 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWASLWNWF

-nh₂

1277 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH₂

1278 Ac-WQEWDREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH₂

1279 Ac-WQEWEREITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH₂

1280 Ac-WQEWEREITALLEQAQIQQEKIEYELQKLDEWEWF-NH₂

Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH₂

Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH₂

Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH₂

Ac-WQEWEITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH₂

Ac-WQEWDREIDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH₂

Ac-WQEWEREIDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH₂

Ac-WQEWEIDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH₂

Ac-WQEWEREIDEYDASISQVNEEINQALAYIREADELWEWF-NH₂

Ac-WQEWEIDEYDASISQVNEEINQALAYIREADELWEWF-NH₂

Ac-WQEWDEYDASISQVNEEINQALAYIREADELWEWF-NH₂

Ac-WQEWWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF-NH₂

Ac-WQEWWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWASLEWF-NH₂

Ac-WQEWWEITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

Ac-WVYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENVWNWF-NH₂ ytslihsliessqnqqenkneqelleldkwaslwnwf-nh₂

Ac-WQEWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWAWF-NH₂

Blotin-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEL-NH₂

Blotin-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAF-NH₂ • ······ · · • · · » · · ·

- 63 BlotiN-QVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKST-NH₂

Ac-WMEWDREI-NH₂

Ac-WQEWEQKI-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIKWASLWEWF-NH₂

Ac-WQEWEREISAYTSLITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF-NH₂

Ac-WQEWEREISAYTSLITALLEQAQIQQEKIEYELQKEWEWFNH₂

Ac-WQEWEREISAYTSLITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWFNH₂

Ac-PNLSDHSESIQKKFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLR-NH₂

Ac-DHSESIQKKFQLMKKHVNKIGVDSDPIGSWLRGIF-NH₂

Ac-WSVKQANLTTSLLGDLLDDVTSIRHAVLONRA-NH₂

Biotin-WMEWDREI-NH₂

Biotin-NNMTWMEWDREINNYTSL-NH₂

Ac-GAASLTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLL-NH₂

Ac-ASLTLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQL-NH₂

Ac-VSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIIHFYDPLVF-NH₂

Ac-QHWSYGLRPG-NH₂

Ac-WQEWEQKIQHWSYGLRPGWASLWEWF-NH₂

Ac-WQEWEQKIQHWSYGLRPGWEWF-NH₂

Ac-WNWFQHWSYGLRPGWNWF-NH₂

Ac-FNFFQHWSYGLRPGFNFF-NH₂

Ac-GAGAGHWSYGLRPGAGAG-NH₂ • · ·«···« ·« « • · · ·· · ·«·· ······· · ··· · · * · ······· • ·· · ·· · · · · ···

-64 1329 PLLVLOAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGT

1330 Ac-WOEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELOKLAKWASLWEWF-nh₂

1331 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELOKLAEWASLWEWF-nh₂

1332 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELOKLAEWASLWEWF-nh₂

1333 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLAEWASLWAWF-nh₂

1334 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELOKLAEWASLWEWF-NH₂

1335 Ac-TNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK-NH₂

1336 Ac-KAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS-NH₂

1337 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NHs

1338 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKGEYELQKLIEWEWF-NH₂

1339 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLDKWEWF-NH₂

1340 Ac-YDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAF-NH₂

1341 Fluor-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

1342 Fluor-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

1344 Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL-NH₂

1345 Ac-QQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARILAVERYLKDQ-NH₂

1346 Ac-SGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLOLTVWGIKQLQARILAVERYL-KDQ-NH₂

1347 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAWF-NH₂

1348 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAW-NH₂ • · ·· 9 · · · • · · · · ·

1349 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAW-NH₂

1350 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAWF-NH₂

1351 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAW-NH₂

1352 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAW-NH₂

1353 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAWF-NH₂

1354 Ac-WQEWQHWSYGLRPGWEWF-NH₂

1355 Ac-WQEWQHWSYGLRPGWEWF-NH₂

1356 Biotinyl-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLW-AWF-NH₂

1357 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAEWASLWAWF

1358 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLEWAWF

1361 Ac-AGSTMGARSMTLTVQARQLLSQIVQQQNNLLRAIEAQQ-NH₂

1362 Ac-AGSAMGAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQ-NH₂

1363 Ac-AGSAMGAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQ-NH₂

1364 Ac-ALTAGSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGT-NH₂

1365 Ac-TLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQELLRLTVWGT-NH₂

1366 Ac-TITVQARQLLAGIVQQQQQLLDWKRQQELLRLTVWGT-NH₂

1367 Ac-WQAWIEYEAELSQVKEKIEQSLAYIREADELWAWF-NH₂

1368 Ac-WQAWIEYEAELSQVKEKIEQSKAYIREADELWAWF-NH₂

1369 Ac-WQAWIEYERLLVOAKLKIAIAKLYIAKELLEWAWF-NH₂

1370 Ac-WQAWIEYERLLVOAKLKIAIAKLYIAKELLEWAWF-NH₂

1371 Ac-WQAWIELERLLVQVKLKLAIAKLEIAKELLEWAWF-NH₂

1372 Ac-GEWTYDDATKTFTVTEGGH-NH₂

1373 Ac-WQEWEQKIGEWTYDDATKTFTVTEGGHWASLWEWF-NH₂

-66 1374 Ac-GEWTYDDATKTFTVTE-NH₂

1375 Ac-WQEWEQKIGEWTYDDATKTFTVTEWASLWEWF-NH₂

1376 Ac-WHRFDYRT-NH₂

1377 Ac-WQEWEQKIMHRFDYRTWASLWEWF-NH₂

1378 Ac-MHRFNWSTGGG-NH₂

1379 Ac-WQEWEQKIMHRFNWSTGGGWASLWEWF-NH₂

1380 Ac-MHRFDYRT-NH₂

1381 Ac-WQEWEQKIMHRFNWSTWASLWEWF-NH₂

1382 Ac-LLVPLARIMTMSSVHGGG-NH₂

1383 Ac-WQEWEQKILLVPLARIMTMSSVHGGWASLWEWF-NH₂

1384 Ac-LLVPLARIMTMSSVH-NH₂

1385 Ac-WQEWEQKILLVPLARIMTMSSVHWASLWEWF-NH₂

1386 TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK

1387 Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH₂

1388 Ac-TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE-NH₂

1389TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE

1390 Ac-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQARIL -AVERY-NH₂

1391 Rhod-QARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQ-ARILAVERY-NH₂

1392 Ac-GAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDWKRQQEML-NH₂

1393 Ac-GSAMGAASLTLSAQSRTLLAGIVQQQQQLLDVVKRQQEML-NH₂

1394 Ac-PALSTGLIHLHQNIVDVQFLFGVGSSIASWAIKWEY-NH₂

1395 Ac-PALSTGLIHLHQNIVDVQFLFGVGSSIASWAIK-NH₂

1396 Ac-LSTTQWQVLPUSFTTLPALSTGLIHLHQNIVDVQY-NH₂

1397 Ac-FRKPPEATFSRUGSGPRITPRUMVDFPFRLWHY-NH₂

1398 Ac-DFPFRLWHFPUTINYTIFKVRLFVGGVEHRLEAAUNWTR-nh₂ » · · · · · ·· • » · ♦ · · ·»►···· · · · · · · • · · · · · · · · ··· · ·· ·· ·· ···

- 67 Ac-YVGGVEHRLEAAUNWTRGERUDLEDRDRSELSPL-NH₂ mvypsdeydsisqvneeinqalayirkadellenv

Ac-GPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGG-NH₂

Ac-LGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLG-NH₂

Ac-FLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWRSLNFL-NH₂

Ac-YTNTIYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

YTNTTYTLLEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

Ac-YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-NH₂

YTGIIYNLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF

Ac-YTSLIYSLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF-NH₂

YTSLIYSLLEESQNQQEKNEQELLELDKWANLWNWF

Ac-EKSQIQQEKNEQELLELDKWA-NH₂

EKSQIQQEKNEQELLELDKWA

Ac-EKSQIQQEKNEQELLELDKWA-NH₂

EKSQIQQEKNEQELLELDKWA

Ac-YTXLIHSLXESQNQQXKNEQELXELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTXLIHSLIXESQNQQXKNEQELXELD-NH₂

Ac-TYSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELD-NH₂

Ac-WQEWEXKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLDKWASLWEWF

-nh₂

Ac-XKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLDKWASLWEWF-NH₂

Ac-WQEWEXKITALLXQAQIQQXKNEYELXKLD-NH₂

Ac-WEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH₂

Ac-QEXKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH₂

Ac-XKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH₂

Ac-CKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH₂

Ac-QKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLD-NH₂ « ·«««·· · · • · · » · · ·

-68 ······ · «·· » • * · · · · « • · · · · · ·

1428 Ac-VYPSDEYDASISQVNEENQALAYIRKADELLEN-OH

1429 Ac-VYPSDEYDASISQVNEENQALAYIRKADELLE-OH

1430 Ac-VYPSDEYDASISQVNEENQALAYIRKADELL-OH

1431 Ac-VYPSDEYDASISQVNEENQALAYIRKADEL-OH 1432YPSDEYDASISQVNEENQALAYIRKADELLENV-NH₂1433PSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

1434 sdeydasisqvneeinqalayirkadellenv-nh₂

1435 deydasiscvneeinqalayirkadellenv-nh₂

1436 Ac-VYPSDEYDASISQVDEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

1437 Ac-VYPSDEYDASISQVDEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

1438 Ac-VYPSDEYDASISQVDEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

1439 Ac-VYPSDEYDASISQVDEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

1440 Ac-LLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLP-NH₂

1441 Ac-LSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPI-NH₂

1442 Ac-STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIV-NH₂

1443 Ac-TNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVN-NH₂

1444 Ac-NKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNK-NH₂

1445 Ac-KAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQ-NH₂

1446 Ac-AVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS-NH₂

1447 Ac-VVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSU-NH₂

1448 Ac-VSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUS-NH₂

1449 Ac-SLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSI-NH₂

1450 Ac-LSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSIS-NH₂

1451 Ac-SNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISN-NH₂

1452 Ac-NGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNI-NH₂

1453 Ac-GVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIE-NH₂

1454 Ac-VSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIET-NH₂

1455 Ac-SVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETV-NH₂ φ < «φφφ * * * Φ* · Β » * * Μ». ř I · ♦·· » » * « · Φ · · φ φ « *·· · Φ· ·® Φ « 4 · φ

-69 1456 Ac-VLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVI-NH₂

1457 Ac-LTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIE-NH₂

1458 Ac-TSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEF-NH₂

1459 Ac-SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQ-NH₂

1460 Ac-KVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQ-NH₂

1461 Ac-VLDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQK-NH₂

1462 Ac-LDLKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKN-NH₂

1463 Ac-DLKNYIDKQLLPIVNKQSUS!SNIETVIEFQQKNN-NH₂

1464 Ac-LKNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNR-NH₂

1465 Ac-KNYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRL-NH₂

1466 Ac-NYIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLL-NH₂

1467 Ac-YIDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLE-NH₂

1468 Ac-IDKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLEI-NH₂

1469 Ac-DKQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLEIT-NH₂

1470 Ac-KQLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLEITR-NHz

1471 Ac-QLLPIVNKQSUSISNIETVIEFQQKNNRLLEITRE-NH₂

1472 Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALA

1473 QVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

1474 VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV

1475 Ac-DEYDASISQVNEEINQALAYIREADEL-NH₂

1476 Ac-DEYDASISQVNEEINQALAYIREADEL-NH₂

1477 Ac-DDECLNSVKNGTYDFPKFEEESKLNRNEIKGVKLS-NH₂

1478 Ac-DDE-Abu-LNSVKNGTYPFPKFEEESKLNARNEIKGVKLS-NH;

1479 Ac-YHKCDDECLNSVKNGTFDFPKFEEESNLNRNEIKGVKLSS-NH₂

1480 Ac-YHK-Abu-DDE-Abu-LNSVKNGTFDFPKFEEESKLNRNEIKGV -KLSS-NH₂

1481 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELLELDKWASSLWNWF-NH₂ ·· ···« • · · · * · 9 · * · ···

- 70 1482 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELLELDKWASSLWNWF-NH₂

1483 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELLELDKWASSLWNWF-NH₂

1484 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELLELDKWASSLWNWF-NH₂

1485 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELLELDKWASSLWNWF-NH₂

1486 Ac-YTSLIHISLIEESQNQQEKNEYELQKLDKWASLWNWF-NH₂

1487 Ac-YTSLIHSLIEESQIQQEKNEQELQKLDKWAGLWNWF-NH₂

1488 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NH₂

1489 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NH₂

1490 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NH₂

1491 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NH₂

1492 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NHz

1493 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NH₂

1494 Ac-YTSL1HSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NH₂

1495 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWQSLWEWF-NH₂

1496 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWEWF-NH₂

1497 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWASLWEWF-nh₂

1498 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAKWASLWEWF -NH₂

1499 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIKWASLWEWF-NH₂

1500 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWAGLWEWF-NH₂

1501 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAKWAGLWEWF -NH₂

1502 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIKWAGLWEWF-NH₂

1503 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWASLWAWF-NH₂

- 71 1504 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAKWAGLWAWF -NH₂

1505 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIKWAGLWAWF-NH₂

1506 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWEWF-NH₂

1507 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELDKWEWF-NH₂

1508 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLAKWEWF-NH₂

1509 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDEWEWF-NH₂

1510 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELAKWEWF-NH₂

1511 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELDKWEWF-NH₂

1512 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELIEWASLWEWF-NH₂

1513 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELIEWAGLWEWF-NH₂

1514 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELLELIEWAGLWAWFNH₂

1515 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLIEWEWF-NH₂

1516 Ac-WQEWEREIQQEKNEYELQKLDKWASLWEVVF-NH₂

1517 Ac-WQEWEREIQQEKGEYELQKLIEWEWF-NH₂

1518 Ac-WQEWEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH₂

1519 Ac-WQEWQAQIQQEKGEYELQKLIEWEWF-NH₂

1520 PEG-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQRLDEWASL-WEWF-NH₂

1521 Ac-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQRLDEWASLW-EWF-NH₂

1522 PEG-YTSLITALLEQAQIQQERNEQELLELDEWASLWEWF-NH₂

1523 Ac-YTSLITALLEQAQIQQERNEQELLELDEWASLWEWF-NH₂1526PEG-YTSLITALLEQAQIQQERNEQELLELDEWASLWEWF-NH₂

- 72 Ac-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQRLDEWASL-wewf-nh₂ peg-ytslitalleqaqiqqerneqelleldewaslwewf-nh₂ peg-gwqeweqritalleqaqiqqerneyelqrldewasl-wewf-nh₂

Ac-GWQEWEQRITALLEQAQIQQERNEYELQRLDEWASL-wewf-nh₂ peg-gwqeweqritalleqaqiqqerneyelqeldrwasl-wewf-nh₂ ac-gwqeweqritalleqaqiqqerneyelqeldrwasl-wewf-nh₂ peg-ytsligslieesqnqqerneqelleldrwaslwnwf-nh

Ac-YTSLIGSLIEESQNQQERNEQELLELDRWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSUEESQNQQEK-OH neqelleldk waslwnwf-nh₂

Ac-AAAWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-nh₂ qqekneyelqkldkwaslwewf-nh₂ qqekneyelqkldkwaslwewf-nh₂ qqekneyelqkldkwaslwewf-nh₂

Ac-WQEWEQKITALLAAAQIQQEKNEYELQKLDKWQSLWEWF

-nh₂

Ac-WQEWEQKITALLAAAQIQQEKNEYELQKLDKWQSLWEWF

-nh₂

Ac-WQEWEQKITALLAAAQIQQEKNEYELQKLDKWQSLWEWF

-nh₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAAAELQKLDKWASLWEWF

-nh₂ • · · · • · · · ·

- 73 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYAAAKLDKWASLWEWF

-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQAAAKWASLWEWF·

-NH₂

Ac-WQEWEQKiTALLEQAQIQQEKNEYELQKLDAAASLWEWF-NH

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWAAAAEWF-NH

Ac-WQEWEQKITALLAAAQIQQEKNEYELQKLDKWQSLWAAA-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLLDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-ERTLDFHDS-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWN(W)F-NH₂Ac-YTSLIHSLIEESQN(Q) QEKNEQELLELDKWASLWNWF -NH₂

Ac-YTSL1HSUEESQNQQDKWASLWNWF-NH₂

Ac-FYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQLQKWEDWVGWIGNI-NH₂

Ac-INQTIWNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIE-NH₂

Ac-WNHGNITLGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQ-NH₂

Ac-YTSUHSLIEESENQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSUEESQDQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNEQEKNEQELLELDKWASLWN(W)F-NH₂ c-YTSUHSUEESQNQEEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSUHSUEESQNQQEKDEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-LGEWYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQ-NH₂

Ac-WYNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQLQK-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEEELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSUHSUEESQNQQEKNEQELLELOKWASLWDWF-NH₂

- 74 Ac-XTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWX-NH₂

Ac-YNQTKDLQQKFYEIIMDIEQNNVQGKKGIQQLQKW-NH₂

Ao-YTSUHSUEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF

Ac-TLTVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQ-lqar-nh₂

Ao-LQQKFYEíIMDIEQNNVQGKKGIQQLQKWEDWVGW-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLALDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEADKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSUHSUEESQNQQEKNEQELLELAKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSUHSUEESQNQQEKAEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSUHSUEESQNQQEKNAQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEQELQKLDKWASLWEWF-nh₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKAEYELQKLDKWASLWEWF-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNAYELQKLDKWASLWEWF-nh₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEAELQKLDKWASLWEWF-NH₂

Ac-EYDLRRWEK-NH₂

Ac-EQELLELDK-NH₂

Ac-EYELQKLDK-NH₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEQELLKLDKWASLWEWF-nh₂

Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEQELLELDKWASLWE-NH₂

AC-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNDKWASLWEWF-NH2

Ac-YTSLIHSLIEESQNQAEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQAKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ ··· «> · · ·· ·· ···

- 75 Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEANEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESANQQEANEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQAQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNAQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSLIHSAIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV-NH₂

Ac-YTSLIHSLAEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂ eesqnqqekneqelleldkwaslwnwf-nh₂

Ao-YTSLAHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTSUASLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-ATSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NHs

Ac-YASUHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-YTAUHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF-NH₂

Ac-RIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQ-NH₂

Ac-HTIDLTDSEMNKLFEKTRRQLREN-NH₂

Ac-SEMNKLFEKTRRQLREN-NH₂

Ac-VFPSDEADASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-VFPSDEFAASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

Ac-WQEWEQKITAALEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF

-nh₂

Ac-WQEWEQKITAALEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF

-nh₂

Ac-WQEWEQKITAALEQAIAQQQEKNEYELQKLDKWASLW-ewf-nh₂ • · • · · · • · ( · · · · · · ·· · ·· ·· ·· ···

- 76 1677 Ac-WQEWEQKITAALEQAQAQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH₂

1678 Ac-WQEWEQKITAALEQAQIAQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-nh₂

1679 Ac-WQEWEQKITAALEQAQIQAEKNEYELQKLDKWASLWEWF-nh₂

1680 Ac-VFPSDEFAASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

1681 Ac-VFPSDEFAASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

1682 Ac-VFPSDEFAASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

1683 Ac-VFPSDEFAASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

1684 Ac-VFPSDEFAASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNV-NH₂

1685 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQAKNEYELQKLDKWASLWEWF-nh₂

1687 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQALDKWASLWEWF-NH₂

1688 Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKADKWASLWEWF-NH₂

Je třeba rozumět, že do rámce předkládaného vynálezu spadají také peptidy uvedené v tabulce 2. Jak se uvádí výše, ty peptidy znázorněné v tabulce 2, které již neobsahují zesilující peptidové sekvence (tj. nejsou hybridními polypeptidy) mohou být použity ve spojení se zesilujícími peptidovými sekvencemi a v přihlášce popisovanými znalostmi pro vytvoření hybridních polypeptidu. Navíc mohou být základní polypeptidy a základní polypeptidy hybridních polypeptidů ukázané v tabulce 2 a obr. 13 použity s jakoukoli zde popisovanou zesilující peptidovou sekvencí pro rutinní získávání dalších hybridních polypeptidů, které mají také patřit do rámci předkládaného vynálezu.

Je třeba rozumět, že zatímco řada polypeptidů uvedených • · ······ ·· · ··· ·· · · · · · ··· · · · · · · ······· · · · · · · • · · · · · · · * ··· · ·· ·· · · ···

- 77 v tabulce 2 a obr. 13 je znázorněna s modifikovanými, například blokovanými aminovými a/nebo karboxylovými konci d-isomerních aminokyselin (označené zbytky v závorkách), má se za to, že jakýkoli polypeptid obsahující primární aminokyselinovou sekvenci zobrazenou v tabulce 2 a obr. 13 je rovněž součástí předkládaného vynálezu.

Sekvence základních polypeptidů samy o sobě ukázané v tabulce 2 a obr. 13, stejně jako hybridní polypeptidy obsahující tyto základní polypeptidy mohou vykonávat antivirovou a/nebo antifuzogenní aktivitu a/nebo mohou mít schopnost modulovat intracelulární procesy, které se týkají peptidových struktur se stočenou šroubovicí (coiled-coil). Mezi těmito sekvencemi základních polypeptidů se například vyskytují sekvence, které byly odvozeny z jednotlivých sekvencí virových proteinů. Mezi sekvence základních polypeptidů patří také například sekvence, které jsou odvozené z více než jedné sekvence virového proteinu (například základní peptid odvozený z HIV-1, HIV-2 a SIV).

Navíc mohou tyto základní polypeptidy obsahovat substituce, delece a/nebo inzerce aminokyselin jak bylo diskutováno výše, zesilujících polypeptidových sekvencí, pokud nedojde ke snížení konkrétní antivirové a/nebo antifuzogenní aktivity základního polypeptidu (buď jako takového nebo jako součásti hybridního polypeptidu).

Co se týče delecí aminokyselin, výhodné je, jestliže má výsledný základní polypeptid délku alespoň přibližně 4 až 6 aminokyselin. Mezi inzercemi aminokyselin jsou výhodné inzerce, které nejsou delší než přibližně 50 aminokyselinových zbytků, a výhodněji nejsou delší než přibližně 15 aminokyselinových zbytků. Je také výhodné, jestliže jsou inzerce základního polypeptidu inzercemi na amino- a/nebo karboxylových koncích.

Mezi těmito inzercemi na aminových a/nebo karboxylových koncích jsou inzerce, které obsahují aminokyselinové sekvence ve ·· «99999 9 9 9 • 9 9 · · 9 9 9 9 « ··· · 9 9 · · »

9999999 · · · · · · • · 9 9 9 · 9 · »

9 9 9 99 · 9 99 999

- 78 směru amino a/nebo karboxy vzhledem k endogenní proteinové sekvenci, ze které je základní polypeptid odvozen. Jestliže je například základní polypeptid odvozen z proteinu gp41, taková inzerce by zahrnovala aminokoncovou a/nebo karboxykoncovou inzerci obsahující aminokyselinovou sekvenci gp41 sousedící se základní polypeptidovou sekvenci gp41. Tyto aminokoncové a/nebo karboxykoncové inzerce mohou být typicky v délce přibližně 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 nebo 50 aminokyselinových zbytků ve směru amino a/nebo karboxy vzhledem k původnímu základnímu polypeptidů.

Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou ještě dále obsahovat další modifikace, které snadno umožňují detekci polypeptidů. Například hybridní polypeptidy mohou být značeny buď přímo nebo nepřímo. Technologie značení peptidů jsou odborníkům v oboru dobře známy a zahrnují bez omezení radioaktivní, fluorescenční a kolorimetrické techniky. Techniky nepřímého značení jsou odborníkům v oboru také dobře známy a zahrnují bez omezení systém biotin/streptavidin a nepřímé značení protilátkami.

Vynález se dále týká asociace zesilujících peptidových sekvencí s typy molekul jinými než jsou peptidy. Například zesilující peptidová sekvence může být navázána na molekuly nukleových kyselin (např. DNA nebo RNA) nebo jakýkoli typ malé organické molekuly pro účely zesílení farmakokinetických vlastností těchto molekul.

2. Syntéza peptidů

Zesilující, základní a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být syntetizovány nebo připravovány technikami dobře známými v oboru, viz například Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co, NY, který se zahrnuje ve své úplnosti odkazem. Hybridní polypeptidy mohou být připraveny použitím běžných postupných syntéz v roztoku nebo na pevné fázi, kondenzací fragmentů, použitím chemických reakcí F-MOC nebo T• 9 ······ ··

9 t a<r · · « · · »· * a «i i · » * • ♦ r · · · * ·♦· « · f j · 9 · · · 9 »

9 9 9 9 ·· · · ···

- 79 BOC (viz např. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams a další, ed., 1997, CRC Press, Boča Raton Florida, a tam uvedené odkazy; Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Atherton & Sheppard, ed., 1989, IRL Press, Oxford, Anglie, a tam uvedené odkazy). Podobně se provádějí modifikace na aminových a/nebo karboxylových koncích.

Zesilující, základní a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být čištěny způsoby známými v oboru, jako je normální HPLC nebo HPLC s reverzní fází, iontoměničová chromatografie, gelová elektroforéza, afinitní chromatografie, metoda size exclusion, srážení apod. Skutečné podmínky použité pro čištění konkrétního polypeptidu budou z části záviset na strategii syntézy a na faktorech jako je celkový náboj, hydrofobicita, hydrofilicita, solubilita, stabilita atd., a budou odborníkům v oboru zřejmé.

Hybridní, zesilující a základní polypeptidy mohou být také vyrobeny použitím technik rekombinantní DNA. Zde mohou být syntetizovány a/nebo klonovány nukleotidové sekvence kódující polypeptidy podle vynálezu, které mohou být exprimovány způsoby známými odborníkům v oboru, viz například Sambrook, a další, 1989, Molécular Cloning, A Laboratory Manual, díl 1 - 3, Cold Spring Harbor Press, NY.

Je možno získat segment DNA kódující příslušný polypeptid použitím celé řady technik molekulární biologie, které jsou odborníkům v oboru obecně známé, například pro vytvoření fragmentu DNA kódujícího příslušný protein může být použita polymerázová řetězová reakce (PCR). alternativně může být fragment DNA získán z komerčního zdroje.

DNA kódující polypeptidy může být vložena pomocí rekombinačních technik do řady systémů hostitelských vektorů, které také poskytují replikaci DNA ve velkém měřítku. Tyto vektory mohou být navrženy tak, aby obsahovaly nezbytné prvky pro řízení transkripce ······· · · · · · · • · · · · · ··· ··· · ·· ·· ·· ···

- 80 a/nebo translace sekvence DNA kódující hybridní polypeptid.

Mezi použitelné vektory patří bez omezení vektory odvozené z rekombinantní bakteriofágové DNA, plasmidové DNA nebo kosmidové DNA. Mohou být například použity plasmidové vektory jako jsou skupiny vektorů pcDNA3, pBR322, pUC 19/18, pUC 118, 119 a M13 mp. Mezi bakteriofágové vektory mohou patřit řady bakteriofágových vektorů Xgt10, Xgt11, Ágt18-23, λΖΑΡ/R a EMBL. Mezi použitelné kosmidové vektory patří bez omezení vektory řady pJB8, pCV 103, pCV 107, pCV 108, pTM, pMCS, pNNL, pHSG274, COS202, COS203, pWE15, pWE16 a charomid 9.

Alternativně zahrnují rekombinantní vektory bez omezení vektory omezené z virů jako je herpetický virus, retroviry, viry vakcinie, adenoviry, viry spojené s adenoviry nebo bovinní papilomaviry, rostlinné viry jako je virus tabákové mozaiky a bakulovirus.

Pro expresi biologicky aktivního polypeptidu může být nukleotidová sekvence kódující protein vložena do vhodného expresního vektoru, tj. vektoru, který obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložených kódujících sekvencí. Pro konstrukci expresních vektorů s kódující sekvenci hybridního polypeptidu operativně spojenou s vhodnými transkripčními/translačními řídícími signály mohou použity metody dobře známé odborníkům v oboru. Mezi tyto metody patří rekombinantní techniky DNA in vitro a syntetické techniky, viz například způsoby popsané v Sambrook, a další, 1992, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. a Ausubel a další, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates & Wiley Interscience, N.Y., které se všechny zařazují ve své úplnosti odkazem.

Molekula nukleové kyseliny kódující hybridní, zesilující a základní polypeptidy, může být operativně spojena s řadou různých promotorových/zesilujících prvků. Promotorové/zesilující prvky mohou být zvoleny tak, aby optimalizovaly expresi terapeutických množství • · ······ ·· · ··· ·· · ···· ······· · ·»* · :

··· · ·· ·· ·· ···

- 81 proteinu.Expresní prvky těchto vektorů mohou mít různou sílu a různé specifické znaky. V závislosti na použitém systému hostitel/vektor je možno použít jakýkoli počet vhodných transkripčních a translačních prvků. Promotor může být ve formě promotoru přirozeně asociovaného s příslušným genem. Alternativně může být DNA umístěna pod kontrolu rekombinantního nebo heterologního promotoru, tj. promotoru, který s tímto genem není za normálních okolností asociován. Například pro řízení exprese přenesené DNA v určitých typech buněk mohou být použity tkáňově specifické promotorové/zesilující prvky.

Příklady transkripčních řídících oblastí, které vykazují tkáňovou specificitu, které byly popsány a které by mohly být použity, zahrnují bez omezení kontrolní oblast genu pro elastázu I, která je aktivní v pankreatických acinárních buňkách (Swift a další, 1984, Cell 38: 639 - 646; Ornitz a další, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol, 50: 399 - 409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 42S - 51S); řídící oblast genu pro inzulín, která je aktivní v buňkách beta pankreatu (Hanahan, 1985, Nátuře 315: 115 - 122); kontrolní oblast genu pro imunoglobulin, která je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosschedl a další, 1984, Cell 38: 647 - 658; Adams a další, 1985, Nátuře 318: 533 - 538 ; Alexander a další, 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436 - 1444); kontrolní oblast genu pro albumin, která je aktivní v játrech (Pinkert a další, 1987, Genes and Devel. 1: 268 - 276); kontrolní oblast genu pro alfa-fetoprotein, který je aktivní v játrech (Krumlauf a další, 1985, Mol, Cell. Biol. 5: 1639 - 1648; Hammer a další, 1987, Science 235: 53 - 58); kontrolní oblast genu pro alfa-1 -antitrypsin, který je aktivní v játrech (Kelsey a další, 1987, Genes a Devel. 1: 161 - 171); kontrolní oblast pro gen beta-globinu, který je aktivní v myeloidních buňkách (Magram a další, 1985, Nátuře 315: 338 - 340; Kollias a další, 1986, Cell 46: 89 - 94); kontrolní oblasti genu pro myelinový bazický protein, který je aktivní v oligodendrocytárních buňkách v mozku (Readhead a další, 1987, Cell 48: 703 - 712); kontrolní oblast pro gen lehkého řetězce 2• ·

- 82 myosinu, který je aktivní v kosterním svalstvu (Shání, 1985, Nátuře 314: 283 - 286); a kontrolní oblast pro gen hormonu uvolňujícího gonadotropin, který je aktivní v hypothalamu (Mason a další, 1986, Science 234: 1372 - 1378). Mohou být použity promotory izolované z genomu virů, které rostou v savčích buňkách (například virus vakcinie 7,5K, SV40, HSV, adenoviry MLP, MMTV, LTR a CMV promotory) stejně jako promotory produkované technikami rekombinantní DNA nebo synteticky.

V některých případech mohou být prvky promotoru konstitutivní nebo inducibilní promotory a mohou být použity za vhodných podmínek pro navození vysokých úrovní nebo regulované exprese příslušné nukleotidové sekvence. Exprese genů pod řízením konstitutivních promotorů nevyžaduje přítomnost specifického substrátu pro indukci exprese genu a bude probíhat za všech podmínek buněčného růstu. Naopak exprese genů řízených inducibilními promotory odpovídá na přítomnost nebo nepřítomnost indukčního činidla.

Pro dostatečnou translaci vložených sekvencí kódujících proteiny jsou také nutné specifické iniciační signály. Mezi tyto signály patří iniciační kodon ATG a přilehlé sekvence. V případech, kdy jsou do příslušných expresních vektorů vloženy celé kódující sekvence včetně iniciačního kodonu a přilehlých sekvencí, nemusí být zapotřebí dalších signálů pro řízení translace. V případech, kdy se vkládá pouze část kódující sekvence, však musí být poskytnuty exogenní translační kontrolní signály včetně iniciačního kodonu ATG. Navíc musí být iniciační kodon ve fázi s čtecím rámcem kódujících sekvencí proteinů pro zajištění translace celého inzertu. Tyto exogenní translační řídící signály a iniciační kodony mohou pocházet z nejrůznějších zdrojů, jak přírodních tak i syntetických. Účinnost exprese může být zvýšena zavedením sekvencí zeslabujících transkripci, zesilujících prvků apod.

······· · ··· · · • · ···· ··* •·· · ·· ·· ·· ···

- 83 3. Použití zesilujících peptidových sekvencí, základních polypeptidů a hybridních polypeptidů podle vynálezu

Jak je diskutováno výše, zesilující peptidové sekvence podle vynálezu mohou být použity pro zlepšení farmakokinetických vlastností jakéhokoli základního polypeptidů prostřednictvím spojení základního peptidu se zesilujícími peptidovými sekvencemi za vytvoření hybridních polypeptidů. Pozorované zesílení farmakokinetických vlastností se vztahuje k farmakokinetickým vlastnostem samotného základního polypeptidů. Standardní parametry farmakokinetických vlastností a způsoby určování a charakterizace farmakokinetických vlastností prostředku jako je polypeptid, jsou dobře známy odborníkům v oboru. Neomezující příklady těchto metod se uvádějí v příkladech dále.

Zesilující peptidové sekvence podle vynálezu mohou být navíc použity pro zvýšení poločasu základního polypeptidů, na který byly navázány zesilující peptidové sekvence, in vivo nebo ex vivo. Zesilující peptidové sekvence mohou například zvyšovat poločas navázaných základních polypeptidů, jestliže jsou získané hybridní polypeptidy přítomné v buněčné kultuře, tkáňové kultuře nebo vzorcích odebraných pacientovi (například vzorky buněk, vzorky z biopsie tkáně nebo jiné vzorky obsahující tělesné tekutiny). Základní polypeptidy a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být také použity jako část způsobů modulace (například snižování, inhibice, přerušení, stabilizace nebo zesílení) fuzogenních událostí. Tyto peptidy s výhodou vykazují antifuzogenní nebo antivirovou aktivitu. Peptidy podle vynálezu mohou také mít schopnost modulovat intracelulární procesy, kterých se účastní interakce peptidů se stočenou šroubovicí.

V konkrétních provedeních mohou být použity hybridní polypeptidy a základní polypeptidy podle vynálezu, které vykonávají antivirovou aktivitu, použity jako součást způsobů pro snížení virové infekce. Tyto antivirové metody mohou být použity proti například

- 84 lidským retrovirům, zvláště HIV (virus lidské imunodeficience), například HIV-1 a HIV-2, a virům lidských T-lymfocytů (HTLV-I a HTLV-II), a jiným než lidským retrovirům, jako je virus bovinní leukózy, kočičího sarkomu a viry leukemie, virů imunodeficience opic (SIV), sarkomových a leukemických virů, a virů progresivní pneumonie ovcí.

Antivirové metody podle vynálezu mohou být také použity proti neretrovirálním virům, včetně bez omezení respiračního syncytiálního viru (RSV), viru psinky, viru Newcastleské nemoci, viru lidské parainfluenzy, virů chřipky, virů spalniček, viru Epstein-Barrové, virů hepatitidy B a Mason-Pfizerových virů.

Výše uvedené viry jsou viry opatřené obalem. Antivirové metody podle vynálezu mohou být použity také proti virům, které nemají obal, včetně bez omezení pikornavirů jako jsou polioviry, viru hepatitidy A, enterovirů, echovirů a virů coxcackie, papovavirů jako je papilomavirus, parvovirů, adenovirů a reovirů.

Mezi další antifuzogenní aktivity, které mohou být metodami využívajícími peptidy podle vynálezu modulovány, patří bez omezení modulace výměny neuropřenašečů prostřednictvím fúze buněk a fúze sperma - vajíčko. Mezi intracelulárními poruchami, kterých se účastní interakce struktur se stočenou šroubovicí, a které mohou být odstraněny způsoby využívajícími peptidy podle vynálezu, je možno uvést například bakteriální toxiny.

Antifuzní a antivirová aktivita daného základního polypeptidů nebo hybridního polypeptidů může být rutinně zjišťována standardními testy in vitro, ex vivo a testy využívajícími zvířecích modelů, které mohou být z hlediska antivirové aktivity specifické nebo částečně specifické pro příslušný virus, a které jsou dobře známé odborníkům v oboru.

Výše uvedený popis se týká zejména antivirových aktivit a antifúzních aktivit základních a hybridních polypeptidů podle vynálezu. Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být také použity • *

- 85 jako část jakékoli metody, pro kterou může být uvažováné použití samotného základního polypeptidu. Použití hybridních polypeptidů jako části těchto metod je zvláště výhodné v případech, kdy se požaduje zlepšení farmakokinetických vlastností základního polypeptidu. Například inzulín se používá jako součást léčení u některých typů diabetů. Hybridní polypeptid obsahující inzulín nebo fragment inzulínu jako základní polypeptid může být proto také použit jako součást metod pro zmírnění příznaků forem diabetů, u kterých se používá a/nebo předpokládá použití inzulínu.

Navíc k výše uvedeným terapeutickým metodám mohou být peptidy podle vynálezu ještě dále použity jako část prognostických metod pro prevenci poruch, včetně bez omezení poruch zahrnujících fúzní události, intracelulárních procesů zahrnujících peptidy se stočenou šroubovicí a virových infekcí, které zahrnují fúzi buňka buňka a/nebo virus - buňka. Základní a hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být tedy například použity jako součást preventivních metod proti virové infekci.

Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být ještě dále používány jako součást diagnostických metod. Tyto metody mohou být buď metody in vivo nebo in vitro. Jakákoli diagnostická metoda, při které může být využit konkrétní základní polypeptid, může být také prováděna použitím hybridního polypeptidu obsahujícího základní polypeptid a modifikaci primární aminokyselinové sekvence, která umožní detekci hybridního polypeptidu. Tyto techniky mohou představovat zlepšení proti diagnostickým metodám v tom, že zvýšený poločas hybridního polypeptidu vzhledem k samotnému základnímu polypeptidu může zvýšit citlivost diagnostického postupu, při kterém se hybridní polypeptid používá. Mezi tyto diagnostické techniky patří bez omezení zobrazovací metody, například metody zobrazování in vivo. V neomezujícím příkladu zobrazovací metody se může struktura, která se váže na základní polypeptid hybridního polypeptidu, detekovat vazbou na hybridní polypeptid a zobrazením (buď přímým nebo • η»:-.

- 86 nepřímým) navázaného hybridního polypeptidu.

4. Farmaceutické prostředky, dávkování a způsoby podávání

Peptidy podle vynálezu mohou být podávány použitím technik dobře známých odborníkům v oboru. Prostředky mohou být formulovány a podávány systémově. Techniky pro formulaci a podávání je možno nalézt v publikaci „Remingtoďs Pharmaceutical Sciences“, poslední vydání, Mack Publishing Co, Easton, PA. Vhodné způsoby mohou zahrnovat orální, rektální, vaginální, plicní (například inhalační), transdermální, transmukosální nebo intestinální podávání; parenterální dodávání, včetně intramuskulárních, subkutánních, intramedulárních injekcí stejně jako intrathekálních, přímých nebo intraventrikulárních, intravenózních, intraperitoneálních, intranazálních nebo intraokulárních injekcí, pokud uvádíme pouze některé. V případě intravenózních injekcí mohou být prostředky podle vynálezu formulovány ve vodných roztocích, s výhodou ve fyziologicky kompatibilních pufrech jako je Hanksův roztok, Ringerův roztok, nebo pufrovaný fyziologický roztok, pokud uvádíme pouze příklady. Pro dodávání peptidů podle vynálezu mohou být například použita infuzní čerpadla. Pro transmukosální podávání se ve formulaci používají látky napomáhající penetraci příslušné bariéry, přes kterou má léčivo proniknout. Tyto látky napomáhající penetraci jsou v oboru obecně známy.

V případech, kdy je výhodné intracelulární podávání peptidů podle vynálezu nebo jiných inhibičních prostředků, mohou být použity techniky dobře známé odborníkům v oboru. Tyto prostředky mohou být například zapouzdřeny do liposomů nebo mikrokuliček, a potom podány jak bylo popsáno výše. Liposomy jsou sférické lipidové dvojvrstvy s vodným prostředím uvnitř. Všechny molekuly přítomné ve vodném roztoku v době tvorby liposomů jsou zahrnuty do vnitřního vodného prostředí. Obsah liposomů je jak chráněný před vnějším l

- 87 mikroprostředím, tak je i účinně dodáván v důsledku fúze liposomů s buněčnými membránami do cytoplasmy buněk. Navíc je možno dosáhnout, v důsledku jejich hydrofobicity při podávání malých molekul, přímého intracelulárního podávání.

Nukleotidové sekvence kódující peptidy podle vynálezu, které mají být podávány intracelulárně, mohou být exprimovány v příslušných buňkách použitím technologií dobře známých odborníkům v oboru. Například pro dodávání a expresi těchto nukleotidových sekvencí do populace cílových buněk mohou být použity expresní vektory odvozené od virů jako jsou retroviry, viry vakcinie, viry spojené s adenoviry, herpetické viry nebo bovinní papilomaviry. Metody konstrukce takových vektorů a expresní konstrukty jsou velmi dobře známy, viz například Sambrook a další, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor NY, a Ausubel a další, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates a Wiley Interscience, NY.

Účinné látky peptidů podle vynálezu, které mají být podávány, mohou být určeny postupy dobře známými odborníkům v oboru, které řeší takové parametry jako je biologický poločas, biologická dostupnost a toxicita. Ve zvláště výhodných provedeních se účinná dávka hybridního polypeptidů určuje na základě znalostí odborníkům v oboru použitím údajů z rutinních studií in vitro a in vivo, které jsou odborníkům v oboru dobře známé. Například testy antivirové aktivity na buněčných kulturách in vitro, jako jsou testy popisované jako příklady v části 7 dále pro T1249, poskytnou údaje, ze kterých může odborník v oboru snadno určit střední inhibiční koncentraci (IC) peptidu nebo polypeptidů nezbytného pro blokování určité části infekčnosti viru (například 50 %, IC50; nebo 90 %, IC90)· Vhodné dávky je možno potom volit na základě znalostí odborníka v oboru s využitím farmakokinetických údajů z jednoho nebo více rutinních zvířecích modelů, jako jsou farmakokinetické údaje popsané na příkladech

- 88 v části 10 níže pro T1249, takže se získá minimální koncentrace v plasmě (C_mi_n) peptidů, která je rovná nebo která převyšuje stanovenou hodnotu IC.

Jako příklady dávkování polypeptidů je možno uvést dávky již od 0,1 pg/kg tělesné hmotnosti až do 10 mg/kg tělesné hmotnosti. Výhodnější a účinnější rozmezí dávek je od 0,1 do 100 pg/kg tělesné hmotnosti. Jiné příklady dávkování peptidů podle vynálezu mohou být 1 až 5 mg, 1 až 10 mg, 1 až 30 mg, 1 až 50 mg, 1 až 75 mg, 1 až 100 mg, 1 až 125 mg, 1 až 150 mg, 1 až 200 mg, nebo 1 až 250 mg peptidů. Terapeuticky účinná dávka označuje takové množství sloučeniny, které je dostatečné pro zmírnění příznaků nebo prodloužení přežívání u pacienta. Toxicita a terapeutická účinnost těchto sloučenin může být zjištěna standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo na experimentálních zvířatech, například pro určení LD₅₀ (dávka smrtelná pro 50 % populace) a ED₅₀(dávka terapeuticky účinná u 50 % populace). Poměr dávek mezi toxickou a terapeutickou dávkou je terapeutický index, který tedy může být vyjádřen jako poměr LD50/ED50. Výhodné jsou sloučeniny, které mají velké terapeutické indexy. Údaje získané z těchto testů na buněčných kulturách a ze studií na zvířatech mohou být použity při formulaci rozmezí dávek pro použití u lidí. Dávkování těchto sloučenin je s výhodou v rozmezí koncentrací v oběhu, které zahrnují hodnotu ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Dávkování se může v tomto rozmezí měnit v závislosti na použité dávkovači formě a použitém způsobu podávání. Pro jakoukoli sloučeninu použitou při způsobu podle vynálezu může být terapeuticky účinná dávka na počátku odhadnuta z testů na buněčné kultuře. Dávky mohou být určeny na zvířecích modelech pro dosažení plasmatické koncentrace v rozmezí, které zahrnuje IC₅₀ (například koncentrace testované sloučenin, která poskytne polovinu maximální inhibice fuzogenní události, jako je polovina maximální inhibice virové infekce vzhledem k míře události v nepřítomnosti testované sloučeniny) tak jak se určí v buněčné • · · · kultuře. Tato informace může být použita pro přesnější určení použitelných dávek u lidí. Hladiny v plasmě mohou být měřeny například chromatografií s vysokou účinností (HPLC) nebo jakýmkoli biologickým nebo imunologickým testem schopným měřit hladiny peptidů.

Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být podávány v jediném podání, přerušovaně, periodicky nebo kontinuálně. Například polypeptidy podle vynálezu mohou být podány v jediném podání, jako je jediná subkutánní injekce, jediná intravenózní infuze nebo jediné orální podání. Polypeptidy podle vynálezu mohou být také podávány celou řadou přerušovaných podání, včetně periodického podávání. Například v některých provedeních mohou být polypeptidy podle vynálezu podávány jednou týdně, jednou denně, dvakrát denně (například každých 12 hodin), každých 6 hodin, každé 4 hodiny, každé 2 hodiny nebo každou hodinu. Polypeptidy podle vynálezu mohou být také podávány kontinuálně, jako například kontinuální subkutánní nebo intravenózní infuzní pumpou, nebo pomocí subkutánních nebo jiných implantátů, které umožňují, aby byly polypeptidy pacientem kontinuálně absorbovány.

Hybridní polypeptidy podle vynálezu mohou být také podávány v kombinaci s alespoň jedním dalším terapeutickým činidlem. I když to není výhodné pro léčení HIV, podávání pro jiné typy terapie (například léčení rakoviny) může být prováděno současně nebo postupně, včetně cyklické terapie (tj. podávání první sloučeniny po určitou dobu, potom podávání druhé antivirové sloučeniny po určitou dobu a opakování tohoto postupného podávání pro snížení vyvinutí rezistence na jeden z těchto způsobů léčení).

V případě virových, například retrovirových infekcí může být účinné množství hybridního polypeptidu nebo jeho farmaceuticky přijatelného derivátu podáváno v kombinaci s alespoň jedním, s výhodou alespoň dvěma dalšími antivirovými prostředky.

• · · · *·· *♦ ·· ·· ·«·

- 90 Pokud jako příklad uvedeme infekci HIV, mezi tyto antivirové prostředky mohou patřit bez omezení DP-107 (T21), DP178 (T20), jakýkoli jiný základní polypeptid zobrazený v tabulce 2 odvozený z HIV-1 nebo HIV-2, jakýkoli jiný hybridní polypeptid, jehož základní polypeptid je alespoň z části odvozen o HIV-1 nebo HIV-2, cytokiny, například rIFN a, rIFN β, rIFN γ; inhibitory reverzní transkriptázy, včetně nukleosidových a nenukleosidových inhibitorů, například AZT, 3TC, D4T, ddl, adefovir, abacavir a jiné dideoxynukleosidy nebo dideoxyfluornukleosidy, nebo delaviridinmesylát, nevirapin, efavirenz; inhibitory zakončování virové mRNA, jako je ribavirin; inhibitory HIV proteázy, jako je ritonavir, nelfinavirmesylát, amprenavir, saquinavir, saquinavirmesylát, indinavir nebo ABT378, ABT538 nebo MK639; amfotericin B jako molekula vázající se na lipidy s anti-HIV účinky: a castanospermin jako inhibitor zpracování glykoproteinů.

Hybridní a/nebo základní polypeptidy podle vynálezu mohou být dále používány preventivně pro prevenci onemocnění. Hybridní a/nebo základní polypeptidy mohou působit přímo pro prevenci onemocnění, nebo mohou být alternativně použity jako vakcíny, přičemž si hostitel vytváří protilátky proti hybridním polypeptidům podle vynálezu, které potom slouží pro neutralizaci patogenních organismů, například pro inhibicí virové, bakteriální a parazitární infekce.

Pro všechny tyto výše popisované způsoby léčení je možno zvolit přesnou formulaci, cestu podávání a dávkování na základě rozhodnutí ošetřujícího lékaře z hlediska stavu pacienta (viz např. Fingl a další, 1975, „The Pharmacological Basis of Therapeutics“, kap. 1, str. 1).

Je třeba uvést, že ošetřující lékař by měl vědět, jak a kdy ukončit, přerušit nebo upravit podávání z hlediska toxicity nebo dysfunkcí orgánů. Naopak by ošetřující lékař měl také vědět jak upravit léčení směrem k vyšším dávkám, jestliže nebyla klinická odpověď dostatečná (i z hlediska toxicity). Podávané dávky při zvládání • « ♦ »«· · ·· ·· ·· ···

- 91 onkogenní poruchy se budou lišit podle vážnosti léčeného stavu a cesty podávání. Dávka a také četnost dávek se budou lišit podle věku, tělesné hmotnosti a reakce každého jednotlivého pacienta. Ve veterinárním lékařství může být použito programu srovnatelného s programem diskutovaným výše. Použití farmaceuticky přijatelných nosičů pro formulaci zde popisovaných sloučenin pro praktické použití vynálezu do dávkovačích forem vhodných pro systémové podávání patří do rámce předkládaného vynálezu. Správnou volbou nosiče a vhodného způsobu výroby mohou být prostředky podle předkládaného vynálezu, zvláště prostředky formulované jako roztoky, podávané parenterálně, jako například subkutánní injekcí, intravenózní injekcí, subkutánní infuzí nebo intravenózní infuzí, například čerpadlem. Sloučeniny mohou být snadno formulovány s použitím farmaceuticky přijatelných nosičů dobře známých v oboru do dávkovačích forem vhodných pro orální podávání. Tyto nosiče umožňují formulaci sloučenin podle vynálezu jako tablety, pilulky, kapsle, kapaliny, gely, sirupy, kaše, suspenze apod., pro orální podávání léčenému pacientovi.

Farmaceutické prostředky vhodné pro použití v rámci předkládaného vynálezu zahrnují prostředky, ve kterých jsou účinné složky obsaženy v účinném množství pro dosažení zamýšleného účelu. Určení účinných množství může provést odborník v oboru, zvláště na základě uvedeného podrobného popisu.

Navíc k účinným složkám mohou tyto farmaceutické prostředky obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče obsahující pomocné látky, které umožňují zpracování aktivních sloučenin do přípravků, které mohou být farmaceuticky použity. Přípravky formulované pro orální podávání mohou být ve formě tablet, dražé, kapslí nebo roztoků. Pro orální podávání peptidů mohou být použity způsoby, které se například používají v Emisfere Technologies, které jsou dobře známé odborníkům v oboru, a mohou být rutinně používány.

'' « • · • · ** · ·

- 92 Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být vyráběny způsobem, který je známý sám o sobě, například pomocí běžného míchání, rozpouštění, granuiace, výroby dražé, rozprašovacím sušením, emulgací, zapouzdřováním, zachycováním, nebo lyofilizací.

Farmaceutické prostředky pro parenterální podávání zahrnují vodné roztoky účinných látek ve formě rozpustné ve vodě. Navíc mohou být emulze a suspenze účinných sloučenin připraveny jako vhodné olejové injekční směsi. Mezi vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula patří mastné oleje jako je sezamový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin jako je ethyloleát nebo triglyceridy, liposomy nebo jiné látky známé v oboru pro výrobu lipidových nebo lipofilních emulzí. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu suspenze, jako je sodná sůl karboxymethylcelulózy, sorbitol nebo dextran. Suspenze může také popřípadě obsahovat vhodné stabilizátory nebo látky zvyšující rozpustnost sloučenin a umožňující přípravu vysoce koncentrovaných roztoků. Farmaceutické prostředky pro orální použití mohou být získány kombinací účinných látek s pevnými pomocnými látkami, popřípadě mletím získané směsi a zpracováním směsí granulí po přídavku vhodných pomocných látek, v případě potřeby, pro získání tablet nebo jader dražé. Vhodné pomocné látky jsou zvláště plniva jako jsou cukry, včetně laktózy, sacharózy, trehalózy, mannitolu nebo sorbitolu; celulózové preparáty jako je například kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragakantová guma, methylcelulóza, hydroxypropylmethylcelulóza, sodná sůl karboxymethylcelulózy a/nebo polyvinylpyrrolidon (PVP). V případě potřeby mohou být přidána desintegrační činidla, jako je zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar, nebo alginová kyselina, nebo jejich soli jako je alginát sodný.

Jádra dražé se opatřují vhodnými povlaky. K tomuto účelu mohou být použity koncentrované roztoky cukrů, které mohou popřípadě obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, ·· ··»» karbopolový gel, polyethylenglykol a/nebo oxid titaničitý, roztoky laků a vhodná organická rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel. K tabletám nebo povlakům pro dražé mohou být přidávána barviva nebo pigmenty pro identifikaci nebo charakterizaci různých kombinací dávek účinné sloučeniny. Farmaceutické prostředky, které mohou být používány orálně, zahrnují zasouvací kapsle vyrobené z želatiny stejně jako měkké uzavřené kapsle, vyrobené z želatiny a plastifikátoru, jako je glycerol nebo sorbitol. Zasouvací kapsle mohou obsahovat účinné složky ve směsi s plnivem jako je laktóza, pojivá jako jsou škroby a/nebo kluzné látky jako je talek nebo stearan hořečnatý a popřípadě stabilizátory. V případě měkkých kapslí mohou být účinné sloučeniny rozpuštěné nebo suspendované ve vhodných kapalinách, jako jsou mastné oleje, parafinový olej nebo kapalné polyethylenglykoly. Navíc mohou být přidány stabilizátory.

V případech, kdy se požaduje zesílení imunitní odpovědi hostitele, mohou být hybridní polypeptidy formulovány s vhodným adjuvans pro zesílení imunitní odpovědi. Mezi tato adjuvans mohou bez omezení patřit minerální gely jako je hydroxid hlinitý; povrchově aktivní látky jako je lysolecithin, polyoly pluronic, polyanionty; další peptidy, olejové emulze; a potenciálně použitelná adjuvans jako BCG a Corynebacterium parvum. Pro zavádění vakcín popisovaných výše je možno použít mnoha způsobů. Mezi tyto způsoby bez omezení patří orální, intradermální, intramuskulární, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní a intranazální způsoby podávání.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Identifikace konvenčních aminokyselinových sekvencí, které obsahují zesilující peptidové sekvence

Retrovirální protein gp41 obsahuje strukturní domény označované jako oblast α-šroubovice umístěnou v C-koncové oblasti • · · · • * * * * ··♦·· ⁿ * · « * · ··*··» » ·· · · **··<·· “’· · ·· ·· · · · ·«

-94proteinu a oblast leucinového zipu umístěnou v N-koncové oblasti proteinu. Srovnání oblastí zesilující peptidové sekvence obsažené uvnitř gp41 (obr. 2A a 2B) z gp41 ze všech současně publikovaných izolovaných sekvencí HIV-1, HIV-2 a SIV identifikovalo konvenční aminokyselinové sekvence ukázané v obr. 1.

Jak se podrobněji popisuje v dále uváděných případech, tyto sekvence reprezentují zesilující peptidové sekvence, ve kterých vazba těchto peptidových sekvencí na řadu různých základních polypeptidů zlepšuje farmakokinetické vlastnosti získaných hybridních polypeptidů.

Příklad 2: Hybridní polypeptidy fungující jako silné inhibitory infekce

HIV-1

T1249 znázorněný v obr. 13, je hybridní polypeptid, který obsahuje zesilující peptidové sekvence navázané na základní polypeptid HIV. Jak je uvedeno dále, hybridní polypeptid T1249 se vyznačuje zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi a silnou aktivitou in vitro proti izolátům HIV-1, HIV-2 a SIV, zesílenou aktivitou proti klinickým izolátům HIV-1 v infekčních testech v HuPBMC in vitro, stejně jako v modelu HuPBMC na myší SCID invekce HIV-1 in vivo. V dále popisovaných biologických testech se porovnává aktivita T1249 s aktivitou silného antivirově účinného polypeptidů T20. Polypeptid T20, který je známý také jako DP-178, je odvozený z proteinové sekvence HIV-1 gp41, a popisuje se a nárokuje v US patentu No. 5,464,933.

1. Materiály a metody

1.1. Syntéza a purifikace peptidů

Peptidy byly syntetizovány použitím syntézy Fast Moc. Peptidy obecně obsahovaly, pokud není uvedeno jinak, amidované karboxylové konce a acetylované aminokonce. Purifikace byla • · · · • · ·· · ···· • * f « · « ··.

······· « * · * . « * ‘ ······· ··· · ·· ·· ·· ···

- 95 prováděna HPLC s reverzní fází.

T1249 (Ac-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASL-WEWF-NH₂) je peptid o délce 39 aminokyselin (Mh = 5036,7) složený výhradně z aminokyselin vyskytujících se v přírodě, který je pro zvýšení stability na aminovém konci blokován acetylovou skupinou a na karboxylovém konci je blokován amidovou skupinou. T1387 je peptid o délce 23 aminokyselin postrádající zesilující peptidové sekvence (Ac-TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK-NH₂). T1387 tedy představuje základní polypeptid hybridního polypeptidu T1249. T1387 je na aminových a karboxylových koncích blokován stejným způsobem jako T1249.

T1249 byl konkrétně syntetizován použitím standardních technik syntézy na pevné fázi. Identita hlavního vrcholu na záznam HPLC byla potvrzena hmotnostní spektroskopií jako T1249.

T1249 bylo možno snadno čistit chromatografií s reverzní fází na koloně 152 mm naplněné nosičem C18, 10 pm, 120Α.

1. 2 Virus

Virus HIV-1_Lai (Popovic, M. a další, 1984, Science 224: 497 508) byl pomnožen v buňkách CEM kultivovaných v médiu RPMI 1640 obsahujícím 10 % fetálního telecího séra. Supernatant z infikovaných buněk CEM byl zfiltrován filtrem 0,2 pm a infekční titr byl určen mikroinfekčním testem použitím buněčné linie ΑΑ5 pro podporu replikace viru. K tomu účelu bylo 20 pl sériově zředěného viru přidáno do 20 pl buněk CEM při koncentraci 6 x 10⁵/ml v 96-jamkové mikrotitrační destičce. Každá zředění viru bylo testováno ve třech opakováních. Buňky byly kultivovány 7 dnů, přičemž každý den bylo přidáváno čerstvé médium. Sedmý den po infekci byly vzorky supernatantu testovány na replikaci viru, kterou je možno dokázat aktivitou reverzní transkriptázy uvolněnou do supernatantu. Hodnota

- 96 TCID50 byla vypočtena vzorcem podle Reeda a Muencha (Reed, L. J. a další, 1938, Am. J. Hyg. 27: 493 - 497).

1. 3 Test buněčné fúze

Přibližně 7 x 10⁴ buněk Molt-4 bylo inkubováno s 1 x 10⁴ buněk CEM chronicky infikovaných virem HIV-1 lai v 96-jamkových destičkách pro tkáňové kultury v konečném objemu 100 pl kultivačního média (RPMI 1640 obsahující 10 % teplem inaktivovaného FBS, doplněného 1% L-glutaminem a 1% Pen-Strep), jak bylo popsáno dříve (Matthews, T. J. a další, 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 5424 - 5428). Inhibitory peptidů byly přidávány v objemu 10 μΙ a buněčné směsi byly inkubovány 24 hod při 37 °C v 5% CO₂. Potom byly počítány vícejaderné obří buňky (syncytia, pětinásobná šířka buněk nebo větší) mikroskopickým počítáním při zvětšení 10 x a 40 x, které umožnilo zviditelnění celé jamky v jediném zorném poli. Ošetřené buňky byly porovnávány s infikovanými neošetřenými kontrolami a výsledky byly vyjádřeny jako procento inhibice infikovaných kontrol.

1. 4 Testy infekčnosti na buňkách MAGI-CCR-5

Přibližně 1 x 10⁶ buněk Magi-CCR-5 (získaných prostřednictvím NIH AIDS Research a Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIAID; Chackerian, B. a další, 1997, J. Virol. 71: 3932 - 3939) bylo zaočkováno o 48-jamkové destičky pro tkáňové kutlury (přibližně 2 x 10⁴ buněk/jamku v objemu 300 μΙ/jamku selektivního růstového média složeného z DMEM doplněného 10 % teplem inaktivovaného FBS, 1 % L-glutaminu, 1 % Pen/Strep, hygromycinem B, geneticinem a puromycinem) a ponechány přichytit přes noc při 37 °C, v atmosféře 5% CO₂. Buňky dosáhly následujícího dne konfluence přibližně 30 %. Očkovací médium bylo odstraněno a byl přidán zředěný peptidový inhibitor v objemech 50 μΙ/jamku (média pouze v neošetřených • <·

- 97 kontrolách) s následným přidáním zředěného viru 100 pl/jamku (požadovaný vstupní titr viru 100 - 200 pfu/jamku). Nakonec bylo do každé jamky přidáno 250 μΙ selektivního růstového média a destička byla inkubována 2 dny při 37 °C, v 5% CO₂. Fixace a barvení bylo prováděno podle protokolu poskytnutého NIAID s buňkami MAGICCR5. Ve stručnosti, médium bylo z destičky odstraněno a do každé jamky bylo přidáno 500 μΙ fixativu. Destičky byly ponechány fixovat 5 min při pokojové teplotě. Fixativ byl odstraněn, každá jamka byla dvakrát promyta DPBS a do každé jamky bylo přidáno 200 μΙ barvicího roztoku. Destička byla potom inkubována při 37 °C v 5% CO₂ 50 min, barvicí roztok byl odstraněn a každá jamka byla dvakrát promyta DPBS. Destička byla ponechána sušit na vzduchu před počítáním modrých buněk pod mikroskopem, přičemž počítání se provádělo pro celou jamku. Ošetřené buňky byly porovnávány s infikovanými neošetřenými kontrolami, a výsledky byly vyjádřeny jako procento inhibice infikovaných kontrol.

1. 5 Test s reverzní transkriptázou

Byl proveden mikrotest s reverzní transkriptázou (RT) upravený z Goff a další (Goff, S. a další, 1981, J. Virol. 38: 239 - 248) a Willey a další (Willey, R. a další, 1988, J. Virol. 62: 139 - 147).

V supernatantech z kultur virů a buněk byla upravena koncentrace 1% Triton-X100. 10 μΙ každého vzorku supernatant/Triton X-100 bylo přidáno do 50 μΙ směsi RT (75 mM KCI, 2 mM Clevelandsovo činidlo, 5 mM MgCI₂, 5 μg/ml póly A, 0,25 jednotek/ml oligo dT, 0,05 % NP40, 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 0,5 μΜ neradioaktivní dTTP a 10 cCi/ml ³²PdTTP) v 96-jamkové mikrotitrační destičce se dnem ve tvaru U a směs byla inkubována při 37 °C 90 min. Po inkubaci bylo převedeno 40 μΙ reakční směsi z každé jamky do zařízení dot blot Schleicher a Schuell (S+S) v částečném vakuu, které obsahovalo filtrační vrstvu pro 96 jamek rozdělenou mřížkou (Wallac katalog # 1450 - 423) a filtr

- 98 nasycený pufrem 2 x SSC (0,3M NaCl a 0,003M citrát sodný). Každá jamka byla promyta 4 x alespoň 200 pl 2 x SSC použitím plného vakua. Zařízení bylo rozebráno a filtrační papír opatřený mřížkou byl vyjmut a třikrát promyt 2 x SSC. Nakonec byla filtrační membrána odsáta na absorpčním papíře, ponechána sušit na vzduchu a byla zatavena do sáčku. Vzorky byly vloženy do kazety s fosforescenční vrstvou a byla přiložena vymazaná (alespoň 8 min) fosforescenční vrstva a kazeta byla uzavřena. Bylo použito expozice 16 hod. Pro zjištění ovlivněného nebo inhibovaného podílu (Fa) pro všechny dávky inhibitoru nebo inhibitorů v porovnání s neošetřenými infekčními kontrolami byly použity hodnoty Pixel Index Values (PIV), vytvořené ve formátu vyjadřujícím objem odvozeném z přenosů fosforescenčního zobrazování (Molecular Dynamics Phosphorimager) (analýza byla prováděna na ImageQuant volume report, byla provedena korekce na pozadí.

1. 6 Test infekčnosti/neutralizace na lidských PBMC

Prototyp testu používal buněčných linií, kde se v testu primárního izolátu používá buněk PBMC, získaných z Interstate Blood Bank, aktivovaných 2 až 3 dny kombinací protilátek OKT3 (0,5 pg/ml) a CD28 (0,1 pg/ml). Cílové buňky byly přeneseny do média pro separaci lymfocytů (LSM), promyty a zmrazený. Buňky byly podle potřeby ponechány roztát a byly aktivovány jak bylo uvedeno výše minimálně 2 až 3 dny před testem. V tomto testu ve formátu 96 jamek byly buňky v koncentraci 2 x 10⁶/ml v 5% médiu IL-2 a konečném objemu 100 pl. Zásobní roztoky peptidů byly připraveny v DPBS (1 mg/ml). Ředení peptidů byla prováděna v kompletním médiu 20 % FBS RPMI 1640/5 % IL-2.

- 99 1. 7 Model infekce HIV-1 na myších HU-PBMC SCID in vivo

Samice myší SCID (stáří 5 až 7 týdnů) dostaly intraperítoneálně 5 až 10 x 10⁷ dospělých lidských buněk PBMC. Dva týdny po rekonstituci byly myši infikovány i.p. v den 0 10³ TCID₅o HIV-1 9320 (izolát A018 citlivý na AZT. Ošetření peptidy bylo prováděno intraperítoneálně, dvakrát denně počínaje dnem -1 a dále až do šestého dne. Míra infekce krevních buněk, splenocytů, lymfatických uzlin a peritoneálních buněk byla testována kvantitativní společnou kultivací s lidskými blasty PBMC týdně po tři za sebou následující týdny po odběru krve a tkání zvířeti (den 7, přibližně 12 až 18 hod po posledním podání léčiva). Supernatanty ze společné kultivace byly testovány na produkci antigenů p24 HIV-1 jako měřítka infekce virem (kity a protokol Immunotek Coulter).

1. 8 Farmakokinetické studie na krysách

Byli použiti samci krys CD o hmotnosti 250 až 300 g s dvojitým jugulárním katétrem, získaní od Charles River Laboratories. Peptidy byly nastřikovány do jednoho jugulárního katétru v objemu 200 pl roztoku peptidu (přibližně 3,75 mg/ml), přičemž koncentrace podávaného roztoku byla určena Edelhochovou metodou (Edelhoch, 1967, Biochemistry 6: 1948 - 1954) a nastavena v závislosti na hmotnost zvířete tak, že každé zvíře dostalo dávku 2,5 mg/kg). Přibližně 250 až 300 pl krve bylo odebíráno v předem určených časových intervalech (0, 15, 30 min a 1, 2, 4, 6 a 8 hod) a přidáváno do zkumavek capiject s EDTA. Po centrifugaci byla od usazených buněk oddělena plasma a buď zmražena nebo okamžité zpracována pro fluorescenční analýzu HPLC.

1. 9 Analýza vzorků plasmy fluorescenční HPLC

100 μΙ vzorku plasmy bylo přidáno k 900 μΙ precipitačního pufru

- 100 (acetonitril, 1,0% TFA, detergent) což vede k vysrážení většiny plasmatických proteinů. Po centrifugaci při 10 000 ot/min 10 minut, bylo odebráno 400 pl supernatantu, který byl přidán k 600 pl vody s čistotou pro HPLC. Byla prováděna sériová ředění určovaná koncentrací peptidu přítomného v každém vzorku v ředicím pufru složeném ze 40 % precipitačního pufru a 60 % vody pro HPLC. Navíc k ředěním vzorků byla prováděna sériová ředění dávkovaného roztoku v pufru stejně jako v plasmě a použita pro vytvoření standardní křivky určující vztah mezi plochou vrcholu a známou koncentrací peptidu. Tato křivka byla potom použita pro výpočet koncentrace peptidu v plasmě se zahrnutím do výpočtu všech ředění a množství nastříknutého na kolonu.

1,10 Protokol XTT

Pro měření cytotoxických/cytostatických účinků peptidů byly prováděny testy XTT (Weislow, O. S. a další, 1989, J. Nati. Cancer Inst. 81: 577 - 586) přítomnosti různých koncentrací peptidu, aby bylo možno určit index selektivity (SI). Hodnota TC₅₀ byla v tomto testu určována inkubací buněk v přítomnosti a v nepřítomnosti sériově ředěného peptidu s následným přidáním XTT. V přežívajících/metabolizujících buňkách se XTT redukuje na rozpustné hnědé barvivo XTT-formazan. Odečítá se absorbance a provádí se srovnání mezi hodnotami získanými v přítomnosti a v nepřítomnosti peptidu pro zjištění hodnoty TC₅₀ Karberovou metodou (viz např. Lennette, E. H. a další, ed., 1969, „Diagnostic Procedures for Viral and Rickettsial Infections“, American Public Health Association, lne., 4. vyd., str. 47 - 52). Buňky Molt 4, CEM (80 000 buněk/jamku) a kombinace těchto dvou typů buněk (70 000, popřípadě 10 000 buněk/jamku) byly vysety a inkubovány se sériově ředěným peptidem 24 hod v celkovém objemu 100 pl. Po inkubaci bylo do každé jamky přidáno 25 pl pracovního roztoku XTT (1 mg/ml XTT,

- 101 250 μΜ PMS v kompletním médiu s obsahem 5 % DMSO) a destičky byly inkubovány při 37 °C. Byl odečítán vývoj barvy a výsledky byly použity pro vyjádření hodnot poskytnutých v jamkách s obsahem peptidů jako procento hodnot získaných z jamek obsahujících neošetřenou kontrolu.

2. Výsledky

2. 1 Antivirová aktivita - testy fúze

T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech fúze buňka - buňka zprostředkované virem s použitím chronicky infikovaných buněk CEM smíšených s neinfikovanými buňkami Molt-4, jak je ukázáno v tabulce 3 níže. Inhibice fúze T1249 proti laboratorním izolátům jako je lllb, MN a RF je srovnatelná s T20, a vykazuje proti T20 přibližně 2,5 až 5 násobné zvýšení. T1249 byl také aktivnější (3 až 28 násobné zvýšení) než T20 proti několika klinickým izolátům indukujícím syncytia, včetně izolátu rezistentního na AZT (G691-2) a izolátu předem ošetřeného AZT (G762-3) a G320 (izolát použitý ve studiích v HuPBMC-SCID). Nejvýznamnější je, že polypeptid T1249 měl více než 800 krát vyšší účinnost než peptid T20 proti HIV-2 NIHZ.

Tabulka 3

Izolát viru	T20 (ng/ml)	n	T1249 (ng/ml)	n	Rozdíl jako násobek
HIV-1 lllb	2,5	9	1,0	9	2,5
HIV-1 G691-2 (AZT-R)	406,0	1	16,0	1	25
HIV-1 G762-3 (pre-AZT)	340,1	1	12,2	1	28
HIV-1 MN	20,0	7	3,1	7	6
HIV-1 RF	6,1	7	2,1	7	3
HIV-1 9320	118,4	1	34,5	1	3
HIV-2 NIHZ	3610,0	>10	4,3	2	840

- 102 2, 2 Antivirová účinnost - testy infekčnosti Maqi-CCR-5

Testy infekčnosti Magi-CCR-5 umožňují přímá srovnání izolátů virů indukujících syncytia a neindukujících syncytia, stejně jako porovnání mezi laboratorními a klinickými izoláty. Tento test je také přímým měřítkem infekce virem (exprese TAT po infekci, transaktivace produkce β-galaktosidázy řízené LTR) naproti běžně používaným nepřímým metodám měření infekčnosti, jako je produkce antigenu p24 nebo produkce reverzní transkriptázy. Testy infekčnosti Magi-CCR-5 (viz tabulka 4 níže) ukazují, že T1249 je konzistentně účinnější než T20 proti všem testovaným izolátům z hlediska EC50, tak i výpočtům inhibice Vn/Vo = 0,1. T1249 vykazuje podstatné zlepšení účinnosti ve srovnání s klinickým izolátem HIV-1 301714 (> 25 násobné), který je jedním z nejméně citlivých izolátů na T20. Navíc je T1249 alespoň 100 krát silnější než T20 vzhledem k izolátů SIV B670. Tyto údaje spolu s údaji o fúzi ukazují, že T1249 je silným peptidovým inhibitorem HIV-1, HIV-2, a SIV.

103

Tabulka 4

T20	T1249
Izolát viru	EC-50	Vn/Vo=0,1	EC-50	Vn/Vo = 0,1	EC-50 rozdíl jako násobek	Vn/Vo=0,1 rozdíl jako násobek
HIV-1 IIIB	42	80	8	10	5	8
HIV-1 9320	11	50	1	6	11	8
HIV-1 301714 (subtyp B,NSI)	1065	4000	43	105	25	38
HIV-1 G691-2 (AZT-R)	13	200	0,3	20	43	10
HIV-1 pNL4-3	166	210	1	13	166	16

SIV-B670	2313	>10000	21	100	110	>100

2. 3 Antivirová aktivita - test infekčnosti HuPBMC

T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech infekčnosti HuPBMC (tabulka 5 níže), který představuje uznávanou náhražku systému in vitro pro předpovídání koncentrací léčiva v plasmě nutných pro inhibici viru in vivo. Tato porovnání ukázala, že T1249 je účinnější proti všem dosud testovaným izolátům HIV-1, přičemž všechny hodnoty Vn/Vo = 0,1 (dávka nutná pro snížení titru viru o jeden log) jsou sníženy až k submikrogramovým koncentracím. Mnohé z nejméně citlivých klinických izolátů na T20 vykazovaly desetinásobnou nebo větší citlivost na T1249. Je třeba zdůraznit, že HIV-1 9320, izolát používaný v myším modelu infekce HuPBMC SCID je 46 x méně citlivý na T20 než na T1249, což ukazuje velmi dobrou korelaci s výsledky in vivo.

······ · ··· · • · · · · · · • · ·· ·· ·· ·

104 Tabulka 5

T20	T1249
Vírový izolát (HIB-1)	Vn/Vo=0,1 (ng/ml)	Vn/Vo=0,1 (ng/ml)	Rozdíl jako násobek
IIIB	250	80	3
9320	6000	130	46
301714 (subtyp B, NSI)	8000	700	11
302056 (subtyp B, NSI)	800	90	9
301593 (subtyp B, SI)	3500	200	18
302077 (subtyp A)	3300	230	14
302143 (SI)	1600	220	7
G691-2 (AZT-R)	1300	400	3

2. 4 Antivirová aktivita - laboratorní izoláty rezistentní na T20

T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech fúze buňka - buňka zprostředkované virem prováděných s použitím chronicky infikovaných buněk CEM smíšených s neinfikovanými buňkami Molt-4 (tabulka 6 níže). T1249 byl téměř 200 krát silnější než T20 při měření na izolátu rezistentním na T20.

Tabulka 6

Izolát viru	T20 (ng/ml)	n	T1249 (ng/ml)	n	Rozdíl jako násobek
HIV-1 pNLA-3 SM (T20 rezistentní)	405,3	3	2,1	3	193

V testech Magi-CCR-5 (viz tabulka 7 níže), je T1249 50 000 krát účinnější než T20 při testování na izolátech rezistentních na T20, jako • · · · · v

- 105 je pNL4-3 SM a pNL4-3 STM (Rimsky, L. a Matthews, T., 1998, J. Virol. 72: 986 - 993).

Tabulka 7

	T20	T1249
Izolát viru (HIV-1)	EC-50	Vn/Vo = 0,1	EC-50	Vn/Vo = 0,1	EC-50 rozdíl jako násobek	Vn/Vo = 0,1 rozdíl jako násobek
pNLA-3	166	210	1	13	166	16
pNLA4-3 SM (T20-R)	90	900	4	11	23	82
pNLA4-3 SM (T20-R) Duke	410	2600	4	11	103	236
PNLA4-3 STM (T20/T649-R)	<50 000	>50 000	1	13	>50 000	>3846

T1249 byl přímo porovnáván s T20 v testech infekčnosti HuPBMC (viz tabulka 8 níže), který vyhodnocoval rozdíly v účinnosti na rezistentní izolát. T1249 je více než 250 krát účinnější než T20 při testování na rezistentním izolátu pNL4-3 SM.

Tabulka 8

	T20	T1249
Izolát viru (HIV-1)	Vn/Vo = 0,1 (ng/ml)	Vn/Vo = 0,1 (ng/ml)	Rozdíl jako násobek
pNL4-3	3500	30	117
pNL4-3 SM (T20-R)	>10 000	40	>250

2. 5 Antivirová účinnost, model in vivo SCID-HuPBMC

Antivirová účinnost T1240 in vivo byla přímo porovnávána s účinností T20 v HuPBMC-SCID myším modelu infekce HIV-1 9320 (obr. 3). Dva týdny po rekonstituci HuPBMC byly myši infikovány i. p. v den 0 10³ TCID₅₀ HIV-1 9320 pasážovaným v PBMC (AZT senzitivní izolát A018). Bylo prováděno ošetření peptidy i. p. dvakrát denně v celkových denních dávkách 67 mg/kg (T20), 20 mg/kg (T1249), 6,7 mg/kg (T1249), 2,0 mg/kg (T1249), a 0,67 mg/kg (T1249), po 8 dnů počínaje dnem -1. Míra infekce v krevních buňkách, splenocytech, lymfatických uzlinách a peritoneálních buňkách byla testována kvantitativní společnou kultivací s lidskými blasty PBMC týdně po tři za sebou následující týdny po odebrání krve a tkání (den 7, přibližně 12 až 18 hod po posledním podání léčiva). Supernatanty ze společné kultivace byly testovány na produkci antigenu HIV-1 p24 jako měřítko infekce virem. Infekční viry nebyly detekovatelné v krvi nebo v lymfatických tkáních u zvířat ošetřených T20, i když byl virus detekován v peritoneální tekutině a preparátu sleziny. Všechny součásti byly negativní na infekční virus při dávce 6,7 mg/kg T1249, což ukazuje alespoň desetinásobné zlepšení ve srovnání s ošetřením T20 V dávce 2,0 mg/kg T1249 byly zcela prosté detekovatelného infekčního viru jak lymfa tak i slezina, přičemž u peritoneální tekutiny došlo ke snížení titru viru s koeficientem 2 log₁₀, a u titru viru v krvi došlo ke snížení s koeficientem 1 log-ίο, přičemž vždy bylo provedeno srovnání s infikovanými kontrolami. Při nejnižší dávce T1249, 0,67 mg/kg, byly peritoneální tekutina a krev ekvivalentní s infikovanou kontrolou; avšak jak u lymfatických, tak i slezinných tkání byl pozorován pokles titru infekčního viru s koeficientem 1 log-ιο- Celkově tyto výsledky ukazují, že T1249 je za těchto podmínek 30 až 100 krát účinnější in vivo proti HIV-1 9320.

·· ··*· • « ··♦ · · · ··· ······· · * · · · · * · ·<·· ··«, . 1οϊ -..........

2. 6 Farmakokinetické studie na krysách

Pro další definici farmakokinetického profilu T1249 byly použity krysy s kanylami. Samcům krys CD o hmotnosti 250 až 300 g byly jugulárním katétrem podávány i.v. polypeptidy T1249 a T20 (obr. 4A 5). Získané vzorky plasmy byly vyhodnocovány fluorescenční HPLC pro odhad množství peptidů v extrahované plasmě, β-fáze poločasu a celková AUC T1249 byly téměř třikrát vyšší než v případě T20 (obr. 5).

2. 7 Cytotoxicita

U T1249 nebyla pozorována žádná zřejmá cytotoxicita in vitro, jak je ukázáno na obr. 6.

Navíc není T1249 akutně toxický (úmrtí během 24 hod) i v dávce 167 mg/kg (nejvyšší testovaná dávka) podané i.v. jugulární kanylou (0,3 ml v průběhu 2 až 3 min).

2. 8 Přímá vazba na konstrukt gp41 Μ41Δ178

T1249 byl radioaktivně označen ¹²⁵l a pomocí HPLC čištěn až k dosažení maximální specifické aktivity. Stejným způsobem byl jodován T20. Saturační vazba na Μ41Δ178 (zkrácený fúzní protein ektodomény gp41 bez aminokyselinové sekvence T20) imobilizovaný na mikrotitračních destičkách v koncentraci 0,5 pg/ml je ukázána na obr. 7. Nespecifická vazba byla definována jako vazba radioligandu v přítomnosti 1 pM neznačeného peptidů. Specifická vazba byla rozdíl mezi celkovou a nespecifickou vazbou. Výsledky ukazují, že IT1249 a ¹²⁵l-T20 mají podobné vazebné afinity s hodnotou 1 až 2 nM. Lineární inverzní Scatchardova vynesení ukazují, že každý ligand se váže na homogenní skupinu míst.

Kinetika vazby ¹²⁵I-TI249 a ¹²⁵l-T20 byla určována na * ··«· ·: · » ···.«, • * · · · · » · · •a···*» _e ··· « « ’ · ······.

-10tf- ’ “ ·· ·· *·· scintilačních mikrotitračních destičkách potažených 0,5 pg/ml Μ41Δ178. Časový průběh asociace a disociace je ukázán na obr. 8. Disociace navázaného radioligandu byla měřena po přídavku neznačeného peptidů na konečnou koncentraci 10 μΜ v jedné desetině celkového testovacího objemu. Počáteční rychlosti nástupu a sestupu pro ¹²⁵I-T1249 byly podstatně pomalejší než hodnoty pro ¹²⁵l-T20. Charakteristiky disociace pro oba radioligandy byly nezměněny, jestliže disociace byla započata s druhým neznačeným peptidem (tj. ¹²⁵I-T1249 s T20).

Aby bylo možno dále ukázat, že oba ligandy soutěží o stejná cílová místa, neznačené T1249 a T20 byly titrovány v přítomnosti jedné koncentrace buď ¹²⁵I-T1249 nebo ¹²⁵l-T20. Ligand byl přidán pro zahájení inkubace právě po neznačeném peptidů. Kompetiční křivky ukázané na obr. 9 ukazují, že ačkoli oba ligandy mají podobné afinity, jsou pro úplnou kompetici vzhledem k vazbě ¹²⁵I-T1249 nutné vyšší koncentrace jak neznačeného T20, tak i T1249.

2. 9 Přímá vazba na oblast HR1 GP41

Pro měření sekundární struktury T1249 v roztoku (fyziologický roztok s fosfátovým pufrem, pH 7) byla použita spektroskopie cirkulárního dichroismu (CD), přičemž T1249 byl použit buď samostatně nebo v kombinaci s peptidem o délce 45 zbytků (T1346) z HR1 (sedmičlenné opakování 1) vazebné oblasti gp41. Obr. 14A ilustruje spektrum CD T1249 samotného v roztoku (10 μΜ, 1 - C). Spektrum je typické pro peptidy, které přijímají a-šroubovicovou strukturu. Konkrétně dekonvoluce tohoto spektra používající rozklad se základem nastaveným na spektrum proteinu o délce 33 předpovídá v T1249 obsah šroubovice (samotného v roztoku) na 50 %. Obr. 14B ilustruje reprezentativní spektrum CD peptidů T1249 smíšeného s T1346. Plné čtverce () označují teoretické spektrum CD předpovězené pro „model bez interakce“, kde se předpokládá, že •9 ···· * 9 peptidy neinteragují v roztoku. Skutečné experimentální spektrum (·) se významně liší od tohoto teoretického „neinterakční model“ spektra, což ukazuje, že oba peptidy interagují za získání měřitelné strukturní změny, která se pozoruje na spektru CD.

2. 10 Proteinázová ochrana vazebné oblasti T1249 uvnitř GP41

Vnímavost chimerního proteinu Μ41Δ178, popisovaná v části 2. 8 výše, vzhledem ke štěpení proteinázou K, byla testována a analyzována elektroforézou na polyakrylamidovém gelu. Výsledky jsou ilustrovány na obr. 15. Jestliže se individuálně s proteinázou K inkubují buď Μ41Δ178 (neštěpený obr. 15, dráha 2; štěpený obr. 15, dráha 3) nebo T1249 (neštěpený obr. 15, dráha 4; štěpený obr. 15, dráha 5), oba peptidy jsou rozštěpeny. Jestliže se však T1249 inkubuje s Μ41Δ178 před přidáním proteinázy K (obr. 15, dráha7), získá se chráněný fragment HR-1 s molekulovou hmotností 6500. Sekvenování chráněného fragmentu ukazuje, že odpovídá oblasti primární sekvence umístěné uvnitř ektodomény gp41. Chráněný fragment zahrnuje rozpustný peptid HR1 (T1346) použitý ve studiích CD popisovaných v části 2. 9 výše a dále obsahuje dalších sedm aminokyselinových zbytků umístěných na aminovém konci. Tato ochrana může být připisována vazbě T1249 na specifickou sekvenci gp41, která je obsažena v konstruktu Μ41Δ178.

Příklad 3: Hybridní polypeptidy respiračního syncytiálního viru

Následující příklad popisuje hybridní polypeptidy respiračního syncytiálního viru (RSV) se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi. Navíc se uvádějí výsledky, které ukazují silné inhibiční účinky hybridních polypeptidů RSV na infekci RSV.

• · · ·

110

1. Materiály a metody

1. 1 Syntéza a pufirikace peptidů

Polypeptidy RSV byly syntetizovány standardní metodou Fast Moc. Obecně, pokud není uvedeno jinak, obsahovaly peptidy amidované karboxylové konce a acetylované aminové konce. Čištění bylo prováděno HPLC s reverzní fází.

1. 2 Test snížení počtu plaků respiračního syncytiálního viru

Všechna nezbytná ředění peptidů byla prováděna v čisté, sterilní, 96-jamkové destičce TC. Celkem bylo připraveno jedenáct ředění pro každý peptid a jedna kontrolní jamka neobsahující žádný peptid. Rozmezí konečných koncentrací peptidu začalo 50 pg/ml nebo 100 pg/ml, přičemž bylo provedeno celkem jedenáct dvojnásobných ředění. RSV byl připraven s koncentrací 100 pfu/jamku ve 100 pl 3% EMEM, při stanovení pomocí RSV známého titru. Viry se potom přidají do všech jamek.

Média byla odstraněna z jedné subkonfluentní 96-jamkové destičky s buňkami Hep2. Materiál z ředicí destičky byl převeden na destičky pro kultivaci buněk počínaje řadou 1 a potom přes řadu 12, řadu 11 atd. až do přenesení všech řad. Destičky byly na 48 hod vloženy zpět do inkubátoru.

Destičky byly kontrolovány pro zajištění, že v kontrolních jamkách byla přítomna syncytia. Média byla odstraněna a do každé jamky bylo přidáno přibližně 50 pl 0,25% krystalové violeti v methanolu. Buňky byly ihned opláchnuty vodou pro odstranění nadbytku barviva a byly ponechány usušit. Použitím mikroskopu byl zjišťován počet syncytií v každé jamce.

• · • *

- 111 2. Výsledky

Farmakokinetické studie s hybridními peptidy RSV T1301 (AcWQEWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELWA WF-NH₂) a T1302 (Ac-WQAWDEYDASISQVNEKINQALAYIREADELW AWF-NH₂) obsahující zesilující peptidové sekvence ukázaly značně zvýšený poločas vzhledem k základnímu peptidu T786 (AcVYPSDEYDASISQVNEElNQALAYIRKADELLENV-NHa), jak je ukázáno na obr. 10A - 10B. Hybridní polypeptidy T1301, T1302 a T1303 (AcWQAWDEYDASISDVNEKINQALAYIREADELWEWF-NH₂) rovněž vykázaly značně zvýšený poločas vzhledem k základnímu polypeptidu T1476 (Ac-DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL-NH₂).

Hybridní polypeptidy RSV T1301, T1302 a T1303, stejně jako polypeptidy T786 a T1293, byly testovány na schopnost inhibovat tvorbu plaků RSV v buňkách HEp2. Jak je ukázáno na obr. 11A a 11B, jak testované hybridní polypeptidy RSV, tak i základní polypeptid T786, byly schopny inhibovat infekci RSV. Překvapivě se také ukázalo, že hybridní polypeptid T1293 je sloučeninou se silnými účinky proti RSV (obr. 13).

Příklad 4: Hybridní polypeptidy luteinizačního hormonu

Popisovaný příklad ukazuje hybridní proteiny luteinizačního hormonu (LH) se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi. Následující hybridní polypeptidy LH byly syntetizovány a purifikovány výše popsanými způsoby: základní peptid T1323 (Ac-QHWSYGLRPGNH₂) a hybridní polypeptid T1324 (Ac-WQEWEQKIQHWSY-GLRPGWASLWEWF-NH₂), které obsahují aminokyselinovou sekvenci základního polypeptidu T1323 spojenou se zesilujícími peptidy na aminových a karboxylových koncích. Jak je ukázáno na obr. 12A a 12B, hybridní peptid T1324 měl podstatně zvýšený poločas v porovnání se základním peptidem T1323, kterému chybí zesilující peptidové sekvence.

• ·

- 112 Příklad 5: Farmakologie hybridního polypeptidu T1249

T1249 znázorněný na obr. 13 je hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidové sekvence navázané na polypeptid jádra odvozený ze směsi virových sekvencí. Jak je ukázáno v příkladu v části 7 výše, hybridní polypeptid T1249 má zlepšené farmakokinetické vlastnosti a účinek in vitro stejně jako in vivo proti HIV-1. V příkladu uvedeném dále se popisují farmakologické vlastnosti T1249 na zvířecích modelech hlodavců a primátů.

1. Materiály a metody

1. 1 Podávání hlodavcům v jedné dávce

Polypeptid T1249 byl podán albinotickým krysám SpragueDawley v jedné dávce kontinuální subkutánní infuzí (CSI), subkutánní injekcí nebo intravenózní injekcí. V každé ošetřované skupině bylo devět krys každého pohlaví. Skupiny dostaly sterilní preparáty polypeptidu T1249 jako chemické sloučeniny v dávce 0,5, 2,0 nebo

6.5 mg/kg CSI. Jedna skupina dostala 50 mM karbonát/bikarbonát, pH 8,5, podaný jako kontrolu. Peptidy byly podávány 12 hod katetrem polyvinylchlorid/polyethylen chirurgicky implantovaným podkožně do šíje. Dvě skupiny dostaly jednu dávku T1249 v množství 1,2 nebo

1.5 mg/kg subkutánní injekcí do mezilopatkové oblasti. Dvě skupiny dostaly jednu dávku T1249 v množství 1,5 nebo 5 mg/kg intravenózní injekcí. Skutečné množství T1249 v miligramech bylo vypočteno použitím obsahu peptidu stanoveného pro každou podanou šarži.

Při analýze byla zvířata pozorována v klecích (dvakrát denně na úmrtnost a stav umírání), byla prováděna klinická vyšetření, byly zjišťovány klinické laboratorní parametry, tělesná hmotnost, a byla prováděna pitva. Vzorky krve byly získávány technikou rozptýleného vzorkování v 12 hodinovém časovém období od tří krys na pohlaví na • · ··· · ·· .. -.. .:.

- 113 skupinu vždy v následujících časech: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 19 a 12 hod po podání dávky. Analýza vzorků byla prováděna použitím analýzy PcAb ECLIA (Blackburn, G. a další, 1991, Clin. Chem. 37: 1534 - 1539; Deaver, D., 1995, Nátuře 377: 758).

Pro plasmatickou a lymfatickou farmakokinetickou analýzu látky T1249 u krys byl připraven sterilní roztok látky T1249 v bikarbonátovém pufru, který byl podáván jednorázově, jednorázovou intravenózní injekcí do laterální ocasní žíly v dávce 20 mg/kg. Krev byla odebírána zvířatům jugulárním katetrem. Vzorky byly odebírány ihned po podání dávky a v čase 5, 15 a 30 min a 1, 2, 4 a 6 hod po podání léčiva. Pro analýzu lymfatických kapalin byly vzorky odebírány ihned po podání dávky a každých 20 min po prvních šest hodin po podání léčiva. Lymfatická tekutina byla odebírána z katetru, který byl umístěn přímo do hrudního lymfatického kanálu, jak bylo popsáno výše (Kirkpatrick a Silver, 1970, The Journal of Surgical Research 10: 147 - 158). Koncentrace T1249 v plasmě a lymfatické tekutině byly určovány použitím standardního testu na T1249 kompetitivní ELISA (Hamilton, G., 1991, str. 139, v „Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay“, Butler, J., ed., CRC Press, Boston).

1. 2 Jednorázové podávání primátům

Sterilní preparáty T1249 jako chemické sloučeniny byly podávány opicím cynomologus v jednorázových dávkách ssubkutánní, intramuskulární nebo intravenózní injekcí. V uspořádání typu postupného křížení dostává jedna skupina zvířat složená ze dvou zvířat každého pohlaví jednozárovou dávku T1249 intravenózně (0,8 mg/kg), intramuskulámě (0,8 mg/kg) nebo subkutánně (0,4, 0,8 a

1,6 mg/kg). Mezi každým podávacím dnem bylo vloženo období vyplachování alespoň tří dnů. Lyofilizovaný T1249 byl rekonstituován ve sterilním fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem pH 7,4 bezprostředně před dávkováním. Skutečné množství testované látky • · · ·

- 114 v miligramech bylo vypočítáno pomocí obsahu peptidu stanoveného pro každou podávanou šarži.

Při analýze byla zvířata pozorována v klecích, byla prováděna fyzikální vyšetření a měření tělesné hmotnosti. V intravenózní fázi studie byly odebírány vzorky krve do heparinizovaných zkumavek v následujících časech: ihned po podání dávky, 0,25, 0,5, 1,5, 3, 6, 12 a 24 hod po podání. V intramuskulární a subkutánní fázi studie byly odebírány vzorky krve do heparinizovaných zkumavek od každého zvířete v následujících časech: 0,5, 1, 2, 3, 6, 12 a 24 hod po podání. Vzorky plasmy byly připraveny v průběhu 1 hodiny po odebrání a vzorky byly rychle zamrazeny v kapalném dusíku. Analýzy vzorků byly prováděny použitím testu PcAb ECLIA (Blackburn, G. a další, 1991, Clin. Chem. 37: 1534 - 1539; Deaver, D., 1995, Nátuře 377: 758).

1. 3 Přemosťující farmakokinetické studie

Šest samců opic cynomologus bylo náhodně uspořádáno do tří skupin vždy po dvou zvířatech ve skupině. Všechny dávky T1249 byly podávány jednorázovou subkutánní injekcí. Studie byla rozdělena do dvou částí. V části 1 dostala zvířata ve skupinách 1, 2 a 3 sterilní preparát T1249 jako chemické sloučeniny (tj. látka T1249 byla rozpuštěna v pufru karbonát/bikarbonát, pH 8,5) ve dvou denních dávkách po čtyři za sebou následující dny (dny studie 1 až 4) po 0,2, 0,6 a 2,0 mg/kg/dávku. Etapy 1 a 2 byly rozděleny desetidenním obdobím promývání. V etapě 2 dostala zvířata ve skupinách 1, 2 a 3 sterilní preparát látky T1249 jako léku (tj. ve vodném roztoku, pH 6,5 plus mannitol) dvakrát denně po čtyři za sebou následující dny (dny studie 15 až 18) v dávkách 0,2, 0,6 a 2,0 mg/kg/dávku.

Ve dnech studie 1 a 15 byly odebírány vzorky krve pro farmakokinetické analýzy pro zjištění farmakokinetických vlastností jedné dávky a v dnech studie 4 a 18 pro zjištění rovnovážných

- 115 plasmatických farmakokinetických parametrů. Vzorky byly odebírány v následujících časech: bezprostředně před podáním a 0,5, 1,5, 3,0, 4,0, 6,0, 8,0 a 12,0 hod po podání. Zvířata byla monitorována v etapách 1 a 2 na klinické vnější znaky a změny tělesné hmotnosti.

2. Výsledky

2. 1 Farmakokinetické vlastnosti T1249 podávané krysám

Pro provedení počátečního testování farmakokinetických vlastností v plasmě a distribuce T1249 byly použity modely na krysách. U zvířat ve všech dávkovačích skupinách nebyly pozorovány žádné změny tělesné hmotnosti, vnějších fyzikálních znaků, parametrů hematologických a klinických nebo mikroskopických patologických znaků spojených s podáváním T1249.

Krysy, které dostaly T1249 pomocí CSI, dosáhly rovnovážných koncentrací peptidů v plasmě přibližně 4 hodiny po podání. Jak rovnovážná koncentrace v plasmě (Cp_ss), tak i vypočtená plocha pod křivkou závislosti koncentrace v plasmě na čase (AUC), byly přímo úměrné podávané dávce, což ukazuje, že T1249 vykazuje lineární farmakokinetické vlastnosti v rozmezí testovaných dávek od 0,5 do 6,5 mg/kg. Vypočetené farmakokinetické parametry a závislosti plasmatické koncentrace na čase pro podávání způsobem CSI jsou uvedeny v tabulce 9, popřípadě obr. 16A.

Tabulka 9

Parametr	Skupiny podle dávek
0,5 mg/kg	2,0 mg/kg	6,5 mg/kg
Cpss (pg/ml)	0,80	2,80	10,9
AUC₍₀-i2hod) (pg.h/ml)	7,99	25,9	120

··· · ·· ·* .· ...

- 116 Při podání T1249 jednorázovou intravenózní injekcí se ukázala přímá farmakokinetická závislost na podané dávce v rámci testovaných dávek. Naopak podání T1249 subkutánní injekcí neprokázalo v rozmezí studovaných dávek závislost na dávce. Vypočtené farmakokinetické parametry a závislosti koncentrace v plasmě na čase pro subkutánní a intravenózní podání T1249 jsou uvedeny v tabulce 10, popřípadě obr. 16B.

Tabulka 10

Parametr	Skupiny podle dávek/podání
(SC)	(IV)
1,2 mg/kg	15 mg/kg	1,5 mg/kg	5,0 mg/kg
ti/₂, (hod)	2,02	2,00	2,46	1,86
tmax (hod);	1,09	1,88	-	-
c_max (Mg/ml)	6,37	21,5	15,7	46,3
AUC₀-i2hod) (pg.h/ml)	27,0	107	45,6	118
AUC₍₀._aj) (pg-h/ml)	27,6	110	47,1	120

Biologická dostupnost T1249 při subkutánním podávání krysám byla zjišťovánajako porovnání s intravenózním podáváním. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 11 níže. V nízké dávce (1,2 mg/kg) byla relativní biologická dostupnost (F_R) T1249 pro subkutánní podávání 73 %. Relativní biologická dostupnost při podání vysoké dávky (15 mg/kg) T1249 byla 30 %, což bylo vyšší, než je koncentrace inhibující 90 % (IC₉₀) infekčnosti HIV po dobu celých 12 hodin studie ve všech vyšetřovaných dávkách.

- 117 -

Tabulka 11

Způsob podání	Dávka (mg/kg)	auc₀._m) (pg.h/ml)	AUC(o-oo) (pg.h/ml)	Fr (%)
Nízká dávka
SC	1,2	27,6	34,5^(a)	73
IV	1,5	47,1	-	-
Vysoká dávka
SC	15	110	36,5^(b)	30
IV	5	120	-	-

(a) Normalizováno z dávky 1,2 mg/kg na dávku 1,5 mg/kg vynásobením AUC(O-oo) 1,25.

(b) Normalizováno z dávky 15 mg/kg na dávku 5 mg/kg dělením AUC(O-co) třemi.

Kinetické údaje pro plasmatické a lymfatické koncentrace T1249 jsou ukázány na obr. 16C a uvedeny v tabulce 12 níže. T1249 rychle pronikal do lymfatického systému a rovnováhy s plasmatickým rezervoárem léčiva bylo dosaženo přibližně 1 hodinu po podání. Po dosažení rovnováhy mezi těmito dvěma oblastmi byly koncentrace v plasmě a lymfě porovnatelné u čtyž z pěti zvířat do tří hodin po podání. U jednoho zvířete byly trvale nižší koncentrace T1249 v lymfě než u jiných zvířat, i když profil lymfatické eliminace u tohoto zvířete nebyl odlišitelný od jiných členů této skupiny. Porovnání poločasu eliminační fáze (t 1/2) pro plasmu a lymfu ukazují, že přechod T1249 mezi těmito dvěma oblastmi je proces řízený difúzí. Po třech hodinách se zdálo, že dochází ke druhé, rychlejší fázi eliminaci z lymfatického systému. Tento rozdíl by mohl být založen na mechanismu (například redistribucí nebo urychlenou degradací peptidů v lymfě) nebo na jiných faktorech. Koncentrace T1249 v lymfatické tekutině 6 hodin po injekci je vyšší než hodnota ICgo pro infekčnost viru u běžných laboratorních ··· · · · ··

- 118 kmenů a u primárních klinických izolátů HIV-1.

Míra penetrace T1249 do cerebrospinální tekutiny (CSF) byla testována rovněž. Koncentrace T1249 byly pod limitem detekce (LOD; 2,0 ng T1249/ml CSF) ve všech měřitelných časech, což ukazuje, že T1249 neproniká při podání v jedné dávce do centrálního nervového systému.

Tabulka 12

Parametr	Plasma	T1249	Lymfa
t-,/2, eliminace (hod)	2,6 ±41			1,3 ± 27
C_max (pg/ml)	291			133^(a)/155^<b)
AUC₍o.6 h) (pg.h/ml)	506			348^(a)/411^(b)
AUCýo^) (pg.h/ml)	598			390^(a)/449^(b>
Cl (ml/h)	7,8			11,5

(a) Vypočtené průměry zahrnují jedno zvíře (krysa #1), u kterého se dosahovalo podstatně nižších lymfatických koncentrací, ale podobného kinetického profilu, než u dalších zvířat ve skupině.

(b) Vypočtené výsledky s vyloučením krysy #1.

2. 2 Farmakokinetické vlastnosti T1249 při podávání primátům

Pro vyhodnocení vztahu mezi dávkou a různými farmakokinetickými parametry souvisejícími s parenterálním podáváním T1249 byly použity modely primátů. Koncentrací v plasmě vyšších než 6,0 pg/ml T1249 bylo dosaženo všemi způsoby podávání, a kvantifikovatelné hladiny (tj. hladiny vyšší než 0,5 pg/ml) byly detekovány 24 hod po subkutánním a intravenózním podání. Doba • ·

- 119 eliminace ti/₂ byla srovnatelná pro všechny způsoby podávání (5,4 hod, 4,8 hod a 5,6 hod pro podání intravenózní, subkutánní, popřípadě intramuskulární). Plasmatické koncentrace T1249, které převýšily hodnoty ICgo pro laboratorní kmeny a klinické izoláty HIV-1, byly pozorovány ve všech časech měření průběhu 24 hodin vzorkování.

Porovnání údajů získaných pro parenterální podávání 0,8 mg/kg T1249 všemi způsoby podávání (tj. subkutánní, intravenózní a intramuskulární) se uvádí v obr. 17A. Obr. 15B ilustruje porovnání údajů získaných z injekce s.c. ve třech různých dávkách T1249 (0,4 mg/kg, 0,8 mg/kg a 1,6 mg/kg). Vložený graf v obr.17B ukazuje vynesení vypočtené hodnoty AUC v závislosti na podané dávce.

T1249 vykazuje u opic cynomologus po subkutánním podání lineární farmakokinetické vlastnosti v rozmezí podávaných dávek, což ukazuje, že v tomto rozmezí dávek nedošlo k saturaci vylučovacího mechanismu. Souhrn farmakokinetických údajů po parenterálním podávání T1249 opicím cynomologus je ukázán v tabulce 13 níže. Srovnání plasmatických koncentrací AUC ukazuje, že vzhledem k intravenóznímu podávání je biologická dostupnost T1249 při přibližně 64 % při podání intramuskulární injekcí a 92 % při podání subkutánní injekcí.

Tabulka 13

Parametr	Způsob podání (dávka, mg/kg)
	SC (0,4)	SC (0,8)	SC (1,6)	IM (0,8)	IV (0,8)
t_1/2, terminální (h)	6,23±0,52	4,83±0,48	5,55±0,92	5,57±0,24	5,35+0,95
1max (h)	3,97±1,18	4,58±1,45	4,72+1,81	2,32±0,43	-
C_max (pg/ml)	3,17±0,09	6,85+1,01	13,3±2,55	6,37±1,69	26,7±0,25
AUC₍₀-24h) (pg.h/ml)	37,5±6,6	8,12±11,4	168±34,0	56,4±12,3	87,4±25,0
AUC₍o-oo) (pg.h/ml)	40,9±8,2	85,3±13,6	181±44,0	59,5±13,1	92,5±25,0
F_r (%)	-	92,3	-	64,4	-

- 120 • · · · · · · • * ·· ·» ··«

2. 3 Přemosťující farmakokinetická studie

Přemosťující farmakokinetické studie byly prováděny pro porovnání farmakokinetických profilů T1249 jako chemické látky v plasmě při použití v neklinických experimentech popsaných výše, sT1249 formulovaným jako léčivo, který by mohl být podáván skutečnému pacientovi, například pro léčení infekce HIV. Studie byla označena jako paralelní, jednosměrné, zkřížené porovnání tří hladin dávek T1249 jako chemické látky a tří hladin dávek formulovaného léčivého výrobku. Farmakokinetické vlastnosti v plasmě byly testovány po podání jedné dávky a po dosažení rovnovážného stavu. Podávání T1249 subkutánní injekcí vedlo ve všech skupinách dávek k měřitelným koncentracím peptidů. Křivky závislosti plasmatické koncentrace na čase byly přibližně paralelní u všech skupin dávek po počátečním podání (dny 1 a 15) a v rovnovážném stavu (dny 4 a 18) jak pro T1249 jako chemickou látku, tak i T1249 formulovaný jako léčivo.

Navíc hodnoty AUC(o-i2 hod) kolísaly přímo úměrně podle dávek pro obě léčivé formulace. Vypočtené hodnoty AUC(o-i2 hod) pro léčivo se pohybovaly od 43 % do 80 % hodnot AUC₍o-i2 hod) vypočtených pro léčivou látku po podání v jedné dávce a od 36 % do 71 % v rovnovážném stavu.

T1249 jako chemická látka i jako léčivo ukázaly podobné farmakokinetické vlastnosti u opic cynomologus po jednorázovém subkutánním podávání ve všech testovaných dávkách a dávkovačích objemech. Přímé porovnání tvarů křivek závislosti koncentrace v plasmě na čase s předkládané studii a tvary křivek z předchozí studie u opic cynomologus ukazuje, že existuje depotní efekt, jestliže se T1249 podá subkutánní injekcí. To je naznačeno prodloužením času, ve kterém se dosáhne maximální koncentrace v plasmě (t_max) a hodnoty ti/₂.

- 121 Tyto výsledky ukazují, že formulace léčivé látky jako chemické sloučeniny použité ve farmakologickém programu, poskytují srovnatelné hodnoty AUC a jiných kinetických vlastností, jako hodnoty získané po podání hotového formulovaného léčiva. Tato pozorování ukazují, že klinické podávání T1249 poskytne celkovou expozici pacienta látce T1249.

Předkládaný vynález není omezen rozsahem zde popisovaných konkrétních provedení, která jsou zamýšlena pouze jako jednotlivé ilustrace individuálních aspektů vynálezu, a do rozsahu vynálezu spadají funkčně ekvivalentní metody a složky. Odborníkům v oboru budou z předcházejícího popisu a přiložených výkresů zřejmé různé modifikace vynálezu navíc k provedením popsaným v této přihlášce. Všechny takové modifikace mají spadat do rozsahu přiložených nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Hybridní polypeptid obsahující zesilující peptidovou sekvenci navázanou na základní polypeptid.
2. Hybridní polypeptid podle nároku 1, kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje: WXXWXXXI, WXXWXXX, WXXWXX, WXXWX, WXXW, WXXXWXWX, XXXWXWX, XXWXWX, XWXWX, WXWX, WXXXWXW, WXXXW, IXXXWXXW, XXX WXXW, XX WXXW, XWXXW, X WXXXW, xwxwxxx, XWXWXX, XWXWX, XWXW, WXWXXXW nebo XWXXXW.
3. Hybridní polypeptid podle nároku 1, kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje WQEWEQKI nebo WASLWEWF.
4. Hybridní polypeptid podle nároku 1, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na aminový konec základního polypeptidu.
5. Hybridní polypeptid podle nároku 4, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci, která je navázána na karboxylový konec základního polypeptidu.
6. Hybridní polypeptid podle nároku 1, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na karboxylový konec základního polypeptidu.

··· · ·· ·· ·· ···

- 123
7. Hybridní polypeptid podle nároku 1, kde terapeuticky účinnou látkou je základní polypeptid.
8. Hybridní polypeptid podle nároku 1, kde základním polypeptidem je aminokyselinová sekvence biologicky aktivního peptidu, růstového faktoru, cytokinů, diferenciačního faktoru, interleukinu, interferonu, faktoru stimulujícího kolonie, hormonu nebo angiogenního faktoru.
9. Hybridní polypeptid podle nároku 1, kde základní polypeptid zahrnuje následující aminokyselinovou sekvenci: YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK;

LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS;

LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS;

NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL;

DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL;

RYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL;

RYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL;

NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLIE;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDK;

ALLEQAQIQQEKIEYELQKLDE;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLE;

- 124 TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAE;

TALLEQAQIQQEKAEYELQKLE;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLE;

TALLEQAQIQQEKGEYELQKLE;

TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAE;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAE;

TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAE;

DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL;

DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL;

DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL;

DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL;

DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDEL; nebo

QHWSYGLRPG.
10. Hybridní polypeptid podle nároku 9, kde zesilující peptidová sekvence je navázána k aminovému konci základního polypeptidů.
11. Hybridní polypeptid podle nároku 10, který dále obsahuje zesilující peptidovou sekvenci navázanou na karboxylový konec základního polypeptidů.

- 125
12. Hybridní polypeptid podle nároku 9, kde zesilující peptidová sekvence je navázána na karboxylový konec základního polypeptidů.
13. Hybridní polypeptid podle nároku 9, kde zesilující peptidová sekvence zahrnuje aminokyselinovou sekvenci WQEWEQKI nebo WASLWEWF.
14. Hybridní polypeptid podle nároku 9, kde tento hybridní polypeptid zahrnuje aminokyselinovou sekvenci: WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF, WQEWEQKITALLEQAQIQQEKIEYELQKLIEWEWF nebo

VYPSDEYDASISQVNEEINQALAYIRKADELLENV.
15. Hybridní polypeptid podle nároku 14, který dále obsahuje aminokoncovou acetylovou skupinu a karboxykoncovou amidovou skupinu.
16. Základní polypeptid, který zahrnuje následující polypeptidové sekvence:

YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK;

LEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKLNS;

LEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKLNS;

NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLEL;

DFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQKL;

RYLEANISQSLEQAQIQQEKNMYELQKL;

RYLEANITALLEQAQIQQEKNEYELQKL;

NNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDK;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDK;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLDE;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLIE;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLDK;

ALLEQAQIQQEKIEYELQKLDE;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLIE;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLE;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKIEYELQKLAE;

TALLEQAQIQQEKAEYELQKLE;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLE;

TALLEQAQIQQEKGEYELQKLE;

TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAK;

TALLEQAQIQQEKAEYELQKLAE;

TALLEQAQIQQEKNEYELQKLAE;

TALLEQAQIQQEKGEYELQKLAE;

DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL;

DEYDASISQVNEKINQALAYIREADEL;

DEYDASISQVNEEINQALAYIRKADEL;

DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDELL;

DEFDESISQVNEKIEESLAFIRKSDEL; nebo

QHWSYGLRPG.

-*127-
17. Základní polypeptid podle nároku 16, který dále zahrnuje aminokoncovou acetylovou skupinu a karboxykoncovou amidovou skupinu.
18. Způsob zlepšení farmakokinetických vlastností základního polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje navázání konvenční zesilující peptidové sekvence k základnímu polypeptidu za vytvoření hybridního polypeptidu tak, že při zavedení do živého systému má hybridní polypeptid zlepšené farmakokinetické vlastnosti ve srovnání s vlastnostmi základního polypeptidu.
19. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e základním polypeptidem je terapeuticky účinná látka.
20. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, ž e jako základní polypeptid se použije biologicky aktivní peptid, růstový faktor, cytokin, diferenciační faktor, interleukin, interferon, faktor stimulující kolonie, hormon nebo angiogenní faktor.