CZ2000601A3

CZ2000601A3 - Gen kódující androctonin, vektor obsahující tento gen, způsob přípravy transgenních rostlin a transgenní rostliny odolné vůči chorobám

Info

Publication number: CZ2000601A3
Application number: CZ2000601A
Authority: CZ
Inventors: Georges Freyssinet; Richard Derose; Jules Hoffmann
Original assignee: Aventis Cropscience S. A.
Priority date: 1998-08-18
Filing date: 1998-08-18
Publication date: 2000-10-11

Abstract

Řešení se týká sekvence DNA kódující androctonin, vektoru obsahujícího tento gen pro transformaci hostitelského organismu a dále se týká způsobu transformace rostlinných buněk a rostlin. Androctonin tvořený v transformovaných rostlinách poskytuje těmto rostlinám rezistenci k chorobám, zejména k chorobám houbovitého původu.

Description

Gen kódující androctonin, vektor obsahující tento gen, způsob přípravy transgenních rostlin a transgenní rostliny odolné vůči chorobám

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká sekvence DNA kódující androctonin a vektoru obsahujícího tuto sekvenci vhodného pro transformaci hostitelského organismu, a dále se týká způsobu transformace takového organismu. Vynález se zvláště týká transformace rostlinných buněk, kdy androctonin produkovaný transformovanými rostlinami poskytuje těmto rostlinám rezistenci k chorobám, zejména k chorobám houbového původu.

Dosavadní stav techniky

V současnosti existuje značná potřeba ziskat rostliny, které by byly rezistentní proti chorobám, zejména houbovým chorobám, aby se zmenšilo, případně úplně odstranilo, používání fungicidních prostředků z důvodu ochrany životního prostředí. Způsob, jak zvýšit rezistenci proti chorobám, spočívá v transformaci rostlin tak, aby tvořily látku, která je schopna zajistit jejich obranu proti těmto chorobám.

Jsou známy různé látky přírodního původu, zejména peptidy, které mají baktericidní nebo fungicidní vlastnosti, a zvláště působí proti houbám zodpovědným za choroby rostlin. Tudíž problém spočívá v tom, aby se mezi těmito látkami nalezla taková látka, která nejenže se bude vytvářet v transformovaných rostlinách, ale navíc si uchová své baktericidní nebo 'fungicidní vlastnosti, které poskytne • ··· · · · · • · · · · · · · * fe fefe ······· ·· « • fefe · · · · * • fefe · ·· · · uvedeným rostlinám. Ve smyslu předkládaného vynálezu se baktericidními nebo fungicidními vlastnostmi rozumí jak baktericidní a fungicidní vlastnosti v pravém smyslu slova tak i vlastnosti bakteriostatické a fungistatické.

Androctoniny jsou peptidy produkované štíry, zejména štíry druhu Androctonus australis. Androctonin a jeho přípravu chemickou syntézou, stejně jako jeho protihoubové a antibakteriální vlastnosti in vitro, popsali Ehret-Sabatier et al.

V současnosti byly identifikovány geny pro androctoniny, které byly upraveny tak, že jsou schopny vložení do hostitelského organismu, zejména do rostliny, kde exprimují androctonin. Expresi androctoninu lze užít jak pro případnou izolaci tohoto androctoninu tak i k tomu, že organismus díky expresi androctoninu získá rezistenci k chorobám bakteriálního a houbového původu, což je zvláště výhodné řešení výše zmíněných problémů.

přípravu a hostitelský

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezů je fragment nukleové kyseliny, která kóduje androctonin, chimérický gen obsahující tento fragment kódující androctonin jakož i heterologní regulační prvky v pozicích 5'a 3' schopné funkce v hostitelském organismu, zejména v rostlině. Dalším předmětem vynálezu je vektor pro transformaci hostitelského organismu, obsahující tento chimérický gen, a dále je předmětem vynálezu transformovaný hostitelský organismus. Vynález se také týká transformované rostlinné buňky, která obsahuje alespoň jeden fragment nukleové kyseliny kódující androctonin a také rostliny rezistentní proti chorobám, která obsahuje tuto buňku, • · · · «·· ··· ««·· • « ···» ···· • · » · ·····»· ·· · • · · · · ···· ··· · ·· · ·· ·· a zvláště rostliny, která byla regenerována z takové buňky. Dále se vynález týká způsobu pěstování transformovaných rostlin podle předkládaného vynálezu.

Androctonin podle předkládaného vynálezu označuje peptid, který je produkován štíry, zvláště druhu Androctonus australis, ze kterých ho lze izolovat. Přitom tento peptid obsahuje alespoň 20 aminokyselin, aminokyselin, přičemž 4 cysteinové disulfidícké můstky.

Ve výhodném provedení vynálezu v podstatě peptidovou sekvenci podle následujícího vzorce (I):

alespoň 25 vytvářej ící výhodně zbytky obsahuje androctonin

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae kde

Xaa představuje peptidový zbytek obsahující nejméně jednu aminokyselinu,

Xab představuje peptidový zbytek obsahující 5 aminokyselin,

Xac představuje peptidový zbytek obsahující. 5 aminokyselin, Xad představuje «peptidový zbytek obsahující 3 aminokyseliny, Xae představuje peptidový zbytek obsahující nejméně jednu aminokyselinu.

Ve výhodném provedení zbytky Xab a/nebo Xad a/nebo Xae obsahují alespoň jednu bazickou aminokyselinu, výhodně právě jednu. K bazickým aminokyselinám ve smyslu předkládaného vynálezu patří aminokyseliny vybrané ze skupiny obsahující lysin, asparagin a homoasparagin.

• · · · ·· · 00 00 00 0000 0000 0 0 0000 0 0 0 ».

0 00 0000000 00 ·

0 0 0 0 0000 000» 00 0 0 0 00

Ve výhodném provedení vynálezu

Xaa představuje peptidovou sekvenci Xaa'-Val-, kde Xaa' je skupina NH₂ nebo peptidový zbytek obsahující nejméně 1 aminokyselinu a/nebo

Xab představuje peptidovou sekvenci -Arg-Xab'-Ile-, kde

Xab'je peptidový zbytek ze 3 aminokyselin a/nebo Xac představuje peptidovou sekvenci -Arg-Xac'-Gly-, kde

Xac'je peptidový zbytek ze 3 aminokyselin a/nebo Xad představuje peptidovou sekvenci -Tyr-Xaď-Lys, kde Xaď .je peptidový zbytek obsahující jednu aminokyselinu a/nebo Xae představuje . peptidovou sekvenci -Thr-Xae', kde Xae' představuje skupinu COOH nebo peptidový zbytek obsahující nejméně 1 aminokyselinu

V ještě výhodnějším provedení vynálezu Xaa' představuje peptidovou sekvenci Arg-Ser a/nebo Xab' představuje peptidovou sekvenci -Gln-Ile-Lys- a/nebo Xac' představuje peptidovou sekvenci -Arg-Arg-Gly- a/nebo Xad' představuje peptidový zbytek -Tyr- a/nebo Xae' představuje peptidovou sekvenci -Asn-Arg-pro-Tyr .

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je androctonin představován peptidovou sekvencí 25 aminokyselin uvedenou Zde jako sekvence identifikačního čísla 1 (id. č. 1) nebo homologními peptidovými sekvencemi.

Termínem homologní peptidová sekvence se podle předkládaného vynálezu rozumí taková ekvivalentní sekvence, která je z 65 % homologní se sekvencí id. č. 1, přičemž počet 4 cysteinových zbytků a počet aminokyselin, které je oddělují, zůstává identický, a některé aminokyseliny jsou nahrazeny jinými, ale ekvivalentními aminokyselinami v místech, která nezpůsobují podstatné změny v protihoubové nebo antibakteriální aktivitě dané homologní sekvence.

··· · «·

Výhodně homologní -sekvence obsahuje nejméně 75% homologii, výhodněji 85% a nejvýhodněji je. homologní z 90 %.

Zbytek na N5L·-konci androctoninu může být potranslačně modifikován, např. acetylaci, a stejně tak může být potranslačně modifikován zbytek C-konce, např. amidaci.

Peptidovou sekvencí obsahující v podstatě peptidovou sekvenci podle vzorce (I) se rozumí nejen sekvence zde definované, ale sekvence obsahující na jednom nebo na druhém konci, nebo na obou, peptidové zbytky, zejména takové zbytky, které jsou nutné pro její expresi a zacílení v hostitelském organismu, zejména v rostlinné buňce nebo v rostlině.

Zvláště jde o fúzní peptid peptid-androctonin nebo androctonin-peptid, výhodně peptid-androctonin, ze kterého se může vystřižením pomocí enzymatického systému rostlinně buňky uvolnit androctonin, jak zde byl definován. Fúzní peptid s androctoninem dále může ..obsahovat signální peptid nebo tranzitní peptid, které umožňují řídit a směrovat vytvářený androctonin specifickým způsobem do určité části hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny, např. do cytoplazmy, buněčné membrány, a nebo v případě rostlin do určitého buněčného kompartmentu nebo tkání nebo do extracelulárního prostoru.

V jednom provedení vynálezu může tranzitní peptid obsahovat signál pro chloroplastovou nebo mitochondriální lokalizaci, čímž je zajištěno štěpení v chloroplastu nebo mitochondrii.

V dalším povedení vynálezu může signální peptid obsahovat N-koncový signál neboli spojený se . signálem zodpovědným v endoplazmatickém retikulu, nebo peptid pro zaměření do vakuoly neboli pro-peptid. Endoplazmatické retikulum je místo, které je v rámci buněčného mechanismu zodpovědné za pre-peptid, případně za zadržení proteinu procesy maturace (zrání) proteinových produktů, jako je např. odštěpení signálního peptidu.

Tranzitní peptid je buďto jeden nebo mohou být dva, a v takovém případě jsou odděleny vmezeřenou intermediátní sekvencí, takže, ve směru transkripce, jedna sekvence kóduje tranzitní .' peptid rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizací, pak následuje část sekvence části maturovaného N-konce rostlinného genu kódujícího enzym, s plastidovou lokalizací, a pak sekvence kódující druhý tranzitní peptid z rostlinného genu kódujícího enzym s plastidovou lokalizaci, jak bylo již popsáno v patentové přihlášce EP 0 508 909.

Jako vhodný tranzitní peptid pro fúzi podle vynálezu může být uveden zvláště signální peptid genu PR-Ια tabáku (WO95/19443) , jehož kódující sekvence je zde uvedena jako sekvence id. č.. 2, a fúze. s androctoninem. jako .sekvence, id. č. 3. Zejména je vhodný fúzní protein odpovídající bažím 12 až 176 této sekvence, když je androctonin produkován rostlinnou buňkou nebo rostlinou, nebo prekurzor faktoru Mátal, jestliže je androctonin produkován kvasinkovou buňkou.

Předkládaný vynález se tedy týká fragmentu nukleové kyseliny, zejména DNA/ kódující androctonin definovaný výše. Vynález se týká fragmentu izolovaného z Androctonus australis nebo odvozeného fragmentu, upraveného tak, aby vedl k expresi androctoninu v hostitelském organismu nebo umožňoval exprimovat peptid. Fragment nukleové kyseliny může být získán standardními metodami izolace a purifikace, kromě toho může být syntetizován metodami užívajícími postupné hybridizace syntetických oligonukleotidů. Tyto postupy jsou známy a jsou popsány v publikaci Ausubel et al.

0 0 0 0 0 0 ___ 0 0 00 0 0 0 · φ 0 0 000 0 00 · .0 00 0000000 00 0 0 · 0 0 0 0 0 00 · 00 0 0 00 · 00 00

Fragment nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu je nukleotidové sekvence typu DNA nebo RNA, výhodně jde o DNA, zvláště o cDNA, zejména dvouřetězcového typu.

V jednom provedení vynálezu fragment nukleové kyseliny kódující androctonin je sekvence DNA uvedená zde jako sekvence id. č. 1, sekvence homologní nebo sekvence komplementární k této Sekvenci, a zvláště je to kódující část sekvence id. č. 1 odpovídající bažím 1 až 75.

Termínem homologní sekvence, se podle předkládaného vynálezu rozumí fragment nukleové kyseliny obsahující jednu nebo několik modifikací vzhledem k nukleotidové sekvenci popsané zde jako sekvence id. č. 1 kódující androctonin.

Takové modifikace lze získat obvyklými mutačními technikami, a kromě toho také výběrem syntetických oligonukleotidů použitých k přípravě uvedené sekvence pomocí hybridizace. Vzhledem k mnoha kombinacím nukleové kyseliny, které' kódují expresi téže aminokyseliny, rozdíly v sekvenci id.. č. 1 a odpovídajících homolognich. sekvencích nejsou v podstatě důležité, a tím spíše to platí pro fragmenty DNA získané chemickou syntézou. Výhodně je míra homologie s uvedenou referenční sekvencí nejméně 70 %, výhodněji nejméně 80 % a nejvýhodněji alespoň 90 %. Obecně jsou tyto modifikace neutrální, tudíž neovlivňují výslednou primární sekvenci androctoninu. ’

Předkládaný vynález se dále týká chimérického genu (nebo expresní kazety) obsahující sekvenci kódující také heterologní regulační prvky v pozicích 5' a 3', schopné funkce v hostitelském organismu, zejména v rostlinné buňce nebo rostlině, . funkčně (operativně) spojené s kódující sekvencí, kterážto kódující sekvence obsahuje alespoň jeden fragment DNA kódující androctonin definovaný výše (včetně.

• «·«* ·· · ·· • · · ··» ··« • * ♦··· ·♦» fúzního peptidu peptid-androctonin nebo androctoninpeptid).

Hostitelským organismem je míněn .organismus jednobuněčný nebo mnohobuněčný, nižší nebo vyšší, do kterého je vložen chimérický gen podle předkládaného vynálezu pro tvorbu androctoninu.. Konkrétně se jedná např. o bakterie E. coli, kvasinky rodu Saccharomyces nebo Kluyveromyces, Pichia, houby rodu Aspergillus, bakuloviry, nebo výhodně rostlinné buňky.

Rostlinná buňka znamená ve smyslu předkládaného vynálezu buňku tvořící rostlinou tkáň, ať už tvoří nediferencovanou tkáň jako je kalus nebo tvoří diferencované tkáně jako embryo, části rostliny, rostlinu nebo semena.

Rostlina ve smyslu předkládaného vynálezu znamená celý mnohobuněčný diferencovaný organismus schopný fotosyntézy, je to rostlina jednoděložná nebo dvouděložná, a zvláště se pak jedná o rostliny kulturní určené pro výživu člověka nebo zvířat, kam patří např. kukuřice, pšenice, řepka, sója, rýže, cukrová třtina, řepa, tabák, bavlna a další.

Regulační prvky nezbytné pro expresi fragmentu DNA kódujícího androctonin, funkční v hostitelském organismu, jsou odborníkovi známy. K těmto prvkům patří zejména' promotorové sekvence,' aktivátory transkripce, tranzitní peptidy, terminační sekvence včetně start a stop kodonú. Prostředky a metody pro identifikaci a výběr regulačních prvků jsou také odborníkovi známy.

Regulační prvky vhodné pro transformaci mikroorganismů jako jsou kvasinky nebo bakterie jsou odborníkům známy, a patří k nim promotorové sekvence, aktivátory transkripce, tranzitní peptidy, terminační sekvence včetně start a stop kodonů.

Pro řízení exprese v kvasinkách a sekreci peptidu do kultivačního média je fragment DNA kódující androctonin ·· · ·

• ·

9 09 integrován do kyvadlového vektoru, kterýžto vektor obsahuje následující prvky:

- markéry umožňující selekci transformant, nukleotidovou sekvenci dovolující replikaci (replikační počátek) plazmidu v kvasinkách, nukleotidovou .sekvenci dovolující replikaci (replikačni počátek) plazmidu v E. coli, expresní kazetu obsahující

1) regulační promotorovou sekvenci,

2) sekvenci kódující signální peptid (nebo pre-peptid) ve spojení se zaměřovacím peptidem (nebo propeptidem)

3) sekvenci regulující terminaci nebo polyadenylaci.

Tyto prvky byly popsány v mnoha publikacích jako např. Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev., 21, 15-24, a Michaut et al., 1996, FEBS Letters 395, 6-10.

Ve výhodném provedení se kvasinky druhu S. cerevisiae transformují expresním plazmidem metodou užívající lithiumacetátu (Ito et al., 1993, J. Bacteriol. 153, 163168) .'

Předkládaný vynález se týká zvláště transformace rostlin. Jako regulační promotorovou sekvenci v rostlině je možné užít jakýkoliv promotor rostlinného, genu, který je přirozeně exprimován v rostlině, a zejména promotor bakteriálního, virového nebo rostlinného původu, jako je např. gen pro malou podjednotku ribulózobisfosfátkarboxylázy/oxygenázy (RuBisCO), nebo gen rostlinného viru jako je např. virus mozaiky květáku (CAMV, 19S nebo 35S promotor), nebo promotor indukovatelný patogenem jako je např. PR-Ία z tabáku, který je také výhodný pro použití dle vynálezu. Výhodné je užití regulační promotorové sekvence, která vede ke konstitutivní expresi kódované sekvence nebo

···· · ·· ··

9 9 · · · · • · · 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 9999 9 9 9 9 · · · 9 9 9 9 9 9 9

999 9 99 9 99 99 ίο k expresi indukované po napadeni patogenem, jako je např. histonový promotor popsaný v patentové přihlášce EP 0 507 698.

Podle předkládaného vynálezu je také možné užit ve spojení s promotorovou sekvencí další regulační sekvence, které jsou situovány mezi promotorem a kódující sekvencí, jako jsou např. aktivátory transkripce (enhacery, zesilovače), např. aktivátor transkripce viru mozaiky tabáku (TMV) popsaný v patentové přihlášce WO 87/07644, nebo z viru skvrnitosti tabáku '(TEV), který popsali Carrington a Freed.

Jako sekvence řídící terminaci nebo polyadenylaci je možné užít odpovídající sekvence bakteriálního původu, jako např. terminátor nos z Agrobacterium tumefaciens/ nebo také rostlinného původu, jako např. terminátor histonového genu, jaký byl popsán v patentové přihlášce EP 0 633 317.

Chimérický gen podle vynálezu je asociován se selekčním markérem adaptovaným pro hostitelský organismus. Takové

selekční markéry	jsou odborníkovi	dobře	známy, jedná se
o geny rezistence	k antibiotikům a	také	o geny tolerance
k herbicidům.
Předkládaný	vynález se také	týká	klonovacího nebo

expresního vektoru pro transformaci hostitelského organismu, který obsahuje alespoň jeden chimérický gen podle vynálezu definovaný výše. Tento vektor obsahuje kromě již zmíněného chimérického genu nejméně jeden replikační počátek a v případě potřeby také vhodný selekční markér. Tento vektor je tvořen plazmidem, kozmidem, bakteriofágem nebo virem, do kterých byl vložen chimérický gen podle předkládaného vynálezu. Takové transformační vektory vhodné pro transformaci hostitelského organismu jsou odborníkovi známy a jsou zevrubně popsány v odborné literatuře.

4 4

4 4 4 44 4 4« · • 4 4 .· 4······ 4 4 · • 4 ·· · 4 4 4 4 • 44 4 ·· · ·· ··

Pro transformaci rostlinných buněk nebo rostlin jde zejména o virus, který lze využít k transformaci vyvíjejících se rostlina obsahující vlastní prvky pro replikaci a expresi. Ve výhodném provedení je transformačním vektorem pro rostlinné buňky nebo rostliny podle vynálezu plazmid.

Dalším předmětem vynálpzu je způsob transformace hostitelského organismu, zejména rostlinných buněk, a to tím, že se integruje alespoň jeden fragment nukieové kyseliny nebo chimérický gen, · jak byly definovány výše podle vynálezu, přičemž transformace lze dosáhnout vhodnými prostředky odborníkovi známými, které jsou popsány v odborné literatuře, zejména v publikacích citovaných v této přihlášce. Zvláště jde o transformaci vektorem podle předkládaného vynálezu.

Jednou z metod transformace je bombardování buněk nebo protoplastů částicemi, na které je navázaná sekvence DNA. Další metoda spočívá v tom, že se jako prostředek k přenosu do rostliny využije Ti plazmid z Agrobacterium tumefaciens nebo Ri plazmid. z Agrobacterium rhizogenes, do kterého se integruje chimérický gen.

Dalšími metodami, které lze užít, je mikroinjekce nebo elektroporace, a také přímá precipitace prostřednictvím PEG.

Odborník zvolí vhodnou metodu v závislosti na' povaze hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky nebo rostliny.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou.hostitelské organismy, zvláště rostlinné buňky nebo rostliny, které, jsou transformované a obsahují ve svém genomu účinné množství chimérického genu obsahujícího sekvenci kódující androctonin, jak je definován výše v této přihlášce.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou rostliny, které obsahují transformované buňky, zvláště rostliny regenerované z transformovaných buněk. Regeneraci lze provést

• ···· ·· · ·· ·· • · · · · * · · · · • · · · · · ··«· • · 9 9 9 9999 9 9 9 9 · • ♦ · · · · · · 9

999 9' 99 9 99 99 jakýmkoliv vhodným způsobem odborníkovi známým, který závisí na druhu rostliny, např. způsobem popsaným v příkladech v referencích k této přihlášce.

Postupy transformace rostlinných buněk a regenerace

rostlin	byly	popsány např.	v následuj icích	patentových
dokumenetch:	US 4 459 355, US	4 536 475, US 5	464 763, ' US
5 177 010	, US	5 187 073, EP 267	159, EP 604 662,	EP 672 752,
US 4 945	050,	US 5 036 006, US	5 100 792, US	5 371 014,
US 5 478	744,	US 5 179 022, US 5 565 346, US	5 484 956,
US 5 538	877,	US 5 554 798,	US 5 489 520, US 5 510 318,
US 5 204	253,	US 5 405 765,	EP 442 174,	EP 486 233,
EP 486 234,	EP 539 563,	EP 674 725,	. WO 91/02071
a WO 95/06128.

Dále jsou předmětem předkládaného vynálezu také transformované rostliny získané kultivací a/nebo křížením regenerovaných rostlin podle vynálezu, a taktéž semena transformovaných rostlin.

Transformované rostliny podle předkládaného vynálezu jsou rezistentní k některým chorobám, zvláště k některým chorobám způsobených houbami nebo bakteriemi. Rezistence rostlin proti těmto chorobám.je vytvořena tím způsobem, že je do rostlin integrována sekvence DNA kódující androctonin podle vynálezu, přičemž androctonin je účinný proti houbovým chorobám, které způsobují houby rodu Cercospora, zejména Cercospora beticola, rodu Cladosporium, zejména Cladosporium herbarum·, rodu Fusarium, zejména Fusarium culmorum nebo Fusarium graminearum, a Phytophthora, zejména Phytophthora cinnamoni.

Ve výhodném provedení je chimérický gen spojen s alespoň jedním selekčním markérem, kterým může být jeden nebo několik genů tolerance k herbicidům.

0« 00 0 00 00 0 0 00 0 0 0 0

0 000 0 00 0

0 0000 0000 0 0 0 0 0 0 0 0

0 00 00

Sekvence DNA kódující androctonin muže být také spojena s takovým markérem pro selekci transformovaných rostlin a ještě s dalšími sekvencemi kódujícími jiné požadované peptidy nebo proteiny, např. s geny tolerance k herbicidům.

Takové geny tolerance k herbicidům jsou odborníkovi známy a byly popsány např. v patentových přihláškách EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO. 96/38567 nebo WO 97/04103.

Samozřejmě také transformované buňky a rostliny podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat kromě sekvence kódující androctonin další heterologní sekvence kódující požadované proteiny jako např. jiné peptidy, které poskytují rostlinám rezistenci k dalším nemocem bakteriálního nebo houbového původu a/nebo další sekvence kódující proteiny zajišťující toleranci k herbicidům definované výše a/nebo další sekvence kódující proteiny zajišťující toleranci k hmyzím škůdcům, zvláště např. protein Bt.

Další sekvence, které se mohou integrovat prostřednictvím vektoru obsahujícího chimérický gen podle vynálezu, jsou takové sekvence, které obsahují první sekvenci kódující androctonin a alespoň jeden další gen kódující další požadovaný peptid nebo'protein.

Je také možné integrovat nejméně jeden další vektor obsahující alespoň jednu další sekvenci, a to způsobem v oboru známým, jak bylo již popsáno.

Rostliny podle vynálezu je také možné získat křížením rodičovských rostlin, kdy jeden z rodičů nese gen podle vynálezu kódující androctonin a druhý z rodičů nese geny kódující alespoň jeden další požadovaný peptid nebo protein.

K sekvencím kódujícím další peptidy s protihoubovým účinkem patří např. sekvence kódující drosomycin, která byla popsána v patentu FR 2 725 992, v publikaci Fehlbaum et al.

• 444

4* 4 44 44

444 4444

4444 4444 • « 4 4444444 44 4

4· baktericidní, vynálezu

1994 a v nepublikované patentové přihlášce FR 97 09115 podané 24 července 1997.

Předkládaný vynález se nakonec také týká způsobu pěstování transformovaných rostlin podle vynálezu. Tento způsob spočívá v tom, že se semena těchto transformovaných rostlin vysejí na médium vhodné pro pěstování takových rostlin, zejména na pole, a na povrch pole se pak aplikuje agrochemický prostředek, aniž by podstatně ovlivnil tato transformovaná semena nebo rostliny, pak jakmile dosáhnou zralosti se pěstované rostliny sklidí a případně se oddělí semena ze sklizených rostlin.

Agrochemickým prostředkem se ve smyslu vynálezu rozumí agrochemický prostředek obsahující alespoň jednu účinnou látku vykazující herbicidní, fungicidní, viruscidní nebo insekticidní účinek.

Ve výhodném provedení způsobu pěstování . podle agrochemický prostředek obsahuje alespoň jednu účinnou látkou s fungicidní a/nebo baktericidní aktivitou, výhodněji s aktivitou doplňující aktivitu androctoninu tvořeného v transformovaných rostlinách podle vynálezu.

Produktem s aktivitou doplňující aktivitu androctoninu se ve smyslu vynálezu míní produkt vykazující řadu doplňujících aktivit, jako je např. produkt účinně působící proti napadení škůdci (houbami, bakteriemi, viry), kteří nejsou citliví k androctoninu, nebo produkt, jehož spektrum účinnosti se plně nebo částečně překrývá s androctoninem, ale aplikační dávka tohoto produktu se podstatně sníží diky přítomnosti androctoninu tvořeného transformovanými rostlinami.

Pěstování transformovaných hostitelských organismů umožňuje produkovat androctonin ve velkém Předkládaný vynález se tudíž týká i způsobu měřítku. přípravy »· « ··»· ·* · ·· ·« • · · · · · · · • ·*«« ···· • *· ······· · · * • ··« · · · · • ·♦ ·'»···.

androctoninu obsahujícího kroky, kdy se kultivuje transformovaný hostitelský organismus obsahující gen, který kóduje androctonin definovaný výše, ve vhodném kultivačním médiu a získaný androctonin se pak částečně nebo zcela purifikuje.

Příklady dále uvedené slouží . k ilustraci vynálezu, ukazují přípravu sekvence kódující androctonin, chimérického genu, integračního vektoru a transformovaných rostlin. Připojené obrázky 1 až 5 schematicky znázorňují strukturu některých plazmidů použitých pro konstrukci chimérických genu. V obrázcích.jsou kurzívou označena restrikční místa.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Konstrukce chimérických genů

Všechny zde použité laboratorní postupy jsou standardní postupy odborníkovi známé. Podrobné popisy těchto postupů lze najít např. v publikaci Ausubel et al.

pRPA-MD-P: příprava plazmidu obsahujícího signální peptid genu PR-la z tabáku ,

Dva syntetické oligonukleotidy s komplemetárními sekvencemi 'Oligo 1 a Oligo 2 (uvedenými dále) byly hybridizovány v 65 °C po 5 minut a pak pomalým snižováním teploty na 30 °C během 30 minut.

Oligo 1: 5 ' GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC

ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA CTCTTCTTCT TTTCC 3' c ~ - V*? ·li—? Λ —

• · · ·« ·· • · · · f · · • ··« 9 · « * • · · ··»· » · · · · • · · · · · ·

9 99 99

Oliuo 2:

5' TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG AAAGATGGAA GC 3’

Po hybridizaci Oligo 1 s Oligo 2 sloužil jednovláknový zbytek DNA polymerázy 1 jako matrice z E. coli pro Klenowúv fragment DNA (ve standardních podmínkách, doporučených 'Výrobcem New England Biolabs) pro vytvoření dvouvláknového oligonukleotidů na 3'-koncích oligonukleotidů. Získaný dvouvláknový oligonukleotid byl pak naštěpen restrikčními enzymy SacII a Nael a klonován do plazmidu pBS II SK(-) (Stratagene), který byl předtím naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Byl tak získán klon obsahující kódující úsek signálního peptidu genu PR-la z tabáku (sekvence id. č. 2) .

pRPA-PS-PRla-andro: Příprava sekvence kódující androctonin fúzovaný se signálním peptidem PR-la bez netranskribovaného úseku 3'

Dva syntetické oligonukleotidy s komplemetárními sekvencemi Oligo 3 a Oligo 4 byly hybridizovány v podmínkách uvedených pro pRPA-MD-P.

Oligo 3: 5’ AGGTCCGTC-T GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG

GTGG 3¹

Oligo 4: 5' CCGC-ATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG

GCCTGTTAGT GCACTTGTAG TAGCAACCAC CCCTCCTCCT GCAGATCTTG ATCTGCC 3'

Po hybridizaci Oligo 3 s Oligo 4 sloužil jednovláknový zbytek DNA polymerázy 1 jako matrice z E. coli pro Klenowúv ' fragment DNA (ve standardních podmínkách

• ΦΦΦ ·· φ φφ φφ φφ φφφφ φφφφ φ φ φφφφ φφφφ φ φ , φφφ φφφφ φ φ φ φ φ φ. φ φφ φ φφφφ φφφ φ φφ φ φφ φφ doporučených výrobcem New England Biolabs) pro vytvoření dvouvláknového oligonukleotidů na 3'-koncích oligonukleotidů. Získaný dvouvláknový oligonukleotid obsahoval část kódující androctonin (sekvence id.' č. 1) byl pak přímo klonován do plazmidu pRPA-MD-P který byl naštěpen restrikčním enzymem Nael. Správnost orientace v získaném klonu byla ověřena sekvencováním. Byl tak získán klon obsahující úsek kódující fúzní protein PR-la-androctonin situovaný mezi restrikčními místy Ncol na N-konci a Sací, SacII a BamHI na C-konci (sekvence id. č. 3).

pRPA-RD-238: Příprava obsahujícího sekvenci androctonin

Plazmid pRTL-2GUS laskavě Dr.

rostlinného expresního -vektoru kódující fúzní protein Pl-laodvozený z plazmidu pUC-19 poskytl Jim Carrington (Texas A&M University, nebyl publikován) . Tento plazmid, jehož struktura je schematicky znázorněna na obr. 1, obsahuje dvojitý 35S CaMV promotor (promotor CaMV 2 x 35S, expresi RNA obsahující izolovaný z viru mozaiky květáku Oděli et al, 1985), který řídí netranslatovanou sekvenci 5'-konce viru skvrnitosti tabáku' (TEV 5'UTR, Carrington a Freed, 1990), gen, pro β-glukuronidázu z E. coli (GUS, Jefferson et al. , 1987), po kterých následuje místo polyadenylace RNA z· 35S CaMV (CaMV polyA, Oděli et al., 1985).

Plazmid pRTL2-2GUS byl štěpen, restrikčními enzymy Ncol a BamHI a takto vzniklý velký fragment, byl purifikován. Plazmid pRPA-PS-PRla-andro byl štěpen také restrikčními enzymy Ncol a BamHI a vzniklý malý fragment DNA obsahující úsek kódující fúzní protein PRla-androctonin byl pák purifikován. Oba purifikované fragmenty DNA byly spojeny do expresní kazety pro rostliny, které pak syntetizují fúzní • · · · · · · · fefe- fefe • · · ··· ···· • · · ··· · ·· « • · ·· ······· ·· · • · ·· · ···· • · · * fefe · fefe fefe protein PRla-androctonin. Schematická struktura této expresní kazety je znázorněna na obr. 2. PRla-androctonin představuje úsek kódující fúzní protein PRla-androctonin z pRPA-RD-230. Androctonin je tedy přenášen do mezibuněčných prostorů v rostlině v důsledku působení signálního peptidu PRla.

pRPA-RD-195: Příprava plazmidu obsahujícího modifikované vícečetné klonovací místo

Plazmid pRPA-RD-195 je. plazmid odvozený z plazmidu pUC-19, který, obsahuje modifikované vícečetné klonovací místo. Komplementární -syntetické oligonukleotidy Oligo 5 a Oligo 6 uvedené dále byly hybridizovýány a vytvořily dvouvláknovou molekulu .stejně jak bylo popsáno pro přípravu pRPA-MD-P.

Oligo 5:

Oligo 6:

5’ AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC 3 '

5' CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC TAGAGG 3'

Získaný dvouvláknový oligonukleotid byl vložen do pUC-19, který byl předtím naštěpen restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a pak byl užit k doplnění Klenowův fragment DNA polymerázy 1 z E. coli. Získaný vektor obsahoval vícečetné klonovací místo umožňující vložení expresní kazety z plazmidového. vektoru z Agrobacterium tumefaciens. Struktura vícečetného klonovacího místa je schematicky znázorněna na obr. 3.

• · · · · · · 0 · · ·· 0 0 0 0 · · · ·

0 0 000 0 00 0 0 0 00 0 000000 00 0 0 0 00 0 0000 0000 00 0 00 00 pRPA-RD-233: Vložení expresní kazety pro PRla-androctonin z pRPA-RD-230 do pRPA-RD-195

Plazmid pRPA-RD-230 byl naštěpen restrikčním enzymem HíndlII a fragment DNA obsahující expresní kazetu pro PRlaandroctonin byl purifikován. Purifikovaný fragment byl vložen do plazmidu pRPA-RD-195, který byl předtím naštěpen restrikčním enzymem HíndlII a defosforylován telecí intestinální fosfatázou.

pRPA-RD-174: Plazmid odvozený z pRPA-B.L-150A (EP 0 508 909) obsahující gen tolerance k bromoxynilu z pRPA-BL-237 (EP 0 508 909)

Gen tolerance k bromoxynilu byl izolován z pRPA-BL-2.37 pomocí genové amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí (PCR). Získaný fragment s tupými konci byl klonován do EcoRI místa· plazmidu pRPA-RD-150A, které .bylo zarovnáno působení Klenowova fragmentu polymerázy za standardních podmínek. Byl tak získán vektor pro Agrobacterium 'tumefaciens, který obsahuje gen tolerance k bromoxynilu v blízkosti své pravé hranice a gen tolerance ke kanamycinu v blízkosti levé hranice a vícečetné klonovací místo z pUC-19 ležící mezi těmito geny.

Schéma struktury pRPA-RD-174 je uvedeno na obr. 4. Na tomto obrázku nos označuje polyadenylační signál z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983) . NOS pro označuje promotor z genu pro nopalinsyntázu z Agrobacterium t^umefaciens (Bevan et al., 1983), NPTII představuje gen pro neomycinfosfotransferázu z transpozonu Tn5 , z E. coli (Rothstein et al., 1981), 35S pro označuje promotor 35S izolovaný z viru mozaiky květáku (Oděli et al., 1985), ' BRX představuje gen pro nitrilázu izolovaný z K. ozaenae (Stalker et al., 1988) a RB a LB označují ¹

• · · · • · · · · 4 4 ·* 4 4·· *·· · • 4 4444 4 444

4 44 44····· · · » •4 4 4 · ···· «·· · 44 4 · 4 « * pravou a lévou hranici sekvence Ti plazmidu z Agrobacterium. tumefaciens.

pRPA-RD-184: Přidání nového jedinečného restrikčního místa do .pRPA-RD-174

Komplementární syntetické oligonukleotidy Oligo 7 a Oligo 8, uvedené dále, byly hybridizovány a vytvořily dvouvláknovou molekulu stejně jak bylo popsáno pro plazmid pRPA-MD-P.

Oligo 7: 5 ¹ CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC

CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT GCTČGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG 3'

Oligo 8: 5> CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA

CACCTAGGCG CGCCGGGGCC GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG 3'

Dvouvláknový oligonukleotidový hybrid (95 párů baží) byl purifikován po separaci na agarózovém gelu (3% NuSieve agaróza, FMC) . Plazmid pRPA-RD-174 byl štěpen restrikčním enzymem Xmal a vzniklý velký fragment DNA byl purifikován. Oba izolované fragmenty pak byly spojeny.

Získaný plazmid odvozený z plazmidu pRPA-RD-174 obsahoval další restrikční místo mezi genem tolerance k bromoxynilu a selekčním markérem kanamycinové rezistence.

Schematické znázornění struktury plazmidu pRPA-RD-184 je uvedeno na obr. 5, kde označení nos, NPTII, NOSpro, 35Spro, gen BRX, RB a LB mají stejný význam jaký byl vysvětlen u obr. 4.

· 9 · · · · • · 9 · · · · • · · · 9 9 9 9 • ······· ·· · • · 9 · · · ·

9 9 » 99 pRPA-RD-236: Příprava vektoru pro Agrobacterium tumefaciens obsahujícího genový konstrukt kódující androctonin směrovaný do mezibuněčného prostoru

Plazmid pRPA-RD-233 byl štěpen restrikčními enzymy Pmel a AscI a fragment DNa obsahující gen PR-la-androctonin byl purifikován. Plazmid pRPA-RD-184 byl naštěpen stejnými restrikčními enzymy. Fragment DNA obsahující expresní kazetu PR-la-androctonin byl vložen do plazmidu pRPA-RD-184. Byl tím získán vektor pro Agrobacterium tumefaciens, který obsahuje sekvenci kódující fúzní protein PR-la-androctonin,. který umožňuje expresi androctoninu v extracelulárním prostoru rostliny.

Příklad 2

Tolerance transformovaného tabáku k herbicidům

2.1. Transformace

Vektor pRPA-RD-236 byl vnesen do buněk kmenu Agrobacterium tumefaciens ÁHA101 (Hood et al., 1987) nesoucích kosmid pTVK291 (Komáři et al., 1986). Technika transformace byla založena . na postupu, který popsali Horsch et al. (1985).

2.2. Regenerace

Regenerace tabáku PBD6 (pocházejícího ze SEITA, Francie) z listových explantátů probíhala na základním médiu dle Murashige a Skoog (MS médium) obsahujícím 30 g/1 sacharózy a 200 pg/ml kanamycinu.' Listové explantáty byly odebrány z rostlin pěstovaných ve skleníku nebo in vitro a, byly transformovány metodou listových disků (Horsch et al., 1985)

4 4 4 4

R ·4 4 • 4 4 I » 4 4 4 » 4 4 4

4 4 4 ve třech postupných etapách: první etapa spočívala v indukci výhonků na médiu s přídavkem 30 g/1 sacharózy obsahujícím naftyloctové kyseliny (NAA) a 2 mg/l BAP) po dobu 15 hodin. Výhonky vytvořené j eště 0,05 mg/l benzylaminopurinu v této etapě byly pak ponechány 10 hodin na MS médiu s přídavkem 30 g/1 sacharózy, ale bez hormonů. Pak byly výhonky odebrány a přemístěny na médium MS s poloviční koncentrací solí, vitamínů a sacharózy, ale neobsahující hormony. Přibližně, po 15. dnech byly zakořeňující výhonky přeneseny do půdy.

2.3. Tolerance k bromoxynilu rostlin transformovaných konstruktem pRPA-RD-236 a regenerovaných bylo umístěno do skleníku. Rostliny byly ve skleníku do stadia 5 listů ošetřovány vodnou suspenzí prosrředku Pardner v množství odpovídajícím, dávce účinné látky bromoxynilu 0,2 kg/ha.

Všechny, rostliny jevící úplnou toleranci k bromoxynilu byly pak použity v pokusu, ve kterém se testoval vliv exprese androctoninu na toleranci transformovaných rostlin k napadení houbami. ...

Citovaná literatura:

Ausubel. F. A. & coli. (eds. Greene). Current Protocols in Molecular Biology. Publ. Wiley & Sons.

Bevan. M. & coli. (1983). Nuc. Acids Res. 1Γ.369-385.

Carringion and Freed (1990). J. Virol. 64:1590-1597.

Ehret-Sabatier & coli. (1996) The Journal of Biological Chemistry, 271.47, 29537-29544. Horsch & coli. (1985). Science 227:1*229-1231.

Jefferson & coli (1987). EMBOJ. 6:3901-3907.

Komáři & coli. (1986). J. Bacteriol. 166:88-94.

Rothstein & coli. (1981). Cold Spring Harb. Svmp. Quant. Biol. 4S: 99-105.

Stalker & coli. (1988). J. Biol. Chem. 263:6310-6314.

Oděli, J.T. & coli. (1985). Nátuře 313:810-812.

• φ φ φ φ φφφ φ ΦΦ· φ · φ φ φ φφφ · φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φφφφ φ φ φ φ φ φφ φφφ φφφφ φφφφ φφ · φ* φφ

SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

ii)	(A) DÉLKA: 110 párů baží (B) TYP: nukleová .kyselina
(C) (D) . TYP	TYP VLAKNA: dvojité TOPOLOGIE: lineární MOLEKULY: DNA
ix)	ZNAKY:
	(A)	JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS
	(B)	POZICE: 1...75

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 1:

AGG

TCC

GTG

TGC

AGG

CAG

ATC

AAG

ATC

TGC AGG AGG

AGG

GGT GGT

TGC

48

Arg

Ser

Val

Cys

Arg

Gin

Tle

Lys

Ile

Cys Arg Arg

Arg

Gly Gly

Cys

1

5

10

15

TAC

AAG

TGC

ACT

AAC

AGG

CCA

TAC

TGAGCTCGGC

GAGGCGAACG

25

Tvr

Tyr

Lys

Cys

Thr

Asn

Arg

Pro

Tyr

20

25

¹ ·

TGTCGACGGA TCCGG (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 106 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: ODS (B) POZICE: 12...101

(xi)	POPIS	SEKVENCE:	SEKVENCE	ID.	Č.	2:		—-
GCGTCGACGC	C ATG	GGT TTC GTG	CTT TTC TCT	CAG	CTT	CCA	TCT	TTC	CTT	50
	Met	Gly Phe Val	Leu Phe Ser	Gin	Leu		Ser	Phe	Leu
	1		5			10

CTT

GTG

TCT

ACT

CTT

TTC

CTT

GTG

ATC

TCT

CAC

TCT

TGC

CGT

98

Leu

.Val

Ser

Thr

Leu

Phe

Leu

Val

Ile

Ser

His

Ser

Cys

Arg

15

20

25

GCC GGCGA Ala

106 • · · · ···· • · · · · · · · · • · · ······· · fe · • fefe · ···· • fefe · fefe fefe (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 211 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina ' (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA.

(ix) DALŠÍ ZNAKY:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: CDS (B) POZICE: 12...176

' (xi)	POPIS	SEKVENCE: SEKVENCE	ID.	Č.	3:
GCGTCGACGC	C ATG	GGT TTC GTG CTT TTC TCT	CAG	CTT	CCA	TCT	TTC	CTT	50
	Met	Gly Phe Val Leu Phe Ser	Gin	Leu	Pro	Ser	Phe	Leu
	1	5			10

CTT GTG Leu Val	TCT ACT CTT CTT CTT TTC CTT GTG ATC	TCT CAC TCT TGC CGT	ss
Ser Thr	Leu	Leu Leu 20	Phe Leu	Val	Ile	Ser His 25	Ser Cys Arg ·
	15
GCC	AGG	TCC GTG	TGC	AGG CAG	ATC AAG	ATC	TGC	AGG AGG	AGG GGT GGT	146
Ala	Arg	Ser Val	Cys	Arg Gin	Ile Lys	Ile	Cys	A.rg Arg	Arg Gly Gly
30				35			40		45
TGC	TAC	TAC AAG	TGC	ACT AAC	AGG CCA	TAC	TGAGCTCGGC	GAGGCGAACG	196
Cys	Tyr	Tyr Lys	Cys	Thr Asn	Arg Pro	Tyr

55

TGTCGACGGA TCCGG 211 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČíŠLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 75 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 1 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 4:

GCGTCGACGC GATGGGTTTC GTGCTTTTCT CTCAGCTTCC ATCTTTCCTT CTTGTGTCTA 60.

CTCTTCTTCT TTTCC

999 9 9 9 9 · *

9 · · · · « · * « • · ···· 9 9 9 9

9 99 9 9999 9 9 99 9

9 9 9 9 · ·« ·

9 9 99 · ·φ 99 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 72 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oliconukleotid 2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 5:

TCGCCGGCAC GGCAAGAGTA AGAGATCACA AGGAAAAGAA GAAGAGTAGA CACAAGAAGG 60

AAAGATGGAA GC 72 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S .IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 44 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 3 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 6:

AGGTCCGTGT GCAGGCAGAT CAAGATCTGC AGGAGGAGGG GTGG 44 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 97 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 4 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 7: ____

CCGGATCCGT CGACACGTTC GCCTCGCCGA GCTCAGTATG GCCTGTTAGT GCACTTGTAG 60

TAGCAACCAC CCCTCCTCCT GCAGATCTTG ATCTGCC

000 · • ·

0 0 0 · 0 0 ·· 0 t 0 0 0

0 0 0

0000 00

0 0 0 • · 0 0 » Μ 0

0 0 0 0

0 0 0 • · 0 0 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 85 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 5 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 8:

AGGGCCCCCT AGGGTTTAAA CGGCCAGTCA GGCCGAATTC GAGCTCGGTA CCCGGGGATC

CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGC (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: , (A) DÉLKA: 66 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE. ID. Č. 9:

CCCTGAACCA GGCTCGAGGG CGCGCCTTAA TTAAAAGCTT GCATGCCTGC AGGTCGACTC 60

TAGAGG ’ 65 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kvselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 7 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 10:

CCGGCCAGTC AGGCCACACT TAATTAAGTT TAAACGCGGC CCCGGCGCGC CTAGGTGTGT

GCTCGAGGGC CCAACCTCAG TACCTGGTTC AGG

• 4 ···· • · • ·

(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché .

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) . TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: syntetický oligonukleotid 8 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE ID. Č. 11:

CCGGCCTGAA CCAGGTACTG AGGTTGGGCC CTCGAGCACA CACCTAGGCG CGCCGGGGCC

GCGTTTAAAC TTAATTAAGT GTGGCCTGAC TGG

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. nukleové Fragment kyseliny nukleové kódující kyseliny, který androctonin. obsahuje sekvenci 2. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 1, kde se jedná o DNA.
3. Fragment nukleové kyseliny podle, nároku 1 nebo 2, kde androctonin . je peptid izolovaný ze štíra, zejména druhu Androctonus australís, kterýžto peptid obsahuje nejméně 20 aminokyselin, výhodně nejméně 25 aminokyselin, přičemž .4 cysteinové zbytky tvoří disulfidícké můstky.
4. Fragment nukleové kyseliny podle nároku kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde androctonin obsahuje v podstatě peptidovou sekvenci podle obecného vzorce (I):

Xaa-Cys-Xab-Cys-Xac-Cys-Xad-Cys-Xae (I), kde '

Xaa představuje peptidový zbytek obsahující nejméně jednu aminokyselinu, ·

Xab představuje peptidový zbytek obsahující 5 aminokyselin,

Xac představuje peptidový zbytek obsahující 5 aminokyselin,

Xad představuje peptidový zbytek obsahující 3 aminokyseliny, Xae představuje peptidový zbytek obsahující nejméně jednu aminokyselinu.
5. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 4, kde Xab a/nebo Xad a/nebo Xae obsahují nejméně jednu bazickou aminokyselinu.

• ·· · ·· · ·· ·· ·· · · · · · · · 9 • · · · · · ··«« * · ········· ·· · • · · · · · ·« · ··· · ·· · ·· ··
6. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 5, kde bazická .aminokyselina je vybrána z lysinu, asparaginu a homoasparaginu.
7. Fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 4 až 6, kde '

Xaa představuje peptidovou sekvenci Xaa'-Val-, kde Xaa' je skupina NH₂ nebo peptidový zbytek obsahující nejméně 1 aminokyselinu a/nebo

Xab představuje . peptidovou sekvenci -Ar.g-Xab'-Ile-, kde

Xab'je peptidový zbytek obsahující 3 aminokyseliny a/nebo Xac představuje peptidovou- sekvenci -Arg-Xac'-Gly-, kde

Xac'je peptidový zbytek obsahující 3 aminokyseliny a/nebo.

Xad představuje peptidovou sekvenci -Tyr-Xaď-Lys, · kde Xaďje peptidový zbytek obsahující jednu aminokyselinu a/nebo Xae představuje peptidovou sekvenci -Thr-X-ae', - kde Xae' představuje skupinu COOH nebo peptidový zbytek obsahující nejméně 1 aminokyselinu.
8. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 7, kde Xaa' představuje peptidovou sekvenci Arg-Ser- a/nebo Xab' představuje peptidovou sekvenci -Gln-Ile-lys- a/nebo Xac' představuje peptidovou sekvenci -Arg-Arg-Gly- a/nebo Xad.' je peptidový zbytek -Tyr- a/nebo

Xae' představuje peptidovou sekvenci -Asn-Arg-Pro-Tvr.
9. Fragment nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, kde androctonin je představován peptidovou sekvencí 25 aminokyselin uvedenou zde jako sekvence id. č. 4 anebo homologními peptidovými sekvencemi.

• ···» ·· « ·· ·» • · · « · · · · · · • · 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 999 9999 99 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 - 9 9 9 · · · ·
10. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 9, který, je představován sekvencí id. č. 1, sekvencí k této sekvenci homologní nebo komplementární, přičemž jde zejména o kódující část sekvence id. č. 1 odpovídající nukleotidům 1 až 75..
11. Fragment nukleové kyseliny, který obsahuje sekvenci nukleové kyseliny kódující fúzní peptid peptid-androctonin nebo androctonin-peptid, výhodně -peptid-androctonin, přičemž androctonin je definován podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
12. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 11, kde, peptid fúzovaný s androctoninem je buď signální peptid nebo tranzitní peptid.
13. Fragment nukleové kyseliny tranzitní peptid. je buďto pro chloroplastu nebo do mitochondrie.

podle nároku 12, zaměření peptidu kde do .
14. signální případně proteinu zaměření' •Fragment nukleové kyseliny podle nároku 12, kde peptid je N-koncový signál neboli ve spojení' se signálem odpovědným v endoplazma,tickém retikulu, nebo do vakuoly- neboli propeptid.

prepeptid, za udržení peptid pro
15. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 14, kde signální peptid je signální peptid genu PR-Ια z tabáku.
16. Fragment nukleové kyseliny podle nároku 15, kde fúzní peptid peptid-androctonin je představován sekvencí id. č. 3 .

444 4 • 4 • ··· • 4 4 4 • 4 4 4 • · · 4

4 4 4 ·

4« 44
17. Fragment nukieové kyseliny podle nároku 16, který je představován kódující sekvencí id. č. 3, sekvencí k této sekvenci homologní nebo komplementární, přičemž jde zejména o kódující část sekvence id. č. 3 odpovídající bažím 12 až 176 této sekvence.
18. Fúzní protein peptid-androctonin nebo androctonin-peptid, výhodně peptid-androctonin, který je definován podle kteréhokoliv z nároků 11 až 16.
19. Chimérický gen, který obsahuje kódující sekvenci a heterologní regulační prvky v polohách 5' a 3', které jsou schopné funkce v hostitelském organismu, zejména v rostlinné buňce nebo v rostlině, a. tyto regulační prvky jsou funkčním způsobem spojeny s kódující sekvencí, přičemž kódující sekvence obsahuje alespoň jeden fragment DNA. kódující androctonin podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.
20. Chimérický gen podle nároku 19, kde hostitelský organismus je vybrán ze skupiny obsahující bakterie, např. E. coli, kvasinky, zejména rodu Saccharomyces nebo K1vyveromyces nebo Pichia, houby, zejména rodu Aspergillus, bakuloviry, a rostlinné buňky a rostliny.
21. Chimérický gen podle nároku 19 nebo 20, který je spojen se selekčním markérem vhodným pro transformovaný hostitelský organismus.
22. Klonovací nebo expresní vektor pro transformaci hostitelského organismu, který obsahuje přinejmenším jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 19 až 21.

··

9 4

4 4

4 4

4 4 • · * · • · · 4 4
23. Způsob transformace hostitelského organismu, zejména rostlinné buňky, v yznačující se tím, že se integruje alespoň jeden fragment nukleové kyseliny nebo jeden chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 19 až 21.
24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se t i m, že chimérický gen se integruje prostřednictvím vektoru podle nároku 22.
25. Způsob podle nároku 23 nebo 24 vyznačuj ící se tím, že hostitelský organismus je vybrán ze skupiny obsahující bakterie, např. E. coli, kvasinky, zejména rodu Saccharomyces nebo Kluyveromyces nebo Pichia,' houby, zejména rodu Aspergillus, bakuloviry, a rostlinné buňky a. rostliny.
26. Způsob podle nároku 25 vyznačující s e t i m, že hostitelský organismus je rostlinná buňka.
27. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že se z transformované rostlinné buňky regeneruje rostlina.
28. Hostitelský organismus, zejména rostlinná buňka nebo rostlina, které jsou transformované, takže obsahují chimérický gen podle kteréhokoliv z nároků 19 až 21.
29. Hostitelský organismus podle nároku 28, který je vybrán ze skupiny obsahující bakterie, např. E. coli, kvasinky, zejména rodu Saccharomyces nebo Kluyveromyces nebo Pichia, houby, zejména rodu Aspergillus, bakuloviry, a rostlinné buňky a rostliny.

• 000 • 0 · · · · 0 0 0 · • 0 · 0 · · 0 0 0 0 • 0 . 0 0 0000000 0 0 ·

0 ' · · 0 0 · 0 0 · ··« 0 00 0 00 00
30. Rostliny, které obsahují rostlinnou buňku podle nároku 29.
31. Rostlina podle nároku 30, která je regenerována z transformované rostlinné buňky.
32. Rostlina, která byla získána pěstováním a/nebo křížením rostlin získaných regenerací podle nároku 31.
33. Rostlina podle kteréhokoliv z nároků 30 až 32, která je vybrána z kukuřice, pšenice, řepky, sóji, rýže, cukrové třtiny, řepy, tabáku a bavlníku.
34. Rostlina podle kteréhokoliv, z nároků 30 až 33, která je rezistentní proti houbovým chorobám, které způsobují houby rodu Cercospora, .-zejména Cercospora bsticola, rodu Cladosporium, zejména Cladosporium herbarum, rodu Fusarium, zejména Fusarium culmorum nebo Fusarium graminearum, a Phytophthora, zejména Phytophthora cinnamoni.
35. Semena rostlin podle kteréhokoliv z nároků 30 až 34.
36. Způsob pěstování transformovaných rostlin podle kteréhokoliv z nároků 30 až 34 nebo rostlin získaných způsobem podle nároku 27, vyznačující se tím, že semena transformovaných rostlin se vysejí na povrch kultivačního' média, zejména pole, vhodného pro pěstování těchto rostlin, na tento povrch se aplikuje agrochemický prostředek, aniž by podstatně ovlivnil tato semena nebo transformované rostliny, a rostliny se pěstují až do dosažení zralosti a pak se sklidí, případně se sklidí semena oddělená od rostlin.

··«·· ·» » ·· *· •» · ·'·· · ·· * • · ««♦ » · · · » » . · · · · ···· · · * · < • · · · · ···· ··· · ·· · ·· ··
37. Způsob podle nároku 36 vyznačující se t i m, že agrochemický prostředek obsahuje alespoň jednu účinnou látku projevující fungicidní a/nebo baktericidní aktivitu.
38. Způsob podle nároku 37 vyznačující se tím, že účinná látka projevuje doplňující aktivitu k aktivitě androctoninu tvořeného v transformovaných rostlinách.
39. Způsob přípravy androctoninu definovaného kteřýmkoliv z nároků 1 až 18 vy z' nač u jící se t í m, že obsahuje kroky, kdy se kultivuje transformovaný hostitelský organismus podle kteréhokoliv z nároků 28 až 29 ve vhodném kultivačním médiu, a získaný androctonin se izoluje a úplně nebo částečně čistí.

• : ·.. · ·· ··