CZ2000634A3 - Vakcína - Google Patents
Vakcína Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2000634A3 CZ2000634A3 CZ2000634A CZ2000634A CZ2000634A3 CZ 2000634 A3 CZ2000634 A3 CZ 2000634A3 CZ 2000634 A CZ2000634 A CZ 2000634A CZ 2000634 A CZ2000634 A CZ 2000634A CZ 2000634 A3 CZ2000634 A3 CZ 2000634A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- plasmid
- hpv
- fusion
- vaccine
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 30
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 claims abstract description 10
- 230000003902 lesion Effects 0.000 claims abstract description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 166
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 151
- 208000022361 Human papillomavirus infectious disease Diseases 0.000 claims description 75
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 45
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 35
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 claims description 29
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 26
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 claims description 26
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 claims description 26
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 229940094937 thioredoxin Drugs 0.000 claims description 22
- 102000002933 Thioredoxin Human genes 0.000 claims description 21
- 108060008226 thioredoxin Proteins 0.000 claims description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 claims description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 11
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 claims description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 108700025701 Retinoblastoma Genes Proteins 0.000 claims description 3
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 63
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 13
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 abstract description 4
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 136
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 99
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 98
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 90
- 230000008696 hypoxemic pulmonary vasoconstriction Effects 0.000 description 71
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 68
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 62
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 59
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 59
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 45
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 45
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 42
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 41
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 39
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 35
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 34
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 33
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 31
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 29
- 101710132582 Protein D1 Proteins 0.000 description 27
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 27
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 26
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 26
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 24
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 22
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 22
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 21
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 21
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 20
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 16
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 16
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 16
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 16
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 16
- 101100525628 Picea mariana SB62 gene Proteins 0.000 description 15
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 14
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 13
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 13
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 12
- 244000309466 calf Species 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 12
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 12
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 12
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 11
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 10
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 10
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 10
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 9
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 8
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 8
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 8
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 8
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 206010008263 Cervical dysplasia Diseases 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 7
- 208000007951 cervical intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 7
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 7
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 7
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 7
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 7
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101150106931 IFNG gene Proteins 0.000 description 6
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 6
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 5
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 5
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 5
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N d-alpha-tocopherol Natural products OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 4
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 4
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 4
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 4
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 4
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229930003799 tocopherol Natural products 0.000 description 4
- 235000010384 tocopherol Nutrition 0.000 description 4
- 239000011732 tocopherol Substances 0.000 description 4
- 229960001295 tocopherol Drugs 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 3
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 3
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 3
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N n-dodecyl-n,n-dimethylglycinate Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC([O-])=O DVEKCXOJTLDBFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- -1 polymerization Proteins 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 3
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 3
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 206010059313 Anogenital warts Diseases 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 241000388186 Deltapapillomavirus 4 Species 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical class [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 2
- 101710132594 Protein E6 Proteins 0.000 description 2
- 101710132595 Protein E7 Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 201000005010 Streptococcus pneumonia Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000006872 enzymatic polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- 239000008062 guanidine hydrochloride buffer Substances 0.000 description 2
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 2
- 208000024312 invasive carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 2
- 150000003248 quinolines Chemical class 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 2
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 2
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 2
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Chemical class 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150078635 18 gene Proteins 0.000 description 1
- PIGCSKVALLVWKU-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoacridone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC(N)=CC=C3NC2=C1 PIGCSKVALLVWKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 235000001815 DL-alpha-tocopherol Nutrition 0.000 description 1
- 239000011627 DL-alpha-tocopherol Substances 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150000092 E5 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100020865 EKC/KEOPS complex subunit LAGE3 Human genes 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101001137983 Homo sapiens EKC/KEOPS complex subunit LAGE3 Proteins 0.000 description 1
- 101000637792 Homo sapiens Solute carrier family 35 member G5 Proteins 0.000 description 1
- 241000701828 Human papillomavirus type 11 Species 0.000 description 1
- 101100540311 Human papillomavirus type 16 E6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 125000002066 L-histidyl group Chemical group [H]N1C([H])=NC(C([H])([H])[C@](C(=O)[*])([H])N([H])[H])=C1[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 241001092142 Molina Species 0.000 description 1
- 101100125879 Mus musculus Il5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100462611 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) prr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 241001454523 Quillaja saponaria Species 0.000 description 1
- 235000009001 Quillaja saponaria Nutrition 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 101100122529 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GON7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001222774 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Minnesota Species 0.000 description 1
- 102100032019 Solute carrier family 35 member G5 Human genes 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical class [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N [2-[3-[6-[3-[(5R,6aS,6bR,12aR)-10-[6-[2-[2-[4,5-dihydroxy-3-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]ethoxy]ethyl]-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-5-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carbonyl]peroxypropyl]-5-[[5-[8-[3,5-dihydroxy-4-(3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]octoxy]-3,4-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxyoxan-2-yl]propoxymethyl]-5-hydroxy-3-[(6S)-6-hydroxy-2,6-dimethylocta-2,7-dienoyl]oxy-6-methyloxan-4-yl] (2E,6S)-6-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-methylocta-2,7-dienoate Chemical compound C=C[C@@](C)(O)CCC=C(C)C(=O)OC1C(OC(=O)C(\CO)=C\CC[C@](C)(O)C=C)C(O)C(C)OC1COCCCC1C(O)C(O)C(OCC2C(C(O)C(OCCCCCCCCC3C(C(OC4C(C(O)C(O)CO4)O)C(O)CO3)O)C(C)O2)O)C(CCCOOC(=O)C23C(CC(C)(C)CC2)C=2[C@@]([C@]4(C)CCC5C(C)(C)C(OC6C(C(O)C(O)C(CCOCCC7C(C(O)C(O)CO7)OC7C(C(O)C(O)CO7)O)O6)O)CC[C@]5(C)C4CC=2)(C)C[C@H]3O)O1 FHICGHSMIPIAPL-HDYAAECPSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003443 anti-oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 201000003565 cervix uteri carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 210000005002 female reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 108700032552 influenza virus INS1 Proteins 0.000 description 1
- 208000020082 intraepithelial neoplasia Diseases 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003780 keratinization Effects 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001589 lymphoproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 101150082581 lytA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000005374 membrane filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000005088 multinucleated cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 208000003154 papilloma Diseases 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- MOJZMWJRUKIQGL-XILRTYJMSA-N procyanidin C1 Chemical compound C1([C@@H]2[C@H](O)[C@H](C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)C2=C3O[C@@H]([C@H](O)[C@H](C3=C(O)C=C2O)C=2C(O)=CC(O)=C3C[C@H]([C@H](OC3=2)C=2C=C(O)C(O)=CC=2)O)C=2C=C(O)C(O)=CC=2)=CC=C(O)C(O)=C1 MOJZMWJRUKIQGL-XILRTYJMSA-N 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 238000000164 protein isolation Methods 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000000601 reactogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 208000022159 squamous carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005748 tumor development Effects 0.000 description 1
- 230000005740 tumor formation Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000022625 uterine cervix carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Chemical class 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Řešení se týká fuzních proteinů lidského papilomavíru (HPV)
spojených s imunologickým fúzním partnerem, který
poskytuje atigenu HPV epitopy pomocných T buněk. Vakcíny
je možné použít při léčbě nebo profylaxi lézí vyvolaných
HPV
Description
Oblast techniky
Vynález se týká fúzních proteinů, které obsahují protein nebo část proteinu, jenž poskytují epitopy pomocných T buněk a antigen vhodný pro lidský papilomavirus, což nachází využití při léčbě nebo profylaxi nádorů vyvolaných lidskými papilomaviry. Vynález se zvláště týká fúzních proteinů, které obsahují protein E6 nebo E7 z HPV 16 nebo 18 spojený s proteinem D pocházející z mikroorganizmu Heamophilius influenzae B.
Dosavadní stav techniky
Papilomaviry jsou malé viry způsobující nádory. Obsahují samotnou DNA (o velikosti 7,9 kilobazí, dvouřetězcová), která jsou vysoce druhově specifická. Je popsáno více jak 70 jednotlivých genotypů lidských papilomavirů. Papilomaviry se klasifikují na základě původu (lidské, bovinní atd.) a stupně genetické příbuznosti s jinými papilomaviry ze stejných druhů. HPV jsou v obecném případě specifické pro kůži nebo pro povrch sliznice a dělí se na málo nebezpečné a vysoce nebezpečné na základě časté nebo řídké detekce v abnormální nebo nádorové tkáni. Málo nebezpečné HPV většinou způsobují benigní léze (bradavice nebo papilomy), které přetrvávají několik měsíců nebo let. Vysoce nebezpečné HPV jsou spojovány s výskytem zhoubného bujení. Nejsilnější pozitivní spojení mezi papilomavirem a zhoubným bujením u lidí existuje mezi HPV 16 a 18 a karcinomem děložního čípku. S karcinomem děložního čípku se spojuje více než deset jiných typů HPV. Tyto typy zahrnují HPV 31 a HPV 33, ačkoli frekvence jejich výskytu je nižší.
Genitální infekce HPV u mladých sexuálně aktivních žen je běžná. U většiny uvedených žen buď infekce zmizí nebo jestliže vzniknou léze, dojde k regresi. Pouze u některých infikovaných • · · · získávají izolací a systému vhodného pro
V současné charakterizací jednotlivců dojde k vytvoření lézí, které se přemění na intraepiteliální neoplázie vysokého stupně a dále pouze část z nich se přemění na invazivní karcinom.
Molekulární příčiny vedoucí k infekci HPV nejsou zcela jasné. Zatím neexistuje systém in vitro pro pomnožení lidských papilomavirů, což zpomaluje postup k získání informací o virovém cyklu.
době se informace pomocí klonovacího bakterie a PCR amplifikaci. Molekulová organizace genomů HPV se identifikovala na základě porovnání s dobře chrakaterizovanými bovinními papilomaviry typu 1 (BPV1).
Ačkoli se objevují minoritní variace, všechny popsané genomy HPV mají alespoň sedm časných genů El až E7 a dva pozdní geny LI a L2. Navíc regulační sekvence proti směru exprese genu kotví regulační sekvence, které řídí většinu kroků transkripce v genomu HPV.
Geny El a E2 se podílejí na řízení virové replikace a transkripce a existují tendence jejich poškození virovou integrací. Geny E6 a E7 se podílejí na virové transformaci. Na tomto procesu se také podílí gen E5.
V případě HPV, které se podílejí na zhoubném bujení děložního čípku, jako je HPV 16 a 18, onkogenní proces začíná po integraci virové DNA. Výsledkem integrace je deaktivace genů kódujících kapsidové proteiny LI a L2 a ztráta represorové funkce E2, která vede k deregulaci otevřeného čtecího rámce E6/E7 podílejícího se na nadměrné expresi dvou časných proteinů E6 a E7, což povede k postupné ztrátě normální diferenciaci buněk a k vývoji zhoubného bujení. E6 a E7 obcházejí normální buněčný cyklus deaktivací hlavních nádorových supresorových proteinů p53 a pRB, což je produkt genu retinoblastomu.
Karcinom děložního čípku je běžný u žen a vzniká tak, že ze stádia prekarcinomu se vyvine invazivní karcinom, který • · · · projevuje jako charakteristickými (i:
(2:
často znamená úmrtí. Stádium prekarcinomu je známé jako cervikální intraepiteliální neoplázie a hodnotí se třemi stupni I až III podle narůstající vážnosti onemocnění (CIN I až III) .
Klinicky se infekce HPV ženského genitálního traktu cervikální rovné kondylomy, jejichž znaky jsou koilocytóza ovlivňující superficiální a intermediální buňky cervikálního dlaždicového epitelu.
Koilocyty, které vznikají důsledkem cytopatického účinku viru, se jeví jako vícejaderné buňky s perinukleárním jasným ohraničením. Epitel se zeslabuje abnormální keratinozací, která odpovídá za objevení lézí.
Takové ploché kondylomy, v případě, že jsou pozitivní na sérotypy HPV 16 a 18 jsou vysoce nebezpečnými faktory pro vývoj cervikální intraepiteliální neoplázie (CIN) a karcinomu in šitu (CIS), který je sám o sobě prekurzor lézí invazivního karcinomu děložního čípku.
Vývoj onkogenní infekce HPV znamená 3 fáze, jmenovitě: latentní infekční fáze fáze nitrojaderné virové replikace s produktem kompletních virionů, které odpovídá výskytu koilocytů.
V tomto stádiu HPV produkuje plné rozmezí proteinů, které zahrnují E2, E5, E6, E7, Ll a L2.
fáze virové integrace do buněčného genomu, který způsobuje počátek maligní transformace a odpovídá CIN II a CIN III/CIS s progresivním vymizením koilocytů.
V tomto stádiu exprese E2 je regulována negativně a exprese E6 a E7 se zvýší. Mezi fázemi CIN II/III a CIN :3)
III/cervikální být epizomální
DNA přestává ale začleňují se 85 % cervikálních karcinom virová v bazálních buňkách, pouze geny E6 a E7 (nádorové buňky) karcinomů jsou karcinomy dlaždicovitých buněk, které jsou ve většině případů spojeny se sérotypem HPV 16. 10 % a 5 % jsou adenokarcinomy respektive adenokarcinomy dlaždicovitých buněk a oba typy jsou převážně spojeny se sérotypem HPV 18. Existují však i další onkogenní HPV.
V dokumentu patentové přihlášky č. WO 96/19496 se popisují varianty lidského papilomavirového proteinu E6 a E7, zvláště fúzní proteiny E6/E7 s delecí v obou proteinech E6 a E7. Uvádí se, že tyto deleční fúzní proteiny jsou imunogenní.
Vynález poskytuje kompozice obsahující buď E6 nebo E7 nebo E6/E7 fúzní protein spojený s imunologickým fúzním partnerem, který má epitopy T buněk.
V preferované formě vynálezu imunologický fúzní partner se získal z proteinu D mikroorganizmu Heamophilius influenzae B. Upřednostňuje se, aby derivát proteinu D obsahoval přibližně první třetinu proteinu, zvláště přibližně prvních 100 až 110 aminokyselin N-konce. Protein D může být lipidován (lipoprotein D) . Mezi jiné imunologické fúzní partnery patří nestrukturální protein z viru chřipky NS1 (hemaglutinin). V typickém případě se využívá 81 N-terminálních aminokyselin, ačkoli se mohou použít různé fragmenty, které poskytují epitopy pomocných buněk T.
V jiném provedení vynálezu imunologickým fúzním partnerem je protein známý jako LYTA. Přednostně se používá C-terminální část molekuly. Protein lyta se získal z mikroorganizmu Streptococcus pneumonia, který syntetizuje N-acetyl-Lalaninamidázu, (amidáza LYTA, kódovaný genem lytA (popisuje se v publikaci Gene, 43 (1986) page 265-272)). Jde o autolyzin, který specificky degraduje jisté vazby v peptidoglykanovém řetězci. C-terminální doména proteinu LYTA je odpovědná za afinitu vůči cholinu nebo k některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost se využívá k vývoji plazmidů vhodných pro expresi C-LYTA v E. coli, které jsou také použitelné pro expresi fúzních proteinů. Popisuje se čištění hybridních proteinů obsahujících na svém N-konci fragment C-LYTA (Biotechnology: 10, (1992) page 795-798) . V preferovaném • · · · • ·
5· · ··# · ··· ·· · ·· ··· ····· ·· ··· ·· ··· ·· · · provedení vynálezu se využívá část repetice molekuly Lyta nalezené na C-konci začínající zbytkem 178. Zvláště preferované formy zahrnují zbytky 188-305.
V preferovaném provedení vynálezu se popisují fúzní proteiny obsahující protein D-E6 pocházející z HPV 16, protein D-E7 pocházející z HPV 16, protein D-E7 pocházející z HPV 18, protein D-E6 pocházející z HPV 16 a protein D-E6E7 pocházející z HPV 16 a 18. Část proteinu D přednostně obsahuje první třetinu proteinu D. Je výhodné, že se mohou využívat proteiny E6 a E7 pocházející z jiných subtypů HPV.
Proteiny podle vynálezu se přednostně exprimují v mikroorganizmu E. coli. V preferovaném provedení vynálezu se proteiny exprimují s histidinovým ocasem, který obsahuje 5 až 9 a s výhodou šest histidinových zbytků. To je výhodné při čištění.
Protein E7 může v preferovaném provedení vynálezu nést mutaci, aby se redukovalo navázání na rb místo (produkt genu retinoblastomu) a tak se eliminuje libovolná potenciální transformační kapacita. Preferované mutace HPV 16 E7 zahrnují nahrazení Cys24 glycinem nebo kyselinu glutamovou26 glutaminem. V preferovaném provedení vynálezu protein E7 obsahuje obě tyto mutace.
Preferované mutace HPV 18 E7 zahrnují nahrazení Cys27 glycinem a/nebo kyselinu glutamovou29 glutaminem. Opět je výhodné, aby byly přítomné obě mutace. Jedna nebo obě mutace se mohou také zavést do oblasti p53 E6, aby se eliminovala potenciální schopnost transformace.
V dalším provedení vynálezu se popisuje fúzní protein E6/E7 pocházející z HPV spojený s imunologickým fúzním partnerem. Preferovaný imunologický fúzní partner je protein D, více se upřednostňuje první třetina proteinu D.
Vynález také poskytuje DNA kódující proteiny podle vynálezu. Takové sekvence se mohou začlenit do vhodného • · β
expresívního vektoru a mohou se exprimovat ve vhodném hostiteli.
Sekvence DNA kódující proteiny podle vynálezu se mohou syntetizovat za použití standardních postupů syntézy DNA, jako je enzymatická ligace, jak se popisuje v publikaci D. M. Roberts et al. Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, chemickou syntézou, enzymatickou polymerizací in vitro nebo technologií PCR využívající například tepelně stabilní polymerázu nebo použitím kombinací všech uvedených technik.
Enzymatické polymerizace DNA se může provést in vitro za použití DNA polymerázy, jako je DNA polymeráza I (Klenow fragment) ve vhodném pufru, který obsahuje nukleozidtrifosfáty dATP, dCTP, dGTP a dTTP, při teplotě 10 až 37 °C. Reakce porbíhá v objemu 50 μΐ nebo menším. Enzymatická ligace fragmentů DNA může proběhnout za použití DNA ligázy, jako je T4 DNA ligáza ve vhodném pufru, jako je 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,01 M MgCl2, 0,01 M dithiotritol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP a 0,1 mg/ml bovinního sérového albuminu při teplotě 4 °C až teplota místnosti. V obecném případě reakce probíhá v objemu 59 ml nebo méně. Chemická syntéza polyméru nebo fragmentů DNA se může provést běžnými chemií fosfotriesteru, fosfitu nebo
| fosforamiditu za použití | metody na | pevné | fázi, | jak se | popis | ;uj e |
| v publikaci Chemical | and Enzymatic | Synthesis of Gene | ||||
| Fragments- A Laboratory | Manual ( | ed. H. | G. | Gassen | an d | A. |
| Lang), Verlag Chemie, | Weinheim | (1982) | nebo | v j iné | vědecké | |
| literatuře na příklad | v publikacích M. | J. | Gait, H | . W. | D. | |
| Matthes, M. Singh, B. | S. Sproat | and R | . C. | Titmas, | Nucleic | |
| Acids Research, 1982, | 10, 6243 | , B. | S . | Sproat, | and | W, |
| Bannwarth, Tetrahedron | Letters, | 1983, | 24, | 5771, | M. | D. |
| Matteucci and Μ. H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, | 21, | |||||
| 719, M. D. Matteucci and Μ. H. | Caruthers, | Journal | of | the |
American Chemical Society, 1981, 103, 3 185, S. P. Adams, et al., Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661, N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic
Ί
Acids Research, 1984, 12, 4539, a H. W. D. Matthes et al.,
EMBO Journal, 1984, 3, 801.
Způsob podle vynálezu se může provést běžnou rekombinantní metodou, jak se popisuje v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Tento způsob může zahrnovat kroky:
i) příprava replikovatelného nebo začlenitelného expresívního vektoru schopného v hostitelské buňce exprimovat polymer DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein nebo jeho imunogenní derivát.
ii) transformaci hostelské buňky uvedeným vektorem.
iii) kultivaci uvedené transformované hostitelské buňky za podmínek, které umožňují expresi uvedeného polyméru DNA za vzniku uvedeného proteinu a iv) získání uvedeného proteinu.
Termín „transformace znamená zavedení cizorodé DNA do buňky hostitele. Toho je možné dosáhnout například transformací, transfekcí nebo infekcí s vhodným plazmidovým nebo virovým vektorem za použití běžných metod, jak se popisuje v publikaci Genetic Engineering, Eds. S. M. Kingsman and AJ. Kingsman, Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, 1988. Termín „transformovaný nebo „transformant znamená výslednou hostitelskou buňku obsahující nebo exprimující cizorodý gen.
Rekombinantní antigen podle vynálezu se s výhodou exprimuje v- mikroorganizmu E. coli. Strategie exprese zahrnuje fúzi E6, E7 nebo fúzi E6/E7 s 1/3-N-terminální části proteinu D pocházející z mikroorganizmu Haemophilius influenzae B, což je imunologický fúzní partner, který poskytuje epitopy pomocných buněk T. Afinitní polyhistidinový ocas se navrhl na karboxylovém konci fúzního proteinu, což umožňuje zjednodušit • · čištění. Takový rekombinantní antigen se nadměrně exprimuje v mikroorganizmu E. coli jako nerozpustný protein.
Protein podle vynálezu se s výhodou exprimují spolu s thiredoxinem v uspořádání trans (TIT). Společná exprese thioredoxinu v uspořádání trans versus cis je výhodná, aby antigen zůstal bez thioredoxinu, aniž je nutná proteáza. Společná exprese thioredoxinu zjednoduší rozpustnost proteinů podle vynálezu. Společná exprese thioredoxinu má také podstatný vliv na výtěžek čištění proteinu, na rozpustnost čištěného proteinu a na jeho kvalitu.
Expresívní vektory jsou nové a také tvoří součást vynálezu. Replikovatelné expresívní vektory se mohou připravit v souladu s vynálezem tak, že se vektor kompatibilní s hostitelskou buňkou štěpí za vzniku lineárního segmentu DNA, který nese neporušený replikon a kombinováním uvedeného lineárního segmentu s jednou nebo více molekul DNA, které spolu s uvedeným lineárním segmentem kóduje požadovaný produkt, jako je polymér DNA kódující protein podle vynálezu nebo jeho derivát za ligačních podmínek.
Je-li to nutné, během konstrukce vektoru je možné upravit nebo vytvořit polymér DNA.
Volba vektoru je zčásti dána hostitelskou buňkou, která může být prokaryontní nebo eukaryontní, upřednostňuje se však mikroorganizmus E. coli. Vhodné vektory zahrnují plazmidy, bakteriofágy, kozmidy a rekombinantní viry.
Příprava replikovatelného expresívního vektoru se může provést běžným způsobem vhodnými restrikčními enzymy, polymerizací a ligaci DNA. Tyto postupy se popisují například v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Rekombinantní hostitelská buňka se připravila v souladu s vynálezem transformací hostitelské buňky replikovatelným expresívním vektorem podle vynálezu za podmínek transformace. Vhodné transformační podmínky se popisují například
• · · · · · · ·· ··· · · ··· · · v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982-1989 nebo „DNA Cloning Vol. II, D. M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.
Volba transformačních podmínek závisí na hostitelské buňce. Tak bakteriální hostitel, jako je E. coli, se může ošetřit roztokem CaCl2 (Cohen et al., Proč. Nat. Acad. Sci., 1973, 69, 2110) nebo roztokem obsahujícím směs RbCl, MnCl2, acetát draselný a glyceról a pak kyselinou 3-[N-morfolino]~ propansulfonovou , RbCl a glycerolem. Savčí buňky v kultuře se mohou transformovat vektorem DNA, který se společně srážel s vápníkem. Vynález také popisuje hostitelskou buňku transformovanou replikovatelným vektorem podle vynálezu.
Kultivace transformované hostitelské buňky za podmínek, které umožňují expresi polyméru DNA, jak se popisuje například v publikaci Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982-1989 nebo „DNA Cloning Vol. II, D. M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985. Upřednostňuje se, aby se buňky doplnily nutrientem a kultivovaly se při teplotě nižší než 50 °C.
Produkt se získal běžnými metodami, které závisí na volbě hostitele. V případě, že hostitelskou buňkou je bakterie, jako je například E. coli, mohou se lyžovat fyzikálním způsobem, chemicky nebo enzymaticky a proteinový produkt se izoluje z výsledného lyzátu.
V případě, že hostitelskou buňkou je savčí buňka, produkt se může v obecném případě izolovat z nutričního média nebo extraktů, které neobsahují buňky. Běžná metoda izolace proteinu zahrnuje selektivní precipitaci, adsorpční chromatografií a afinitní chromatografií zahrnující afinitní kolonu s monoklonálními protilátkami.
V případě, že se proteiny podle vynálezu exprimují s histidinovým ocasem (His tag) . Proteiny se mohou jednoduše čistit afinitní chromatografií za použití afinitní chromatografické kolony za použití kovových iontů (IMAC).
• ·
9 · ·· · «« ··* · · · · «··· « ···· · ·· · ίο :: : · : :
·· ··· ·· ··· ·· ··
Sekundární chromatografické čištění, jako je například za použití Q-sefarózy, se může využít buď před nebo po použití kolony IMAC s výtěžkem vysoce čištěného proteinu. Jestliže imunologický fúzní partner je C-LYTA, pak je možné využít afinitu C-LYTA k cholinu a/nebo k DEAE za účelem čištění uvedeného produktu. Produkty obsahující C-LYTA a his tag se mohou jednoduše a účinně čistit v procesu se dvěma kroky, které zahrnují diferenciální afinitní chromatografií. Jeden krok zahrnuje afinitu His tag vůči koloně IMAC. Druhý krok zahrnuje afinitu C-terminální oblasti LYTA k cholinu nebo DEAE.
Proteiny obsahující C-LYTA a his tag jsou nové a jsou zahrnuty ve vynálezu. Při čištění uvedených proteinů je možné dosáhnout vysokého stupně čistoty (vyšší než 80 %, s výhodou vyšší než 90 %) pomocí jednoduchého dvoustupňového diferenciálního afinitního postupu.
Proteiny podle vynálezu se připravují alespoň z 80 % čisté. Více se upřednostňuje 90 % čistota. Čistota se posuzuje na SDS PAGE. Při testu SDS PAGE za redukčních podmínek protein představuje hlavní jediný pruh a analýza westernovým přenosem vykazuje méně než 5 % kontaminace proteinem hostitelské buňky.
Vynález popisuje farmaceutickou kompozici obsahující protein podle vynálezu ve farmaceuticky přijatelném ekcipientu. Kompozice preferované vakcíny obsahuje alespoň protein D-E6 pocházející z HPV 16 nebo jeho derivát spolu s proteinem D-E7 pocházející z HPV 16. V jiném případě E6 a E7 se mohou vyskytovat v jedné molekule, přičemž se upřednostňuje fúze proteinu D E6/E7. Taková vakcína může obsahovat buď protein E6 nebo E7 nebo oba tyto proteiny pocházející z HPV 18. Upřednostňuje se forma fúzního proteinu protein D-E6 nebo protein D-E7 nebo fúzní protein protein D E6/E7. Vakcíny podle vynálezu mohou obsahovat buď HPV antigeny pocházející z HPV 16 nebo 18. Vakcína může zvláště obsahovat antigenní monoméry LI nebo L2. V jiném případě takové antigeny LI nebo L2 se mohou ·· ···· ·· ···· • · · · · * • ···· · ···· ii :: : · : : :
• · ··· · · ··· vyskytovat společně jako částice podobné viru nebo samotný protein LI se může vyskytovat jako partikule podobné viru nebo jako kapsomérovou strukturu. Takové antigeny, částice podobné viru a kapsoméry jsou dobře známy v oboru (popisují se například v dokumentech W094/00152, WO94/20137, WO94/05792 a WO 93/02184.
Tako se mohou zahrnout časné proteiny, jako je E2 nebo s výhodou E5. Vakcína podle vynálezu může navíc obsahovat antigeny z jiných kmenů HPV. Upřednostňují se antigeny z kmenů HPV 6, HPV 11, HPV 31 nebo HPV 33.
Příprava vakcíny se v obecném případě popisuje v publikaci Vaccine Design-The subunit and adjuvant approach (Ed. Powell and Newman) Pharmaceutical Biotechnology Vol. 6 Plenům Press 1995. Kapsulizace s lipozómy se popisuje v dokumentu Fullerton, US patent č. 4,235,877.
Proteiny podle vynálezu se přednostně vyskytují ve vakcinačních formulacích podle vynálezu. Vhodné adjuvans zahrnuje sole hliníku, jako je gel hydroxidy hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý. Mohou to také být sole vápníku, železa nebo zinku nebo může jít o nerozpustnou suspenzi acetylovaného tyrozinu nebo acetylovaného cukru, kationicky nebo anionicky derivatizovaných polysacharidů nebo polyfosfazenů.
Ve formulaci podle vynálezu se preferuje, aby adjuvans v kompozici indukovalo odezvu TH1. Vhodné systémy adjuvans zahrnují například kombinaci monofosforyl-lipidu A. Upřednostňuje se 3-de-O-acetylovaný monofosforyl-lipid A (3DMPL) spolu se solemi hliníku.
Zesílený systém zahrnuje kombinaci monofosforyl-lipidu A a derivát saponinu zvláště v kombinaci QS21 a 3D-MPL, jak se popisuje v dokumentu WO 94/00153 nebo méně reaktogenní kompozici, kde QS21 je doplněn cholesterolom, jak se popisuje v dokumentu WO 96/33739.
• · ···· ·· ···· • · « · · ř • · « · · · ···· • ·
Zvláště silné adjuvans zahrnuje QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulzi olej ve vodě, jak se popisuje v dokumentu WO 95/17210 a je preferovanou formulací.
V jednom provedení vynálezu vakcína obsahuje protein D (nebo jeho derivát)-E6 nebo protein D(nebo jeho derivát)-E7 a adjuvans je monofosforyl-lipid A nebo jeho derivát.
Upřednostňuje se, aby vakcína obsahovala saponin, více se upřednostňuje QS21.
Upřednostňuje se formulace, která obsahuje emulzi olej ve vodě a tokoferol. Vynález popisuje způsob produkce vakcinační formulace obsahující směs proteinu podle vynálezu spúolu s farmaceuticky přijatelným ekcipientem, jako je 3D-MPL.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Konstrukce fúze protein Dl/3-E7-His(HPV16) kmene mikroorganizmu exprimující se v E. coli
1. Konstrukce expresívního plazmidu
a) Plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu přihláška UK patentu č. 951 3261.9, který se zveřejnil jako W097/01640), ve kterém kodony 4-81 NS1 kódující oblasti z Influenzae se nahradily kodony korespondujícími se zbytky Ser 20 —> Thr 127 zralého proteinu D Haemophilius influenzae, kmen 772, biotyp 2 (popisuje se v publikaci H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. P. 119-125). Po sekvenci Prot-Dl/3 následuje vícenásobné klonovací místo (11 zbytků)a kódující oblast C-terminálního histidínového ocasu (6 His). Tento plazmid se použil přo expresi fúzního proteinu D1/3-E7-HÍS.
b) HPV genomové sekvence E6 a E7 typ HPV 16 (popisuje se v publikaci Dorf et al., Virology 1985, 145, p.181-185) se amplifikovaly genomu HPV 16 plné délky klonovaného do pBR322 (získal se z instituce Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human • » · · · ·· · · · · * ·· ··· ·· ··· ·· ·· pathogen Papillomaviruses-D 69120-Heidelberg) a subklonoval se do pUC19 za vzniku TCA 301 (=pRIT14462).
Konstrukce plazmidu TCA 308 (=pRIT14501) , jde o plazmid exprimujicí fúzní protein-Dl/3-E7-His
Nukleotidové sekvence odpovídající aminokyselinám 1 —> 98 proteinu E7 se amplifikovaly z pRIT14462. Během polymerázové řetězcové reakce vznikly na 5'a 3'koncích sekvencí E7 restrikční místa Ncol a Spěl, která umožňují inzerci do stejných míst plazmidu pMGMCS Prot Dl/3 za vzniku plazmidu TCA308(=pRIT14501) . Inzert se sekvenoval, aby se ověřilo, zda během polymerázové řetězcové reakce nedošlo k žádným modifikacím. Sekvence uvedené fúze protein-Dl/3-E7-His (HPV 16) se popisuje na obrázku č. 1.
1) transformace kmene AR58
Plazmid pRIT14501 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) defektivního λ lysogenu obsahujícího represor citlivý na teplo promotoru λ pL.
2) Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese Prot-Dl/3-E7His
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14501 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μρ/πιΐ kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu D1/3-E7-HÍS. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
Příklad 2: Charakterizace fúze protein Dl/3-E7-His (HPV 16)
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4
C.
• · · · · • ♦ · • · * • · ·· ·
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem. Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 33 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových biotech králičím polyklonálním anti-protein D a Ni-NTA konjugátem spojeným s telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 5 % celkového proteinu, jak se zobrazilo na SDSpolyakrylamidovém gelu barveného podle Coomassie.
Příklad 3: Čištění protein-Dl/3-E7-His (HPV 16)
Jeden litr kultury bakterií exprimujících protein-Dl/3-E7His se centrifugoval při 11 300 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C a buněčný pelet se uchovával při teplotě -80 °C až do doby ošetření. Po resuspenzací v pufru PBS o objemu 75 ml se buňky mikroorganizmu E. coli poruší na zařízení Prench pressure cell press (SLM Aminco®) při tlaku 140 MPa. Lyžované buňky se peletovaly centrifugací při 17 000 g po dobu 30 minut. Pelet obsahující protein -Dl/3-E7-His su pH 7,5, pak dvakrát ve 30 ml 50 mM se promyl jednou ve 30 ml 2M NaCl, 50 mM fosforečnanu pH 7,5. Proteiny se rozpustí po dvou hodinách inkubace peletu ve 30 ml 8 M močoviny, 50 mM fosforečnanu pH 7,5 při teplotě místnosti. Buněčný debris se odstranil centrifugací po dobu 15 minut při 17 000 g a při teplotě 4 °C. Čištění proteinu se provedlo při teplotě místnosti. 15 ml rozpustného proteinu se aplikovalo na 5 ml NÍ2+NTA (Qiagenu) pryskyřice (kolona Pharmacia XK 16/20), která se uvedla do rovnováhy 8 M močovinou, 50 mM fosforečnanem pH 7,5 při průtokové rychlosti 0,2 ml/min. Kolona se prommývala stejným pufrem až absorbance při vlnové délce 280 nm dosáhla základní hodnoty. Protein se vymyl gradientem 0 až 600 mM imidazolu v 8 M močovině, 50 mM fosforečnanu pH 7,5. Průtoková rychlost
44«4 ·· ·r·4 těchto dvou posledních kroků je 1 ml/min. Vymyté frakce se analyzovaly elektroforézou na SDS polyakrylovém gelu a westernovým blotem. ProtDl/3-E7-His se zviditelnil barvením Coomassieovou modří, polyklonálním anti-proteinem D nebo monoklonálními protilátkami proti E7. Tento pruh se jeví jako hlavní jediný pruh o molekulové hmotnosti 32 000 a odhadl a jeho čistota se odhadla na 95 %. Polyklonální protilátky proti proteinlm E. coli neobsahovaly žádné kontaminanty z bakterií E. coli.
Za účelem odstranit močovinu se 9 ml čištěného antigenu v koncentraci 1,33 g/ml (Bradford) se dialyzovalo proti 3 litrům pufru PBS přes noc při teplotě místnosti. Pak následuje dialýza po dobu 4 hodin proti čerstvému pufru PBS. 80 % protein, který není kontaminován močovinou, se získal jako rozpustný protein. Aby se odstranily kontaminující endotoxiny 6 ml dialyzovaného proteinu se inkubovalo s 1 ml gelu Affiprep (Biorad) po dobu 3 hodin při teplotě 4 °C za jemného míchání. Druhá inkubace s pryskyřicí Affiprep o objemu 500 μΐ se uskutečnila za účelem minimalizace množství endotoxinu na hodnotu 8,8 Εϋ/μς proteinu. Po sterilní filtraci na filtračním zařízení s póry o velikosti 0,22 μπι (Millex 0,22 GV, Millipore) se u prot-Dl/3-E7-His při koncentraci 0,665 mg/ml testovala jeho stabilita. Analýza na SDS PAGE naprokázala žádný vývoj proteinu po 7 dnech inkubace při teplotě -20 °C, 4 °C, teplotě místnosti nebo 37 °C.
Příklad 4: Konstrukce fúze protein-Dl/3-E6-his/HPV 16, který se exprimuje v kmeni mikroorganizmu E. coli 1. Konstrukce expresívního plazmidu
a) Plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu W097/01640, kde kodony 4-81 kódující oblasti NS1 pocházející z Influenza se nahradily kodony, které odpovídají zbytkům Ser 20 —> Thr 127 zralého proteinu D mikroorganizmu Haemophilius influenzae kmen 722, * · ft · · ·
U 'U · * · · · * · * • ft ftftft *· ··· ft· ·* biotyp 2 (H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity,
Jan. p. 119-125). Po sekvenci Prot-Dl/3 následuje vícenásobné klonovací místo (11 zbytků) a kódující oblast C-terminálného histidinového konce (6 His). Tento plazmid se používá při expresi fúzního proteinu Dl/3-E6-his.
b) HPV genomové sekvence E6 a E7 typu HPV 16 (popisuje se v publikaci Dorf et al., Virology 1985, 145, p. 181-185) se amplifikovaly z genomu HPV 16 v celé délce klonovaného do pBR322 (který se získal v instituci Deutches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Refenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses - D 69120 - Heidelberg)
c) subklonovaly se do pUC19 za vzniku TCA 301 (=pRIT14462).
Konstrukce plazmidu TCA 307 (=pRIT14497) : plazmid exprimující fúzi protein-Dl/3-E6-His/HPVl6
Nukleotidové sekvence odpovídající aminokyselině.
Oblast 1 -> 151 proteinu E6 se amplifikovala z pRIT14462.
Během polymerázové řetězcové reakce se na 5'a 3' koncích sekvencí E6 vytvořily restrikční místa Ncol a Spěl, které umožňují začlenění stejných míst plazmidu pMGMCS protDl/3 za vzniku plazmidu TCA307 (=pRITl4497) (zobrazeno na obrázku č. 2) . Inzert se sekvenoval za účelem ověření, že během polymerázové řetězcové reakce nedošlo žádné modifikaci. Kódující sekvence fúze protein-Dl/3-E6-His se popisuje na obrázku č. 3.
2. Transformace kmene AR58
Plazmid pRIT14497 se zavedl do E. coli AR58 (popisuje se v publikaci Mott et al. , 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. 82: 88) defektního lysogenu λ, který obsahuje represor promotoru λ pL citlivého na teplo.
3. Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese Prot-Dl/3-ΕβHis ·* 9999
9999 < « 9 * 9 9 * · «99« * «'99* * ‘ 9 ·
Ί Ί «« 999· 9 9*·' »
4-1 9» 9 9 · 9 9 * « · >9 999 99 ··· 99 99
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14497 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μς/πιΐ kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu D1/3-E6-HÍS. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovával se při teplotě -20 °C.
4. Charakterizace fúze protein Dl/3-E6-His (HPV 16)
Příprava extraktů
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže) . Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Analýza SDS-polyakrylamidových gelů barvených podle Coomassie a westernový bloty
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem.
Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 32 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových biotech králičím polyklonálním anti-proteinem D a Ni-NTA konjugátem spojeným telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 5 % celkového proteinu.
5. Společná exprese s thioredoxinem
Analogickým způsobem jako v případě exprese prot Dl/3 E7 His z HPV 18 (příklad 13) se mikroorganizmus E. coli kmen AR58 transformoval plazmidem kódujícím thioredoxin a protein D 1/3 E7 His (HPV 16).
Příklad 5: Čištění prot D 1/3 E6 His (HPV 16)
Rekombinantní antigen HPV-16 ProtDl/3E6 se exprimoval v mikroorganizmu E. coli (AR58). Strategie exprese zahrnuje fúzi E6 s 1/3-N-terminální části proteinu D z Haemophilius influenzae, což je imunologický fúzní partner poskytující epitopy pomocných T buněk. Na carboxylovém konci fúzního proteinu se vytvořil afinitní polyhistidinový konec. Rekombinantní antigen se nadměrně exprimoval v E. coli jako nerozpustné proteiny.
Při rozpouštění antigenů jsou nutná denaturační činidla. Při nepřítomnosti denaturačního činidla ProtDl/3-E6-His se sráží při neutrálním pH. Za účelem obejít problémy rozpustnosti se provedla společná exprese těchto proteinů s thioredoxinem v poloze trans (TIT).
Bakteriální exprese se provedla v kultivačním médiu LB v přítomnosti 0,05 mg/ml kanamycinu při teplotě 30 °C. V případě, že se společně exprimuje thiredoxin přidá se 0,2 mg/ml ampicilinu. Exprese rekombinantního proteinu se termálně indukuje při teplotě 42 °C, přičemž optická hustota (OD 600 nm) dosahuje hodnoty 0,4. Exprese proteinu se udržuje po dobu 4 hodin. Čištění se provádí podle následujícího protokolu.
| Pelet buněčné kultury | 60 OD 600 nm 1 mM pefabloc, 2 M NaCI, PBS pH 7,4 (pufr A) |
| Zařízení na otevření buněk „French press | Tři pasáže, 140 MPa |
| Centrifugace | 17 000 g, 30 minut, 4 °C |
| Promytí peletu | 2 M NaCI, PBS pH7,4 (pufr B) xl PBS pH 7,4 (pufr C) x2 |
| Centrifugace | 17 000 g, 30 minut, 4 °C |
| Rozpouštění peletu | 6 M guanidinchlorid, 20 mM PO4, pH7,0 (pufr D) přes noc při teplotě 4 °C |
| Centrifugace | 17 000 g, 30 minut, 4 °C |
| Aplikace supernatantu na IMAC | Ekvilibrace: 6 M guanidinchlorid, 20 mM PO4, pH 7,0 (pufr D) Eluce: imidazolové kroky (0,025M, 0,1M, 0,5 M) v 8 M |
• · · · · · ··· · ··· ·· ·
| močovině, 20 mM PO4, pH 7,0 | |
| Affiprep polymixin | 8 M močovina, 20 mM PO4, pH 7,0 (pufr E), 2 hod. při teplotě místnosti |
| Dialýza | 4 M močovina, 0,5 M arginin, 150 mM NaCI, 10 mM PO4, pH 6,8 (pufr I) |
| 2 M močovina, 0,5 M arginin, 150 mM NaCI, 10 mM PO4, pH 6,8 (pufr J) | |
| 0 M močovina, 0,5 M arginin, 150 mM NaCI, 10 mM PO4, pH 6,8 (pufr K) |
Buňky se účinně porušily homogenizací za vysokého tlaku za použití zařízení „French pressure device. Antigen se extrahoval s vysokou koncentrací denaturačního činidla. Tento první krok otevírá buněčnou stěnu bakterie a antigen se extrahuje z bakteriální nerozpustné frakce. Následující čištění probíhá z kultury o objemu 4 litry.
Pufry:
A. PBS/ 2M NaCI / 1 mM Pefabloc
B. PBS / 2 M NaCI
C. PBS: 137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 8,1 mM NaH2PO4, 1,47 mM KH2PO4 pH 7,4.
D. 6 M guanidinchlorid, 20 mM PO4 (NaH2PO4(2H2O)/K2HPO4(3H2O) pH 7,0
Počáteční materiál je 10 lahví, kdy každá obsahuje 400 ml kultury.
Buněčná pasta se suspenduje v pufru A, aby hodnota optické hustoty při vlnové délce 600 nm byla 60 (v tomto případě 240 ml pufru A ) . Pak následuje lyže třemi průchody zařízením „French press disruptor (pří tlaku 140 MPa) . Lyžované buňky se peletovaly po dobu 30 minut při 15 000 g při teplotě 4 °C. Bakteriální buněčný pelet obsahující rekombinantní protein se • · · · • · se při promyje jednou pufrem B při objemu 240 ml, pak dvakrát 240 ml pufru C.
Prot D E6-His (TIT) se rozpouští ve 240 ml pufru D přes noc při teplotě 4 °C na rotujícím kole. Buněčný debris odstranil centrifugací při 15 000 g po dobu 30 minut a teplotě 4 °C. Supernatant (230 ml) se uchovával při teplotě 20 °C. Materiál se pak aplikoval na chromatografií AMAC.
Chelatační ligand NTA (kyselina nitrilo-tri-octová) se přichytil na agarózový podklad (Qiagen) . Ligand NTA se nabil iontem niklu, se kterým interaguje přes 4 ze 6 míst niklu. Dvě zbývající koordinační místa interagují s histidinovými zbytky proteinu, který obsahuje 6x His-tag. Eluce se dosáhlo kompeticí s imidazolem, který se váže na Ni-NTA a nahrazuje antigen s tag.
Použil se Ni-NTA agaróza firmy Qiagen (kat. č. 30 250).
koordinačních niklu silně
Roztoky:
D: 6 M guanidinchlorid, 20 mM PO4 (NaH2PO4 (2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 7,0
E: 8 M močovina, 20 mM PO4 ((NaH2PO4 (2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 7,0
F: E + 0,025 M imidazol
G: E + 0,lM imidazol
Η: E + 0,5 M imidazol
0,5 M NaOH deionizovaná voda
0,02 % NaN3
Čištění:
a) Kolona se naplnila pryskyřicí (15 ml pryskyřice/230 ml vzorku) a uvedla se do rovnováhy 10 objemy kolony (C.V.) pufru D při rychlosti průtoku 15 cm/hod.
b) Supernatant s rozpouštěné frakce se vnesl injekcí do kolony při rychlosti 15 cm/hod.
c) Kolona se promyla při rychlosti 15 cm/hod. pufrem D až hodnota OD při vlnové délce 280 nm dosáhla hodnoty pozadí.
d) Kolona se promývá 2 objemy kolony pufru E při rychlosti průtoku 15 cm/hod. Shromažďují se promývací frakce.
e) Kolona se nejprve vymývá 5 objemy kolony pufru F. Odstraní se hlavní kontaminant s molekulovou hmotností 25 000.
f) Kolona se vymývá 2 objemy pufru G.
g) Kolona se nakonec vymyje 3 objemy pufru H. Dojde k eluci antigenu.
Frakce obsahující antigenn se spojí (30 ml).
Endotoxin se odstraní chromatografií na Affiprep.
Podklad Affi-Prep® Polymixin obsahuje polymixin B odpovídající stupni čistotě USP spojený s Affi-Prep® Matrix. To způsobuje jeho vysoká afinita k části lipidu A endotoxinů. Polymixin B váže molekuly endotoxinu s vysokou kapacitou a selektivitou.
Roztoky:
Ε: 8M močovina, 30 mM P04 ( (NaH2PO4 (2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH
7,0 (apyrogenní).
0,5 M NaOH deionizovaná apyrogenní voda
Postup:
1) pryskyřice Affi-Prep® Polymixin se promyje 10 objemy 0,1 M roztokem NaOH, pak následuje promytí 10 objemy vody bez pyrogenů.
2) Pryskyřice se přivede do rovnováhy 10 objemy pufru E.
3) 15 ml (polovina shromážděného eluátu) vzorku eluovaného z kolony IMAC se inkubuje s 3 ml pryskyřice Affi-Prep® Polymixin ve vsádkovém modu.
4) Inkubace probíhá při teplotě místnosti po dobu 4 hodin nebo přes noc při teplotě 4 °C na otáčejícím se kole.
• ♦ * ··» ···· • ···· · ···· · · · · • · ··· · ··· · · · • · · ·· · ···· • · · · · ·« ··· ·· ··
5) Vzorek se centrifuguje po dobu 10 minut při 2 000 g (Beckman GS-6R).
6) Shromažďuje se supernatant obsahující antigen a provedou se testy analyzující endotoxiny a protein.
7) Pryskyřice je vyřazena.
Malé molekuly procházejí semi-permeabilní membránu, zatímco velké molekuly zůstávají. Proces dialýzy je řízen rozdílem koncentrace rozpuštěné látky na dvou stranách membrány. Zavádí se nový roztok pufru až složení pufru se na každé straně vyrovná.
Pufry:
I: 4 M močovina, 0,5 M arginin, 10 mM P04 (NaH2PO4 (2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 6,8
J: 2 M močovina, 0,5 M arginin, 0,15 M NaCl, 10 mM PO4 (NaH2PO4 (2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 6,8
K: 0 M močovina, 0,5 M arginin, 0,15 M NaCl, 10 Μ PO4 (NaH2PO4 (2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 6,8
1) Vzorek (o objemu 15 ml) se zavedl do dialyzační trubice (průměr 20,4 mm a výška 6 cm).
2) Dialyzační trubice se umístila do 2 litrového cylindru, který obsahuje pufr I za stálého míchání při teplotě 4 °C a po dobu 2 hodin.
3) Dialyzační trubice se umístila do 2 litrového cylindru, který obsahuje pufr J za stálého míchání při teplotě 4 °C po dobu 2 hodin.
4) Dialyzační trubice se umístila do 2 litrového cylindru, který obsahuje pufr K za stálého míchání při teplotě 4 °C a přes noc. Pufr se vyměnil a dialýza probíhá další 2 hodiny při teplotě 4 °C.
(Použilo se Mollipore Sterile Millex-GV 0,22 μ, 13 mm.
Kat. č. SLGV0130S.
Všechny kroky se uskutečnily při teplotě místnosti (=22 °C). Antigen se jeví být stabilní.
• · · ·
Roztok antigenu se filtruje skrz filtr s póry 0,2 pm, aby se předešlo libovolnému bakteriálnímu růstu. Antigen se uchovává při teplotě -20 °C ve zkumavkách Nunc.
Charakterizace:
ProteinDl/3E6His je charakterizován následujícím způsobem:
ProteinDl/3E6His je peptid obsahující 273 aminokyselin, přičemž 112 aminokyselin pochází z části proteinu D. Teoretická molekulová hmotnost fúze proteinDl/3E6His je 32 000 a migruje na gelu SDS-PAGE jako protein s molekulovou hmotností 33 000. Teoretický bod fúze proteinDl/3E6His je
8,17.
Virový protein E6 je základní protein obsahující 14 cysteinových zbytků, přičemž 8 z nich (Cys 30, 33, 63, 66 a
Cys 103, 106, 136, 139) se podílí na dvou C-terminálních vazebných motivech zinku.
ProteinDl/3E6His se exprimuje v nerozpustné formě v mikroorgaznimu E. coli kmen £R58 spolu thioredoxinem v poloze trans. Buněčná kultura se produkuje v kultivačních lahvích o objemu 400 ml. Z jednoho litru kultury je možné získat 5,4 mg proteinu o čistotě 95 %.
Příklad 6: : Konstrukce fúze protein D1/3-E6E7-HÍS(HPV16) kmene mikroorganizmu exprimující se v E. coli
1) Konstrukce expresívního plazmidu
a) Plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu přihláška UK patentu č. 951 3261.9, který se zveřejnil jako W097/01640), ve kterém kodony 4-81 NS1 kódující oblasti z Influenzae se nahradily kodony korespondujičími se zbytky Ser 20 —> Thr 127 zralého proteinu D Haemophilius influenzae, kmen 772, biotyp 2 (popisuje se v publikaci H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. P. 119-125). Po sekvenci Prot-Dl/3 následuje vícenásobné klonovací místo ( 11 zbytků) a • · • *
kódující oblast C-terminálního histidinového ocasu (6 His). Tento plazmid se použil při expresi fúzního proteinu Dl/3E6E7-his.
b) HPV genomové sekvence E6 a E7 typ HPV 16 (popisuje se v publikaci Dorf et al., Virology 1985, 145, p.181-185) se amplifikovaly z genomu HPV 16 plné délky klonovaného do pBR322 (získal se z instituce Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses-D 69120-Heidelberg) a subklonovaly se do pUC19 za vzniku TCA 301 (=pRITl4462).
c) Kódující sekvence E6 a E7 v TCA301 (=pRIT14462) se upravily syntetickým oligonukleotidovým adaptorem (začleněným mezi restrikční místa AflIII a Nsil), který vytváří deleci 5 nukleotidů mezi geny E6 a E7 za účelem odstranění stop kodonu E6 a vzniku kódujících sekvencí E6 a E7 v plazmidu TCA309 (=pRIT14556) (zobrazuje obrázek č. 4).
Konstrukce plazmidu TCA311(=pRIT14512): plazmid exprimující fúzi protein-Dl/3-E6E7-His/HPV16
Nukleotidové sekvence odpovídající aminokyselinám 1 —> 249 proteinu E6E7 se amplifikovaly z pRIT14556. Během polymerázové řetězcové reakc vznikly na 5'a 3' koncích sekvencí E6E7 restrikční místa Ncol a Spěl, která umožňují inzerci do stejných míst plazmidu pMGMCS Prot Dl/3 za vzniku plazmidu TCA311(=pRIT14512). Inzert se sekvenoval, aby se ověřilo, zda během polymerázové řetězcové reakce nedošlo k žádným modifikacím. Kódující sekvence uvedené fúze protein-Dl/3-His se popisuje na obrázku č. 6.
2. Transformace kmene AR58
Plazmid pRIT14501 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) defektivního λ lysogenu obsahující represor promotoru λ pL citlivého na teplo.
3) Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese Prot-Dl/3E6E7-HÍS
Buňky AR58 transformované plazmidem pRITl4512 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 gg/ml kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu Dl/3-E6E7-His. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
4) Charakterizace fúze protein Dl/3-E6E7-his
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzovaly elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem.
Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 48 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových blotech králičím polyklonálnim anti-proteinem D a Ni-NTA konjugátem spojeným s telecí intestinálni alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 1 % celkového proteinu.
Příklad 6b:
Fúzní protein Lipo Dl/3 a E6-E7 pocházející z HPV16 se exprimoval E. coli v přítomnosti thioredoxinu.
N-konec pre-proteinu obsahuje (388 aminokyselin) obsahuje MDP zbytky, po kterých následuje 16 aminokyselin signálního peptidů lipoproteinu D (z Haemophilius influenzae), který se štěpí in vivo za vzniku zralého proteinu (370 aminokyselin). Lipoproteinovou část (aminokyselina 1 až 127) následují proteiny E6 a E7 spojené ve fúzi. C-konec proteinu je prodloužen motivem TSGHHHHHH.
Protein se čistil podle následujícího protokolu:
Příklad 7: Čištění fúze lipoprotein Dl/3-E6-E7-His(TIT)
A) Rozpouštění:
Buněčná pasta se suspendovala v pufru 2 M NaCI, 20 mM fosforečnanu (NaH2PO4 (2H2O)/K2HPO4(3H2O)) pH 7,5 v přítomnosti 1 mM Pefabloc, který slouží jako inhibitor proteáz před lyží buněk, tak, aby se dosáhla hodnota OD při 600 nm 60. Lyže buněk se provedla třemi průchody zařízením „French press disruptor (140 MPa). Lyžované buňky se peletovaly po dobu 30 minut při 15 000 g při teplotě 4 °C. Za účelem redukovat množství endotoxinu, se bakteriální buněčný pelet obsahující rekombinantní protein dvakrát promyl 4M močovinou, 2 M NaCI, 20 mM fosforečnanem pH 7,5, jednou 2 % Empigen BB, 20 mM fosforečnan pH 7,5 a nakonec dvakrát 20 mM fosforečnanovým pufrem pH 7,0, aby se odstranily stopy detergentu (každé promytí se uskutečnilo v objemu, jako byl objem buněčné suspenze). LipoProt.Dl/3-E6-E7-His(TIT) se rozpustil (ve stejném objemu, jako byl objem buněčné suspenze) v 8 M močovině s 0,2 M β-merkaptoetanolem (βΜβΟΗ), 20 mM PO4 pH 12 přes noc při teplotě 4 °C. Pak následují dvě hodiny inkubace při teplotě místnosti. Buněčný debris se odstranil centrifugací po dobu 30 minut při 15 000 g při teplotě 4 °C.
Supernatant se uchovával při teplotě -20 °C.
B) Čištění:
1) Chromatografie s výměnou aniontů na Q-sefaróze s rychlým průtokem
Zmrazený vzorek o objemu 225 ml se rozmrazil při teplotě místnosti v lázni se studenou vodou a aplikoval se na kolonu s Q-sefarózou s rychlým průtokem (Pharmacia, XK 26/20), které se uvedla do rovnováhy 8 M močovinou, 0,2 Μ βΜΕΟΗ, 20 mM PO4 • ···· · ···· · * · · • · · · · Η ··· · « · • · · · · · · · « · • · · · · ·· ··· · · «· ρΗ12 (30 ml pryskyřice/225 ml supernatantu) při rychlosti průtoku 45 cm/hod.. Kolona se promývala 8 M močovinou, 0,2 M βΜΕΟΗ, 20 mM PO4 pH 12, až do doby, kdy hodnota optické hustoty při vlnové délce 280 nm dosáhla základní hodnoty. Pak následuje druhé promytí 8 M močovinou, 20 mM fosforečnanem pH (objemem, který odpovídá dvěma objemům kolony). Eluce se provedla NaCI (0,1 M, 0,25 M, 0,5 M NaCI, kdy v každém kroku se použil objem odpovídající 2 objemům kolony) v 8 M močovině, mM fosforečnanem pH 12 při rychlosti průtoku 45 cm/hod..
Shromáždily se frakce eluované 0,5 M NaCI.
2) Afinitní chromatografie s ionty kovu (IMAC)
Shromáždily se frakce eluované z Q sefarózy 0,5 M NaCI a dialyzovaly se proti 0,2 M NaCI, 8 M močovině, 20 mM fosforečnanu pHIO dříve než se nanesly na kolonu s NÍ2+NTA (Qiagen) (XK 26/20, Pharmacia), která se uvedla do rovnováhy 8 M močovinou, 20 mM PO4 pH 12 (30 ml pryskyřice/ 61 ml vzorku) při rychlosti průtoku 5,6 cm/hod. Kolona se promyla 8 M močovinou, 20 mM PO4 pH 12 až se dosáhlo základní hodnoty optické hustoty. Pak se kolona promyla 8 M močovinou, 20 mM PO4 pH 10. Antigen se eluoval imidazolovými kroky (0,025 M, 0,05 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,5 M imidazolem v každém kroku se použil objem odpovídající dvou objemům kolony) v 8 M močovině, 20 mM PO4 pH 10 při rychlosti průtoku 45 cm/hod. Shromáždily se frakce eluované 0,05 M imidazolem.
C) Koncentrace
Na membráně Filtron Omega (Amicon), která odděluje molekuly o molekulové hmotnosti 5 000, za stálého míchání při teplotě místnosti se zvýšila koncentrace vzorku přibližně 5 krát (0,407 mg/ml)
D) Dialýza • · · · ; · ; · j ; ! * ί i: * • · · · · ·· ··· ·· · ·
Koncentrovaný vzorek se dialyzoval při teplotě místnosti v krocích proti snižující se koncentraci močoviny (4M, 2 M močovina) v 0,5 M argininu, 150 mM NaCl, 10 mM PO4 pH 6,8. Poslední dialýza proti 0,5 M argininu, 150 mM NaCl, 10 mM PO4 pH 6,8 proběhla při teplotě 4 °C.
Výsledky:
Krok IMAC je schopen odstranit kontaminanty s molekulovou hmotností 32 000 v 0,0025 M imidazolu, který eluuje také stejný antigen. Čistota antigenu eluovaného 0,05 M imidazolem se odhaduje na gelu SDS-PAGE obarveným Coomassieovou modří na 90 %. Po tomto kroku čištění vzorek neobsahuje žádné kontaminanty mikroorganizmu E. coli. Analýza westernovým přenosem užívající protilátky specifické k N- a/nebo C-konci antigenu vykazuje heterogenní patern pruhů s vyšší a nižší molekulovou hmotností proteinu v plné délce. Tento patern naznačuje přítomnost agregátů a neúplně zpracovaného proteinu a/nebo degradovaného proteinu, který se společně čistily s proteinem v plné délce.
Příklad 8: Konstrukce fúze ProtDl/3-E7, která se exprimuje v E. coli kmen B1002
Mutovaný (cys24 -> gly, glu26 -> gin) typ HPV16
1) konstrukce expresívního plazmidu
Počáteční materiál:
a) plazmid pRIT14501 (=TCA 308), který kóduje fúzi ProtDl/3E7-HÍS
b) plazmid LITMUS 28 (New England Biolabs kat. č. 306-28) klónovací vekotr odvozený od pUC
c) plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu přihláška UK patentu č. 951 3261.9, který se zveřejnil jako W097/01640), ve kterém kodony 4-81 NS1 kódující oblasti z Influenzae se nahradily kodony korespondujícími se zbytky Ser 20 —> Thr 127 zralého proteinu D Haemophilius influenzae, kmen 772, (popisuje se v publikaci H. Janson et al., 1991, and Immunity, Jan. P. 119-125). Po sekvenci následuje vícenásobné klonovací místo (11 zbytků)a oblast C-terminálního histidinového ocasu (6 His).
biotyp 2 Infection Prot-Dl/3 kóduj ící
Konstrukce plazmidu pRIT 14733(=TCA347): plazmid exprimující fúzi protein-Dl/3-E7 mutovaný (cys24 -> gly, glu26 -> gin) s koncem His
Fragment Ncol-Xbal z pRIT14501(=TCA 308) nesoucí kódující sekvenci genu E7 pocházející z HPV 16 prodloužený koncem Hisse subklonoval do vektoru Litmus 28 použitelného pro mutagenezi za vzniku pRIT 14909(=TCA337). Dvojitá mutace cys24 —» gly (popisuje se v publikaci Edmonds and Vousden, J. Virology 63: 2650 (1989) a glu26 —> gin (popisuje se v publikaci Phelps et al., J. Virology 66: 2418-27 (1992) se vybrala za účelem omezení navázání antionkogenního produktu genu retinoblastomu (pRB) . Zavedení mutací genu E7 se realizovalo kítem „Quick Change Site directed Mutagenesis (Stratagene kat. č. 200518) za vzniku plazmidu pRIT 14681(=TCA343). Po ověření přítomnosti mutací a integrity celého genu E7 sekvenováním se mutovaný gen zavedl do vektoru pRIT 14589 (=pMG MCS ProtDl/3) za vzniku plazmidu pRIT 14733 (=TCA347) (obrázek č.7).
Sekvence fúze proteín-Dl/3-E7 mutovaný (cys24 -» gly, glu26 —> gin)-His se popisuje na obrázku č. 8.
2) Konstrukce fúze protDl/3-E7mutovaný(cys24 —> gly, glu26 —> gin)-His/HPV16
Plazmid pRIT14733 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) detektivního λ lysogenu obsahující represor promotoru λ pL citlivého na teplo za vzniku kmene B1002. Selekce transformantů se provedla na základě rezistence na kanamycin.
• · · · • # • · · »
3) Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese Prot-Dl/3-E7mutovaný (cys24 —> gly, glu26 gin)-His/HPV16
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14733 (kmen B1002) se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μρ/ιηΐ kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu Dl/3-E7mutovaný-His. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
4) Charakterizace fúze protein D1/3-E7- mutovaný(cys24 —> gly, glu26 —> gin)-His typ HPV16
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzovaly elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem.
Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 33 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových blotech králičím polyklonálním 22 J 70 anti-proteinem D, monoklonálním antiE7/HPV16 z Zymed a Ni-NTA konjugátem spojeným s telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. '34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 3 až 5 % celkového proteinu.
Buňky B1002 se separovaly z kultivační půdy centrifugací. Koncentrované buňky B1002 se uchovávaly při teplotě -65 °C.
Příklad 9: Čištění PROTD1/3E7(Dmutant)HPV16 • · · · • · • ·
Obecné schéma čištění -HPV16E7
Rozmražené buňky získané po fermentací v
Porušení buněk i
ί homogenát
Diafiltrace/zakoncentrování/rozpuštění DMF
Konečný permeát (uchováváno při teplotě -20 v °C)
Zn-chelatace, chromatografie na sefaróze eluát
Ψ chromatografie na Q-sefaróze eluát v
diafiltrace a zakoncentrování/molek. hm. 10 000-UF Filtron dialyzovaný roztok
Ψ sterilní filtrace 0,22 μΜ cistený roztok 0,5 až 1,0 mg/ml, uchovávání pří teplotě -20 °C
a) Příprava buněčné suspenze
Zmrazené koncentrované buňky B1002 se rozmrazily a při teplotě 4 °C se resuspendovaly v pufru vhodném pro otevření buněk (tabulka č. 1) tak, aby konečná hodnota optické hustoty při vlnové délce 650 nm byla 60 (což odpovídá koncentraci buněk přibližně 25 g DCW/1).
b) Otevření buněk
Buňky se otevřely dvěma průchody vysokotlakového homogenizéru (Rannie) (1 000 barů). Suspenze otevřených buněk se umístila do nádoby a uchovávala se při teplotě 4 °C.
Pufr vhodný pro otevření buněk má následující složení: Na2HPO4 (0,02N), NaCI (2M) pH se upravilo na hodnotu 7,5 pomocí 3M HCl (Merck).
Čištění:
2a) dynamická filtrace přes membránu (DMF®-Pall Filtron)
Suspenze otevřených buněk o objemu 2 1 se nanesla na DMF , což je dynamický filtrační systém od firmy Pall, který obsahuje membránu, jenž odděluje částice o velikosti 0,2 μτη. .
Zakoncentrováním z objemu 2 litry na 1 litr vzniká vzorek
PCC1.
Promýváním při konstantním objemu se třemi objemy (3L) pufru obsahující empigen-EDTA (koncentrace EDTA 1,86 g, empigen (30 %) 3,33 ml, PO4 3- 0,5 M 40 ml) vznikne vzorek PD1.
Zakoncentrováním objemu 11 na 300 ml vznikne vzorek PCC2.
Promýváním při konstantním objemu s deseti objemy (3L) pufrem pH 7,5 obsahující empigen (v jednom litru je obsažen empigen (30 %) 3,33 ml, PO4 3' 0,5 M 40 ml) vznikne vzorek.
Rozpuštěním proteinu přidáním stejného množství (300 ml) pufru pH 7,5, který obsahuje 8 M guanidinhydrochlorid (v jednom litru je obsažen empigen (30 %) 3,33 ml, Gu.HCl 764 g,
PO4 3' 0,5 M 4 0 ml) .
Získání proteinu : shromážděním dialyzovaného roztoku (vzorek P3) během zakoncentrování na počáteční objem (300 ml) a diafiltrací s třemi objemy pufru pH 7,5, který obsahuje 4 M guanidinhydrochlorid (množství v jednom litru: Gu-HCl 328,1 g, empigen (30 %) 3,33 ml, PO4 3- 0,5 M 40 ml) .
Všechny tyto kroky se uskutečnily v chladničce (při teplotě 2 až 8 °C) , pH se upravilo 0,5 M PO4 3-.
Frakce P3 se uchovávala při teplotě -20 °C do dalšího kroku čištění.
2b) Zn-chelatační sefarózová chromatografie
Frakce P3 se rozmrazila a injekcí se zavedla do kolony naplněné Zn-chelatační sefarózou, která je v rovnováze.
Kolona se promyje:
Třemi objemy pufru 4M guanidin hydrochloridů (popisuje se shora v textu) vznikne vzorek Zn-FT a objemy pufru tvořeného 4M močovinou (v jednom litru obsahuje 240,24 g močoviny, 3,33 ml empígenu, 40 ml 0,5 M PO4 3' vzniklý vzorek se označí Zn-W.
Kolona se eluuje 3 objemy pufru, který obsahuje 4M močovinu a 29 mM imidazol (v jednom litru obsahuje 240,24 g močoviny, 3,33 ml empígenu (1, 35g) , 40 ml 0,5 M PO4 3 pH je 7,5) vzniklý vzorek se označí. Pufr je stejný, jako ten uvedený shora v textu, ale množství imidazolu v jednom litru je 34,04 g. Vznikne vzorek Zn-20.
Kolona se dále eluuje 4M močovinou a 500 mM imidazolem až do konce UV píku . Vznikne vzorek Zn-500.
Kolona se promyje 50 mM EDTA a 0,5 M NaOH.
Eluát Zn-chelatační sefarózy (Zn-500) se uchovává při teplotě 2 až 8 °C až do dalšího kroku čištění.
Zn-chelatační sefarózová chromatografie se provádí při teplotě místnosti.
2c) Q-sefarózová chromatografie • V » · fefe * ‘ · · · * · · · · * · • · · · * ·
Frakce Zn-500 se vnesla injekcí do kolony naplněné Qsefarózou FF, která je v rovnováze.
Kolona se promyje:
objemy pufru 4M guanidin hydrochloridu (popisuje se shora v textu) vznikne vzorek QS-FT.
objemy pufru tvořeného 4M močovinou (v jednom litru obsahuje 240,24 g močoviny, 40 ml 0,5 M PO4 3' vzniklý vzorek se označí QS-W1.
objemy pufru tvořeného 6M močovinou (v jednom litru obsahuje 360,3 g močoviny) vzniklý vzorek se označí QS-W2.
Kolona se eluuje 5 objemy pufru, který obsahuje 6M močovinu a 200 mM NaCl (v jednom litru obsahuje 360,3 g močoviny, 11,69 g NaCl, 40 ml 0,5 M PO4 3’ pH je 7,5)
Kolona se dále eluuje 3 objemy 6M močoviny a 500 mM NaCl (stejný jako shora v textu popsaný s výjimkou, že množství NaCl v jednom litru je 29,22 g) . Skutečný konec frakce se stanovil koncem UV píku. Vznikl vzorek QS-500.
Kolona se dále eluuje 4 objemy 4M močoviny a 1M NaCl ( množství NaCl v jednom litru je 58,44 g, 360,36 g močoviny, 40 ml 0,5 M PO4 3-) . Vznikl vzorek QS-1M.
Kolona se promyje 0,5 M NaOH.
Eluát z QS-sefarózy (QS-500) se uchovává při teplotě 2 až 8 °C až do dalšího kroku čištění.
Q-sefarózová chromatografie se provádí při teplotě místnosti.
2d) Ultrafiltrace
Frakce QS-500 se pak ošetřila na ultrafiltrační jednotce dělící molekuly s molekulovou hmotností 10 000 (UltrasettePall Filtron)
Produkt se nejdříve zakoncentruje na koncentraci 1 mg/ml proteinu a pak se diafiltruje proti 10 objemům fosforečnanového pufru.
• 9 *999 • * · · > · • 9 · 9 9 9 9999 · :: : · : : : ·:
•9 «·9 99 999
Permeát (frakce UF-P) se znehodnotí a dialyzovaný roztok (frakce UF-R) se uchovává při teplotě 2 až 8 °C až do konečné filtrace.
Ultrafiltrace se provede při teplotě 2 až 8 °C.
2e) Konečná filtrace
Konečná frakce (frakce UF-R) se filtruje sterilním filtrem o velikosti pórů 0,22 pm (Millipak-Millipore) při laminárním průtoku v aseptické místnosti třídy 100.
Konečná koncentrace proteinu je mezi 0,5 a 1,0 pg/ml.
Sterilní frakce se uchovává při teplotě -20 °C.
Příklad 10: Konstrukce fúze clyta-E6-his(HPV16) , která se exprimuje v kmenu E. coli
1. konstrukce expresívního plazmidu
a) Plazmid pRIT14497 (=TCA307), který kóduje fúzi ProtDl/3-E6His/HPV16
b) Plazmid pRITl4661(=DVA2 je vektor obsahující kódující sekvenci 117 C-terminálních kodonů LytA mikroorganizmu Streptococcus pneumoniae. Lyta se získala z mikroorganizmu Streptococcus pneumonia, který syntetizuje N-acetyl-Lalaninamidázu (amidáza LYTA) (kódovaná genem LytA (Gene, 43 (1986) pag. 265-272). Je to autolyzin, který specificky degraduje jisté vazby v řetězci peptidoglykanu. Cterminální oblast proteinu LYTA je odpovědná za afinitu cholinu nebo některých cholinových analogů, jako je DEAE.
l.b Konstrukce plazmidu pRIT14634(=TCA332): plazmid exprimující fúzi clyta-E6-His/HPV16
a) Prvním krokem je čištění velkého restrikčního fragmentu Ncol - AflII z plazmidu pRIT14497 a čištění malého restrikčního fragmentu AflII-AflIIz pRIT14661.
b) Druhým krokem je spojení sekvencí clyta se sekvencemi E7His (Ncol a AflIII jsou kompatibilní restrikční místa), ·· *»»» «· ·»·· »· «· • * * · « ·»«· • ···· · β·*· * * · * • · · » ♦ · 9 · · ·· · která dávají vzniku plazmidu pRIT 14634(=TCA332), jenž kóduje fúzní protein clyta-E6-His řízený promotorem pL (obrázek č. 9).
c) Kódující sekvence fúzního proteinu clyta-E6-His se popisuje na obrázku č. 10.
Transformace kmene AR58
Plazmid pRIT14634 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 38) defektivního λ lysogenu obsahujícího represor citlivý na teplo promotoru λ pL.
Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese clyta-E6-His
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14364 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μρ/πιΐ kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu clyta-E6-his. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
Charakterizace fúze clyta-E6-his
Zmrazené buňky se nechaly rozrát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Po centrifugaci extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem. Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 33 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových biotech králičími polyklonálními anti-clyta protilátkami a Ni-NTA konjugátem spojeným s telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), ·· **·· ♦· ···· ·· ·· » · * · · >. · »-.*·· · 6 · · · ·
0-7 · ·** » · 4 « ··«'«»
O / ·· · · * ···<:« ·· ··· 44 444 49 94 které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 3 % celkového proteinu.
Příklad 11: Konstrukce fúze clyta-E7-his (HPV16) exprimující se v kmeni E. coli.
1. konstrukce expresívního plazmidu
l.a počáteční materiály
a) Plazmid pRIT14501(=TCA308), který kóduje fúzi PortDl/3-E7His/HPV16
b) Plazmid pRITl4661 (=DVA2) obsahuje kódující sekvenci 117 Cterminálních kodonů LytA mikroorganizmu Streptococcus Pneumoniae.
1. b Konstrukce plazmidu pRITl4626 (=TCA330): plazmid exprimující fúzi clyta-E7-His/HPV 16
a) Prvním krokem je čištění velkého restrikčního fragmentu Ncol - AflII z plazmidu pRIT14501 a čištění malého restrikčního fragmentu AflII-AflIII z pRITl4661.
b) Druhým krokem je spojení sekvencí clyta se sekvencemi E7His (Ncol a AflIII jsou kompatibilní restrikční místa), která dávají vzniku plazmidu pRIT 14626(=TCA330), jenž kóduje fúzní protein clyta-E7-His řízený promotorem pL (obrázek č. 11).
Kódující sekvence fúzního proteinu clyta-E7-His se popisuje na obrázku č. 12.
2. Transformace kmene AR58
Plazmid pRIT14626 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al.,
1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) defektivního λ lysogenu obsahujícího represor citlivý na teplo promotoru λ pL.
3. Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese clyta-E7-His
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14626 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μg/ml kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se • · teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu clyta-E7-his. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
4. Charakterizace fúze clyta-E7-his
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem. Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 35 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových blotech králičími polyklonálnimi anti-clyta protilátkami a Ni-NTA konjugátem spojeným s telecí intestinálni alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 5 % celkového proteinu.
Příklad 12: Konstrukce fúze clyta-E6E7-his(HPV16) , která se exprimuje v kmeni E. coli
1. konstrukce expresívního plazmidu
l.a počáteční materiály (a) Plazmid pRIT14512(=TCA311) , který kóduje fúzi ProtDl/3E6E7-His/HPV16 (b) Plazmid pRITl4661 (=DVA2) obsahuje kódující sekvenci 117
C-terminálnich kodonů LytA mikroorganizmu Streptococcus
Pneumoniae.
l.b Konstrukce plazmidu pRIT14629 (=TCA331): plazmid exprimující fúzi clyta-E6E7-His/HPV 16 • · · · ·· ···· ·· ·· •·· ··* ···· n ····· ····· · · · · jy · * ♦ · · · ··»··· ·· ........
• · · · · · · ··· · · ··
a) Prvním krokem je čištění velkého restrikčního fragmentu Ncol - AflII z plazmidu pRITl4512 a čištění malého restrikčního fragmentu AflII-AflIII z pRIT14661.
b) Druhým krokem je spojení sekvencí clyta se sekvencemi E7-His (Ncol a AflIII jsou kompatibilní restrikční místa), která dávají vzniku plazmidu pRIT 14629(=TCA331) , jenž kóduje fúzní protein clyta-E6E7-His řízený promotorem pL (obrázek č. 13) .
Kódující sekvence fúzního proteinu clyta-E6E7-His se popisuje na obrázku č. 14.
2. Transformace kmene AR58
Plazmid pRIT14629 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al.,
1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) defektivního λ lysogenu obsahujícího represor citlivý na teplo promotoru λ pL.
3. Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese clyta-E7-His
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14629 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μρ/πιΐ kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu clyta-E6E7-his. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
4. Charakterizace fúze clyta-E6E7-hís
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem.
• · · · > · · ( » * · 4 » · · 4
Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 48 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových blotech králičími polyklonálními anti-clyta protilátkami a Ni-NTA konjugátem spojeným s telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 1 % celkového proteinu.
Příklad 13: ProtDl/3E7his(HPV18)(E. coli B1011)
ProteinDl/3E7hisHPV exprimovaný thioredoxinem v poloze trans (E. coli B1012)
1) Konstrukce expresívních plazmidů
l.a. Konstrukce plazmidu TCA316(=pRIT14532) plazmid exprimující fúzi protein-Dl/3-E7-His/HPV18
Počáteční materiál
a) Plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu přihláška UK patentu č. 951 3261.9, který se zveřejnil jako W097/01640), ve kterém kodony 4-81 NS1 kódující oblasti z Influenzae se nahradily kodony korespondujícími se zbytky Ser 20 -» Thr 127 zralého proteinu D Haemophilius influenzae, kmen 772, biotyp 2 (popisuje se v publikaci H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. P. 119-125). Po sekvenci Prot-Dl/3 následuje vícenásobné klonovací místo (11 zbytků)a kódující oblast C-terminálního histidinového ocasu (6 His) (obrázek č. 15). Tento plazmid se použil při expresi fúzního proteinu D1/3-E7-HÍS.
b) HPV genomové sekvence E6 a E7 typ HPV 18 (popisuje se v publikaci Cole et al., J. Mol. Biol. (1987) 193, 599-608) se amplifikovaly z genomu HPV 18 plné délky klonovaného do pBR322 (získal se z instituce Deutsches
Krebsforschungszentrum (DKFZ) , Referenzzentrum fur human • · · · • ·
4- --www V » « V ···· ·· ··♦· ···«·· ·· · ♦ · ····· • · ··· ·· ··· « · · · pathogen Papillomaviruses-D 69120-Heidelberg) a subklonoval se do pUC19 za vzniku TCA 302 (=pRIT14467).
Konstrukce plazmidu TCA 316 (=pRIT14532
Nukleotidové sekvence odpovídající aminokyselinám 1 —> 105 proteinu E7 se amplifíkovaly z pRIT14467. Během polymerázové řetězcové reakce vznikly na 5'a 3'koncích sekvencí E7 restrikční místa Ncol a Spěl, která umožňují inzerci do stejných míst plazmidu pMGMCS Prot Dl/3 za vzniku plazmidu TCA316(=pRIT14532) . Inzert se sekvenoval, aby se ověřilo, zda během polymerázové řetězcové reakce nedošlo k žádným modifikacím. Srovnáním se sekvencí prototypu E7/HPV18 se identifikovaly modifikace genu E7 (nukleotid 128 G—»A) , které generují substituci glycinu kyselinou glutamovou (aminokyselina 43 v E7, poloha 157 ve fúzním proteinu). Sekvence uvedené fúze protein-Dl/3-E7-His/HPV 18 se popisuje na obrázku č. 16.
l.b. Konstrukce plazmidu TCA313(=pRITl4523): plazmid exprimující thioredoxin
Počáteční materiál
a) Plazmid pBBRlMCS4 (Antoine R. and C. Locht, Mol. Microbiol. 1992, 6, 1785-1799, Μ. E. Kovach et al., Biotechniques 16:
(5), 800-802), který je kompatibilní s plazmidy obsahujícími počátky replikace ColEl nebo Pl5a.
b) Plazmid pMG42 (popisuje se v dokumentu WO93/04175) obsahující sekvenci promotoru pL fágu lambda,
c) Plazmid pTRX (Invitrogen, kit Thiofusion K350-01) nesoucí kódující sekvenci thioredoxinu následovanou terminátorem transkripce AspA.
Konstrukce plazmidu TCA313(=pRIT14523) ♦ · · · :**· ......
• · ·· · · · · · • * · · · · · ··· · > t ·
Fragment EcoRI-Ndel pocházející z pMG42 nesoucí promotor pL a fragment Ndel-HindlII pocházející z pTRX nesoucí kódující sekvenci thioredoxinu, po níž následuje terminátor AspA, se čistily a ligovaly do restrikčních míst EcoRI a HindlII plazmidového vektoru pBBRlMCS4 za vzniku plazmidu TCA313(=pRIT14523) (zobrazeno na obrázku č. 17).
Sekvence thioredoxinu se popisuje na obrázku č. 18.
2) Transformace kmene AR58
2.a. Získání kmene B1011 exprimujícího ProtDl/3-E7-His/HPV18
Plazmid pRIT14532 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) defektivního λ lysogenu obsahujícího represor citlivý na teplo promotoru λ pL. Selekce transformantů proběhla v závislosti ne rezistenci na kanamycin.
2.b. Konstrukce kmene B1012 exprimující ProtDl/3-E7-His/HPVl8 a thioredoxin
Plazmid pRITl4532 a pRIT14523 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) defektivního λ lysogenu obsahujícího represor citlivý na teplo promotoru λ pL. Selekce transformantů proběhla v závislosti na rezistenci na kanamycin a ampicilin.
3. Růst a indukce bakteriálních kmenů B1011 a B1012 - Exprese fúze Prot-Dl/3-E7-His/HPV18 aniž se exprimuje thioredoxin v poloze trans a nebo se společnou expresí s thioredoxinem v poloze trans.
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14532 (kmen B1011) a buňky AR58 transformované plazmidy pRTI14532 a pRIT14523 (kmen B1012) se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μρ/ιηΐ kanamycinu při teplotě 30 °C (v případě buněk kmene B1012 se přidalo 100 μς/πιΐ kanamycinu a • * • · 9 · • ♦ · ·
| 43 | • · · · ♦ · • · · · · • · · · · | ···· · · · · • « · ♦ « · · • · ··· ·· ·· | |
| ampicilinu) | . Během logaritmické | fáze růstu se | teplota zvýšila |
| na 39 °C, | aby se deaktivoval | represor λ a | začala syntéza |
| proteinu | Dl/3-E7-his/HPV18 a | thioredoxinu. | Inkubace při |
teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterii a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
Charakterizace fúze protein Dl/3-E7-his/HPV18
Příprava extraktu
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval pří 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Analýza SDS-polyakrylamidových gelů barvených podle Coomassie a westernový bloty
Po centrifugaci extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem.
Fúze protDl/3-E7-His ( o molekulové hmotnosti přibližně 31 000) lokalizovaný v peletové frakci B1012 se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie. V případě kmene B1012 se tato fúze identifikovala částečně (30 %) ve frakci supernatantu. Fúze se identifikovala na westernových blotech králičím polyklonálním anti-proteinem D a Ni-NTA konjugátem spojeným telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 1 až 3 % celkového proteinu, jak se potvrdilo na SDS-polyakrylovém gelu obarveném podle Coomassie.
V případě extraktu kmene B1012 se thioredoxin (o molekulové hmotnosti přibližně 12 000) vizualizoval v supernatantu barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se westernovými bloty monoklonálním anti-thioredoxinem (Invitrogen R920-25).
Čištění ProtDl/3E7-his/HPV18
Rekombinantní fúze HPV 18-ProtDl/3-E7-His se exprímovala v mikroorganizmu E. coli (jak se popisuje shora v textu) kmen AR58. Všechny kroky se uskutečnily při teplotě místnosti (RT přibliřně 22 °C) . Proteiny se sledují monitorováním hodnoty OD při vlnové délce 280 nm. Mezi jednotlivými kroky frakce pozitivní na antigen se uchovávají při teplotě -20 °C.
Čištěný antigen je stabilní po dobu jednoho týdne při teplotě -20 °C a 4 °C (nedochází k degradaci) , ale jeví se být více citlivý vůči oxidaci po inkubaci při teplotě 37 °C.
d) Rozpustnost
Rozpustnost proteinu je závislá na pH (popisuje se dále v textu), přičemž při hodnotě' pH nižší než 7,4 rozpustnost klesá:
| PBS pH 7,4 | 686 pg/ml | 100 % |
| PBS pH 7,2 | 560 μρ/ml | 81 % |
| PBS pH 7,0 | 498 pg/ml | 72 % |
| PBS pH 6,8 | 327 pg/ml | 48 % |
e) Protein HPV 18 Prot Dl/3 E7 se skládá z 227 aminokyselin. Jeho teoretická molekulová hmotnost je 25 900 a teoretický izoelektrický bod je 5,83. Při SDS PAGE v redukčním prostředí tento protein migruje do vzdálenosti odpovídající molekulové hmotnosti 31 500.
Příklad 14: Čištění HPV 18 protein Dl/3 E7
a) rozpustnost:
Buněčná pasta se suspendovala v pufru 2 M NaCI, 20 mM fosforečnanu (NaH2PO4/K2HPO4) pH 7,6. Lyže buněk se provedla dvěma průchody zařízením „Rannie disruptor. Lyžované buňky se peletovaly po dobu 30 minut při 9 000 ot./min. v rotoru JA 10 při teplotě 4 °C. Za účelem redukovat množství endotoxinu, se bakteriální buněčný pelet obsahující rekombinantní protein • · « · jednou promyl v pufru obsahujícím 5 mM EDTA, 2 M NaCl, PBS pH 7,4, dále se jednou promyl 4M močovinou, 20 mM fosforečnanem pH 7,4, a nakonec PBS pH 7,4, aby se odstranily stopy EDTA (každé promytí se uskutečnilo v objemu, odpovídajícímu objemu buněčné suspenze). HPV18-Prot-Dl/3-E7-His(TIT, thioredoxin v poloze trans) se rozpustil (ve stejném objemu, jako byl objem buněčné suspenze) v 6 M guanidinchloridu, 50 mM P04 pH 7,6 přes noc při teplotě 4 °C. Buněčný debris se odstranil centrifugací po dobu 30 minut při 9 000 ot./min. při teplotě 4 °C na rotoru JA 10. Supernatant se doplnil 0,5 % empigenem BB a inkuboval se po dobu 30 minut při teplotě místnosti.
b) Čištění:
l.a. Imobilizovaná kovová afinitní chromatografie
Vzorek o objemu 125 ml se nanesl na Zn2+-chelatační sefarózovou FF kolonu (XK 26/20 Pharmacia, 50 ml gelu /125 ml), která se předem uvedla do rovnováhy 0,5 % empigenem BB, 6 M guanidinchloridem, 50 mM PO4 pH 7,6 při průtokové rychlosti 4 ml/min. Kolona se promyje 6M guanidinchloridem, 50 Μ PO4 pH 7,6, 50 mM PO4 pH 7,6 až se dosáhne základních hodnot, pak 6 M močovinou, 0,5 M NaCl, 50 mM PO4 pH 7,6. Antigen se eluoval 0,25 M imidazolem obsaženým v 6 M močovině, 0,5 M NaCl, 50 mM P04 pH 7,6 při průtokové rychlosti 2 ml/min (obrázek č. 1B) . Vzorek eluovaný z IMAC se dialyzoval při teplotě 4 °C proti PBS pH 7,4.
l.b. Affi-Prep®Polymixin (Bio-Rad)
Za účelem redukovat množství endotoxinu se 28 mg (37 ml) antigenu inkubovalo ve vsádkovém módu s 2 ml pryskyřice Affiprep Polymyxin, která se uvedla do rovnováhy PBS pH 7,4 přes noc při teplotě místnosti. Získalo se přibližně 60 % proteinu a obsah endotoxinu se snížil 6,5 krát.
l.c. Analýza
Čištěný antigen se analyzoval na redukčním SDS-PAGE a zobrazil se jako dva pruhy odpovídající molekulové hmotnosti 30 000 respektive 55 000. Gel se obarvil Coomassieovou modří nebo stříbrem. Při jednom SDS-PAGE při podmínkách, které nejsou redukční se HPV-18-ProtDl/3-E7-His jevil jako šmouha, přičemž molekulová hmotnost se odhaduje na hodnotu větší nebo rovno 175 000. Tato oxidace se však může vrátit přidáním 5 mM β-merkapto-etanolu. Tento patern se potvrdil na westernových blotech použitím anti-ProtD nebo anti-His.
c) Stabilita
Čištěný antigen je stabilní po dobu jednoho týdne při teplotě -20 °C a 4 °C (nedochází k degradaci), ale jeví se být více citlivý k oxidaci po inkubaci při teplotě 37 °C.
d) Rozpustnost
Rozpustnost proteinu je závislá na pH (popisuje se dále v textu), přičemž při hodnotě pH nižší než 7,4 rozpustnost klesá:
| PBS pH 7,4 | 686 μg/ml | 100 % |
| PBS pH 7,2 | 560 μρ/ιηΐ | 81 % |
| PBS pH 7,0 | 498 μg/ml | 72 % |
| PBS pH 6,8 | 327 μρ/ιηΐ | 48 % |
Protein HPV 18-Prot Dl/3-E7-His se skládá z 227 aminokyselin. Jeho teoretická molekulová hmotnost je 25 900 a teoretický izoelektrický bod je 5,83. Při SDS PAGE v redukčním prostředí tento protein migruje do vzdálenosti odpovídající molekulové hmotnosti 31 500.
Příklad 15: Konstrukce fúze ProtDl/3-E7, která se exprimuje v mikroorganizmu E. coli kmen B1098 Mutovaný (cys27-»gly, glu29—»gln) typ HPV18 • · · · · · • ·«·· · ···· • · · · · · «
1) Konstrukce expresívního plazmidu
Počáteční materiál
a) plazmid pRIT14532 (=TCA 316), který kóduje fúzi ProtDl/3E7-His
b) plazmid LITMUS 28 (New England Biolabs kat. č. 306-28) klonovací vektor odvozený od pUC
c) plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu přihláška UK patentu č. 951 3261.9, který se zveřejnil jako W097/01640), ve kterém kodony 4-81 NS1 kódující oblasti z Influenzae se nahradily kodony korespondujícími se zbytky Ser 20 —> Thr 127 zralého proteinu D Haemophilius influenzae, kmen 772, biotyp 2 (popisuje se v publikaci H. Janson et al., 1991, Infection
119-125). klonovací
Po sekvenci Prot-Dl/3 místo (11 zbytků) a and Immunity, Jan. P. následuje vícenásobné kódující oblast C-terminálního histidinového ocasu (6 His)
Konstrukce plazmidu pRIT14831(=TCA355): plazmid exprimujicí fúzi protein-Dl/3-E7 mutovaný (cys27-»gly, glu29—>gln) s His ocasem
Fragment Ncol-Xbal z pRIT14532(=TCA 316) nesoucí kódující sekvenci genu E7 pocházející z HPV 18 prodloužený koncem His se subklonoval do vektoru Litmus 28 použitelného pro mutagenezi za vzniku pRIT 14910 (=TCA348) . Na základě anoligie s mutagenezi E7/HPV16 se dvojitá mutace cys27 —> gly a glu29 -> gin vybrala za účelem omezení navázání antionkogenního produktu genu retinoblastomu (pRB).
Zavedení mutací genu E7 se realizovalo kitem „Quíck Change Site directed Mutagenesis (Stratagene kat. č. 200518). Sekvenování pRIT14532 vyjevilo pítomnost kyseliny glutamové v poloze 43 genu E7 místo glycinu, jak je tomu u prototypové sekvence HPV18. Druhý cyklus mutageneze se realizoval zavedením glycinu do polohy 43. Získaly jsme plazmid pRIT14829(=TCA353). Po ověření přítomnosti mutací a integrity celého genu E7 sekvenováním se mutovaný gen E7 zavedl do vektoru pRIT 14589 (=pMG MCS ProtDl/3) za vzniku plazmidu pRIT 14831(=TCA355) (obrázek č.7).
Sekvence fúze protein-Dl/3-E7 mutovaný (cys27 —> gly, glu29 -> gin)-His se popisuje na obrázku č. 18.
2) Konstrukce ProtDl/3-E7 mutovaný(cys27 —> gly, glu29 —» gin)His/HPV18
Plazmid pRIT14831 se zavedl do E. coli AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci., 82: 88) defektivního λ lysogenu obsahujícího represor citlivý na teplo promotoru λ pL za vzniku kmene B1098. Selekce transformantů se provedla na základě rezistence na kanmycin.
3) Růst a indukce bakteriálního kmene B1098-Exprese ProtDl/3E7mutovaný(cys27 —» gly, glu29 —» gin)-His/HPV18
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT14831 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μρ/πιΐ kanamycinu pří teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu Dl/3-E7-His. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
4) Charakterizace fúze ProtDl/3-E7mut((cys27 —> gly, glu29 —> gin)-His/HPV16
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4
C.
• · • · • · · · «9 · «9 9
Analýza na SDS polyakrylových gelech barvených podle Coomassie a westernový bloty
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem. Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 31 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových biotech králičím polyklonálním 22J70 antiprotein D a mnonoklonálním Panta-His (Qiagen kat. č. 34660), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 3 až 5 % celkového proteinu.
Příklad 16: Konstrukce fúze Protein-Di/3-E6-his/HPV18, která se exprimuje v mikroorganizmu E.-coli 1. Konstrukce expresívního plazmidu
a) Plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRITl4589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu přihláška UK patentu č. 951 3261.9, který se zveřejnil jako W097/01640), ve kterém kodony 4-81 NSl kódující oblasti z Influenzae se nahradily kodony korespondujícími se zbytky Ser 20 -> Thr 127 zralého proteinu D Haemophilius influenzae, kmen 772, biotyp 2 (popisuje se v publikaci H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. P. 119-125). Po sekvenci Prot-Dl/3 následuje vícenásobné klonovací místo (11 zbytků)a kódující oblast C-terminálního histidinového ocasu (6 His). Tento plazmid se použil při expresi fúzního proteinu D1/3-E6-HÍS.
HPV genomové sekvence E6 a E7 typ HPV 16 (popisuje se v publikaci Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, p.599-608) se amplifikovaly genomu HPV 18 plné délky klonovaného do pBR322 (získal se z instituce Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses-D 69120-Heidelberg) a subklonoval se do pUC19 za vzniku TCA 301 (=pRIT14467).
• ·
Konstrukce plazmidu TCA302 (=pRIT14526): plazmid exprimující fúzi Protein-Dl/3-E6-His/HPV18
Nukleotidová sekvence odpovídající aminokyselinám 1 -a 158 proteinu E6 se amplifikovaly z pRIT14467. Během polymerázové řetězcové reakce vznikly na 5'a 3'koncích sekvencí E6 restrikční místa Ncol a Spěl, která umožňují inzerci do stejných míst plazmidu pMGMCS Prot Dl/3 za vzniku plazmidu TCA314(=pRIT14526). Inzert se sekvenoval, aby se ověřilo, zda během polymerázové řetězcové reakce nedošlo k žádným modifikacím. Sekvence uvedené fúze protein-Dl/3-E6-His se popisuje na obrázku č. 22.
Transformace kmene AR58
Plazmid pRIT14526 se zavedl do E. coli AR58 (popisuje se v publikaci Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. 82: 88) defektního lysogenu λ, který obsahuje represor promotoru λ pL citlivého na teplo.
3. Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese Prot-Dl/3-E6His
Buňky AR58 transformované plazmidem pRIT1426 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μg/ml kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu Dl/3-E6-His. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
6. Charakterizace fúze protein Dl/3-E6-His
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4
C.
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem.
Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 32 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových blotech králičím polyklonálním anti-proteinem D a Ni-NTA konjugátem spojeným telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 3 až 5 % celkového proteinu.
Příklad 17: Konstrukce fúze Protein-Dl/3-E6E7-his/HPV18
1. Konstrukce expresívního plazmidu
a) Plazmid pMG MCS prot Dl/3 (=pRIT14589) je derivát pMG81 (popisuje se v dokumentu přihláška UK patentu č. 951 3261.9, který se zveřejnil· jako WO97/01640), ve kterém kodony 4-81 NS1 kódující oblasti z'Influenzae se nahradily kodony korespondujícími se zbytky Ser 20 —> Thr 127 zralého proteinu D Haemophilius Influenzae, kmen 772, biotyp 2 (popisuje se v publikaci H. Janson et al., 1991, Infection and Immunity, Jan. P. 119-125). Po sekvenci Prot-Dl/3 následuje vícenásobné klonovací místo (11 zbytků)a kódující oblast C-terminálního histidinového ocasu (6 His). Tento plazmid se použil při expresi fúzního proteinu D1/3-E6E7his.
b) HPV genomové sekvence E6 a E7 typ HPV 18 (popisuje se v publikaci Cole et al., J. Mol. Biol. 1987, 193, p.599608) se amplif ikovaly z genomu HPV 18 plné délky klonovaného do pBR322 (získal se z instituce Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), Referenzzentrum fur human pathogen Papillomaviruses-D 69120-Heidelberg) a subklonoval se do pUC19 za vzniku TCA 302 (=pRITl4467).
c) Kódující sekvence E6 a E7 v TCA302 (=pRITl4467) se upravily syntetickým oligonukleotidovým adaptorem (začleněným mezi
·. · restrikční místa Hgal a Nsil), který vytváří deleci 11 nukleotidů mezi geny E6 a E7 za účelem odstranění stop kodonu E6 a vzniku kódujících sekvencí E6 a E7 v plazmidu TCA320 (=pRIT14618) (zobrazuje obrázek č. 23).
Konstrukce plazmidu TCA328 (=pRIT14567): plazmid exprimující fúzi Protein-Dl/3-E6E7-His/HPV18
Nukleotidové sekvence odpovídající aminokyselinám 1 —> 263 fúzovaného proteinu E6E7 se amplifikovaly z pRIT14618. Během polymerázové řetězcové reakce vznikly na 5'a 3' koncích sekvencí E6E7 restrikční místa Ncol a Spěl, která umožňují inzerci do stejných míst plazmidu pMGMCS Prot Dl/3 za vzniku plazmidu TCA328(=pRIT14567) -(obrázek č. 24). Inzert se sekvenoval, aby se ověřilo, zda během polymerázové řetězcové reakce nedošlo k žádným modifikacím. Sekvence uvedené fúze protein-Dl/3-E6E7-His se popisuje na obrázku č. 25.
Transformace kmene AR58
Plazmid pRITl4567 se zavedl do E. coli AR58 (popisuje se v publikaci Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. 82: 88) defektního lysogenu λ, který obsahuje represor promotoru λ pL citlivého na teplo.
3. Růst a indukce bakteriálního kmene - exprese Prot-Dl/3E6E7-His
Buňky AR58 transformované plazmidem pRITl4512 se kultivovaly ve 100 ml kultivačního média LB doplněném 50 μρ/ηιΐ kanamycinu při teplotě 30 °C. Během logaritmické fáze růstu se teplota zvýšila na 39 °C, aby se deaktivoval represor λ a začala syntéza proteinu Dl/3-E6E7-His. Inkubace při teplotě 39 °C pokračovala po dobu 4 hodin. Vytvořil se pelet bakterií a uchovávaly se při teplotě -20 °C.
4. Charakterizace fúze protein Dl/3-E6E7-his • * ·
Zmrazené buňky se nechaly roztát a resuspendovaly se v 10 ml pufru PBS. Buňky se otevřely působením tlaku podle Frenche zařízením SLM Amicon při tlaku 140 MPa (tři pasáže). Extrakt se centrifugoval při 16 000 g po dobu 30 minut při teplotě 4 °C.
Po centrifugací extraktů, které se popisují shora v textu, se alikvoty supernatantu a pelet analyzoval elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu a westernovým přenosem.
Hlavní pruh o molekulové hmotnosti 48 000 lokalizovaný v peletové frakci se zviditelnil barvením gelu podle Coomassie a identifikoval se na westernových blotech králičím polyklonálním anti-proteinem D a Ni-NTA konjugátem spojeným telecí intestinální alkalickou fosfatázou (Qiagen kat. č. 34510), které detekují přístupný histidinový konec. Síla exprese reprezentuje přibližně 1 % celkového proteinu.
Příklad 18: Vakcinační formulace
Vakcíny se vytvořily z proteinu pocházejícího ze shora v textu popsaných vzorků exprimovaných v mikroorganizmu E. coli kmene AR58 a adjuvans. Mezi adjuvans patří formulace obsahující směs 3 de-O-acetylovaného monofosforyllipidu A (3DMPL) a hydroxidu hlinitého nebo 3D-MPL a/nebo QS21 v emulzi olej/voda. Často obsahují také cholesterol.
3D-MPL: je detoxifikovaná forma lipolysacharidu (LPS) gram-negativní bakterie Salmonella minnesota.
Experimenty provedené v instituci Smith Kline Beecham Biologicals vykazují, že 3D.MPL kombinovaný s různými vehikly silně zvyšuje jak humorální a buněční imunitu tak i buněčnou imunitu THl.
QS21: je saponin čištěný ze surového extraktu kůry stromu Quillaja Saponaria Molina, který má silnou aktivitu adjuvans. Aktivuje jak lymfoproliferaci specifickou pro antigen tak i CTL na několik antigenu.
···· ·· ·· » · · · · · *··· · ·· · • · · · * · »
Vakcína obsahující antigen podle vynálezu spolu s 3D-MPL a alum se může připravit analogickým způsobem, jak se popisuje v dokumentu WO93/19780 nebo 92/16231.
Experimenty provedené v instituci Smith Kline Beecham Biologicals vykazují jasný synergický účinek kombinací 3D-MPL a QS21 při vyvolání humorální imunitní odezvy a buněčné imunitní odezvy typu TH1. Vakcíny obsahující antigen se popisují v dokumentu US 5750110.
Emulze olej/voda obsahuje dva oleje (tokoferol a skvalen) a PBS obsahující jako emulgační prostředek Tween 80. Emulze obsahuje 5 % skvalenu, 5 % tokoferolu, 0,4 % Tween 80 a průměrná velikost partikul! je 180 nm. Tato emulze je známa jako SB62 (popisuje se v dokumentu WO 9/17210).
Experimenty provedené v instituci Smith Kline Beecham Biologicals prokázaly, že adjunkce emulze O/V spolu s MPL/QS21 zvyšuje jejich imunostimulační vlastnosti.
Příprava emulze SB62 (2 x koncentrováno)
Tween 80 se rozpustil ve fyziologickém roztoku pudrovaném fosforečnanem (PBS) za vzniku 2 % roztoku PBS. Aby vzniklo 100 ml dvakrát koncentrované emulze, 5g DL alfatokoferolu a 5 ml skvalenu se míchalo na vortexu. Přidalo se 90 ml roztoku se. Výsledná emulze pak prošla
PBS/Tween a zamíchalo stříkačkou a nakonec se ikrofluidizačního přístroje, velikost přibližně 180 nm.
mikrofluidizovala Výsledné kapičky za použití oleje mají
Příprava oleje Prot.D1/3E7QS21/3DMPL ve vodní formulaci
ProtDl/3-E7 (5μς) se naředil desekrát koncentrovaný PBS pH
6,8 a vodou a pak se přidalo SB62 a 3D MPL (5gg) a v pětiminutových intervalech se jako konzervační činidlo přidávalo 50μρ/πι1 thiomersalu. Objem emulze se rovná 50 % celkového objemu (50 μΐ v případě dávky 100 μΐ). Všechny inkubace se provedly při teplotě místnosti za stálého míchání.
Kontroly obsahující adjuvans bez antigenu se připravily nahrazením proteinu PBS.
Experimenty regrese nádoru (HPV16) s PROT D E7
Vakcínační antigen: fúze protein ProtDE7
Protein D je lipoprotein na povrchu gram negativní bakterie Haemophilius influenzae.
Za účelem vzniku antigenu vakcíny s kolemjdoucími pomocnými vlastnostmi se začlení inkluze prvních 109 zbytků proteinu D, který je fúzním partnerem. Antigen se připravil s QS21 3D-MPL a SB62, jak se popisuje shora v textu.
Příklad 19: Experimenty regrese nádoru in vivo
Nádorová buněčná linie TC1:
Primární epiteliální buňky plic pocházející z myší C57BL.6 se imortalizovaly HPV16 E6 a E7 a pak se transformovaly s aktivovaným onkogenem ras za vzniku tumorogenní buněčné linie exprimující E6 a E7 (Lin KY et al., 1996). Exprese E7 se ověřila analýzou FACS fixovaných a permeabilízovaných buněk TC1 za použití myšího anti-HPV 16E7 Mab (Triton Corp. Alameda, CA) .
Růst nádoru
Buňky TC1 rostoucí v kultuře in vitro se ošetřily trypsinem, davkrát se promyly v médiu, které neobsahuje sérum a podkožní injekcí se zavedly do pravého boku myší. Aby se mohla hodnotit léčba vzniklých nádorů, buňky TCl se zavedly injekcí v dávce třikrát 10e4 buněk na jednu myš. Jeden a dva týdny po injektování nádorových buněk se myši vakcinovaly 5 μα protDl/3E7His v objemu 100 μΐ PBS nebo 3D-MPL, QS21 a SB62 do šlapky končetiny (50 μΐ do šlapky končetiny) PBS nebo s PBS nebo se samotným adjuvans. V každé skupině bylo 5 myší C7BL/6 (Iffa Credo). U myší se dvakrát týdně monitoroval růst. Průměrná hmotnost nádoru na skupinu je uvedena na obrázku č. 26. U myší vakcinovaných protDl/3E7His v PBS nebo PBS nebo • · ···· · · · · · · · · ·· ··· · · ’ ·«·· ft · · · · · · · · · · ·· *
6 :: : · : : :·::::
·· ··· ·· ··· ·· ·· samotným adjuvans se vyvinul progresivně rostoucí nádory (0-1 zvířat bez nádoru/skupina) . Naopak u čtyř z pěti myší vakcinovaných protDl/3E7His v adjuvans se nádor nevyvinul. U jednoho zvířete se vyvinul velmi malý a stabilní nádor po 40 dnech. Tyto výsledky ukazují, že protein protDl/3E7His pocházející z HPV 16 připravený v adjuvans je schopný vyvolat regresi malých nádorů exprimujících uvedený antigen.
Imunologické testy
Proliferační test:
V případě testu in vitro se lymfocyty připravily rozdrcením sleziny popliteálních lymfatických žláz získaných z vakcinovaných myší v den 69.
Alikvoty 2xl0e5 buněk se nanesly na plotnu s 96 prohlubněmi ve třech provedeních se snižujícími se koncentracemi (10, 1, 0,1 μ9/πι1) protDl/3E7His, který byl nebo nebyl na latexových mikročásticích (Sigma), aby se buňky restimulovaly in vitro (72 hodin). Proliferace T buněk se měřila začleněním 3H thymidinu.
Na obrázku č. 27 a 28 se porovnává schopnost protD E7 stimulovat proliferaci splenocytů a buněk lymfatických žláz in vivo pomocí PBS, 3D-MPL, QS21 SB62, ProtDl/3 E7 His a ProtDl/3 E7 His plus adjuvans 3D-MPL, QS21, SB62 a ukazují vysokou proliferační odezvu ve slezině se ve srovnání s jinými skupinami detekovaly pouze u myší imunizovaných protDl/3 E7 His v adjuvans.
Protilátková odezva
Ve stejnou dobu jako orgány se izolovaly jednotlivá séra a podrobily se testu nepřímá ELISA.
Jako antigen potažený na povrchu prohlubní se použilo 5 μρ/ml čištěného proteinu E7. Po saturaci v PBS s 1% sérem právě narozených telat po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C se séra sériově naředila (počáteční ředění 1/100) v saturačním pufru a inkubovala se přes noc při teplotě 4 °C nebo 90 minut při teplotě 37 °C. Po promytí v PBS s Tween 20 se použily jako sekundární protilátky kozí anti-myší Ig (1/1 000) nebo antiséra podtřídy kozích anti-myších Ig (celý IgG, IgGl, IgG2a, IgG2b) (1/5 000) . Po inkubaci po dobu 90 minut při teplotě 37 °C se přidal streptavidin spojený s peroxydázou a jako substrát se použil TMB (tetra-methyl-benzidin/peroxid). Po deseti minutách se reakce zastavila 0,5 M H2SO4 a stanovila se hodnota optické hustoty při vlnové délce 450 nm.
Na obrázku č. 29 jsou uvedeny titry podtřídy specifických anti-E7 vyvolané vakcinací v různých skupinách s relativním průměrným středním ředěním séra.
Tyto výsledky ukazují, že slabou protilátkovou odezvu spouští aplikace samotného ProtD 1/3 E7 HPV16 ve formě dvou injekcí.
Daleko více protilátek proti E7 se vytvořilo, když se ProtDl/3 E7 aplikoval injekcí v přítomnosti adjuvans SB62, QS21 a 3D-MPL.
V žádném séru, dokonce ani v séru myší, kterým se aplikoval ProtD 1/3 E7 v adjuvans SB62, QS21 a 3D-MPL (data nejsou uvedena), se nezjistily IgA nebo IgM. Naopak množství celkového IgG se slabě zvýšilo vakcinací myší samotným ProtD 1/3 E7 a silně se zvýšilo, když se k proteinu přidalo adjuvans SB62, QS21 a 3D-MPL. Analýza koncentrací různých podtříd IgG vykazuje, že smíšená protilátková odezva se vyvolala, jak se zvýšila koncentrace všech typů analyzovaných podtříd IgG (IgGl, IgG2a a IgG2b) v séru myší, kterým se aplikovalo antigen s adjuvans, což se porovnává s koncentracemi pozorovanými v séru myší, kterým se aplikoval antigen nebo samotné adjuvans. IgG2 je převažující izotop, který reprezentuje více než 80 % celkového množství IgG. Tento izotop je v obecném případě spojen se zavedením imunitní odezvy typu TH1.
• 9 9 99 9 9999
999 «9 999 99 99
Příklad 20: In vivo experimenty ochrany proti nádoru
Myši se imunizovaly dvakrát ve 14-ti denních intervalech buď PBS, adjuvans podle příkladu 1, 5 μρ fúze protDl/3 E7 His nebo 5 μς protD 1/3 E7 His v adjuvans podle příkladu 1 do polštářku končetiny při objemu 100 μΐ (50 μΐ do polštářku končetiny).
Růst nádoru:
Čtyři týdny po vakcinaci se myším do boku aplikovalo podkožně 2xl0e5 buněk TC1 na jednu myš. Buňky TC1 rostoucí v kultuře in vivo se ošetřily tripsinem a dvakrát se promyly v médiu bez séra a aplikovaly se injekcí. V každé skupině bylo 5 myší. U myší se dvakrát za týden sledoval růst nádoru.
Z obrázku č. 30 vyplývá, že vakcinace s proteinem E7 v adjuvans SB62, QS21, 3D-MPL chrání myši proti vývoji nádoru (pouze jedno zvíře z pěti mělo velmi malý a stabilní nádor) ve všech skupinách, kterým se aplikoval protein E7 bez adjuvans. Jestliže se aplikovalo samotné adjuvans vyvinul se rostoucí nádor.
Iminulogický test
Tři týdny po poslední vakcinaci dříve než se vyvinul nádor se pět myší v každé skupině usmrtilo, aby se mohly provést imunologické testy.
Proliferační test
V případě testu in vitro se lymfocyty připravily rozdrcením sleziny popliteálních lymfatických žláz.
Alikvoty 2xl0e5 buněk se nanesly na plotnu s 96 prohlubněmi ve třech provedeních se snižujícími se koncentracemi (10, 1, 0,1 μς/ιηΐ) protDl/3E7His, který byl nebo nebyl na latexových mikročásticích (Sigma), aby se buňky restimulovaly in vitro (72 hodin). Proliferace T buněk se měřila začleněním 3H thymidinu.
• · 9 ·
9 ···· 9· • * * · » » ♦ ·«·« · ···· • * « · · »
99 9 * * · · ·
Na obrázku č. 31 a 32 ukazují, že jak u splenocytů tak u buněk poplietálních lymfatických žláz, jak se pozorovalo při terapeutickém zavedení, se lepší lymfoproliferační aktivita získala u myší, kterým se aplikoval protein E7 v adjuvans SB62 QS21, 3D-MPL
Obrázek č. 33 ukazuje, že jako při terapeutickém zavedení se lepší protilátková odezva pozorovala v séru myší vakcinovaných proteinem ProtDl/3E7 připraveném v 3D-MPL, QS21 (objem /hmotnost). Byla vyvolána smíšená protilátková odezva. Vyskytovaly se všechny testované podtřídy IgG (IgG2a, IgG2b, IgGl). V tomto případě převažuje izotyp IgG2b a reprezentuje 7 % celkového IgG.
Příklad 21: Vakcinační experimenty s proteinem ProtDl/3E7(HPV18)
Myši se vakcinovaly dvakrát v rozmezí dvou týdnů 5 μρ ve 100 μΐ protDl/3 18 E7 His do polštářku končetiny (50 μΐ do polštářku končetiny v PBS nebo QS21, 3D-MPL a SB62, DQ MPL, jak se popisuje v dokumentu WO96/33739 nebo DQ alum MPL, jak se popisuje v dokumentu WO98/15827. V každé skupině bylo 8 myší Balb/c (Iffa Credo) 6 až 8 týdnů starých. 14 dní po druhé imunizaci se získala slezina a lymfatické žlázy za účelem imunologického vyšetření a krev se rozdělila na vzorky za účelem serologického vyšetření.
• Imunologické testy:
Proliferační test:
V případě testu in vitro se lymfocyty připravily rozdrcením sleziny popliteálních lymfatických žláz získaných z vakcinovaných myší 28 den.
Alikvoty 2xl0e5 buněk se nanesly na plotnu s 96 prohlubněmi ve třech provedeních se snižujícími se koncentracemi (10, 1, 0,1 μρ/ml) proteinu protDl/3 18 E7 His, který byl nebo nebyl na latexových mikročásticích (Sigma), aby * · tu » » · » · · · « se buňky restimulovaly in vitro (72 hodin). Proliferace T buněk se měřila začleněním 3H thymidinu. Výsledky jsou vyjádřeny jako stimulační index (cpm vzorku/cpm pozadí).
Na obrázku č. 34 a 35 se porovnává schopnost proteinu protDl/3 18 E7 stimulovat proliferaci splenocytů a buněk lymfatických žláz in vivo primárně imunizovaných ProtDl/3 18 E7 His nebo ProtDl/3 18 E7 His plus adjuvans. Z obrázků je zřejmé, že u myší, kterým se aplikoval pouze protein je možné vidět pouze základní proliferaci a naopak u myší imunizovaných protDl/3 18 E7 His v adjuvans je možné pozorovat velmi vysokou proliferační odezvu ve slezině a v lymfatických žlázách.
Produkce cytokinů • Cytokiny (IL-5 a IFNg) produkované v supernatantu kultury po hodinách in vitro restimulace sleziny nebo buněk lymfatických žláz médiem nebo proteinem ProtDl/3 18 E7 ( 1 nebo 3 μς/πιΐ) se měřily testem ELISA, jak se popisuje:
• IFNg (Genzyme)
Kvantifikace IFNy se uskutečnila testem ELISA za použití činidel od firmy Genzyme. Vzorky a roztoky protilátek se použily v množství 50 μΐ na jednu prohlubeň. Mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánsko) se potáhly přes noc při teplotě 4°C 50 μΐ anti-myšího séra křečka IFNg ředěného v 1,5 μς/ιηΐ uhličitanovém pufru pH 9,5. Destičky se pak inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C se 100 μΐ PBS, které obsahuje 1 % albuminu bovinního séra a 0,1 % Tween 20 (saturační pufr). Dvojnásobné ředění supernatantu ze stimulace in vitro (počínající ředění 1/2) v saturačním pufru se přidalo na plotny potažené anti-IFNg a inkubovalo se po dobu 1 hodiny 30 minut při teplotě 37 °C. Plotny se promyly čtyřikrát PBS Tween 0,1 % (promývací pufr) a přidaly se kozí anti-myší IFNg konjugované s bíotinem ředěné v saturačním pufru tak, aby konečná koncentrace v každé «· ···« »· ···♦ ** 9· • · · · · « 4 « · • ·»·« · *··· · *-« <
¢2-1 ·· · · » » «··«»·
LJ X · « * ι. fc « · · » « ·· ··· ·· ··· ·· ·· prohlubni byla 0,5 μς/ιηΐ. Vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Po kroku promytí se přidal konjugát AMDEX (Amersham) ředěný 1/10 000 v saturačním pufru a následuje inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Plotny se promyly jak se popisuje shora v textu a inkubovaly se s 50 μΐ TMB (Biorad) po dobu 15 minut. Reakce se zastavila přidáním 0,4 N H2SO4 a stanovila se optická hustota při vlnové délce 450 nm. Koncentrace se vypočítaly za použití standardní křivky (myší IFNy standard) pomocí SoftmaxPro (rovnice se čtyřmi parametry) a vyjádřily se jako pg/ml.
• IL5 (Pharmingen)
Kvantifikace IL5 se provedla testem ELISA za použití činidel od firmy Pharmingen. Vzorky a roztoky protilátek se použily v množství 50 μΐ na jednu prohlubeň. Mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi (Maxisorb Immuno-plate, Nunc, Dánsko) se potáhly přes noc při teplotě 4°C 50 μΐ krysího antimyšího IL5 ředěného v 1 μς/ιηΐ uhličitanovém pufru pH 9,5. Destičky se pak inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C se 100 μΐ PBS, které obsahuje 1 % albuminu bovinního séra a 0,1 % Tween 20 (saturační pufr). Dvojnásobné ředění supernatantu ze stimulace in vitro (počínající ředění 1/2) v saturačním pufru se naneslo na plotny potažené anti-IFNg a inkubovalo se po dobu 1 hodiny 30 minut při teplotě 37 °C. Plotny se promyly čtyřikrát PBS Tween 0,1 % (promývací pufr) a přidaly se krysí anti-myší IL5 konjugované s biotinem ředěné v saturačním pufru tak, aby konečná koncentrace v každé prohlubni byla 1 μρ/πιΐ. Vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Po kroku promytí se přidal konjugát AMDEX (Amersham) ředěný 1/10 000 v saturačním pufru a následuje inkubace po dobu 30 minut při teplotě 37 °C. Plotny se promyly jak se popisuje shora v textu a inkubovaly se s 50 μΐ TMB (Biorad) po dobu 15 minut. Reakce se zastavila přidáním 0,4 N H2SO4 a stanovila se ·· ···*
9999 optická hustota při vlnové délce 450 nm. Koncentrace se vypočítaly za použití standardní křivky (rekombinatní myší IL5) pomocí SoftmaxPro (rovnice se čtyřmi parametry) a vyjádřily se jako pg/ml.
Počínajíce s buňkami sleziny v žádné ze skupin se nemohl detekovat IL-5. Naopak ve všech skupinách se pozorovala se pozorovala velmi vysoká produkce IFNg. Ve srovnání s ostatními skupinami se pozorovalo u skupiny myší, kterým se aplikovalo protein s adjuvans SBASlc, pouze malé zvýšení IFNg. To naznačuje indukci imunitní odezvy typu TH1.
Co se týče buněk lymfatických žláz, velmi slabá produkce IFNg se získala ve skupině myší, kterým se aplikoval samotný protein a 5-ti násobné až 10-ti násobné zvýšení se pozorovalo u protein s adjuvans. IL5 se mohlo detekovat ve skupině myší, kterým se aplikoval protein s adjuvans SBAS2.
Obrázky 36 a 37 porovnávají schopnost ProtDl/3 18 E7 His stimulovat produkci cytokinů IFNg a IL5 po in vitro restimulaci buněk sleziny a lymfatických žláz.
Protilátková odezva
Ve stejnou dobu jako orgány se izolovaly jednotlivá séra a podrobily se testu nepřímá ELISA.
Jako antigen potažený na povrchu prohlubní se použilo 2,5 μg/ml čištěného proteinu protDl/3 18E7 HPV18. Po saturaci v PBS s 1% sérem právě narozených telat po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C se séra sériově naředila (počáteční ředění 1/100) v saturačním pufru a inkubovala se přes noc při teplotě 4 °C nebo 90 minut při teplotě 37 °C. Po promytí v PBS s Tween 20 se použily jako sekundární protilátky kozí anti-myší Ig (1/1 000) nebo antiséra podtřídy kozích anti-myších Ig (celý IgG, IgGl, IgG2a, IgG2b) (1/5 000) . Po inkubaci po dobu 90 minut při teplotě 37 °C se přidal streptavidin spojený s peroxydázou a jako substrát se použil TMB (tetra-methyl-benzidin/peroxid) .
• 4 4 4 4 » 44 444· 44 44
4 · 44? 4444
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4» · : : : · : :
··· 44 ·4· 44 44
Po deseti minutách se reakce zastavila 0,5 M H2SO4 a stanovila se hodnota OD při vlnové délce 450 nm.
Velmi slabá protilátková odezva se vyvolala 2 injekcemi samotného ProtDl/3 18 E7. Celkové množství IgG se značně zvýšilo přidáním adjuvans do proteinové vakcíny.
Analýza koncentrací různých podtříd IgG vykazuje, že když se protein aplikuje injekcí v přítomnosti adjuvans DQS21 3DMPL nebo SB62, QS21/3D-MPL, dojde ke slabému zvýšení procenta subtypu IgG2a: 28 % IgGl, 48 % IgG2a a 43% IgGl, 44% IgG2a ve srovnání s 46 % IgGl, 32 % IgG2a v případě, že se aplikoval protein bez adjuvans. Nejsilnější protilátková odezva se získala s proteinem připraveným v DQ alum s jasným posunem v koncentraci izotypu (80 % IgGl, 8 % IgG2a) . Uvažuje se, že izotyp IgG2a u Balb/c myší je v obecném případě spojen s indukcí imunitní odezvy typu THI.
Tyto výsledky ukazují, že adjuvans DQS21, 3D-MPL a SB62 QS21/3D-MPL mají trend zvýšit profil humorální odezvy typu THI, zatímco SBAS5 vyvolává jasno odezvu typu TH2.
Obrázek č. 38 porovnává střední ředění séra a relativní procento různých izotypů vyvolaných vakcinací u různých skupin myší.
Závěr:
Ukázalo se, že fúzní protein 1/3 Prot D a časný protein E7 viru HPV 16 vyvolává silnou systémovou anti-nádorovou imunitu. Dále se ukázalo, že fúzní protein ProtDl/3 a E7 viru HPV 18 je pro myši imunogenní. Vakcinace fúzním proteinem protDl/3 E7 HPV 16 chrání myši před vytvořením nádoru s buňkami, které exprimují protein E7, a eliminovala malé předem vytvořené nádůrky exprimující E7 viru HPV 16, které se zavedly injekcí v odlišném místě než je místo vakcinace.
Ukázalo se, že protein protDl/3 E7 HPV16 v adjuvans je schopný zvýšit proliferaci pomocných buněk T, což naznačuje, • · · · ···· • · · · · · · · · · · · * · ; ; ϊ’ίΐ ί * i i: i ·· ··· ·· ··· ·· ·· že se touto vakcinací indukpovala anti-nádorová odezva, která je alespoň s části spojená s odezvou buněk CD4+T.
Také se ukázalo, že lepší protilátková buněčná odezva se vyvolala vakcinací s proteinem protDl/3E7 v přítomnosti 3D-MPL obsahujícím adjuvans. Převládajícím izotopem v séru myší C57BL/6 je IgG2b, což naznačuje, že došlo k imunitní odezvě typu TH1.
Claims (4)
1. Fúzní protein obsahující antigen lidského papilomaviru vybraný ze skupiny zahrnující E6, E7 a fúzní protein E6E7 s pojený s proteinem D nebo s jeho derivátem z Haemophilius influenzae B.
2. Protein podle nároku 1, kde proteiny E6 nebo E7 se získaly z HPV16 nebo HPV18.
3. Protein podle nároku 1 nebo 2, kde proteiny E7 se mutovaly, aby se omezilo navázání produktu genu retinoblastomu.
4. Protein podle nároku 1 nebo 2, kde se do oblasti p53 E6 zavedla mutace.
protein podle libovolného z nároků 1 až 5 a farmaceuticky přijatelné ředidlo a ekcipient.
11. Vakcína podle libovolného z nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že obsahuje další antigen HPV.
ββ :: : · : :
• · · · » ·· · · · ·· ··
12. Vakcína podle libovolného z nároků 7 až 11, vyznačující se tím, že se může použít v medicíně.
13. Použití proteinu podle libovolného z nároků 7 až 11 při výrobě vakcíny vhodné pro imunoterapeutické ošetření pacienta, který trpí nádorovými lézemi (benigní nebo maligní) vyvolanými HPV.
14. Použití proteinu podle libovolného z nároků 7 až 11 pří výrobě vakcíny, která brání infekci virem HPV.
15. Vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 6.
16. Vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 6 a sekvenci DNA kódující thioredoxin.
17. Host, vyznačující se tím, že se transformoval sekvencí DNA podle nároku 6.
18. Host, vyznačující se tím, že se transformoval vektorem podle nároku 15 nebo 16.
19. Host podle nároku 17, vyznačující se tím, že se dále transformoval sekvencí DNA kódující thioredoxin.
20. Způsob produkce proteinu podle libovolného z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že zahrnuje transformaci buňky hostitele sekvencí DNA podle nároku 6, expresi uvedené sekvence a izolaci požadovaného produktu.
21. Způsob produkce vakcíny podle libovolného z nároků 7 až 11, vyznačující se tím, že zahrnuje smíšení proteinu s vhodným adjuvans, ředidlem nebo s jiným farmaceuticky přijatelným ekcipientem.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000634A CZ2000634A3 (cs) | 1998-08-17 | 1998-08-17 | Vakcína |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2000634A CZ2000634A3 (cs) | 1998-08-17 | 1998-08-17 | Vakcína |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2000634A3 true CZ2000634A3 (cs) | 2001-01-17 |
Family
ID=5469690
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2000634A CZ2000634A3 (cs) | 1998-08-17 | 1998-08-17 | Vakcína |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2000634A3 (cs) |
-
1998
- 1998-08-17 CZ CZ2000634A patent/CZ2000634A3/cs unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6342224B1 (en) | Recombinant papillomavirus vaccine and method for production and treatment | |
| KR100824105B1 (ko) | 백신접종을 위한 융합 단백질 및 조성물의 제조를 위해사용되는 ｍａｇｅ 군으로부터의 종양 관련 항원 유도체 및이들을 암호화하고 있는 핵산 서열 | |
| WO1998023635A1 (en) | Novel promiscuous t helper cell epitopes | |
| EP2288380B1 (en) | Vaccine composition useful for hpv and hepatitis b infections and a method for preparing the same | |
| RU2743016C2 (ru) | Улучшение иммуногенности пептида l2 впч | |
| US20050031638A1 (en) | Vaccine | |
| WO1999033868A2 (en) | Human papillomavirus vaccine | |
| US10940194B2 (en) | Mutant of L1 protein of human papillomavirus type 58 | |
| JP2023182596A (ja) | ヒトパピローマウイルス３９型のｌ１タンパク質の変異体 | |
| WO2017092711A1 (zh) | 一种人乳头瘤病毒11型l1蛋白的突变体 | |
| KR102567627B1 (ko) | 인간 유두종 바이러스 타입 16의 l1 단백질의 변이체 | |
| CZ2000634A3 (cs) | Vakcína | |
| WO2019233412A1 (zh) | 一种人乳头瘤病毒18型l1蛋白的突变体 | |
| US8715681B2 (en) | Minimal motifs of linear B-cell epitopes in L1 protein from human papillomavirus type 58 and their applications | |
| MXPA00001813A (en) | Vaccine | |
| MXPA00006323A (en) | Human papillomavirus vaccine | |
| HK1033838B (en) | Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |