CZ2000715A3 - Geny kódující enzymy pro biosyntézu ligninu a jejich použití - Google Patents

Abstract

Popisují se způsoby a kompozice vztahující se ke změnám obsahu a/nebo složení biosyntézy ligninu v rostlinách. Dále se popisují izolované nukleové kyseliny ajimi kódované proteiny, které se podílejí na biosyntéze ligninu. Dále se popisují rekombinantní expresívní kazety, hostitelské buňky, transgenní rostliny a složení protilátkové kompozice.

Description

Geny kódující enzymy pro bíosyntézu ligninu a jejich použití w

Oblast techniky

Vynález se týká molekulární biologie rostlin. Konkrétně se týká nukleových kyselin a metod modifikace obsahu ligninu v rostlinách.

Dosavadní stav techniky

Rozdíly ve složení buněčných stěn u rostlin zahrnují rozdíly v chemické reaktivitě, mechanické pevnosti a v energetickém obsahu v rostlinném materiálu. Rozdíly v chemických a mechanických vlastnostech rostlinného materiálu pak mají značný dopad na využití rostlinné biomasy v zemědělství a v průmyslu. Jednou z hojných složek mnoha typů rostlinných buněk, která přitahuje pozornost díky svému významu při využití rostlin, jsou ligniny.

Ligniny : sou skupina složitých heteropolymerů spojovaných s polysacharicovými složkami buněčné stěny určitých z hlediska rostlinných buněk.

Ligniny mají podstatnou roli tuhosti, pevnosti v tlaku a strukturní podpory rostlinných tkání. Propůjčují také buněčným stěnám hydrofobicitu, což umožňuje vedení vody a rozpuštěných látek. Š ohledem na jejich důležitost ligniny představují po celulóze druhou nejvíce zastoupenou organickou látku na Zemi, která představuje přibližně 25 % rostlinné biomasy. Ligniny vznikají oxidační kondenzací tří monomerů: kumarylalkoholu, koniferylalkoholu a sinapylalkohoiu. Variabilita ligninové struktury částečně závisí na vzájemném poměru těchto tří konstitutivních monomerů.

Biosyntéza ligninů probíhá z fenylalaninu přes fenylpropanoidovou dráhu na cinnamoyl-CoA, které jsou obecnými prekurzory širokého rozmezí fenolických látek. Enzymy, které se účastní této dráhy biosyntézy jsou fenylalaninamoniumlyáza (PAL), cinamát-4-hydroxyláza (C4H), 4-kumarát-3-hydroxyláza • · • · • · (C3H), O-methyltransferáza (ΟΜΤ), ferulát-5-hydroxyláza (F5H), kafeoyl-CoA-3-O-methyltranseráza (CcoA-OMT) a 4-kumarát:CoA ligáza (4CL) (popisuje se v publikacích Whetten and Sederoff, The Plant Cell, 7: 1001-1013 (1995); Boudet and GrimaPettenati, Molecular Breeding, 2:25-39 (1996).

Ligninová specifická dráha vede cinnamoyl CoA k syntéze monolignolů a ligninů. Tato cesta zahrnuje dva redukční enzymy, které přeměňují hydroxycinamoyl-CoA-estery na monolignoly: reduktáza cinamoyl-CoA (CCR) a dehydrogenáza cinamylalkoholu (CAD).

Zatímco ligniny jsou vitální komponenty v pozemních vaskulárních rostlinách, často tvoří překážku využití rostlinné biomasy. Například v průmyslu celulózy a papírenském průmyslu se ligniny oddělují od celulózy nákladným procesem, který znečišťuje prostředí. Obsah ligninu také omezuje stravitelnost krmin konzumovaných dobytkem. Zatímco v obecném případě při takových aplikacích je snížení obsahu ligninu nutné, zvýšení obsahu ligninu v rostlinném materiálu, který slouží jako chemický základ při produkci fenolů pro využití jako palivového zdroje nebo při zlepšení vlastností požadovaných v zemědělství (např. schopnost stát, aby nedošlo k uválení rostlin) je také výhodné, v ros tt inách upravit obsah ligninu.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje nukleové kyseliny

Proto je výhodné proteiny spojené s biosyntézou ligninů. Vynález popisuje antigenní fragmenty proteinů podle vynálezu. Dále popisuje transgenní rostliny obsahující nukleové kyseliny podle vynálezu. Vynález se týká způsobů pro modulaci exprese nukleových kyselin podle vynálezu v transgenní rostlině.

Dále vynález popisuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující člena vybraného ze skupiny zahrnující (a) polynukleotid, který vykazuje alespoň 60 % shodu

I • · • · • · • · « s polynukleotidem kódujícím polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75, přičemž polypeptid přítomný jako imunogen vyvolává produkci protilátky, která specificky reaguje s polypeptidem, (b) polynukleotid, který je komplementární s polynukleotidem popsaným v odstavci (a) a (c) polynukleotid obsahující alespoň 25 sousedících nukleotidů z polynukleotidu popsaného v odstavci (a) nebo (b). V některých provedeních podle vynálezu má polynukleotid sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78. Izolovanou nukleovou kyselinou může být DNA.

Dále se vynález vztahuje k rekombinantním expresívním kazetám, které obsahují nukleovou kyselinu, jak se popisuje shora v textu, operativně spojenou s promotorem. V některých provedeních vynálezu je nukleová kyselina operativně spojená s promotorem v antisense orientaci.

Dále vynález popisuje hostitelskou buňku transfekovanou rekombinanntí expresívní kazetou, jak se popisuje shora v textu. V některých provedeních vynálezu hostitelskou buňkou je buňka čiroku (Sorghum bicolor) nebo kukuřice (Zea mays).

Dále se vynález týká izolovaného proteinu obsahujícího polypeptid, který zahrnuje alespoň 10 sousedících aminokyselin kódovaných izolovanou kyselinou, jak se popisuje shora v textu. V některých provedeních· vynálezu polypeptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75.

Dále se vynález týká izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotid s alespoň 25 nukleotidy, který selektivně hybridizuje za přísných podmínek s nukleovou kyselinou vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78 nebo její komplement. V některých provedeních podle vynálezu je izolovaná nukleová kyselina operativně spojena s promotorem.

Dále vynález popisuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující polynukleotid, který vykazuje alespoň 80 % «« · · ·»· ···· • · ···· · · · · • · » · ···«·«* · · · ·· ··· » * · · ······· ·· · ·» ·· sekvenční shodu s ekvivalentní délkou nukleové kyseliny vybrané ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78 nebo její komplement.

Dále vynález popisuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující polynukleotid vykazující sekvenci nukleové kyseliny amplifikovanou z knihovny nukleové kyseliny Zea mays za použití primerů vybraných ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 37 až 72 a 79 až 84 nebo její komplement. V některých provedeních podle vynálezu knihovna nukleové kyseliny je knihovna cDNA.

Dále se vynález týká rekombinantní expresívní kazety obsahující nukleovou kyselinu amplifikovanou z knihovny, jak se popisuje shora v textu, kde nukleová kyselina je operativně spojena s promotorem. V některých provedeních vynálezu se popisuje hostitelská buňka transfekovaná touto rekombinantní expresívní kazetou. V některých provedeních se vynález týká proteinu podle vynálezu, který se produkuje z této hostitelské buňky.

Dále vynález popisuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující polynukleotid kódující polypeptid, kde (a) polypeptid obsahuje alespoň 10 sousedících aminokyselinových zbytků z prvního polypeptidů vybraného ze skupiny obsahující SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75, kde uvedený polypeptid, když je prezentován jako imunogen, umožňuje produkci protilátek, které se specificky váží na první polypeptid, (b) polypeptid neváže antisérum vytvořené proti prvnímu polypetidu, které se zcela imunosorbovalo prvním polypeptidem, (c) molekulová hmotnost polypeptidů v neglykosylované formě je v rozmezí 10 % molekulové hmotnosti prvního polypeptidů..

Vynález se týká heterologního promotoru operativně spojeného s neizolovaným polynukleotidem podle vynálezu, kde polypeptid je kódován nukleovou kyselinou amplifikovanou z knihovny nukleové kyseliny.

Dále vynález popisuje transgenní rostlinu obsahující rekombinantní expresívní kazetu zahrnující rostlinný promotor • · ·»···»« · · · ·«· operativně spojený s libovolnou z izolovaných nukleových kyselin podle vynálezu. V některých provedeních výnálezu je transgenní rostlinou Zea mays. Vynález dále poskytuje transgenní semena pocházející z transgenní rostliny.

Vynález se dále vztahuje ke způsobu modulace exprese genů kódujících proteiny podle vynálezu v rostlině, který zahrnuje kroky (a) transformace rostlinné buňky rekombinantní expresívní kazetou, která obsahuje polynukleotid podle vynálezu operativně spojený s promotorem, (b) kultivaci rostlinné buňky za podmínek růstu rostlin a (c) vyvolání exprese polynukleotidu na dobu dostatečnou k modulaci exprese genů v rostlině. V některých provedeních podle vynálezu uvedenou rostlinou je kukuřice. Exprese genů kódujících proteiny podle vynálezu se může vzhledem k netransformované kontrolní rostlině zesílit nebo zeslabit.

Definice

Jednotky, předpony a symboly odpovídají formátu SI. Neníli uvedeno jinak, nukieové kyseliny se píší zleva doprava v orientaci od 5' do 3' konce; aminokyselinové sekvence se píší zleva doprava v orientaci od N-konce do C-konce. Číselná rozmezí zahrnují čísla definující rozmezí. Aminokyseliny se zde označují běžně známými třípísmennými symboly nebo jednopísmennými symboly doporučenými biochemickou názvoslovnou komisí IUPAC-IUB. Nukleotidy se mohou podobně označovat jednopísmennými kódy. Pro plný význam dále definovaných termínů se odkazuje k celému textu.

Termín „amplifikovaný znamená konstrukci více kopií sekvence nukieové kyseliny nebo více kopií komplementárních se sekvencí nukieové kyseliny, kdy se jako templát použije alespoň jedna ze sekvencí nukleových kyselin. Amplifikační systémy zahrnují systém polymerázové řetězcové reakce (PCR), systém ligázové řetězcové reakce (LCR), amplifikaci založenou na sekvenci nukieové kyseliny (NASBA, Cangene, Mississauga, • · · , · · · « · * * · . * · « ···«·»+ ·· ·· * » · ··· £ ·····»« * · > * * * *

Ontario), Q-Beta replikační systémy, amplífikační systém založený na transkripci (TAS) a amplifikace nahrazením řetězce (SDA) (popisuje se v publikaci Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persing et al., Ed., American Society for Mocrobiology, Washington, D. C. (1993). Produkt amplifikace se nazývá amplikon.

Termín „protilátka zahrnuje formu protilátek, která se váže na antigen (např. Fab, F(ab)₂). Termín „protilátka znamená polypeptid, který je v podstatě kódovaný genem nebo geny imunoglobulinu nebo jejich fragmentů, které se specificky váží nebo rozeznávají analyt (antigen). Zatímco různé fragmenty protilátek se mohou definovat na základě štěpení intaktních protilátek, pro odborníka je výhodné, že tyto fragmenty se mohou syntetizovat de novo buď chemicky nebo využitím metod rekombinace DNA. Termín protilátka zde tedy také zahrnuje fragmenty protilátek, jako jsou jednoduchý řetězec Fv, chimérové protilátky (to znamená protilátky, které obsahují konstantní a variabilní oblasti z různých druhů), humanizované protilátky (to znamená protilátky obsahující oblast stanovující komplementaritu (CDR) pocházející ze zdroje jiného než je člověk) a heterokunjugační protilátky (například bispecifické protilátky).

Termín „antigen zahrnuje látku, proti níž může být protilátka vytvořena a/nebo proti níž je protilátka specificky imunoreaktivní. Specifická imunoreaktivní místa v antigenu jsou známa jako epitopy nebo antigenní determinanty. Tyto epitopy mohou být lineárním seřazením monomerů v polymerní kompozici, jako jsou aminokyseliny v proteinu, nebo jsou tvořeny nebo obsahují komplexnější sekundární nebo terciální strukturu. Odborníkovi je zřejmé, že všechny imunogeny (to znanemá látky schopné vyvolat imunitní odezvu) jsou antigeny. Některé antigeny, jako jsou hapteny, však nejsou imunogeny, ale mohou se stát imonogenními spojením s molekulou nosiče. Protilátky imunogenně reaktivní s určitým antigenem se mohou • · vytvořit in vivo nebo způsobem rekombinace, jako je výběr • «·· ♦ * ♦ » « ···* · · · · • · · *······ ·· *

knihoven re	kombinantních protilátek	ve	fágu nebo v	podobných
vektorech i	(popisuje se například v	publikaci Huse	et al.,
Science 246	: 1275-1281 (1989) a Ward,	et	al., Nátuře	341: 544-
546 (1989)	a Vaughan et al., Nátuře	Biotech. 14:	: 309-314
(1996)).
Termín	„antisense orientace	znamená	duplexní
polyn ukleotidovou sekvenci, která	je	operativně	spoj ená

s promotorem v takové orientaci, že se přepisuje kódující DNAřetězec. Kódující DNA-řetězec je dostatečně komplementární s endogenním transkripčním produktem tak, že translace endogenního transkripčního produktu je často inhibována.

Termín „chromozomální oblast zahrnuje délku chromozómu, která se měří s ohledem na lineární segment DNA, který ji zahrnuje. Chromozomální oblast se může definovat s ohledem na na dvě jedinečné sekvence DNA, to znamená markéry.

Termín „konzervativně upravené varianty znamená jak aminokyselinové sekvence, tak sekvence nukleových kyselin. S ohledem na určité sekvence nukleových kyselin konzervativně upravené varianty znamenají ty nukleové kyseliny, které kódují shodné nebo konzervativně upravené varianty aminokyselinových sekvencí. Vzhledem k degeneraci genetického kódu velké množství funkčně identických nukleových kyselin kóduje libovolný daný protein. Například všechny kodóny GCA, GCC, GCG a GCU kódují aminokyselinu alanin. Tak v každé poloze, kde je alanin specifikovaný kodónem, se může kodón změnit na libovolný z odpovídajících popsaných kodónů, aniž dojde ke změně kódovaného poiypeptidu. Takové variace nukleových kyselin se nazývají „tiché variace a reprezentují jeden druh konzervativně upravené variace. Každá sekvence nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid; také popisuje každou možnou tichou variaci nukleové kyseliny. Odborníkovi je zřejmé, že každý kodón v nukleové kyselině (mimo AUG, což je obecně kodón pouze pro methionin) se může upravovat za vzniku funkčně • · shodné molekuly. Proto každá tichá variace nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid podle vynálezu₍ je implicitní v každé popsané polypeptidové sekvenci.

Pokud se týče aminokyselinových sekvencí, odborníkovi je zřejmé, že jednotlivé substituce, delece nebo adice k sekvenci nukleové kyselinu, proteinu nebo peptidu, které mění, adují

nebo deletují	j edinou	aminokyselinu	nebo	malé procento
aminokyselin	v kódované	sekvenci,	je	„konzervativně
modifikovanou	variantou,	kde změna	vede	k substituci

aminokyseliny chemicky podobnou aminokyselinou. Tak se může změnit libovolný počet aminokyselinových zbytků vybraných ze skupiny celých čísel obsahujících čísla od 1 do 15. Tak například se můře. provést 1, 2, 3, 4, 5, 7 nebo 10 změn.

Konzervativně upravené varianty v typickém případě poskytují podobnou biologickou aktivitu, jako neupravená polypeptidová sekvence, ze které vznikly. Například substrátová specifita, enzymatická aktivita nebo schopnost vazby ligand/receptor tvoří alespoň 30 %, 40 %, 50 %, 60 nebo 90 hodnot, které vykazuje přirozený protein v přítomnosti jeho přirozeného substrátu. Tabulky konzervativní substituce poskytují funkčně podobné aminokyseliny, které jsou dobře známy v oboru.

Následuje . 6 skupin, kdy každá obsahuje aminokyseliny, které jsou vzájemné konzervativní substituce:

1)	alanin (A), .	serin (S),
2)	kyselina aspartová (D),
3)	asparagin (N	), glutamin
4)	arginin (R),	lyzin (K)
5)	izoleucin (I	), leucin (
6)	fenylalanin	(F) , tyrozi

(popisuje se také v publikaci Creighton (1984) Proteins W. H. Freeman and Company).

Termín „kódující” nebo „kódovaný znamená s ohledem na určitou nukleovou kyselinu, že obsahuje informaci pro •» · · · ♦ · · « « « · · · · • · · · · · · · • * « ·«···« 'Β ·· • « · « · · » ··· ·· » 4* * translaci na specifikovaný protein. Nukleová kyselina kódující protein může v překládaných oblastech nukleové kyseliny obsahovat nepřekládané sekvence (například introny) nebo nemusí tyto zasahující nepřekládané sekvence obsahovat (například jako v cDNA). Informace, kterou je protein kódován, je specifikována použitím kodónů. Typicky je aminokyselinová sekvence kódována nukleovou kyselinou s použitím „univerzálního genetického kódu. Varianty univerzálního kódu, jaké jsou například vyskytují v mitochondriích některých rostlin, živočichů a hub, v bakteriích Mycoplasma capricolum (Proč. Nati. Acad. Sci. (USA), 82: 2306-2309 (1985)) nebo u nálevníka Macronucleus, se však mohou používat, když se nukleová kyselina exprimuje za použití těchto organizmů.

Když se nukleová kyselina připravuje nebo mění synteticky, je možno využít známých kodónových preferencí zamýšleného hostitele, v němž má být nukleová kyselina exprimována. Například ačkoli sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou exprimovat jak v jednoděložných tak dvouděložných rostlinách, sekvence se mohou upravovat tak, aby braly v úvahu preference specifického kodónu a obsah GC v jednoděložných a dvouděložných rostlinách, protože se ukázalo, že se tyto preference liší (popisuje se v publikaci Murray et al., Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)). Tak například kodón preferovaný kukuřicí pro určitou aminokyselinu se může odvodit ze známých sekvencí genů kukuřice. Použití kukuřičného kodónu v případě 28 genů z rostlin kukuřice se uvádí v tabulce č. 4 v publikaci Murray et al., Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)).

Termín „sekvence v celé délce znamená specifikovaný polynukleotid nebo jeho kódovaný protein, který vykazuje celou aminokyselinovou sekvenci přirozené (nesyntetické), endogenní, katalyticky aktivované formy specifikovaného proteinu. Sekvence v plné délce se může stanovit porovnáním velikostí vzhledem ke kontrole, která je přirozenou (nesyntetickou)

I • ··· ···» * · ··· · ·· · « · ······· · · · • · · · · · · • ·· ♦ «· · · endogenní buněčnou formou specifikované nukleové kyseliny nebo proteinu. Způsoby stanovení, zda se sekvence vyskytuje v celé délce, jsou dobře známy v oboru a zahrnují takové metody, jako je northernovy a westernový přenosy, extenzi primerů, ochranu Sl a ribonukleázovou ochranu (popisuje se například v publikaci Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997). Porovnání známých homologních sekvencí (ortologních a/nebo paralogních) se může také použít při identifikaci sekvencí v plné délce podle vynálezu. Identifikaci polynukleotidu jako polynukleotidu v plné délce napomáhají také konvenční sekvence, typicky přítomné v 5' a 3' nepřekládaných oblastech mRNA. Například konvenční sekvence ANNNNAUGG, kde podtržený kodón reprezentuje N-terminální methionin, napomáhá ke stanovení, zda polynukleotid má kompletní 5' konec. Konvenční sekvence na 3' konci, jako jsou polyadenylační sekvence,. napomáhají ke stanovení, zda polynukleotid má úplný 3' konec.

Termín „heterologní s ohledem na nukleovou kyselinu znamená nukleovou kyselinu, která pochází z cizorodého druhu nebo jestliže je ze stejného druhu, její složení a/nebo genový lokus se podstatně liší od její přirozené formy v důsledku úmyslného lidského zásahu. Například promotor operativně spojený s heterologním strukturním genem pochází z druhu, který je odlišný od druhu, z něhož se získal strukturální gen, nebo pocházejí-li oba ze stejného druhu, je původní forma jednoho nebo obou podstatně upravena. Heterologní protein může pocházet z cizorodých druhů nebo jestliže je ze stejného druhu, je jeho původní forma podstatně upravena úmyslným lidským zásahem.

Termín „hostitelská buňka znamená buňku, která obsahuje vektor a podporuje replikaci a/nebo expresi expresívního vektoru. Hostitelské buňky mohou být prokaryontní buňky, jako jsou E. coli, nebo eukaryontní buňky, jako jsou buňky kvasinek, hmyzu, obojživelníků nebo savců. Upřednostňuje se, • · • ·

aby hostitelské buňky byly buňky jednoděložných nebo dvouděložných rostlin. Zvláště preferovanou jednoděložnou hostitelskou buňkou je buňka kukuřice.

Termín „hybridizační komplex zahrnuje strukturu duplexní nukieové kyseliny tvořenou dvěma sekvencemi jednořetězcové nukieové kyseliny, které spolu vzájemně selektivně hybridi zuj í.

Termín „imunologicky reaktivní podmínky nebo „imunoreaktivní podmínky znamená podmínky, které umožňují protilátce vytvořené proti určitému epitopu vázat se na uvedený epitop ve vyšší míře (například alespoň dvakrát silněji proti pozadí), než se protilátka váže v podstatě na všechny jiné epitopy v reakční směsi, která obsahuje určitý epitop. Imunologicky reaktivní podmínky závisí na formátu reakce vázající protilátku a v typickém případě využívají protokolu imunologických testů (formáty a podmínky imunologických testů se popisují například v publikaci Harlow and Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)).

Termín „zavedený v souvislosti se začleněním nukieové kyseliny do buňky znamená „transfekci nebo „transformaci nebo „transdukci a zahrnuje začlenění nukieové kyseliny do eukaryontní a prokaryontní buňky, kde nukleová kyselina se může začlenit do genomu buňky (například chromozómová, plazmidová, plastidová nebo mitochodriální DNA), přeměnit se na autonomní replikon nebo se dočasně exprimovat (například transfekovaná mRNA).

Termín „izolovaný znamená materiál, jako je nukleová kyselina nebo protein, který je (1) v podstatě nebo v zásadě prostý složek, které jej v normálním případě doprovází nebo s ním reagují v jeho přirozeném prostředí. Izolovaný materiál popřípadě obsahuje materiál, který se s ním nenachází v jeho přirozeném prostředí nebo (2) jestliže materiál je ve svém přirozeném prostředí, • · • · · · * <

materiál se synteticky (nikoli přirozeně) změnil úmyslným zásahem člověka a/nebo se umístil do lokusu v buňce (např. genom nebo sub-buněčná organela), nepřirozeného pro materiál nalézaný v tomto prostředí. Změna pro získání syntetického materiálu se může provádět v materiálu v jeho přirozeném stavu nebo po odebrání z něj. Například přirozeně se vyskytující nukleová kyselina se stává izolovanou nukleovou kyselinou, jestliže je změněna nebo se přepisuje z DNA, která byla změněna pomocí nepřirozených, tj . syntetických (tzn. umělých) metod uskutečněných v buňce, z níž pochází (viz například Compounds and Methods for Site Directed Mutagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, U.S. Patent č. 5,565,350; In vivo Homologous Sequence Targeting in Eukaryotic Cells; Zarling et al., PCT/US93/03868). Podobně se přirozeně se vyskytující nukleová kyselina (např. promotor) stává izolovanou, jestliže se zavede nepřirozeným způsobem do lokusu genomu, který není přirozený pro tuto nukleovou kyselinu. Nukleové kyseliny, které jsou zde definovány jako „izolované, se také nazývají „heterologní nukleové kyseliny.

Není-li uvedeno jinak, znamená termín „nukleová kyselina pro biosyntézu ligninu nukleovou kyselinu obsahující polynukleotid („polynukleotid pro biosyntézu ligninu), kódující polypeptid biosyntézy ligninu. Termín „gen biosyntézy ligninu znamená genomovou formu polynukleotidu biosyntézy ligninu v plné délce, která není heterologní.

Termín „lokalizovaný v chromozomální oblasti definované pomocí a zahrnující s ohledem na určité markéry zahrnuje odkaz na kontinuální délku chromozomu, vymezeného uvedenými markéry a zahrnujícího je.

Termín „markér znamená lokus na chromozómu, který slouží k definici jediné polohy na chromozómu. Termín „polymorfní markér zahrnuje markér, který se vyskytuje ve více formách (alely), takže různé formy markéru, když jsou přítomny na homologním • · páru, umožňují přenos každého z chromozómů do toho páru, který následuje. Genotyp se může definovat použitím jednoho nebo více markérů.

Termín „nukleová kyselina zahrnuje deoxyribonukleový nebo ribonukleový polymer buď v jednořetězcové nebo v dvouřetězcové formě a neexistuje-li jiné omezení, zdůrazňuje známé analogy, které mají podstatu přirozených nukleotidů, která se projevuje tak, že hybridizují s jednořetězcovými nukleovými kyselinami způsobem podobným, jako dochází u přirozeně se vyskytujících nukleotidů (například peptidové nukleové kyseliny). Termín „knihovna nukleové kyseliny znamená sbírku izolovaných molekul DNA nebo RNA, které obsahují a' v podstatě reprezentují celou přepsanou frakci genomu specifikovaného organizmu. Konstrukce příkladů knihoven nukleové kyseliny, jako je genomová nebo cDNA knihovna, se provádí postupy molekulární biologie (popisují se například v publikaci Berget and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academie Press, Inc., San Diego, CA (Berger), Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2^nd ed., Vol. 1-3 (1989) a Current Protocols in Molecular Biology,

F. M. Ausubel et al., Eds., Current Protocols a joint venture mezi Greene Publishing Associates, Inc. a John Wiley and Sons, Inc. (1994 Supplement).

Termín „operativně spojený zahrnuje funkční spojení mezi promotorem a druhou sekvencí, kde promotorové sekvence zprostředkovává iniciuje a odpovídající druhé sekvenci „operativně spojený znamená, transkripci sekvence DNA V obecném případě termín že spojené sekvence nukleové kyseliny spolu sousedí a, jestliže je nezbytné spojit dvě oblasti kódující protein, ty spolu sousedí ve stejném čtecím rámci.

Termín „rostlina zahrnuje celou rostlinu, rostlinné orgány (např. listy, stonky, kořeny atd.), semena a rostlinné buňky a potomstvo. Rostlinná buňka zahrnuje bez omezení

« suspenzní kultury semen, embrya, meristematické oblasti, tkáň kalusu, listy, kořeny, výhonky, gametofyty, sporofyty, pyl a mikrospory. Třída rostlin, která se může použít v metodách podle vynálezu, je obecně tak široká jako třída vyšších rostlin, na které je možné aplikovat transformační metody a které zahrnují jednoděložné a dvouděložné rostliny. Zvláště preferovanou rostlinou je Zea mays.

Termín „polynukleotid zahrnuje deoxyribopolynukleotid, ribopolynukleotid nebo jejich analogy, které mají podstatný charakter přirozeného ribonukleotidu v tom, že hybridizují za přísných hybridizačních podmínek s v podstatě stejnou nukleotidovou sekvencí jako přirozeně se vyskytující nukleotidy. Polynukleotid může mít plnou délku nebo subsekvenci přirozeného nebo heterologního strukturálního nebo regulačního genu. Není-li uvedeno jinak, termín zahrnuje specifikovanou sekvenci, stejně jako její komplementární sekvenci. Tak DNA nebo RNA s modifikovaným hlavním řetězcem pro stabilitu nebo pro jiné účely spadají pod termín „polynukleotidy, jak je zde zamýšlen. DNA nebo RNA obsahující neobvyklé báze, jako je inosin, nebo modifikované báze, jako jsou tritylované báze, uvedema-li pouze dva příklady, jsou také polynukleotidy podle zde definovaného termínu. Je nutno zdůraznit, že byly provedeny četné modifikace DNA a RNA, které slouží pro řadu účelů, známých odborníkům. Termín polynukleotid zde zahrnuje chemicky, enzymaticky nebo metabolicky modifikované formy polynukleotidů, stejně jako chemické formy DNA a RNA, charakterisitické pro viry a buňky zahrnující mimo jiné jednoduché a komplexní buňky.

Termíny „polypeptid, „peptid a „protein se mohou zaměnit a znamenají polymer aminokyselinových zbytků. Tyto termíny se vztahují na aminokyselinové polymery, kde jeden nebo více aminokyselinových zbytků je umělý chemický analog odpovídající přirozeně se vyskytující aminokyseliny, stejně jako přirozeně se vyskytující aminokyselinové polymery.

Podstatnou charakteristikou takových analogů přirozeně se vyskytujících aminokyselin je, že když se začlení do proteinu, tento protein specificky reaguje s protilátkami vyvolanými proti témuž proteinu, tvořenému jen přirozeně se vyskytujícími aminokyselinami. Termíny „polypeptid, „peptid a „protein zahrnují modifikace, mezi něž patří bez omezení glykosylace, přichycení lipidů, sulfatace, gamma-karboxylace zbytků glutamové kyseliny, hydroxylace a ADP-ribosylace. Příklady modifikací jsou ve většině základních prací, jako je Proteins - Structure and Molecular Properties, 2^nd ed., T. E. Creighton,

W. H. Freeman and Company, New York (1993) . Na toto téma existuje řada podrobných přehledů, například Wold, F. , Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pp. 1-12, Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academie Press, New York

Meth. Enzymol. 182: Synthesis:

N. Y. Acad.

(1983); Seifter et al.

Rattan et al., Protein Modifications and Aging, Ann

626-646 (1990) a

Posttranslational

Sci. 663: 48-62 (1992). Je nutno zdůraznit, jak je známo a výše vzpomenuto, že polypeptidy nejsou vždy zcela lineární. Polypeptidy mohou být například větvené v důsledku všeobecného rozšíření, mohou být kruhové, s větvením nebo bez větvení, většinou jako výsledek posttranslačních jevů, včetně přirozeně probíhajících jevů a jevů způsobených lidskou manipulací, které se přirozeně nevyskytují. Kruhové, větvené a větvené kruhové polypeptidy se mohou syntetizovat netranslačním přirozeným procesem i plně syntetickými metodami. Úpravy mohou probíhat v libovolném místě polypeptidů včetně hlavního řetězce peptidů, bočních řetězců aminokyselin a N- nebo C-konce. Blokování aminoskupiny nebo karboxyskupiny v polypeptidů nebo obou kovalentní modifikací je běžné totiž v přirozeně se vyskytujících i syntetických polypeptidech a takové modifikace se mohou vyskytovat i v polypeptidech podle vynálezu. Například aminoterminální zbytek polypeptidů připravených v E. coli nebo • · • · · · · • · · · · · · · • · · · * · ·»·· • · * · ·····*· * · · • · ··« ···· ·«····· ·· · ·· ·* o

v jiných buňkách před proteolytickým zpracováním většinou vždy bude N-formylmethionin. Během post-translační úpravy peptidu se může deletovat methioninový zbytek na N-konci. Vynález popisuje použití obou aminoterminálních variant proteinu podle vynálezu, který obsahuje nebo neobsahuje methionin. V obecném případě termín polypeptid zdůrazňuje všechny takové modifikace, zvláště ty, které jsou přítomny v polypeptidech syntetizovaných expresí polynukleotidu v hostitelské buňce.

Termín „promotor zahrnuje oblast DNA proti směru exprese genu od počátku transkripce a podílí se na rozeznávání a navázání RNA polymerázy a jiných proteinů při iniciaci transkripce. Termín „rostlinný promotor je promotor schopný vyvolat transkripci v rostlinných buňkách. Příklady rostlinných promotorů zahrnují, ale nejsou omezeny na ty, které se získaly z rostlin, rostlinných virů a bakterií, které obsahují geny exprimované v rostlinných buňkách, jako je Agrobacterium nebo Rhi z obi um. Příklady promotorů zahrnují promotory, které s výhodou vyvolávají transkripci v jistých tkáních, jako jsou listy, kořeny, semena, vlákna, mízní cesty xylemu, tracheidy nebo sklerenchym. Takové promotory se označují jako „tkáňově preferované. Promotory, které iniciují transkripci pouze v určité tkáni, se označují jako „tkáňově specifické. Promotor specifický pro „typ buňky primárně řídí expresi v jistých typech buněk v jednom nebo více orgánů, například ve vaskulárních buňkách v kořenech nebo listech. „Indukovatelný promotor je promotor, který je řízen prostředím. Příklady podmínek prostředí, které mohou způsobit transkripci indukovatelnými promotory, zahrnují anaerobní podmínky nebo přítomnost světla. Tkáňově specifické, tkáňově preferované, indukovatelné promotory a promotory specifické pro typ buňky tvoří třídu „nekonstitutivních promotorů. „Konstitutivní promotor je promotor, který je aktivní při většině podmínek prostředí.

exprimují pnrozene geny, abnormálně, v nedostatečném

Termín „polypeptid biosyntézy ligninu znamená jednu nebo více aminokyselinových sekvencí v glykosylované nebo neglykosylované formě, které se účastní biosyntetické dráhy ligninu. Termín také zahrnuje fragmenty, varienty, homology, alely nebo jejich prekurzory (například pre-pro-proteiny nebo pro-proteiny). „Protein biosyntézy ligninu zahrnuje polypeptid biosyntézy ligninu.

Termín „rekombinantní zahrnuje buňku nebo vektor, který se upravil zavedením heterologní nukleové kyseliny nebo se buňka získala z buňky, která je upravena tímto způsobem. Tak například rekombinantní buňky exprimují geny, které se nenacházejí v přirozené (ne rekombinantní) formě buňky nebo které jsou jinak exprimovány množství nebo neexperimovány v důsledku úmyslného lidského zásahu. Termín „rekombinantní nezahrnuje změnu buňky nebo vektoru pomocí přirozeně se vyskytujícího jevu (například spontánní mutace, přirozená transformace/transdukce/transpozice) , jako jsou ty, které se vyskytují bez úmyslného zásahu člověka.

„Rekombinantní expresívní kazeta je konstrukt nukleové kyseliny, vytvořený rekombinantně nebo synteticky, s řadou specifikovaných elementů nukleových kyselin, které umožňují transkripci určité nukleové kyseliny v cílové buňce. Rekombinantní expresívní kazeta se může začlenit do plazmidu, chromozómu, mitochondriální DNA, plasmidové DNA, viru nebo fragmentu nukleové kyseliny. V typickém případě část expresívního vektoru tvořící rekombinantní expresívní kazetu zahrnuje mezi jinými sekvencemi přepisovanou nukleovou kyselinu a promotor.

Termíny „zbytek nebo „aminokyselinový zbytek nebo „aminokyselina zaměnitelně označují aminokyselinu, která je začleněna do proteinu, poiypeptidu nebo peptidů (souhrnně „protein). Aminokyselina může být přirozeně se vyskytující aminokyselinou a není li jinak vymezeno, může zahrnovat • · známé analogy přirozených aminokyselin, které mohou fungovat podobným způsobem jako přirozeně se vyskytující aminokyseliny.

Termín „selektivně hybridizuje znamená detekovatelně silnější hybridizaci sekvence nukleové kyseliny za přísných hybridizačních podmínek se specifikovanou cílovou sekvencí nukleových kyselin (například alespoň dvojnásobnou vůči pozadí), než je její nukleových kyselin, a nukleových kyselin.

hybridizace s necílovými s podstatným vyloučením Selektivně hybridi zující sekvencemi necílových sekvence v typickém případě vzájemně vykazují přibližně alespoň 80 % sekvenční identity a sekvenční identity (to je sekvenční identity, přednostně nejvíce se preferuje 100 % komplementární).

Termín „specificky reaguje zahrnuje vazebnou reakci mezi protilátkou a proteinem, který má epitop rozeznávaný vazebným místem antigenu na protilátce. Tato vazebná reakce determinuje přítomnost proteinu, který vykazuje rozeznávaný epitop, mezi přítomností heterogenní populace proteinů a jiných biologických láfejr. Za navržených podmínek imunologických testů se tedy specifické protilátky vážou na analyt obsahující rozeznávaný epitop v podstatně vyšší míře (například alespoň dvakrát silnější než pozadí), než na v podstatě všechny jiné analyty, kterým chybí epitop, jenž je přítomný ve vzorku.

Specifické navázání na protilátku za takových podmínek může vyžadovat protilátku, která je vybrána pro svou specifitu k určitému proteinu. Například je možno vybrat protilátky vytvořené proti polypeptidům podle vynálezu pro získání protilátek, které specificky vynálezu. Proteiny používané vyskytovat v přirozené konformaci nebo mohou být denaturovány tak, že poskytují lineární epitop.

Při selekci protilátek, které specificky reagují s určitým proteinem (nebo jiným analytem), se mohou použít různé formáty imunologických testů. Například imunologické testy ELISA na reagují s polypeptidy podle jako imunogeny se mohou

I »· » · pevné fázi se rutinně používají při selekci monoklonálních protilátek, které specificky imunologicky reagují s proteinem. Popis formátů imunologických testů a podmínek, které se mohou použít pro stanovení selektivní reaktivity, se uvádí v publikaci Harlow and Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)).

Termíny „přísné podmínky nebo „přísné hybridizační podmínky zahrnují podmínky, při kterých sonda detekovatelné silněji hybridizuje se svou cílovou sekvencí (například alespoň dvakrát silněji proti pozadí). Přísné podmínky závisí na sekvenci a liší se při různých okolnostech. Řízením přísnosti hybridizačních a/nebo promývacích podmínek se mohou identifikovat cílové sekvence, které jsou 100 % komplementární se sondou (homologní hybridizace). V jiném případě se mohou připravit přísné podmínky, aby v sekvencích umožnily chybné párování tak, že se detekují nižší stupně podobnosti (heterologní hybridizace). V obecném případě sondu tvoří méně než přibližně 1000 nukleotidů, upřednostňuje se méně než 500 nukleotidů.

Přísné podmínky jsou nejčastěji takové, kde koncentrace solí je nižší než asi 1,5 M iontů Na, typicky asi 0,01 až 1,0 M iontů Na (nebo jiných solí) při pH 7,0 až 8,3. Teplota je alespoň přibližně 30· °C v případě krátkých sond (například 10 až 50 nukleotidů) a alespoň přibližně 60 °C v případě dlouhých sond (například větších jak 50 nukleotidů). Přísných podmínek je také možné dosáhnout přidáním destabilizačních činidel, jako je formamid. Příkladné málo přísné podmínky zahrnují hybridizaci v přítomnosti pufrovacího roztoku obsahujícího 30 až 35 % formamidu, 1 M NaCI, 1 % SDS (dodecylsulfát sodný) při teplotě 37 °C a promývání v pufru lx až 2x SSC (20x SSC je 3,0 M NaCl/0,3 M citrát sodný) při teplotě 50 až 55°C. Příklad středně přísných podmínek hybridizace zahrnuje hybridizaci ve 40 až 45 % formamidu, 1M NaCI, 1 % SDS při teplotě 37 °C a promývání v • « • · * I * · · « - « · · .

······· · t β «- Ι

0,5x až Ix SSC při teplotě 55 až 60 °C. Příklady podmínek s vysokou přísností zahrnují hybridizaci v 50 % formamidu, 1M NaCl, 1 % SDS při teplotě 37 °C a promývání v 0,lx SSC při teplotě 60 °C až 65 °C.

Specifita hybridizace je v typickém případě funkcí promývání po hybridizaci. Kritickými faktory jsou iontová síla a teplota konečného promývacího roztoku. V případě hybridizace DNA-DNA se teplota denaturace T_m může odhadnout z rovnice Meinkotha a Wahla (uvádí se v publikaci Anal. Biochem., 138:267-284 (1384)): T_m = 81,5 °C + 16,6(log M) + 0,41 (%GC) 0,61 (% forr.)-500/L, kde M je molarita monovalentního kationtů, %GC je procento guanozinu a cytozinu v DNA, % form. je procento formamidu v hybridizačním roztoku a L je délka hybridu v párech baží. Teplota T_m je teplota (při definované iontové síle a pH) , při které 50 % komplementární cílové sekvence hybridizuje se sondou při úplném párování. Teplota T_m se snižuje o přibližně 1 °C pro každé 1 % nesprávného párování. Tak ceplota hybridizace T_m a/nebo podmínky promytí se mohou upravit tak, aby došlo k hybridizaci se sekvencemi požadované identity. Například, jestliže se uvažují sekvence vykazující více jak 90 % identitu, teplota tání T_m se může snížit o 10 °C. V obecném případě přísné podmínky se vybraly tak, aby teplota byla přibližně o 5 °C nižší než teplota denaturace (Ty pro specifickou sekvenci a jeho doplněk při definované iontové síle a pH. Avšak silně přísné podmínky vykazují hybridizaci a/nebo promývání při teplotě o 1, 2, 3 nebo 4 °C nižší než je teplota denaturace. Přísné podmínky vykazují hybridizaci a /nebo promytí při teplotě o 6, 7, 8, 9 nebo 10 °C než je teplota denaturace. Málo přísné podmínky zahrnují hybridizaci a/nebo promývání při teplotě o 11, 12,

13, 14, 15 nebo 20 °C nižší než je teplota denaturace. Za použití rovnice, hybridizačních a promývacích podmínek a požadované teploty denaturace, je odborníkovi zřejmé, že se popisuje řada přísností hybridizačních podmínek. Jestliže na • · • 0 · ·'>'« » • 0 * « 4 '» Μ · · · «· » ♦ * 4. β « • 000000 00 · 00 základě požadovaného stupně nesprávného párování je T_m menší než 45 °C (vodný roztok) nebo 32 °C (formamidový roztok), je výhodné zvýšit koncentraci SSC, aby mohla být použita vyšší teplota. Vyčerpávající návod k hybridizaci nukleových kyselin lze nalézt v Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,

Part I, Chapter 2 „OverView of principles of hybridization and the stratégy of nucleic acid probe assays, Elsevier, New York (1993) a Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2,

Ausubel, et al. , Eds., Greene Publishing and WileyInterscience, New York (1995).

„Transgenní rostlina zde odkazuje na rostlinu, která zahrnuje ve svém genomu heterologní polynukleotid. Obecně se heterologní nukleotid stabilně integruje do genomu, takže tento polynukleotid přechází na další generace. Heterologní polynukleotid může být integrován do genomu samotný nebo jako součást rekombinantní expresívní kazety. Termín „transgenní zde zahrnuje libovolnou buňku, buněčnou linii, kalus, tkáň, rostlinou část nebo rostlinu, jejichž genotyp se změnil přítomností heterologní nukleové kyseliny, a vztahuje se na původně takto změněné transgenní objekty stejně jako na ty, které vznikly sexuálním křížením nebo asexuálním množením z původních transgenních objektů. Termín „transgenní zde nezahrnuje změnu genomu (chromozomální nebo extrachromozomální) běžnými metodami šlechtění rostlin nebo v důsledku přirozeně se vyskytujících jevů, jako je náhodné křížové oplození, nerekombinantní virová infekce, nerekombinantní bakteriální transformace, nerekombinantní transpozice nebo spontánní mutace.

Termín „vektor znamená nukleovou kyselinu používanou při transfekci hostitelské buňky, do které je možné začlenit polynukleotid. Vektory jsou často replikony. Expresívní vektory umožňují transkripci vložené nukleové kyseliny.

• * to

Při popisu sekvenčních vztahů mezi dvěma nebo více nukleovými kyselinami nebo polynukleotidy se používají tyto termíny: (a) „referenční sekvence, (b) „srovnávací okno (c) „sekvenční shoda, (d) „procento sekvenční shody a (e) „podstatná identita.

(a) „Referenční sekvence znamená definovanou sekvenci používanou jako základní sekvenci při porovnání sekvencí. Referenční sekvencí může být část nebo celek specifikované sekvence, například segment c-DNA v plné délce nebo genové sekvence nebo kompletní cDNA nebo genová sekvence.

(b) „Srovnávací okno odkazuje na souvislý a konkrétní segment polynukleotidové sekvence, kde se polynukleotidová sekvence může porovnat s referenční sekvencí a kde část polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okně může obsahovat adice nebo delece (tj. mezery) ve srovnání s referenční sekvencí (která neobsahuje adice nebo delece) při optimálním uspořádání dvcu sekvencí. Obecně tvoří srovnávací okno délka alespoň 20 sousedících nukleotidů, popřípadě 30, 40, 50, 100 nebo více nukleotidů. Odborníkovi je zřejmé, že pro předejití vysoké podobnosti s referenční sekvencí v důsledku zabudování mezer do polynukleotidové sekvence se nejčastěji zavádí srážka na mezery a odečte se z počtu párování.

Metody uspořádání sekvencí pro porovnání jsou v oboru známy. Optimální uspořádání sekvencí pro porovnání se může provést pomocí algoritmu lokální homologie podle Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), algoritmu homologického uspořádání podle Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), metodou vyhledávání podobnosti podle Pearson and Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci.

komputerizovaným použitím těchto algoritmů, neomezujícím se na CLUSTAL v PC/Gene programu Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA v Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group

85: 2444 (1988), zahrnujícím, ale

I

4> · · · • · : BLASTN pro nukleotidovým (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA. Program CLUSTAL se dobře popisuje v publikaci Higgins and Sharp, Gene 73: 237244 (1988), Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989),

Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988),

Huang et al., Computer Applications in the BioscipDces 8: 15565 (1992) a Pearson et al. , Mefhods in Molecular Biology 24:

307-331 (1994). Programy rodiny BLAST, které se mohou použít při vyhledávání databázové podobnosti zahrnují nukleotidové dotazované sekvence proti databázovým sekvencím, BLASTX pro nukleotidové dotazované sekvence proti proteinovým databázovým sekvencím, BLASTP pro proteinové dotazované sekvence proti proteinovým databázovým sekvencím, TBLASTN pro proteinové dotazované sekvence proti nukleotidovým databázovým sekvencím a TBLASTX pro nukleotidové dotazované sekvence proti nukleotidovým databázovým sekvencím (popisuje se v publikaci Cubrent Protocols in Molecular Biology , Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995)).

Není-li uvedeno jinak, zde uváděné hodnoty sekvenční podobnosti/shody se získaly použitím programu BLAST 2.0.1 za použití nastavených parametrů (popisuje se v publikaci Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)).

Odborník rozumí, že vyhledávání programem BLAST předpokládá, že proteiny se mohou modelovat jako náhodné sekvence. Avšak řada reálných proteinů obsahuje oblasti nenáhodných sekvencí, které mohou být homopolymerní trakty, krátké repetice nebo oblasti bohaté na jednu nebo dvě aminokyseliny. Takové oblasti s nízkou komplexností se mohou nacházet mezi proteiny, které nejsou příbuzné dokonce i tehdy, jsou-li jiné oblasti proteinu zcela odlišné. Za účelem redukovat takové málo komplexní uspořádání může se použít řada programů filtrujících nízkou komplexnost. Například filtry nízké komplexnosti SEG (Wooten and Federhen, Comput. Chem.,

17:149-163 (1993)) a XNU (Claverie and States, Comput. Chem.,

17: 191-201 (1993)) se mohou použít samotní nebo v kombinaci.

(c) Termín „sekvenční shoda nebo „shoda v kontextu kyseliny nebo dvou sekvencích, s dvěma sekvencemi nukleové polypeptidu zahrnuje zbytky ve která jsou stejné, když se řadí na základě maximální korespondence ve specifikovaném srovnávacím okně. V případě, že se sekvenční shoda použije v souvislosti s proteinem, zjišťuje se, že pozice zbytků, které nejsou shodné, se často liší konzervativními aminokyselinovými substitucemi, kde aminokyselinové zbytky se substituují jinými aminokyselinovými zbytky s podobnými chemickými vlasonostmi (například náboj nebo hydrofobicitu) a proto se nemění funkční vlastnosti molekuly. Tam, kde se sekvence liší konzervativními substitucemi, může se procento sekvenční shody nadhodnotit, aby se opravila konzervativní podstata substituce. Uvádí se, že sekvence, které se liší takovými konzervativnímiii substitucemi, vykazují „sekvenční podobnost nebo „podobnost. Způsoby provedení tohooo odhadu jsou dobře známy v oboru. V typickém případě uvedené metody zahrnují skórování konzervativní substituce, jako částečné spíše než úplné párování, přičemž se zvyšuje procento sekvenční shody. Tak například, jestliže shodné aminokyselině se přiřadí skóre 1 a nekonzervativní subsoituci se přiřadí skóre 0 pak konzervativní subsoituci se přiřadí skóre mezi 0 a 1. Skórování konzervativních substitucí například podle algoritmu se může vypočítat Meyers and Miller,

Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17 (1988), který se například může v nést do programu PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA).

a · (d) Termín „procento sekvenční shody znamená hodnotu optimálně seřazených okně, kde část (e) (i) Termín „podstatná sekvencí znamená, že stanovenou porovnáním dvou sekvencí ve srovnávacím polynukleotidové sekvence ve srovnávacím okně může obsahovat ve srovnání s referenční sekvencí (která neobsahuje adice a delece) adice nebo delece (to znamená mezery) pro optimální uspořádání dvou sekvencí. Procento se vypočítá stanovením počtu poloh, kde se v obou sekvencích objevuje identická báze nukleových kyselin nebo aminokyselinový zbytek, aby se získal počet párovaných poloh,, vydělením počtu párovaných poloh celkovým počtem poloh ve srovnávacím okně a vynásobením výsledku stem, aby se získalo procento sekvenčí identity.

shoda polynukleotidových polynukleotid obsahuje sekvenci, která má alespoň 70% sekvenční přednostně alespoň 80% sekvenční shodu, a optimálně alespoň 95% shodu, výhodně shodu alespoň

90^£ v porovnání s referenční sekvencí za použití jednoho z popsaných programů za použití standardních parametrů. Odborník ví, že tyto hodnoty se mohou za odpovídající shody proteinů nukleovými' sekvencemi příslušně kodónu, účelem stanovení kódovaných dvěma nastavit tím, že se zohlední degenerace podobnost aminokyselin, polohování čtecího rámce a podobně. Podstatná shoda aminokyselinových sekvencí pro tyto účely normálně znamená alespoň 60% sekvenční shodu, přednostně alespoň 70%, 80%, 90% a optimálně alespoň 95% shoda.

Dalším náznakem, že nukleotidové sekvence v podstatě shodné, je, vzájemně hybridizují za nukieové kyseliny, jsou spolu

Avšak když dvě molekuly přísných podmínek.

které spolu vzaj emne i

• 4>

• Μ · · « « ·

Přehled stále které K tomu může dojít nehybridizují za přísných podmínek, jsou v podstatě shodné, jestliže polypeptidy, kódují, jsou v podstatě shodné například, když se vytvoří kopie nukleové kyseliny za použití maximální degenerace kodónu přípustné genetickým kódem. Jednou indikací, že dvě sekvence nukleových kyselin jsou v podstatě shodné je, že polypeptid, kyselinou, který je kódován první nukleovou reaguj e imunologicky křížově s polypeptidem kódovaným druhou nukleovou kyselinou, (ii) Termín „podstatná shoda v souvislosti s peptidem znamená, že peptid obsahuje sekvenci vykazující alespoň 70 % sekvenční shodu s referenční sekvencí. Upřednostňuje se 80 % shoda, více se upřednostňuje 85 % shoda. Nejvíce se preferuje alespoň 90 % nebo 95 % sekvenční shoda s referenční sekvencí ve specifikovaném srovnávacím okně. Je výhodné, aby optimální seřazení se uskutečnilo za použití algoritmu homologního seřazení podle Neediemama a Wunsche (popisuje se v publikaci Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)). Indikace skutečnosti, že dvě peptidové sekvence jsou v podstatě identické, imunologicky reaktivní proti druhému peptidů.

je, když jeden peptid je s protilátkami vytvořenými Peptid je tak v podstatě shodný s druhým peptidem, což je například, když se dva peptidy liší pouze konzervativní substitucí. Peptidy, které jsou „v podstatě podobné sdílí sekvence, jak se popisuje shora v textu, s výjimkou, že polohy zbytků, které nejsou identické se mohou lišit konzervativními změnami aminokyselin.

«4 «

Vynález popisuje mimo jiné kompozice a metody úpravy (to znamená zvýšecí nebo snížení) celkového množství proteinů podle vynálezu a/nebo změny jejich poměrů v rostlinách. Vynález dále popisuje využití při takových příkladných aplikacích, jaro je zlepšení trávení krmných plodin, zvýšení hodnoty rostlinného materiálu využitelného v papírenském průmyslu a v průmyslu zpracování buničiny, stejně jako při zlepšení stojazosti plodin, zlepšení využitelnosti rostlinného materiálu , kce je obsah a složení ligninu důležité, jako je například použití rostlinných ligninů jako chemické výchozí suroviny, neoo použití hyperligninovaného rostlinného materiálu pro použití jako palivového zdroje. Zvláště polypeptidy podle vynálezu se mohou exprimovat v době nebo v množství, kzeré není charakteristické pro nerekombinantní rostliny.

Vynález áále popisuje izolovanou nukleovou kyselinu obsahující nukleotidy dostatečné délky a komplementarity s genem lignir.ové biosyntézy vhodné pro použití jako sond nebo pro amplifikaci primerů při detekci, kvantifikaci nebo izolaci genových trauskriptů. Izolované nukleové kyseliny podle vynálezu se například mohou použít jako sondy při detekci nedostatečnosti na úrovni mRNA, při testování požadovaných transgenních rostlin, při detekci genu (například substituce, delece a adice;, při monitorování nadměrné exprese nebo změn enzymatické aktivity, při testování látek, při detekci libovolného poštu alelových variant (polymorfizmus) genu nebo při použití jako molekulových markérů v programech šlechtění rostlin. Izolované nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou také použít při rekombinantní expresi polypeptidů biosyntézy ligninu nebo při použití imunogenů při přípravě a/nebo testování prccilátek. Izolované nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou také použít při sense a antisense supresi jednoho nebo více genů biosyntézy ligninu hostitelské buňky, tkáně nebo rostliny. Zachycení chemického činidla, které se * · · váže, interkaluje, štěpí a/nebo se síťuje s izolovanou nukleovou kyselinu podle vynálezu, se může také použít při modulaci transkripce nebo translace. Dále, za použití primeru specifického pro začleněnou sekvenci (například transpozón) a primeru, který specificky hybridizuje s izolovanou nukleovou kyselinou podle vynálezu, se může použít amplifikace nukleové kyseliny pro identifikaci začleněné sekvence deaktivovaných genů biosyntézy ligninu z knihovny cDNA připravené ze začleněné sekvence rostlin upravených mutací. Ze semen potomstva rostlin obsahujících požadovaný deaktivovaný gen se mohou vypěstovat rostliny pro studium fenotypických změn, které jsou charakteristické pro deaktivaci (popisuje se v publikaci Tools to Determine the Function of Genes, 1995 Proceedings of the Fiftieth Annual Corn and Sorghum Industry Research Conference, American Seed Trade Association, Washington, D. C. 1995). Navíc se může nepřekládaná 5' nebo 3' oblast polynukleotidů podle vynálezu použít při úpravě výtěžku heterologní mRNA a/nebo syntézy proteinu. Dále se může kodónová preferenční charakteristika polynukleotidů podle vynálezu použít v heterologních sekvencích nebo změnit v homologních nebo heterologních sekvencích za účelem modulace síly a/nebo rychlosti translace.

Vynález dále popisuje izolované proteiny obsahující polypeptidy zahrnující aminokyselinovou sekvenci z polypeptidů biosyntézy ligninů (například preproenzym, proenzym nebo enzymy). Vynález dále popisuje proteiny obsahující alespoň jeden epitop z polypeptidu biosyntézy ligninu. Proteiny podle vynálezu se mohou použít při testování agonistů nebo antagonistů funkce enzymů nebo pro použití jako imunogeny nebo antigeny pro získání protilátek, specificky imunoreaktivních s proteinem podle vynálezu. Takové protilátky se mohou použít v testech síly exprese, při identifikaci a/nebo izolaci nukleových kyselin podle vynálezu z expresívních knihoven nebo při čištění polypeptidů biosyntézy ligninu.

• ·

Izolované nukieové kyseliny podle vynálezu se mohou použít v širokém rozmezí rostlinných typů, které zahrnují druhy rodu Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Irifoliům, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Mar.ihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Scianum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisur., Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Secale, Triticum, Sorghum, Picea a Populus.

Nukieové kyseliny

Vynález mimo jiné popisuje izolované nukieové kyseliny RNA, DNA a jejich analogy a/nebo chiméry, které obsahují polynukleotid biosyntézy ligninu kódující takové enzymy, jako jsou: cinamár-4-hydroxyláza (C4H), 4-kumarát-3-hydroxyláza (C3H), kávová O-metyltransferáza (C-OMT), ferulát-5hydroxyláza (F5H), kafeyl-CoA-3-0-metyltransferáza (CcoA-OMT), 4-kumarát:CoA ligáza (4CL), cinnamoyl-CoA reduktáza (CCR), cinnamylalkohcldehydrogenáza (CAD), difenyloxidáza (DPO), což je lakkáza, která.se podílí na polymerizaci monomeru.

Nukieové kyseliny biosyntézy ligninu podle vynálezu obsahují izolované polynukleotidy biosyntézy ligninu, které zahrnují:

(a) polynukleotid kódující polypeptid biosyntézy ligninu se sekvencí SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75 a jeho konzervativně modifikované a polymorfní varianty, zahrnující příkladné polynukleotidy se sekvencí SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78, (b) polynukleotid, který je produktem amplifikace z knihovny nukieové kyseliny rostliny Zea mays za použití párů primerů z konsekutivních párů ze

I • · sekvencí SEQ ID NO: 37 až 72 a 79 až 84, které amplifikují polynukleotidy vykazující podstatnou shodu s polynukleotidy ze skupiny mající sekvence SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78, (c) polynukleotid, který selektivně hybridizuje s polynukleotidem popsaným v odstavci (a) a (b), (d) polynukleotid vykazující alespoň 60 % sekvenční shodu s polynukleotidy popsanými v odstavci (a), (b) a (c) , (e) polynukleotid kódující protein, který vykazuje specifický počet sousedících aminokyselin z prototypového polypeptidu, kde protein je specificky rozeznáván antisérem vyvolaným proti proteinu a kde protein není schopen detekovatelně imunologicky reagovat s antisérem, které je zcela imunologicky sorbováno proteinem, (f) komplementární sekvence polynukleotidů popsaných v odstavci (a), (b), (c), (d) nebo (e) a (g) polynukleotid obsahující alespoň 15 sousedících nukleotidů z polynukleotidů popsaného v odstavci (a), (b) , (c) , (d) , (e) nebo (f) .

A. Polynukleotidy kódující protein A SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75 nebo jeho konzervativně modifikované nebo polymorfní varianty

Jak se uvádí v odstavci (a) shora v textu, vynález popisuje izolované heterologní nukleové kyseliny obsahující polynukleotid biosyntézy ligninu, kde uvedený polynukleotid kóduje polypeptid biosyntézy ligninu. Polynukleotid vykazuje sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75 nebo jeho konzervativně modifikované nebo polymorfní varianty. Odborníkovi je zřejmé, že degenerace genetického kódu umožňuje pluralitu nukleotidů, aby kódovaly identickou aminokyselinovou sekvenci. Takové „tiché variace se mohou použít například při * 4 selektivní oybridizaci a detekci alelových variant polynukleotidy podle vynálezu. Vynález zahrnuje polynukleotidy se sekvencí uvedenou SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78 a tiché variace polynukleotidů kódujících polypeptid se sekvencí uvedenou v SE2 ID NO: 1 až 18 a 73 až 75. Vynález dále popisuje izolcvané nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy kódující konzervativně modifikované varianty polypeptidů se sekvencí uvezenou v SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75. Konzervativně modifikované varianty se mohou použít při tvorbě nebo selekce protilátek, které jsou imunoreaktivní s invariantním polypeptidem. Vynález dále popisuje izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy kódující jed/vj nebo více polymorfních (alelových) variant polypeptidů/pcíynukleotidů. Polymorfizmy se často využívaly při segregaci chromozomálních oblastí například při selekčních metodách za peužití markéru, které slouží při zlepšení plodin. Příklady polymerfizmu jsou uvedeny v tabulce č. 1.

Tabulka č. 1

SEQ ID NO: 20
Poloha polymorfizmu
V/mezi nukleotidem č.	Kodón č.	Polymorfní varianty	Kódovaná aminokyselina(y )
248	31	T, C	Leu
376	141	A, C	Arg
719	188	C, T	Ala
1169	338	T, C	Ile
1431	426	A, C	Lys, Gin
1454	433	A, C	Gly
1613	486	T, C	Asp
1820	555	G, C	Gin, His
1846		A, G

1851		C, G
1859		A,G
2021, 2022		G (inzerce)
2075		T, C

4-kumarát: CoA ligáza je kódována polypeptidy se sekvencí SEQ ID NO: 1, 2 a 3, které kódují nukleové kyseliny se sekvencí SEQ ID NO: 19, 20, resp. 21.

Kávová O-metyltransferáza (C-OMT) je kódována polypeptidy se sekvencí SEQ ID NO: 4, 5, 6 a 7, které kódují nukleové kyseliny se sekvencí SEQ ID NO: 22, 23, 24, resp. 25.

Cinamát-4-hydroxyláza (C4H) je kódována polypeptidy se sekvencí SEQ ID NO: 8 a 9, které kódují nukleové kyseliny se sekvencí SEQ ID NO: 26, resp.a 27.

Cinamylalkoholdehydrogenáza (CAD) je kódována polypeptidy se sekvencemi SEQ ID NO: 10, 11 a 12, které kódují nukleové kyseliny se sekvencemi SEQ ID NO: 28, 29, resp. 30.

Kafeoyl-CoA-3-O-metyltransferáza (CcoA-OMT) je kódovánay polypeptidy se sekvencemi SEQ ID NO: 13, 14, 15 a 74, kódují nukleové kyseliny se sekvencemi SEQ ID NO: 31, 32, 33, resp.

~7 7 / : .

Cinamoyl-CoA reduktázy (CCR) je kódována polypeptidem se sekvencí SEQ ID NO: 34, který je kódován nukleovou kyselinou se sekvencí SEQ ID NO: 16.

Částečná sekvence ferulát-5-hydroxylázy (F5H) je kódována polypeptidem se sekvencí SEQ ID NO: 35, který kóduje nukleová kyselina se sekvencí SEQ ID NO: 17.

Částečná sekvence difenyloxidázy (DPO) je kódována polypeptidem se sekvencí SEQ ID NO: 36, který kóduje nukleová kyselina se sekvenci SEQ ID NO: 18.

Ferulát-5-hydroxyláza (F5H) je kódována polypeptidem se sekvencí SEQ ID NO: 73, který kóduje nukleová kyselina se sekvencí SEQ ID NO: 76.

Difenyloxidáza (DPO) je kódována polypeptidem se sekvencí SEQ ID NO: 75, který je kódován nukleovou kyselinou se sekvencí SEQ ID NO: 78.

genomová knihovna nebo z jaderných transkriptů

B. Polynukleotidy amplifikované z knihovny nukleové kyseliny rostliny Zea mays.

Jak se uvádí v odstavci (b) shora v textu, vynález popisuje izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy biosyntézy ligninu, kde uvedené polynukleotidy se amplifikují z knihovny nukleové kyseliny Zea mays. Linie Zea mays B73, PHREl, A632, BMS-P2#10, W23 a Mol7 jsou dobře známy v oboru a jsou běžně dostupné. Jiné běžně známé a dostupné linie kukuřice je možné získat v Maize Genetics Cooperation (Urbana, IL). Knihovnou nukleových kyselin může být knihovna cDNA, knihovna obecně konstruovaná v libovolném stádiu zpracování intronů. Obecně se knihovna nukleové kyseliny cDNA konstruuje tak, aby obsahovala většinu cDNA celé délky. Často se knihovny cDNA normalizují tak, aby se zvýšilo zastoupení relativně řídce se vyskytujících cDNA. V preferovaných provedeních se knihovna cDNA konstruuje ze zralé lignifikované tkáně, jako jsou kořeny, listy nebo vláknina. Knihovnu je možné zkonstruovat za použití metod syntézy cDNA v plné délce. Příklady takových způsobů zahrnují metodu „Oligo-Capping (Maruyama, K. and Sugano, S. Gene 138: 171-174, 1994), biotinovaný zachycovač CAP (Carninci, P. Kvan, C. et al., Genomics 37: 327-336, 1996) a postup CAP retence (Edery, E.,

Chu, L. L., et al. Molecular and Cellular Biology 15: 33633371, 1995). Syntéza cDNA se přednostně katalyzuje při teplotě až 55 °C, aby se předešlo tvorbě sekundární struktury RNA. Příklady reverzních transkriptáz, které jsou relativně stabilní při uvedených teplotách, jsou SuperScript II reverzní Technologies, lne.), AMV transkriptáza transkriptáza (Life (Boehringer Mannheim)

RetroAmp reverzní reverzní transkriptáza (Epicentre). Jako zdroje mRNA se výhodně používají rychle rostoucí tkáně nebo rychle se dělící buňky.

Polynukleotidy podle vynálezu zahrnují amplifikované polynukleotidy za použití příměrových párů:

SEQ ID NO: 37 a 38, kde vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 19,

SEQ ID NO: 39 a 40, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 20,

SEQ ID NO: 41 a 42, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 21,

SEQ ID NO: 43 a 44, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 22,

SEQ ID NO: 45 a 46, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 23,

SEQ ID NO: 47 a 48, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 24,

SEQ ID NO: 49 a 50, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 25,

SEQ ID NO: 51 a 52, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 26,

SEQ ID NO: 53 a 54, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 27,

SEQ ID NO: 55 a 56, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 28,

SEQ ID NO: 57- a 58, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 29,

SEQ ID NO: 59 a 60, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 30,

SEQ ID NO: 61 a 62, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 31,

SEQ ID NO: 63 a 64, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 32,

SEQ ID NO: 65 a 66, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 33,

I

SEQ ID NO: 67 a 68, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 34,

SEQ ID NO: 69 a 70, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 35,

SEQ ID NO: 31 a 72, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 36,

SEQ ID NO: 79 a 80, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 76,

SEQ ID NO: 31 a 82, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 77,

SEQ ID NO: 33 a 84, vzniklý amplikon obsahuje sekvenci vykazující podstatnou shodu se sekvencí SEQ ID NO: 78.

Vynález saké popisuje sub-sekvence nukleových kyselin v plné délce. Libovolný počet sub-sekvencí se může získat odkazem na SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78 a za použití primeru, které selektivně amplifikují za přísných podmínek: alespoň dvě místa na polynukleotidech podle vynálezu nebo dvě místa v nukleové kyselině, která lemuje 3 obsahuje polynukleotid podle vynálezu, nebo místo v polynukleotidu podle vynálezu a místo v nukleové kyselině, která bo obsahuje. Je známo řada metod, které lze použít pro získání 5' a/nebo 3'konců. Je ~o například metoda RACE (rychlá amplifikace komplementárních konců), jak se popisuje v publikaci Frohman, M. A., PCR Protocols: A Guide to methods and applications, M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, T.

(Academie Press, lne. , San Diego, 1990), pp, popisuje v publikacích U.S. Pat. Č. 5,470,722 a Protocols in Molecular Biology, Unit 15.6, Ausubel, et al., Eds., Greene Pu. blishing and Wiley-Interscience, New York Vynález popisuje polynukleotidy biosyntézy ligninu, mají sekvenci genu biosyntézy ligninu , jaderný transkript, cDNA nebo komplementární sekvence a/nebo jejich sub-sekvence.

J. White, Eds. 28-38), dále se

Current (1995;

které • «

Sekvence primerů se mohou získat odkazem na souvislou sekvenci polynukleotidu podle vynálezu. Vybírají se primery, aby selektivně hybridizovaly za podmínek amplifikace PCR s polynukleotidem podle vynálezu v amplifikační směsi, která obsahuje genomovou knihovnu a/nebo knihovnu cDNA ze stejných druhů. V obecném případě jsou primery komplementární se subsekvencí amplikonu, který tvoří. V některých provedeních vynálezu se primery budou konstruovat navázáním jejich 5'terminálních konců ke kodonu, který kóduje aminokyselinový zbytek C- nebo N-konce (nebo jejich komplementy) polynukleotidů podle vynálezu. Délka primerů v nukleotidech se volí ze skupiny celých čísel zahrnující alespoň 15 až 50. Tyto primery mohou obsahovat alespoň 15, 18, 20, 25, 30, 40 nebo 59 nukleotidů. Na 5' konec primerů je možno přidat sekvenci, nepodléhající teplotní hybridizaci („ocas), například pro zavedení klonovacího místa na terminální konce amplikonu.

Amplifikační primery se mohou prodlužovat směrem ke 3' konci dalšími sousedícími nukleotidy z polynukleotidových sekvencí, jako jsou SEQ ID NO: 19 až 36 a 76 až 78, ze kterých jsou odvozeny. Počet nukleotidů, které mohou primery prodloužit, se volí ze skupiny celých čísel zahrnující alespoň 1 až 25. Primer tak může být například prodloužen o dalších 1, 5, 10 nebo 15 nukleotidů. Odborníkovi je zřejmé, že prodloužená příměrová sekvence se může použít' pro zvýšení specifity navázání (tj. teplotní hybridizace) k cílové sekvenci.

Amplifikační produkty lze překládat za použití expresních systémů, známých odborníkům nebo níže popisovaných. Výsledné translační produkty lze potvrdit jako polypeptidy podle vynálezu například testováním příslušné katalytické aktivity (například specifická aktivita a/nebo substrátová specifita) nebo ověřením přítomnosti jednoho nebo více lineárních epitopů, specifických pro polypeptid podle vynálezu. Metody vhodné pro syntézu proteinu z templátu získaných PCR jsou dobře známy v oboru a jsou běžně dostupné a popisují se v publikaci Amersham Life Sciences, lne. Catalog'97, p. 34.

C. Polynukleotidy, které selektivně hybridizují s polynukleotidem popsaným v odstavci (A) nebo (B).

Jak se uvádí v odstavci (c) shora v textu, vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy biosyntézy ligninu, kde polynukleotidy selektivně hybridizují za selektivně hybridizačních podmínek s polynukleotidem popsaným v shora v textu v odstavci (A) nebo (B). Polynukleotidy tohoto provedení se mohou použít při izolaci, detekci a/nebo kvantifikaci nukleových kyselin obsahuj ícít⁴¹ polynukleotidy popsaní/ . v odstavci (A) nebo (B) . Polynukleotidy podle vynálezu se mohou například použít při identifikaci, izolaci a amplifikaci částí nebo celých klonů v uložené knihovně. V některých provedeních vynálezu jsou polynukleotidy genomové sekvence nebo sekvence cDNA izolované z knihovny nukleové kyseliny Zea mays. Upřednostňuje se, aby knihovna cDNA obsahovala alespoň 80 % sekvencí plné délky, upřednostňuje se alespoň 85 % nebo 90 % sekvencí plné délky a více se upřeonostňuje alespoň 95 % sekvencí plné délky.

Knihovny cDNA se mohou upravit tak, aby se zvýšila reprezentace řídkých sekvencí. Hybridizace za málo přísných podmínek je typická, nikoli však exkluzivní v případě sekvencí, které mají omezenou sekvenční identitu relativní s komplementárními sekvencemi. V případě sekvencí s vysokou identitou je možné použít upravené a velmi přísné podmínky. Málo přísné podmínky umožňují selektivní hybridizaci sekvencí, které vykazují přibližně 70 % sekvenční shodu a mohou se použít při identifikaci ortologních nebo paralogních sekvencí.

D. Polynukleotidy vykazující alespoň 60 % sekvenční shodu s polynukleotidy popsanými v odstavci (A), (B) nebo (C).

• · '# »1 ·> «

9 99 4 9

Jak se popisuje shora v textu v odstavci (d); vynález popisuje izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy biosyntézy ligninu, kde polynukleotidy vykazují specifickou identitu na úrovni nukleotidů s polynukleotidem, jak se popisuje shora v textu v odstavci (A), (B) a (C) . Procento shody s ohledem na sekvenci je alespoň 60 % a může se exprimovat jako celek vybraný ze skupiny celých čísel zahrnující 60 až 99. Tak například procento shody s referenční sekvencí může být alespoň 70 %, 75 %, 80 %, 85%, 90 % nebo 95% .

Polynukleotidy v tomto provedení vynálezu /Mř/iou sdílet epitop s polypeptidem kódovaným polynukleotidy popsanými shora v textu v odstavci (A) , (B) nebo (C) . Tak tyto polynukleotidy kódují první- polypeptid, který vyvolává produkci antiséra obsahuj ící^protilátky, které jsou specificky reaktivní s druhým polypeptidem kódovaným polynukleotidem popsaným v odstavci (A), (B) nebo (C). První polypeptid však neváže antisérum vytvořené proti sobě samému, když amtisérum se zcela imunologicky sorbovalo s prvním polypeptidem. Proto polynukleotidy tohoto provedení vynálezu se mohou použít při přípravě protilátek pro použití například při testování expresívních knihoven nukleových kyselin obsahujících polynukleotidy popsané v odstavci (A) , (B) nebo (C) nebo při čištění nebo imunologických testech polypeptidů kódovaných polynukleotidy popsanými v odstavci (A), (B) nebo (C) . Polynukleotidy v tomto provedení vynálezu obsahují nukleové sekvence, které se mohou použít při selektivní hybridizaci s polynukleotidem kódujícím polypeptid podle vynálezu.

Testování polypeptidů, zda se specificky váží na antisérum, se může dobře dosáhnout za použití knihoven vykazujících peptid. Tato metoda zahrnuje testování velké sbírky peptidu pro jednotlivé členy, které mají požadovanou funkci a strukturu. Protilátkové testy knihoven vykazujících peptid jsou dobře známy v oboru. Vykazované peptidové sekvence l

e · mohou obsahovat 3 až 5 000 nebo více aminokyselin. Často obsahují 5 až 100 aminokyselin a často obsahují přibližně 8 až 15 aminokyselin. Vedle přímých metod chemické syntézy pro přípravu peptidových knihoven se popisuje několik metod rekombinace CNA. Jeden typ zahrnuje vyjevení peptidové sekvence na povrchu bakteriofága nebo buňky. Každý bakteriofág nebo buňka obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující zvláštní peptidovou sekvenci. Takové metody se popisují v dokumentu přihláška PCT č. 91/17271, 91/18980, 91/19818 a 93/08278. Jiné systémy přípravy knihoven peptidů zahrnují chemickou syntézu in vitro a rekombinantní metody (popisuje se například v dokumentech přihláška patentu PCT č. 92/05258, 92/14843 a 96/19256, také v US patentu č. 5,658,754 a 5,643,768). Knihovny vykazující peptid, vektory a testovací kity jsou běžně dostupné u firmy Invitrogen (Carlsbad,' CA) .

E. Polynukleotidy kódující protein vykazující sub-sekvenci z prototypu polypeptidu a zkříženě reagující s prototypovým polypeptidem.

Jak se uvádí shora v textu v odstavci (e), vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy biosyntézy ligninu, kde polynukleotidy kódují protein vykazující sub-sekvenci sousedících aminokyselin z prototypu polypeptidu biosyntézy ligninu. Příklady prototypu polypeptidů biosyntézy ligninu se uvádějí v sekvenci SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75. Délka sousedících aminokyselin z prototypového polypeptidu se vybrala ze skupiny celých čísel, která zahrnuje alespoň čáslo 10 až číslo počtu aminokyselin v prototypové sekvenci. Tak například polynukleotid může kódovat polypeptid vykazující sub-sekvenci, která obsahuje alespoň 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 nebo 50 sousedících aminokyselin z prototypového polypeptidu. Dále počet takových sub-sekvencí kódovaných polynukleotidem běžného provedení vynálezu může být libovolné celé číslo vybrané ze

I • · skupiny zahrnující čísla od 1 do 20, jako je 2, 3, 4 nebo 5.

číslem

Sub-sekvence se mohou oddělit libovolným celým nukleotidů od 1 do čísla počtu nukleotidů v sekvenci takové, jako je alespoň 5, 10, 15, 25, 50, 100 nebo 200 nukleotidů.

Proteiny kódované polynukleotidy podle vynálezu, když tvoří imunogen, vyvolávají produkci polyklonálních protilátek, které se specificky vážou na prototypový polypeptid, jako je například polypeptid kódovaný polynukleotidem popsaným shora (b) nebo příkladnými polypeptidy se

V obecném případě podle uvedeného vyvolané proti antisérum se zcela polypeptidu. Způsoby testy, nepřímé v textu v odstavci sekvencemi SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75 však protein kódovaný polynukleotidem provedení vynálezu neváže antisérum prototypovému polypeptidu, když imunologicky sorbuje v prototypovém přípravy a testování vazebné specifity protilátek/afinity jsou dobře známy v oboru. Příklady imunologických testů zahrnují test ELISA, kompetitivní imunofluorescenční radioimunologické testy, westernový přenosy, imunofluorescentní testy a podobně.

Při metodě preferovaného testu se mohou použít zcela imunologicky sorbované a sloučené antiséra, která se vyvolávají prototypovým polypeptidem v kompetetivním vazebném testu při testování proteinu.

Stanoví se koncentrace prototypového polypeptidu, která je nutná pro inhibici 50% navázání vazebného antiséra na prototypový polypeptid. Jestliže množství proteinu nutného pro inhibici navázání je menší než dvojnásobek množství prototypového proteinu, uvádí se, že protein se specificky váže na antisérum vyvolané imunogenem. Proteiny podle vynálezu tak zahrnují alelové varianty, konzervativně modifikované varianty a minoritní rekombinantní modifikace prototypového polypeptidu.

Polynukleotid podle vynálezu popřípadě kóduje protein s molekulovou hmotností jako neglykosylovaný protein v rozmezí • · • · • · »»»· % molekulové hmotnosti neglykosylovaných polypeptidů biosyntézy ligninu v plné délce podle vynálezu (SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75). Molekulová hmotnost se může snadno stanovit testem SDS-PAGE za redukčních podmínek. Výhodně je molekulová hmotnost v rozmezí 15 %, přednostně 10 až 15 % a zejména 3 %, 2 % nebo 1 % molekulové hmotnosti plné délky polypeptidů biosyntézy ligninu podle vynálezu. Stanovení molekulové hmotnosti proteinu je možno výhodně provádět testem SDS-PAGE za denaturačních podmínek.

Polynukleotidy v tomto provedení popřípadě kódují protein vykazující specifickou aktivitu alespoň 20 %, 30 %, 40 % nebo 50 % přirozeného, endogenního (tj. neizolovaného) polypeptídu biosyntézy ligninu v plné délce. Dále mají proteiny kódované polynukleotidy podle vynálezu popřípadě podstatně podobnou disociační konstantu (K_m) a/nebo katalytickou aktivitu (tj . konstantu mikroskopické rychlosti, k_cat) jako - přirozený endogenní protein biosyntézy v plné délce. Odborníkovi je zřejmé, že hodnota poměru k_cat/ K_ra určuje specifitu pro soutěžící substráty a je často zmiňována jako konstanta specifity. Proteiny v tomto provedení mohou mít hodnotu poměru kcat/Km alespoň 10 % neizolovaného polypeptidů biosyntézy ligninu v plné délce, stanoveno použitím substrátu polypeptidů ze specifické dráhy biosyntézy ligninu, jak se popisuje shora v textu. Hodnota poměru k_cat/K_m je popřípadě alespoň 20 %, 30 %, 40%, 50 % a zejména alespoň 60 %, 70 %, 80 %, 90 % nebo 95 % hodnoty poměru k_cat/K_m neizolovaného polypeptidů biosyntézy ligninu v plné délce. Stanovení k_cat, Km a poměru k_cat/ K_m se může provést libovolným počtem způsobů, které jsou dobře námy v oboru. Například počáteční rychlosti (to je prvních 5 % nebo méně reakce) mohou být stanoveny za použití metody rychlého smíšení (například metodou kontinuálního průtoku, zastaveného průtoku nebo rychlého ochlazení), rychlé fotolýzy nebo relaxační metody (například i

• · ·· »•*«>•5· • · · · · ······· ·· · teplotní skoky) ve spojení s takovými příklady metod měření, jako je spektrofotometrie, spektrofluorimetrie, jaderná magnetická resonance nebo radioaktivní metody. Kinetické hodnoty je možné běžně získat za použití Lineweaver-Burkových nebo Eadie-Hofsteeových grafů.

F. Polynukleotidy komplementární s polynukleotidy popsanými v odstavcích (A) až (E).

v textu v odstavci (f), vynález nukleové

Jak se uvádí shora poskytuje izolované polynukleotidy biosyntézy ligninu, komplementární s polynukleotidy kyseliny obsahující kde polynukleotidy jsou popsanými shora v textu v odstavcích (A) až (E) . Jak je odborníkovi zřejmé, komplementární sekvence se v bázích párují po celé své délce až (E) (tzn. mají po celé délce Komplementární báze se spojují vodíkovou vazbou ve dvouřetězcovou nukleovou kyselinu. Komplementární jsou například tyto báze: guanin a cytozin, adenin a thymin a adenin a uráčil.

s polynukleotidy podle (A) 100% sekvenční identitu).

G. Polynukleotidy, které jsou sub-sekvencemi polynukleotidů popsaných v odstavcích (A) až (F).

Jak se popisuje shora v textu v odstavci (g) , vynález poskytuje izolované nukleové kyseliny obsahující polynukleotidy biosyntézy ligninu, kde polynukleotid obsahuje alespoň 15 sousedících bází pocházejících z polynukleotidů popsaných v odstavci (A) až (F) . Délka polynukleotidů je dána jako celé číslo vybrané ze skupiny zahrnující číslo alespoň 15 do čísla vyjadřující délku sekvence nukleové kyseliny, ve které je polynukleotid sub-sekvencí. Polynukleotidy podle vynálezu tak například zahrnují polynukleotidy, které obsahují alespoň 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75 nebo 100 sousedících nukleotidů z polynukleotidů popsaných v odstavcích (A) až (F). Počet takových sekvencí kódovaných polynukleotidem uvedeného • β · · · · · provedení vynálezu může být libovolné celé číslo vybrané ze skupiny zahrnující čísla od 1 do 20, jako je 2, 3, 4 nebo 5.

Sub-sekvence se mohou oddělit libovolným celým číslem nukleotidů od 1 do počtu nukleotidů v sekvenci, jako je alespoň 5, 10, 15, 25, 50, 100 nebo 200 nukleotidů.

Sub-sekvence podle vynálezu mohou obsahovat strukturální lé&fi'' charakteristiky sekvence, ze které jsou odvozeny. V jiném případě sub-sekvence charakteristiky větší mohou postrádat jisté strukturální sekvence, ze které jsou odvozeny.

Například sub-sekvence z polynukleotidu kódu j í cí^polypept id máj alespoň jeden lineární epitop společný s prototypovou sekvencí, jako je sekvence SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75, může kódovat epitop společný s prototypovou sekvencí. V jiném případě sub-sekvence nemůže kódovat epitop společný s prototypovou sekvencí, ale může se používat k izolaci větší sekvence například hybridizací nukleových kyselin se sekvencí, ze koerých je odvozena. Sub-sekvence se mohou použít pro modulaci nebo detekci genové exprese zavedením látek do sub-sekvencí, které vážou, interkalují, štěpí a/nebo síťují nukleové kyseliny. Příklady takových látek zahrnují akridin, psoralen, fenantrolin, naftochinon, daunomycin nebo chloroetylaminoarylové konjugáty.

Konstrukce nukleových kyselin

Izolované nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou vytvořit za použití (a) standardních rekombinantních metod, (b) syntetickými postupy nebo kombinací uvedených metod. V některých provedeních vynálezu polynukleotidy podle vynálezu se budou klonovat, amplifikovat nebo jinak konstruovat z jednoděložných rostlin. V preferovaném provedení vynálezu je jednoděložnog rostlinou Zea mays. Zvláště se preferuje použití tkáně Zea mays pocházející z kořenů, listů ví/zn .'z /

Je výhodné, aby nukleové kyseliny vedle polynukleotidu podle vynálezu obsahovaly další sekvence. Například do • · nukleové kyseliny je možné zavést vícenásobné místo klonování obsahující jedno nebo více k izolaci polynukleotidu. Aby restrikčních míst, což vede se dosáhlo izolace přeloženého pOG44, pRS406, polynukletidu podle vynálezu, je možné začlenit přeložitelné sekvence. Například hexahistidinová markerová sekvence poskytuje vhodný způsob čištění proteinů podle vynálezu. Nukleová kyselina podle vynálezu vylučující polynukleotidovou sekvenci je vektor, adaptér nebo linker pro klonování a/nebo expresi polynukleotidu podle vynálezu. Do takové klonovací a/nebo expresívní sekvence se mohou přidat další sekvence, aby se optimalizovala jejich funkce při klonování a/nebo expresi. To vede k izolaci polynukleotidu nebo ke lepšení zavedení polynukleotidu do buňky. V typickém případě délka nukleové kyseliny podle vynálezu kratší než délka jeho polynukleotidu podle vynálezu je menší než 20 kb. Často je kratší než 15 kb a často kratší než 10 kb. Použití klonovacích vektorů, expresívních vektorů, adaptorů a linkerů je dobře známo v oboru. Příklady nukleových kyselin zahrnují vektory, jako jsou M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda Dash II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, UniZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'ss, pOPRSVI CAT, pOP13 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, )OG45, pFRTpGAL, pNEOpGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSlox a lambda MOSElox.Popis různých nukleových kyselin se uvádí například v publikaci Staratagene Clon ing- Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA) a Amersham Life Sciences, Inc.

Catalog'97 (Arlington Heights, IL) .

A. Rekombinantní metody konstrukce nukleových kyselin

Kompozice izolovaných nukleových kyselin podle vynálezu, jako jsou RNA, cDNA genomová DNA nebo její hybrid, se může získat z rostlinných biologických zdrojů za použití • ·

libovolného počtu klonovacích metod, které jsou dobře známy v oboru. V některých provedeních vynálezu se oligonukleotidové sondy, které selektivně hybridizují za přísných podmínek s polynukleotidy podle vynálezu, používají k identifikaci požadované sekvence v knihovně cDNA nebo genomové DNA. Zatímco izolace RNA a konstrukce cDNA knihovny a genomové knihovny je dobře známa v oboru_; následuje zdůraznění některých použitých metod.

Al. Izolace a čištění mRNA

Celková RNA z ros^_tlinných buněk obsahuje takové nukleové kyseliny, jako je mitochondriální RNA, chloroplastová RNA, rRNA, tRNA, hnRNA a mRNA. Příprava celkové RNA v typickém případě zahrnuje lyži buněk a odstranění proteinů, pak následuje srážení nukleových kyselin. Extrakce celkové RNA z rostlinných buněk se může uskutečnit různými způsoby. Extrakční pufry často zahrnují silné detergenty, jako je SDS, a organická denaturační činidla, jako jsou guanidinizothiokyanát, guanidinhydrochlorid nebo fenol.

i O izolíJRi' celkové RNA, poly(A)⁺mRNA je v typickém případě čištěna zbývající RNA za použití oligo(dT) celulózy. Příklady protokolů izolace celkové RNA a mRNA se popisují v publikací Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997) a Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). Izolační kity pro celkovou RNA a mRNA jsou běžně dostupné u firem, jako je Stratagene (La Jolla, CA), Clontech (Palo Alto, CA), Pharmacia (Piscataway, NJ) a 5'-3'(Paoli, PA) (popisuje se také v dokumentu US patent č. 5,614,391 a 5,459,253. mRNA se může rozdělit na populace v rozmezí velikostí přibližně 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 nebo 3,0 kb. cDNA syntetizovaná pro každou z těchto frakcí se může dříve než se začlení do vektoru dělit podle velikosti do stejného rozmezí velikosti své mRNA. Tento l

« ·

6 způsob napomáhá eliminovat zkrácenou cDNA vytvořenou neúplně reverzně přepsanou mRNA.

A2. Konstrukce cDNA knihovny

Konstrukce cDNA knihovny v obecném případě zahrnuje pět kroků. Nejdříve se z templátu póly (A)⁺mRNA vyvolá syntéza jednořetězcové cDNA za použití primerů poly(dT) nebo náhodných hexanukleotidú. Za druhé, výsledný hybrid RNA-DNA se převede na dvouřetězcovou cDNA, v typickém případě kombinací RNázy H a DNA polymerázy I (nebo Klenow fragment). Za třetí, konce dvouřetězcové cDNA se liguJi s adaptory. Ligace adaptorů produkuje kohezivní konce pro klonování. Za čtvrté, selekce dvouřetězcové cDNA. na základě velikosti eliminuje nadbytečné adaptory a fragmenty primerů a eliminuje molekuly parciální cDNA, které vznikají degradací mRNA nebo chybnou reverzní transkriptázou při syntéze kompletních prvních řetězců. Za páté, cDNA se liguje dc klcnovacích vektorů a ba lise. Protokoly syntézy cDNA jsou dobře známy v oboru a popisují se ve standardních publikacích, jako je Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Varlag,

Berlin (1997) a Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and WileyInterscience, New York (1995). Kity pro syntézu cDNA jsou dostupné z různých komerčních zdrojů, jako je firma Stratagene a Pharmacia.

Popisuje se řada protokolů syntézy cDNA, které poskytují v podstatě čisté cDNA knihovny v plné délce. V podstatě čisté cDNA knihovny v plné délce se zkonstruovaly tak, aby obsahovaly mezi klůny obsahu j í cíp'inzerty alespoň 90 %, více se upřednostňuje alespoň 93 % nebo 95 % inzertů plné délky. Délka inzertu v takových knihovnách může být od 0 do 8, 9, 10,

11, 12, 13 nebo více kb. Vektory, které nesou inzerty o uvedené velikosti^ jsou známy v oboru a jsou běžně dostupné

4Ί (například Stratagene's lambda ZAP Express (cDNA klonovací vektor s klonovací kapacitou 0 až 12 kb).

Příklad způsobu konstrukce knihovny cDNA v plné délce s čistotou vyšší než 95 % se popisuje v publikaci Carninci et al., Genomics, 37: 327-336 (1996). V tomto protokolu struktura čepičky eukaryontní mRNA je chemicky značena biotinem. Použitím magnetických partikulí potažených streptavidinem se po ošetření RNázou I selektivně získají jednořetězcové hybridy cDNA/mRNA v plné délce. Způsob poskytuje knihovny s vysokým výtěžkem reprezentace počáteční populace mRNA. V oboru jsou známy další metody produkce knihoven v plné délce (popisuje se například v publikaci Edery et al., Mol. Cel Biol., 15(6): 3363-3371 (1995) a v dokumentu PCT WO 96/34981.

A3. Normalizované nebo zkrácené knihovny cDNA

Knihovny cDNA, které nejsou normalizované, reprezentují populaci mRNA tkáně, ze které jsou připraveny. Protože jedinečné klony jsou převýšeny počtem klonů odvozených ze silně exprimovaných genů, jejich izolace může být pracná. Normalizace knihovny cDNA je proces tvoření knihovny, ve které je každý klon rovnoměrněji zastoupen.

V oboru jsou známy různé přístupy pro normalizaci knihoven cDNA. Jeden přístup je založen na hybridizaci s genomovou DNA. Frekvence každé hybridizované cDNA ve výsledné normalizované knihovně bude úměrná frekvenci každého korespondujícícho genu v genomové DNA. Jiný přístup je založen na kinetice. Jestliže teplotní hybridizace cDNA probíhá podle kinetiky druhého řádu, vzácnější druhy teplotně hybridizují pomaleji a zbývající jednořetězcová frakce cDNA se v průběhu hybridizace stává progresivně více normalizovanou. Při žádné hodnotě Cot nedochází ke specifickému úbytku libovolného druhu cDNA bez ohledu na jeho četnost. Konstrukce normalizovaných knihoven se popisuje v publikaci Ko, Nucl. Acids. Res., 18(19): 5705-5711 (1990), Patanjali et • · • «* «······ « · · « » ····· ·· φ * * al., Proč. Nati. Acad. U.S.A., 88: 1943-1947 (1991), U.S. patent 5,482,685 a 5,637,685. Příklad metody normalizace popsané v Soares et al., vede k redukci četnosti klonů z rozmezí čtyř řádů velikosti na zúžené rozmezí pouze jednoho řádu (popisuje se v publikaci Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 9228-9232 (1994)).

Dalším způsobem zvýšení poměru méně častých druhů cDNA jsou subtrahované knihovny cDNA. V tomto postupu se cDNA připravená z jednoho souboru mRNA zbaví sekvencí přítomných v druhém souboru mRNA hybridizaci. Hybridy cDNA:mRNA se odstraní a zbývající nehybridizovaný soubor cDNA se obohatí sekvencemi jedinečnými pro tento soubor (viz Foote et al., Plant Molecular Biology: A Laboratory Mnaual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997), Kho and Zarbl, Technique, 3(2):58-63 (1991), Sivé and St. John, Nucl. Acids Res., 16(22):10937 (1988), Current Protocols in Molecular Biology,

Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and WileyInterscience, New York (1995), Swaroop et al., Nucl. Acids Res., 19(8):1954 (1991). Subtrakční kity cDNA jsou obchodně dostupné, viz například PCR-Select (Clontech).

A4. Konstrukce genomové knihovny

Aby se zkonstruovala genomová knihovna, náhodnou fragmentací například za použití restrikčních endonukleáz se vytvoří velké segmenty genomové DNA a ligují se s vektorem DNA za vzniku konkatemerů, které se mohou sbalit do vhodného vektoru. Metodologie, jak docílit těchto cílců, a metody sekvenování pro verifikaci sekvence nukleových kyselin jsou dobře známy v oboru. Příklady vhodných molekulových biologických metod a instrukce prostačující pro kvalifikované osoby pro konstrukci, klonování a metody vyhledávání se popisují v publikaci Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Vols. 1-3 (1989), Methods in Enzymology, Vol. 152: Guide to

Molecular Cloning Techniques, Berger and Kimmel, Eds., San Diego: Academie Press, lne. (1987), Current Protocols in

Molecular Biology, Ausubel, et al., Eds., Hreene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995), Plant Molecular Biology: A Laboratory Mnaual, Clark, Ed., Springer-Verlag,

Berlin (1997). Kity pro konstrukci genomových knihoven jsou také komerčně dostupné.

A5. Testování nukleových kyselin a izolační metody

CDNA a genomová knihovna se mohou testovat za použití sond založených na sekvenci polynukleotidu podle vynálezu, jak se popisuje zde v textu. Sondy se mohou použít při hybridizaci se sekvencemi genomové DNA nebo cDNA k izolaci homologních genů ve stejném nebo odlišném rostlinném druhu. Pro odborníky je zřejmé, že při testu je možné použít různé míry přísnosti a přísná může být buď hybridizace nebo promývací médium. Se zvyšováním přísnosti hybridizačních podmínek musí existovat vyšší stupeň komplementarity mezi sondou a cílem, aby došlo k vytvoření duplexu. Stupeň přísnosti se může teplotou, intovou silou, denaturujícího rozpouštědla, regulovat částečně

Přísnost polarity přítomností je formamid. mění změnou pH a jako hybridizace se například výhodně reakčního roztoku manipulací koncentrace formamidu v rozmezí 0 % až 50 %. Stupeň komplementarity (sekvenční shoda) nutný pro detekovatelné navázání kolísá podle přísnosti hybridizačního média a/nebo promývacího média. Stupeň komplementarity je optimálně 100 %, avšak je samozřejmé, že drobné sekvenční variace sond a primerů se mohou kompenzovat snížením přísnosti hybridizačního a/nebo promývacího média.

Příslušné nukleové kyseliny se mohou také amplifikovat ze vzorků nukleových kyselin za použití amplifikačních metod. Například metoda polymerázové řetězová reakce (PCR) se může použít při amplifikaci sekvencí polynukleotidů podle vynálezu a příbuzných genů přímo z knihoven genomové DNA •I 4 nebo knihovny cDNA. PCR a další amplifikační metody in vitro se mohou také použít například ke klonování sekvencí nukleových kyselin, které kódují proteiny, jez se exprimují, při přípravě nukleových kyselin, kterých lze použít jako sond pro detekci přítomnosti požadované mRNA ve vzorcích, při sekvenování nukleových kyselin nebo pro jiné účely. Příklady metod, které jsou pro odborníka dostatečné, aby mohl provést amplifikaci in vitro, se popisují v publikaci Berger, Sambrook and Ausubel, Mullis et al., US patent č. 4,683,202 (1987) a PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Innis et al., Eds., Academie Press lne., San Diego, CA (1990). V oboru jsou dobře známy křty pro amplifikaci genomové PCR, jak se uvádí v Advantage-GC Genomic PCR Kit (Clontech) . T4 gen 32 protein (Boehringer Mannheim) se může použít pro zlepšení výtěžku produktů dlouhé PCR.

Metody testování založené na PCR jsou také už popsány. Wilfinger et al. popisuje metodu založenou na PCR, ve které nejdelší cDNA se identifikovala v prvním kroku tak, že neúplné klony se ze studie eliminovaly (popisuje se v publikaci BioTechniques, 22(3): 481-486 (1997). V této metodě se pár primerů syntetizoval tak, že jeden primer se teplotně hybridizoval na 5'konec negativního řetězce požadované cDNA a druhý primer se připojil na vektor. Klony se spojily, aby se mohlo uskutečnit testování ve velkém měřítku. Tímto postupem se může mezi kandidáty klonů identifikovat nejdelší možný klon. Dále, produkt PCR se použil pouze při stanovení přítomnosti požadované cDNA a není sám osobě jinak využíván. Takové metody jsou zvláště účinné v kombinaci metodami konstrukce cDNA plné délky popsané shora v textu.

B. Syntetické metody při konstrukci nukleových kyselin

Izolované nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou také připravit přímou chemickou syntézou takovými způsoby, jako je fosfortriesterová metoda, která se popisuje v publikaci Narang • · • · et al., Meth. Enzymol. 68: 90-99 (1979), fosfodiesterová metoda, která se popisuje v publikaci Brown et al. , Meth. Enzymol. 68: 109-151 (1979), dietylfosforamiditová meotda, která se popisuje v publikaci Beaucage et al., Tetra. Lett. 22: 1859-1862 (1981), fosoframidittriesterová metoda na pevné fázi, jak se popisuje v publikaci Beaucage and Caruthers, Tetra Letts. 22(20): 1859-1862 (1981) například použitím automatizovaného syntetizéru, jak se popisuje v publikaci Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168 (1984) a metoda na pevném nosiči podle US patentu č. 4,458,066. Chemická syntéza obvykle produkuje jednořetězcový oligonukleotid. Ten se může převést na dvouřetězcovou DNA hybridizaci s komplementární sekvencí nebo polymerizaci s DNA polymerázou za použití tohoto jednoho řetězce jako templátu. Odborníkovi je zřejmé, že zatímco chemická syntéza DNA se omezuje na sekvence s přibližným počtem baží okolo 100, delší sekvence se mohou získat ligaci kratších sekvencí.

Rekombinantní expresívní kazety

Vynález dále popisuje rekombinantní expresívní kazety obsahující nukleovou kyselinu podle vynálezu. Sekvence nukleové kyseliny kódující požadovaný nukleotid podle vynálezu, například sekvence cDNA nebo genomové DNA kódující polypeptid v plné délce' podle vynálezu, se může použít při konstrukci rekombinantní expresívní kazety, která může být začleněna do požadované hostitelské buňky. Rekombinantní expresívní kazeta bude v typickém případě obsahovat polynukleotid podle vynálezu operativně spojený s regulačními sekvencemi vyvolávajícími transkripci, které budou řídit transkripci polynukleotidu v uvedené hostitelské buňce, jako jsou tkáně transformované rostliny.

Rostlinné expresívní vektory mohou například zahrnovat (1) klonovaný rostlinný gen, jehož transkripci řídí 5' a 3' regulační sekvence a (2) dominantní selekční markér. Takové

I • · rostlinné expresívní vektory mohou také obsahovat,je-li to nutné, promotorovou regulační oblast (např. indukovatelnou nebo konstitutivní expresi regulovatelnou prostředím nebo vývojem nebo buněčně nebo tkáňově specifickou /selektivní expresi), počáteční místo inicí^ující transkripcí, vazebné místo na ribozóm, signál zpracování RNA, místo terminace transkripce a,· nebo polyadenylační signál.

Může se soužit rostlinný promotorový fragment, který řídí expresi polynukleotidů podle vynálezu ve všech tkáních regenerované rostliny. Takové promotory se zde označují jako „konstitutivní a jsou aktivní za většiny podmínek prostředí a ve všech stádiích vývoje nebo při diferenciaci buněk. Příklady konstitutivnícn promotorů zahrnují transkripční iniciační oblast 35S květákového mozaikového víru (CaMV), 1'- nebo 2'promotor nevožený z T-DNA Agrobacterium tumefaciens, všudypřítomný promotor 1, dehydrogenázy cinnamylalkoholu promotor Smas, promotor (US patent č. 5, 683, 439), promotor Nos, promotor pEmu, promotor rubisco, promotor GRP1-8 a jiné oblasti ínici_ující transkripci z různých rostlinných genů, které jsou známy v oboru.

V jiném případě rostlinný promotor může řídit expresi polynukleotidů podle vynálezu ve specifické tkáni nebo může být jinak řízen prostředím nebo stádiem vývoje. Takové promotory

Podmínky se zde nazývají prestředí, které „indukovatelnými promotory, mohou vyvolat transkripci prostřednictvím indukovatelného promotoru zahrnují působení patogenu, anaerobní podmínky nebo přítomnost světla. Příkladem indukovatelnýcn promotorů jsou promotor Adhl, který se indukuje nedostatečným přívodem kyslíku nebo působením nízké teploty, promotor Hsp70, který se indukuje působením tepla a promotor PPDK, který se indukuje světlem.

Příklady promotorů, které jsou řízeny fází vývoje, zahrnují promotory, jež inici^ují transkripci pouze nebo

I • · s výhodou v jistých tkáních, jako jsou listy, kořeny, plody, semena nebo květy. Působení promotoru může také velmi kolísat v závislosti na jeho poloze v genomu. Tak indukovatelný promotor se může stát zcela nebo částečně konstitutivní v určitých polohách.

K řízení exprese nukleových kyselin podle vynálezu mohou být použity heterologní i neheterologní (tj . endogenní) promotory. Tyto promotory se mohou také využívat například v rekombinantních expresívních kazetách při řízení exprese antisense nukleových kyselin, aby došlo k zeslabení, zesílení nebo změně obsahu a/nebo složení biosyntézy ligninu v požadované tkáni. Tak v některých provedeních bude konstrukt nukleové kyseliny buňce, jako je s polynukleotidem obsahovat promotor funkční v rostlinné buňka Zea mays, operativně spojený podle vynálezu. Promotory použitelné v těchto provedeních zahrnují endogenní promotory, které řídí expresi polypeptidu podle vynálezu.

V některých provedeních mohou být izolované nukleové kyseliny, které slouží jako promotor nebo zesilující elementy, zavedeny do vhodné polohy (obecně před) vzhledem k nehetoregenní formě polynukleotidu podle vynálezu tak, aby zvyšovaly nebo snižovaly expresi polynukleotidu podle vynálezu. Endogenní promotory podle vynálezu se například mohou změnit mutací in vivo, delecí a/nebo substitucí (popisuj e 5,565,350, se například v dokumentech Kmiec, US patent Zarling et al., PCT/US93/03868) nebo se mohou izolované promotory zavést do rostlinné buňky ve správné orientaci a ve vzdálenosti od genu biosyntézy ligninu tak, aby řídily expresi genu. Genová exprese může být modulována za podmínek vhodných pro růst rostliny tak, aby se měnil obsah a/nebo složení biosyntézy ligninu. Vynález tedy poskytuje kompozice a metody pro přípravu, heterologní promotory a/nebo zesilovače operativně « 9 • « » 9 ..I « · · * • · « -· ·

·. · · a····* • · 4 «.

» · · · I · · spojené s přirozenou, endogenní (to je neheterologní) formou polynukleotidu podle vynálezu.

Metody pro identifikaci promotorů s určitým expresívním paternem, co se týče typu tkáně, typu buňky, stádia vývoje a/nebo podmínek prostředí, jsou dobře známy v oboru (popisují se například v publikaci The Maize Handbook, Chapter 114-115, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994), Corn and Corn Improvement, 3-nd edition, Chapter 6, Sprague and Dudley, Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988)). Typickým krokem metod izolace promotorů je identifikace genových produktů, které se exprimují s určitým stupněm specifity v cílové tkáni. Mezi metodologii patří diferenciální hybridizace s knihovnami cDNA, subtraktivní hybridizace, diferenciální zobrazení, diferenciální 2-D gelová elektroforéza, soubor DNA sond a izolace proteinů, které jsou známy, že se exprimují s určitou specifitou pro cílovou tkáň. Takové metody jsou dobře známy v oboru. Komerčně dostupné produkty pro idenitifkaci promotorů jsou dobře známy v oboru, jako Universal GenomeWalker Kit od firmy Clontech (Palo Alto).

V případě metod založených na proteinech je výhodné získat aminokyselinovou sekvenci pro alespoň část identifikovaného proteinu a pak je možné použít tuto proteinovou sekvenci jako základ pro přípravu nukleové kyseliny, která se může použít jako sonda pro přímou identifikaci jiné genomové DNA nebo s výhodou pro identifikaci klonu cDNA z knihovny připravené z cílové tkáně. Jakmile byl identifikován takový klon cDNA., pak se sekvence může použít při identifikaci sekvence na 5' konci transkriptu uvedeného genu. V případě diferenciální hybridizace, subtraktivní hybridizace a diferenciálního zobrazení se použije sekvence nukleové kyseliny, identifikovaná jako obohacená v cílové tkáni, pro identifikaci sekvence na 5' konci transkriptu uvedeného genu. Jakmile jsou takové sekvence identifikovány, ať už se začne z proteinových sekvencí nebo ze sekvencí ·· promotor s aktivitou určitých podmínek, ale Meky nukleových kyselin, pak libovolná z takových sekvencí, která pochází z genového transkriptu se může použít k testování genomové knihovny připravené z cílového organizmu. Metody pro identifikaci a potvrzení počátečního místa transkripce jsou dobře známy v oboru.

V procesu isolace promotorů exprimovaných za určitých podmínek prostředí nebo stresů nebo ve specifických tkáních nebo v určitých stádiích vývoje, se identifikovala řada genů, které se exprimují za požadovaných okolností v požadované tkáni nebo v požadovaném stádiu vývoje. Další analýza ukázala expresi každého určitého genu v jedné nebo ve více tkáních rostliny. Je možné identifikovat v požadované tkáni za nevykazuje aktivitu v jiné běžné tkáni.

Aby se identifikovala promotorové sekvence, v 5'-částech zde popsaných klonů se zkoumala přítomnost sekvenčních charakteristik promotorových sekvencí. Elementy promotorové sekvence například zahrnují sekvenci TATA boxu (TATAAT), která se obvykle nachází v pruhu obsahujícím 5 až 10 bp bohatém na AT, jenž leží 20 až 40 párů baží proti směru exprese genu od počátku transkripce. Identifikace TATA boxu je dobře známa v oboru. Jedním způsobem, jak předpovědět polohu tohoto elementu je identifikace počátečního místa transkripce za použití standardních metod mapování RNA, jako je extenze primerů, analýza Sl a/nebo ochrana proti působení RNázy. Aby se potvrdila přítomnost sekvence bohaté na AT, uskutečnila se analýza struktury a funkce, která zahrnuje mutagenezí putativní oblasti a kvantifikaci účinku mutace na expresi reportního genu spojeného proti směru exprese genu (popisuje se například v publikaci The Maize Handbook, Chapter 114, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York, (1994)).

V rostlinách dále proti směru exprese v polohách -80 až -100 se v typickém promotorový element (to znamená CAAT box) genu od TATA boxu případě vyskytuje v sériích adeninů i

obklopujících trinukleotid G (nebo T)NG (popisuje se například v publikaci J. Messing et al., Genetic Engineering in Plants, Kosage, Meredith and Hollaender, Eds., pp. 221-227 1983.). V případě kukuřice zde neexistuje dobře konzervovaný box CAAT, ale existuje zde proti směru exprese genu od TATA boxu několik krátkých konzervativních motivů vázajících protein. Ty zahrnují motivy trans-působení transkripčních faktorů, které se podílejí na regulaci světlem, anaerobní indukci, hormonální regulaci nebo anthocyaninové biosyntéze, každého z konkrétních genů.

Jakmile je známa promotorové a/nebo genová sekvence, vybere se oblast vhodné velikosti z genomové DNA, která je směrem 5' od místa počátku transkripce nebo translace, a takové sekvence jsou pak spojeny s kódující sekvencí. Jestliže se místo počátku transkripce používá jako bod fúze, pak se může použít libovolný počet možných 5' nepřekládaných oblastí mezi počátečním místem transkripce a částečnou kódující sekvencí. Jestliže se používá počáteční místo translace na 3' konci specifického promotoru, pak je spojeno přímo s počátečním kodonem methioninu kódující sekvence.

Jestliže je požadována exprese polypeptidu, je v obecném případě žádoucí zahrnout polyadenylační oblast na 3'-konci kódující oblasti polynukleotidů. Polyadenylační oblast se může odvodit z přirozeného genu, z různých jiných rostlinných genů nebo z T-DNA. Sekvence 3' konce, která má být přidána, se může odvodit například z genů syntetázy nopalinu nebo oktopinu nebo v jiném případě z jiného rostlinného genu nebo méně výhodně z libovolného jiného eukaryontního genu.

K 5' nepřekládané oblasti nebo ke kódující sekvenci částečné kódující sekvence je možné přidat intronovou sekvenci, aby se zvýšilo množství zpracované mRNA, která se akumuluje v cytozolu. Ukázalo se, že inkluze intronu, který je možné upravit sestřihem, v transkripční jednotce v rostlinné a zvířecí expresívní konstrukci zesiluje genovou expresi na úrovni mRNA a proteinu až 1 000 krát (popisuje se v publikaci Buchman and 3erg, Mol. Cell Biol. 8: 4395-4405 (1988), Callis et al., Genes Dev. 1: 1183-1200 (1987)). Takové zesílení genové exprese intronem je v typickém případě největší, když se intron zavede blízko 5'konce transkripční jednotky. Použití kukuřičných intronů Adhl-S, intronu 1, 2 a 6 a intronu Bronze1 je dobře známo v oboru (popisuje se v publikaci The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1954 ) ) .

Vektor obsahující sekvence pocházející z polynukleotidu podle vynálezu bude v typickém případě obsahovat markerový gen, který potvrzuje selektovatelný fenotyp na rostlinných buňkách. Obvykle gen selekčního markéru bude kódovat rezistenci na antibiotika s vhodným genem, který zahrnuje geny kódující rezistenci na spektinomycin (například gen aada), gen fosfotranferázy streptomycinu (SPT) kódující rezistenci na streptomycin, gen fosfotransferázy neomycinu (NPTII) kódující rezistenci na kanamycin nebo geneticin, gen fosfotransferázy hygromycinu (HPT) kódující rezistenci na hygromycín, geny kódující rezistenci na herbicidy, které inhibují působení syntézy acetolaktátu (ALS), zvláště herbicidy typu sulfonylmočoviny (například gen syntázy acetolaktátu (ALS) obsahující mutace vedoucí k uvedené rezistenci zvláště v určitých mutacích S4 a/nebo Hra), geny kódující rezistenci na herbicidy, které inhibují působení syntázy glutamínu, jako je fosfinotricin nebo basta (například gen bar) nebo jiných takových genů, které jsou dobře známy v oboru. Gen bar kóduje rezistenci na herbicid basta, gen nptll kóduje rezistenci na antibiotika kanamycin a geneticin a gen ALS kóduje rezistenci na herbicid chlorsulfuroň.

Typické vektory použitelné při expresí genů u vyšších rostlin jsou dobře známy v oboru a zahrnují vektory odvozené z plazmidu vyvolává j ícílůf nádory (Ti) mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens (popisuje se v publikaci Rogers et • · al., Meth. In Enzymol., 153: 253-277 (1987)). Tyto vektory jsou rostlinné integrující vektory, které působá při transformaci. Vektory integrují část vektorové DNA do genomu hostitelské rostliny. Příklady zde použitelných vektorů mikroorganizmu A. tumefaciens jsou plazmidy pKYLX6 a pKYLX7 (popisují se v publikaci Schardl et al. , Gene, 61: 1-11 (1987) a Berger et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 86: 8402-8406 (1989)). Další použitelný vektor je plazmid pBI101.2, který je dostupný u firmy Clontech Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA).

Polynukleotid podle vynálezu se může exprimovat podle potřeby buď v sense nebo anti-sense orientaci. Je vhodné, aby řízení genové exprese buď sense nebo anti-sense orientace mělo přímý vliv na pozorovatelné charakteristiky rostliny. Antisense technologie se může s výhodou použít při expresi v rostlinách. Aby se dosáhlo této skutečnosti, segment nukleové kyseliny pocházející z požadovaného genu se klonuje a je operativně spojen s promotorem tak, že se přepisuje antimediátorový řetězec RNA. Konstrukce se pak transformuje do rostlin a vzniká antimediátorový řetězec RNA. Ukázalo se, že v rostlinných buňkách antimediátorová RNA inhibuje genovou expresi tím, že předchází akumulaci mRNA, která kóduje enzym, jenž je středem zájmu (popisuje se v publikaci Sheehy et al., Proč. Nati. Acad. Sci (USA( 85: 8805-8809 (1988) a Hiatt et al., US patent č. 4,801,340.

Jiná metoda suprese je „sense suprese. Ukázalo se, že zavedení nukleové kyseliny v sense orientaci je účinný způsob, kterým je možné blokovat transkripci cílových genů. Například použití uvedeného způsobu při modulaci endogenních genů se popisuje v publikaci Napoli et al., The Plant Cell 2: 279-289 (1990) a US patent č. 5,034,323.

Katalytické molekuly RNA a ribozymy se mohou také použít při inhibici exprese rostlinných genů. Je možné vytvořit ribozymy, které se specificky párují s libovolnou cílovou RNA a štěpí fosfodiesterovou kostru ve specifické poloze, přičemž • · • · funkčně deaktivují cílovou RNA. Když proběhne uvedené štěpení, sám ribozym zůstane beze změn a je tak schopen znovu štěpit další molekuly a chová se jako opravdový enzym. Inkluze ribozymových sekvencí s antimediátorovou RNA potvrzuje aktivitu štěpení RNA, čímž se zvyšuje aktivita konstrukcí. Návrh a použití ribozymů specifických pro cílovou RNA se popisuje v pumlikaci Haseloff et al., Nátuře 334: 585-591 (1988).

Pro navázání, značení, detekci a/nebo štěpení nukleových kyselin je mzžné použít různá síťovací činidla, alkylační činidla a radzkálv generuj ící ako závěsné skupiny na polynukleotidy podle vynálezu. V publikaci Vlassov, V. V., et al., Nucleic Acids Res (1986) 14: 4065-4076 se popisuje kovalentní vazoa fragmentu jednořetězcové DNA s alkylačními deriváty nukleotidů komplementárních s cílovými sekvencemi. Stejný problém, se popisuje v publikaci Knorre, D. G., et al., Biochimie (19Ξ5) 67:785-789. Iverson a Dervan také popisuje sekvenčně specifické štěpení jednořetězcové DNA zprostředkované začleněním upraveného nukleotidu, který je schopen aktivačního štěpení (J. Am. Chem. Soc. (1987) 109: 1241-1243). V publikaci Meyer, R. B. et al., J. Am. Chem. Soc. (1989) 111:851^-8519 se popisuje účinek kovalentního síťování s cílovým nukleotidem za použití alkylačního činidla komplementárnímo s jednořetězcovou nukleotidovou sekvencí. Síťování jedmořetězcových oligonukleotidů zprostředkované psoralenem aktivované světlem se popisuje v publikaci Lee, B.

L., et al·., Bizchemistry (1988) 27:3197-3203. Použití síťování v sondách tvořených tripl-helixem se popisuje v publikaci Home, et al., J. Am. Chem. Soc. (1990) 112: 2435-2437. Použití N4, N4-etanocytzzinu jako alkylačního činidla pro síťování jednořetězcovýzh oligonukleotidů se také popisuje v publikaci Webb and Matteucci, J. Am. Chem. Soc. (1986) 108: 2764-2765, Nucleic Acids Res (1986) 14: 7661-7674, Feteritz et al., J. Am. Chem. Soc. 113:4000 (1991). Různé sloučeniny pro navázání,

			•	·· ··« ·· ·· ·· · · « ···· • · · * * ♦··· • »· ·····»· ·· ·
		60	•	····· ·· · ·· ··
detekování,	značení a/nebo štěpení	nukleových	kyselin jsou
dobře	známy	v oboru (popisuji se	například v	dokumentu US
patent	č.	5,543,507, 5,672,593,	5,484,908,	5,256,648 a

5,681,941.

substrátová přirozenému

Proteiny

Izolované proteiny podle vynálezu obsahují polypeptid, který má alespoň 10 aminokyselin kódovaných libovolným polynukleotidem podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu, nebo polypeptidy, které jsou jejich konzervativně modifikovanými variantami. Příklad polypeptidových sekvencí se popisuje v sekvencích č. 1 až 18 a 73 až 75. Proteiny podle vynálezu nebo jejich varianty mohou obsahovat libovolný počet sousedících aminokyselinových zbytků z polypeptídu podle vynálezu, kde uvedený počet se vybral ze skupiny celých čísel zahrnujících číslo 10 až číslo odpovídající- počtu zbytků v polypeptidů biosyntézy ligninu v plné délce. Tato subsekvence sousedících aminokyselin je alespoň 15, 20, 25, 30, nebo 40 aminokyselin, často alespoň 50, 60, 70, 80 nebo 90 aminokyselin. Dále počet takových sub-sekvencí může být libovolné celé číslo vybrané ze skupiny zahrnující číslo od 1 do 20, jako je 2, 3, 4 nebo 5.

Odborníci přivítají, že vynález zahrnuje katalyticky aktivní polypeptidy podle vynálezu (to je enzymy). Katalyticky aktivní polypeptidy vykazují specifickou aktivitu alespoň 20 %, 30 % nebo 40 %. Upřednostňuje se alespoň 50 %, 60 % nebo 70 % a nejpreferovanější je alespoň 80 %, 90 % nebo 95 % aktivita přirozeného (nesyntetického) endogenního polypeptidů. Dále, specifita (k_cat/K_m) je v podstatě podobná (nesyntetickému) endogennímu polypeptidů.

V typickém případě hodnota K_m bude alespoň 30 %, 40 % nebo 50 % hodnoty přirozeného (nesyntetického) endogenního polypeptidů. Více se upřednostňuje, aby uvedená hodnota byla alespoň 60 %, 70 %, nebo 90 %. Metody testování a kvantifikace meření • * ♦ · • · · « ·

enzymatické aktivity a substrátové specifity (k_cat/K_m) jsou odborníkům známy.

Proteiny podle vynálezu, vyskytují-li se jako imunogeny, obecně vyvolávají produkci protilátek specificky reaktivních s polypeptidem podle vynálezu kódovaným výše popsaným polynukleotidem podle vynálezu. Příklady polypeptidů zahrnují ty, které se vyskytují v plné délce, jak se popisují v sekvenci SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75. Pproteiny podle vynálezu se dále nebudou vázat na antisérum, které vzniklo proti polypeptidu podle vynálezu, který byl plně imunosorbován stejným polypeptidem. Imunologické testy vhodné pro stanovení navázání jsou známy v oboru. Preferovaným imunologickým testem je kompetitivní imunologický test, jak se popisuje dále v textu. Tak je možno proteiny podle vynálezu použít jako imunogeny pro konstrukci protilátek, které imunologicky reagují s proteinem podle vynálezu pro použití například pro imunologické testy nebo techniky čištění proteinů.

Exprese proteinů v hostitelských buňkách

Při použití nukleových kyselin podle vynálezu se může exprimovat protein podle vynálezu v rekombinantně upravené buňce, jako je buňka bakterie, kvasinky, hmyzu, savce nebo výhodně buňky rostlin. Buňky produkují protein při nepřirozených podmínkách (například množství, složení, poloha a/nebo čas), protože byly za tímto účelem geneticky upraveny lidským zásahem.

Očekává se, že odborník zná řadu expresívních systémů, které jsou dostupné pro expresi nukleové kyseliny kódující protein podle vynálezu. Různé metody pro expresi proteinů v prokaryontech nebo v eukaryontech se proto detailněji nepopisuj i.

Exprese izolovaných nukleových kyselin kódujících protein podle vynálezu se v typickém případě dosáhne operativním spojením například DNA nebo cDNA s promotorem (který je buď • · e

konstitutivní nebo indukovatelný), s následujícím začleněním do expresívního vektoru. Vektory mohou být vhodné pro replikaci a integraci v prokaryontech nebo v eukaryontech. Typické expresivní vektory obsahují terminátory transkripce a translace, iniciační sekvence a promotory použitelné pro regulaci exprese DNA kódující protein podle vynálezu. Aby se získala silná exprese klonovaného genu, je nutné zkonstruovat expresivní vektory, které obsahují minimálně silný promotor pro řízení transkripce, vazebné místo pro ribozóm vhodné pro iniciaci translace a terminátor transkripce/translace. Odborníkovi je zřejmé, že na proteinu podle vynálezu je možné provést úpravy, aniž se sníží jeho biologická aktivita. Je možno provést některé modifikace, aby se usnadnilo klonování, exprese nebo začlenění cílené molekuly do fúzního proteinu. Takové modifikace jsou v oboru známy a zahrnují například přidání methioninu na N-konec za vzniku iniciačního místa nebo další aminokyseliny (například polyHis) umístěné na libovolný konec za vzniku vhodně umístěných restrikěních míst nebo terminačních kodonů nebo čištěných sekvencí.

A. Exprese v prokaryontech

Prokaryontní buňky je možné při expresi použít jako hostitele. Prokaryonti jsou nejčastěji reprezentováni různými kmeny E. coli; mohou se však použít i jiné mikrobiální kmeny. Běžně užívané prokaryontní kontrolní sekvence, které jsou zde definovány tak, že zahrnují promotory pro iniciaci transkripce, často s operátorem, spolu se sekvencemi místa, na něž se váže ribozóm, zahrnují takové běžně užívané promotory, jako jsou promotorové systémy beta laktamázy (penicilináza) a laktózy (lac) (Chang et al., Nátuře 198: 1056 (1977), promotorový systém tryptofanu (trp) (popisuje se v publikaci Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980)) a PL promotor získaný z fágu lambda a vazebné místo pro ribozym NI • ·

genu (popisuje se v publikaci Shimatake et al., Nátuře 292:128 (1981)). Je také možné použít inkluze selekčních markérů ve vektorech DNA transfekovaných v E. coli. Příklady takových markérů zahrnují geny, které specifikují rezistenci na ampicilin, tetracyklin nebo chloramfenikol.

Vektor se volí tak, aby umožňoval zavedení do vhodné hostitelské buňky. Bakteriální vektory pocházejí v typickém případě z. plazmidu nebo z fága. Vhodné bakteriální buňky se infikují fágovými částicemi, které obsahují vektor, nebo se transfekují samotnou fágovou vektorovou DNA. Jestliže se používá plazmidový vektor, bakteriální buňky se transfekují DNA plazmidového vektoru. Expresívní systémy vhodné pro expresi proteinu podle vynálezu jsou dostupné při použití mikroorganizmů Bacillus sp. a Salmonella (Palva, et al., Gene 22: 229-235 (1983), Mosbach, et al., Nátuře 302: 543-545 (1983)).

B. Exprese v eukaryontech

Odobrníkům je známa řada eukaryontních expresívních systémů, jako jsou kvasinky, hmyzí buněčné linie, rostlinné a savčí buňky. Jak se stručně vysvětluje dále v textu, je možno v těchto eukaryontních systémech exprimovat protein podle vynálezu. V některých provedeních vynálezu se jako expresívní systémy při produkci proteinů podle vynálezu používají transformované/transfekované rostlinné buňky, podrobně popsané dále v textu.

Syntéza heterologních proteinů v kvasinkách je známa. Sherman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboracory (1982) je uznávaná práce, popisující různé metody dostupné pro produkci proteinů v kvasinkách. Vhodné vektory obvykle mají expresi řídící sekvence, promotory, zahrnující 3-fosfoglycerát kinázu glykolytické enzymy, a podle potřeby počátek terminační sekvence a podobně. Vhodné vektory se například jako jsou nebo j iné replikace, * · • · · · · popisují v publikaci Botstein, et al., Gene 8: 17-24 (1979),

Broach, et al., Gene 8: 121-133 (1979).

Protein podle vynálezu, jakmie je exprimován, se může izolovat z kvasinek lyží buněk a dále se na lyzát aplikuje standardní izolační technika proteinu. Sledování procesu čištění se může uskutečnit použitím metody westernová přenosu nebo radioimunologického testu nebo jiných standardních metod imunologických testů.

Sekvence kódující proteiny podle vynálezu se mohou také ligovat do různých expresívních vektorů za účelem použití v transfekovaných buněčných kulturách, které například pochází ze savců, hmyzu nebo rostlin. Příkladem buněčných kultur použitelných při produkci peptidů jsou savčí buňky. Savčí buněčný systém je často ve formě monovrstev buněk, ačkoli se také mohou použít suspenze savčích buněk. V oboru byla vyvinuta řada vhodných hostitelských buněčných linií schopných exprimovat nepoškozené proteiny a zahrnují buněčné linie HEK293, BHK21 a CHO. Expresívní vektory vhodné pro tyto buňky mohou zahrnovat sekvence řídící expresi, jako je počátek replikace, promotor (například promotor CMV, promotor HSV tk nebo promotor pgk (fosfoglycerát kinázy), zesilovač (popisuje se v publikaci Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986)) a nezbytná místa pro zpracování informací, jako jsou vazebná místa ribozómů, místa sestřihu RNA, polyadenylační místa (například SV40 velké T ag póly A adiční místo) a transkripční terminační sekvence. Jiné savčí buňky použitelné při produkci proteinů podle vynálezu jsou dostupné například u instituce American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7. vydání, 1992).

Vhodné vektory pro expresi proteinů podle vynálezu v hmyzích buňkách se obvykle získaly z bakuloviru SF9. Vhodné hmyzí buněčné linie zahrnují buněčné linie z larvy moskytů, bource morušového, vojnice, molů a mušky Drosophila, jako je * · • · · · · · ······· « · ·

Schneiderova buněčná linie (popisuje se v publikaci Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365 (1987)).

Stejně jako u kvasinek, použijí-li se hostitelské buňky vyšších živočichů nebo rostlin, do vektoru se typicky začleňují terminační sekvence polyadenylace nebo transkripce. Příkladem terminační sekvence je polyadenylační sekvence z genu bovinního růstového hormonu. Mohou se také zahrnout sekvence pro správnou úpravu sestřihem transkriptu. Příkladem sekvence řídící úpravu sestřihem je intron VP z SV40 (Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-781 (1983)). Navíc mohou být do vektoru zabudovány genové sekvence pro řízení replikace v hostitelské buňce, jako jsou ty, které se nacházejí ve vektorech typu bovinních papilomavirů (popisují se v publikaci Saveria-Campo, Μ. , Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Clonning Vector in DNA Clonning Vol. II a Practical Approach, D. M. Glover, Ed., IRL Press, Arlington, Virginia pp. 213-238 (1985)).

Transfekce/transformace buněk

Způsob transformace/transfekce není z hlediska vynálezu rozhodující; v současné době jsou dostupné různé metody transformace nebo transfekce. Protože jsou pro transformaci plodin nebo jiných hostitelských buněk dostupné novější metody, mohou se přímo aplikovat. Je tedy vyvinuto velké množství metod pro začlenění sekvence DNA do genomu hostitelské buňky k dosažení transkripce a/nebo translace sekvence za účelem uskutečnění změn fenotypu v organizmu. Tak se může použít libovolná metoda, která poskytuje účinnou transformaci/transfekci.

A. Transformace rostlin

Sekvence DNA kódující požadovaný vynálezu, například cDNA nebo genomová protein v plné délce, se může použít při polynukleotid podle sekvence kódující konstrukci • <1 • · • · • · rekombinantní expresívní kazety, která se může zavést do požadované rostliny.

Izolované nukleové kyseliny podle vynálezu se mohou zavést do rostlin podle metod dobře známých v oboru. V obecném případě se připravily rekombinantní expresívní kazety, jak se popisuje shora v textu, které jsou vhodné pro transformaci rostlinných buněk. Způsoby transformování různých druhů vyšších rostlin jsou dobře známy v oboru a popisují se v technické, vědecké a patentové literatuře (popisuje se například v publikaci Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477 (1988)). Konstrukce DNA se může například zavést přímo do genomové DNA rostlinné buňky za použití metod, jako je elektroporace, porace pomocí PEG, bombardování částicemi, zavedení silikonových vláken nebo mikroinjekce protoplastů rostlinných buněk nebo embryonálního kalusu. V jiném případě se konstrukce DNA mohou kombinovat s vhodnými oblastmi lemujícími T-DNA a mohou se zavést do vhodného hostitelského vektoru mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens. Funkce virulence hostitele Agrobacterium tumefaciens budou řídit inzerci konstrukce a markéru do DNA rostlinné buňky, v případě, že buňka se infikovala bakterií.

Zavedení konstrukcí DNA za použití srážení polyetylenglykolem se popisuje v publikaci Paszkowski et al., Embo J. 3: 2717-2722 (1984). Metody elektroporace se popisují v publikaci Fromm et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 82: 5824 (1985). Metody balistické transformace se popisují v publikaci Klein et al., Nátuře 327: 70-73 (1987).

Transformační techniky zprostředkované mikroorganizmem Agrobacterium tumefaciens se popisují ve vědecké literatuře v publikaci Horsch et al., Scince 233: 496-498 (1984) a Fraley et al., Proč. Nati. Acad. Sci. 80: 4803 (1983). Ačkoli mikroorganizmus Agrobacterium je možné použít primárně ve dvouděložn^ch rostlinách, také transformace jednoděložn^ch rostlin může proběhnout za použití uvedených organizmů.

i • * • ·

Transformace kukuřice mikroorganizmem Agrobacterium tumefaciens se popisuje v dokumentu US patent č. 5,550,318.

Jiné metody transfekce nebo transformace zahrnují (1) transformaci zprostředkovanou mikroorganizmem Agrobacterium rhizogenes (popisuje se v publikaci Lichtenstein and Fuller v Genetic Engeneering, vol. 6, PWJ Rigby, Ed., London, Academie Press, 1987 a Lichtenstein, C. P. and Draper, J. , v DNA Cloning, Vol. II, D. M. Glover, Ed., Oxford, IRI Press, 1985), přihláška PCT/US87/02512 (WO 88/02405 zveřejněno 7. dubna 1988), kde se popisuje použití A. rhizogenes kmen A4 a jeho plazmidc £i spolu s vektory pARC8 nebo pARC16 mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens, (2) zavedení DNA zprostředkované lipozomy (popisuje se například v publikaci Freeman et al., Plant Cell Physiol. 25: 1353, 1984), (3) způsob míchání na vortexu (popisuje se v publikaci Kindle, Proč. Nati. Acad. Sci., USA 87: 1228, (1990)).

DNA se může také zavést do rostlin přímým transferem DNA do pylu, jak se popisuje v publikací Zhou et al., Methods in Enzymology, 101: 433 (1983), D. Hess, Intern Rev. Cytol.,

107:367 (1987), Luo et al., Plane Mol. Biol. Reportér, 6: 165 (1988). Exprese genů kódujících polypeptid se může dosáhnout injekcí DNA do reprodukčních orgánů rostliny, jak se popisuje v publikaci Pěna et al., Nátuře, 325:274 (1987). DNA se může také zavést injekcí přímo do buněk nezralých embryí a rehydratací vysušených embryí, jak se popisuje v publikaci Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75: 30 (1987) a Benbrook et al., v Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass., pp. 27-54 (1986). Různé rostlinné viry , které se mohou použít jako vektory, jsou dobře známy v oboru a zahrnují květákový mozaikový virus (CaMV), geminivirus, tabákový mozaikový virus.

B. Transfekce prokaryont, nižších eukaryont a zvířecích buněk « Μ

Hostitelské buňky zvířat a nižších eukaryont (například kvasinky) jsou kompetentní nebo skoro kompetentní pro transfekci různými způsoby. Existuje několik dobře známých metod, které jsou vhodné pro zavedení DNA do zvířecích buněk. Ty zahrnují srážení fosforečnanem vápenatým, fúzi recipientních buněk s bakteriálními protoplasty, které obsahují DNA, ošetření recipientních buněk lipozomy, které obsahují DNA, ošetření dextranem DEAE, elektorporaci, biolistiku a mikroinjekce DNA přímo do buněk. Transfekované buňky se kultivují způsoby, které jsou dobře známy v oboru (popisují se například v publikaci Kuchler, R. J., Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchínson and Ross, lne. (1977)) .

Syntéza proteinů

Proteiny podle vynálezu se mohou konstruovat za použití nebuněčných syntetických metod. Syntéza proteinů obsahujících méně než přibližně 50 aminokyselin na pevné fázi se může uskutečnit připojením C-terminální aminokyseliny sekvence k nerozpustnému podkladu, po čemž následuje sekvenční adice zbývajících aminokyselin v sekvenci. Techniky syntézy pevné fáze se popisují v publikaci Barany and Nerrifield, SolidPhase Peptide Synthesis, pp. 3-284 in The Peptides: Analysis,

Synthesis,	Biology.	Vol. 2: Speciál	Methods in	Peptide
Synthesis,	Part A.,	Merrifield, et al.,	J. Am. Chem.	Soc. 85:
2149-2156	(1963) a	Stewart et al.,	Solid Phase	Peptide
Synthesis,	2nd ed.,	Pierce Chem. Co.,	Rockford, III	(1984) .

Proteiny větší délky se mohou syntetizovat kondenzací N- a Ckonců kratších fragmentů. Metody tvoření peptidových vazeb aktivací C-kcnce (například použitím kondenzačního činidla Ν, N'-dicycylohexylkarbodiimid) jsou dobře známy v oboru.

Čištění proteinů * v stlačením) produktů

Proteiny podle vynálezu se mohou čistit standardními metodami známými v oboru. Proteiny podle vynálezu produkované rekombinantními metodami se mohou exprimovat přímo nebo se exprimují jako fúzní proteiny. Rekombinatní protein se čistí kombinací buněčné lyže (například sonikací, Frenchovým a afinitní chromatografii. V případě fúzních následné štěpení fúzního proteinu vhodným proteolytickým enzymem uvolňuje požadovaný rekombinantní protein.

Proteiny podle vynálezu, rekombinantní nebo syntetické, se mohou čistit k dosažení podstatné čistoty standardními metodami, které jsou dobře známy v oboru. Tyto metody zahrnují selektivní srážení s takovou látkou, jako je síran amonný, kolonovou chromatografii, imunologické čistící metody a jiné v publikaci R. Scopes, Protein [popisuj e se například

Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag: New York (1982), Deutscher, Guide to Protein Purification, Academie Press (1990) . Je možno například vyvolat protilátky proti zde popsaným proteinům. Čištění z E. coli je možné dosáhnout postupy, které se popisují v dokumentech US patent č. 4,511,503. Protein se pak může izolovat z buněk exprimujících protein a může se dále čistit technikami standardní proteinové chemie. Detekce exprimovaného proteinu se může dosáhnout způsoby známými v oboru, které zahrnují například radioimunologické testy, techniky westernová přenosu nebo imunologické srážení.

Transgenní rostlinná regenerace

Transformované rostlinné buňky, které se získaly libovolnou ze shora popsaných technik transformace, se mohou kultivovat za vzniku celé rostliny, která vykazuje transformovaný genotyp. Takové regenerační techniky se často spoléhají na manipulaci jistých fytohormonů v růstovém médiu tkáňové kultury. V typickém případě se spoléhají na biocidový φ · φ φ nebo herbicidový markér, který se zavede spolu s polynukleotidem podle vynálezu.

Rostlinné buňky transformované rostlinným expresívním vektorem se mohou regenerovat například z jednotlivých buněk, z kalusové tkáně nebo z listových disků podle metod standardních kultur rostlinné tkáně. V oboru je dobře známo, že různé buňky, tkáně orgány z většiny rostlin se mohou úspěšně kultivovat za vzniku celé rostliny. Regenerace rostliny z kultivovaných protoplastů se popisuje v publikaci Evans et al., Protoplast Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillilan Publishing Company, New York, pp. 124-176 (1983) a Binding, Rgeneration of Plants, Plant

Protoplasts, CRC Press, Boča Raton, pp. 21-73 (1985).

Rgenerace rostlin obsahujících cizorodý gen zavedený mikroorganizmem Agrobacterium z listových explantátů se může dosáhnout způsobem, který se popisuje v publikaci Horsch et Science, 227:1229-1231 (1985)

V této proceduře se il transformanti kultivují v přítomnosti selekčního činidla a v médiu, které indukuje regeneraci výhonků v rostlinných druzích, které jsou transformovány, jak se popisuje v publikaci Fraley et al., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 4803 (1983). Tímto postupem je možné získat v typickém případě výhonky během dvou až čtyř týdnů a tyto výhonky transformantů se pak přenesou do vhodného média indukujícího kořeny, které obsahuje selekční činidlo a antibiotika, aby se zabránilo růstu bakterií. Transgenní rostliny podle vynálezu mohou být fertilní nebo sterilní.

Regenerace také může proběhnout z rostlinného kalusu, explantátů, orgánů nebo jejich částí. Takové metody regenerace se popisují v publikaci Klee et al., Ann. Rev. of Plant Phys. 38: 467-486 (1987). Regenerace rostlin buď z protoplastů jedné rostliny nebo z různých explantátů, jsou dobře známy v oboru (popisuje se například v publikaci Methods for Plant Molecular Biology, A. Weissbach and H. Weissbach, eds., Academie Press, ♦ · • · lne., San Diego, Calif. (1988). Tento proces regenerace a růstu zahrnuje kroky selekce transformovaných buněk a výhonků, vytvoření kořenů tranformovaných výhonků a růst rostlinek v půdě. V případě kultury buněk kukuřice a regenerace se tyto metody popisují v publikaci The Maize Handbook, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994), Corn and Corn Improvement, 3-rd edition, Sprague and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988).

Odborníkovi je zřejmé, že po stabilním zavedení rekombinantní expresívní kazety do transgenních rostlin a potvrzení, že je funkční, se může kazeta zavést do jiné rostliny pohlavním křížením. Může se použít kterákoli ze standardních metod křížení v závislosti na druzích, které se mají křížit.

U vegetativně množených plodin se zralé transgenní rostliny mohou množit řízky nebo technikou kultivace tkání za vzniku více shodných rostlin. Provede se selekce požadovaných transgenů a získají se nové odrůdy, které se vegetativně pomnoží pro komerční účely. U plodin, které se množí semeny, se mohou zralé transgenní rostliny navzájem křížit za vzniku homozygotní inbrední rostliny. Inbrední rostlina produkuje semena obsahující nově zavedenou heterologní nukleovou kyselinu. Tato semena se mohou kultivovat za vzniku rostlin, které budou produkovat vybraný fenotyp (například změněný obsah nebo složení biosyntézy ligninu).

Vynález zahrnuje části získané z regenerované rostliny, jako jsou květy, semena, listy, větve, plody a podobně, pokud tyto části obsahují buňky, které zahrnují izolovanou nukleovou kyselinu podle vynálezu. Potomstvo a odrůdy a mutanti regenerovaných rostlin jsou také zahrnuty do vynálezu, pokud tyto části obsahují zavedené sekvence nukleových kyselin.

U transgenních rostlin exprimujících selektovatelný markér se může testovat přenos nukleové kyseliny podle • · · • « · » * · Μ vynálezu například standardním imunoblotem a metodou detekce DNA. U transgenní linie se také v typickém případě hodnotí síla exprese heterologní nukleové kyseliny. Na začátku je možné stanovit expresi na úrovni RNA, aby se identifikovaly a kvantifikovaly rostliny s pozitivní expresí. Mohou se použít standardní metody analýzy RNA a zahrnují testy amplifikace PCR za použití oligonukleotidových primerů navržených pro amplifikaci pouze templátů heterologní RNA a hybridizační testy v roztoku za použití heterologních sond specifických pro nukleovou kyselinu. U RNA pozitivních rostlin je pak možno analyzovat expresi proteinu westernovou analýzou imunoblotem za použití specificky reaktivních protilátek podle vynálezu.

Navíc je možno uskutečnit hybridizaci in šitu a imunocytochemii podle standardních protokolů za použití polynukleotidových sond a protilátek specifických pro heterologní nukleovou kyselinu za účelem lokalizace míst exprese v transgenní tkáni. Obecně se na zabudovanou nukleovou kyselinu obvykle testuje několik transgenních liní, aby se zjistily a vybraly rostliny s nejvhodnějším profilem exprese.

Výhodné provedení vynálezu představuje transgenní rostlina, která je homozygotní v případě přidané heterologní nukleové kyseliny, tj. transgenní rostlina, která obsahuje dvě přidané sekvence nukleové kyseliny, jeden gen ve stejném lokusu na každém chromozomu páru chromozomů. Homozygotní transgenní rostlina se může získat pohlavním křížením (samoopylením) heterozygotní transgenní rostliny, která obsahuje jedinou přidanou nukleovou kyselinu, naklíčením části získaného osiva a analýzou výsledných rostlin na změněnou lignifikace vzhledem ke kontrolní rostlině (tj. přirozené, netransgenní). Vynález zahrnuje také zpětné křížení s rodičovskou rostlinou a křížení s netransgenní rostlinou.

Modulace obsahu a/nebo složení biosyntézy ligninu • *

Vynález dále zahrnuje způsob modulace (to znamená zvyšování nebo snižování) obsahu nebo složení biosyntézy ligninu v rostlině nebo její části. Modulaci je možno provádět zvyšováním nebo snižováním obsahu biosyntézy ligninu (tj. celkového množství biosyntézy ligninu) a/nebo složení biosyntézy ligninu (poměru různých monomerů biosyntézy ligninu v rostlině) v rostlině. Způsob zahrnuje transformaci rostlinné buňky rekombinantní expresívní kazetou, která obsahuje polynukleotid podle vynálezu, jak se popisuje shora v textu, aby se získala transformovaná rostlinná buňka, kultivaci transformované rostlinné buňky za podmínek tvorby rostlin a vyvolání exprese polynukleotidu podle vynálezu v rostlině po dobu dostatečnou pro modulaci obsahu a/nebo složení biosyntézy ligninu v rostlině nebo v její části.

V některých provedeních je možno lignifikaci v rostlině modulovat in vivo nebo in vitro měněním promotoru neizolovaného genu biosyntézy ligninu, přičemž se reguluje pozitivně nebo negativně exprese genu. V některých provedeních mohou být kódující oblasti přirozených genů biosyntézy ligninu měněny substitucí, adicí, inzercí nebo delecí pro snížení aktivity kódovaného enzymu (popisuje se v publikaci Kmiec, US patent 5,565,350, Zarling et al., PCT/US93/03868. V některých provedeních se izolovaná nukleová kyselina (například vektor) obsahující promotorovou sekvenci transfekuje do rostlinné buňky. Následně se vybírá rostlinná buňka obsahující promotor operativně spojený s polynukleotidem podle vynálezu způsoby známými v oboru, jako je Southernův přenos, sekvenování DNA nebo analýza PCR za použití primerů specifických pro promotor a gen a detekce produkovaných amplikonů. Rostlina nebo

rostlinná	část	změněná	nebo	modifikovaná	výše	uvedenými
provedeními	se	pěstuje	za podmínek tvorby	rostlin	po dobu,
dostatečnou	pro	modulaci	obsahu	a/nebo složení	biosyntézy

ligninu v rostlině. Podmínky, při kterých dochází k tvorbě rostliny jsou dobře známy v oboru a popisují se shora v textu.

V obecném případě se obsah nebo složení zvyšuje nebo snižuje alespoň o 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % nebo 90 % relativně vzhledem k přirozené kontrolní rostlině nebo buňce, která neobsahuje dříve popisovanou expresívní kazetu. Modulace podle vynálezu se může projevit během a/nebo následně po vypěstování rostliny do požadovaného stádia vývoje. Modulování exprese nukleové kyseliny dočasně a/nebo v určitých tkáních se může řídit použitím vhodného promotoru operativně spojeného s polynukleotidem podle vynálezu například v sense nebo antisense orientaci, jak se diskutuje shora v textu. Indukce exprese polynukleotidu podle vynálezu se může také řídit exogenní aplikací účinného množství indukující látky. Indukovatelné promotory a indukující látky, které aktivují expresi z těchto promotorů, jsou dobře známy v oboru. V preferovaných provedeních podle vynálezu se lignifikace moduluje v jednoděložních rostlinách, zvláště v kukuřici.

Molekulové markéry

Vynález poskytuje způsob typování genů rostliny obsahující polynukleotid podle vynálezu. Upřednostňuje se jednoděložná rostlina, jako je kukuřice nebo proso. Typování genů poskytuje způsoby rozlišování homologů chromozomového páru a může se použít pro diferenciaci segregantů v rostlinné populaci. Molekulové markerové metody se mohou použít pří fylogenetických studiích, charakterizujících genetické vztahy mezi odrůdami plodin, identifikování kříženců nebo somatických hybridů, lokalizaci chromozomálních segmentů ovlivňujících monogenní rysy, klonování na základě mapy a studie kvantifikace zděděných vlastností (popisuje se v publikaci Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Chapter 7, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlin (1997)).

»· · *

Molekulární markerové metody se popisují v publikaci The DNA Revolution by Andrew H. Paterson 1996 (Chapter 2) in Genome Mapping in Plants (ed. Andrew H. Pateson) Academie Press/R. G. Landis Company, Austin, Texas, pp. 7-21).

Určitý způsob typování genů podle vynálezu může použít libovolný počet molekulových markerových analytických technik, jako je polymorfizmus délky restrikčních fragmentů (RFLP). RFLP je produkt alelových rozdílů mezi restrikčními fragmenty DNA způsobených variabilitou nukleotidové sekvence. V oboru je dobře známo, že RFLP se v typickém případě detekuje extrakcí genomové DNA a štěpením restrikčními enzymy. Výsledné fragmenty se obvykle separují podle velikosti a hybridizují se sondou; preferují se sondy tvořící jednu kopii. Zjišťují se tak restrikční fragmenty z homologních chromozómů. Rozdíly ve velikosti fragmentů mezi alelami reprezentují RFLP. Vynález tak dále poskytuje metodu umožňující sledovat segregaci genu nebo nukleové kyseliny biosyntézy ligninu podle vynálezu, stejně jako chromozomové sekvence geneticky spojené s těmito geny nebo nukleovými kyselinami za použití takových technik, jako je analýza RFLP. Spojené chromozomální sekvence tvoří 50 centiMorganů (cM) , často 40 nebo 30 cM, přednostně 20 nebo 10 cM, výhodně 5, 3, 2 nebo 1 cM genu biosyntézy ligninu.

Podle vynálezu sondy nukleových kyselin používané pro molekulové markerové mapování rostlinných jaderných genomů selektivně hybridizují za selektivních hybridizačních podmínek s genem kódujícím polynukleotid podle vynálezu. V preferovaném provedení vynálezu se sondy volí z polynukleotidů podle vynálezu. V typickém případě tyto sondy jsou sondy cDNA nebo Pstl genomové klony. Délka sond se popisuje ve větších detailech shora v textu, ale typicky sondu tvoří alespoň 15 baží, výhodně alespoň 20, 25, 30, 35, 40 nebo 50 baží. Obecně jsou však sondy kratší než přibližně 1 kb.

Upřednostňují se sondy tvořící jednu kopii, které hybridizují s jediným lokusem v haploidním chromozómovém komplementu. Příklady některých restrikčních enzymů, které se podílejí na RFLP mapování, jsou EcoRI, EcoRv a Sstl. Termín „restrikční enzym zahrnuje kompozici, která rozeznává sama nebo ve spojení s jinou kompozicí a štěpí specifickou nukleotidovou sekvenci.

Způsob detekce RFLP zahrnuje (a) štěpení genomové DNA rostliny pomocí restrikčního enzymu, (b) hybridizací sondy nukleové kyseliny za selektivních hybridizačních podmínek se sekvencí polynukleotidů podle vynálezu uvedené DNA, (c) detekci RFLP. Jiné metody diferenciačních polymorfních (alelových) variant polynukleotidů podle vynálezu mohou najít použití v molekulových markerových technikách, které jsou dobře známy v oboru. Jsou to: 1) jednořetězcová konformační ananlýza (SSP), 2) denaturační gradientově gelová elektroforéza (DGGE), 3) testy ochrany proti působení RNázy, 4) oligonukleotidy specifické pro alely (ASO), 5) použití proteinů, které rozeznávají nesprávné párování nukleotidů, jako je například protein mutS mikroorganizmu E. coli a 6) PCR specifické pro alely. Jiné přístupy založené na detekci nesprávného párování mezi komplementárními řetězci DNA zahrnují sevřenou denaturační gelovou elektroforézu (CDGE), heteroduplexní analýzu (HA) a chemické štěpení chybného párování (CMC). Příklady polymorfních variant jsou uvedeny v tabulce č. I shora v textu. Vynález tak dále popisuje způsob typování genů, který zahrnuje kontaktování vzorku, kde se očekává, že obsahujepolynukleotid podle vynálezu, s nukleovou sondou za přísných hybridizačních podmínek. V obecném případě vzorek je rostlina. Upřednostňuje se vzorek, kde se očekává, že obsahuje polynukleotid kukuřice podle vynálezu (například gen, mRNA). Sonda nukleové kyseliny selektivně hybridizuje za přísných podmínek se sub-sekvencí polynukleotidů podle vynálezu, který obsahuje polymorfní markér. Selektivní a · hybridizace sondy nukieové kyseliny se sekvencí nukieové kyseliny polymorfního markéru vede k vytvoření hybridizačního komplexu. Detekce hybridizačního komplexu indikuje přítomnost uvedeného polymorfního markéru ve vzorku. V preferovaném provedení vynálezu sonda nukieové kyseliny obsahuje polynukleotid podle vynálezu.

UTR a preference kodónu

Zjistilo se, že v obecném případě se účinnost translace reguluje elementy specifické sekvence v 5'nekódující nebo nepřekládané oblasti (5'UTR) RNA. Pozitivní sekvenční motivy zahrnují iniciační sekvence (popisuje se v publikaci Kozák, Nucleic Acids Res. 15: 8125 (1987)) a strukturu čepičky 5<G> 7 metylGpppG (popisuje se v publikaci Drummond et al., Nucleic Acids Res. 13: 7375 (1985)). Negativní elementy zahrnují stabilní intramolekulové struktury 5'UTR smyčky stonku (popisuje se v publikaci Muesing et al., Cell 48: 691 (1987)) a sekvence AUG nebo krátké otevřené čtecí rámce, kterým předchází v 5'UTR vhodný AUG (popisuje se v publikaci Kozák, Nucleic Acids Res. 15: 8125 (1987), Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8: 284 (1988)). Vynález dále popisuje oblasti 5'a/nebo 3' UTR vhodné pro modulaci translace heterologních kódujících sekvencí.

Dále, segmenty kódující polypeptid polynukleotidů podle vynálezu se mohou modifikovat, aby se změnilo použití kodonu. Změněné použití kodonu je možné využít při změně účinnosti translace a/nebo optimalizovat kódující sekvenci vhodnou pro expresi požadovaného hostitele nebo pro optimalizaci použití kodonu v heterologní sekvenci při expresi v kukuřici. Použití kodonu v kódujících oblastech polynukleotidu podle vynálezu se může analyzovat statisticky za použití komerčně dostupného softwaru, jako je „Codon Preference, který je dostupný u instituce University of Wisconsin Genetics Computer Group (popisuje se v publikaci Devereaux et al., Nucleic Acids Res.

·

7í

12: 387-395 (1984)) nebo MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Vynález tak popisuje frekvenční charakteristiky použití kodonu kódující oblasti alespoň jednoho z oligonukleotidů podle vynálezu. Počet polynukleotidů, které se mohou použít pro stanovení frekvence použití kodonu, může být libovolné celé číslo od čísla 1 do čísla, které odpovídá počtu polynukleotidů podle vynálezu. Polynukleotidy budou sekvence v plné délce. Příklad počtu sekvencí v případě statistické analýzy může být alespoň 1, 5, 10, 20, 50 nebo 100.

Přeskupení sekvencí

Vynález popisuje způsoby přeskupení sekvencí za použití polynukleotidů podle vynálezu a takto vzniklé výsledné kompozice. Přeskupení sekvencí se popisuje v přihlášce PCT č. 96/19256 a v publikaci Zhang, J.-H., et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94: 4504-4509 (1997). V obecném případě přeskupení sekvencí poskytuje způsoby vzniku knihoven polynukleotidů, které mají požadovanou charakteristiku a jenž se mohou vybrat a testovat. Knihovny rekombinantních polynukleotidů se vytvořily z populace příbuzných sekvenčních polynukleotidů, které obsahují sekvenční oblasti, které jsou v podstatě shodné a mohou se homologicky rekombinovat in vitro nebo in vivo. Populace sekvenčně rekombinovaných polynukleotidů obsahuje sub-populaci polynukleotidů, které výhodné charakteristiky a které se mají požadované nebo mohou vybrat vhodnou selekční testovací metodou. Charakteristikami mohou být libovolné vlastnosti nebo atributy, které je možné vybrat pro testovací systém nebo je v něm detekovat. Mohou zahrnovat vlastnosti kódovaného proteinu, transkripčního elementu, sekvence řídící transkripci, zpracování RNA, stability RNA, konformace chromatinu, translace nebo jiné vlastnosti genu nebo transgenu, replikačního expresívní elementu, elementu vázajícího protein nebo podobně. Mohou to být takové

I

rysy, které (rfodtdNčijí selektovatelné nebo detekovatelné vlastnosti. V některých provedeních podle vynálezu vybranou charakteristikou bude zvýšená hodnota K_m a/nebo K_cat ve srovnání s uvedenými hodnotami proteinu divokého typu. V jiných provedeních vynálezu protein nebo polynukleotid vytvořený přeskupením sekvence bude obsahovat ligand s vazebnou afinitou vyšší než je nepřeskupený polynukleotid divokého typu. Posílení takových vlastností může být alespň 110 %, 120 %, 130 %, 140 % nebo alespoň 150 % ve srovnání s hodnotou divokého typu.

Detekce nukleových kyselin

Vynález dále popisuje metody vhodné pro detekci polynukleotidu podle vynálezu ve vzorku nukleové kyseliny, u které se očekává, že obsahuje polynukleotid podle vynálezu, jako je lyzát rostlinných buněk, zvláště lyzát kukuřice. V některých provedeních vynálezu se u kukuřice gen biosyntézy ligninu nebo jeho část se může amplifikovat dříve než dojde ke kontaktu vzorku nukleové kyseliny s polynukleotidem podle vynálezu. Vzorek nukleové kyseliny přichází do kontaktu s polynukleotidem za vzniku hybridizačního komplexu. Polynukleotid hybridizuje za přísných podmínek s genem kódujícím polypeptid podle vynálezu. Vytvoření hybridizačního komplexu je možné použít pro detekci genu kódujícího polypeptid podle vynálezu ve vzorku nukleové kyseliny. Pro když izolovaná nukleová kyselina podle vynálezu nebude zahrnovat skříženě hybridizujicí sekvence, které jsou běžné v genech biosyntézy jiných látek než· je lignin, které povedou k falešně pozitivním výsledkům.

Detekce hybridizačního komplexu se může dosáhnout za použití libovolného počtu metod dobře známých v oboru. Vzorek nukleové kyseliny nebo jeho část se může například testovat hybridizací, která například probíhá v roztoku, na pevné fázi odborníky bude výhodné, obsahující polynukleotid nebo hybridizaci in šitu. Při hybridizaci v roztoku (nebo v kapalině) jsou cílová nukleová kyselina a sonda nebo primer ve volné formě, aby mohly intera<Aj ovát v reakční směsi. Při hybridizaci na pevné fázi jsou sondy nebo primery v typickém případě navázány na pevný podklad, kde jsou dostupné pro hybridizaci s cílovou nukleovou kyselinou v roztoku. Ve smíšené fázi meziprodukty nukleové kyseliny hybridizují v roztoku s cílovými nukleovými kyselinami v roztoku, stejně jak tomu je u nukleových kyselin navázaných na pevném podkladu. Při hybridizaci in šitu se cílová nukleová kyselina uvolní ze svého okolí tak, že je dostupná pro hybridizaci v buňce, zatímco se zachová buněčná morfologie pro následnou interpretaci a analýzu. V publikaci Singer et al., Biotechniques 4(3): 230-250 (1986), Haase et al., Methods in

Virology, Vol, and practice Hybridization,

VII, pp, of in

D. G.

189-226 (1984), Wilkinson, The theory šitu hybridization, in: In šitu

Wilkinson, Ed., IRL Press, Oxford

University Press, Oxford, a Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, Hames, B. D. and Higgins, S. J. , Eds., IRL Press (1987) se uvádí přehled formátů různých hybridizačních testů.

Značení nukleových kyselin a detekční metody

Způsob jakým se značí nukleové kyseliny podle vynálezu není kritický aspekt vynálezu a může se usktečnit libovolným počtem metod, které jsou doposud známy nebo budou dále vyvinuty. Detekovatelné značící činidla vhodná pro použití podle vynálezu mohou zahrnovat libovolné kompozice detekovatelné spektroskopickým, radioizotopickým, fotochemickým, biochemickým, imunochemickým, elektrickým, optickým nebo chemickým způsobem. Použitelná značící činidla podle vynálezu zahrnují biotin pro barvení se značeným streptavidinovým konjugátem, magnetické částice, fluorescenční barviva (například fluorescein, texas |<.á červeň, rodamin, zelený fluoerescenční protein a podobně), radioaktivní značící činidla (například ³H, ^12bI, ^JbS, ⁱ⁴C nebo ³²P) , enzymy (například křenovou používané činidla, plastové peroxidázu, alkalickou enzymy v testu ELISA) fosfatázu a jiné běžně a kolorimetrická značící jako jsou koloidní zlato nebo barevné sklo nebo (například polystyrénové, polypropylenové, latexové atd.) částice.

Nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být značeny libovolnou z několika metod, typicky používaných pro detekci přítomnosti hybridizovaných nukleových kyselin. Jednou běžnou metodou detekce je použití autoradiografie za použití sond značených ³H,

125

I,

S,

C nebo ³²P nebo podobně.

radioaktivního izotopu záleží na preferencích

Volba výzkumu z hlediska jednoduchosti syntézy, stability a poločasu rozpadu vybraných izotopů. Jinými značícími činidly jsou ligandy, které vážou protilátky značené fluorofory, chemiluminiscenčními činidly a enzymy. V jiném případě se mohou sondy spojovat přímo se značícími činidly, jako jsou fluorofory, chemiluminiscenční činidla nebo enzymy. Volba znaícího činidla závisí na požadované citlivosti, jednoduchosti konjugace se sondou, požadavcích stability a dostupném přístrojovém vybavení. Značení nukleových kyselin podle vynálezu je snadno dosažitelné, například za použití značených PCR primerů.

V některých provedeních vynálezu se značící činidlo současně začleňuje během amplifikace při přípravě nukleových kyselin. Tak například polymerázová řetězová reakce (PCR) se značenými primery nebo se značenými nukleotidy poskytuje značený produkt amplifikace. V jiném provedení se transkripční amplifikaci s použitím značených nukleotidů (například fluoresceinem značená UTP a/nebo CTP) začleňuje značící činidlo do přepisovaných nukleových kyselin.

Neradioaktivní sondy se často značí nepřímými způsoby. Například molekula ligandu se kovalentně naváže na sondu.

I • · • * • · «

Ligand se pak váže na molekulu anti-ligandu, která je buď detekovatelná inherentně nebo je kovalentně vázaná na detekovatelný signální systém, jako je enzym, fluorofor nebo chemiluminiscenční látka. Enzymy sloužící jako značící činidla jsou primárně hydrolázy, jako jsou fosfatázy, esterázy a glykosidázy, nebo oxireduktázy, zvláště pak peroxidázy. Fluorescenční látky zahrnují fluorescein a jeho deriváty, rodamin jeho deriváty, umbelliferon luciferin a dansyl, zahrnuj i atd. .

Chemiluminiscenční činidla zahrnují luciferin a 2,3dihydroftalazindiony, například luminol. Ligandy a antiligandy mohou široce kolísat. V případě, že ligand má přirozený anti-ligand, jmenovitě ligandy, jako je biotin, thyroxin a kortizol, je možné je použít ve spojení s jejich značenými, přirozeně se vyskytujícími antí-ligandy. V jiném případě se může použít libovolná haptenová nebo antigenní sloučenina v kombinaci s protilátkou.

Sondy je možné také značit konjugací se značícím činidlem. Například klonované sondy DNA byly párovány přímo s křenovou peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou (popisuje se v publikaci Renz. M., and Kurz, K., A Colorimetric Method for DNA Hybridization, Nucl. Acids Res. 12: 3435-3444 (1984)) a syntetické oligonukleotidy byly párovány přímo s alkalickou fosfatázou (popisuje se v publikaci Jablonski,

Preparation of Oligodeoxynucleotide-Alkaline Conjugates and Their Use as Hybridization Probes, Nuc. Acids. Res. 14: 6115-6128 (1986) a Li P., et al., Enzyme-linked

Synthetic Oligonucleotide probes: Non-Radioactive Detection of Enterotoxigenic Escherichia Coli in Faeca Specimens, Nucl. Acids Res. 15: 5275-5287 (1987)).

Způsoby detekce takových značících činidel jsou dobře známy v oboru. Tak například radioaktivní značící činidla se mohou detekovat za použití fotografického filmu nebo

E . , et al. , Phosphatase scintilačních čítačů, fluorescenční značící činidla se mohou detekovat za použití fotodetektoru, který • · · β · · · v pnrozene se v rekombinantních detekuje vyzářené světlo. Enzymatické značící činidla jsou v typickém případě detekovatelné reakcí se svým substrátem za vzniku reakčního produktu, který se detekuje. Kolorimetrická značící činidla se detekují jednoduchou vizualizací barevných značících činidel.

Protilátky proti proteinům

Protilátky vznikají proti proteinům podle vynálezu a zahrnují jednotlivé, alelové, kmenové nebo druhové varianty a jejich fragmenty. Vyskytují se vyskytujících formách (v plné délce) í formách. Navíc protilátky mohou vzniknout proti uvedeným proteinům buď ve své přirozené konfiguraci nebo ve své nepřirozené konfiguraci. Mohou také vznikat anti-idiotypické protilátky. Řada metod přípravy protilátek je dobře známa v oboru. Následující diskuze se prezentuje jako obecný přehled dostupných metod, ale odborníkovi je zřejmé, že je známo řada variant následujících metod.

Za účelem produkce protilátek specificky reaktivních s proteinem podle vynálezu se používá řada imunogenů. Izolovaný rekombinantní, syntetický nebo přirozený protein biosyntézy ligninu obsahující 5 aminokyselin nebo větší a vybraný z proteinu kódovaného polynukleotidem podle vynálezu, jako jsou například sekvence SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75, jsou preferovanými imunogeny (antigen) monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, zřejmé, že proteiny podle vynálezu jsou v typickém případě před tvorbou protilátek vhodných pro testování expresívních knihoven nebo jiných testů, při kterých se putativní protein exprimuje nebo denaturuje na nepřirozenou sekundární, terciální nebo kvarterní strukturu, denaturovány a redukovány. Přirozeně se vyskytující polypeptidy biosyntézy ligninu se mohou použít buď v čisté nebo nečisté formě.

Protein podle vynálezu se pak zavede injekcí do zvířete, které je schopné produkovat protilátky. Pro následné použití pro produkci Odborníkovi je v imunologických testech vhodných pro měření přítomnosti a možné vytvořit Metody produkce množství proteinu podle vynálezu je monoklonální nebo polyklonální protilátky, polyklonálních protilátek jsou odborníkům známy. Stručně řečeno se imunogen (antigen), výhodně čištěný protein spojený s vhodným nosičem (například GST, hemanocyanin kuželnatky atd.), nebo protein začleněný do imunizačního vektoru, jako je rekombinantní virus vakcinie (popisuje se v dokumentu US patent č. 4,722,848) smísí s vehikulem a směsí se imunizují zvířata. Imunitní odezva zvířete na imunogenní přípravek se monitoruje tak, že se odebírají vzorky krve a stanovuje se titr reaktivity s proteinem. Jestliže se získá dostatečně vysoký titr protilátky s imunogenem, odebere se zvířeteti krev a připraví se antisérum. Je-li to žádoucí, provede se další frakcionace antiséra, čímž se obohatí o protilátky reaktivní s proteinem (popisuje se například v publikaci Coligan, Current Protocols in Immunology, Wiley/Greene, NY (1991) a Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)).

Imunizací zvířat se vytvoří protilátky, zahrnující vazebné fragmenty a jejich jednořetězcové rekombinantní verze, proti předem definovaným fragmentům proteinu podle vynálezu, například konjugáty fragmentů s nosičovými proteiny, jak se popisuje shora v textu. Typicky je daným imunogenem protein s délkou alespoň asi 5 aminokyselin, ve více typickém případě jde o protein s délkou 10-ti aminokyselin. Upřednostňuje se protein, který je tvořen 15-ti aminokyselinami a více se upřednostňuje protein s 20 aminokyselinami nebo větší. Peptidy jsou v typickém případě spojeny s nosičovým proteinem (například jako fúzní protein) nebo jsou rekombinantně exprimovány v imunizačním vektoru. Antigenní determinanty na peptidech, se kterými se vážou protilátky, tvoří v typickém případě 3 až 10 aminokyselin.

Monoklonální protilátky se připravují z buněk vylučujících požadované protilátky. U monoklonálních protilátek se testuje jejich schopnost vázat protein, ze kterého se získal imunogen. Specifické monoklonální a polyklonální protilátky budou obvykle vykazovat hodnotu afinitni konstanty vůči svému příbuznému monovalentnímu antigenu alespoň mezi 10⁶ až 10⁷, obvykle alespoň 10⁸, upřednostňuje se alespoň 10⁹, více se

Popis technik pro přípravu uvádí například i th upřednostňuje alespoň 1O¹⁰ a ne jvýhodnější je hodnota alespoň 10ⁿ litr/mol.

V některých příkladech je nutné připravit monoklonální protilátky z různých savčích hostitelů, jako jsou myši, hlodavci, primáti, lidé atd..

takových monoklonálních protilátek se v publikaci Basic and Clinical Immunology, 4^tn ed., Stites et al., Eds., Lange Medical Publications, Los Altos, CA a Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY (1989), Goding, Monoclonal Antibodies

Principles and Practice, 2 ed., Academie Press, New York, NY (1986), Kohler and Milstein, Nátuře 256: 495-497 (1975). Zvířeti se zavede injekcí imunogen obsahující protein podle vynálezu. Zvíře se pak usmrtí a ze sleziny se odeberou buňky, které se fúzují s buňkami myelomu. Výsledkem jsou hybridní buňka nebo hybridom, který je schopný se reprodukovat in vitro. Populace hybridomů se pak testuje , aby se izolovaly jednotlivé klony, kdy každý z nich vylučuje jediný . druh protilátek proti imunogenu. Jednotlivé druhy získaných protilátek jsou produkty imortalizovaných a klonovaných jednotlivých buněk B z imunizovaného zvířeteyytvořené jako odezva na specifiké místo rozeznávané imunogenní látkou.

Jiné vhodné techniky zahrnují selekci knihoven rekombinanntích protilátek ve fágu nebo v podobných vektorech )popisuje se například v publikaci Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989) a Ward, et al., Nátuře 341: 544-546 (1989) a Vaughan et al., Nátuře Biotechnology , 14: 309-314 (1996)).

i • fc ř · · ¹ • · · · »· · *

V jiném případě je možné získat vysokou aviditu lidských monoklonálních protilátek z transgenních myší, které obsahují /f/kvi' ‘F· fragmentý lidského těžkého a lehkého řetězce Ig (to je minilokus transgenní myši) (popisuje se v publikaci Fishwild et al., Nátuře Biotech., 14: 845-851 (1996)). Mohou se také produkovat rekombinantní imunoglobuliny (popisuje se v dokumentu Cabilly, US patent č. 4,816,567 a Queen et al., Proč. Naťl. Acad. Sci. 86: 10029-10033 (1989)).

Protilátky podle vynáelézu se mohou také použít při afinitní chromatografií při izolaci proteinů podle vynálezu. Kolony se připravují například s protilátkami přichycenými na pevný podklad. Jsou to například částice, jako je agaróza, Sephadex nebo podobně. Buněčný lyzát pak prochází kolonou, promývá se a ošetří se zvyšující se koncentarcí slabého denaturačního činidla, přičemž se uvolní čištěný protein.

Protilátky se mohou použít k testování expresívní knihovny, kde se zjišťuje přítomnost určitých expresívních produktů, jako je normální nebo abnormální protein. Obvykle se protilátky při takovém postupu značí částí umožňující jednoduchou detekci přítomnosti antigenu navázíním protilátek.

Protilátky vytvořené proti proteinu podle vynálezu se mohou také použít k vytvoření anti-idiotypických protilátek. Ty se mohou použít při detekci nebo diagnostice různých podmínek, které se vztahují k přítomnosti patologických antigenů.

Proteiny kovalentním a protilátky podle vynálezu se často značí nebo nekovalentním spojením s látkou, která umožňuje detekovatelný signál. Je známa řada značících činidel a technik a popisují se ve vědecké literatuře tak i v patentových dokumentech. Vhodná značící činidla zahrnují radionukleotidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční látky, chemiluminiscenční látky, magnetické částice a podobně.

4 4 · * · 4

Proteinové imunologické testy

Způsoby detekce proteinů podle vynálezu nejsou kritickými aspekty vynálezu. V preferovaném provedení vynálezu se proteiny detekují a/nebo kvantifikují za použití libovolného z uznávaných testů imunologické vazby (popisuje se například v US patentu 4,366,241, 4,376,110, 4,517,288 a 4,837,168). Přehled obecných imunotestů se uvádí také v publikaci Methods in Cell Biology, Vol. 37: Antibodies in Cell Biology, Asai, Ed., Academie Press, Inc. New York (1993), Basic and Clinical Immunology, 7^th Edition, Stites and Terr, Eds. (1991). Imunologické testy podle vynálezu se navíc mohou uskutečnit v libovolné z několika konfigurací, například jak se uvádí v publikaci Enzyme Immunoassay, Maggio, Ed., CRC Press, Boča Raton Florida (1980), Tijan, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier Science Publishers Β. V., Amsterdam (1985), Harlow and Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), Immunoassay: A Practical Guide, Chán Ed., Academie Press, Orlando, FL (1987), Principles and Practice of Immunoassaysm, Price and Newman, Eds., Stockton Press, NY (1991) a NonIsotopic Immunoassays, Ngo, Ed., Plenům Press, NY (1988). Imunologické vazebné testy (nebo imunotesty) v typickém případě využívají „záchytné činidlo, které se specificky váže na analyzovaný vzorek a často jej imobilizuje (v tomto případě je to protein podle vynálezu). Záchytné činidlo je látka, která se specificky váže na analyt. V preferovaném provedení vynálezu je záchytné činidlo protilátka, která se specificky váže na protein(y) podle vynálezu. Protilátka může být produkována kterýmkoli ze způsobů, které jsou známy v oboru.

Imunologické testy často využívají značící činidla ke specifické vazbě a značení vazebného komplexu vytvořeného záchytným činidlem a analytem. Samo značící činidlo může být členem komplexu protilátka/analyt. Značící činidlo může

být značený protein podle vynálezu nebo značená protilátka, která specificky reaguje s proteinem podle vynálezu, případě může být značícím činidlem třetí látka,

V jiném jako je na například další protilátka, která se specificky váže komplex protilátka/protein.

V preferovaném provedení vynálezu je značícím činidlem sekundární protilátka, která nese značení. V jiném případě sekundární protilátka nemusí nést značení, ale může pak být vázána značenou třetí protilátkou, specifickou pro protilátky látky, ze které se získala sekundární protilátka. Sekundární protilátka se může upravit detekovatelnou látkou, jako je biotin, na kterou se třetí značená molekula může specificky vázat, jako je enzymem značený streptavidin.

Jako značící činidlo je také možné využít jiné proteiny, schopné specificky vázat konstantní oblasti imunoglobulinu, jako je protein A nebo protein G. Tyto proteiny se v normálním případě nacházejí v buněčných bakterií. Vykazují silnou s konstantními oblastmi imunoglobulinů z různých (popisuje se v publikaci Kronval, et al., J. Immunol 1401-1406 (1973), a Akerstrom et al., J. Immunol. 135: 2589

2542 (1985)).

stěnách streptokokálních neimunogenní reaktivitu druhů

111:

V testech může být nutné po každé kombinaci činidel provést inkubaci a/nebo promývání. Délka inkubace může kolísat od asi 5 vteřin do několika hodin, přednostně asi 5 minut až asi 24 hodin. Doba inkubace bude však záležet na formátu testu, na analytu, objemu roztoku, koncentraci a podobně. V obvyklém případě testy proběhnou při teplotě prostředí, ačkoli se mohou provést v rozmezí teplot, například od 10 °C do 40 °C.

Zatímco detaily imunologických testů podle vynálezu se liší s určitým použitým formátem, metoda detekce proteinu podle vynálezu v biologickém vzorku obvykle zahrnuje obsahovat kroky zahrnující kontakt biologického vzorku s protilátkami, • · · « · · · * · » • · ·· ······« ·· · ·· · · · » · · · ·····«· · · · ·· ·· které za imunologicky reaktivních podmínek specificky reagují s proteinem podle vynálezu. Protilátky se vážou na protein za imunologicky reaktivních podmínek a přítomnost navázaných protilátek je detekována přímo nebo nepřímo.

A. Nekompetitivní formáty testů

Imunologické testy vhodné pro detekci proteinů podle vynálezu zahrnují kompetitivní a nekompetitivní formát. Nekompetitivní imunologické testy jsou testy, kde se přímo měří množství zachyceného analytu (to je protein podle vynálezu). V jednom preferovaném sendvičovém testu může být například záchytné činidlo (například protilátka, kteráé za imunoreaktivních podmínek specificky reaguje s proteinem podle vynálezu) přímo vázáno na pevný substrát, kde se imobilizují.

Tyto imobilizované protilátky pak zachycují protein, který je přítomný v testovaném vzorku. Tímto způsobem imobilizovaný protein je pak vázán značícím činidlem, například druhou protilátkou nesoucí značení. V jiném případě druhá protilátka nemusí nést značení, ale může pak být vázána značenou třetí protilátkou, která je specifická pro protilátky druhu, ze kterého se získala druhá protilátka. Druhá protilátka může být modifikována detekovatelnou látkou, jako je biotin, se kterou se třetí značená molekula může specificky vázat, jako je enzymem značený streptavidin.

B. Kompetitivní formáty testů

V kompetitivních testech se množství analytu přítomné ve vzorku měří nepřímo měřením množství přidaného (exogenního) analytu (například proteinu podle vynálezu) nahrazeného (nebo vytěsnému) ze záchytného činidla (například protilátky, která za imunoreaktivních podmínek specificky reaguje s proteinem) analytem přítomným ve vzorku. Při jednom kompetetivním testu se ke vzorku přidá známé množství analytu a vzorek se pak přivede do kontaktu se záchytným činidlem, které specificky • · · · váže protein podle vynálezu. Množství proteinu vázaného na záchytné činidlo je nepřímo úměrné koncentraci analytu přítomného ve vzorku.

V určitém preferovaném provedení vynálezu se protilátka imobilizuje na pevném substrátu. Množství proteinu vázaného na protilátku se může stanovit buď měřením mnoství proteinu přítomného v komplexu protein/protilátka nebo v jiném případě měřením množství proteinu, které není v komplexu. Množství proteinu se může detekovat poskytnutím značeného proteinu.

Haptenový inhibiční test je další preferovaný kompetitivní test. V tomto testu se známý analyt (jako je protein podle vynálezu) imobilizuje na pevném substrátu. Známé množství protilátky, která za imunoreaktivních podmínek specificky reaguje s proteinem, se přidá do vzorku a vzorek se přivede do kontaktu s imobilizovaným proteinem. V tomto případě je množství protilátky, které se naváže na protein, nepřímo úměrné množství proteinu přítomnému ve vzorku. Množství imobilizované protilátky se může detekovat detekcí buď imobilizované frakce protilátek nebo frakce protilátky, která zůstává v roztoku. Detekce může být přímá, přičemž se protilátka značí, nebo nepřímá, kdy dochází k následnému přidání značené látky, která se specificky váže na protilátky, jak se popisuje shora v textu.

C. Vytvoření antiséra pro použití v imunologických testech

V imunologických testech se stanovuje protein, který se specificky váže na protilátku vytvořenou proti definovanému imunogenu, jako je imunogen obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1 imunologicky reaguje.

až 18 a 73 až 75, nebo který s ní

V imunologickém testu se používá polyklonální antisérum, které vzniká proti polypeptidů podle vynálezu (to je imunogenní polypeptid). Toto antisérum se vybírá, aby vykazovalo nízkou zkříženou reaktivitu s jinými • · proteiny a každá taková zkřížená reaktivita se eliminuje imunologickou absorbcí dříve než se antisérum použije v imunologickém testu (například imunologickou sorbcí antiséra s proteinem s rodílnou substrátovou specifitou (například odlišným enzymem a/nebo proteinem se stejnou substrátovou specifitou, ale odlišnou formou).

Za účelem produkovat antisérum pro použití v imunologickém testu se izoloval polypeptid (například SEQ ID NO: 1 až 18 a 73 až 75), jak se popisuje v textu. Rekombinantní protein se například může produkovat v savčí nebo jiné eukaryontní buněčné linii. Inbrední kmen myši se imunizoval proteinem za použití standardního adjuvans, jako je Freundovo adjuvans a standardního imunizačního protokolu pro imunizaci myší (popisuje se v publikaci Harlow and Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)). V jiném případě syntetický polypeptid získaný ze zde uvedených sekvencí a spojených s nosičovým proteinem se používá jako imunogen. Sebralo se polyklonální sérum a titrovalo se proti imunogennímil polypeptidů v imunologickém testu, například v imunologickém testu na .pevné fázi, kde je imunogen imobilizovaný na pevném podkladu. Vybraly se polyklonální antiséra s titrem 10⁴ nebo větším a testovala se jejich zkřížená reaktivita proti polypeptidům různých forem nebo substrátové specifity za použití kompetitivního vazebného imunologického testu, jako se popisuje v publikaci Harlow and Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988) na straně 570 až 573. Upřednostňuje se aby se při stanovení použily dvě nebo více odlišných forem. Tyto odlišné typy polypeptidů se používají jako kompetitory pro identifikaci protilátek, které se specifiky vážou na testovaný polypeptid. Kompetttivní polypeptidy mohou vznikat jako rekombinantní proteiny a izolují se za použití metod standardní molekulové biologie a proteinové chemie.

• * • » · c · ·» · soutěžit s se porovnává

Imunologické testy v kompetítivním vazebném formátu se používají při stanovení zkřížené reaktivity. Imunogenní polypeptid se například imobilizuje na pevném podkladu. Proteiny přidané do testu soutěží s antisérem o imobilizovaný antigen. Schopnost shora uvedených proteinů navázáním anriséra na imobilizovaný protein s imunogenním polypeptidem. Procento skřížené reaktivity shora v textu uvedených proteinů se vypočítá za použití standardních výpočtů. Vybrala se ta antiséra, která vykazují zkříženou reaktivitu s odlišnou formou poiypeptidu nižší než 10 %, a spojila se. Protilátky vykazující zkříženou reaktivitu se pak odstraní ze spojeného antiséra imunosorbcí odlišnou formou poiypeptidu.

Imunoabscrbovaná a spojená antiséra se pak použijí v kompetetivním vazebném imunologickém testu, jak se popisuje v textu, aby se porovnal druhý „cílový polypeptid s imunogenním polypeptidem. Za účelem udělat toto srovnání se testovaly dva polypeptidy ve širokém rozmezí koncentrací a za použití standardních technik se stanovilo množství každého poiypeptidu, které je nutné k inhibici 50 % navázání antiséra na imobilizovaný protein. Jestliže množství nutného cílového poiypeptidu je nižší než dvojnásobek množství nutného imunogenního poiypeptidu, pak se může říct, že cílový polypeptid se specificky váže na protilátky vytvořené proti imunogennímu proteinu. Konečné stanovení specifity probíhá tak, že sebrané antisérum je zcela imunologicky sorbováno s imunogenním polypeptidem do té doby, kdy se přestane vázat na polypeptrd užívaný při imunosorbovaného antiséra se testovaného poiypeptidu. Jestliže pak testovaný polypeptid se specificky váže na antisérum vyvolané imunogenním proteinem.

imunosorbcí. pak testuje se nepozoruje

U zcela reaktivita reaktivita,

D. Jiné formáty testů • · · · * ♦ · *

V určitém preferovaném provedení vynálezu se analýza westernovým přenosem (imunoblot) používá při detekci a kvantifikaci přítomnosti proteinu podle vynálezu ve vzorku. Metoda v obecném případě zahrnuje separaci proteinů ve vzorku gelovou elektorforézou na bázi molekulové hmotnosti. Separovaný protein se přenese na vhodný pevný podklad (jako je nitrocelulový filtr, nylonový filtr nebo derivatizovaný nylonový filtr) a vzorek se inkubuje s protilátkami, které se specificky vážou na protein podle vynálezu. Protilátky se specificky vážou na protein na pevném podkladu. Tyto protilátky se mohou přímo značit nebo v jiném případě se mohou následně detekovat za použití značených protilátek (například značené ovčí anti-myší protilátky), které se specificky váží na protilátky.

E. Kvantifikace proteinu

Proteiny podle vynálezu se moHu detekovat a kvantifikovat libovolným počtem způsobů, které jsou dobře známy v oboru. Tyto způsoby zahrnují analytické biochemické metody, takové jako je elektroforéza, kapilární elektroforéza, vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC), chromatografie na tenké vrstvě (TLC), hyperdifúzní chromatografie a podobně a různé imunologické metody, jako jsou kapalinové nebo gelové srážecí reakce, imunodifúzní (jedna nebo zdvojená) imunoelektroforéza, radioimunotesty (RIA), testy ELISA, imunofluorescentní testy a podobně.

F. Omezení nespecifického navázání

Pro odborník aje výhodné, že je často nutné redukovat specifické navázání v imunologických testech a během čištění analytu. V případě, že test zahrnuje antigen, protilátky nebo jiné záchytné činidlo imobilizované na pevném substrátu,, je nutné minimalizovat množství nespecificky vázaného substrátu. Způsoby snižující takové nespecifické navázání jsou dobře známy v oboru. V typickém případě tyto způsoby zahrnují potažení substrátu bílkovinovou kompozicí. Zvláště se využívají bílkovinové kompozice, jako je bovinní sérum albumin (BSA), netučné práškové mléko a želatina.

G. Značení v imunologických testech

Značící činidla mohou být například monoklonální protilátky, polyklonální protilátky, vazebný protein nebo komplex nebo polymer, jako je afinitní matrice, cukr nebo lipid. Detekovatelná značící činidla, která jsou vhodná pro použití podle vynálezu, zahrnují libovolnou kompozici detekovatelnou spektrofotometrickými, radioizotopickými, fotochemickými, biochemickými, imunochemickými, elektrickými, optickými nebo chemickými způsoby. Detekce může probíhat libovolnou známou metodou, jako je imunoblotování, westernová analýza, test posunu mobility na gelu, analýza fluorescenční hybridizaci in šitu (FISH), detekce radioaktivních nebo bioluminiscenčních markérů, jaderná magnetická rezonance, elektronová paramagnetická rezonance, spektroskopie zastaveného toku, chromatografie na koloně, kapilární elektorforéza nebo jiné metody, které sledují molekulu, v závislosti na změně velikosti a/nebo náboje. Značící nebo detekovatelně skupiny nejsou kritickým aspektem vynálezu. Detekovatelnou skupinou může být libovolný materiál, který vykazuje detekovatelně fyzikální nebo chemické vlastnosti. Takové detekovatelně značení se vyvinulo v rámci oboru imunologických testů a v obecném případě lze v metodách podle vynálezu použít libovolné značení. Značení je tak libovolná kompozice detekovatelná spektroskopickým, fotochemickým, biochemickým, imunochemickým, elektrickým, optickým nebo chemickým způsobem. Použitelná značení podle vynálezu zahrnují magmetické částice, f luorescentní barviva, radioaktivní látky, enzymy a kolorimetrická značící činidla nebo zbarvené sklo » · • · • » nebo plastové částice, jak se uvádí shora v textu, kde se popisuje značení nukleových kyselin.

Značky se mohou spojovat přímo nebo nepřímo s požadovaným komponentem testu podle metod, které jsou dobře známy v oboru. Jak je označeno shora v textu, je možné použít široké rozmezí značek. Značení se volí v závislosti na požadované citlivosti, jednoduchosti konjugace látky, požadované stabilitě, dostupnému přístrojovému vybavení a nařízení o zneškodňování.

Neradioaktivní značení se snadno zachycuje nepřímým způsobem. V obecném případě molekula ligandu (například biotin) je kovalentně vázána na molekule. Ligand se pak váže na molekulu anti-ligandu (například streptavidin), který je buď inherentně detekovatelný nebo je kovalentně vázaný na signální systém, jako je detekovatelný enzym, fluorescenční látka nebo chem'luminiscenční látka. Může se použít řada ligandů a anti-ligandů. V případě, že ligand má přirozený anti-ligand₍ například biotin, thyroxin a kortizol, může se použít ve spojení se značenými, přirozeně se vyskytujícími anti-ligandy. V jiném případě se můží libovolná haptenová nebo antigenní sloučenina použít v kombinaci s protilátkou.

Molekuly se mohou také spojovat přímo s látkou, která generuje signál. Což je například konjugace s enzymem nebo fluorcforem. Enzymy vhodné pro značení jsou primárně hydrolázy, zvláště fosfatázy, esterázy a glykozidázy,, nebo oxidoreduktázy, zvláště peroxídázy. Fluorescentní sloučeniny zahrnují fluorescein a j6h<5 deriváty, rodamin a jeho deriváty, dansyl, umbeliferon atd.. Chemiluminiscenční sloučeniny zahrnují luciferin a 2,3-dihydroftalazindiony, například luminol. Přehled různých použitelných systémů produkujucích značení nebo signály se popisují v publikaci US patent č. 4,391,904.

Způsoby detekce značení jsou dobře známy v oboru. Tak například v případě, že značení probíhá radioaktivně, způsoby detekce zahrnují scintilační počítač nebo fotografický film, • · · « · jako při autoradiografii. V případě, že značení probíhá fluorescentní látkou, může se detekovat excitací fluorochromu s vhodnou vlnovou délkou fluorescence, například světla a detekuje mikroskopicky, se výsledná vizuálně, prostřednictvím fotografického filmu, použitím elektronického detektoru, jako je zařízení z vázaným nábojem CCD nebo fotonásobiče a podobně. V podobném případě se může enzymatické značení detekovat tím, že se poskytne vhodný substrát pro enzym a detekuje se výsledný produkt reakce. Nakonec jednoduché kolorimetrické značení se může detekovat jednoduchým pozorováním barvy, která je spojena se značením. Tak v různých proužkových testech se konjugované zlato často jeví růžové, zatímco u různých konjugovaných částic se projevuje barva částic.

Některé formáty testů nevyžadují používání značených komponent. Například aglutinační testy se mohou použít při detekci přítomnosti cílových protilátek. V tomto případě částice potažené antigenem se aglutinují se vzorky, které obsahují cílové protilátky. V tomto formátu žádný z komponentů nemusí být značen a v přítomnost cílových protilátek se detekuje jednoduše vizuálně.

Testy sloučenin, které modulují enzymatickou aktivitu nebo expresi

Vynález dále poskytuje metody identifikace sloučenin, které se vážou (například na substrát) a/nebo zvyšují nebo snižují (to je modulují) enzymatickou aktivitu katalyticky aktivních polypeptidů podle vynálezu. Způsob zahrnuje kontaktování polypeptidů podle vynálezu se sloučeninou, u níž se má stanovit její schopnost vázat nebo modulovat enzymatickou aktivitu. Používaný polypeptid bude vykazovat alespoň 20 %, přednostně alespoň 30 % nebo 40 %, výhodně alespoň 50 % nebo 60 % a zejména alespoň 70 % nebo 80 % specifické aktivity přirozeného polypeptidů biosyntézy » » ligninu v plné délce (například enzymu). Obecně je polypeptid přítomen v rozmezí, které je dostatečné pro stanovení účinku sloučeniny, typicky asi 1 nM až 10 μΜ. Podobně bude tedy sloučenina přítomna v koncentračním rozmezí asi 1 nM až 10 μΜ. Odborníkovi je zřejmé, že takové faktory, jako je koncentrace enzymu, koncentrace ligandů (tj. substrátů, produktů, inhibitorů, aktivátorů), pH, iontová síla a teplota se řídí tak, aby se získala použitelná kinetická data a stanovila se přítomnost nebo nepřítomnost sloučeniny, .která váže nebo moduluje aktivitu polypeptidů. Metody měření enzymatické kinetiky jsou dobře známy v oboru (popisují se například v publikaci Segel, Biochemical Calculations, 2^nd edition, John Wiley and Sons, New York (1976).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Tento příklad popisuje konstrukci knihoven cDNA.

Izolace celkové RNA

Celková RNA se izolovala z kukuřičných tkání činidlem TRIzol (Life Technology lne. Gaithersburg, MD) za použití modifikace postupu guanidinizothiacyanát/kyselý fenol, jak se popisuje v publikaci Chomczynski, P. and Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, 156 (1987)). Stručně řečeno byly vzorky rostlinných tkání rozdrceny v kapalném dusíku, načež bylo přidáni činidlo TRIzol a pak se dále homogenizovalo v misce tloučkem. Přidání chloroformu a následná centrifugace umožnila separaci vodné a organické fáze. Celková RNA se získala srážením izopropylalkoholem z vodné fáze.

Izolace poly(A)+RNA

Výběr póly(A)+RNA z celkové RNA se uskutečnil za použití systému PolyATact (Promega Corporation. Madison, WI). Oligo(dT) primery označené biotinem se použily při hybridizaci • · hybridizaci s 3'póly(A) konci na mRNA. Hybridy se zachycovaly za použití streptavidinu spojeného s paramagnetickými částicemi a proběhla magnetická separace. mRNA se promylo při velmi přísných podmínkách a eluce se provedla deicťzovanou vodou bez RNáz.

Konstrukce knihovny cDNA

Uskytečnila se syntéza cDNA a zkonstruovaly se jednosměrné knihovny cDNA za použití SuperScript Plasmid Systému (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD). První řetězec cDNA se syntetizoval použitím oligo(dT) primerů, který obsahuje restrikční místo Notl. Reakce se katalyzovala reverzní transkriptázou II SuperScript při teplotě 45 °C. Druhý řetězec cDNA se značil alf a-³²P-dCTP a část reakce se analyzovala elekttcforézou na agarózovém gelu, čímž se stanovila velikost cDNA. Molekuly cDNA, které jsou menší než 500 párů baží, a neligované adaptory se odstranily Sephacryl-S400 chromatografií. Vybrané molekuly cDNA se ligovaly do vektoru pSPORTl mezi restrikční místa Not I a Sal I.

Příklad 2:

Tento příklad popisuje sekvenování cDNA a subtrakci knihovny

Příprava sekvenování templátu

Izolovaly se jednotlivé klony a DNA se připravila buď PCR za použití forward primerů M13 a reverzního primerů M13 nebo izolací plazmidu. Všechny klony cDNA se sekvenovaly za použití reverzních primerů M13.

Postup subtrakoe Q-bot

Knihovna cDNA vystavená postupu subtrakoe se nanesla na agarové plotny o rozměru 22 x 22 cm² při hustotě přibližně 3 000 kolonií na jedné plotně. Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C v inkubátoru po dobu 12 až 24 hodin. Kolonie se izolovaly a přenesly se na plotny s 384 prohlubněmi pomocí automatického izolátoru kolonií Q-bot (GENETIX Limited). Tyto plotny se inkubovaly přes noc při teploě 37 °C.

Když se isolovaly kolonie^ nanesly se na nylonovou mebránu o rozměrech 22 x 22 cm² za použití Q-bot. Každá membrána obsahovala 9 216 kolonií nebo 36 864 kolonií. Tyto membrány se umístily na agarové plotny, které obsahují vhodná antibiotika. Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C přes noc.

Druhý den, když se vytvořily kolonie, se filtry umístily na filtrační papír a zvlhčily se denaturačním roztokem po dobu 4 minut. Pak se membrány inkubovaly položené na horní části lázně S vroucí vodou po další 4 minuty. Filtry se pak umístily na filtrační papír navlhčený neutralizačním roztokem, kde se ponechaly po dobu 4 minut. Pak se nadbytečný roztok odstranil tak, že se membrány položily na suchý papír po dobu jedné minuty. Na stranu filtru s koloniemi se nanesl roztok proteinázy K a vše se inkubovalo při teplotě 37 °C po dobu 40 až 50 minut. Filtry se umístily na suchý filtrační papír a nechaly se sušit přes noc. DNA se pak zachytila na nylonovou mebránu UV zářením.

Hybridizace kolonií se provedla způsobem, který se popisuje v publikaci Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd. Ed. (1989), Cold Spring Harbor, New Yo rk. Při hybridizací kolonií se použily následující sondy:

první řetězec cDNA ze stejné tkáně, jako ze které se eliminovaly nejvíce se připravila knihovna, čímž redundantní klony.

až 192 nejvíce redundantních klonů ze stejné knihovny založených na dříve uvedených sekvenačních datech.

192 nejvíce redundantních klonů cDNA z dřívějšího sekvenování v případě kukuřice.

Sal-A20 oligonukleotid: TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA, čímž se odstraní klony, které obsahují konec póly A, ale nikoli cDNA.

• 0

100

5. Klony cDNA získané z rRNA.

Zobrazení autografie se skenovalo do počítače a zkoumala se intenzita signálu a poloha každé kolonie. Provedlo se opětné uspořádání kolonií z ploten se 384 prohlubněmi na plotny s 96 prohlubněmi za použití zařízení Q-bot.

Příklad 3:

Tento příklad popisuje tkáň a ošetření tkáně, která se použila pro konstrukci knihoven cDNA.

Polynukleotid vykazující sekvence DNA, které jsou uvedeny v SEQ ID NO: 19 až 36, se získaly ze sekvenování knihovny klonů cDNA připravených z kukuřice. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 19, se zkonstruovala z premeiotické až jednojaderné vlákniny z linie A632. Knihovna, ze které se SEQ ID NO: 20 získala, se zkonstruovala z kultury výhonků z kukuřičné linie Crusader. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 21, se zkonstruovala z nezralých klasů linie AP9. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 22, se zkonstruovala z tkáňové kultury během indukované apoptózy linie BMS-P2#10. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 23, se zkonstruovala z premeiotické až jednojaderné vlákniny z linie A632. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 24, se zkonstruovala z časně meiotické vlákniny (16 až 18 mm) . Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 25, se zkonstruovala z linie B73 kořenů zamořených škůdcem (corn rootworm). Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 26, se zkonstruovala z linie AP9 nezralých klasů. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 27, se zkonstruovala ze skvamových kolínek klíčících semen kukuřice linie B73. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 28, se zkonstruovala z embryí B73, 13 dní po opylení. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 29, se zkonstruovala ze semenáčů B73, vzpamatovaných z osmihodinového teplotního šoku. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 32, se zkonstruovala ze semenáčů B73, vzpamatovaých z osmihodinového teplotního • ·

101 šoku. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 33, se zkonstruovala ze špiček kořenů (jejich délka je menší než 5 mm) B73. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 34, se zkonstruovala ze zelených listů B73 ošetřených kyselinou jasmonovou. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 35, se zkonstruovala ze zelených listů B73. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 36, se zkonstruovala z nezralého klasu inbrední B73. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 76, se zkonstruovala z tkáně krčku listů klasu po rozptylu pylu z imbrední B73. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 77, se zkonstruovala z krčků listů klasů inbrední B73. Knihovna se podrobila proceduře subtrakce, jak se popisuje v příkladu 2. Knihovna, ze které se získala SEQ ID NO: 78, se zkonstruovala ze sekce o velikosti 7 cm přeslenu z B73, které se dříve infikovaly škůdcem (European corn borer) (první napadení) ve vývojovém stádiu V9 (stadium 9. nodu vegetativního růstu).

Claims (26)

1. 3 NÁROKY nahrnující člen vybraný ze cí alesooň 85% shodu

   102

   PATENTOVÍ

   1. Izolovaná nukleová kyselina, : skupiny, kterou tvoří:

   (a) první polynukleotid vykazují s rovnající se délkou druhého polynukleotidu kódujícího polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1 až 15, 17, 18 a 73 až 75, (b) polynukleotid, který je komplementární s uvedeným prvním polynukleotidem popsaným v odstavci (a) a (c) polynukleotid obsahující alespoň 50 sousedících nukleotidů z prvního polynukleotidu popsaného v odstavci (a) nebo z polynukleotidu popsaného v odstavci (b).
2. 2. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde uvedený polynukleotid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 19 až 33, 35, 36 a 76 až 78.
3. 3. Rekombinantní expresívní kazeta, vyznačující se tím, že zahrnuje nukleovou kyselinu podle nároku 1 operativně spojenou s promotorem.
4. 4. Rekombinantní expresívní kazeta podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená nukleová kyselina je operativně spojena s uvedeným promotorem v antisense orientaci.
5. 5. Hostitelská buňka se zavedenou rekombinantní expresívní kazetou podle nároku 3.
6. 6. Hostitelská buňka podle nároku 5, kde jde o buňku čiroku Sorghum bicolor nebo kukuřice Zea mays.

   » ·

   103
7. 7. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 1, kde polynukleotidem je DNA.
8. 8. Izolovaný protein, zahrnující polypeptid s alespoň 25 sousedícími aminokyselinami, kódovaný izolovanou nukleovou kyselinou podle nároku 2.
9. 9. Protein podle nároku 8, kde uvedený polypeptid má sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1 až 15, 17, 18 a 73 až 75.
10. 10. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnující polynukleotid o délce alespoň 30 nukleotidů, který selektivně hybridizuje za přísných podmínek s nukleovou kyselinou vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 19 až 33, 35, 36 a 76 až 78, nebo jeho komplement.
11. 11. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 10, operativně spojená s promotorem.
12. 12. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnující polynukleotid, kde polynukleotid vykazuje alespoň 85% sekvenční shodu s polynukleotidem rovné délky, vybraným ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 19 až 33, 35, 36 a 76 až 78, nebo jeho komplement.
13. 13. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnující polynukleotid se sekvencí nukleové kyseliny amplifikované z knihovny nukleové kyseliny Zea mays za použití primerů vybraných ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 37 až 72 a 79 až 84, nebo jeho komplementy.
14. 14. Izolovaná nukleová kyselina podle nároku 13, kde uvedenou knihovnou nukleové kyseliny je knihovna cDNA.

    • · « · * · · · · · ·*·· ··· · · » · » · » * » «· * * · · « · · · ·»····* * * · • · ··» · · · · ······· ·· * »···

    104
15. 15. Rekombinantní expresívní kazeta, vyznačující se tím, že zahrnuje nukleovou kyselinu podle nároku 13, operativně spojenou s promotorem.
16. 16. Hostitelská buňka, zahrnující rekombinantní expresívní kazetu podle nároku 15.
17. 17. Protein, produkovaný z hostitelské buňky podle nároku 16 expresí uvedeného proteinu kódovaného uvedenou nukleovou kyselinou.
18. 18. Izolovaná nukleová kyselina, zahrnující polynukleotid kódující první polypeptid, kde:

    (a) uvedený první polypeptid obsahuje alespoň 25 sousedících aminokyselinových zbytků z druhého poiypeptidu vybraného ze skupiny, kterou tvoří SEQ ID NO: 1 až 15, 17, 18 a 73 až 75, a kde uvedený první polypeptid, když vystupuje jako imunogen, vyvolává produkci protilátky, která se specificky váže na uvedený druhý polypeptid, (b) uvedený první polypeptid neváže antisérum vytvořené proti uvedenému druhému poiypeptidu, které bylo plně imunosorbováno uvedeným druhým polypeptidem a (c) uvedený první polypeptid má molekulovou hmotnost v neglykosylované formě v rozmezí 10 % molekulové hmotnosti uvedeného druhého poiypeptidu.
19. 19. Heterologní promotor, operativně spojený s neizolovaným polynukleotidem biosyntézy ligninu kódujícím polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podle nároku 13.
20. 20. Transgenní rostlina, vyznačující se tím, že zahrnuje rekombinantní expresívní kazetu zahrnující rostlinný promotor operativně spojený s izolovanou nukleovou kyselinou podle nároku 1.

    I • φ

    105
21. 21. Transgenní rostlina podle nároku 20, vyznačuj ící se tím, že rostlinou je Zea mays.
22. 22. Transgenní semeno z transgenní rostliny podle nároku 20.
23. 23. Transgenní semeno podle nároku 22, kde semeno je ze Zea mays.
24. 24. Způsob modulace biosyntézy ligninu v rostlině, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    (a) transformaci rostlinné buňky rekombinantní expresívní kazetou, zahrnující promotor operativně spojený s polynukleotidem biosyntézy ligninu vybraným ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 19 až 33, 35, 36 a 76 až 78, (b) kultivaci rostlinné buňky za podmínek růstu rostlin a (c) vyvolání exprese uvedeného polynukleotidu po dobu dostatečnou pro modulaci biosyntézy ligninu v uvedené rostlině.
25. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že rostlinou je kukuřice.
26. 26. Způsob podle nároku 24, vyznačuj ící tím, že se zvyšuje biosyntéza ligninu.