CZ2000733A3 - Buněčný systém pro expresi interferonu beta in vivo a farmaceutický přípravek obsahující tento systém - Google Patents

Description

Předkládaný vynález se týká genové terapie. Konkrétně se vynález týká podávání DNA, která kóduje sekretované proteiny jako jsou např. interferonové proteiny, člověku nebo zvířeti.

Dosavadní stav techniky

Interferony (také označované IFN) jsou proteiny mající řadu biologických aktivit, z nichž některé jsou antivirové, imunomodulační a antiproliferativní. Jsou to relativně malé, druhově specifické jednořetězcové polypeptidy, tvořené v buňkách savců, které tak odpovídají na expozici různým induktorů, jako jsou např. viry, polypeptidy, mitogeny apod. Interferony chrání savčí tkáně a buňky proti napadení viry a jsou důležitou součástí hostitelského obranného mechanismu. Ve většině případů poskytují interferony lepší ochranu těm tkáním a buňkám, ve kterých byly vytvořeny, než ostatním tkáním a buňkám, což ukazuje, že interferony pocházející z člověka budou účinnější při léčení nemocí u člověka než interferony z jiných biologických druhů.

Existuje několik odlišných typů lidských interferonů, které se obecně rozdělují na leukocytové (interferon-alfa [a]), fibroblastové (interferon-beta [β]) a imunitní (interferon-gamma [γ] ) , a celá řada jejich variant. Obecnou diskusi o interferonech lze najít v mnoha odborných publikacích, např. The Interferon Systém (W.E.Stewart, II., *

-· <·-·Springer Verlag, N.Y., 1979) a Interferon ,'Therapy (World Health Organization Technocal Reports Series 676, WHO, Geneva, 1982) .

Interferony jsou potenciálně využitelé k léčení mnoha druhů rakovin, neboť projevují protirakovinovou aktivitu, která . působí na mnoha úrovních. Za prvé, interferonové proteiny mohou přímo inhibovat proliferaci lidských nádorových buněk. . Antiproliferační aktivita působí synergicky s mnoha již uznávanými chemoterapeutickými činidly, jako je cis-platina, 5FU a taxol. Za druhé, imunomodulační aktivita, interferonových proteinů může indukovat protinádorovou imunitní odpověď. Součástí této odpovědi je aktivace NK buněk, stimulace’ aktivity makrofágú a indukce exprese MHC třídy I na povrchu, což vede k indukci ' protinádorové aktivity cvtotoxických T lymfocytů. Kromě toho některé studie ukazují, že IFN-β má antiangiogenní aktivitu. Angiogeneze, t j . vytváření nových krevních cév, je kritická pro růst solidních nádorů. Důkazy ukazují, že IFN-β může inhibovat angiogenezi tím, že inhibuje expresi pro-angiogenních faktorů jako jsou bFGF a VEGF. A nakonec interferonové. proteiny mohou mírnit i invazivnost, nádorů tím, že ovlivňují expresi enzymů jako je kolagenáza a elastáza, které jsou důležité při přetváření tkání.

Interferony projevují také antivirovou aktivitu, která je založena na dvou odlišných mechanismech. Např. interferonové proteiny typu I (a a β) přímo inhibují replikaci lidského viru hepatitídy B (HBV) a C (HCV), a také stimulují imunitní odpověď namířenou'proti buňkám, infikovaným těmito viry.

I přes jejich potenciální terapeutické využití měly interferonové proteiny pouze omezenou ' klinickou úspěšnost proti virové hepatitidě a solidním nádorům. IFN-ct byl schválen pro léčení jak HBV tak , i HCV, ale odpovídavost je v'obou případech tak přibližně 20 %. Zatímco interferonové proteiny

4-.44/4 · · 4 4 · ·· · ·- '4- .€·#',· 4 ' · 4-44.. 4.5·· ' .4.. 4 4 4 4 * . . 4 · 4 4 .. 4 4. 14

9 9' 4 4 4 4 4.-4, ' -4 '

9 9 44' 44 '44 4 4 · 4 ' byly schváleny pro léčení některých typů rakoviny jako jsou lymfomy, leukémie, melanomy a karcinom ledvinných buněk, většina klinických zkoušek, kdy byly interferony použity buďto samotné nebo v kombinaci s konvenčními’ chemoterapeutiky při léčení solidních nádorů, byla neúspěšná.

Způsob podávání- interferonu je důležitým faktorem při klinickém použití tohoto důležitého terapeutického agens. Systémové podávání interferonu, ať již intravenózní, intramuskulární nebo subkutánní injekcí, bylo nejčaštěji užívaným a do jisté míry úspěšným způsobem- při léčení leukémie vlasatých buněk, syndromu získané imunodeficience (AIDS) a souvisejícího Kaposiho sarkomu. Avšak je známo, že proteiny v jejich purifikované formě jsou zvláště náchylné k degradaci. Konkrétně u interferonu-beta primárním mechanismem degradace interferonu v roztoku je agregace a deamidace. Nedostatečná stabilita interferonu v roztoku či v jiných produktech velmi omezuje možnosti využití. Kromě toho po parenterálním podání interferonověho proteinu (tj . intramuskulárně, subkutánně nebo intravenózně) se projevuje velmi rychlá cíearance interferonu. Proto parenterální podání proteinu nezajistí lokalizaci dostatečného ' množství interferonu v aktivním místě (solidní nádor nebo játra v případě hepatitidy). Množství interferonu, které může být podáno parenterálně, je omezené vedlejšími účinky, které jsou pozorovány při vyšších dávkách interferonu. Je tedy zjevně potřeba účinnější terapie.

Podstata vynálezu

Předkládaná přihláška směřuje k řešení toho, jak eliminovat problémy spojené s aplikací sekretovaných proteinů jako je např. interferon, jakožto léčiva. Předkládaný vynález ···· · · * · ···· • ·· ·»♦··· » ·♦·«····»··· ♦ ·*··· · · · · ···· <· ·· ···· ·· ··

Λ se proto týká způsobu interferonové terapie, kdy še místo proteinu samotného aplikuje do organismu gen kódující sekretovaný protein.

Tudíž jeden předmět předkládaného vynálezu se týká způsobu genové terapie, který je založený na použití geneticky upravených buněk 'a jejich využití k přenosu sekretovaného proteinu do příjemce, kterým je savec. Předkládaný vynález poskytuje způsob přípravy buněčného expresního systému, takto vytvořený expresní systém a farmaceutický přípravek obsahující takový expresní systém. Buněčný expresní systém exprimuje gen, který kóduje jeden nebo několik sekretovaných proteinů a je užitečný jako vehikulum pro přenos genového produktu do savčího příjemce ín sítu. Ve výhodném, provedení je příjemcem, který je savec, člověk.

Jiné provedení předkládaného vynálezu popisuje- buněčný expresní systém pro expresi v buňce savčího příjemce in vivo interferonového proteinu pro léčení nemoci. Expresní systém obsahuje buňky téhož biologického druhu jako je savčí příjemce a expresní vektor v nich obsažený pro expresi interferonového proteinu. Výhodně-je savčím příjemcem člověk a expresní vektor obsahuje virový vektor.

V jiném provedení vynálezu expresní systém obsahuje množství buněk téhož biologického druhu jako je savčí příjemce a expresní vektor obsažený v těchto buňkách pro expresi sekretovaného proteinu. Přitom expresní vektor je obsažen pouze v části z mnoha buněk. Výhodně alespoň 0,3 i z celkového počtu buněk obsahuje vektor. Výhodný- sekretovaný protein' je, interferon beta, gamma a konvenční interferon, nejvýhodnější je interferon beta.

V jiném provedení buněčný expresní systém obsahuje množství rakovinných buněk a alespoň část těchto buněk obsahuje adenovirový vektor obsahující izolovaný, polynukleotid » 0 0 · 0 ·» 0 · · 0 0

-··· 0 0 0 0 0 0 « ·· 0 0 0 0 0 0 000000 - 0 0'0' 0 0 0 0 0 0 0

0000 0« 00 0000 00 00 kódující expresi interferonu. V tomto buněčném expresním systému jsou adenovirové vektory vybrány ze skupiny obsahující: a) adenovirový vektor mající deleci a/nebo . mutaci v genu El, b) adenovirový.vektor mající deleci a/nebo mutaci v genu Έ2, přičemž vektor exprimuje lidský interferon beta, c) adenovirový vektor mající deleci a/nebo mutaci jak v genu El tak i v genu E4 a d) adenovirový vektor .mající deletované všechny geny, přičemž vektor exprimuje lidský interferon beta.

Předmětem předkládaného vynálezu je také farmaceutický přípravek pro podání sekretovaného proteinu do určeného místa v příjemci, kterým je savec. Přípravek obsahuje nosič a množství geneticky modifikovaných buněk téhož biologického druhu jako je savčí příjemce, přičemž alespoň část- buněk obsahuje expresní vektor pro expresi účinného množství sekretovaného proteinu. Výhodný sekretovaný protein je interferon. Přípravek zahrnuje přípravek jak pro podávání in vivo tak i pro přenos in vitro.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy farmaceutického přípravku ex vivo pro podání savčímu příjemci při genové terapii. Tento způsob obsahuje kroky, kdy se: a) připraví množství buněk téhož biologického druhu jako je savčí příjemce, b) alespoň do jedné buňky z tohoto množství buněk se vnese expresní vektor pro expresi sekretovaného proteinu, aby se vytvořila alespoň jedna geneticky modifikovaná buňka a c) alespoň jedna geneticky modifikovaná buňka se umístí do farmaceuticky přijatelného nosiče, aby se tak z-ískal . farmaceutický přípravek, který je vhodný pro podávání do místa v savčím příjemci.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je způsob genové terapie, který obsahuje genetickou modifikaci alespoň jedné buňky savčího příjemce prostřednictvím následujících kroků: a) alespoň do jedné buňky se vnese expresní vektor pro expresi ·· • ·· . » • « · 0 · 0 • · 0 0 * * 0 , · '·· 0 0 ·

9' '00 · ;♦-»· . «0 .

sekretovaného	proteinu,	aby	• se vytvořila	alespoň jedna
geneticky modifikovaná	buňka	a b)	umožní	se	geneticky
modifikované	buňce, aby	se	dostala	'do kontaktu	s místem

v savčím příjemci. Způsob může případně dále obsahovat krok, kdy se ze savčího příjemce odstraní alespoň jedna buňka před tím, než se vnese expresní vektor. V dalším provedení krok vnesení vektoru obsahuje vnesení vektoru pouze do části z množství buněk.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je způsob genové terapie ex vivo, který obsahuje kroky, kdy se ze subjektu vyjme množství buněk, podá se rekombinantní adenovirus do alespoň jedné buňky z tohoto množství buněk, takže existuje přebytek buněk neobsahujících adenovirus. Adenovirus má delecí v genu El a obsahuje izolovaný polynukleotid kódující sekretovaný protein. Toto množství buněk je pak vneseno zpět do subjektu.

Kroky ve způsobu genové terapie in vivo obsahují podání adenovirového vektoru, který obsahuje izolovaný polynukleotid kódující protein lidského interferonu-beta (β) , přímo- do buněk subjektu, aniž by předtím byly buňky vyjmuty ze subjektu. Způsoby in vivo a ex vivo umožňují topické, intraokulární, parenterální, intranazální, . intratracheální, intrabronchiální, intramuskulární, subkutánní, intravenózní, intramuskulární a intraperitoneální podání.

Předkládaný vynález poskytuje řadu výhod. Interferonová genová terapie umožňuje aplikovat velmi vysokou lokální koncentraci interferonu s velmi nízkými systémovými hladinami. To vede k dosažení velké účinnosti při minimálních vedlejších účincích. Také interferony podávané genovou terapií budou přítomny ve značně vyrovnané, konstantní hladině, na rozdíl od situace při léčení interferonovým proteinem, kdy se pozorují značné výrony interferonu nebo vrcholy v koncentraci • · ·* ·· proteinů (které mohou vést až k toxicitě) následující po injekci proteinu, po nichž následují velmi nízké hladiny, kdy je koncentrace interferonu pravděpodobně příliš nízká na to, aby byla účinná.

Pohodlí pacienta je také důležitým faktorem. Zatímco při proteinové terapii jsou nutné časté injekce interferonu, jediné podání nebo několik nepříliš častých podání vektoru exprimujícího interferonový gen poskytne dlouhodobou stálou produkci požadovaného proteinu. Genová terapie dovoluje podání interferonú řízeným způsobem do určitého cílového orgánu nebo do nádoru. Může být vytvořen takový autokrinní systém, kdy tytéž buňky exprimují, sekretují i přijímají interferon. Lze tak dosáhnou velmi vysokých dávek interferonu. Takto vysokých dávek není možné dosáhnout parenterálním podáváním proteinu z důvodů toxicity.

Jelikož interferonové proteiny jsou sekretovány z buněk, každá buňka nádoru nebo hepatitidou infikovaných jater nemusí být transdukována genem interferonu. Ty buňky, do kterých se nedostane gen, budou pod vlivem sousedních buněk (tzv. bystander effect)/· které obsahují gen a sekretují interferonový protein. To je velmi významné zjištění a bude mít velmi vážné důsledky pro léčebný režim, neboť, není třeba, aby každá buňka z celkové masy nádoru nebo orgány obsahovala expresní vektor.

Bylo ukázáno, že parenetrální podávání interferonu vede k tvorbě anti-interferonových protilátek. Je možné, že tato odpověď potenciálně neutralizačních protilátek bude zmenšena po vnesení genu pro interferon do určité lokální oblasti. Kromě toho, že bude interferon exprimován lokálně, bude tvořen endogenními lidskými buňkami, proto budou jeho struktura a glykosylace bližší přirozenému stavu, a proto také méně imunogenní než interferon produkovaný v bakteriích, kvasinkách • · 9 9 9 9 9 9 9 9 99 • 999 9·99 9999 • 9 9 9 9 9 ·>9« • 999999 £ 9999

-9 9 9 9 9 9 9 9 «9

9999 99 99 9999 99 99 nebo buňkách ovarií čínského křečka, purifikovaný a podávaný parenterálně injekcí.

Tyto a další výhody předkládaného vynálezu budou zřetelnější na základě detailního popisu výhodných provedení vynálezu a doprovázejících obrázků.

Popis obrázků

Obr. 1. (A) Neinfikované buňky MDA-MB-468 H nebo buňky infikované H5.110ňTFN/? v 0,01 % (Δ) , 0,03 % (□), 0,1 % (V) nebo 0,3 % (O) byly injikovány subkutánně do boku nahých myší a pak byla průměrná velikost nádoru vynesena v závislosti na čase po implantaci nádorových buněk.

(B) Kaplan-Meirův graf ukazující procento přežívajících myší po dobu pozorování 109 dnů. Neinfikované buňky (°) , buňky infikované H5.11 OňTFŇ/? v 0,01 % (Δ) ,

0, 03 % (□) ,0,1% (V) a 0, 3 % (O) .

Obr. 2. (A) Ex vivo genová terapie s interferonem beta v (1) buňkách KM12L4A, (2) buňkách Huh7 a (3) buňkách ME180. Průměrná velikost nádoru byla vynesena jako funkce času po implantaci nádorových buněk. Myším byly implantovány neinfikované buňky () nebo buňky infikované H5. HOňTFN/?

v 1 % (·) nebo 10 % () . V těch skupinách, kde byly některé myši utraceny, je velikost nádoru uvedena jako . průměrná hodnota s poslední uvedenou hodnotou pro utracená zvířata. Přerušení grafu odráží úhyn nebo· utracení všech zvířat ve skupině.

• · 4 4

«. ·

4 «4 «4

4.4 4

4-4 ,4 ·

• 4 «44444

4 4

4 ♦

4 .4

4 · 4 , .4.4..

(Β)Procenta přežívání myší po dobu pozorování 70 dnů. Panely 1, 2 a 3 ukazují data získaná na myších s implantovanými buňkami KM12L4A, Huh7 a ME180, v uvedeném pořadí. Symboly představují myši, kterým byly implantovány neinfikované buňky () nebo buňky infikované H5.110hT.FW/?

Obr. '3. Přímé ošetření in vivo zavedených nádorů MDA-MB-468. Nádory byly injikovány H5.11OhIFNfí v množství 3 x 10' pfu (O), 1 x 10 pfu (□) , 3 x 10⁸ pfu (°) , 1 x 10⁸ pfu (Δ) a 3 x 10' pfu (V), nebo PBS (ⁿ) anebo H5.110iacZ v množství 3 x 10^y pfu (0) , 1 x 10⁹ pfu (.*.), 3 x 10⁸ pfu (x) , 1 x 10⁸ pfu (>) .

Velikost nádorů byla měřena po dobu 14 dnů po injekčním ošetření. · '

Popis výhodných provedení vynálezu

Předkládaný vynález je založen, z části, na vývoji metody genové terapie ex vivo, která užívá buňky, které 1) mohou být snadno získány od pacienta, 2) mohou být modifikovány in vitro vnesením genetického materiálu, 3) mohou být pohodlně, implantovány příjemci, 4) nejsou trombogenní a 5) mohou se implantovat příjemci ve velkém počtu. Genová terapie in vivo podle předkládaného vynálezu užívá buňky, které . 1)· jsou přítomny v příjemci a 2) mohou být in šitu modifikovány, aby exprimovaly izolovaný genetický materiál. Geneticky modifikované buňky obsahují regulační prvky pro řízení množství genetického materiálu“, které je exprimováno.

Geneticky modifikované buňky přežívají a produkují exprimovaný materiál in šitu po' dobu nutnou k tomu, aby.

« * '-· φ exprimovaný materiál projevil prospěšný (tj. léčebný) účinek, aniž- by došlo k nežádoucímu narušení normální funkce tkáně, kde jsou buňky lokalizovány.

Výhodně je' exprimovaným materiálem sekretovaný protein (dále podrobněji definovaný). Nejvýhodněji je sekretovaným proteinem interferon. Skutečně, i když' interferony ' jsou nejvýhodnějším terapeutickým ageňs, byl nalezen obecný terapeutický princip aplikovatelný na genovou terapii s jakýmkoliv sekretovaným proteinem. Bylo zjištěno, že díky tomu, že sekretované proteiny, jako jsou např.. interferony,' jsou uvolňovány z buněk, ve kterých jsou exprimovány, nemusí být každá buňky z celkové'masy nádoru nebo např. hepatitidou infikovaných jater transdukována genem pro sekretovaný protein. Ty -buňky, do kterých se nedostane gen, budou pod vlivem sousedních buněk (tzv. bystander effect), které obsahují gen a sekretují interferonový- protein. Ačkoliv je popsána genová terapie s izolovaným polynukleotidem,. který kóduje expresi interferonů, jakýkoliv sekretovaný protein (jak je definován dále) může být potenciálně využit v metodě nebo přípravku podle vynálezu. Všechny citované publikace v tomto textu jsou do přihlášky zahrnuty formou odkazů.

Definice

Genová terapie je postup, kterým se fenotyp spojený s nemocí opraví tím,- že se vnese genetická informace do organismu trpícího nemocí.

Genová- terapie ex vivo je postup, při kterém se ze subjektu vyjmou buňky a kultivují se in vitro. 'Polynukleotid jako např. funkční gen se vnese do buněk in vitro, modifikované buňky se namnoží v kultuře a pak se implantují zpět subjektu.

φ φ »· ·· · φ φ • * Φ . Φ » · Φ Φ Φ «Φ 1

Φ ΦΦ Φ Φ · · φ · 1

ΦΦ ΦΦΦ · Φ φφ ΦΦ 1 φ φ φ ΦΦφ Φ φ φ 4 φφφφ φφ φφ φφφφ φφ φφ

Genová terapie in vivo je postup, při kterém se cílové buňky nevyjímají ze subjektu, ale přenášený polynukleotid (např. gen kódující expresi interferonu) je vnesen do buněk příjemcova organismu in šitu, tj. uvnitř příjemce. Genová terapie in vivo byla zkoumána na několika zvířecích modelech a současné odborné publikace popisují možnost přímého přenosu in šitu do orgánů a tkání.

. Termín stavy vhodné pro genovou terapii zahrnuje patologické stavy .jako jsou genetické nemoci (tj.’ nemoci, které jsou důsledkem jednoho nebo více defektů genů), získané 'nemoci (tj. patologické stavy, které nejsou důsledkem vrozené vady) , různé typy rakovinných onemocnění, a také příslušné profylaktické procesy (tj. prevenci nemocí nebo nežádoucích stavů).

Získaná nemoc označuje nemoc nebo syndrom, které se projevují nenormálním fyziologickým, biochemickým, buněčným, strukturním nebo molekulárně biologickým stavem.

Polynukleotid je polymer monomerních jednotek nukleové kyseliny, kdy monomerní jednotky jsou buďto ribonukleové kyseliny (RNA) nebo deoxyribonukleové kyseliny (DNA) nebo jejich kombinace. Čtyři baze přítomné v DNA jsou adenin (A), guanin (G) , cytosin (C) a thymin (T) .

G, C a uráčil (U).

Termín izolovaný znamená, polynukleotidových sekvencí genů, které kódují interferon, RNA nebo DNA polynukleotid, část genomového polynukleotidu, cDNA nebo syntetický polynukleotid, který v důsledku svého původu nebo zacházení s ním: I) není spojen se všemi polynukleotidy kterými je spojen v přírodě

Čtyři baze RNA jsou A, pokud se týká se .napr je přítomen v hostitelské buňce jako část esxpresního vektoru), II) je spojen s nukleovou kyselinou nebo jinou chemickou skupinou, které se odlišují od těch, se kterými je spojen v přírodě, ·· 99 • 9 9 9

99

9-9 • · * ··9 9 »

9999 99

nebo III) nevyskytuje se v přírodě. Jako izolovaná se dále označuje polynukleotidová sekvence I) amplifikovaná in vitro např. metodou polymerázové řetězové reakce (PCR), II) syntetizovaná chemicky, III) rekombinantně připravená klonováním nebo IV) purifikovaná, např. štěpením a gelovou separací.

Takže k izolovaným interferonovým polynukleotidúm patří např. nukleové kyseliny .nevyskytující se v přírodě, které sé mohou snadno transkribovat do anti-sense RNA, a také gen kódující interferonový protein, který není exprimován nebo je exprimován v biologicky nevýznamném množství v přirozeně se vyskytujících buňkách. Pro ilustraci, syntetický nebo přírodní gen kódující lidský interferon-beta la by se považoval za izolovaný vzhledem k mozkovým buňkám člověka, neboť tyto buňky přirozeně neexprimují interferon-beta la. Ještě dalším příkladem izolovaného polynukleotidu je použití pouhé části interferonového genu k vytvoření rekombinantního genu, jako je např. kombinace indukovatelného promotoru se sekvencí kódující endogenní interferon prostřednictvím homologní rekombinace.

Gen je sekvence DNA (tj. lineární uspořádání nukleotidů spojených navzájem 3'-5'pentózofosfodiesterovou vazbou), která kóduje prostřednictvím mRNA aminokyselinovou sekvenci specifického proteinu.

Transkripce je proces kterým vzniká z,genu mRNA.

Translace je proces kterým vzniká z mRNA protein.

Exprese je proces, ve které ze sekvence DNA nebo genu vzniká protein, zahrnující jak transkripci tak translaci.

Termín inhibující růst se zde užívá k označení inhibice rustu cílových buněk (např. nádoru) . a inhibice transformovaného fenotypu (měřené např. změnami v morfologii).

Aminokyselina je monomerní jednotka peptidu, polypeptidu nebo proteinu. Existuje dvacet L-isomerů aminokyselin. Patří • 9 • 9 » 4 ··

II 9*99 sem také analogy aminokyselin a D-isomery aminokyselin tvořící' proteiny a jejich analogy.

Protein je polymer složený v podstatě z kterýchkoliv z dvaceti proteinových aminokyselin, bez ohledu na jeho velikost. I když termín polypeptid se často užívá k označení relativně velkých polypeptidů a termín peptid se často užívá k označení relativně malých polypeptidů, použití těchto termínu v oboru se často překrývá a je odlišné. V tomto textu se užívá ‘termín protein k označení peptidů, proteinů i polypeptidů, pokud není uvedeno jinak.

Sekretovaný protein je protein, který je transportován z vnitřku buňky do okolí buňky, k sekretovaným proteinům patří velký počet růstových faktorů a imunomodulačních proteinů jako jsou např. různé interferony (ct, β, γ) , ínterleukiny jako IL-1, -2, -4, -8' a 12 a růstové faktory jako GM-CSF a G-CSF.

Genetická fúze označuje kolineární kovalentní spojení dvou nebo více proteinů prostřednictvím jejich jednotlivých peptidových koster, a to tím, že se exprimuje polynukleotidová molekula kódující tyto proteiny.

Mutace (a také mutanta) označuje jakoukoliv změnu v kvalitě' nebo struktuře genetického materiálu organismu, konkrétně jakákoliv změna (tj. delece, substituce, adice nebo alterace) v genu interferonu divokého typu nebo jakoukoliv změnu v interferonovém proteinu divokého typu.

Divoký typ je přirozeně se vyskytující polynukleotidová nebo aminokyselinová sekvence interferonového genu nebo proteinu, tak jak se vyskytuje in vivo.

Standardní hybridizační podmínky jsou podmínky určené teplotou v podstatě shodné s podmínkami 65 °C jak pro vlastní hybridizaci tak

Termín standardní proto operační koncentrací solí a 0,5xSSC až 5xSSC a promývání.

užívaný je hybridizační podmínky zde definice zahrnující řadu ·· · · • · · · » · 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999999 99 99 hybridi žací. Podmínky s vysokou stringencí (přísností) mohou např. zahrnovat hybridizaci v pufru pro screening plaků (0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll 400, 0,2% bovinní.

sérový albumin, 50mM Tris-HCl, pH 7,5), 1M NaCl, 0,1% hydrogenfosforečnan sodný, 1 % SDS) s 10% dextrasulfátem a 100 4ig/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 65 °C po 12 až 20. hodin a promývání v 75mM NaCl/7,5mM· citrát sodný (0,5xSSC)/l% SDS při 65 °C. Podmínky s nízkou stringencí mohou např. zahrnovat hybridizaci v pufru pro screening plaků s 10% dextransulfátem a 110 ^g/ml denaturované sonikované DNA lososího spermatu při 55 °C po 12 až 20 hodin a promývání ’ v 300mM NaCl/30mM citrát sodný (2xSSC)/l% SDS při 55 °C.

Expresní kontrolní sekvence je sekvence nukleotidů, která řídí a reguluje- expresi genů, když je s geny operativně spojena.

Operativně spojena znamená, že poíynukleotidová sekvence je operativně spojena s expresní kontrolní sekvencí, když expresní kontrolní -sekvence řídí a- reguluje -transkripci a translaci této polynukleotidové sekvence. Termín operativně spojena znamená, že před polynukleotidovou sekvencí, která má být exprimována, je vhodný startovací signál (např. ATG), a že sekvence je ve správném čtecím rámci, který dovoluje expresi polynukleotidové sekvence pod kontrolou expresní kontrolní sekvence, a tudíž produkci požadovaného interferonu kódovaného izolovanou polynukleotidovou sekvencí.

Expresní vektor je polynukleotid, většinou DNA plazmid (ale také to může být virus), který dovoluje expresi alespoň jednoho genu, když je vektor vnesen do hostitelské buňky. Vektor múze ale nemusí být schopen replikace v hostitelské buňce.

Nádor označuje jakoukoliv nežádoucí proliferaci buněk. Nádorový 'růst zahrnuje jak maligní tak i nemaligní nádory, ·· 00 00 00 ·· 00 00 0 0 0000 0000

00 00 0 000« • 0 000 0 0 00 00 ·

0 0 000 0000 0000 00' 0* 0000 00 00 •solidní nebo fluidní nádory,, karcinomy, myelomy, sarkomy, leukémie, lymfomy a další neoplázie a rakovinné a tumorigenní stavy.

Geneticky modifikovaná buňka (také nazývaná buněčný ' expresní systém) obsahuje buňku a expresní vektor pro expresi interferonového proteinu. Pro účely ex vivo jsou geneticky modifikované buňky vhodné pro podávání savčímu hostiteli, kde buďto nahradí nebo existují současně s endogenními buňkami příjemce. Pro účely in vivo se' modifikované buňky vytvářejí přímo v příjemci.

Předkládaný vynález poskytuje také různé způsoby pro přípravu a užití výše popsaných 'geneticky modifikovaných buněk. Konkrétně vynález poskytuje způsob genetické modifikace buněk savčího příjemce ex vivo a podávání geneticky modifikovaných buněk savčímu příjemci. Ve výhodném provedení genové terapie ex vivo jsou buňkami autologní buňky, tj . buňky odebrané ze savčího příjemce. Termín odebrané znamená buňku nebo. množství buněk, které byly odebrány či vyjmuty z místa jejich přirozeného výskytu v těle. Způsoby odebírání buněk pacientovi, také způsoby udržování izolovaných , buněk v kulturách, jsou odborníkovi známy (Stylianou, Έ. , et al

Kidney Intl. Peritoneal

Biochem J,

37: 1563-1570,

Dialysis Intl. 9

1992, Hjelle, J.H. et al 341-347, 1989, Heldin, · P

283: 165-170, 1992, DiPaolo, N. et al.., Int. J.

Art. Org. 12:' 485-501, 1989, DiPaoío, N. et al., Clinical

Nephrol·. 34: 179-1848, 1990, DiPaolo, N. et al., Nephron 57:

323-331, 1991. Všechny dříve i 'dále citovaně patenty, patentové přihlášky a odborné publikace jsou zde zahrnuty formou odkazu.

*· ·4 • 4 4 4 • · · • · 9 4 4 4

44 · · · • · ·

9 ' · «94 • 4 4 « • · . ·«. Λ

4.. 4 .4 . · · . - .4-.4 - 9'

9 '···.16

II. Izolovaní interferonové polynukleotidy

Interferon (zkráceně označovaná IFN) je malý, druhově specifický, jednořetězcový polypeptid, tvořený v buňkách savců jako reakce na expozici různých induktorům jako jsou viry, polypeptidy, mitogeny apod. Výhodně· interferony jsou v rekombinantní formě, přičemž metody přípravy proteinů technikami rekombinantní DNA jsou ' známy, včetně přípravy různých interferonu, a nijak neomezují předkládaný vynález, viz např. patenty U.S. č. 4 399 216, 5 149 636 a 5 179 017 (Axel et al. ) a 4 470 461 (Kaufman) . Rekombinantní formy interferonu alfa, beta, gamma a- konvenčního interferonu byly připraveny. Tyto formy lze exprimovat z buněk, které obsahují polynukleotidové sekvence kódující varianty jako jsou cysteinu zbavené mutanty (např. pro interferon-beta) a methioninu zbavené mutanty. Další modifikace se mohou uskutečnit prostřednictvím potranslačního opracování v hostitelské buňce. Přesná chemická struktura konkrétního interferonu je tedy závislá na několika faktorech a nijak nemezuje předmět předkládaného vynálezu. Všechny takové proteiny obsažené v. přípravcích podle vynálezu si udrží svou biologickou aktivitu, pokud se dostanou do vhodného prostředí.

Výhodné polynukleotidy, které lze užít podle předkládaného vynálezu, byly odvozeny ze sekvencí interferonu divokého typu různých obratlovců, výhodně savců, a byly získány metodami, které jsou odborníkovi známé. Viz např. patent U.S. 5 641 656 (udělený 24.6.1997, DNA kódující ptačí interferonový proprotein typu I a zralý ptačí interferon typu I), patent U..S. '5 605 688 (25. února 1997 - rekombinantní psí a koňské interferony typu I) , patent U.S. 5 554 513 (10. září 1996 DNA sekvence kódující lidský interferon beta2A), patent U.S. 5 541 513 (10. července 1996 - DNA sekvence kódující ·· 99 ·· ·*

9* 4 4 · 9 « • 99 9-9 9 • « 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9

9999 99 99 9999

99 • . 9 9. 9

9 9 ♦ • 9 ·9 9

9 9 9

9 99 lidských LyIFN-alfa-3) , DNA sekvence vyskytujících sekvenci známými lidský fibroblastový polypeptid interferonu beta2A), patent U.S. 5 231 176 (27. července 1993, DNA molekula kódující lidský leukocytární interferon) , patent U.S. 5 071 761 (10.

12. 1991, DNA sekvence kódující subsekvence lymfoblastoidních interferonů LyIFN-alfa-2 a patent U.S. 4 970 161 (13. listpoadu 1990, kódující lidský interferon gamma), patent U.S. 4 738 931 (19.

dubna 1988, DNA sekvence obsahující gen lidského interferonu beta), patent U.S. 4 456 748 (26. červan 1984, DNA sekvence kódující subsekvence různých přirozeně se leukocytových interferonů) .

Mutantní členy rodiny interferonových genů se také mohou užít podle vynálezu. Mutace v polynukleotidové interferonu divokého typu se připravují v oboru metodami cílené mutageneze. Termín mutanta také zahrnuje genetické fúze, takže i dále uvedené sekvence interferonů lze považovat za mutantní sekvence:

Patent U.S. 5 273 889 (28. prosince 1993, DNA konstrukt obsahující gen interferonu gamma spojený se sekvencí kódující imunogenní leukotoxin), patent U.S. 4 959 314 (25. září 1990,

Gen mající DNA sekvenci, která kóduje syntetický mutein nativního proteinu) , patent

29. květen 1990, DNA kódující des-Cys-Tyr-Cys lidský 'imunitní interferon) , patent (3. dubna 1990, DNA molekula kódující modifikovaný interferon-beta obsahující interferon beta) a patent U.S. 4 569 908 (11. února 1986, DNA molekula mající sekvenci, která kóduje vícetřídní hybrid interferonového polypeptidu).

Kromě toho izolované polynukleotidy popsané ve výše uvedených patentech mohou být změněny tak, aby poskytly funkčně ekvivalentní polypeptidy. Polynukleotid je funkčně biologicky aktivního

U.S. 4 929 554 rekombinantní U.S. 4 914 033

9 99

I 9 9»

I · · ► 99 • 9 4 • ·· ► ·9· 99 .9 9 99·· ekvivalentní, ve srovnání s polynukleotidem s výše uvedenými sekvencemi pokud splňuje alespoň jednu z následujících podmínek: ,

a) funkčně ekvivalentní je polynukleotid, který hybridizuje s kteroukoliv předcházející . sekvencí za standardních hybridizačních podmínek a/nebo je degenerovaný vzhledem ke kterékoliv předchozí sekvenci, nejvýhodněji kóduje mutantní interferon mající terapeutickou aktivitu interferonu divokého typu, '

b) funkčně ekvivalentní je polynukleotid, ' který kóduje expresi aminokyselinové sekvence kódované polynukleotidem s kteroukoliv z předchozích interferonových sekvencí.

Lze tedy shrnout, že termín interferon zahrnuje, avšak není omezen pouze na ně, všechna agens uvedená v předchozím funkční ekvivalenty. Termín funkční textu a jejich ekvivalenty se nebo týká interferonového proteinu polynukleotidu kódujícího interferonový protein, které mají stejný nebo lepší prospěšný účinek na savčího příjemce jako původní interferon, k němuž se funkční ekvivalent vztahuje. Odborníkovi je zřejmé, že funkčně ekvivalentní protein může být připraven rekombinantní technikou, tj. expresí funkčně ekvivalentní DNA. Tudíž předmětem předkládaného vynálezu jsou také interferony kódované přirozeně se vyskytující DNA, a také kódované DNA, která se přirozeně nevyskytuje, ale kóduje stejný protein jako je kódován přirozeně se vyskytující DNA. Díky degeneraci nukleotidových kódujících sekvencí se mohou užít jiné polynukleotidy pro kódování interferonů. K nim patří celé nebo části výše uvedených sekvencí, které byly změněny substitucí různých kodonů, které kódují stejný aminokyselinový zbytek v sekvenci, jde tedy o umlčenou záměnu. Takové změněné sekvence se považují za ekvivalenty těchto sekvencí. Tak,např. Phe (F) je kódován dvěma kodony, a sice TTC nebo TTT, Tyr (Y)

4» 0 ·· 00 00 ·· 00 • ·* · · ·· 0 0 0 0,0 0 00 · 0 · 0 0 0 · 0 0 00 0 0 0 00 00 0 • •-• 0 ·> - 0 00 0 »000 00 00 0000 00 00 je kódován TAC nebo TAT a His (H) je kódován GAC nebo CAT. Na druhé straně Trp (W) je kódován jediným kodonem TGG. Tudíž je jasné, že pro danou sekvenci DNA kódující konkrétní interferon existuje mnoho degenerovaných sekvencí, které ho kódují. Tyto degenerované sekvence jsou také zahrnuty ve vynálezu.

Konvenční (consensus) interferon také spadá pod uvedenou definici. Termín konvenční interferon se zde užívá k označení polypeptidu, který se přirozeně nevyskytuje, ale který převážně obsahuje aminokyselinové zbytky společné všem přirozeně se vyskytujícím ' lidským interferonú, přičemž obsahuje v jedné pozic, kde není žádná aminokyselina společná všem subtypům, aminokyselinu, 'která se vyskytuje v této pozici převážně a v žádném případě neobsahuje aminokyselinu, která se v této pozici nevyskytuje alespoň u jednoho přirozeně se vyskytujícího subtypu. Konvenční interferonové sekvence zahrnují konvenční sekvence všech výše uváděných interferonú za předpokladu, že mají sekvence subtypů. Příklady konvenčních interferonových sekvencí jsou uvedeny

U.S. 4 695 623 a 4 897 471 (Amgen) konvenční interferony mohou být sekvencím nebo více subtypů takových v patentech DNA sekvence kódující syntetizovány způsobem popsaným v těchto patentech nebo jiným standardním způsobem.

jsou výhodně produkty transformovaných, nebo se popisuje v této

Konvenční interferonové polypeptidy exprese připravených sekvencí DNA, transfekovaných do hostitele, jak přihlášce. To znamená že výhodné konvenční interferony jsou produkovány rekombinantním způsobem. Takové materiály pak mohou být purifikovány standardními postupy odborníkovi známými.

Výše popsané interferony a stavy vhodné pro genovou terapii jsou ilustrativní a nijak neomezují předmět předkládaného vynálezu. Výběr vhodného interferonu pro léčení • 9

99 • 9 9 9

9. 9 9

9 '9 '

9 9

9999 • 9 • ^9-- · 9

9 9

9 9 • · 9 9 9 ·' ;·

9 9 9

9 97- 9 . 9 9 9

9...,-9-9 · 9 ' 9‘-'9 - · 9-9 .

známé nemoci je v rámci rutinní činnosti Odborníka bez nepřiměřeného exprimentování.

III. ZpUsoby vnášení polynukleotidových sekvencí pro sekretované proteiny do buněk

Termín transformovat nebo transformace s.e týká jakýkoliv genetických modifikací buněk a zahrnuje jak transfekci tak transdukci.

Transfekce buněk označuje získání nového genetického materiálu buňkami' tím, že se do buněk vnese dodatečná DNA. Takže transfekce se týká vložení nukleové kyseliny (např. DNA) do buňky pomocí fyzikální nebo chemické metody. Odborníkům je známo několik technik transfekce, k nimž např. patří: koprecipitace DNA s kalciumfosfátem (viz Methods in Molecular Biology, Vol. 7., Gene Transfer And Expression Protocols, ed.

E.J. Murray, Humana Press, 1991), metoda s DEAE-dextranem (viz výše uvedená citace), elektroporace (viz výše), transfekce zprostředkovaná kationtovými liposomy (viz výše) a ostřelování mikročásticemi wolframu (Johnston, S.A., Nátuře 346: 776-777, 1990) a koprecipitace DNA se stronciumfosfátem (Brash D.E. et al., Molec. Cell. Biol. 7: 3031-2034, 1987). Každá z těchto metod jev oboru dobře známa.

Naproti' tomu transdukce buněk se týká procesu přenosu nukleových kyselin do buňky pomocí RNA nebo DNA virů. Jedna nebo několik izolovaných polynukleotidových sekvencí, které

kóduj i	j eden	nebo	několik	interferonovýčh	proteinů, je
obsažena	ve	viru	a může	být	vloženo	do chromosomu
transdukované	buňky.	Alternativně	buňka je	transdukována
virem,	ale	přitom	nebude	mít	izolovaný	polynukleotid

inkorporovaný ve svých chromosomech, ale bude schopna exprimovat interferon uvnitř buňky extrachromosomálně.

·» ·· » * * I • ·· ···· ·· • ♦ ο ·· ··« polynukleotid jako spojený s jednou

- expresi . rekombinantního rekombinantního interferonu)

Podle jednoho provedení vynálezu jsou buňky transformovány (tj. geneticky modifikovány) ex vivo. Euňky jsou izolovány ze savce (výhodně člověka) a transformovány (tj. transdukovány nebo transfekovány in vitro) vektorem obsahujícím izolovaný je např. rekombinantní gen. operativně nebo několika expresními kontrolními sekvencemi pro expresi rekombinantního sekretovaného proteinu (např. interferonu). Buňky se pak podají savčímu příjemci pro to, aby tvořily protein in sítu. Výhodně je savčím příjemcem člověk a modifikované buňky jsou autologní buňky, tj . buňky izolované ze savčího příjemce. Izolace a kultivace buněk in vitro již byly v odborné literatuře popsány.

Podle jiného provedení vynálezu jsou buňky transformovány nebo jinak geneticky modifikovány in vivo. Buňky ze .savčího příjemce (výhodně člověka) jsou transformovány (tj. transdukovány nebo transfekovány) in vivo vektorem, který obsahuje izolovaný polynukleotid jako je rekombinantní gen operativně spojený s jednou nebo několika expresními kontrolnimo sekvencemi pro sekretovaného proteinu (např. a protein je pak dodáván in šitu.

Izolovaný' polynukleotid kódující sekretovaný protein (např. cDNA kódující jeden nebo několik terapeutických interferonových proteinů) je vnesena do buňky ex vivo nebo in vivo způsobem pro přenos genů, jako je např. transfekce nebo transdukce, čímž' \vznikne geneticky modifikovaná buňka. Různé expresní vektory (tj. nosiče pro usnadnění přenosu izolovaného polynukleotidu do cílové buňky) jsou odborníkovi známy.

Typicky Vnesený genetický materiál obsahuje izolovaný polynukleotid .jako je např. interferonový gen (obvykle ve formě cDNA obsahující exony kódující interferon) společně

9» 99 » 9 9 <

• »·

9 · 99

9 · 9 · 9 •

9 9 ·

9 9 9 9

9999 99 99 9999

9 «9

9 9 9

9 9 9 • · 9 · · · 9 *9 99 s promotorem pro kontrolu transkripce nového genu. Promotor má typicky specifickou nukleotidovou sekvenci nutnou 'pro iniciaci transkripce. Případně může genetický materiál obsahovat intronové sekvence, které se odstraní ze zralého transkriptu sestřihem RNA. Na 3'-konci genu, který má být exprimován, by měl být přítomen polydenylační signál. Vnesený genetický materiál také může obsahovat vhodnou signální sekvenci pro sekreci produktu terapeutického genu (např. interferonů) z buňky do mezibuněčného prostředí.

Izolovaný genetický materiál případně dále obsahuje další sekvence (tj. zesilovače, enhancerv) potřebné k získání požadovaného stupně transkripční aktivity. 'Pro diskuse enharicer neboli ' zesilovač je netranslatovaná sekvence DNA, která spojení s kódující sekvencí (tj. v cis) funguj e v účel této j ednoduše souvislém tak, že mění základní transkripční hladinu určovanou, promotorem.

Výhodně je izolovaný genetický materiál ' vnesen do buněčného genomu bezprostředně po směru (dowristream) od promotoru, takže promotor a kódující sekvence jsou operativně spojeny, což dovoluje transkripci kódující sekvence. Výhodné virové expresní vektory obsahuji exogenní promotorový element pro kontrolu ' transkripce vloženého interferonového genu. K takovým exogenním promotorům patří jak konstitutivní tak i induko.vatelné promotory.

Přirozeně se· vyskytující konstitutivní promotory řídí expresi proteinů, které regulují esenciální buněčné funkce. Výsledkem je, že gen kontrolovaný konstitutivním promotorem je exprimován za jakýchkoliv okolností buněčného růstu.

K příkladům konstitutivních promotorů patří promotory následujících genů, které kódují základní udržovací funkce metabolismu:

hypoxanťinfosforibosyltrasferáza ;hprt;

dihydrofolátreduktáza (DHFR) (Scharfmann, et al'., Proč. Nati.

• 0

00 00 0 0 0 0 0 0 0 0 • · · 0000 00 «0 • 0 0 · • 5· 0 ·« - -: 0 ·

--0 0- - 0000

Acad. Sci. USA 88 4626-4630, 1991), adenosindeamináza, fosfoglycerátkináza (PGK), pyruvátkináza, fosfoglycerolmutáza a dále promotor β-aktinu (Lai et al·., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10006-10010, 1989) a další konstitutivní promotory odborníkům známé.

Kromě toho mnoho virových promotorů funguje v eukaryotických buňkách konstitutivním způsobem. K takovým promotorům patří: časné . a pozdní promotory SV40 (viz Bernoist a Chambon, Nátuře 290: terminálních opakovaných promotory z dlouhých LTR) viru Moloneyho

304, 1981), sekvencí leukemie (MLV) a dalších retrovirů (viz Weiss et al., RNA Tumor Viruses, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring harbor, N.Y., 1985), thimidinkinázový promotor z viru Herpes simplex (HSV)(viz Wagner etal., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1441, 1981), bezprostředně časný promotor cytomegaloviru IE1 (viz Karasuymama et al., J. Exp. Med. 169: 13, 1989), promotor viru Rousova sarkomu, RSV (viz Yamamoto et al, cell. 22: 787,

1980), pozdní promotor adenoviru (Yamada et al., Proč. Nati. Acad. Sci'. USA 82: 3567, 1985 a další. Tudíž kterýkoliv z výše uvedených konstitutivních promotorů může být užit ke kontrole transkripce genového inzertu v předkládaném vynálezu (viz také část B).

Pokud se má uskutečnit přenos inter feronového genu do specifické tkáně, může být žádoucí přímo zaměřit expresi tohoto genu. Např. existují promotory, popsané v odborné literatuře, které umožňují expresi pouze v některých tkáních. K příkladům takových promotorů patří promotory viru hepatitidy B specifické pro' játra (Sandig et al., Gene Therapy 3: 1002-1009, 1996) a albuminového genu (Pinkert etal., Genes and Development 1: 268-276, 1987, Guo et al., Gene Therapy 3: 802-810, 1996) jako příklad dalšího promotoru specifického pro játra. Kromě toho existuje celá řada promotorů, které jsou ·· ·· ·· ·· ·· ·· • · · β · ··.· · · · · • ·· · · φ ♦ · .· * .

• · φ · · · · 'φ φ · · · • · · · · β · · · · φφφφ · 3 Φ· · · ·, · . · · ··' popsány v odborné literatuře, a které umožňují expresi pouze ve specifických nádorech. K příkladům takových promotorů patří promotor PSA (karcinom prostaty), promotor 'karcinoembryonálního antigenu (karcinom tlustého střeva a plic), promotor β-kaseinu (karcinom prsu), promotor tyrosinázy (melanom), promotor.kalcineurinu Aa (gliom, neuroblastom),, promotor c-sis (osteosarkom) a promotor α-fetoproteinu '(hepatom).

Geny, které jsou pod kontrolou indukovatelného promotoru jsou exprimovány, a nebo jsou ve větší míře exprimovány, pouze v přítomnosti indukujícího činidla (např. transkripce pod kontrolou metalothioneninového promotoru se výrazně zvyšuje v přítomnosti některých kovových iontů. Viz také promotor indukovatelný glukokortokoidy vyskytující se v dlouhé koncové repetici (LTR) viru tumoru prsní žlázy myší (MMTV)(Klessig et al., Mol. Cell Biol. 4: 1354, 1934. K indukovatelným promotorům patří responzivní (odpovídající) elementy (RE), které stimulují transkripci, když se naváže jejich indukující faktor. Např. existují RE pro sérové faktory, hormony, kyselinu retinovou a cyklický AMP.

obsahující konkrétní RE lze, vybrat proto, aby se získala indukovatelné 'odpověď a v některýchpřípadech samotný RE může být připojen k jinému promotoru, čímž se získá indukov-atelnost rekombinantního genu.

Takže výběrem vhodného promotoru (konstitutivního nebo indukovatelného, silného nebo slabého) je možné řídit jak existenci tak i hladinu exprese interferonu v geneticky modifikovaných buňkách. Když je gen kódující interferon pod kontrolou indukovatelného promotoru, . podávání interferonu in šitu spustí tím, že se geneticky modifikovaně buňky vystaví podmínkám, které dovolí expresi interferonu, např. tím, že se injikují specifické induktory pro indukovatelné promotory,_ které kontrolují transkripci agens. Tak např. exprese insitu steroidní

Promotory

44 • 4 4 4 44	44 44 44 4 44 44 4 4 4 4 4 4 • «4 44 *444	4 4 4 4 4 4 4 ’ 4 • 4 4 4 4 4 *4
	25
v geneticky modifikovaných	buňkách interferonového	proteinu
kódovaného interferonovým	genem pod	kontrolou	metalo-
thioneninového promotoru	se zvyšuje	kontaktem	geneticky

modifikovaných buněk s roztokem obsahujícím vhodné (tj . indukující) kovové ionty in šitu.

Nedávno byl vyvinut velmi .komplikovaný systém, který umožňuje přesnou regulaci genové exprese exogenně .podávanými malými molekulami. K příkladům patří systém FK505/Rapamycin (Rivera et al., Nátuře Medicine 2(9):' 1028-1032, 1996), tetracyklinový systé,m ( Gossen et al., Science 268:1766-1768, 1995), ekdysonový systém (No et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93: 3346-3351, 1996) a progesteronový systém (Wang et al. ,

Nátuře Biotechnology 15: 239-243, 1997).

Tudíž -množství interferonu, které se dodává in šitu, je regulováno kontrolou několika faktorů jako jsou : 1) povaha promotoru použitého ke kontrole transkripce vloženého genu. (tj . zda jde o promotor indukovatelný nebo konstitutivní, silný nebo slabý nebo tkáňově specifický), 2) počet kopií exogenního genu, které jsou vloženy do buňky, 3) počet transdukovaných/transfekovaných buněk, které jsou podány (např. implantovány) pacientovi, 4) velikost implantátu (např. štěp nebo zapouzdřený expresní systém) při způsobu ex vivo, 5) počet implantátu při způsobu ex vivo, 6) počet transdukovaných/transfekovaných buněk při podání in vivo, 7) doba, po kterou jsou transdukované/transfekované buňky ponechány na místě jak při způsobu ex vivo tak i in vivo a 8) rychlost, s jakou je v geneticky modifikovaných buňkách tvořen interferon.

Selekce a optimalizace těchto faktorů pro podání terapeuticky účinné dávky určitého interferonu patří ke schopnostem průměrného odborníka, a pokud se vezmou v úvahu « ·· φ φ φφ φ φ φφ φ

ΦΦΦ φφ φ Φφφφ φφ φφφ φ φ φ · φφ φ φ φφ φφφ φφφφ φφφφ φφ φφ φφφφ φφ ·<

výše uvedené faktory a klinický stav pacienta, lze je provést bez nepřiměřeného experimentování.

Protože protein exprimováný při způsobu genové terapie podle předkládaného vynálezu je sekretovaný protein, okolní buňky, které neobsahují vektor pro genovou terapii, jsou také ovlivněny (viz příklady). V důsledku toho se při metodě podle předkládaného vynálezu typicky nevyžaduje užití selekčního genu. Avšak kromě alespoň jednoho promotoru a alespoň jednoho izolovaného polynukleotidu kódujícího ' interferon, může expresní vektor případně obsahovat selekční gen, např. gen rezistence k neomycinu, pro usnadnění selekce buněk, · které byly transfekovány nebo transdukovány expresním vektorem. Alternativně se buňky transfekují dvěma nebo více expresními vektory, přičemž alespoň jeden vektor obsahuje gen(-y) kódující interferon(-y) a jiný vektor obsahuje selekční gen. Selekce vhodného promotoru, zesilovače, selekčního genu a/nebo signální sekvence (popsané ještě dále) je v rámci schopností průměrného odborníka, aniž by bylo třeba nepřiměřené experimentování.

IV. Způsoby přípravy specifických vektorů pro genovou terapii

Muže být použita jakákoliv metoda v oboru známá pro vložení polynukleotidové sekvence do vektoru. Viz např.

Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989, a Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons, lne., 1992. Běžné vektory obsahují vhodné, transkripčni/translační kontrolní signály operativně spojené s polynukleotidovou sekvencí pro konkrétní interferon. Promotory/enhancery se také mohou užít ke kontrole exprese interferonů (viz qást III) .

« · »

• ·. <

• · * · • 0

0 0 0

0 0 4

0 0 4

00 I · · 4 »004 I 0 0 I » 0 0 4

0 0 0

K expresním vektorům kompatibilním se savčími hostitelskými buňkami pro použití v genové terapii nádorů patří např. plazmidy, ptačí, myší a lidské retrovirové vektory, adenovirové vektory, vektory z herpetických virů, parvoviry a nereplikativní viry neštovic. Replikačně defektní rekombinantní viry je možné připravit pomocí sbalovacích (pakážovacích) buněčných linií, které produkují pouze replikačně defektní viry. Viz Current Protocols in Molecular Biology, kapitoly 9.10 až 9.14, Asubel et al.(eds.), Greene Publishing Associates, 1989.

Specifické virové vektory pro použití jako přenosové systémy genů jsou nyní již dobře známy a zavedeny. Podrobné informace lze najít např. v publikacích Madzak et al., J. Gen. Virol. 73: 1533-36, 1992 (papovavirus SV4 0) ,· Berner et al. , Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158: 39-61, 1992 (adenovirus),

Moss et al., Curr. Top. Microbiol (virus vakcínie), Muzyczka, Curr..

Immunol.158: 25-38, 1992.

Top. Microbiol. Immunol. (adeno-asociované viry), Margulskee, Curr.

158: 97-123, 1992

Top. Microbiol. simplex, HSV, a virus Epsteina-Barrové, EBV), Miller, Curr. Top. Microbiol.

Immunol.158: 67-93, 1992 (virus Herpes

1992

Immunol. 158: 1-24,

Brandyopadhyay et al., Mol. Cell. Biol. 4 (retrovirus), Miller et al. , Nátuře 357: (retrovirus), Anderson, Scinece 256: (retrovirus).

Výhodné (retrovirus), 749-754, 1984

455-450, 1992

808-813, 1992 vektory jsou DNA vektory, ke kterým patří adenoviry (výhodně vektor jejíchž základem jsou Ad-2. nebo Ad5) , herpetické viry (výhodně vektory založené na viru Herpes simplex) a parvoviry (výhodně defektní nebo neautonomní parvovirové vektory, výhodněji vektory, založené na adenoasociovaných virech, nejvýhodněji vektory založené na AAV-2),

• 9 » *· • ·· ·· ··«·

Ačkoliv použity nevhodné reportérový nebo Obecné adenoviry viz Ali et al., Gene Therapy 1: 367-384, 1994, patent

U.S. 4 797 368 a 5 339 346 a také následující diskuse.

Výběr konkrétního vektorového systému pro přenos, např. interferonové sekvence, závisí na řadě různých faktorů. Jedním, důležitým faktorem je povaha populace' cílových buněk retr.oviry byly velmi ' extenzivně zkoumány a také v mnoha způsobech genové terapie, obecně jsou k infekci buněk, které se nedělí, ale mohou být užitečné v terapii nádorů, protože integrují a exprimuji své geny pouze v replikujících se buňkách. Jsou užitečné při způsobech terapie ex vivo a z tohoto hlediska jsou atraktivní vzhledem k jejich stálé integraci do genomu cílové buňky.

Adenoviry jsou eukaryotické DNA viry, které mohou být modifikovány tak, aby účinně přenášely terapeutický transgen do buněk různých'typů typů 2 a 5 (A.d2 a Ad5) , které způsobí respirační onemocněné u člověka, jsou v současné době zkoumány s cílen využít je při genové terapii Duchenneovy muskulární dystrofie (DMD) a cystické fibrózy (CF) . ' Jak Ad2 tak Ad5 patří do podtřídy adenovirů, které nijak nesouvisí s lidskými malignitami. Adenovirové vektory jsou schopné mimořádně účinného přenosu transgenu do téměř všech typů buněk bez ohledu na jejich mitotick.ý stav. Vysoké titrv {10'r jednotek tvořících plak/ml) rekombinantního viru mohou být snadno připraveny v buňkách- 293 (což je linie lidských embryonálních ledvinných buněk transformovaných adenovirem, ATCC CRL1573) a uchovány ve zmraženém, stavu bez znatelných ztrát. Účinnost tohoto systému přenosu terapeutických transgenů in vivo, které doplňují genetickou nerovnováhu, byla již modelech různých nemocí, viz Atherosclerosis, 36: 261-268,- 1986, prokázána na např. Y.

zvířecích

Watanabe,

K.Tanzawa et al

FEBS

Letters 118 >1-84, 1980, J.L.Golasťen et al., New England J.

• · • ··

Med. 309: 11983: 288-296, 1983, S.Ishibashi et al., J. Clin. Invest. 92: 883-893, 1993 a S. Ishibashi et al. , J. Clin. Invest. 93: 1889-1893, 1994. A skutečně rekombinantní replikačně defektní adenovirus kódující cDNA pro transmembránový regulátor cystické fibrózy (CTFR) byl schválen pro použití v několika klinických zkouškách u pacientů s CF (viz např. J. Wilson, Nátuře 365: 691-692, Oct. 21, 1993). Další skutečností, která podporuje .bezpečnost rekombinantních adenovirů pro genovou terapii, je značně rozsáhlá zkušenost s očkováním lidských populací živými adenovirovými vakcínami.

Lidské adenoviry obsahují genom tvořený lineární ‘dvouřetězcovou DNA velikosti 36 kb, který je rozdělen do 100 mapových jednotek (m.u.), každá o velikosti 360 bp. DNA obsahuje úseky krátké' invertované koncové repetice (ITR) na každém konci genomu, které jsou nezbytné pro replikaci DNA. Genové produkty jsou organizovány do časných (El až E4)' a pozdních (Ll až L5) úseků, v závislosti na expresi před nebo po iniciaci syntézy virové DNA, viz Horwitz, Virology, 2nd ed., B.N. Fileds, ed., Raven Press Ltd. New York, 1990.

Adenovirový genom podstupuje velmi regulový program v průběhu virového životního cyklu, viz Y.Yang et al. , Proč. .Nati. Acad. Sci. USA· 91: 4407-4411, 1994. Viriony jsou internalizovány buňkami, vstupují do endosomu a odtud virus vstupuje do cytoplasmy a začíná ztrácet svůj proteinový obal. Virion DNA pak migruje' do jádra, kde zůstává jako extrachromosomová lineární struktura, aniž by se integroval. do genomu. Bezprostředně časné geny Ela Elb se exprimují v jádře. Tyto produktry časných genů regulují transkripci adenoviru a· jsou nezbytné pro replikaci viru a expresi různých genů hostitele, které připraví buňku na produkci viru, a jsou centrem kaskádové aktivace, pozdních časných genů (např. E2, E3 a E4) následovaných pozdními geny (Ll až L5).

» · · ·

99 φ 9 9 9

99 9 99

9 9 9 1 ·· 9 · 4 ·♦ ··

První generace rekombinantních replikačně defektních adenovirů, které byly vyvinuty pro., genovou terapii, obsahovaly delece celého úseku Ela a části úseku Elb. Tento replikačně defektní virus se pěstoval v buňkách 293, které obsahují funkční úsek El adenovirů, který poskytuje Ei protein v trans, čímž umožňuje replikaci adenovirů s deletovaným El. Výsledný virus muže neurony a neintegruj i jsou zcela do genomu tvořený genomu schopen, infikovat mnoho buněčných typů exprimovat vložený gen (za předpokladu, že nesen- promotor), ale nemůže se replikovat v buňkách, které neobsahují úsek DNA El. Rekombinantní adenoviry máji výhodu,-' že mají široké hostitelské spektrum, mohou infikovat klidové nebo již konečné diferencované buňky jako jsou např zjevně neonkogenní. Adenoviry se hostitele.' Jelikož existují extrachromosomově, riziko inzerční mutageneze je značně sníženo. Rekombinantní adenoviry' tvoří velmi vysoké titry, virové částice jsou středně stálé, hladiny exprese jsou vysoké a může být infikováno široké spektrum buněk.

Adeno-asociované viry (AAV) byly také užity jako vektory v somatické genové terapii. AAV je malý -virus jednořetězcovou (ss) DNA s jednoduchou organizací velikosti 4,7 kb, což ho činí ideálním materiálem pro genové inženýrství. Dva otevřené čtecí rámce kódují sérii polypeptidů rep a cap. Polypeptid rep (rěp78, rep68, rep62 a rep40) se účastní replikace, uvolnění a integrace genomu AAV. Proteiny cap (VP1, VP2 a. VP3) vytvářejí virovou kapsidu. Otevřené čtecí rámce pro rep a cap jsou jak na' 5'-konci tak na 3'-konci lemovány invertovanou koncovou repeticí (ITR) velikosti 145 bp, přičemž prvních 125 baží je schopno tvořit duplexovou strukturu tvaru Y nebo T. Pro vývoj AAV vektorů je důležité, že celé domény rep a cap mohou být vyjmuty a nahrazeny terapeutickým nebo reportérovým transgenem, viz B.J.Carte.r, • · • ·

Handbook of Paroviruses, ed. P. Tijsser, CRC Press, pp. .155168, 1990. Bylo ukázáno, že ITR představují minimální sekvenci nutnou pro replikaci, uvolnění, sbalení a integraci¹ genomu AAV.

Životní cyklus AAV je dvoufázový, složený j ak z latentní tak lytické fáze. Během latentní infekce viriony AAV vstupují do buňky jako enkapsidovaná (opouzdřená) ssDNA a krátce potom se dostávají až do jádra, kde se AAV DNA trvale integruje do hostitelova chromosoniu, aniž by k tomu bylo třeba dělení hostitelské buňky. Pokud není přítomen pomocný (helper) virus, .integrovaný genom AAV zůstává latentní, ale schopný aktivace a uvolnění. Lytická fáze životního cyklu začíná, když buňka nesoucí AAV provirus je vyprovokována druhotnou infekcí herpetickým virem nebo adenovirem, které kódují pomocnou (helper) funkci, kterou AAV potřebuje ke svému vystřižení z hostitelského chromatinu (B.J.Carter, viz výše),. Původní infikující jednořetězcová (ss) DNA je zmnožena na dvouřetězcovou replikační formu (RF) DNA způsobem závislým na rep. Uvolněné genomy AAV jsou sbalovány do předem vytvořené virové kapsidy (proteinového obalu s ikosahedrální symetrií s průměrem přibližně 20 nm) a po buněčné lýzi se uvolňují jako infekční viriony, ve kterých je sbalen genom v podobě buďto +ssDNA nebo -ssDNA.

AAV mají významný potenciál pro genovou terapii. Virové částice jsou velmi stabilní a rekombinantní AAV (rAAV) mají vlastnosti podobné léčivům v tom, že rAAV mohou být purifikovány peletováním nebo z izolací z pásu v gradientu

CsCl. Jsou teplotně stabilní je možné je lyofilizovat v podobě prášku a pak rehydratovat opět na plnou aktivitu. Jejich DNA se trvale integruje do hostitelského chromosomu, takže exprese je dlouhodobá. Mají široký hostitelský rozsah

9 · »9 9 9 ' 9 9« 9 9 9

9*999 · 9

9 9 * 9 9

999 9 99 «9 99 99 a není známo, že by AAV způsobovaly nějakou nemoc, takže rekombinantní vektory jsou netoxické.

Bylo ukázáno, že vysoká exprese genu z AAV v myši přetrvává alespoň 1,5 roku, viz Xiao a Samulski, 1996, Journal of Virology 70, 8089-8108. Jelikož nejsou známy žádné důkazy o virové toxicitě nebo o vyvolání imunitní odpovědi hostitele, tato omezení genové terapie byla tedy překonána.

Kaplitt, Léone, Samulski, Xiao, Pfaff, O'Mallev a During (1994,. Nátuře Genetics 8, 148-153) popsali dlouhodobou (až 4 měsíce) expresi tyrosinhydroxylázy v mozku potkana po přímé intrakraniální injekci AAV vektoru. To je základ pro potenciální terapii Parkinsonovy nemoci u lidí. Exprese byl vysoce účinná a vektor byl bezpečný a stálý.

Fisher et al. (Nátuře Medicine, 1997, 3, 306-312) popsal stálou genovou expresi u myši po injekci AAV do svalu. Opět virus byl zcela bezpečný. Nebyla detekována žádná buněčná nebo humorální imunitní odpověď ani proti viru ani proti cizorodým genovým produktům.

Kessler et · al (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 14082-14087) ukázalo vysokou hladinu exprese erytropoetinového (Epo) genu po intramuskulární injekci AAV u myši. Bylo prokázáno, že protein Epo byl přítomen v krevním oběhu a byl zaznamenán zvýšený počet červených · krvinek, což ukazuje terapeutický potenciál. V jiném práci tatáž skupina užila AAV exprimující gen HSV-tk pro léčení rakoviny a byla popsána vysoká hladina genové exprese v solidních nádorech.

Nedávno bylo ukázáno, že rekombinantní bakulovirus primárně odvozený z bakuloviru Autographa californica (virus mnohačetné jaderné polyhedrosy,

AcMNPV) ie schopen transdukovat savčí buňky in vitro (Hofmann, C., Sandig, V.,

Jennings,

Rudolph, M.

Schlag, P. , Strauss, M, 1995,

Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus

9 9 · · ·

9 9 9 9

99 9 9 9 W

99 99 9999

9999 99 99 9999 99 99 vectors, Proč. Nati. ' Acad. Sci. USA 92: 10099-10103,

Boyce,F.M., Buchner, N.L.R., 1996, Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93. 2348-2352).

Rekombinantní. bakuloviry mají značné potenciální výhody pro genovou terapii. Patří k nim velmi velká inzerční kapacita,. nepřítomnost imunitní odpovědi u člověka, dále to, že u člověka nedochází k replikaci, není toxicita pro savce, u savců nedochází k expresi virových genů vzhledem ke specifičnosti bakulovirových promotorů transkripce a potenciálně neexistuje odpověď cytotoxických lymfocytů namířená proti proteinům těchto virů.

IV. Testy účinnosti/identifikace interferonů

Interferonové polynukleotidy jsou podávány do buňky prostřednictvím expresního vektoru. Obecně se účinnost určitého vektoru pro genovou terapii v konkrétních buněčných podmínkách, a za určitého metabolismu testuje na I) . změny v buněčné' morfologii, II) inhibici buněčné proliferace a III) antivirovové aktivity.

Výběr a optimalizace konkrétního expresního vektoru pro expresi specifického produktu interferonového genu v izolované buňce se uskuteční tak, že se· získá interferonový gen, výhodně s jedním nebo několika kontrolními úseky (např. promotorem), připraví se vektorový konstrukt obsahující vektor, do kterého je vložen interferonový gen, vektorovým konstruktem se transfekuje nebo transdukuje buněčná kultura'in vitro a pak se určí, zda produkt interferonového genu je přítomen v kultivovaných buňkách.

Účinek transfekce polynukleotidy, ' které . kódují interferony, lze testovat in vitro pomocí celé řady'dostupných buněčných linií lidských nádorů. Έ takovým buněčným liniím patří např. linie lidských buněk karcinomu močového měchýře 5637 (ATCC HTB9), lidská buněčná linie karcinomu prsu MDA-MB468 (ATCC HTB132), lidská buněčná linie karcinomu prostaty DU145 (ATCC HTB81), lidská buněčná linie osteosarkomu SAOS2 (ATCC HTB85), linie fibrosarkomové metastazující plicní rakoviny Hs913T (ATCC HTB152), linie, karcinomu děložního čípku HeLa (ATCC . ECL2) . Každá z těchto buněčných linií může být transfekována vhodnými polynukleotidy kódujícími interferony a vliv transfekce na buněčný růst a buněčnou morfologii může být testován způsoby, které jsou v oboru známy, jako je např. test vylučování trypanové modři měřící' životaschopnost buněk nebo počítání buněk ke zjištění množení v průběhu času a inkorporace thymidinu značeného tritiem ke změření replikace

DNA.

Vliv sekretovaného proteinu na okolní buňky, které neobsahují virový vektor s polynukleotidem kódujícím interferon, lze snadno testovat metodami popsanými v .příkladu

3.

Jakmile je jednou vložena do cílové buňky, může být interferonová sekvence identifikována konvenčními metodami, např. hybridizací nukleových kyselin se sondou obsahující sekvence, které jsou homologní/kompelementární s vloženou mutovanou interferonovou sekvencí. Transkripci interferonu je možné měřit pomocí polymerázové řetězové . reakce spřažené s reverzní transkriptázou. Alternativně lze měřit interferonový protein v médiu po kultivaci buněk pomocí standardních intivirových testů nebo pomocí testu ELISA. Při' jiném způsobů je možné identifikovat sekvenci podle přítomnosti/absence funkce markerového genu (jako je např. aktivita thymidinkinázy, rezistence k antibiotikům apod.) vnesené do cílové buňky expresním vektorem. Tak např.· pokud je ·· 00 ·· ·· 4 » 0· ,» »0 0 < 00 0 * «0 0 • 00 ·· 0 0000 0··0«0 0^0 00 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 «000 00 00 00« · 00 ·♦ vložen do vektoru polynukleotid kódující interferon-beta ia, přičemž vektor obsahuje dominantní selekční markerový gen jako je gen pro neomycinfosfotransferázu pod samostatnou kontrolou časného promotoru SV40, sekvenci lze identifikovat podle přítomnosti funkce markerového genu (tj. rezistence na Geneticin). Odborníkovi jsou známy i další vhodné metody pro detekci vhodných vektorů.

V. Užitečnost vynálezu

A. Interferony a infekční nemoci

Interferony se užívají k léčení bakteriálních, virových a houbových infekcí. Virus chřipky a ' virus vesikulární stomatitidy (VSV) jsou zvláště citlivé na inhibici interferony a často se užívají v testech ke změření interferonové aktivity a také ve výzkumu mechanismu antivirové aktivity interferonú. K dalším virům, které jsou lidskými patogeny a jsou citlivé k interferonům, patří virus hepatitidy B (HBV), ' virus hepatitidy C (HCV), virus hepatitidy D, lidský papilomavirus, virus herpes simplex, virus herpes zoster, cytomegalovirus (CMV), rhinovirus a virus encefalomyokarditidy.

K velmi atraktivním, terapeutickým cílům mezi virovými onemocněními patří hepatitida. Virová hepatitida, onemocnění jater způsobované několika viry, je hlavním problémem světového zdravotnictví. Bylo . izolováno a klonováno pět odlišných virů lidské hepatitidy. Jsou to viry hepatitidy A,

B, C, D a E. Zdá se, že některé případy akutní a chronické hepatitidy jsou způsobeny jinými viry hepatitidy, než' jsou dosud popsané, jako- je např. nově objevený virus hepatitidy. G. Viry s.nejhojnějším výskytem jsou viry hepatitidy A, B a C. Kromě toho, že 'způsobují akutní a chronické poškození jater

* · · * 0 0 0 0 0 * » 0 • •0 00 0 t»00

0 000 0 0 0 0 00 0

00 000 00 00

0000 00 00 0000 0· «0 a záněty, infekce HBV a HCV mohou vést k hepatocelulárnímu karcinomu. Bylo ukázáno, že interferony projevují jistou míru účinnosti; in vivo proti HBV a HCV , a také proti viru hepatitidy D a A v buněčné kultuře.

Virová hepatitida by mohla být léčena podáváním genu pro interferon. Výhodným cílem pro přenos takového genu jsou hepatocyty v játrech. Ačkoliv ex vivo terapie (např. vyjmutí jaterních buněk, vložení polynukleotidů exprimujících interferon a zpětná transplantace pacientovi) je možná, přenos genu in vivo je však zvláště výhodný. Provede se chirurgický zákrok, aby se gen injikoval do vrátnice (V. portae) nebo se gen podá infúzí pomocí katetru v jaterní tepně (A. hepatica) . V ideálním případě se užije méně invazivní postup jako např. intravenózní injekce.

Interferonový gen je vložen pod kontrolu promotoru transkripce ve vhodném expresním ve-ktoru. Promotor transkripce může být buněčného nebo virového (např. CMV, SV40, RSv etd.) původu. Pokud je žádoucí exprese specifická pro játra, je výhodný buněčný promotor specifický pro hepatocyty jako je např. albuminový enhancer/promotor, promotor ccl-antitrypsinu nebo enhancer/promotor HBV.' V odborné literatuře je popsána řada promotorů specifických pro jaterní tkáň (viz výše).

Je také možné navrhnout vektor, ve kterém je interferonový gen, který se exprimuje pouze v jaterních buňkách infikovaných virem hepatitidy. Tak např. exprese interferonu může být indukována transkripčním faktorem HBx z HBV, který je přítomen pouze v hepatocytech infikovaných'HBV. Kromě toho se může užít nosičový systém. To může být nevirový systém jako jsou např. kationtové liposomy nebo konjugáty protein:DNA (konjugáty DNA s asialoglykoproteiny se mohou přenášet přednostně do jater prostřednictvím vazby na receptory pro asialoglykoproteiny na hepatocytech). '

• · · 4 • 4

4' • 4 ·

4 4

4444 44

44 • «4 · • >4 «

4 4 4 ·

4 4 4

4 44

Avšak současné nejúčinnější systémy pro přenos genů jsou založeny na virech. Rekombinantní retroviry byly užity k přenosu genů do lidských hepatocytú ex vivo. Zvířecí modely ukazují, ze rekombinantní adenoviry se mohou účinně lokalizovat in vivo v játrech po intravenózním. podání. Přibližně 98 z adenoviru je po intravenózním podání lokalizováno v játrech.

Zdá se, že také rekombinantní adeno-asociované viry (rAAV) mohou- infikovat játra po in vivo podání. Mohou se užít i jiné typy virů jako např. alfa viry, lentiviry nebo další savčí viry. Nedávno bylo ukázáno, že i jiný než savčí virus, a sice bakulovirus specifický pro hmyz, je schopen přenést geny a exprimovát je účinně v hepatocytech (Hofmann et al., 1995, Boyce a Bucher, viz výše).

Jako příklad uveďme, že rekombinantní adenoviry se mohou užít také k přenosu interferonu in vivo. Několik, výzkumných skupin zkonstruovalo replikačně-defektní adenoviry. První generace těchto virů je defektnř díky deleci v úseku El. Tento defekt je komplementován v buněčné linii 293, která exprimuje adenovirový úsek El. Je však výhodné užít adenovirus, který byl poškozen ve větším rozsahu, tedy delecemi v genech El, E2a a/nebo E4. Všechny deletované funkce se mohou exprimovát ve sbalovací buněčné linii. Interferonový gen se vloží do polohy po ' směru (downstre'am) od kteréhokoliv z velkého počtu možných promotorů (např. bezprostředně časný promotor CMV, promotor z LTR. RSV, promotor buněčného aktinu, enhancer/promotor albuminu nebo jiný promotor specifický pro játra). Tato genová kazeta se pak vloží do rekombinantního adenoviru místo jednoho z deletovaných genů, jako např. El, čímž se vytvoří adenovirový přenosový'vektor.

Rekombinantní adenoviry obsahující interferonový' gen se připraví přímou ligací nebo homol,ogní rekombinací, po které

44 44 44 44 94 • »4 4 4 4 · 4 « «4 4

44 4 4 4 4 4 4«

4·4 4 4 44 44 9

49 4 4 4 4444

4494 94 49 «944 4« 44 možné purifikovat chromatografíí nebo sbalovacích buňkách následuje transfekce do sbalovací buněčné linie standardním způsobem. Rekombinantní virový kmen obsahující interferonový gen se pak purifikuje metodou plaků několikrát za sebou a pak se namnoží ve velkém měřítku ve sbalovacích buňkách. Virus je z pásu CsCl gradientu, sloupcovou jiným způsobem a pak titrovat na Metody přípravy adenovirů defektních v genech El a E2a (Engelhardt et al. , Proč. Nati. Acad. Sci.. USA 91: 6196-6200, 1994) a adenovirů defektních v. genech El a E4 (Gao et al., J. Virology 70': 8934-8943, 1996) byly dostatečně podrobně popsány. Metody přípravy adenovirů defektních v El lze najít v publikaci Graham, F.L., L.Prevec, Methods for Construction of Adenovirus vectors”, Mol. Biotech. 3:207-220, 1995.

V pokusech se pak testují různé dávky viru. Velikost dávky je od 10' jednotektvořících plaky (pfu) do 10^ί-. pfu. Pokud je to třeba, virus se podává opkovaně (např. jedenkrát za jeden Humorální imunitní odpověď v důsledku viru může omezit účinnost opakovaného a z sest měsíců) . opakovaného podání podání. V takovém případě je možné podat společně s ·' virem imunosupresivní agens jako např. cyklosporin nebo protilátku namířenou proti ligand CD40.

Účinek interferonové genové terapie proti virové hepatitidě je možné testovat -na zvířecích modelech (viz část C) . Např. v případě viru hepatitidy B je dostupné množství modelu, k nimž patří svišť, kachna, rejsek, potkan a myš. K myším modelům HBV patří myši, které jsou transgenní na HBV a trvale replikují HBV DNA ve svých játrech,' což vede k trvalé produkci HBV do krevního oběhu. Pro HCV je dostupný šimpanzí model. Adenoviry obsahující interferonový gen mohou být podávány přímo do jater nebo mohou být podávány intravenózní injekcí. Účinnost je možné stanovit monitorováním replikace

9* *9

9 9 9

9*9

99 ♦ 9 9 4 • 9*

9 9 * • 9 9 9 »9 <

virové DNA, virových částic v oběhu, jatérních enzymů (ALT), případně patologie jater a· zánětů.

B. Rakovina

Bylo ukázáno, že interferonové proteiny mají za mnohých okolností antionkogenni aktivitu. Přehledné články viz Wadler a Schwarz, Cancer Research 50: ' 3473--3486, 1990, MartinOdeaard, DN&P 4:116-117, 1991, Spiegel, Seminars in Oncology

15(5):41-45, 1988. Léčení interferonem-alfa a interferonembeta jevilo jistou účinnost proti několika typům rakoviny. Genová terapie se může provádět samostatně nebo ve spojení s konvenčním chirurgickým postupem, ozařováním nebo chemoterapií. Následující přehled typů rakovinných onemocnění vhodných pro genovou terapii není úplný a je zřejmé,· že interferonová genová terapie by mohla býc -účinná v řadě dalších nemocí, které nejsou v tomto seznamu.

Maligní gliomy představují 60 až 80% primárních nádorů mozku u dospělých. Lidské gliomové buňky je možné implantovat do 'mozku imunodeficitní myši (tzv. nahé myši), aby se vytvořil model gliomu. Bylo ukázáno, že léčení interferonembeta zlepšilo přežívání u těchto myší. Problémem v některých pokusech s léčením gliomu proteinem interferon-beta byla vysoká toxicita po parenterálním podáním (intravenózním nebo intramuskulárním) interferonu-beta. Lokalizované podání genu' interferonu-beta do mozku, pravděpodobně přímo , v okamžiku zákroku, povede k dlouhodobé produkci aniž by se projevily vedlejší účinky pozorované při systémovém podání proteinu.

Melanom je .výborným cílem pro interferonovou .genovou terapii. Prognóza je v případě metastazujíčího maligního melanomu velmi špatná. Incidence nemoci se dramaticky zvyšuje chirurgického interferonu-beta v mozku,

4

4· • 4 44 «4

44

4 «444 44

4 4 •4 4444 «4 4 · 4 ·

4 4 4

4 4 « « 4 4 a konvenční chemoterapie je neúčinná. Melanom je nádor imunogenního typu, kdy pacientova odpověď závisí na hostitelově 'imunitní reakci. Za těchto okolností mohou být účinné jak anti-proliferativní tak i imunomodulační akivity interferonu-beta. Bylo ukázáno, že protein interřeron-beta má' přímé antiproliferativní účinky na kultivované buňky maligního melanomu.

Hemangiom je proliferace endotelia kapilár do shluku' mastocytů, fibroblastů a makrofágů a vede k poškození tkáně. Ačkoliv jsou samy zpravidla neškodné, hemangiomy mohou poškodit životně důležité orgány s fatálními důsledky. Bylo ukázáno, že interferon-alfa indukuje časnou regresi hemangiomů rezistentních ke steroidům u dětí (Martin-Odegard, viz výše).

Bylo. také ukázáno, že interferonové proteiny jsou účinné při léčení leukémií, lymfomů a myelomů. Účinnost ukázaná u těchto nemocí je v rozporu s obecným zjištěním, že účinnost in vivo je mnohem méně obvyklá, i - když účinnost interferonových proteinů při léčení rakoviny in vitro je dobře charakterizovaná. Avšak interferon-alfa je účinný v klinických pokusech proti leukémii vlasatých buněk, chronické myeloidní leukémii, kutánním lymfomům T buněk, Hodgkinově lymfomu a mnohačetnému lymfomu. Interferon-beta inhibuje růst kultivovaných buněk renálního buněčného karcinomu. IFN-α byl již- schválen pro použití k léčení renálního buněčného karcinomu.

Kolorektální karcinom je hlavní příčinou úmrtí způsobených rakovinou v USA. Existují, silné antiproliferativní účinky proteinů IFN-a, IFN-β a IFN-γ na kultivované buňky lidského karcinomu tlustého střeva. Karcinom tlustého střeva tvoří časté metastázy v játerch s velmi špatnými následky. Adenoviry nebo jiné přenosové systémy specifické pro játra se mohou užít k přenosu interferonového genu do jater pro léčení těchto • Φ φφ » φ φ « • φφ φφ φφ

I φ · 4 » · · «

ΦΦΦΦ ΦΦ

ΦΦ ΦΦΦΦ podání genu pro přenosem pomocí metastáz. Hepatocelulární karcinom je také atraktivním cílem vzhledem k vysoké účinnosti přenosu' do jater při užití adenoviru. Bylo pozorováno, že protein IFN-β významně inhiboval proliferaci lidských hepatomových buněk v kultuře.

Interferonové proteiny projevily v některých klinických zkouškách účinnost také v léčení , neoperovatelného nemalobuněčného plicního karcinomu, ale v jiných zkouškách zůstaly bez účinku. Bylo zjištěno, že dvě lidské linie plicní rakoviny jsou citlivé k inhibici růstu interferonem-beta (interferon-beta byl účinnější než alfa). V jedné klinické zkoušce byla pozorována významná toxicita související s interferonem po intravenózním podání interferonu. Lokální interferon-beta do plic (pravděpodobně rekombinantního adenovirového vektoru v aerosolu) bude účinné aniž by se projevily vedlejší účinky pozorované po systémovém podání proteinu. - Byla pozorována in vitro inhibice proliferace buněk malobuněčného plicního karcinomu účinkem interferonu-beta.

Interferon-alfa inhibuje růst xenoštěpů karcinomu prsu u nahých myší. Interferon-alfa může být účinný proti rakovině prsu nejen pro svůj antiproliferativní účinek, ale také díky indukci estrogenových receptorů a progesteronových receptorů in vivo, což činí karcinomy prsu citlivé k antiestrogenu tamoxifenu. Zde jsou uvedena data z pokusů, kdy byla užita genová terapie IFN-β na myším modelu lidského karcinomu prsu (viz příklady 3 a 4) .

Rakovina vaječníků je také' možnou cílovou nemocí. Interferon-beta se zdá být méně účinný než interferon-alfa v inhibici proliferace kultivovaných buněk rakoviny vaječníků. Terapie se v tomto případě může provádět vložením vektoru pro genovou terapii do peritonea, jelikož tento typ nádorů má tendenci vyplňovat peritoneální dutinu.

99 99 · · 9 · 9 9

9 9 * 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9999 99 99 • · ·9

9 9 9 · • 99 9 • 9 * 9 9

9 9 9

9999 99

Lze shrnout, že interferonové proteiny prokázaly antionkogenní vlastnosti v řadě podmínek, i když,klinické výsledky s užitím interferonového proteinu nejsou jednoznačně pozitivní. Proteiny IFN-α a- IFN-β byly testovány ve spojení s konvenčními chemoterapeutiky a projevily synergický účinek s těmito léky v mnoha indikacích včetně buněk -rakoviny děložního čípku, hrtanu, leukémií, karcinomů- ledvin, adenokarcinomu tlustého střeva a myelomu. Věří se také, že interferony mají antiangiogenní aktivitu. Existuje inverzní korelace mezi lokální hladinou IFN-β a- angiogenní schopností. Některá data ukazují, -že trvalá' hladina proteinu IFN-β je nezbytná pro inhibici angiogeneze. V takovém případě by interferonová genová terapie byla výhodnější než proteinová terapie, při které hladiny interferonového proteinu velmi rychle padají na příliš nízkou nebo nedetekovatelnou hladinu.

C. Zvířecí modely

Odborníkům je známo, že existuje mnoho zvířecích modelů, které jsou dostupné k testování ex vivo a in vivo genové terapie. Nejužívanějším modelem, patřícím k hlodavcům, je model xenoštěpů lidských nádorů u nahých (nu/nu) myší. Lidské rakovinné b-uňky se - namnoží v kultuře a transfekují se nebo se infikují genem, který kóduje interferon, a je operativně spojen s vhodnou expresní kontrolní, sekvencí. Tyto buňky se pak injikují do nahých myší. Typicky se nádorové buňky injikují subkutánně do hřbetu myši, což vede k vytvoření hmoty solidního nádoru (viz příklad 1) . Alternativně se nádorové buňky injikují ortotopicky do orgánu, ve kterém by se přirozeně vyskytovaly (buňky plicní rakoviny by se injikovaly do plic, rakoviny tlustého střeva do tlustého střeva atd.).

0« · 0 0

00 0 0 0 0 0 0

0 0 0

0000 00 *0

0

0 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0

00 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

0 00

Růst nádorů je možné sledovat měřením průměru nádorové hmoty v závislosti na čase (viz příklad 2).

Okada et al. (1996, Gene Therapy 3, 957-964) vytvořily experimentální gliomy . u myší přímou intrakraniální stereotaktickou injekcí lidských gliomových buněk do mozku. Po té, co se vytvořily detekovatelné nádory, byl přímo do stejného místa injikován AAV vektor exprimující gen thymidinkinázy (HSV tk) z viru herpes simplex. Enzym HSV tk přeměňuje netoxický nukleosidový analog gancyklovir (GCV) na toxický metabolit. Po genové terapii byl intraperitoneálně podán GCV. Myši, které dostaly AAV-tk a GCV, ale nikoliv kontrolní AAV nebo AAV-TK bez - GCV, projevily dramatické zmenšení velikosti nádoru. Tato terapie byla bezpečná a účinná.

Rekombinantní adenoviry (AdV) byly také použity při léčení solidních nádorů na zvířecích modelech a v časných- klinických zkouškách na lidech. Mnohé z těchto studií užívaly podobné modely jako je lidský xenoštěp/nahá myš. Některé příklady těchto modelových experimentů jsou uvedeny dále.

Clayman et al. (1995, Cancer Research 55, 1-6) připravili model· lidského kožního karcinomu dlaždicového epitelu v oblasti hlavy a krku na nahých myších. Zjistili, že adenovirus exprimující divoký typ p53 zabránil tvorbě těchto nádorů.

Hirschowitz et al (1995, Human Gene Therapy) vnesli buňky lidského karcinomu tlustého střeva do nahých myší. Po té, co se vytvořily nádory, injikovali přímo do nádoru adenovirus exprimující gen cytosindeaminázy (CD) z E. coli a pak podali systémově 5-fluorocytosin (5FC) ' (CD a 5FC je kombinace enzym/prekurzor léku podobná kombinaci tk s GCV). Pozorovali 4 až 5 x menší velikost nádorů.

• 9 · 9 . · · 9 9 * * · · • · 9 9 9 99 9 9 99 9

99 99 9 9999

999 9 9 · 9 99 9

99 999 9999

9999 99 9.9 9999 99 99

Zhang et al. (1996, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 45134518) vytvořili lidský nádor prsu u nahých myší. Tyto nádory byly injikovány přímo adenovirem, který exprimoval interferonalfa. Pozorovali regresi nádorů u 100 % zvířat.

Ko et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 1683-1691) připravili lidské nádory prostaty u nahých myší a zjistili, že přímá intratumorová injekce adenoviru exprimujícího p53 divokého typu -inhibovala růst nádorů. Všechny léčené myši zůstaly bez nádorů ještě alespoň po dobu 12 týdnů po ukončení léčení.

Bishoff et al. (1996, Science 274, 373-376) vytvořili lidský karcinom děložního čípku a glioblastomové nádory u nahých myší. Léčily tyto myši adenovirem, který měl deleci v genu E1B. V nepřítomnosti E1B adenovirus selektivně usmrcoval nádorové buňky deficitní v p53. Pokud byl injikován přímo do nádoru, tento adenovirus způsobil regresi nádoru u 60 % zvířat.

Ohwada et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 1567-1576) injikovali buňky lidského karcinomu tlustého střeva do jater nahých myší, aby napodobili jaterní metastázy střevního karcinomu. Pak do jater v blízkosti nádoru injikovali adenovirus exprimující CD. Systémové podání 5FC potlačilo růst nádorů u těchto zvířat.

Modely rakoviny je možné vytvořit také u imunokompetentních myší a potkanů. Nádory mohou být založeny z nádorových buněk syngenních zvířat. V těchto případech endogenní nádory mohou vznikat podáváním karcinogenu zvířeti nebo mohou vznikat spontánně V důsledku genetického základu určitých myší (např. deficitních v p53). Následuje několik příkladu. ,

Elsahami et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 141-148) léčili endogenní mesotheliom u imunokmpetentních potkanů

·· ·· 9 9 9 9 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9'

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9999 99 99 pomocí adenovirů exprimujícího gen tk. Virus byl inj ikován . dooblasti pleury a GCV byl podán ' systémově. Bylo ukázáno dramatické snížení hmotnosti nádorů a zvýšení doby přežívání.

Eastham et al. (1996, Human Gene Therapy 7, 515-523) implantovali buňky nádoru prostaty syngenní myši subkutánně do imunokompetentní myši. Pak. injikovali adenovirus-tk přímo do nádoru a podávali GCV systémově. Autoři popsali zmenšení velikosti nádorů a prodloužení života.

Bramson et al. ,(1996, Human Gene Therapy 7, 1995-2002) injikovali adenovirus exprimující cytokin IL-12 přímo do endogenního nádoru prsu u myší. Zjistili, že u 75 % myší se projevila regrese nádoru a 33 % myší zůstalo- bez nádoru i po dlouhé době.

Riley et al. (1996, Nátuře Medicine 2, 1336-1341) injikovali adenovirus exprimující gen retinoblastomu do melanotrofních nádorů štítné žlázy, které vznikly spontánně u Rb+/- myší. U léčených zvířat zjistili snížení' proliferace nádorových buněk, zpomalení růstu nádoru a prodloužení délky života.

Retrovirové vektory byly prvními vektory, které byly užity v klinických testech genové terapie u lidí. Publikací relevantní k předkládané patentové přihlášce je práce Roth et al. (1996, Nátuře Medicine 2, 985-991). Autoři vytvořili rekombinantní retrovirus, který exprimoval gen p53 divokého typu. Tento .virus byl ..podán devíti pacientům trpícím nemalobuněčným karcinomem plic pomocí přímé intratumorové injekce užitím jehly vložené do bronchoskopu. Z těchto devíti pacientů se u tří projevila regrese nádoru a u tří' dalších pacientu došlo ke stabilizaci nádorového rustu.

···· ·· • · a*

9· ·· ' · ar· • ♦ · · • · a · · • a a · • · *·

D. Další provedení vynálezu

Geneticky modifikované , buňky se podávají např. intraperitoneální injekcí nebo implantováním- buněk nebo štěpu nebo také pouzdra/tobolky obsahující kompatibilního místa v těle příjemce buňky do buněčně Termín buněčně dutinu nebo tělní kompatibilní místo tekutinu- příjemce, modifikované buňky, expresní . systém, znamená strukturu, do které se implantují geneticky buněčný štěp nebo zapouzdřený buněčný aniž by došlo k vyvolání nepříznivých fyziologických následků.· K příkladům buněčně kompatibilních míst patří např. peritoneální, pleurální nebo perikardiální dutina, a také solidní nádor, ze kterého pocházejí buňky nebo orgán, ze kterého byl odstraněn nádor.

Geneticky modifikované buňky se implantují do buněčně kompatibilního místa, samotné nebo v kombinaci s jinými geneticky modifikovanými buňkami. Takže předkládaný vynález zahrnuje i způsob modifikace systému příjemce užitím směsi geneticky modifikovaných buněk, kdy první modifikovaná buňka exprimuje .první interferon a druhá modifikovaná buňka exprimuje druhý interferon nebo 'jiný sekretovaný protein. Další typy geneticky modifikovaných buněk (např. hepatocyty, buňky hladkého -svalstva, fibroblasty, gliové buňky, endotelové buňky, keratinocyty) se mohou přidat, společně s geneticky změněnými buňkami, aby se dosáhlo exprese komplexní sady vnesených genů. Navíc do každé geneticky modifikované buňky může být vnesen víc než jeden rekombinantní gen, a sice pomocí téhož vektoru nebo různých vektorů, což umožňuje expresi několika interferonu v jediné buňce.

Předkládaný vynález se týká také buněčných štěpů. Štěp obsahuje množství výše popsaných genově modifikovaných buněk navázaných na nosič, který je vhodný pro implantaci do

44 ·« 44 44 ·· · · · · 44 4 4 4 4 4

44 44 4 4 4 4 4

444 4 4 44 44 4

44 444 4444 •444 44 44 4444 44 44 příjemce, kterým je savec. Nosič může být buď z přírodního nebo syntetického materiálu. V jiném provedení vynálezu štěp obsahuje kousek peritonea. V takovém případě je nosičem přirozeně se vyskytující matrix, která udržuje pohromadě množství geneticky modifikovaných buněk. Alternativně obsahuje štěp množství výše uvedených geneticky modifikovaných buněk navázaných na náhražku zmíněné přírodní matrix, např. Gelfoam (Upjohn, Kalamazoo, Mích.), Dacron nebo Cortex®.

Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje opouzdřený buněčný expresní systém. Opouzdřený systém obsahuje tobolky vhodné pro implantaci do savčího příjemce a množství výše popsaných geneticky modifikovaných buněk mesothelia obsažených uvnitř. Tobolka může být buď z přírodního nebo syntetického materiálu. Formulace takových tobolek je odborníkovi známa. Proti buňkám, které jsou přímo implantovány savčímu příjemci (např. implantovaným tak, že geneticky modifikované buňky jsou v přímém fyzickém kontaktu s buněčně kompatibilním místem) opouzdřené buňky zůstávají po implantaci izolované (tj. nejsou v přímém kontaktu s místem). Opouzdřený systém není omezen jen na tobolky obsahující geneticky modifikované buňky, .které nebyly imortalizovány, ale může obsahovat i geneticky modifikované imortalizované buňky.

VI. Formulace

Ve výhodném provedení přípravek geneticky modifikovaných buněk obsahuje množství buněk dostatečné k tomu, aby se přenesla terapeuticky účinná dávka interferonu do příjemce in šitu. Stanovení terapeuticky účinné dávky pro specifický interferon a známý stav je- v kompetenci běžného odborníka, aniž by bylo nutné nepřiměřené experimentování. Takže při stanovení účinné dávky by. odborník zvážil stav pacienta, ·· ·« 6· ·· ·· ·· · · 9 9 9 9 9 ·«·· • ·· 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 9999 99 99 závažnost onemocnění, a . také výsledky klinických testů konkrétního interferon, který je podáván.

Pokud již gen nebo geneticky modifikované buňky nejsou přítomny ve farmaceuticky přijatelném nosiči, jsou do takového nosiče umístěny před podáním příjemci. K farmaceuticky přijatelným nosičům patří např. isotonický solný roztok nebo jiné pufry v závislosti na vhodnosti pro' daného pacienta a zvolené terapii.

Termín farmaceuticky přijatelný nosič znamená jednu nebo několik přísad, přírodních či syntetických, se kterými se izolovaný polynukleotid sdružuje, aby se usnadnilo jeho podávání. K vhodným nosičům patří sterilní solný roztok, ačkoliv i jiné vodné či nevodné isotonické sterilní roztoky a sterilní suspenze, které jsou farmaceuticky přijatelné, jsou odborníkovi známé. V tomto ohledu termín nosič zahrnuje také jakýkoliv plazmidový a virový expresní vektor. Termín účinné množství” se týká množství, které je schopné zlepšit stav nebo zpomalit postup nemoci, degenerativního stavu nebo poškození.' Účinné množství lze stanovit na individuální bázi a vychází z části ze zvážení symptomů, které ' se léčí, a výsledku, kterého se má dosáhnout. Účinné množství může být stanoveno běžným odborníkem při zvážení takových faktorů aniž by bylo třeba více než rutinní testy.

Ve výhodném způsobu podle vynálezu se účinné množství interferonové polynukleotidové sekvence obsažené v doprovodném vektoru (např. nosiči) podá přímo do cílové buňky nebo nádorové tkáně pomocí přímé injekce s jehlou nebo pomocí katetru nebo jinou podávači trubičkou vloženou do rakovinné tkáně, nádoru nebo krevní cévy zásobující nádor. Dávkování je primárně závislé na faktorech jako je nemoc, která se má léčit, vybraný interferon, věk, hmotnost a zdravotní stav subjektu, a je tedy rozdílné pro různé subjekty. Když se užívá

• · « · ·· ···· virový vektor pro genovou terapii, má se za to, že účinné množství pro člověka je od 0,1 do 10 mil fyziologického roztoku obsahujícího 1 x 10⁷ až 1 x 10¹² jednotek tvořících plak (pfu)/ml virových expresních vektorů obsahujících interferon.

Jak bylo již diskutováno výše, interferonový gen může být podáván přímou injekcí do solidního nádoru. Alternativně se podání do nádoru může uskutečnit prostřednictvím infúze do krevní cévy, která zásobuje nádor. Je také možné parenterální podání vektoru. Polynukleotidy kódující interferon mohou být podávány topicky, intraokulárně, parenterálně., intranasálně, intratracheálně, intrabronchiálně, intramuskulárně, subkutánně nebo jakýmkoliv podání patří intraperitoneální dalším způsobem. K parenterálním způsobům podání intravenózní, intramuskulární, a subkutánní. Složitějším přístupem je parenterální podání, podávání viru nebo chemického konjugátu, který se lokalizuje do určitého typu nádoru díky přirozenému tropismu nebo díky přítomnosti povrchové molekuly, která se váže na receptor vyskytující se pouze , na určitých typech nádoru.

'Jak již .bylo popsáno výše, předkládaný vynález poskytuje způsoby přípravy buněčného' expresního systému pro expresi genového produktu (např. interferonu) v příjemci, kterým je savec, tento expresní systém takto připravený a farmaceutické přípravky obsahující takový systém. ' Cílem následujících příkladů je demonstrovat proveditelnost buněčné genové terapie na zvířecím modelovém systému.

:l-;b ··.···'· ··

• · · ·

O ·

9999 99

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příklady zvířecích modelů

Testování in vivo poiynukleotidů schopných exprimo.vat interferon se obyčejně provádí na zvířecích modelech. Nádory u nahých myši se tvoří injekcí lidských nádorových buněk do myši. Nahé myši (kmen nu/nu) jsou impnodef icitní myši a neodvrhují cizorodé nádorové buňky. Nádory se vytvoří' za 1 až 2 týdny po injekci nádorových buněk, i když přesný okamžik závisí na množství inj ikovaných buněk a tumorigeničnosti injikované buněčné linie. Polynukleotidy exprimující interferon se vnesou do nádorových buněk konvenčním postupem transfekce v buněčné kultuře před injekcí do myší. Alternativně se vhodný polynukleotid vnese do nádoru transfekcí nebo virovou transdukcí in vivo po té, co se u myší vytvořily nádory.

Až na jeden příklad jsou užívané buňky buďto buňky linie karcinomu močového měchýře ,HTB9 (Huang et al. , viz výše) nebo linie retinoblastomových buněk WERI-Rb27 (Takahashi et al., Proč. Nati. ' Acad. Sci. USA 88: 5257-5261, 1991) . Pro přenos izolovaného polynukleotidu kódujícího interferon do kultury se nádorové buňky transfekují .(konvenčním způsobem jako je kalciumfosfátová precipitace, elektroporace nebo transfekce s 1ipofectaminem) nebo přímo infikují (retrovirem, adenovirem, bakulovirem nebo adeno-asociovaným virem) . V přípa'dě účinné virové infekce, kdy 100 % buněk úspěšně inkorporovalo příslušný polynukleotid, není potřeba žádná selekce. Kromě toho bylo zjištěno (viz příklad 3), že je třeba, aby pouze

• 0

0

0

04 000 000·

0000 00 ·· ··*· ·♦ ·· malé procento, buněk exprimovalo interf eronový gen,· takže selekce pomocí léků se obvykle nevyžaduje.

Jestliže se .provádí selekce v případě transfekce, která není tak účinná jako virová infekce zde popisovaná, buňky se transfekují expresním vektorem, který kóduje jak gen rezistence k léku (jako je gen neo kódující rezistenci k G418) a polynukleotid jako je např. interferonový gen. Kontrolní transfekce se provede vektorem, který kóduje samotnou rezistenci k léku.

Po 2 až 3 týdnech selekce na médiu obsahujícím lék se buněčné kolonie sloučí a subkutánně injikují do boku samic myší nu/nu (tzv. nahých myší) v počtu 10⁶ buněk v objemu 100 μΐ. Virem infikované buňky se injikují přímo bez nutnosti provádět selekční krok. myši jsou dále drženy po alespoň dva měsíce a monitoruje se velikost nádoru pomocí kaliperu na týdenní bázi.

Alternativně netransfekované nebo neinfikované nádorové buňky se subkutánně injikují do boku myši. Po vytvoření nádoru se přímo do nádoru injikuje DNA' nebo virus obsahující polynukleotid kódující interferon. Pro tento postup jsou vhodné mnohé' viry, i když nejúčinnější jsou rekombinantní adenoviry, a rekombinantní retroviry mají výhodu, že se trvale integrují do genomu nádorových buněk. DNA může být vnesena do buněk tak, že se DNA smíchá s kationtovými liposomy a pak se injikuje tato směs. DNA nebo virus neobsahující interferonový gen se injikují do nádorů dalších myší, které slouží jako kontrola. Pomocí kaliperu se pak sleduje progrese nebo regrese nádorů. >

• « · ···« * · • ·· · · υ · · ·· ♦·· ♦ · 9 9 ·

Příklad 2

Příklad modelu karcinomu plic

Jako další příklad je možné uskutečnit léčení lidského malobuněčného karcinomu plic in vivo pomocí ' izolovaného polynukleotidu kódujícího interf eron zapouzdřeného v-l.iposomu tak, že se polynukleotid kódující interferon vnese do buněk vyžadujících tento zásah užitím liposomů, - konkrétně aerosolu malých liposomových částic. Při podání prostřednictvím aerosolu je polynukleotid kódující interferon deponován rovnoměrně na povrchu nosohltanu, v tracheobronchiálním traktu a v oblasti plic, viz diskuse liposomových aerosolů v Knight a Gilbert, Eur. J. Clin. Micro, and Inf. Dis. 7: -721-731,

1988. Pro léčení plicní rakoviny takovým způsobem je polynukleotid kódující interferon purifi-kován jakoukoliv obvyklou metodou. Polynukleotid kódující interferon se pak smíchá s liposomy a je do nich s. velkou účinností inkorporován. jelikož je podání aerosolu velmi jemné a je dobře snášeno jak normálními dobrovolníky tak pacienty, jsou liposomy obsahující polynukleotid kódující interferon podávány k léčení pacientům trpícím plicními rakovinami v kterémkoliv stadiu. Liposomy se podávají nasální inhalací nebo napojenou na nebulizační zařízení k inhibici růstu nádorů. Léčení aerosolem se provádí denně po dobu dvou týdnů, a pokud je to třeba, opakuje se.

Studie in vivo užitím orthotopického malobuněčného' plicního karcinomu se mohou provádět tak, že se nádor injikuje do pravého hlavního bronchu bezthymových nu/nu (nahých) myší (1,5 x 10^c buněk na jedno zvíře). Tři dny později se zahájí léčeni (denně po tři po sobě následující dny) tím že jsou endotracheální sondou v,dávkách dostatečných ·· 0 0 • 00 0 0 00 0 · · · * 0 00 000 0 0 · ♦ 00 0*0 0 · · Μ · · ·

00 0 00 0000 • 000 »» 00 0000 ♦·, ·· inokulovány endobronchiálně interferonovým genem zapouzdřeným v liposomu a kontroly postrádají sekvenci interferonového genu. vytváření- nádorů a jejich velikost se sledují u obou skupin měřením pomocí kaliperu a hodnocením přežívání myší.

Příklad 3

Genová terapie ex vivo s genem interferonu-beta la

V tomto příkladu byla užita buněčná linie lidského karcinomu prsu MBA-MD-468 (získaná z Americké sbírky mikroorganismů ATCC). Buňky byly buďto neinfikované nebo infikované adenovirem exprimujícím gen lidského interferonu beta la. V tomto případě měl adenovirus delece v genech El a teplotně senzitivní mutaci v genu E2a. Metody pro přípravu tohoto konkrétního adenoviru lze najít v publikaci Engelhardt et al., 1994, Gene Therapy 5: 1217-1229 (a níže jsou popsány další podrobnosti). Stručně shrnuto, gen interferonu-beta la byl již dříve klonován do adenovirového vektoru pAdCMVlinkl tak, že translace byla řízena promotorem CMV IE1, čímž se vytvořil adenovirový přenosový plazmid. Gen byl vložen do tohoto vektoru na místo deletovaného genu El. Rekombinantní interferonový gen byl připraven' plazmidu a adenovirového genomu v buňkách 293. Virus byl pak plakově purifikován a titrován v plakovém testu konvenčním způsobem.

adenovirus obsahující rekombinací přenosového « 4 » « ··

Materiály a metody

Buněčné kultury

Lidské karcinomové buňky MDA-MB-468, Huh7, KM12LA4, MET 8.0, HeLa, U87 a 293 byly udržovány jako adherentní kultury v Dulbeccem modifikovaném Eagleho médiu obsahujícím 101 bovinní sérum, 2mM glutamin,' penicilín a streptomycin, neesenciální aminokyseliny a vitamíny.

Příprava purifi kovaných adenoviru

Adenovirový přenosový vektor kódující lidský gen IFN-β řízený časným promotorem cytomegaloviru, pAdCMV-huIF^, byl zkonstruován ligací- inzertu cDNA kódujícího lidský IFN^la do plazmidu pAdCMVlinkl (viz Englehardt et al., 1994, viz výše). Plazmid pAdCMV-huIF^ byl přenesen do buněk 293 společně s genomovou DNA purifikovanou z teplotně. senzitivního adenoviru H5tsl25. Rekombinantní adenoviry pocházející z jednotlivých plaků pak byly užity k infikování buněk 293 při 39 °C. a supernatanty se testovaly na genovou expresi IFN-β pomocí ELISA testu. Adenovirus nesoucí cDNA pro TFN-β byl identifikován (H5. ΙΙΟΙιΙΙΓΝβ) a dále amplif ikován. Podobně byl připraven kontrolní adenovirus s teplotně senzitivní mutací v E2A kódující kolorimeztrický markér β-galaktosidázu (H5.11QlacZ). Virové preparáty pak byly produkovány v buňkách 293 a purifikovány na gradientu CsCl po ,dvou cyklech plakové izolace. Tyto preparáty se ukázaly negativní v testu na přítomnost adenoviru divokého typu.

Subkonf luent.ní buňky byly infikovány H5.110hlIF^ při násobku infekce (MOI) 100 ve 3 ml média obsahujícího 2% hovězí sérum. 15 až 18 hodin později byly supernatanty sebrány a koncentrace IFN-β byla kvantitativně stanovena pomocí ELISA testu.

·· ·· «· ·· 44 ·· « 9 · * 9 4 4 4 * · * · '9 «9 4 4 · » * · * •»·»·· 4 · ♦ · ··

9994 99 «4 444 4 44 44

55’

ELISA test

96jamkové destičky byly potaženy přes noc ve 4 °C protilátkou proti lidskému IFN-β, BO'2 (Summit Pharmaceuticals Co., Japonsko). Protilátka byla užita v koncentraci 10- qg/ml v potahovacím pufru, který obsahoval 50mM hydrogenuhličitan /uhličitan sodný, 0,2mM MgCl₂ a 0,2mM CaCl₂ (pH 9,6) . Po té, co byly destičky blokovány 1% kaseinem v PBS po 1 hodinu při teplotě místnosti, byly přidány vzorky standardů IFN-β proteinu (AVONEX™, Biogen), naředěné v 1% kaseinu a 0,05% Tween-20. Destičky se pak postupně inkubovaly při teplotě místnosti 1 hodinu s králičím anti-IFN-β sérem (ředění 1:2000), 1 hodinu s křenovou peroxidázou (HRP) konjugovanou s oslí anti-králičí protilátkou (Jackson Immuno Research, ředění 1:5000) a substrátovým roztokem (4,2mM -TMB a 0, ÍM octa-n sodný-kyselina citrónová, pH 4,9). Pó zastavení' reakce pomocí 2N H2SO4 byla měřena absorbance při 450 nm.

Pokusy na myších

Samice myší balb/c nu/nu stáří 4 až 6 týdnů byly získány od farmy Taconic (Boston, Massachussets) . Všechny myši byly udržovány ve speciálním zařízení bez patogenů firmy Biogen po dobu nejméně 2 týdnů před pokusem. pro experimenty - in vivo byly infikované a neinfikované buňky, sklizeny roztokem trypsin/EDTA a dvakrát opláchnuty PBS. Tyto- buňky byly smíchány těsně před injikováním do myší. v poměrech popsaných dále. Celkem bylo implantováno 2 x 10⁶ buněk ve 100 μΐ PBS subkutánně do pravého boku. Velikost nádorů byla měřena jako délka a šířka pomocí kaliperu a uvedené hodnoty představují průměrnou hodnotu průměru nádoru (v mm).

Pro experimenty s přímou injekcí in vivo (příklad 4) bylo nejdříve implantováno 2 x 10'~ buněk ve 100 μΐ PBS subkutánně do nahých myší. Když velikost průměru nádoru dosáhla 5 až 6 mm, • •99

• · 9 9 • 9 9 9

9 9 ·

9 9 9 9 « · · 9 • 9 9 9 injíkovalo se 100 μΐ

PBS obsahujících. různé dávky rekombinantních adenovirů přímo do středu, nádoru jako jediná injekce. Monitorovala se délka a šířka nádoru pomocí kaliperu. Velikost nádoru se vypočetla .jako průměrná hodnota z šířky a délky. Smrt zvířete byla určena tím, že zvířata byla utracena, když nádory projevovaly známky krvácení nebo jejich hmotnost dosáhla 10 % celkové tělesné hmotnosti. Apoptdza byla vyšetřována pomocí soupravy In sítu Apoptosis Detection Kit od firmy Oncor, lne.'(katalog. č. S7110-KIT).

Výsledky

Nejdříve byla vyhodnocena účinnost transdukce a exprese transgenu adenovirových vektorů. Buňky lidského karinomuprsu MDA-MB-468 byly infikovány H5.1101acZ se zvyšující se multiplicitou infekce (MOI). Po obarvení X-gal bylo stanoveno, že při MOI 100 účinnost transdukce dosáhla přibližně 100 % u těchto buněk (data nejsou uvedena). Tudíž buňky karcinomu prsu byly infikovány v kultuře v poměru 100 jednotek tvořících plak (pfu) na jednu buňku, neboť ze zkušenosti s těmito karcinomovými buňkami vyplývalo, že to byl nejnižší poměr virus:buňka, .který vedl k expresi genu v každé buňce populace.

V prvním pokuse byla 18 hodin po infekci podána subkutánně injekce 2 x 10^c buněk do hřbetu každé nahé myši. 5 myším byly podány injekce neinfikovaných buněk a 5 myším, byly podány injekce buněk infikovaných adenovirem-IFNP. U všech myší injikovaných kontrolními neinfikovanými buňkami vznikly nádory významné velikosti. U žádné z myší injikovaných buňkami ošetřenými adenovirem exprimujícím IFN-β se nádor neobjevil (H5 . IlOňIFNfi·. tabulka 1).

Aby se vyloučila možnost, že in vitro expozice nádorových buněk proteinu IFN-β mohla vést ke ztrátě schopnosti vyvolávat nádory in vivo, byly buňky MDA-MB-468 ošetřeny proteinem IFN-β

Μ·· • 4 ·♦ ·· »4 4 4·«

4 1 ► 1 « 4 v takové koncentraci, která byla detekována po .18 hodinách virové infekce. Po důkladném promytí se nahým myším podávaly injekce se stejným množstvím ošetřených buněk, neošetřených buněk nebo směsi obsahující 10 % ošetřených buněk. Ve všech třech skupinách myší byl ' pozorován rozvoj nádorů (data neukázána), což naznačuje, že pro inhibici tvorby nádorů je kritické podání genu IFN-β ex vivo, ale ne ošetření,proteinem in vitro.·

Aby se určilo, zda rakovinné buňky exprimující gen IFN-β mohou vést k destrukci netransdukovaných buněk, prováděl se následující pokus. Stejné rakovinné buňky jsou buď neinfikovány, infikovány adenovirem exprimujícím gen IFN-β (H5. llOhJFN/?) nebo jsou infikovány stejným typem adenovirů, ale exprimujičího gen lacZ (H5.llOlacZ), který kóduje reportérový protein β-galaktosidázu, u kterého se neočekává žádný protirakovinný účinek a proto je to kontrola jakéhokoliv účinku vyvolaného samotným adenovirem. Všechny adenovirové infekce byly vyvolávány při poměru pfu:buňku = 100. Nádorové buňky MDA-MB-468 byly infikovány odděleně s H5.110hIFN/3 nebo H5.1102aců V MOI 100. 18 hodin po infekci byly infikované buňky sklízeny a část se smísila s neinfikovanými buňkami těsně před injekcí myším. Nahým myším Balb/c bylo subkutánně implantováno stejné množství infikovaných buněk, neinfikovaných buněk nebo směsi obsahující 10 % infikovaných buněk a 90 % buněk, které nebyly vystaveny viru. Růst nádoru se sledoval 12 dnů později. Zatímco u všech'myší, kterým byly implantovány neinfikované buňky, se vyvinuly nádory, u myší, které dostaly 100 % buněk infikovaných H5.110hIFN/3 nebo H5.1101acf nebyly pozorovány žádné nádory, což svědčí pro to, že. infekce oběma viry může zrušit schopnost vyvolávat nádory (tabulka 1). Avšak u všech myší, které dostaly 10 % buněk infikovaných H5.1102acf se nádory vyvinuly, zatímco u žádné

»t ·· φ φφφ φ ·· φφφ φφφφ φ»

φφ ·φ • * φ · φ φ φ · • φ φ · Φ · Φ Φ v blokování a neínfikovaných z myší, které dostaly 10 % buněk infikovaných H5. llOňlFN/? se tak nestalo. Tudíž infekce H5.110_ZacZ, i když byla · postačuj ící pro supresi tvorby nádoru již' infikovaných buněk, selhala tumorigeničnosti společně injikovaných naivních buněk. Na rozdíl od toho, transdukce

H5.110ŮJFN/7 v 10 % buněk byla postačující pro supresi tumorigeničnosti buněk, které byly transdukovány virem, a také buněk, které transdukovány nebyly. Inhibice tvorby nádoru HS.llOiacZ u 100/ transdukované populace mohla být způsobena některými obecnými toxickými' účinky nebo některými protinádorovými účinky této generace adenoviru, ale je nutné poznamenat, že transdukované buňky byly schopné replikace in vitro (nepublikovaná data).

Aby se stanovilo množství virů obsahujícího interferon potřebné pro supresi tumorigeničnosti, byly nádorové buňky odděleně infikované s H5.11QhIFNfi a H5.1101acZ smíseny s neinfikovanými buňkami v různých poměrech tak, že byl v každém případě přebytek neinfikovaných buněk. Směsi jsou sestavené tak,’ že různé vzorky obsahovaly 10

0,3 ϊ·: buněk infikovaných adenovirem a zbytek byl neinfikován. Okamžitě po smísení byly buňky injikovány nahým myším. Výsledky jsou ukázány v tabulce 1. Průměry nádorů jsou měřeny ve dvou rozměrech v různou dobu po injekci buněk. Každá položka v tabulce 1 představuje průměr ± standardní odchylku měření laterálního a longitudinálního rozměru u čtyř myší. Měření se prováděla ve dnech 12, 19, 26 a 33 po injekci nádorových buněk.

λ

/--'•-Λ

φ φ·

ΦΦΦΦ Φ ·

Tabulka 1

Průměrný rozměr nádorů (v mm)

Vzorek	Den 12	Den 19	Den 2 6	Den 33
100 % neinfikovaných	4,1 ± 0,6	4, 9 ± 0,8	5,9 ± 0,5	6,3 ± 0,6
100 % AdV-IFN	0, 0	0,0	0, 0	0, 0
10 % AdV-IFN	0,0	0, 0	o, o-	0,0
3 % AdV-IFN	0, 0	0, 0	O o	0, 0
1 % AdV-IFN	0, 0	0,0	0,0	0, 0
0,3 % AdV-IFN	2,8 ± 0,2	2,9 ± 0,3	3,0 ± 0,6	1,8 ± 2,0
100 % AdV-l-acZ	0, 0	0, 0	0, 0	0, 0
10 % AdV-lacZ	4,8 ± 0,4	5,2 ± 0,6	6,2 ± 0,5	6/5 ± 0,5
3 % AdV-lacZ	4,3 ± 0,5	4,6 ± 0,6	5,8 ± 0,8	6,5 ± 1,0
1 % AdV-lacZ	4,3 ± 0,4	4,6 ± 0,4	5,0 ± 0,5	6,3 ± 0,9
0,3 % AdV-lacZ	4,4 ± 0,5	4,7 ± 0,6	NESTANOVENO	NESTANOVENO

Rozvoj nádorů byl úplně blokován u myší, které dostaly i tak málo jako 1 % buněk transdukovaných H5. llQhIFN/3 (.tabulka 1). Vprvním týdnu po injekci buněk byly detekovány velmi malé nádory (byly přístupné palpaci, ale nebyly dostatečně velké pro měření) u myší injikovaných 10, 3 a 1 % H5.11OhIFNfi. Ale všechny tyto malé nádory kompletně ustoupily v den 9. To naznačuje, že některé buňky krátkou dobu' přežívaly a během tohoto období exprimovaly gen IFN-β, což vedlo ke smrti celého nádoru. V několika pokusech prováděných s touto buněčnou linií na nahých myších nebyla tvorba nádorů nikdy pozorována, když bylo 1 % buněk transdukováno H5. IlOňJFN/? a přežití bylo 100 % (data neukázána) . U myší, které dostaly 0,3 % buněk transdukovaných H5, HOňJFN/7 se vyvinuly nádory, ale velikost těchto nádorů byla významně menší než nádorů u kontrolních i

9 9 9 » 9 9 4 » · -9 • 9 4 • 99

9 •999 91 • 9 ·9

9 9 9

9 9 9 myší a u 2 z 5 myší v této 0,3% skupině byla v den 33 pozorována kompletní regrese (tabulka 1).

Na rozdíl od toho se u myší, které dostaly 10 % až .0,3 % se vyvinuly nádory skupiny a v žádné pozorována regrese podobné z těchto nádoru buněk ošetřených H5. HOlacZ, velikosti jako u neinfikované kontrolních · skupin nebyla (tabulka 1). '

Nepochybně se ukazuje, že exprese lidského interferonu beta (hIFN-β) i jen ve velmi malém procentu buněk, blokuje u nahých myší tumorigenezi. Dále byl vyšetřován nejnižší poměr buněk infikovaných H5.110hJFN/? nezbytných pro ovlivnění, ale ne nutně blokádu, tvorby nádoru a podporující přežití myší. Nahým myším byla ' implantována stejná množství buněk MDA-MB-468 obsahující 0,3 %, 0,1 infikovaných H5.ΙΙΟηΙΡΝβ %, 0, 03 %, 0, 01 % · a' 0 % buněk a sledoval se růst nádorů. U myší, které dostaly 0,3 % nebo 0,1 % infikovaných buněk, se vyvinuly mnohem menší nádory ve srovnání s myšmi, které dostaly pouze neinfikované buňky (obrázek 1A) . Z nádorů, které se tvořily při 0,3 a 0,1% transdukci, úplně - reg-redovaly 3 z 5 a 1 z 5 nádoru. Významně prodloužené přežití bylo pozorováno v' 0,3% a 0,1% transdukčních skupinách. Zatímco implantace 0 %, 0,01 % nebo 0,03 '% infikovaných buněk měla za následek smrt všech zvířat během 75 dnů, ve skupinách 0,1 % a 0,3 % bylo naživu bez nádoru-1 z 5 a 3 z 5 zvířat v den 109, kdy byl tento pokus ukončen (obrázek 1B).

Je pravděpodobné, že pouze' malá část (větší než přibližně 0,3 %, výhodně větší než přibližně 1,0 % všech nádorových buněk potřebuje být transfekována nebo infikována, aby se takových přístupů podávání nádorových dosáhlo účinnosti. To se liší od protinádorové genové léčby, jako je supresorů divokého typu (například p53), . ve kterých každá buňka v nádoru potřebuje získat nádorový supresorový gen.

• · «

4 4

4444 44

44 ·4 44

44 4 4 44 4 • 4 4 4 4 4 4 • 4 4 44 4 4 4

4 4 4 4 4 4 • 4 4444 44 44

Tudíž gen interferonu prokazuje silný antiproliferační účinek in vivo po infekci in vitro. Kontroly ukazují, že 'to bylo způsobeno spíše interferonem než adenovirem.

Genová terapie ' IFN-β ex vivo dalších lidských nádorových xenoimplantátů .

Účinek transdukce H5. HOňTFN/? byl také- testován na dalších nádorových buněčných typech v modelu lidského xenoimplantátů ex vivo. Buňky lidského karcinomu tlustého střeva KM12L4A, buňky lidského karcinomu jater Huh7 nebo buňky ' lidského karcinomu čípku ME180 byly transduktovány H5. IlOhTFN/?. Stejné množství buněk obsahující 10 %, 1 % nebo 0 % transdukovaných buněk se testuje na schopnost tvořit nádory u nahých myší. Injekce neinfikovaných buněk tří typů způsobuje tvorbu rychle rostoucích nádorů u všech myší. Na rozdíl od toho, podávání % buněk infikovaných H5. llOhTFN/? ex vivo- vedlo buď k tomu, že se nádor nevyvinul nebo se u všech vyšetřovaných zvířat opozdil výskyt pomaleji rostoucích· nádorů (obrázek 2A). Na rozdíl od výsledků získaných s buňkami MDA-MB-468, u kterých transdukce H5.11 OhTFN/? úplně zabránila tvorbě nádorů, li transdukce těchto tří buněčných typů měla za následek tvorbu nádorů, i když . jejich velikosti byly menší než u neinfikovaných kontrol v každém časovém bodě. Myši, které dostaly 10 % a 1 % transdukovaných buněk, přežívaly déle ve srovnání s těmi, které dostaly neinfikované buňky (obrázek 2B). Tudíž podávání genu IFN-β zprostředkované adenovirem ex vivo do četných odlišných nádorových buněk mělo za následek účinnou inhibici tumorigeničnosti a vedlo k prodlouženému přežívání zvířat.

-0 · • 000 ·· «000

00 • 0 0 ► 0 0 » > · · « » · * ·

Příklad 4

Genová terapie in vivo s genem'interferonu-beta la

Místo způsobu terapie ex vivo byla provedena přímá -genová terapie in vivo. Při genové terapii in vivo se gen podává přímo pacientovi. V tomto příkladu byl adenovirus obsahující, lidský -gen IFN-β (H5.11OhIFNfi) přímo injikován do -solidních nádoru. .Stručně shrnuto, 2 x 10® buněk lidského karcinomu prsu MBA-MD-468 bylo injikováno subkutánně do hřbetu padesáti nahých myší. Vtvořili se subkutánní nádory přibližné velikosti 5 až 6 mm v průměru u nahých myší do 24. dnů po subkutánní injekci buněk MBA-MD-468. V této době byly nádory ošetřeny buďto PBS nebo vektory H5.11 OhIFN/3 a H5.1101acZ v různých dávkách viru v rozmezí od 1 x 107 do 3 x 109 pfu/myš v jedné intratumorové injekci.

Data uvedená na obr. 3 ukazují, že během 14 dnů léčení jedinou dávkou H5.11 OhJFN/? v 3 x -ΙΟ⁹, 1 x 10^s nebo 3 x 10⁸ celkových pfu vedlo k regresi nádoru. K úplné regresi nádoru došlo u 4 z 5 myší ve skupině 3 x 10^;' pfu H5.11 OhIFNfí a u 3 z 5 ve skupině 1 x 10·' H5.11 OhIFNfi. V nádorech injikovaných dávkou 1 x 10' pfu H5.110hIFN/? byla detekována vysoká lokální koncentrace IFN-β 1500 IU/ml, zatímco- v séru bylo detekováno pouze 37 IU/ml IFN-β. Nižší dávky IFN-β,které byly 1 x 10⁸,

x.lď a 1 x 10⁹ pfu měly jen-.malý nebo žádný účinek (obr. 3 a neuvedená data), což ukazuje, že protinádorová' odpověď je závislá na dávce. Injekce PBS nebo H5.1101acZ ve stejných dávkách nevedly k regresi nádoru (obr. '3) . Když byly nádory monitorovány delší období, pomalý růst a regrese byly pozorovány u několika individuálních nádorů injikovaných H5.1101acZ v dávce 3 x 10⁹ pfu, což ukazuje, že i kontrolní virus v této dávce muže slabě inhibovat růst nádorů. Ošetření • 0 • « • 0 0 0

0 · • 9 09 • · ·

90 • 4

0

0000 «·

9 0 • 0 0000

H5. ÍIOŮIFN/? v dávkách 3 x 10^s, 1 χ 10⁹ nebo 3 χ 10⁸ významně zvyšovalo přežívání 'vzhledem k myším ošetřeným PBS nebo H5.1101acZ (údaje nejsou ukázány). Testovaly jsme také podání několika injekcí. Např. 5 injekcí s dávkou í xlO⁸ pfu H5.11OhIFNfi podávaných jednou za tři dny do založených nádorů MDA-MB-486 nebo HeLa vedlo k pomalejšímu růstu a regresi nádorů obou typů (nepublikováno). Byl proveden také podobný experiment in vivo s linií lidských gliomových buněk U87. Tyto buňky byly velmi citlivé k IFN-β, jelikož byla pozorována úplná regrese nádoru u 4 myší ze 4 léčených dávkou 1 x ICÚ pfu H5.11 OhlFN/? a u 2 ze 4 léčených dávkou 1 χ 10⁸ pfu (data neuvedena). Tato zjištění ukazují, že přímé a lokální podání genu IFN-β prostřednictvím adenoviru může projevit výrazný protinádorový účinek.

Čtyři dny po injekci 1 x^: 10⁹ pfu viru byly nádory MDA-MB468 odebrány pro histologickou analýzu. V této době nádory injikované H5.IlOhIFNfí jevily známky regrese. Byla provedena hematologická analýza nádorů MDA-MB-468 barvením hematoxylinem-eosinem. Více · apoptotíckých buněk bylo pozorováno v nádorech injikovaných H5.110ŮIFN/? než v nádorech injikovaných H5.1107acZ. Apoptóza byla potvrzena přímou detekci fluorescence koncově značené fragmentované genomové DNA. Pouze velmi málo infiltrujících mononukleárních buněk bylo pozorováno v nádorech injikovaných EF.llOhIFNfí nebo H5.1101acZ, což ukazuje, že buněčná imunitní odpověď nemusí hrát hlavní roli v regresi nádoru řízené H5. HOhTFN/? u tohoto modelu.

Oba pokusy ex vivo a in vivo ukázané výše měřily pouze přímý antiproliferační účinek interferonu. Protože se jedná o myši s imunodeficitem, není přítomna žádná imunostimulační aktivita interferonu, která by mohla stimulovat zničení nádoru. Také, protože interferony nejsou druhově zkřížené .> .Λ.·.

99 ·> *· ··

9 9 9 9 9 9 99 9

9« 99 9 9999

9 9 9 9 9 99 · · ·

999 9999

99 9999 99 99

9999 z člověka na myš, nečekalo by se, že by lidský IFN-β používaný pro inhibici lidských rakovinných buněk u těchto myší inhiboval angiogenezi, protože lidský IFN-β nepůsobí na myší vaskulární pndotelové buňky. Tudíž je možné, že kdyby byli adenovirem s lidským IFN-β léčeni lidští pacienti, byla by pozorována dokonce dramatičtější protirak.ovinná aktivita. To by se mohlo modelovat na imunokompetentních primátech jiného než lidského původu. Jako alternativa by se u imunokompetentních myší s nádory myšího původu mohl použít adenovirus s myším genem IFN-β. Mnoho těchto syngenních modelů myších nádorů je k dispozici.

Data zde poskytnutá dokazují pozoruhodnou schopnost genové léčby IFN-β blokovat tvorbu nádorů de novo, a také způsobit regresi prokázaných nádorů. Transdukční pokusy ex , vivo potvrdily, že zavedení silného sekretovaného proteinu do i tak málo jako 0,3 % - 1 % transdukovaných buněk, blokovalo rozvoj nádorů MDA-MB-468. Byla testována celá řada dalších nádorových buněčných linií, a zatímco zde byly rozdíly v síle ' účinku IFN-β, mohly být všechny blokovány 1-10 % buněk transdukovaných IFN-β. Relativně malé procento buněk sekretujících IFN-β nezbytné pro ovlivnění tvorby nádoru bylo povzbuzující pro další pokus, kdy byly předem vytvořené nádory stimulovány přímou .intratumorovou injekcí adenoviru. Účinek podání genu IFN-β byl při jedné injekci viru opět silný, což mělo za následek buď částečnou nebo v některých případech i úplnou regresi nádorů.

V těchto studiích se ukázalo, že dramatická regrese nádorů je primárně důsledkem přímé antiproliferační nebo cytotoxické aktivity IFN-β. Tento závěr byl podporován faktem, že gen IFN-β používaný v této studii je lidského původu, a lidský IFN-β nereaguje zkříženě s hostitelskými myšími buňkami. Také imunodeficitní nahé myši, které byly použity, postrádají

-di.··’

• · • ·

T lymfocyty, hlavní efektorovou buňku v indukované IFN typu 1 (Tough, D.F., et al imunostimulaci

Science, 272,

1947-1950, 1996, Rogge, L., et al. , J. Exp. Med., 185, 825831, 19-97). Kromě toho u nádorů rychle regredujicích po. podání genu IFN-β nebylo pozorováno zřetelné zvýšení infiltrace mononukleárních buněk. Tyto nálezy podporují teorii, že samotná antiproliferační aktivita zprostředkovaná IFN-β by mohla být postačující pro vyvolání nádorové regrese. Ukazuje se, že data’- vynálezu jsou konzistentní s dříve pozorovanou klinickou korelací mezi senzitivitou maligních buněk in vitro k antiproliferační aktivitě indukované IFN a léčebnému účinku in .vivo (Einhorn a Grander, J. Interferon Cytokine Res., 16, 275-281, 1996) .

Lze' shrnout, že bylo' zjištěno, že genová terapie IFN-β zprostředkovaná 'adenovirem může v myších modelech uplatnit použitelný protínádorový účinek. Podávání genu IFN-β ex vivo ve velmi malém procentu buněk bylo postačující, aby blokovalo tvoření nádoru a přímé intraťumorové podání genu IFN-β v jedné dávce vedlo k regresi prokázaných nádorů. Bez ' ohledu na jakoukoliv teorii účinku, tento výrazný protínádorový účinek muže být důsledkem autokrinního a parakrinního působení IFN-β. Tento protínádorový účinek by mohl být kritický faktor v klinických zkouškách genové léčby rakoviny, ve kterých je pravděpodobné, že je limitující množství podávání genů . a je nezbytný významný vedlejší účinek. Tudíž místní genová léčba IFN-β genem poskytuje slibnou strategii pro léčbu nádorů u lidí.

Ekvivalence

Je třeba chápat, že předchozí text je pouze detailním popisem' některých výhodných provedení předkládaného vynálezu, odborníkovi je proto zřejmé, že lze provést modifikovaná či ekvivalentní řešení vynálezu, která spadají do předmětu předkládaného vynálezu.

···

• ·

1. Buněčný systém pro expresi interferonu-beta, který obsahuje buňku vložený, který obsahuje polynukleotidovu beta kódující protein interferon-beta expresi.

Claims (23)

1. Buněčný systém pro expresi interferonu-beta, který obsahuje buňku vložený, který obsahuje polynukleotidovu beta kódující protein interferon-beta expresi.

*·.

• · ♦ ···· ··

PATENTOVÉ

NÁROKY in vivo proteinu savce a vektor v ní sekvenci interferonua umožňující jeho

2. Buněčný systém podle nároku 1, kde savec je člověk.

3. Buněčný systém podle nároku 1, kde expresní vektor obsahuje virový vektor vybraný ze skupiny obsahující adeno-asociované virové vektory a adenovirové vektory, přičemž adenovirový vektor sám je vybrán ze skupiny obsahující a) adenovirový vektor mající deleci v genu El, b) adenovirový vektor mající deleci v genu El a deleci nebo mutaci v genu E2, c) adenovirový vektor mající deleci jak v genu El tak i v genu E4 a d) adenovirový vektor mající deleci všech genů El, E2, E3 a E4 .

4. Buněčný systém podle nároku 1, kde buňka je součástí množství buněk, ve kterém nejvýše 10? z tohoto množství buněk obsahuje vektor.

5. Buněčný systém podle nároku 4, kde nejvýše 3 % z tohoto množství buněk obsahují vektor.

6. Buněčný systém podle nároku 5, kde nejvýše.1 % z tohoto množství buněk obsahuje vektor.

7. Buněčný systém podle nároku^ 5, kde nejvýše 0,3 * z tohoto množství buněk obsahuje vektor. .

9· 99 ·· ··

9 99 9 9 99 9

9 99 99 9

9 9 · 9 · ·

9999. 99 99 9999

8. Buněčný systém podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, kde buňka je rakovinná buňka.

9. Buněčný systém podle nároku 8, kde rakovinná buňka je buňka rakoviny jater.

10. Farmaceutický přípravek vyznačující se t i m, že obsahuje buněčný systém podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 a farmaceuticky přijatelný nosič.

11. Způsob přípravy farmaceutického přípravku pro genovou terapii vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se a) připraví množství buněk téhož biologického druhu jako je příjemce přípravku pro genovou terapii, b) alespoň do jedné buňky z tohoto množství buněk se vnese vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci interferonu-beťa kódující a umožňující expresi proteinu interferonu-beta a c) alespoň jedna buňka se umístí do farmaceuticky přijatelného nosiče..

12.. Způsob podle nároku 11 v y z n a č u j í c í se t i m, že krok, kdy se vnese.vektor do alespoň jedné buňky, obsahuje vnesení vektoru do množství buněk představujícího nejvýše 10 % z celkového množství buněk.

V

13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 10 až 12 vyznačující se tím, že vektor obsahuje virový vektor vybraný ze skupiny obsahující adeno-asociované virové vektory a adenovirové vektory.

14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se t i m, že adenovirový vektor je vybrán ze skupiny obsahující

0 0

0 ·

00 0«

0 0 0 « ··

a) adenovirový vektor mající delecí v genu El, b) adenovirový vektor mající delecí v genu El a delecí nebo mutaci v genu E2, c) adenovirový vektor mající deleci jak v genu El tak i v genu E4 a d) adenovirový vektor mající deleci všech genů El, E2, E3 a E4 .

15. Způsob genové terapie vyznačujíc.i se tím, že obsahuje genovou modifikaci alespoň jedné buňky savce prostřednictvím kroků, kdy se a) alespoň- do jedné buňky savce se vnese vektor obsahující polynukleotidovou sekvenci interferonu-beta kódující a umožňující expresi proteinu interferonu-beta a b) alespoň jedné buňce se umožní kontakt s místem v savci.

16. Způsob podle nároku· 15, vyznačující se tím, že dále obsahuje kroky, kdy se vyjme alespoň jedna buňka ze savce před krokem, kdy se vnese vektor.

17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se t í m, že krok vyjmutí alespoň jedné buňky ze savce obsahuje krok, kdy se vyjme množství buněk . a krok vnesení vektoru obsahuje vnesení vektoru do. nejvýše 10 % z tohoto množství buněk.

18. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17 vyznačující se tím, že krok vnesení vektoru obsahuje přímé injikování vektoru do alespoň jedné buňky.

19. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 17 vyznačující se tím, že krok podání obsahuje podáni vybrané ze skupiny obsahující podání topické,

4 4

4 4

4 4

4 4 intraokulární,' parenterální, intranasální, intratracheální, intrabronchiální, intramuskulární a subkutánní podání.

44 44

4 4 4 4

4 44

4 4 ·4

4 4 4

4444 44

4« 4*

4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4 •4 4*44

20. Způsob podle' nároku 19 vyznačující se tím, že parenterální podání obsahuje podání vybrané ze skupiny obsahující podání intravenózní, intramuskulární, intraperitoneální a subkutánní.

21. ' Způsob podle kteréhokoliv z nároků 15 až 20 vyznačující se tím, že buňka je nádorová buňka.

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se t i m, že buňka je jaterní buňka.

23. Způsob podle kteréhokoliv z' nároků 15 až 22 vyznačující se tím, že vektor obsahuje virový vektor vybraný ze skupiny obsahující adeno-asociované virové vektory a adenovirové vektory, přičemž adenovirový vektor sám je vybrán ze skupiny obsahující a) adenovirový vektor mající deleci v genu El, b) adenovirový vektor mající deleci v genu El a deleci nebo mutaci v genu E2, c) adenovirový vektor mající deleci jak v genu El tak i v genu E4 a d) adenovirový vektor mající deleci všech genů El, E2, E3 a E4.