CZ2000860A3 - Gonadotropiny získané expresí v Dictyostelium - Google Patents

Abstract

Gonadotropiny exprimované v Dictyostelium, kteréjsou secemovány v biologicky aktivní formě. Exprese gonadotropinů v Dictyostelimje snadnýmzpůsobempro selekci mutantních gonadotropinů.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká gonadotropinů nebo jejich mutantů exprimovaných v Dictyostelium, farmaceutických prostředků obsahujících takové gonadotropiny, způsobu přípravy gonadotropinů a způsobů selekce mutantních gonadotropinů se superagonistickými nebo antagonistickými vlastnostmi.

Dosavadní stav techniky

Gonadotropiny tvoří rodinu strukturálně příbuzných glykoproteinových hormonů. Typickými členy této rodiny jsou choriový gonadtropin (CG), folikuly-stimulující hormon (FSH), luteinizační hormon (LH) a thyroidální stimulační hormon (TSH). FSH, LH a TSH jsou přítomné u většiny obratlovců a jsou syntetizovány a secernovány hypofýzou. CG byl doposud objeven pouze u primátů, včetně lidí, a u koní a je syntetizován tkání placenty.

Hormony jsou heterodimerní proteiny velikosti přibližně 30 kD, kde tyto heterodimery jsou tvořeny nekovalentní vazbou společné a-podjednotky a hormon-specifické β-podjednotky.

U jednoho druhu je a-podjednotka v podstatě identická pro každý člen gonadotropinové rodiny; je také vysoce konzervovaná mezi druhy, β-podjednotky jsou odlišné pro každý člen, t.j. CG, FSH, TSH a LH, ale existují významné homologie v jejich struktuře. Dále, β-podjednotky jsou také vysoce konzervované mezi druhy. U lidí se a-podjednotka skládá z 92 aminokyselin, zatímco β-podjednotka má pro každý hormon jinou velikost: 111 zbytků pro hFSH, 121 zbytků pro hLH, 118 zbytků pro hTSH a 145 zbytků pro hCG (Combarnous, 'i. (.1992), Endocrine Eevisws, 13: 670-691;

Lustbader, J.W. et al., (1993), Endocrine Reviewa, 14: 291-311).

;3-pod jednotka hCG je významně větší než ostatní 8-pcd j ednotky, protože obsahuje dalších 34 aminokyselin na C-konci, které jsou označovány jako karboxy-koncový peptid (CTP). Tento CTP obsahuje yř

Gonadotropiny mají různé účinky na různé tělesné funkce, včetně metabolismu, regulace teploty a reprodukčních procesů. Například, hypoíyzární FSH má zásadní úlohu ve stimulaci vývoje a zrání íolikulu, zatímco LH indukuje ovulaci (Sharp, E.M. (1990), Clin. Endocrine!. 33: 787-807; Dorrington and Armstrong (1979),

Eecent Prcg. Hormon. Pes ;5 : 301-342) .

současnosti je FSH kombinaci s LH, pro aplikován klinicky, buď samostatně nebo ovariální stimulaci, t.j. pro ovariální hyperstimulaci pro fertilizaci in vitro (IVF) a pro indukci ovulace in vivo u neplodných žen nemajících ovulaci (Insler, V. (1988), Int. J. Fertility 33: 85-97; Navot and Rosenwaks (1988), J. Vitro Fert Embryo Transfer, 5: 3-13), stejné jako v léčbě mužského· hypogenadismu. Lidský choriogonadotropin (HCG) se účastní udržování těhotenství v časných stadiích po· početí a má také významné terapeutické aplikace.

Dvě pod jednotky heterodimeru mají mnoho· konzervovaných intra-podjednotkových disulfidových vazeb: pět disulíidových vazeb v d-podjednotce a šest disulfidových vazeb v β-podjednotce.

i. í i-O X 'U.Ol líz* cystěinové zbytky jsou plně konzervované mezi všemi členy gonadotropinové rodiny. Nedávno získaná rentgenová struktura hCG ukázala, že tyto disulíidevé vazby se účastní typické trojrozměrné struktuře, která se nazývá disulfidová smyčka.

Gonadotropiny obsahují tři nebo čtyři asparaginové zbytky, • · · · které mohou být N-glykosylované a které mají významný vliv na jejich konformaci a biologickou aktivitu. Kromě C-koncového peptidu (CTP) hCG může být hCG glykosylován na čtyřech serinových pozicích. Hlavní úlohou glykosylováného CTP se zdá být prodloužení cirkulačního poločasu hCG.

Biosyntéza glykoproteinových hormonů je vysoce komplexní proces. V poslední dekádě bylo zjištěno, že skládání, sestavení a sekrece gonadotropinů je usnadněna pomocí velké sady chaperonů a skládacích enzymů, které jsou lokalizovány v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Protože a- a β-podjednotky obsahují takzvanou disulfidovou smyčku, může se předpokládat, že protein-disulfid izomerasa má klíčovou úlohu při skládání proteinu. Dále bylo zjištěno, že N-vázané oligosacharidové vedlejší řetězce jsou nutné pro správné skládání, tvorbu disulfidových vazeb a sekreci hCG (Feng, W. et al., (1995), J.

Biol. Chem. 270, 11851-11859). Úspěšné sestavení dvou podjednotek do dimeru je nezbytným předpokladem pro biologickou aktivitu dimeru.

Hodnocení funkčních determinant heterodimerních glykoproteinových hormonů je často narušeno nežádoucími sekundárními účinky mutací na sestavení podjednotek. Pro zlepšení studií analyzujících strukturu/funkci byly připraveny mutanty, ve kterých jsou kódující regiony β-podjednotky hCG a společné α-podjednotky spojeny prostřednictvím peptidových vmezeřených sekvencí nebo interpodjednotkových disulfidových vazeb. Bylo zjištěno, že tyto kovalentně vázané α-podjednotky a β-podjednotky hCG se mohou skládat do biologicky aktivních konformaci.

Gonadotropiny byly exprimována v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) a jejich rekombinantní deriváty měly biologické aktivity srovnatelné s přirozenými hormony (Olijve, W. et al., (1996), Mol. Hum. Reprod. 2: 371-382). Tato skutečnost naznačuje, že tyto hostitelské buňky obsahují všechny chaperony a skládací enzymy nezbytné pro sestavení α-podjednotky a S-podjednotky hCG a pro provedení všech posttranslačních modifikací nutných pro plnou biologickou aktivitu. Dále, použití CHO buněk v kombinaci s místně-cílenou mutagenesí bylo potvrzeno jako hodnotný nástroj pro hodnocení funkčních determinant v glykoproteinových hormonech (Puett, D. et al., H.(1994), v Glycoprotein Hormones (Lustbader, J.W., Puett, D. and Ruddon, R.W., ed.), str. 59-82,

Springer-Verlag, New Zork) a pro vývoj nových terapeutických analogů těchto hormonů (Fares, F.A. et al., (1992), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4304-4308).

Naneštěstí má použití savčích buněk jako jsou CHO buňky pro expresi lidských gonadotropinů několik nevýhod. Není mošno generovat vysoký počet transformantů, který je nutný pro studie využívající náhodnou mutagenesí proteinových domén. Náhodná mutagenese vybraných domén v proteinech je hodnotným nástrojem pro identifikaci strukturálních determinant vazby na receptor a biologické aktivity. Dále, použití CHO buněk je nákladné a pracné. Proto existuje potřeba exprese gonadotropinů v méně robustním expresním hostiteli.

Hostitelské buňky z nižších organismů mohou splňovat výše uvedené požadavky, ale předpokládá se, že komplexní skládání gonadotropinů znemožní správnou expresi a sekreci takových komplexních rekombinantních proteinů.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že organismus Dictyostelum je schopen produkce vysoce komplexních glykoproteinových hormonů.

Půdní améba Dictiostielum discoideum je organismem, který umožňuje provedení atraktivní alternativy pro heterologní expresi lidských glykoproteinových hormonů. Tento organismus může být kultivován a transformován stejně snadno jako kvasinka Saccharomyces a zároveň má některé komplexní vlastnosti podobné jako savčí buňky, jako je glykosylace a chemotaxe. Dále bylo nedávno ujištěno, že Dictiosteilum je vhodným systémem pro přístupy využívající náhodné mutagenese.

Nicméně, bylo zjištěno několik odlišností v glykosylaci mezi proteiny produkovanými v Dictyostelium a materiálem produkovaným v CHO buňkách. Je známo, že glykosylace má významný vliv na funkcí hormonu a u většiny glykosylaci provedených v

Dictyostelium nejsou galaktosa, N-acetylgalaktosaamin nebo kyselina sialová navázány na oligosacharidové vedlejší řetězce (Slade, M. et al., (1997), Biotech. Genet. Eng. Rev. 14: 1-35). Bylo zjištěno, že ačkoliv není post-translační modifikace identická s modifikací u vyšších eukaryotických organismů, jsou gonadotropiny produkované v Dictyostelium také biologicky aktivní. Bylo zjištěno, že protein je schopen vazby na svůj receptor a stimulace produkce cAMP v buňkách exprímujících lidský LH/CG receptor.

Heterogenita exprimovaných glykoproteinů je značně snížena, což vede k produkci homogenějších přípravků isohormonů. Proto jsou gonadotropiny produkované v Dictyostelium chemicky lépe definovány než komplexnější gonadotropiny produkované v CHO. Toto je hlavní výhodou udržování a analytické hodnocení složení jednotlivých šarží. Protože glykosylace je velmi významnou determinantou pro poločas gonadotropinů in vivo poskytuje produkce gonadotropinů v Dictyostelium prostředek pro produkci nemutovaných gonadotropinů s dobře definovanými poločasy in vivo. Dále, úprava exprese gonadotropinů v Dictyostelium pomocí genového inženýrství umožňuje vývoj konkrétních gonadotropinů pro některé klinické aplikace.

« * • · · · • » · · • · · * • · · · • · · ·

Vzhledem ke komplexu inter- a intramolekulového skládání dvou podjednotek, velkému počtu disulfidových můstků, disulfidovým smyčkám a post-translačním modifikacím je překvapivé, že aktivní gonadotropiny mohou být exprimovány v Dictyostelium a že správně složené molekuly mohou být připraveny způsobem podle předkládaného vynálezu. Správná tvorba disulfidových vazeb je zásadním dějem ve skládání a zrání funkčních gonadotropinů. Zásadní je zejména tvorba disulfidových vazeb v β-podjednotce: pro účinné kombinování a složení jsou nutné všechny disulfidové vazby. Podrobné studie skládání hCG ukázaly, že skládání molekuly neprobíhá jednoduchou sekvenční dráhou, ale že probíhá nezávisle v různých doménách molekuly. Proto se předpokládalo, že buňky nižších organismů nejsou schopny sekrece správně složených gonadotropinů.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje gonadotropiny exprimované v Dictyostelium.

Použití Dictyostelium discoideum má tu výhodu, že se jedná o dobře prostudovaný organismus. Vegetativní amébu lze snadno a levně kultivovat buď v axenické kultuře, nebo na Gram-negativních bakteriích. Kromě toho, bylo popsáno několk transformačních vektorů, které mohou být použity pro řízení exprese cizorodých proteinů.

Gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být dimerické, t.j. složené ze dvou nekovalentně navázaných podjednotek. Výhodně je gonadotropinem hCG nebo FSH. Nicméně, gonadotropiny mohou obsahovat obecně přijímané modifikace.

V jedné takové výhodné modifikaci gonadotropinů podle • · · · • · · · předkládaného vynálezu je C-konec aminokyselinové sekvence jedné podjednotky navázán - volitelně prostřednictvím spojovací skupiny - na N-konec aminokyselinové sekvence druhé podjednotky. Výhodně je spojovací skupinou kompletní nebo částečná CTP jednotka nebo její varianta, nebo repetitivní oligopeptid, například 5-krát opakující se Ser-Gly peptid.

Jinou modifikací gonadotropinů podle předkládaného vynálezu může být rozšíření a-podjednotky a/nebo β-podjednotky na jejich N- nebo C-koncích o kompletní nebo částečnou CTP jednotku nebo její variantu. Rozšíření může obsahovat příslušné CTP jednotky v jednoduché nebo mnohotné formě. Alternativně může být kompletní CTP jednotka nebo částečná CTP jednotka nebo její mnohotné formy insertována v N- nebo C-konci uvedených podjednotek. Ještě jinou modifikací je vložení jedné nebo více dalších disulfidových vazeb.

Dále, gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být buď glykosylovane, nebo částečně glykosylováné. Částečně glykosylované gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být získány místně cílenou mutagenesí, při které je odstraněno jedno nebo více míst pro glykosylaci v gonadotropinů.

Alternativně může být charakter glykosylace gonadotropinů podle předkládaného vynálezu modifikován vložením dalších glykosylačních míst a volitelně odstraněním jednoho nebo více glykosylačních míst, což vede k modifikované glykosylaci uvedených gonadotropinů. Glykosylační místa, jak je zde tento termín použit, se skládají z aminokyselinové sekvence Asn-X-Ser/Thr, kde X může být jakákoliv aminokyselina.

Termíny a-podjednotka a β-podjednotka CG, FSH, LH a TSH, stejně jako heterodimerické formy, jsou použity v běžném významu a označují proteiny mající aminokyselinovou sekvenci známou v • 999 oboru, nebo jejich alelické varianty, bez ohledu na charekter glykosylace.

Přirozené formy těchto proteinů jsou ty proteiny, které mají aminokyselinovou sekvenci izolovanou z příslušné tkáně obratlovce a jsou tvořeny těmito sekvencemi jako takovými nebo jejich alelickými variantami.

Termín varianty označuje ty proteiny, které obsahují alterace aminokyselinové sekvence vzhledem k přirozeným proteinům. Alteracemi mohou být jednotlivé nebo mnohotné delece, inserce, substituce a jejich kombinace, a mohou být připraveny, například, místně specifickou mutagenesí.

Termín CTP jednotka, jak je zde použit, označuje aminokyselinovou sekvenci, která se nachází na karboxylovém konci β-podjednotky hCG v rozsahu od 112-118 zbytku do zbytku 145 na C-konci, nebo její část. Kompletní CTP jednotka obsahuje 28-34 aminokyselin, v závislosti na N-konci CTP. Částečná CTP jednotka je aminokyselinová sekvence, která se nachází mezi pozicemi 112-118 až 145 včetně, ale která má alespoň jednu aminokyselinu deletovanou vzhledem k nejkratší možné kompletní CTP jednotce (aminokyseliny 118-145). Mnohotné CTP jednotky jsou tandemová seskupení kompletních CTP jednotek nebo částečných CTP jednotek nebo jejich kombinace.

Způsoby konstrukce gonadotropinových genů podle předkládaného vynálezu jsou v oboru dobře známé (Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, poslední vydání). Techniky pro místně cílenou mutagenesi, ligaci dalších sekvencí, PCR a konstrukci vhodných expresních systémů jsou také všechny dobře známé v oboru. Části nebo celá DNA kódující požadovaný protein může být • · · konstruovány synteticky za použití standardních technik syntézy na pevné fázi, výhodně tak, aby obsahovala restrikční místa pro snadné provedení ligací. DNA kódující sekvence může obsahovat vhodné kontrolní elementy pro transkripci a translaci.

Vynález dále obsahuje způsob pro expresi gonadotropinů nebo jejich mutantů v Dictyostelium. Uvedený způsob podle předkládaného vynálezu obsahuje kroky:

- transformaci kmene Dictyostelium rekombinantním plasmidovým vektorem obsahujícím DNA sekvenci kódující geny nebo mutované geny pro gonadotropiny pod kontrolou Dictyostelium regulačních sekvencí;

- kultivaci rekombinantního kmene za podmínek umožňujících expresi uvedené DNA sekvence; a

- izolaci exprimovaného proteinu.

Výhodně je exprimovaným proteinem jednořetězcový protein, tzn., že podjednotky jsou kovalentně vázané pomocí spojovací molekuly. Ještě lépe je gonadotropinem jednořetězcový hCG.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob pro skríning mutovaných gonadotropinů. Uvedený způsob obsahuje:

- náhodnou mutagenesi genů pro gonadotropiny;

- inserci mutovaných genů do plasmidového vektoru pro

Dictyostelium;

- transformaci kmene Dictyostelium uvedeným rekombinantním plasmidovým vektorem;

- kultivaci klonů za podmínek umožňujících expresi DNA sekvence;

- určení poměru vazba na receptor/přenos signálu; a

- izolaci klonů s poměrem, který se liší od poměru určeného pro přirozené gonadotropiny.

Výhodně mají mutované gonadotropiny vazbu na receptor, která • · · · • · se rovná vazbě přirozeného gonadotropinu na jeho receptor. Lépe je afinita mutovaného proteinu k jeho receptoru vyšší než afinita jeho přirozeného protějšku. Přenos signálu by měl být alespoň dvakrát vyšší nebo nižší ve srovnání s přirozeným proteinem. Výhodně je rozdíl v přenosu signálu 10-násobný.

Proteiny mající vysoký poměr jsou použitelné jako antagonisté, zatímco proteiny s nízkým poměrem mohou být použity jako superagonisté.

Způsoby pro stanovení vazby na receptor, stejně jako in vitro a in vivo testy pro stanovení biologické aktivity gonadotropinů j sou v oboru dobře známé.

Náhodná mutagenese nemusí být provedena na kompletním gonadotropinovém genu, ale může být provedena na genu pro jednu podjednotku nebo na dobře definovaném regionu, jako je například determinantní smyčka.

Pro vložení náhodných bodových mutací do genu pro gonadotropin může být použita amplifikace vybraného regionu za použití Taq DNA polymerasy. Protože Taq DNA polymerasa postrádá 3'->5' exonukleolytickou editační aktivitu, je tento enzym DNA polymerasou vnášející chyby do sekvence, se změřenou chybovostí 10~⁵ až 10^_4 chyb na syntetizovaný nukleotid. Proto může být PCR s Taq DNA polymerasou za v podstatě standardních podmínek reakce použita pro zavádění mutací (Zhou, Z. et al., (1991),

Nucl. Acids Res. 19: 52). Nicméně, frekvecne mutací získaná za použití této techniky je adekvátní pro mutagenesi relativně velkých sekvencí, ale ne pro mutagenesi malých DNA fragmentů (<500 bp) . Nespolehlivost Taq DNA polymerasy může být zvýšena přidáním Mn²* a použitím relativně vysokých koncentrací dNTP a Mg²' (Leungh, D.W. et al., (1989), Technique 1: 1-15).

• · • · · ·

Alternativním způsobem pro úpravu frekvence mutací, kterou je také možno ovlivnit typ mutací, je použití dITP v kombinaci s omezenými množstvími čtyř dNTP (Spee, J.H. et al., (1993), Nucl.

Acids Res. 21: 777-778) . Pro mutagenesi krátké cílové DNA (< 50 bp) je metodou volby použití degenerovaných oligonukleotidů (Kirchhoff, F. and Desrosiers, R.C. (1996), Meth. Molec. Biol.

57: 323-333). Obvykle se skládají tyto způsoby ze čtyř kroků. V prvním kroku je vybraný region amplifikován (modifikovanou) PCR. Ve druhém kroku je amplifikované DNA trávena párem restrikčních endonukleas, které tráví každý konec vybrané DNA sekvence. Ve třetím kroku je DNA fragment obsahující vybranou DNA sekvenci ligován s vektorovou DNA trávenou restrikčními endonukleasami. Ve čtvrtém kroku jsou výsledné rekombinantní DNA molekuly vloženy do buněk transformací nebo elektroporací.

DNA vektory kódující jakýkoliv gonadotropin podle předkládaného vynálezu také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. DNA vektory podle předkládaného vynálezu mohou být získány operativní vazbou DNA kódující přirozené gonačotropiny nebo jejich varianty s DNA obsahující Dictyostelium regulační sekvence. Volitelně mohou tyto vektory také obsahovat regiony, které obsahují sekvence rozpoznávající počátek replikace a/nebo sekvence kódující polypeptid usnadňující extrachromosomální replikaci. Takové vektory mají tu výhodu, že se mohou replikovat v Dictyostelium hostitelských buňkách extrachromosomálně.

Jak bylo uvedeno výše, variantní gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být agonisté nebo antagonisté, v závislosti na místě mutace. Místo mutace může způsobit jemné změny v konformaci molekuly. Pokud je místo mutace vybráno například v částech proteinu, které jsou asociovány s vazbou na receptor a/nebo přenosem signálu, tak může mít secernovaný protein podle předkládaného vynálezu částečnou nebo úplnou ztrátu signální aktivity. Takové změněné gonadotropiny, které mají zachovanou vazbu na receptor, mohou být použity jako antagonisté. Také mohou být připraveny gonadotropiny se zlepšenou vazbou a lepším přenosem signálu.

Agonistické gonadotropiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro stejné klinické aplikace jako přirozené gonadotropiny. Kromě proteinů mohou být použity jako diagnostické prostředky pro detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti protilátek k přirozeným proteinům v biologickém vzorku. Mohou být také použity jako kontrolní činidla v testech pro hodnocení koncentrací gonadotropinových hormonů v různých vzorcích. Antagonisté mohou být použity například v léčbě nádorů závislých na gonadotropinech; LH/hCG antagonisté mohou být použity pro prevenci kolísání LH během kontrolované ovariální hyperstimulace a FSH antagonisté mohou být použity pro mužskou antikoncepci.

Vhodné farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují jeden nebo více gonadotropinů podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Farmaceuticky přijatelné nosiče jsou v oboru dobře známé a zahrnují, například, sterilní fyziologický roztok, laktosu, sacharosu, fosforečnan vápenatý, želatinu, dextrin, agar, pektin, podzemnicový olej, olivový olej, sesamový olej a vodu.

Dále mohou farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu obsahovat jedno nebo více stabilizačních činidel, jako jsou například uhlovodany, včetně sorbitolu, manitolu, škrobu, sacharodextrinu a glukosy, proteiny, jako je albumin nebo kasein a pufry jako jsou například alkalické fosfáty.

Vhodnými způsoby podání jsou intramuskulární injekce, podkožní • · · 9

• · · · injekce, intravenosní injekce nebo intraperitoneální injekce, orální a intranasální podání.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález a nijak neomezují jeho rozsah.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. l: Plasmidy a strategie klonování. (1A) Mapy plasmidů MB12n a MB12n/PsA. Oba plasmidy se skládají ze čtyř hlavních fragmentů, obsahujících E. coli udržovací sekvenci (bluescript), gen pro resistenci na blasticidin pod kontrolou Dd promotoru (BSR), klonovací kazetu s Dd promotorem (actl5) a terminátor (2H3) a sekvence pro extrachromosomální expresi v Dictyostelium (G4/D5, G5/D6). MB12n/PsA obsahuje PsA vazebnou sekvenci (tabulka 1) insertovanou do jedinečného BglII místa MB12n. (1B) - diagram klonování JV158. Použité oligonukleotidy jsou označeny horizontálními šipkami, xxx v oligonukleotidu b20aarev ukazuje, že v sekvenci mohou být provedeny substituce pro optimalizaci sekvence pro preferenční kodony Dictyostelium. (lc) - diagram klonování JV10PSA. Všechny oligonukleotidové sekvence jsou uvedeny v tabulce 1.

Obr. 2: Vazebná aktivita přirozených hLH, hCG a jednořetězcového hCG (schCG) produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd) k membránám CHO buněk stabilně exprimujícím lidský LH/CG receptor. Membrány byly inkubovány se ¹²⁵1-značeným hCG za nepřítomnosti nebo za přítomnosti různých koncentrací neznačeného přirozeného hLH, hCG nebo jednořetězcového hCG. Křivky vytěsnění z vazby jsou uvedeny jako procento maximální vazby při každé dávce neznačeného hormonu.

• · • · · ·

Obr. 3: In vitro biologická aktivita přirozeného hLH, hCG a jednořetězcového hCG (schCG) produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd). Extracelulární cAMP byl stanoven specifickou RIA po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský LH/CG receptor.

Obr. 4: In vitro biologická aktivita přirozeného hCG produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd). Produkce luciferasy byla měřena po 4 hodinové inkubaci při 37 °C a po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský LH/CG receptor a reporterový konstrukt.

Obr. 5: In vitro biologická aktivita přirozeného FSH produkovaného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO) nebo Dictyostelium discoideum (Dd). Produkce luciferasy byla měřena po 4 hodinové inkubaci při 37 °C a po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský FSH receptor a reporterový konstrukt.

Obr. 6: In vitro biologická aktivita přirozeného hCG a vybraných mutantních hCG produkovaných v Dictyostelium discoideum (Dd). Produkce luciferasy byla měřena po 4 hodinové inkubaci při 37 °C a po stimulaci CHO buněk stabilně exprimujících lidský LH/CG receptor a reporterový konstrukt.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Vývoj expresních konstruktů

Pro expresi v Dictyostelium byl vybrán mutantní gonadotropin skládající se ze zcela intaktní a-podjednotky navázané přes dekamerní peptid obsahující pět Ser-Gly repetitivních sekvencí na β-řetězec bez jeho C-koncového peptidu.

Byly připraveny dva konstrukty, které se lišily ve vedoucí sekvenci. První z nich obsahoval přirozenou vedoucí sekvenci β-podjednotky hCG. Pro omezení možných problémů při translaci mRNA způsobených přítomností významného množství (přibližně 40% v β-podjednotce hCG) řídce používaných kodonů bylo prvních 30 baží kódující sekvence změněno na preferenční kodony pro Dictyostelium. Při konstrukci druhého konstruktu se předpokládalo, že proteiny účastnící se na sekreci v savčích buňkách v ER a Golgiho aparátu nemusí být mezi druhy konzervované. Pro usnadnění transportu v Dictyostelium byl vedoucí peptid lidské β-podjednotky zaměněn za vedoucí peptid Dictyostelium glykoproteinu, Prespore proteinu A (PsA), který je transportován přes plasmatickou membránu. Tato vedoucí sekvence byla již dříve použita pro expresi secernovaných heterologních proteinů (Dittrich, W. et al., (1994), Bio/Technology 12:

614-618).

Expresní plasmidy byly označeny JV158 (adaptované kodony s vedoucím peptidem β-podjednotky) a JVlOPsA (s vedoucím peptidem PsA) a byly získány z MB12n.

MB12n je 8,25 kb extrachromosomální plasmid v Dictyostelium discoideum (Dd), který obsahuje jedinečné restrikční místo mezi Dd promotorem a terminátorem. MBl2n se skládá z 2,9 kb (Clal-HincII částečného tráveného fragmentu) z pl55dl (Hughes, J.E. et al., (1994), Mol. Cell Biol. 14: 6117-6124) obsahujícího

Dd sekvenci rozpoznávající počátek replikace a dva Dd geny nutné pro replikaci (G4/D5 a G5/D6), 2,95 kb fragmentu z pBluescript (Stratagene) pro propagaci v E. coli, 1,3 kb fragmentu obsahujícího gen pro resistenci na blasticidin mezi Dd Actine 15 promotorem a Dd Actin 8 terminátorem (z pBSR2, Sutoh, K. (1993), Plasmid 30: 150-154) a 1,05 kb klonovací kazety obsahující Dd Actin 15 promotor, jedinečné BglII restrikční místo a Dd 2H3

terminátor (z BS18.2H3, Kumagai, A. et al., (1989), Cell 57:

265-275) . BglII místo v genu pro resistenci na blasticidin bylo odstraněno mutagenesi. Obr. 1A ukazuje relativní pozice těchto složek v MB12n. Plasmid MB12n/PsA obsahuje spojovací sekvenci kódující 19 aminokyselinový PsA vedoucí peptid (Early, E.A. et al., (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 3458-3466; Dittrich, W. et al., (1994), Bio/Technology 12: 614-618) klonovaný do jedinečného BglII místa. Plasmid má jedinečné Ndel místo v 3' části PsA sekvence a jedinečné BglII místo 5' k 2H3 terminátoru, pro usnadnění klonování ve čtecím rámci. BglII místo sousedící s Dd Actin 15 promotorem bylo eliminováno během klonování (viz tabulka 1) .

Za použití primerů b20aarev a alphater (tabulka 1) byl jednořetězcový hCG amplifikován PCR z plasmidu obsahujícího hCG mutant 1 [β-(1-111)-(Ser-Gly)_s-a-(1-92)] (Heikoop, J.C. et al., (1997), Eur. J. Biochem. 245: 656-662). Výsledný fragment byl klonován v MB12n po trávení BglII. Primer b20aarev je navržen pro optimalizaci prvních 10 aminokyselin β-řetězce pro preferenční kodony v Dictyostelium. Stejný templát byl amplifikován s primery bmature (tabulka 1) a alphater za zisku produktu, který byl, po trávení Ndel a BglII, klonován do MB12n/PsA. Výsledné plasmidy byly označeny JSV158 a JV10PSA, v příslušném pořadí (viz obr. 1B a 1C). PCR byla provedena za použití Expand High Fidelity (Boehringer Mannheim) systému, za použití následujících parametrů cyklu: denaturace po dobu 3 minut při 94 °C, potom 25 cyklů o 30 sekundách při 94 °C, 30 sekundách při 37 °C a 60 sekundách při 72 °C. PCR produkty byly separovány gelovou elektroforesou, byly excidovány z gelu a byly přečištěny za použití Qiaex II (qiagen) před restrikčním trávením a klonováním. Všechny DNA sekvence byly analyzovány a potvrzeny dideoxy-sekvenováním.

Tabulka 1: DNA sekvence pro oligonukleotidy a PsA spojovací sekvenci. PsA sekvence také ukazuje sekvenci PsA vedoucí sekvence, stejně jako jedinečná restrikční místa Bglll a Ndel.

Oligo ID: Sekvence

PsA: (Bglll) Ndel Bglll agatcatgaa attccaacat acatttattg catíattatc actattaaca tatgcaaatg cagaíct

MK FQ HT FIALLS LLT YANA b20aarev: gcagatctat ggagatgttc caaggtctcc tccttttatt actcctcagc atgggtggta catgggcatc caag alphater: ccagatctaa acatttaaga tttgtg bmature: gctatcgaca tatgcaaatg catccaagga gccgcttcg

Příklad 2: Exprese jednořetězcového hCG v Dictyostelium

Dictyostelium kmen AX3 byl kultivován do hustoty 2 x 10^e buněk na ml v axenickém mediu před elektroporací. Podmínky elektroporace byly v podstatě stejné, jak byly popsány (Mann, S.K.O. et al., (1994), v: Cell Biology: a Laboratory Handbook,

J.E. Celíš ed., Academie Press, svazek 1, str. 412-452), za použití 1 μg plasmidové DNA pro elektroporací 10⁷ buněk.

Plasmidy JV158 a JV10PSA byly transformovány do Dictyostelium, stejně jako MB12n kontrolní plasmid. Po elektroporací byly buňky z jedné kyvety umístěny na 10 cm plotnu. 12 hodin po elektroporací byl přidán blasticidin v konečné koncentraci 5 ^g/ml. 24hodin po elektroporací bylo medium obsahující mrtvé buňky aspirováno, buňky byly re suspendovány pipetováním ve mediu obsahujícím blasticidin a byly rozděleny do 24 jamek v 96-jamkové » 0 • * • · • · · · « · mikrotitrační plotně. 24 jamek bylo ředěno sériově 10-, 100- a 1000-krát. Medium obsahující blasticidin bylo vyměňováno každé 3 dny. Pozitivní jamky byly identifikovány 5-9 dnů po umístění na plotnu a transformační účinnost byla hodnocena ze sériového ředění. Obvykle bylo získáno mezi 1 x 10⁴ a 6 x 10⁴ kolonií na ptg DNA. Jednotlivé jamky byly potom vybrány pro další pokusy. Jedna jamka obsahovala 200 μΐ media, což je dostatečné množství pro DELFIA^r hLH test, který má 100% zkříženou reaktivitu s hCG. Test je založen na přímé sandwichové technice, ve které jsou monoklonální protilátky zaměřené proti specifickému antigenu na β-podjednotce imobilizovány. Po vazbě intaktního (jednořetězcového) hCG na protilátku na pevné fázi se navážou a kvantifikují europiem značené protilátky proti specifickému antigennímu místu na α-podjednotce. Test se provede podle návodu výrobce (Wallac Oy, Turku, Finland).

Výsledky jasně ukazují, že imunologicky aktivní jednořetězcový hCG je produkován z obou expresních konstruktů a nikoliv z kontrolního plasmidu. Kromě toho, množství jednořetězcového hCG produkované z JV158 (267 mU/ml) se zdá být významně vyšší než množství produkované z JV10PSA (4,9 mU/ml), což naznačuje, že v tomto případě je lidský S-hCG vedoucí peptid účinější než Dictyostelium vedoucí peptid z PsA.

Kinetiky produkce jednořetězcového hCG byly studovány pro buňky transformované JV158. Různé hustoty transformovaných buněk byly umístěny na plotny v axenickém mediu, byly kultivovány do konfluence a takto byly udržovány po dobu několika dnů, bez jakékoliv výměny media. Alikvoty media byly odebírány každých 24 hodin a byly provedena jejich analýza na přítomnost jednořetězcového hCG. Úroveň exprese dosáhla maxima 4 až 5 dnů poté, co buňky dosáhly konfluence (data nejsou uvedena). Protože buňky se začínají odlučovat od plotny přibližně 6-7 dnů po • b dosažení konfluence, je medium sklízeno v den 5 po dosažení konfluence.

Příklad 3: Aktivita jednořetězcového hCG exprimovaného v Dictyostelium

Schopnost vazby jednořetězcového hCG z Dictyostelium na lidský LH/CG receptor byla stanovena testem kompetitivní vazby s heterodimerním hCG. CHO buňky exprimující lidský LH/CG receptor (Jia, X.-C. et al. (1991), Mol. Endocrinol. 5: 759-768) byly simultáně inkubovány se ^12sI-hCG a přečištěným materiálem ze supernatantu buněčné kultury Dictyostelium.

Vazebná aktivita k receptoru pro přečištěný jednořetězcový hCG byla kvantifikována testem vytěsnění radioaktivně značeného ligandu z receptoru na membránových frakcích izolovaných z exponenciálně rostoucích buněk. V celkovém objemu 0,5 ml pufru (konečné složení 10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, 0,1% hovězí sérový albumin, pH 7,4) bylo fixní množství membránového proteinu indukováno se ^:L2sI-hCG (20000 cpm, přibližně 12 pM) a stoupajícím množstvím kompetičního proteinu po dobu 18 hodin při teplotě okolí. ¹²⁵I-značený hCG (NEX-106) byl získán od DuPont de Nemours. Specifická vazba byla 10-12% celkové přidané radioaktivity. Po inkubaci byly navázané a volné hormony separovány centrifugováním. Vysoce přečištěné rekombinantní gonadotropiny byly použity jako standardy.

Pro přečištění hCG z buněčné kultury Dictyostelium bylo z velkých (22x22 cm) kultivačních ploten odebráno medium.

Přečištění bylo provedeno za použití programovatelného FPLC systému (Pharmacia, Roosendaal, The Netherlands) za použití kontrolního a chromatografického supervizního systému UNICORN (Pharmacia, Roosendaal, The Netherlands). Přečištění • · • * · « · · jednořetězcového hCG bylo provedeno za použití kombinace hydrofobní interakce a imunochromatografie s monoklonálními protilátkami specifickými pro LH/CG β-podjednotku. Pro tento účel bylo připraveno 150 ml media s koncentrací jednořetězcového hCG 0,372 jednotek/ml podle DELFIA^R. Za použití tohoto media byly získány přibližně 3 jednotky přečištěného jednořetězcového hCG (přibližně 5% výtěžek). Všechny postupy byly provedeny při 4 °C.

Současná inkubace s různými koncentracemi přirozeného hCG, přirozeného hLG nebo jednořetězcového hCG vytěsňovala ^12sI-hCG z vazby způsobem závislým na dávce (obr. 2). Křivky ukazují, že materiál produkovaný v Dictyostelium je schopen vazby na lidský LH/CG receptor. Afinita pro receptor je srovnatelná s afinitou jednořetězcového hCG produkovaného v CHO buňkách, o kterém bylo prokázáno, že je významně méně účinný ve vytěsnění ¹²⁵I-hCG z vazby než heterodimer hCG. Proto se zdá, že neexistují významné rozdíly ve vazebné kapacitě mezi jednořetězcovým hCG produkovaným v Dictyostelium ve srovnání s jednořetězcovým hCG produkovaným v CHO buňkách.

Biologická aktivita jednořetězcového hCG z Dictyostelium byla analyzována stanovením jeho schopnosti stimulovat produkci cAMP v CHO buňkách exprimujících lidský LH/CG receptor. Buňky byly inkubovány po dobu 4 hodin se stoupajícími koncentracemi hormonu za přítomnosti 0,1 mM 3-isobutyl-l-methylxantinu. Extracelulární cAMP byl stanoven RIA (Immunotech).

Výsledky ukazují, že jednořetězcový hCG produkovaný v Dictyostelium je schopen aktivace lidského LH/CG receptoru, což vede k produkci cAMP. Byl zjištěn pouze malý rozdíl v účinnosti mezi jednořetězcovým hCG produkovaným v Dictyostelium a materiálem produkovaným v CHO buňkách (IC hodnota přibližně 5-krát nižší).

•I *·»

Příklad 4: Exprese a biologická aktivita heterodimerního hCG v Dictyostelium

Pokusili jsme se o expresi heterodimerního hCG v Dictyostelium. Pro expresi a- a β-podjednotky byly vytvořeny dva plasmidy. Jejich struktura a celková organisace jsou v podstatě stejné se strukturou a organisací MB12n, který byl popsán v příkladu 1. Pro usnadnění exprese dvou nezávislých plasmidů v Dd jsme nahradily kazetu resistence na blasticidin v MBl2n 2,4 kb KpnI-Xbal fragmentem z pl55dl (Hughes, J.E. et al., (1994), Mol.

Cell Biol. 14: 6117-6124), který obsahuje neomycinovou kazetu, čímž jsme získali MB12neo. Pro konstrukci expresního vektoru pro a-podjednotku byla její přirozená cDNA sekvence produkovaná pomocí PCR za použití primerů, které vkládají BglII restrikční místo jak na 5'-konec, tak na 3 '-konec fragmentu, takže tento fragment může být klonován do MB12neo. Pro konstrukci expresního vektoru pro β-podjednotku hCG byl MB12n modifikován tak, aby obsahoval jiné jedinečné restrikční místo (Sphl) 3' v BglII klonovacím místu (viz příklad 1) . cDNA pro β-podj ednotku hCG byla amplifikována za použití 5'-primeru, což vedlo k alteraci prvních 30 baží kódující sekvence tak, že byly tvořeny preferenčními kodony pro Dictyostelium (viz příklad 1). Primery také vkládaly vhodná restrikční místa jak na 5' konec (BglII), tak na 3' konec (Sphl) fragmentu, což usnadnilo přímé klonování.

Dva expresní plasmidy byly transformovány simultáně do Dictyostelium. Po transformaci byly buňky umístěny na plotny pro klonální ředění. Klonální transformanty byly potom selektovány a byly dále kultivovány pro analýzu. Množství hCG secernovaného Dictyostelium bylo stanoveno podle návodu výrobce Delfia^R hLH testu (Wallac Oy, Turku, Finland), který má 100% zkříženou reaktivitu s hCG. Výsledky jasně ukazují, že imunologicky aktivní hCG je produkován v Dictyostelium.

• ···· ·» *

·· • · ··

A · «

Φ • β

ΦΦΦ· ·»

Ačkoliv byla přítomnost heterodimerního hCG demonstrována v mediu pomocí detekce epitopů, byly nutné další pokusy pro stanovení toho, zda je hCG produkovaný v Dictyostelium biologicky aktivní. Kvantifikace byla založena na imunoreaktivitě.

Biologická aktivita heterodimerního hCG z Dictyostelium byla analyzována vyšetřením jeho schopnosti aktivovat lidský LH/CG receptor v luciferasovém testu. Výsledky ukazují, že heterodimerní hCG produkovaný v Dictyostelium je schopen aktivovat lidský LH/CG receptor (obr. 4). Kromě toho, jeho biologická aktivita je srovnatelná (hodnota IC_so přibližně dvakrát vyšší) s biologickou aktivitou přirozeného hCG produkovaného v CHO buňkách.

Příklad 5: Exprese a biologická aktivita heterodimerního FSH v Dictyostelium

Pro výzkum toho, zda je Dictyostelium také schopno produkovat jiné komplexní glykoproteinové hormony, jsme studovali produkci FSH v tomto organismu. Stejným způsobem jako pro hCG (příklad 4) jsme připravili dva expresní plasmidy. Pro konstrukci expresního vektoru pro β-podjednotku FSH byla cDNA amplifikována za použití 5'-primeru, což vedlo k alteraci prvních 27 baží kódující sekvence tak, že byly vytvořeny preferenčními kodony pro Dictyostelium a klonování bylo potom provedeno způsobem popsaným pro β-podjednotku hCG. Po transformaci Dictyostelium byly buňky umístěny na plotny pro klonální ředění. Klonální transformanty byly potom selektovány a byly dále kultivovány pro analýzu.

Množství FSH secernované Dictyostelium bylo stanoveno sandwichovým imunotestem (SS-artikel). Výsledky ukazují, že v Dictyostelium je produkován imunologicky aktivní FSH. Kromě toho, heterodimerní FSH produkovaný v Dictyostelium je také schopný aktivovat lidský FSH receptor (obr. 5).

• · · · • · • · ···· ·· ·· ··· ·· ··

Příklad 6: Náhodná mutagenese vybraného regionu hCG v Dictyostelium

Protože jsme ukázali, že Dictyostelium je schopno produkovat biologicky aktivní gonadotropiny, bylo naším dalším cílem vyvinout postup pro náhodnou mutagenesi. Pro tento účel jsme vybrali dvě aminokyseliny v determinantní smyčce hCG, o kterých bylo prokázáno, že se účastní vazby na receptor a přenosu signálu.

Specifické substituce baží byly vloženy místně cílenou mutagenesi a kombinování PCR fragmentů s překrývajícími se sekvencemi, za standardních podmínek PCR. Primery byly navrženy tak, aby měnily aminokyseliny 94 a 95 v β-podjednotce hCG. První dva nukleotidy obou kodonů byly měněny zcela náhodně (A, C, T nebo G) , zatímco třetí baze byla omezena na G nebo T pro minimalizaci procenta vložených stop-kodonů. PCR fragmenty byly separovány a byly subklonovány v pCR^R2.1 (Invitrogen), Leek, The Netherlands). Primery byly vybrány tak, že subklonované PCR fragmenty obsahovaly BglII místo na 5'-konci a Sphl místo na 3'-konci. Po PCR a klonování byl soubor pCR^R2.1 konstruktů transformován do E. coli. Potom byla ze souboru 200 transformantů izolována DNA a po restrikčním trávení BglII/Sphl byly mutované fragmenty subklonovány do MB12n, který obsahoval BglII a Sphl místo. Po umístění E. coli transformovaných plasmidy MB12 obsahujícími náhodně mutované fragmenty na plotny bylo získáno 400 kolonií a byla připravena DNA.

Dictyostelium byly transformovány simultáně expresním pro α-podjednotku pomocí elektroporace. Selekce blasticidinem (10 ^g/ml) byla provedena 5 hodin po elektroporaci. Další den byly buňky klonálně ředěny v 96-jamkových plotnách za použití 4-násobných ředění a byla zahájena selekce neomycinem (10 /xg/ml) .

• ·

Medium bylo vyměňováno každé 3-4 dny za zachování selekčních podmínek. Pozitivní jamky byly identifikovány 11-14 dní po elektroporaci a účinnost transformace byla stanovena ze sériových ředění. Obvykle bylo získáno 500 transformantů při elektroporaci 10⁷ buněk 1 μ<3 jak hCGa, tak hCGS vektorů. Jedna jamka obsahovala 200 μΐ media. Větší množství media pro přečištění bylo získáno z větších (22 x 22 cm)kultivačních ploten.

Supernatanty 85 klonů Dictyostelium byly analyzovány na přítomnost imunoaktivity a biologické aktivity. Pro kontrolu bylo na 96-jamkové plotně přítomno několik klonů produkujících přirozený hCG a několik netransformovaných Dictyostelium klonů. Koncentrace přirozeného a mutantního hCG byly stanoveny za použití DELFIE^R hLH testu (Wallac Oy, Turku, Finland), který má 100% zkříženou reaktivitu s hCG. Potom byla stanovena in vitro biologická aktivita na lidském LH/CG receptoru. Polovina z 85 analyzovaných mutantů měla B/I poměry od 0,35 do 1,05. Při započítání variací 2 samostatných analýz může být považována aktivita těchto mutantů za srovnatelnou s aktivitou přirozeného hCG. Přibližně 40% těchto mutantů mělo snížený poměr B/I. Toto bylo předpokládáno, protože bylo prokázáno, že mutované aminokyseliny 94 a 95 se účastní vazby na receptor a jeho aktivace. Skutečnost, že 11 klonů nevykazovalo žádnou produkci hCG je pravděpodobně způsobena interferencí alterovaných aminokyselin se správným skládáním mutovaného β-polypeptidu a/nebo interferencí s asociací s α-podjednotkou nebo skutečností, že ne všechny klony obsahuj i expresní konstrukty pro a- i β-podjednotku. Dvanáct klonů s různými poměry B/I bylo vybráno pro podrobnou analýzu.

Vybrané klony byly dále kultivovány na 6-jamkových plotnách do dosažení konfluence a supernatanty buněčných kultur byly odebírány po dalších 4 dnech, 4 z 20 klonů neprodukovaly žádný • · • · detekovatelný hCG. Toto odpovídá výsledkům získaným pro tyto klony v počátečním skríningu. V dalších klonech se množství produkovaného hCG významně lišilo (116-2118 mU/ml). Supernatanty buněčných kultur byly analyzovány na přítomnost in vitro biologické aktivity hCG při různých koncentracích. Všechny mutanty, které vykazovaly B/I poměry v rozmezí poměrů pro přirozený hCG v počátečním vyšetření vykazovaly také biologickou aktivitu přirozeného hCG při podrobnějším vyšetření. 4 supernatanty, které nevykazovaly žádnou imunologickou aktivitu, nebyly také schopny aktivovat LH/CG receptor. Proto jsme usoudili, že tyto klony neprodukují žádný hCG. Dále, všechny mutanty se sníženým poměrem B/I v počátečním vyšetření měly také sníženou hodnotu IC . Jejich poměry B/I se pohybovaly v rozsahu od 2-krát až > 100-krát nižších hodnot než pro přirozený hCG produkovaný v Dictyostelium. Křivky dávka/odpověď pro osm mutantů jsou uvedeny na obr. 6.

Pro korelaci pozorovaných biologických aktivit s mutacemi přítomnými v β-podjednotce byly mutované expresní vektory sekvenovány. Izolovali jsme celkovou DNA z vybraných Dictyostelium klonů a transformovali jsme jí do E. coli. Pro každý Dictyostelium klon bylo mnoho transformantů analyzováno PCR pro kolonie na přítomnost plasmidů pro α-podjednotku nebo plasmidů pro β-podjednotku. Potom byla DNA izolována z několika transformantů obsahujících plasmid pro β-podjednotku a byla provedena analýza sekvence mutovaných regionů za použití automatizovaného sekvenátoru (Pharmacia) .

Bylo zjištěno, že většina Dictyostelium klonů obsahuje pouze jeden typ mutace v hCGfi expresním vektoru. Tyto klony produkovaly jeden typ mutantu. Kromě toho jsme zjistili, že většina analyzovaných klonů Dictyostelium obsahuje nepříbuzné sekvence v pozicích 64 a 95 β-pod jednotky, což ukazuje na to, že mutagenese • · ··· · · ‘ ···· ···· · ♦ · · · · • * ··· · ··· ·· · ····· ····· ···· ·· ·· ··· ·· ·· byla náhodná.

Příklad 7: Hmotnostní spektrometrická analýza rechCG z Dictyostelium discoideum

Rekombinantní hCG, produkovaný v Dictyostelium, byl izolován ze supernatantu kultur pomocí postupného provedení chromatografie využívající hydrofobní interakce a imunochromatografie s MoAb 119A, které reaguje s epitopem společným pro LH a hCG. Protilátka byla imobilizována na NHS-Sepharose. Kyselinou eluovaný, přečištěný rec hCG byl dialyzován proti 50% acetonitrilu a byl dialyzován. Protein byl rozpuštěn v 0,1% TFA a hmotnostní spektrální analýza byla provedena MALDI-TOF využívající superDHB jako matrici. Čistý rec hCG produkovaný CHO buňkami a izolovaným stejným způsobem přečištění byl použit jako standard.

Jak o?-, tak β-podj ednotky v materiálu z Dictyostelium měly nižší molekulovou hmotnost než příslušné podjednotky z CHO buněk, s mediány píků 11578 a 17351 D pro podjednotky produkované v Dictyostelium a 14013 a 23284 D pro polypeptidy produkované v CHO buňkách. Tato skutečnost naznačuje, že hormon produkovaný v Dictyostelium obsahuje méně a/nebo kratší karbohydratové řetězce. Kromě toho, šířka píků příslušných podjednotek se významně lišila, t.j. 11110-12452 D (1342 D) pro Dictyostelium a- vs. 12959-15591 D (2632 D) pro CHO a- řetězec a 17006-18104 D (1098 D) pro Dictyostelium β vs. 20674-25208 D (4534 D) pro CHO β-řetězec. Tyto skutečnost naznačuje, že glykosylace materiálu produkovaného v Dictyostelium je mnohem méně komplexní.

• · ··· · · ' ···· ···· · · · ·· · * · ·

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Akzo Nobel N.V.

(B) Ulice: Velperweg 76 (C) Město: Arnhem (E) Stát: Nizozemí (F) Poštovní kod (ZIP): 6824 BM (G) Telefon: 0412 666379 (H) Telefax: 0412 650592 (ii) Název vynálezu: Gonadotropiny získané expresí v Dictyostelium (iii) Počet sekvencí: 5 (v) Počítačová čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verse #1.30 (EPO) (2) Informace pro SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 67 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Jméno/klíč: CDS (B) Umístění: 6...62 (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 1:

AGATC ATG AAA TTC CAA CAT ACA TTT ATT GCA TTA TTA TCA CTA TTA Met Lys Phe Gin His Thr Phe Ile Ala Leu Leu Ser Leu Leu

5 10

ACA TAT GCA AAT GCA GATCT

Thr Tyr Ala Asn Ala • · (2) Informace pro SEQ ID NO: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 19 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 2:

Met Lys Phe Gin His Thr Phe Ile Ala Leu. Leu Ser Leu Leu Thr Tyr ¹ 5 10 15

Ala Asn Ala (2) Informace pro SEQ ID NO: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 74 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 3:

GCAGATCTAT GGAGATGTTC CAAGGTCTCC TCCTTTTATT ACTCCTCAGC ATGGGTGGTA 60

CATGGGCATC CAAG ⁷⁴ (2) Informace pro SEQ ID NO: 4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 26 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA • · ·· ·· ·· · · · · « · · · · * ·*·· ···· · · · · · · * · · • · ··· · ··· ► · · (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 4:

CCAGATCTAA ACATTTAAGA TTTGTG (2) Informace pro SEQ ID NO: 5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 39 párů basí (B) Typ: nukleová kyselina (C) Řetězec: jednoduchý (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence:SEQ ID NO: 5:

GCTATCGACA TATGCAAATG CATCCAAGGA GCCGCTTCG

Claims (7)

1. I? a. t θ η t θ ν θ η a :r ο A y

   1. Gonadotropin nebo jeho mutant získaný heterologní expresí v Dictyostelium hostiteli.
2. 2. Mutantní gonadotropin podle nároku 1, jehož podjednotky jsou kovalentně navázané.
3. 3. Gonadotropin podle nároku l nebo 2 pro terapeutické použití.
4. 4. Gonadotropin podle jakéhokoliv z nároků 1-3, kde uvedeným gonadotropinem je hCG nebo FSH.
5. 5. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje gonadotropin podle nároku 1 nebo 2 a farmaceuticky přijatelný nosič.
6. 6. Způsob přípravy gonadotropinu nebo jeho mutantu vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

   - transformaci kmene Dictyostelium rekombinantním plasmidovým vektorem obsahujícím DNA sekvenci kódující geny nebo mutované geny pro gonadotropiny pod kontrolou Dictyostelium regulačních sekvencí;

   - kultivaci rekombinantního kmene za podmínek umožňujících expresi uvedené DNA sekvence; a

   - izolaci exprimovaného proteinu.
7. 7. Způsob selekce mutantních gonadotropinů se superagonistickou nebo antagonistickou aktivitou vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

   - náhodnou mutagenesi genů pro gonadotropiny;

   - inserci mutovaných genů do plasmidového vektoru pro

   Dictyostelium;

   • ·

   - transformaci kmene Dictyostelium uvedeným rekombinantním plasmidovým vektorem;

   - kultivaci klonů za podmínek umožňujících expresi DNA sekvence;

   - určení poměru vazba na receptor/přenos signálu pro exprimovaný protein; a

   - izolaci klonů s poměrem, který se liší od poměru určeného pro přirozené gonadotropiny.