CZ2000978A3

CZ2000978A3 - Hepatitis B Virus Polypeptides

Info

Publication number: CZ2000978A3
Application number: CZ2000978A
Authority: CZ
Inventors: Steven Neville Chatfield
Original assignee: Medeva Europe Limited
Priority date: 1997-09-19
Filing date: 1998-09-21
Publication date: 2001-01-17
Also published as: US20040258709A1; CA2304255A1; HUP0003511A3; NO20001397D0; PL339366A1; KR20010024176A; AU751646B2; NO20001397L; GB9720033D0; JP2001517447A; CZ297131B6; PL195242B1; DE69814884T2; EP1015593B1; WO1999015671A1; EP1015593A1; KR100637282B1; HUP0003511A2; DE69814884D1; AU9174498A

Abstract

The present invention provides a polypeptide comprising tetanus toxin fragment C, or a fragment thereof, fused to the pre-S1 region of hepatitis B virus (HBV), or a fragment thereof, and/or the pre-S2 region of HBV or a fragment thereof. It also provides vaccine compositions comprising the polypeptide of the invention.

Description

Oblast technikyTechnical area

Poskytnutý vynález se vztahuje k odvozených z povrchového antigenu viru použití ve vakcinových přípravcích.The present invention relates to virus surface antigen-derived antigens for use in vaccine formulations.

Dosavadní stav technikyState of the art

Infekce hepatitidou B a následné zahrnují chronickou jaterní nemoc, cirhosu a hepatocelulární karcinom představují velký zdravotní problém na celém světě. Systematická vakcinace jednotlivců s nebezpečím virové expozice představuje hlavní způsob kontoly infekce. První vakcína proti viru hepatitidy B (HBV) byla připravena čistěním a inaktivací povrchového antigenu HBV (HBsAg), získaného z plasmy chronických nositelů. Tento postup byl brzy následován přípravou HBsAg za použití technik rekombinantní DNA. Nicméně u významné části jedinců nedochází k zahájení tvorby protilátek vůči HBsAg přítomnému ve vakcinových přípravcích. Předpokládá se, že tito jedinci zůstávají citliví na infekci HBV.Hepatitis B infection and its sequelae, including chronic liver disease, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma, represent a major health problem worldwide. Routine vaccination of individuals at risk of viral exposure is the main method of infection control. The first hepatitis B virus (HBV) vaccine was prepared by purifying and inactivating HBV surface antigen (HBsAg) obtained from the plasma of chronic carriers. This procedure was soon followed by the preparation of HBsAg using recombinant DNA techniques. However, a significant proportion of individuals do not develop antibodies to the HBsAg present in vaccine preparations. It is believed that these individuals remain susceptible to HBV infection.

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Vynález poskytuje polypeptid obsahující fragment C tetanového toxinu nebo jeho fragment, fúzovaný s oblastí pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) nebo jeho fragmentem, a/nebo s jeho oblastí pre-S2 nebo jeho fragmentem.The invention provides a polypeptide comprising a tetanus toxin C fragment or a fragment thereof, fused to a hepatitis B virus (HBV) pre-S1 region or a fragment thereof, and/or to a pre-S2 region or a fragment thereof.

Výhodně fragment oblasti pre-Sl a oblasti pre-S2 obsahuje nejméně 5 aminokyselin, výhodněji nejméně 6 aminokyselin a nejvýhodněji 10, 15 nebo 20 aminokyseLin.Preferably, the fragment of the pre-S1 region and the pre-S2 region comprises at least 5 amino acids, more preferably at least 6 amino acids, and most preferably 10, 15 or 20 amino acids.

• 9 · 9 9 • «9 · • 9 9 9 · 9 · • 9 9 ·• 9 · 9 9 • «9 · • 9 9 9 · 9 · • 9 9 ·

Fragment C tetanového toxinu nebo jeho fragment se může fúzovat s oblastí pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) nebo jejím fragmentem, nebo s oblastí pre-S2 HBV nebo jejím fragmentem, cestou zavěšení spojovací oblasti. Obdobně jestliže jsou přítomny jak fragment oblasti pre-Sl, tak fragment oblasti pre-S2, lze je spojit dohromady cestou zavěšení spojovací oblasti.The tetanus toxin C fragment or a fragment thereof can be fused to the hepatitis B virus (HBV) pre-S1 region or a fragment thereof, or to the HBV pre-S2 region or a fragment thereof, by way of a hinged linker region. Similarly, if both a pre-S1 region fragment and a pre-S2 region fragment are present, they can be joined together by way of a hinged linker region.

Vynález dále poskytuje kódování polynukleotid kódující pro polypeptid podle tohoto vynálezu.The invention further provides a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention.

Vynález rovněž poskytuje vektory obsahující polynukleotid kódující pro polypeptid podle vynálezu řízené spojené s regulační sekvencí. Regulační sekvence výhodně umožňuje expresi polypeptidu v buňce hostitele. Hostitelskou buňkou je typicky bakterie, která může být oslabena, nebo buňka zvířecí, výhodněji savčí, včetně buňky primátů a lidské.The invention also provides vectors comprising a polynucleotide encoding a polypeptide of the invention controlled by a regulatory sequence. The regulatory sequence preferably allows expression of the polypeptide in a host cell. The host cell is typically a bacterium, which may be attenuated, or an animal cell, more preferably a mammalian cell, including a primate cell and a human cell.

Polypeptidy, polynukleotidy a vektory a hostitelské buňky podle tohoto vynálezu se mohou použít v prevenci nebo léčbě infekcí virem hepatitidy B. Takto je dalším aspektem vynálezu poskytnutí vakcínových přípravků, obsahujících polypeptidy, polynukleotidy nebo vektory podle tohoto vynálezu spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Vakcinové přípravky mohou obsahovat oslabenou bakterii přeměněnou polynukleotidem podle tohoto vynálezu. Může být preferováno použití polypeptidů podle vynálezu v kombinaci s aktivními složkami jiných HBV vakcínových přípravků, aby se zvýšila jejich účinnost. Takto vakcinový přípravek podle tohoto vynálezu výhodně dále obsahuje například polypeptidové složky HBV vakciny, popsané ve W 0 88/10301 (to jest S,S+pre-S2 a S+ aminokyseliny 20 až 47 pre-Sl antigenní složky jak subtypů adw, tak ayw).The polypeptides, polynucleotides and vectors and host cells of the present invention may be used in the prevention or treatment of hepatitis B virus infections. Thus, a further aspect of the invention is to provide vaccine compositions comprising the polypeptides, polynucleotides or vectors of the present invention together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent. The vaccine compositions may comprise an attenuated bacterium transformed with a polynucleotide of the present invention. It may be preferred to use the polypeptides of the present invention in combination with the active ingredients of other HBV vaccine compositions to enhance their efficacy. Thus, the vaccine composition of the present invention preferably further comprises, for example, the polypeptide components of the HBV vaccine described in WO 88/10301 (i.e. S, S+pre-S2 and S+ amino acids 20 to 47 of the pre-S1 antigenic component of both the adw and ayw subtypes).

Vynález rovněž poskytuje způsob léčby nebo prevence • 4The invention also provides a method of treating or preventing • 4

· · · · · · • 4 44 infekce HBV u lidí nebo zvířat, zahrnující podávání účinného množství polypeptidu, polynukleotidu nebo vektoru vynálezu lidem nebo zvířatům.· · · · · · • 4 44 HBV infection in humans or animals, comprising administering to the humans or animals an effective amount of a polypeptide, polynucleotide or vector of the invention.

Polypeptidy podle tohoto vynálezu mohou být rovněž použity k indukci protilátkové odpovědi u zvířat za účelem produkce protilátek, které rozpoznají epitopy v rámci oblastí pre-Sl a/nebo pre-S2 HBV. Tímto vynález poskytuje způsob produkce protilátek, které rozpoznají epitopy v rámci oblastí pre-Sl a/nebo pre-S2 HBV, který zahrnuje podání polypeptidu, polynukleotidu nebo vektoru podle vynálezu savci. Vzniklé protilátky mohou být polyklonální nebo monoklonální protilátky nebo jejich fragmenty. Tyto protilátky mohou být použity jako způsob léčby HBV infekce u lidí nebo zvířat.The polypeptides of the invention can also be used to induce an antibody response in animals to produce antibodies that recognize epitopes within the pre-S1 and/or pre-S2 regions of HBV. The invention thus provides a method for producing antibodies that recognize epitopes within the pre-S1 and/or pre-S2 regions of HBV, which comprises administering a polypeptide, polynucleotide or vector of the invention to a mammal. The antibodies produced can be polyclonal or monoclonal antibodies or fragments thereof. These antibodies can be used as a method for treating HBV infection in humans or animals.

Kromě potenciálního léčebného použití polypeptidů, polynukleotidů, vektorů a protilátek podle vynálezu, tyto mohou být rovněž použity jako nástroj určení například antigenních determinant v rámci oblastí pre-Sl a/nebo pre-S2 HBV povrchového antigenu (HBsAg). Lze se důvodně domnívat, že obě oblasti hrají významnou roli ve zvětšení anti-HBsAg odpovědí, které zabraňují nasednutí viru na hepatocyty a vyvolávají protilátky, které jsou účinné při odstranění virů, zvýšení buněčné imunitní odpovědi a obejití genetické absence odpovědi na samotnou S oblast.In addition to the potential therapeutic use of the polypeptides, polynucleotides, vectors and antibodies of the invention, they can also be used as a tool to determine, for example, antigenic determinants within the pre-S1 and/or pre-S2 regions of the HBV surface antigen (HBsAg). It is reasonable to believe that both regions play a significant role in enhancing anti-HBsAg responses that prevent viral attachment to hepatocytes and elicit antibodies that are effective in clearing viruses, enhancing cellular immune responses and bypassing the genetic lack of response to the S region itself.

Podrobný popis vynálezuDetailed description of the invention

A. PolypeptidyA. Polypeptides

Polypeptidy podle tohoto vynálezu zahrnují fragment C tetanového toxinu nebo epitop obsahující tento fragment fúzovaný s fragmentem oblasti pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) a/nebo s fragmentem oblasti pre-S2 HBV.The polypeptides of the invention include a tetanus toxin C fragment or an epitope comprising this fragment fused to a hepatitis B virus (HBV) pre-S1 region fragment and/or a HBV pre-S2 region fragment.

Strukturní gen tetanového toxinu byl klonován a secerován [Fairweather a kol., J.Bacteriol., 165, 21 - 27 (1986)]. Fragment C je 50kDa polypeptid vytvořený štěpením papainem a obsahující nebo zásadně odpovídající 451 aminokyselinám na C konci řetězce. Fragmenty C fragmentu tetanového toxinu, které obsahují epitopy mohou být rovněž použity v polypeptidech podle tohoto vynálezu. Tyto fragmenty budou obsahovat nejméně 5 nebo 6 aminokyselin, výhodně nejméně 10 aminokyselin a výhodněji nejméně 15, 20, 50 nebo 100 aminokyselin. Zvláště výhodné fragmenty obsahují aminokyseliny od 80 do 180, což je vyhovující epitop B-buněk a aminokyseliny asi od 83 do 103 a od 409 do 420, což jsou vyhovující epitopy T-buněk (počítání vychází z toho, že aminokyselina 1 fragmentu C je aminokyselina 864 celého tetanového toxinu).The tetanus toxin structural gene has been cloned and secreted [Fairweather et al., J. Bacteriol., 165, 21-27 (1986)]. Fragment C is a 50 kDa polypeptide produced by papain digestion and containing or substantially corresponding to 451 amino acids at the C terminus of the chain. Fragments of the tetanus toxin fragment C which contain epitopes can also be used in the polypeptides of the present invention. Such fragments will contain at least 5 or 6 amino acids, preferably at least 10 amino acids and more preferably at least 15, 20, 50 or 100 amino acids. Particularly preferred fragments contain amino acids from 80 to 180, which is a suitable B-cell epitope, and amino acids from about 83 to 103 and from 409 to 420, which are suitable T-cell epitopes (counting based on amino acid 1 of fragment C being amino acid 864 of the whole tetanus toxin).

Výhodně fragment oblasti pre-Sl a oblasti pre-S2 obsahuje nejméně 5 aminokyselin, výhodněji nejméně 6 aminokyselin a nejvýhodněji 10, 15 nebo 20 aminokyselin. Fragment může například obsahovat aminokyseliny od 1 do 19, od 20 do 39, od 40 do 59, od 60 do 79, od 80 do 99, nebo od 100 do 119 pre-Sl nebo od 1 do 19, od 20 do 39 nebo od 40 do 55 pre-S2. Vhodné fragmenty, které se mohou použít v polypeptidech podle tohoto vynálezu, jsou popsány v příkladech. Zvláště výhodné fragmenty obsahují aminokyseliny 20 nebo 21 až 47 pre-Sl (místo vážící hepatocyty) a aminokyseliny 1 až 26 a 14 až 32 pre-S2.Preferably, the fragment of the pre-S1 region and the pre-S2 region comprises at least 5 amino acids, more preferably at least 6 amino acids and most preferably 10, 15 or 20 amino acids. For example, the fragment may comprise amino acids 1 to 19, 20 to 39, 40 to 59, 60 to 79, 80 to 99, or 100 to 119 of pre-S1 or 1 to 19, 20 to 39 or 40 to 55 of pre-S2. Suitable fragments which may be used in the polypeptides of the invention are described in the examples. Particularly preferred fragments comprise amino acids 20 or 21 to 47 of pre-S1 (hepatocyte binding site) and amino acids 1 to 26 and 14 to 32 of pre-S2.

Dále sekvence aminokyselin fragmentu C tetanového toxinu a fragmentů oblastí pre-Sl a pre-S2 lze modifikovat, aby poskytly polypeptidy podle vynálezu. Například to lze provést, aby se zvýšila imunogenicita polypeptidů podle vynálezu. Substituce aminokyselin může být provedena například od 1, 2 nebo 3 do 10, 20 nebo 30 substituci za předpokladu, že modifikované polypeptidy si ponechajíFurthermore, the amino acid sequences of the tetanus toxin fragment C and the fragments of the pre-S1 and pre-S2 regions can be modified to provide polypeptides of the invention. For example, this can be done to increase the immunogenicity of the polypeptides of the invention. The amino acid substitutions can be made, for example, from 1, 2 or 3 to 10, 20 or 30 substitutions, provided that the modified polypeptides retain

epitopy.epitopes.

Konzervativní substituce lze provést například podle tabulky uvedené níže. Aminokyseliny ve stejné části ve druhém sloupci a výhodně ve stejné řádce ve třetím sloupci se mohou nahradit jedna za druhou:Conservative substitutions can be made, for example, according to the table below. Amino acids in the same part in the second column and preferably in the same row in the third column can be replaced one after the other:

i ri r

I II I

ALIFATICKÉ | Nepolární |ALIPHATIC | Non-polar |

Polární - bez náboje|Polar - without charge|

Polární - s nábojemPolar - with charge

AROMATICKÉAROMATIC

GAPGAP

I L V —I L V —

C S T MC S T M

N QN Q

D ED E

K RK R

H F W YH F W Y

Fragment C tetanového toxinu může být fúzován s fragmentem oblasti pre-Sl viru hepatitidy B (HBV) nebo s fragmentem oblasti pre-S2 HBV cestou zavěšení spojovací oblasti. Obdobně jestliže jsou přítomny jak fragment oblasti pre-Sl, tak fragment oblasti pre-S2, lze je spojit dohromady cestou zavěšení spojovací oblasti.The tetanus toxin C fragment can be fused to a hepatitis B virus (HBV) pre-S1 region fragment or to a HBV pre-S2 region fragment via a hinged linker region. Similarly, if both a pre-S1 region fragment and a pre-S2 region fragment are present, they can be joined together via a hinged linker region.

Zavěšená spojovací oblast je oblast určená ke vzniku samostatného složení jak fragmentu C tetanového toxinu, tak fragmentu oblasti pre-Sl a fragmentu oblasti pre-S2 poskytnutím jak prostorového tak časového oddělení mezi • · · • · · • · · doménami.The hinged junction region is a region designed to allow for the separate assembly of both the tetanus toxin C fragment, the pre-S1 region fragment, and the pre-S2 region fragment by providing both spatial and temporal separation between the • · · · · · · · · domains.

Zavěšená oblast je typicky sekvence kódující vysoký podíl aminokyselin prolinu a/nebo glycinu. Zavěšená oblast může být složena výhradně z aminokyselin prolinu a/nebo glycinu. Zavěšená oblast může obsahovat jednu nebo více dipeptidových jednotek glycin-prolin. Zavěšená oblast může alternativně obsahovat karboxylové zakončení fragmentu C tetanového toxinu.The hinge region is typically a sequence encoding a high proportion of proline and/or glycine amino acids. The hinge region may be composed entirely of proline and/or glycine amino acids. The hinge region may comprise one or more glycine-proline dipeptide units. The hinge region may alternatively comprise the carboxyl terminus of a tetanus toxin C fragment.

Zavěšená oblast může například obsahovat až asi 15 aminokyselin, například nejméně 4 a výhodně od 6 do 14 aminokyselin, počet aminokyselin tak dodává flexibilitu mezi rozdílnými polypeptidovými doménami.The hinge region may, for example, comprise up to about 15 amino acids, for example at least 4 and preferably from 6 to 14 amino acids, the number of amino acids thus providing flexibility between different polypeptide domains.

V jednom ztělesnění zavěšená oblast může významně odpovídat zavěšené doméně imunoglobulinu protilátky.In one embodiment, the hinge region may substantially correspond to a hinge domain of an immunoglobulin of an antibody.

Zavěšené oblasti IgG protilátek jsou zvláště bohaté na prolin [Michelson T.E. a kol., J. Biol. Chem. 252, 883 až 889 (1977)], což, jak se předpokládá, poskytuje flexibilní spojení mezi vážícím antigenem a koncovými doménami.The pendant regions of IgG antibodies are particularly rich in proline [Michelson T.E. et al., J. Biol. Chem. 252, 883-889 (1977)], which is thought to provide a flexible link between the antigen-binding and terminal domains.

Jiné aminokyseliny lze substituovat glycinem, zejména ty, které jsou bez objemného postranního řetězce, jako je alanin, serin, asparagin a threonin.Other amino acids can be substituted for glycine, especially those without a bulky side chain, such as alanine, serine, asparagine, and threonine.

V jednom výhodném ztělesnění zavěšená oblast je řetězec čtyř nebo více aminokyselin určující sekvenci:In one preferred embodiment, the hinge region is a chain of four or more amino acids defining the sequence:

-[X]p-Pro-[Y]_q-Pro-[Z]_rve které-[X]p-For-[Y] _q -For-[Z] _r in which

Pro je prolin,Pro is proline,

X a Y jsou každý z nich glycin nebo aminokyselina majrcí neobjemný postranní řetězec,X and Y are each glycine or an amino acid with a non-bulky side chain,

Z je jakákoli aminokyselina, φ φ • · · · • φ φ · φ · φ φ ρ je kladné celé číslo, q je celé kladné číslo od 1 do 10 a r je nula nebo kladné celé číslo větší než nula.Z is any amino acid, φ φ • · · · • φ φ · φ · φ φ ρ is a positive integer, q is a positive integer from 1 to 10, and r is zero or a positive integer greater than zero.

B. Polynukleotidy a vektoryB. Polynucleotides and Vectors

Polynukleotidy podle tohoto vynálezu zahrnují sekvence nukleových kyselin kódující pro polypeptidy podle vynálezu. Polynukleotidy podle tohoto vynálezu mohou zahrnovat DNA nebo RNA. Mohou být rovněž polynukleotidy, které obsahují mezi sebou syntetické nebo modifikované nukleotidy. Řada různých druhů modifikací oligonukleotidů je známa v oboru. Zahrnují methylfosfonátový a fosfothioatový hlavní řetězec, adici akridinových nebo polylysinových řetězců na 3' a/nebo 5' koncích molekuly. Pro účely poskytnutého vynálezu je třeba pochopit, že polynukleotidy zde popsané mohou být modifikovány kterýmkoli způsobem známým v oboru. Takové modifikace lze provést s cílem zvýšit aktivitu za podmínek in vivo nebo životnosti polynukleotidů podle vynálezu.Polynucleotides of the present invention include nucleic acid sequences encoding polypeptides of the invention. Polynucleotides of the present invention may include DNA or RNA. They may also be polynucleotides that contain synthetic or modified nucleotides between them. A variety of different types of modifications to oligonucleotides are known in the art. These include methylphosphonate and phosphothioate backbones, addition of acridine or polylysine chains at the 3' and/or 5' ends of the molecule. For purposes of the present invention, it is to be understood that the polynucleotides described herein may be modified in any manner known in the art. Such modifications may be made to enhance the in vivo activity or longevity of the polynucleotides of the invention.

Výhodné polynukleotidy podle tohoto vynálezu rovněž obsahují polynukleotidy kódující pro jakékoli polypeptidy podle vynálezu popsané výše. Kvalifikovaná osoba bude vědět, že řada různých polynukleotidů může kódovat pro stejný polypeptid, což je důsledek degenerace genetického kódu.Preferred polynucleotides of the present invention also include polynucleotides encoding any of the polypeptides of the invention described above. The skilled person will recognize that a number of different polynucleotides may encode the same polypeptide, as a result of the degeneracy of the genetic code.

Polynukleotidy zahrnuté ve vynálezu se mohou začlenit do rekombinantního replikovatelného vektoru. Vektor se může použít k replikaci nukleových kyselin v kompatibilních hostitelských buňkách. Takto v dalším ztělesnění poskytuje vynález způsob přípravy polynukleotidů podle vynálezu zavedením polynukleotidu podle tohoto vynálezu do replikovatelného vektoru, zavedením vektoru do kompatibilní hostitelské buňky a pěstováním hostitelské buňky za podmínek, při kterých dochází k replikaci vektoru. Vektor lze znovu získat z hostitelské buňky. Vhodné hostitelské ♦ «*· *· · * ♦ ·· • · teThe polynucleotides encompassed by the invention may be incorporated into a recombinant replicable vector. The vector may be used to replicate nucleic acids in compatible host cells. Thus, in another embodiment, the invention provides a method of preparing polynucleotides of the invention by introducing a polynucleotide of the invention into a replicable vector, introducing the vector into a compatible host cell, and growing the host cell under conditions in which the vector is replicated. The vector may be recovered from the host cell. Suitable host cells include:

Λ · » · • · te • te *·· • 9 te· te · · · te · · * • · · · » • · te · ·· ·· buňky zahrnují bakterie, jako je E. coli, kvasinky, savčí buněčné linie a jiné eukaryotické buněčné linie, například hmyzí Sf9 buňky.Λ · » · • · te • te *·· • 9 te· te · · · te · · * • · · · » • · te · ·· ·· cells include bacteria such as E. coli, yeast, mammalian cell lines, and other eukaryotic cell lines, for example, insect Sf9 cells.

Výhodně je polynukleotid podle vynálezu ve vektoru řízené spojen s regulační sekvencí, která je schopna zajistit expresi kódující pro sekvenci hostitelskou buňkou, tedy že vektorem je vektor exprese. Výraz řízené spojen se vztahuje k postavení vedle sebe, kde popsané složky jsou ve vztahu, umožňujícím jim působit zamýšleným způsobem. Regulační sekvence řízené spojená s kódující sekvencí je spojena takovým způsobem, že exprese kódující pro sekvenci se dosáhne za podmínek kompatibilních s kontrolní sekvencí.Preferably, the polynucleotide of the invention is in a vector directionally linked to a regulatory sequence capable of ensuring expression of the coding sequence by a host cell, i.e. the vector is an expression vector. The term directionally linked refers to a juxtaposition where the described components are in a relationship that enables them to function in the intended manner. The regulatory sequence directionally linked to the coding sequence is linked in such a way that expression of the coding sequence is achieved under conditions compatible with the control sequence.

Takové vektory lze změnit nebo převést do vhodných hostitelských buněk způsobem uvedeným výše, aby se dosáhlo exprese polypeptidů podle vynálezu. Tento postup může zahrnovat pěstování hostitelské buňky změněné expresí vektoru, jak bylo popsáno výše, za podmínek zajištujících expresi vektorem té kódující sekvence, která kóduje pro polypeptidy. Exprimované polypeptidy lze získat za podmínek in vitro. Hostitelské buňky změněné, aby poskytly stálou expresi polypeptidů, lze rovněž použít in vivo. Například jako vakcínu lze použít hostitelskou buňku, jako je oslabená bakterie, změněnou, aby expresovala polypeptid podle tohoto vynálezu. Oslabenou bakterii lze vybrat ze Salmonely,Such vectors can be modified or transformed into suitable host cells as described above to achieve expression of the polypeptides of the invention. This process can involve culturing a host cell modified to express the vector as described above under conditions that ensure expression by the vector of the coding sequence that encodes the polypeptides. The expressed polypeptides can be obtained under in vitro conditions. Host cells modified to provide stable expression of the polypeptides can also be used in vivo. For example, a host cell, such as an attenuated bacterium, modified to express a polypeptide of the invention can be used as a vaccine. The attenuated bacterium can be selected from Salmonella,

Bordetely, Vibria, Haemofila, Neisserie a Jersinie.Bordetely, Vibria, Haemophila, Neisseria and Jersinia.

Výhodněji oslabená bakterie je enterobakterie, jako je E. coli nebo Salmonela, například S. tyfi, S. tyfimurium nebo S. enteritidis.More preferably, the attenuated bacterium is an enterobacterium such as E. coli or Salmonella, for example S. typhi, S. typhimurium or S. enteritidis.

Vektory mohou být například plasmidy nebo virové vektory poskytnuté s původcem replikace, popřípadě promotor exprese zmíněného polynukleotidu a popřípadě regulátor promotoru. Vektory mohou obsahovat jeden nebo více volitelných kontrolních (značících) genů, například gen « · • · fc · • · ·· • · · tf « · « · · • · · * · rezistence na ampicillin v případě bakteriálních plasmidů nebo gen rezistence na neomycin u savčích vektorů.Vectors may be, for example, plasmids or viral vectors provided with an origin of replication, optionally a promoter for expression of said polynucleotide and optionally a regulator of the promoter. Vectors may contain one or more optional control (marker) genes, for example an ampicillin resistance gene in the case of bacterial plasmids or a neomycin resistance gene in the case of mammalian vectors.

Vektory lze použít in vitro, například pro tvorbu RNA nebo pro změnu či přenos do hostitelských buněk. Vektory lze rovněž adaptovat na použití in vivo, například při metodě genové terapie.Vectors can be used in vitro, for example, for the production of RNA or for the alteration or transfer into host cells. Vectors can also be adapted for use in vivo, for example, in gene therapy.

Promotory/enhancery a jiné signály regulace exprese lze vybrat, aby byly kompatibilní s hostitelskou buňkou, pro kterou je vektor exprese určen. Například lze použít prokaryotické promotory, zejména ty, které jsou vhodné pro užití u kmenů E. coli (jako je E. coli HB 101). Ve zvláště vhodném ztělesnění tohoto vynálezu se použije promotor, jehož aktivita je indukována v odpovědi na změnu okolního prostředí, jako anaerobních podmínek. Vhodně lze použít promotory htrA nebo nirB. Tyto promotory lze použít zejména k expresi polypeptidů oslabených bakterií například k použití jako vakcína. Když se uskuteční exprese polypeptidů podle vynálezu na savčích buňkách, jak in vitro, tak in vivo, lze použít savčích promotorů. Lze rovněž použít tkáňově specifické promotory, například specifické promotory buněk hepatocytů. Také je možno použít virových promotorů, například virus Moloneyho myší leukemie s dlouhými koncovými opakujícími se skupinami (MMLV LTR), promotor rouš sarcoma viru RSV LTR, promotor SV40, IE promotor lidského cytomegaloviru (CMV), promotory viru herpes simplex nebo promotory adenoviru. Všechny tyto promotory jsou přímo dostupné v oboru.Promoters/enhancers and other expression control signals may be selected to be compatible with the host cell for which the expression vector is intended. For example, prokaryotic promoters may be used, particularly those suitable for use in E. coli strains (such as E. coli HB 101). In a particularly preferred embodiment of the invention, a promoter whose activity is induced in response to a change in the environment, such as anaerobic conditions, is used. The htrA or nirB promoters may be suitably used. These promoters may be used in particular for the expression of polypeptides by attenuated bacteria, for example for use as a vaccine. When the polypeptides of the invention are expressed in mammalian cells, both in vitro and in vivo, mammalian promoters may be used. Tissue-specific promoters may also be used, for example hepatocyte cell-specific promoters. Viral promoters can also be used, for example, the Moloney murine leukemia virus long terminal repeat (MMLV LTR) promoter, the RSV LTR promoter, the SV40 promoter, the human cytomegalovirus (CMV) IE promoter, herpes simplex virus promoters, or adenovirus promoters. All of these promoters are readily available in the art.

C. PodáníC. Submission

Polypeptidy podle tohoto vynálezu lze podat přímo injekčně. Vhodně jsou polypeptidy kombinovány s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem, aby vznikl farmaceutický přípravek. Vhodné nosiče nebo ředidla představují izotonické roztoky solí, například fyziologický roztok pufrovaný fosfátem. Přípravky mohou být připraveny pro parenterální, intramuskulární, intravenózní, intranasální, subkutánní, intraokulární nebo transdermální podání. Obvykle se každý polypeptid podává v dávce od 0,01 do 30 μ9 na kg tělesné hmotnosti, výhodně od 0,1 do 10 μ9 na kg, výhodněji od 0,1 do 1 μg na kg tělesné hmotnosti. Rovněž je možné použít protilátky připravené použitím polypetidů podle tohoto vynálezu, způsobem popsaným výše, v léčbě nebo prevenci HBV infekce. Neutralizující protilátky nebo jejich fragmenty, které si zachovávají specificitu pro HBV antigeny, lze podat podobným způsobem jako polypeptidy podle tohoto vynálezu.The polypeptides of the invention can be administered directly by injection. Suitably, the polypeptides are combined with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent to form a pharmaceutical preparation. Suitable carriers or diluents include isotonic salt solutions, for example, phosphate buffered saline. The preparations can be prepared for parenteral, intramuscular, intravenous, intranasal, subcutaneous, intraocular or transdermal administration. Typically, each polypeptide is administered at a dose of from 0.01 to 30 μg per kg of body weight, preferably from 0.1 to 10 μg per kg, more preferably from 0.1 to 1 μg per kg of body weight. It is also possible to use antibodies prepared using the polypeptides of the invention, as described above, in the treatment or prevention of HBV infection. Neutralizing antibodies or fragments thereof that retain specificity for HBV antigens can be administered in a similar manner to the polypeptides of the invention.

Polynukleotidy podle tohoto vynálezu mohou být podány přímo jako neizolovaný konstrukt nukleových kyselin, výhodně dále obsahující přimykající se sekvence homologní genomu hostitelské buňky. Když se podá expresní kazeta ve formě neizolovaných nukleových kyselin, množství nukleových kyselin je obvykle v rozmezí od 1 μg do 10 mg, výhodně od 100 μg do 1 mg.The polynucleotides of the invention can be administered directly as a non-isolated nucleic acid construct, preferably further comprising flanking sequences homologous to the host cell genome. When the expression cassette is administered in the form of non-isolated nucleic acids, the amount of nucleic acids is typically in the range of 1 μg to 10 mg, preferably 100 μg to 1 mg.

Zpětné vychytávání neizolovaného konstruktu nukleových kyselin savčími buňkami se zvyšuje několika známými způsoby přenosu, například těmi, které zahrnují přenosové látky. Příklady těchto látek zahrnují kationické látky (například fosforečnan vápenatý a DEAE-dextran) a lipofektanty (například lipofectam^Xii a transfectairr¹¹). Obvykle jsou konstrukty nukleových kyselin smíchány s přenosovými látkami, aby vznikl přípravek.The uptake of non-isolated nucleic acid constructs by mammalian cells is enhanced by several known methods of delivery, such as those involving delivery agents. Examples of such agents include cationic agents (e.g., calcium phosphate and DEAE-dextran) and lipofectants (e.g., lipofectam ^Xii and transfectairr ¹¹ ). Typically, nucleic acid constructs are mixed with delivery agents to form a formulation.

Výhodně se polynukleotid nebo vektor podle tohoto vynálezu kombinuje s farmaceuticky vhodným nosičem nebo ředidlem, aby vznikl farmaceutický přípravek. Vhodné nosiče nebo ředidla zahrnují fyziologické roztoky, například fyziologický roztok pufrovaný fosfátem. Přípravek může být připraven pro parenterální, intramuskulární, intravenózní, subkutánní, intraokulární nebo transdermální podání.Preferably, the polynucleotide or vector of the invention is combined with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent to form a pharmaceutical composition. Suitable carriers or diluents include physiological solutions, for example, phosphate buffered saline. The composition can be prepared for parenteral, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intraocular or transdermal administration.

Popsaný způsob podání a dávky jsou zamýšleny pouze jako návod, protože kvalifikovaný praktik bude schopen určit přímo nejvhodnější způsob podání a dávku pro každého jednotlivého pacienta v konkrétních podmínkách.The described route of administration and dosages are intended as a guide only, as a qualified practitioner will be able to determine directly the most appropriate route of administration and dosage for each individual patient in the particular circumstances.

D. Příprava vakcínD. Vaccine preparation

Vakcíny lze připravit z jednoho nebo více polypeptidů podle tohoto vynálezu. Mohou rovněž obsahovat jeden nebo více imunogenních HBV polypeptidů, například imunogenní HBV polypeptidy známé v oboru. Takto mohou vakcíny podle tohoto vynálezu zahrnovat jeden nebo více polypeptidů podle tohoto vynálezu a popřípadě jeden nebo více polypeptidů zvolených z polypeptidů HBV S, pre-Sl, pre-S2 a jejich imunogenních fragmentů.Vaccines can be prepared from one or more polypeptides of the present invention. They can also contain one or more immunogenic HBV polypeptides, for example immunogenic HBV polypeptides known in the art. Thus, vaccines of the present invention can include one or more polypeptides of the present invention and optionally one or more polypeptides selected from HBV S, pre-S1, pre-S2 polypeptides and immunogenic fragments thereof.

Polypeptidy podle tohoto vynálezu mohou být zpracovány do vakcíny jako neutrální nebo ve formě soli. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují adiční soli s kyselinou (tvořené s volnou aminoskupinou peptidu), které jsou vytvořeny s anorganickou kyselinou, například s kyselinou chlorovodíkovou nebo fosforečnou, nebo s organickou kyselinou, například s kyselinou octovou, oxalovou, vinnou nebo maleinovou. Soli vytvořené s volnou karboxylovou skupinou mohou být rovněž odvozeny z anorganických baží, například z hydoxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého nebo železitého a z takových organických baží, jako je isopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin a prokain.The polypeptides of the invention may be formulated into a vaccine as neutral or in salt form. Pharmaceutically acceptable salts include acid addition salts (formed with the free amino group of the peptide) formed with an inorganic acid, such as hydrochloric or phosphoric acid, or with an organic acid, such as acetic, oxalic, tartaric or maleic acid. Salts formed with the free carboxyl group may also be derived from inorganic bases, such as sodium, potassium, ammonium, calcium or ferric hydroxides, and from organic bases such as isopropylamine, trimethylamine, 2-ethylaminoethanol, histidine and procaine.

Příprava vakcín, které obsahují imunogenní polypetid(y) jako účinnou látku (účinné látky) je známa osobě se znalostmi v oboru. Obvykle se takové vakcíny připravují jako injekční přípravky, buď jako kapalné roztoky « · • * · · · tt '·· ·· · » · · nebo suspenze; pevné formy jsou vhodné pro roztoky nebo suspenze, kdy kapalná forma může být rovněž připravena před injekcí. Přípravek může být také emulzifikován nebo protein enkapsulován do liposomů.The preparation of vaccines containing immunogenic polypeptide(s) as the active ingredient(s) is known to the person skilled in the art. Typically, such vaccines are prepared as injectable preparations, either as liquid solutions « · • * · · · tt '·· ·· · » · · · or suspensions; solid forms are suitable for solutions or suspensions, where the liquid form can also be prepared prior to injection. The preparation can also be emulsified or the protein encapsulated in liposomes.

Vakcíny mohou obsahovat oslabenou bakterii schopnou exprese polypeptidů podle tohoto vynálezu.Vaccines may contain an attenuated bacterium capable of expressing polypeptides of the invention.

Účinné imunogenní látky se často smíchávají s pomocnými látkami, které jsou farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s účinnou látkou. Vhodné pomocné látky jsou například voda, fyziologický roztok, dextróza, glycerol, ethanol nebo podobně a jejich kombinace.Active immunogenic agents are often mixed with excipients that are pharmaceutically acceptable and compatible with the active agent. Suitable excipients include, for example, water, saline, dextrose, glycerol, ethanol, or the like, and combinations thereof.

Navíc pokud je to žádoucí, mohou vakcíny obsahovat malé množství pomocných látek jako jsou zvlhčovadla nebo emulzifikující látky, látky pufrující pH a/nebo přídatné látky, které zvyšují účinnost vakcíny. Příklady přídatných látek, které mohou být účinné, zahrnují hydroxid hlinitý, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637, označovaný jako nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1’,2’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyfosforyloxy)ethylamin (CGP 19835A, označovaný jako MTP-PE) a RIBI, který obsahuje tři složky extrahované z bakterií, monofosforyl lipid A, dimykolat trehalosy a skelet buněčné stěny (MPL+TDM+CWS) ve 2% emulzi skvalenu ve Tweenu 80, ale nejsou tímto výčtem omezeny. Účinnost přídatných látek lze určit měřením množství protilátek zaměřených proti imunogenním polypeptidům obsahujícím HBV antigenní sekvence, vznikající podáním tohoto polypeptidu ve vakcínách, které rovněž obsahují různé přídatné látky.Additionally, if desired, vaccines may contain small amounts of excipients such as wetting or emulsifying agents, pH buffering agents and/or additives that enhance the efficacy of the vaccine. Examples of additives that may be effective include, but are not limited to, aluminum hydroxide, N-acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamine (thr-MDP), N-acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (CGP 11637, referred to as nor-MDP), N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine-2-(1’,2’-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamine (CGP 19835A, referred to as MTP-PE), and RIBI, which contains three components extracted from bacteria, monophosphoryl lipid A, trehalose dimycolate, and cell wall scaffold (MPL+TDM+CWS) in a 2% squalene emulsion in Tween 80. The efficacy of adjuvants can be determined by measuring the amount of antibodies directed against immunogenic polypeptides containing HBV antigenic sequences, generated by administration of this polypeptide in vaccines that also contain various adjuvants.

Vakcíny jsou obvykle podávány parenterálně, injekčně, například buď subkutánně nebo intramuskulárně. Další přípravky, které jsou vhodné pro jiné způsoby podání,Vaccines are usually administered parenterally, by injection, for example either subcutaneously or intramuscularly. Other preparations suitable for other routes of administration,

• · 4 4 · · · t ř · ··«»··· • · · 4 · · 4• · 4 4 · · · t ř · ··«»··· • · · 4 · · 4

4 4 · 4 4 4 · 4 »* 4* zahrnují čípky a intranasální přípravky. Orální přípravky lze poskytnout, zejména pro podání oslabených bakterií.4 4 · 4 4 4 · 4 »* 4* include suppositories and intranasal preparations. Oral preparations can be provided, especially for the administration of attenuated bacteria.

V případě čípků mohou tradiční pojivá a nosiče zahrnovat například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy; takové čípky lze vyrobit ze směsí obsahujících účinnou látku v rozsahu 0,5 % až 10 %, výhodně 1 % až 2 %. Orální přípravky obsahují takové běžně používané pomocné látky, jako například farmaceutickou jakost mannitolu, laktózy, škrobu, stearátu hořečnatého, sodné soli sacharinu, celulózy, uhličitanu hořečnatého a podobně. Tyto směsi mohou mít formu roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, kapslí, přípravků s řízeným uvolňováním nebo prášku a obsahují 10 % až 95 % účinné látky, výhodně 25 % až 70 %.In the case of suppositories, traditional binders and carriers may include, for example, polyalkylene glycols or triglycerides; such suppositories may be prepared from compositions containing the active ingredient in the range of 0.5% to 10%, preferably 1% to 2%. Oral preparations contain such commonly used excipients as, for example, pharmaceutical grade mannitol, lactose, starch, magnesium stearate, sodium saccharin, cellulose, magnesium carbonate and the like. These compositions may be in the form of solutions, suspensions, tablets, pills, capsules, controlled release preparations or powders and contain 10% to 95% of the active ingredient, preferably 25% to 70%.

Vakcínu, obsahující například oslabenou bakterii, lze s výhodou připravit v lyofilizované formě, například ve formě kapslí, pro orální podání pacientovi. Takové kapsle, tablety nebo pilulky pro orální podání pacientovi lze připravit s enterickým potahem, například obsahujícím Eudragit S, Eudragit L, acetát celulózy, acetát ftalát celulózy nebo hydroxypropylmethylcelulózu. Tyto kapsle lze použít jako takové nebo případně lyofilizovaná látka může být rekonstituována před podáním, například jako suspenze. Rekonstituci lze s výhodou uskutečnit v pufru o vhodném pH, aby se zajistila životaschopnost organismu. S cílem ochránit oslabenou bakterii a vakcínu před žaludeční kyselostí lze s výhodou podat přípravek s hydrogenuhličitanem sodným před každým podáním vakcíny.A vaccine, for example, containing an attenuated bacterium, may be advantageously prepared in a lyophilized form, for example in the form of capsules, for oral administration to a patient. Such capsules, tablets or pills for oral administration to a patient may be prepared with an enteric coating, for example containing Eudragit S, Eudragit L, cellulose acetate, cellulose acetate phthalate or hydroxypropylmethylcellulose. These capsules may be used as such or optionally the lyophilized substance may be reconstituted prior to administration, for example as a suspension. Reconstitution may advantageously be carried out in a buffer of suitable pH to ensure viability of the organism. In order to protect the attenuated bacterium and the vaccine from gastric acidity, a sodium bicarbonate preparation may advantageously be administered prior to each administration of the vaccine.

E. Dávka a podání vakcínE. Dose and administration of vaccines

Vakcíny se podávají způsobem slučitelným s dávkou přípravku a v množství, které je profylakticky a/nebo léčebně účinné. Množství, které se má podat a které je všeobecně v rozmezí 5 μ9 až 250 gg antigenu na dávku, závisí na léčené osobě, schponosti jejího imunitního systému «· ·· .ί vytvářet protilátky a na požadovaném stupni ochrany. Přesné množství účinné látky, které se vyžaduje k podání, může záležet na posouzení praktického lékaře a může být individuální pro každého jedince.Vaccines are administered in a manner compatible with the dosage of the preparation and in an amount that is prophylactically and/or therapeutically effective. The amount to be administered, which is generally in the range of 5 μg to 250 μg of antigen per dose, depends on the individual being treated, the capacity of his immune system to produce antibodies and the degree of protection desired. The precise amount of active substance required to be administered may depend on the judgment of the practitioner and may be individual for each individual.

Vakcíny lze podat v jednodávkovém schématu, nebo výhodně ve vícedávkovém schématu. Schéma vícedávkové je takové, ve kterém základní trvání vakcinace může být v rozsahu 1 až 10 jednotlivých dávek, následované jinými dávkami podávanými v časových intervalech nutných k zachování nebo obnovení imunitní odpovědi, například v intervalech 1 až 4 měsíce pro druhou dávku a, pokud je zapotřebí, následované další dávkou (dalšími dávkami) po několika měsících. Dávkové schéma bude rovněž, alespoň z části, určeno potřebami daného jedince a záleží na posouzení praktického lékaře.The vaccines may be administered in a single dose schedule, or preferably in a multiple dose schedule. A multiple dose schedule is one in which the basic duration of vaccination may be in the range of 1 to 10 individual doses, followed by further doses administered at intervals necessary to maintain or restore the immune response, for example at intervals of 1 to 4 months for the second dose and, if necessary, followed by further dose(s) after several months. The dose schedule will also be determined, at least in part, by the needs of the individual and is at the discretion of the practitioner.

Kromě toho vakcíny obsahující imunogenní HBV antigen (antigeny) lze podat ve spojení s dalšími látkami regulujícími imunitu, například imunoglobuliny.In addition, vaccines containing immunogenic HBV antigen(s) can be administered in conjunction with other immune-regulating agents, such as immunoglobulins.

F. Příprava protilátek proti polypeptidům podle tohoto vynálezuF. Preparation of Antibodies to Polypeptides of the Invention

Imunogenní polypeptidy, připravené způsobem popsaným výše, lze použít k přípravě protilátek, a to jak polyklonálních, tak monoklonálních. Pokud se požadují polyklonální protilátky, imunizuje se vybraný savec (například myš, králík, koza, kůň atd.) imunogenním polypeptidem, nesoucím HBV epitop (epitopy). Sérum imunizovaného zvířete se sbírá a zpracovává známými způsoby. Pokud sérum obsahující polyklonální protilátky proti HBV epitopu obsahuje protilátky proti jiným antigenům, lze polyklonální protilátky čistit imunoafinitní chromatografíí. Způsoby produkce a zpracování polyklonálních antiser jsou známy v oboru.Immunogenic polypeptides prepared as described above can be used to prepare antibodies, both polyclonal and monoclonal. If polyclonal antibodies are desired, a selected mammal (e.g., mouse, rabbit, goat, horse, etc.) is immunized with an immunogenic polypeptide bearing the HBV epitope(s). Serum from the immunized animal is collected and processed by known methods. If the serum containing polyclonal antibodies to the HBV epitope contains antibodies to other antigens, the polyclonal antibodies can be purified by immunoaffinity chromatography. Methods for producing and processing polyclonal antisera are known in the art.

β ·β ·

Monoklonální protilátky zaměřené proti HBV epitopům v polypeptidech podle tohoto vynálezu může rovněž přímo vyrábět osoba se znalostmi v oboru. Obecná metodologie přípravy monoklonálních protilátek pomocí hybridomů je dobře známa. Linie imortálních buněk vytvářejících protilátky lze vytvořit buněčnou fúzí a rovněž jinými způsoby, jako je přímá transformace B lymfocytů s onkogenní DNA nebo přenosem s Epstein-Barrovým virem. Panely monoklonálních protilátek vytvářených proti HBV epitopům lze třídit podle různých vlastností, to znamená podle isotypu nebo afinity k epitopům.Monoclonal antibodies directed against HBV epitopes in the polypeptides of the invention can also be directly produced by one skilled in the art. The general methodology for preparing monoclonal antibodies using hybridomas is well known. Immortal antibody-producing cell lines can be generated by cell fusion, as well as by other methods, such as direct transformation of B lymphocytes with oncogenic DNA or transduction with Epstein-Barr virus. Panels of monoclonal antibodies produced against HBV epitopes can be sorted according to various properties, i.e., isotype or affinity for the epitopes.

Protilátky, jak monoklonální tak polyklonální, které jsou zaměřeny proti HBV epitopům, jsou zvláště užitečné v diagnóze, a ty, které jsou neutralizující, jsou užitečné v pasivní imunoterapii. Zejména monoklonální protilátky lze použít k získání anti-idiotypových protilátek.Antibodies, both monoclonal and polyclonal, that are directed against HBV epitopes are particularly useful in diagnosis, and those that are neutralizing are useful in passive immunotherapy. In particular, monoclonal antibodies can be used to raise anti-idiotypic antibodies.

Anti-idiotypové protilátky jsou imunoglobuliny, které nesou vnitřní obraz antigenu infekčního agens, proti němuž je žádána ochrana.Anti-idiotypic antibodies are immunoglobulins that carry the internal image of the antigen of the infectious agent against which protection is sought.

Způsoby získání anti-idiotypových protilátek jsou známy v oboru. Tyto anti-idiotypové protilátky mohou být rovněž užitečné v léčbě HBV, stejně jako pro objasnění imunogenních oblastí HBV antigenů.Methods for obtaining anti-idiotypic antibodies are known in the art. These anti-idiotypic antibodies may also be useful in the treatment of HBV, as well as for elucidating the immunogenic regions of HBV antigens.

Je rovněž možno použít fragmenty protilátek popsaných výše, například Fab fragmenty.Fragments of the antibodies described above, for example Fab fragments, may also be used.

G. Zkoušky imunityG. Immunity tests

Jak polypeptidy podle tohoto vynálezu, tak protilátky vytvářené za použití polypeptidů podle tohoto vynálezu lze použít při metodách zkoušení imunity, například těch, které reagují imunologicky se sérem, obsahujícím HBV protilátky, • ·Both the polypeptides of the invention and antibodies produced using the polypeptides of the invention can be used in immunity assay methods, for example those that react immunologically with serum containing HBV antibodies,

W · · · • · 4 9W · · · • · 4 9

4 4 4 • * 44 například k detekci přítomnosti HBV protilátek nebo přítomnosti virových antigenů v biologických vzorcích, zahrnujících například vzorky krve nebo séra. Zejména lze polypeptidy a protilátky podle tohoto vynálezu použít k mapování vysoce imunogenních oblastí v rámci pre-Sl a pre-S2 oblastí HBsAg. Provedení zkoušek imunity u subjektů je ve značném rozsahu předmětem obměn a v oboru je známa celá řada těchto zkoušek imunity. Zkoušky imunity mohou například využívat jeden virový antigen, například polypeptid podle tohoto vynálezu, nebo volitelně mohou zkoušky imunity využívat kombinace virových antigenů zahrnujících polypeptidy podle tohoto vynálezu. Rovněž mohou využívat například protilátky získané použitím způsobu podle tohoto vynálezu nebo kombinace těchto protilátek zaměřených na jeden nebo několik virových antigenů. Postupy mohou být založeny například na soutěži, přímé reakci nebo na zkouškách sendvičového typu. Postupy použitých zkoušek imunity mohou rovněž například používat pevnou fázi nebo mohou být imunoprecipitační. Většina zkoušek zahrnuje použití značené protilátky nebo polypeptidu, značení může být například fluorescenční, chemiluminiscenční, radioaktivní nebo barvícími molekulami. Rovněž jsou známy zkoušky, které amplifikují signály ze sondy. Jako jejich příklad je možno uvést zkoušky, které využívají biotin a avidin a enzymaticky značené a zprostředkované zkoušky imunity, jako je zkouška ELISA.4 4 4 • * 44 for example, to detect the presence of HBV antibodies or the presence of viral antigens in biological samples, including, for example, blood or serum samples. In particular, the polypeptides and antibodies of the invention can be used to map highly immunogenic regions within the pre-S1 and pre-S2 regions of HBsAg. The performance of immunity assays in subjects is subject to considerable variation and a variety of such immunity assays are known in the art. For example, the immunity assays can utilize a single viral antigen, for example, a polypeptide of the invention, or optionally, the immunity assays can utilize combinations of viral antigens including polypeptides of the invention. They can also utilize, for example, antibodies obtained using the method of the invention or combinations of such antibodies directed against one or more viral antigens. The procedures can be based on, for example, competition, direct reaction or sandwich type assays. The immunity assay procedures used can also, for example, utilize solid phase or immunoprecipitation. Most assays involve the use of a labeled antibody or polypeptide, the labeling may be, for example, fluorescent, chemiluminescent, radioactive or dye molecules. Assays that amplify signals from a probe are also known. Examples include assays that utilize biotin and avidin and enzyme-linked immunosorbent assays, such as ELISA.

Vynález bude popsán s odkazem na následující příklady, které jsou zamýšleny pouze k ilustraci a nikoli jako omezení. Příklady se vztahují k obrázkům. Odkazujíce na obrázky se uvádí podrobněji:The invention will be described with reference to the following examples, which are intended to be illustrative only and not limiting. The examples relate to the figures. Referring to the figures, it is set forth in more detail:

Přehled obrázků na výkresechOverview of images in drawings

Obr. 1 ukazuje klonovací schéma pro plasmid pTECH3.Fig. 1 shows the cloning scheme for plasmid pTECH3.

• ·• ·

Obr. 2Fig. 2

a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-fragment C, 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).a) Total immunoglobulin response, anti-fragment C, 14 days after the initial dose with purified fusion proteins () of fragment C-S/\S1/S2 and (·) of fragment C-B/\S1/S2. Normal response of mouse serum (unimmunized) (A).

b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-fragment C, 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze (·) fragmentu C-S/\ S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (a).b) Total immunoglobulin response, anti-fragment C, 7 days after a boost with purified fusion proteins (·) fragment C-S/\ S1/S2 and (·) fragment C-B/\S1/S2. Normal response of mouse serum (unimmunized) (a).

Obr. 3Fig. 3

a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa61-81), 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze (fl) fragmentu C-S/XS1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).a) Total immunoglobulin response, anti-S1 (peptide aa61-81), 14 days after the initial dose with purified fusion proteins (fl) of the C-S/XS1/S2 fragment and (·) of the C-B/\S1/S2 fragment. Normal response of mouse serum (unimmunized) (A).

b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa61-81), 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze () a (0) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).b) Total immunoglobulin response, anti-S1 (peptide aa61-81), 7 days after a boost with purified fusion proteins () and (0) of the C-B/\S1/S2 fragment. Normal response of mouse serum (unimmunized) (A).

Obr. 4Fig. 4

a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aal2-24), 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).a) Total immunoglobulin response, anti-S1 (peptide aa12-24), 14 days after the initial dose with purified fusion proteins () of the C-S/\S1/S2 fragment and (·) of the C-B/\S1/S2 fragment. Normal response of mouse serum (unimmunized) (A).

b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aal2-24), 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze («) fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\Sl/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).b) Total immunoglobulin response, anti-S1 (peptide aal2-24), 7 days after a boost with purified fusion proteins («) of the C-S/\S1/S2 fragment and (·) of the C-B/\S1/S2 fragment. Normal response of mouse serum (unimmunized) (A).

Obr. 5Fig. 5

a) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa21-47, přítomný v S-pre-Sl částicích), 14 dní po úvodní dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séraa) Total immunoglobulin response, anti-S1 (peptide aa21-47, present in S-pre-S1 particles), 14 days after the initial dose with purified fusion proteins () of the C-S/\S1/S2 fragment and (·) of the C-B/\S1/S2 fragment. Normal mouse serum response

(ne imun i z ováného) (A) .(not immunized) (A) .

b) Celková imunoglobulinová odpověď, anti-Sl (peptid aa21-47, přítomný v S-pre-Sl částicích), 7 dní po zvětšené dávce s čištěnými proteiny fuze () fragmentu C-S/\S1/S2 a (·) fragmentu C-B/\S1/S2. Normální odpověď myšího séra (neimunizovaného) (A).b) Total immunoglobulin response, anti-S1 (peptide aa21-47, present in S-pre-S1 particles), 7 days after a boost with purified fusion proteins () of the C-S/\S1/S2 fragment and (·) of the C-B/\S1/S2 fragment. Normal response of mouse serum (unimmunized) (A).

Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention

Příklad 1Example 1

Příprava konstruktů expresePreparation of expression constructs

Plasmid pTECH-3, základní vektor exprese používaný v těchto příkladech, se připraví postupem zobrazeným v obr.Plasmid pTECH-3, the basic expression vector used in these examples, is prepared according to the procedure shown in FIG.

z pTECH-2 a pTEThtrA-1, jak je popsáno v naší dřívější přihlášce PCT/GB95/00196. pTECH-3 zahrnuje sekvenci kódující pro fragment C tetanového toxinu a obsahuje zavěšenou oblast, řízené spojenou s promotorem htrA.from pTECH-2 and pTEThtrA-1 as described in our earlier application PCT/GB95/00196. pTECH-3 includes the coding sequence for the C fragment of tetanus toxin and contains a hinge region, controlled by the htrA promoter.

Konstrukty zaznamenané v tabulce uvedené níže se připraví následujícím způsobem:The constructs recorded in the table below are prepared as follows:

Tabulka 1Table 1

Konstrukt Sekvence hepatitidy BConstruct Hepatitis B Sequence

pIBEM PIBEM pře Sl ^2M7aa via Sl ^2M7aa jjteS2^_w l-5Saa jjteS2^ _w l-5Saa pTEefozsw pTEefozsw pre SI 21 -47/preS2 1-SSaa for SI 21 -47/forS2 1-SSaa pTECWSB pTECWSB _: S _ww 120-147aa _: S _ww 120-147aa pTBCH3/SaS1/S2 pTBCH3/SaS1/S2 pre 81^21-139/32^1-55^ for 81^21-139/32^1-55^ _PT£CH3/BaS1/S2 _P T£CH3/BaS1/S2 pře Sl 42-119/S2 l-55aa via Sl 42-119/S2 l-55aa pTBCH3AVSI/S2 pTBCH3AVSI/S2 pře Sl 1-119/S2 _w 3-SSas over Sl 1-119/S2 _w 3-SSas

Plasmid pMBdSlRN/44 (obsahující gen pre-Sl(20-47)/S ayw hepatitidy B) se použije jako vzor pro přípravu pTECH3/Sl, pTECH3/SB a pTECH3/Sl/S2. pMByS2/8 (obsahující gen pre-S2(1-55)/S ayv hepatitidy B) se použije jako vzor pro přípravu pTECH3/S2, pTECH3/Sl/S2 a pRIT12793 (obsahující celý gen pre-Sl/S2 adw hepatitidy B v pBR322) se použije pro pTECH3/S/\Sl/S2, pTECH3/BASl/s2 a pTECH3/WSl/S2.Plasmid pMBdSlRN/44 (containing the hepatitis B pre-Sl(20-47)/S ayw gene) was used as a template for the preparation of pTECH3/Sl, pTECH3/SB and pTECH3/Sl/S2. pMByS2/8 (containing the hepatitis B pre-S2(1-55)/S ayv gene) was used as a template for the preparation of pTECH3/S2, pTECH3/Sl/S2 and pRIT12793 (containing the entire hepatitis B pre-Sl/S2 adw gene in pBR322) was used for pTECH3/S/\Sl/S2, pTECH3/BASl/s2 and pTECH3/WSl/S2.

Následující páry primerů se použijí k PCR klonu za standardních podmínek, sekvence pre-Sl/S2 hepatitidy B pro vložení do pTECH3:The following primer pairs will be used to PCR clone under standard conditions, the hepatitis B pre-S1/S2 sequence for insertion into pTECH3:

Primer Example Sekvence Sequence MTCTASATGCAAAACCTGC MTCTASATGCAAAACCTGC TAACTAGTAATACAffiTGCA TAACTAGTAATACAffiTGCA M©R10<SI M©R10<SI ATGTCTAGAAATCCTCTGGSATTC ATGTCTAGAAATCCTCTGGSATTC MOR238(52sfl<m®) MOR238(52sfl<m®) AAGCHATGCAGTGGMTTCCAGA AAGCHATGCAGTGGMTCCAG MGR105(51) MGR105(51) C6MCTAGTGTTGGGATTGM6TC C6MCTAGTGTTGGGATTGM6TC MU 06(52) MU 06(52) AGGGTCACTAGTCCTCGtóAAGAT AGGGTCACTAGTCCTCGtóAAGAT TCTGTTGCTAGCCCTCTGBGATTC TCTGTTGCTAGCCCTCTGBGATTC MGR254(BzxSl/S2) MGR254(BzxSl/S2) TCAAACGCTAGCGA.TT'GGSACTTC TCAAACGCTAGCGA.TT'GGSACTTC MGR243(S&žmd «&5Ι/82) MGR243(S&žmd «&5Ι/82) TTGClAGCGTTCAGCGCAGSGTCC TTGClAGCGTTCAGCGCAGSGTCC HGR250ÍW31/52) HGR250ÍW31/52) CCCGCTAGCATGGGAGGTTGGTCA CCCGCTAGCATGGGAGGTTGGTCA

Každý PCR fragment se digeruje restrikcními enzymy, gel se čistí a naváže na 3,76 kbp fragment pTECH3. První čtyři konstrukty se připraví digescí plasmidu pTECH3s Xbal/Spel/CIAP, aby vznikl 3,76 kbp fragment. Vhodný HBV PCR fragment, který byl předštěpen pomocí Nhel, se potom naváže na 3,76 kbp fragment. Poslední dva konstrukty se připraví digescí plasmidu pTECH3 s Xbal/CIAP, aby vsnikl 3,76 kbp fragment, který se potom naváže na vhodný HBV PCR ·· ·· ♦ · 1Each PCR fragment is digested with restriction enzymes, gel purified and ligated to the 3.76 kbp fragment of pTECH3. The first four constructs are prepared by digesting plasmid pTECH3 with XbaI/SpeI/CIAP to generate the 3.76 kbp fragment. The appropriate HBV PCR fragment, which has been pre-cut with NheI, is then ligated to the 3.76 kbp fragment. The last two constructs are prepared by digesting plasmid pTECH3 with XbaI/CIAP to generate the 3.76 kbp fragment, which is then ligated to the appropriate HBV PCR ·· ·· ♦ · 1

I Φ ♦ 1 φ φ »I Φ ♦ 1 φ φ »

Φ Φ 4 produkt, který byl předštěpen pomocí Nhel.Φ Φ 4 product that was pre-cleaved with NheI.

Příklad 2Example 2

Exprese polypeptidů a Western blottingPolypeptide expression and Western blotting

Plasmidy se transformují do kmenu HB101 E. coli za použití standardních způsobů. Exprese fúzovaných polypeptidů se indukuje tepelným stresem při 37 °C. Exprese se testuje pomocí western blotting buněčných extraků E. coli s protilátkou proti fragmentu C protilátky proti tetanovému toxinu a specifickými protilátkami pro každou vloženou sekvenci (viz tabulka 2).The plasmids are transformed into E. coli strain HB101 using standard methods. Expression of the fusion polypeptides is induced by heat stress at 37°C. Expression is assayed by western blotting of E. coli cell extracts with an antibody against the C fragment of the tetanus toxin antibody and specific antibodies for each inserted sequence (see Table 2).

Příklad 3Example 3

Příprava polyklonálních protilátek proti polypeptidovým konstruktůmPreparation of polyclonal antibodies against polypeptide constructs

Fúzované polypeptídy, vytvořené v příkladu 2 z plasmidů pTECH3/s/\Sl/S2 a pTECH3/B/\Sl/S2 se pročistí od buněčných extraktů E. coli afinitní chromatografií za použití fragmentu C anti-tetanového toxinu jako ligandu imobilizovaného na sloupci 4B sefarosy. Čištěné proteiny se připraví pro injekci a podají myši (BIO, samička, 6 až 8 týdnů stará) za použití standardních postupů, jak je podrobněji popsáno dále.The fusion polypeptides generated in Example 2 from plasmids pTECH3/s/\S1/S2 and pTECH3/B/\S1/S2 were purified from E. coli cell extracts by affinity chromatography using anti-tetanus toxin fragment C as ligand immobilized on a 4B Sepharose column. The purified proteins were prepared for injection and administered to mice (BIO, female, 6-8 weeks old) using standard procedures, as described in more detail below.

RozvrhSchedule

Skupina 1 Imunizace myši (úvodní dávka) intraperitoneálně (I/P), 5 gg čištěného fuzního proteinu Frag C-SZ\S1/S2.Group 1 Immunization of mice (priming dose) intraperitoneally (I/P), 5 µg of purified Frag C-SZ\S1/S2 fusion protein.

Vzorek krve 14 dnů po úvodní dávce.Blood sample 14 days after the initial dose.

Imunizace myši (pokračovací dávka), I/P, 5 gg čištěného fuzního proteinu Frag C-S/\S1/S2 , 21 dnů po úvodní dávce.Immunization of mice (booster dose), I/P, 5 µg of purified Frag C-S/\S1/S2 fusion protein, 21 days after the initial dose.

Vzorek krve 7 dnů po pokračovací dávce.Blood sample 7 days after booster dose.

Skupina 2 Imunizace myši (úvodní dávka) intraperitoneálně (I/P), 5 čištěného proteinu fuze Frag C-B/\S1/S2.Group 2 Immunization of mice (priming dose) intraperitoneally (I/P), 5 purified Frag C-B/\S1/S2 fusion protein.

Imunizace myši (pokračovací dávka), I/P, 5 μ5 čištěného fuzního proteinu Frag C-B/\S1/S2 21 dnů po úvodní dávce.Immunization of mice (booster dose), I/P, 5 μ5 of purified Frag C-B/\S1/S2 fusion protein 21 days after the initial dose.

Celkové protilátkové odpovědi se určí metodou ELISA proti čištěnému fragmentu C, peptidům pre-Sl (aa61-81), pre-S2 (aal2-24) a pre-Sl (aa21-47) obsaženém v rámci S-Sl částic. Odpovědi jsou ilustrovány na obr. 2,Total antibody responses are determined by ELISA against purified fragment C, pre-S1 (aa61-81), pre-S2 (aa2-24) and pre-S1 (aa21-47) peptides contained within the S-S1 particles. The responses are illustrated in Fig. 2,

3, 4 a 5.3, 4 and 5.

Shrnuto, odpovědi se detekují jak pro složky pre-Sl, tak pre-S2 fuzních proteinů a protein fragmentu C nosiče.In summary, responses are detected for both the pre-S1 and pre-S2 components of the fusion proteins and the carrier fragment C protein.

ωω

4J4J

O i-4About i-4

Λ βΛ β

ββ

0)0)

-P ω-P ω

0) &0) &

OJ (0 rHOJ (0 rH

Λ (ΰ Ε-ιΛ (ΰ E-ι

Western blotWestern blot

$ $ ' Q X ' Q X a % and % -F -F G Z G Z g z g z a . z' a . z' ©· .ígr «3 ©· .ígr «3 £3 Z £3 From a z and of 4- 4- k to X X $ $ βφ βφ WÍ( WÍ( V» In» Vi* See* O About a and a and Q. Q. a and EO EO z from z from z from Z From k to k to z from s with «r «r o a- o a- £5: Z £5: From : O : About 4 4 4- 4- _; gr _; gr X X 4- 4- k to $ Ϋ $ Ϋ k' to' X X k to 4- 4- ' k . ' to . 4- 4- CQ S CQ S § § a a ΟΊ a a ΟΊ Vi See VS VS s with Ό Ό ilIlTií ilIlTií u*s u*s Vi See Vi Vi See See 1 1 < < U At « « £ £ sř Wed w w •H 4-> •H 4-> 04 OQ 04 OQ i n i n Ol Ol á *S3 a *S3 (0 (0 b b 05 05 03 03 ot ot dl tt) X! dl tt) X! «X t**k «X t**k es ' es es ' es .& r- .& r- tó that Q% Q% eš you i and tt tt to that ra ra tfUM« tfUM« *** *** tt) O Č tt) tt) O T tt) 1 <M 1- 1 <M 1- Ά 1 í «? Ά 1 í «? t (3 J_ t (3 J_ r- iř w*. i & <N r- iř w*. i & <N 04 i >*» 04 i >*» i and i i i i > 44 tt) W > 44 tt) W 05 t Cu 05 t Cu 05 £ o* 05 £ o* ' 05 s Cm ' 05 s Cm » . s eo » . s eo 05 £ Rh 05 £ Rh 09 cl? 09 cl? $3 B. ' Sk $3 B. ' Sk -P 44 -P 44 oi o : 04 : 82 : 04 : 82 CM CM β 5-1 j_j β 5-1 j_j 04 05 04 05 <52 05 <52 05 *TÍ- <β. <3 *TÍ- <β. <3 ' 05 ' 05 (fl β (fl β • s • with OJ 82 OJ 82 w* ea r*>. w* ea r*>. ,{33 m ,{33 m «3 8? ťk «3 8? tk . i . and cň còn 0 K 0 K U At Γ“·* Q Γ“·* Q g g pXt u pXt u *k u *k u . a o . and about z O from O a and í ω í ω U3 U3 a and r* C. r* C. . r* ÍX . r* ÍX k* ‘o. k* ‘o. : Z Cl» : From Cl» ^,fa. ^,f a. ÍX IX

ΓΟ σ> ΓΟ σ> o about η η cn cn X—% X—% Ch Ch v in <υ <υ n n 44 44 44 44 α) α) Ή I a and Η The i-4 i-4 05 05 '(0 '(0 54 54 in in Ό Ό Μ M o about ο ο 1 1 C0 C0 to that η η Ch Ch Ρ' Ρ' ι—1 ι—1 m m Ch Ch (Μ (M < < \ \ á a ο- ο- α α u at ν ν tn tn C0 C0 . . (0 (0 ι—Ι ι—Ι Ο O 54 54 C0 C0 &4 &4 1 1 1 1 Γ- Γ- ο ο •rl •rl Μ¹ M ¹ νθ νθ +) +) 1 1 -—· -—· c c ο ο (0 (0 04 04 γ-4 γ-4 05 05 6 6 1 1 β β Η The ·γ4 ·γ4 54 54 05 05 4-1 4-1 '0) '0) 1 1 β β (fl (fl ·γ4 ·γ4 β β 4-> 4-> Ή I β β Ή I >0 >0 β β >Ο >Ο •r4 •r4 •Η •Η i—1 i—1 Ή I I—ί I—ί '(« '(« >ω >ω 'β 'β Ρ Ρ >1 >1 β β 44 44 β β 44 44 ^Kr4 ^To r4 Ή I Ή I β β β β β β r-4 r-4 Η The γ-4 γ-4 '(ϋ '(ϋ 'ίΰ 'ίΰ '<0 '<0 ο ο β β β β β β ο ο 0 0 0 0 0 0 sř Wed I—I I—I r-4 r-4 ι-Η ι-Η • · • · 44 44 44 44 44 44 (—ι (—ι >1 >1 0 0 5ο 5th γ-Ι γ-Ι β β γΗ γΗ > > 0 0 0 0 ο ο 0 0 C0 C0 a and ο ο S With ο ο (β (β ο ο ο ο s~\ with~\ Η The —. —. Η The β β • · • · η η ·· ·· ϋ ϋ rH rH γΗ γΗ — — 04 04

(d) Monoklonální myší anti-S2 1-901 buněčný supernatant Harv. 20/11/97. Fre 26/11/97 1:10 (e) Polyklonální myší (SWR/J) anti-HB 147 (VRU, Imperiál College) 1:50(d) Monoclonal mouse anti-S2 1-901 cell supernatant Harv. 20/11/97. Fre 26/11/97 1:10 (e) Polyclonal mouse (SWR/J) anti-HB 147 (VRU, Imperial College) 1:50

Claims

PATENTOVÉ NÁ

A polypeptide comprising (i) a tetanus toxin C fragment or at least 6 amino acid fragment thereof, fused to (ii) a hepatitis B virus pre-S1 region (HBV) or at least 6 amino acid fragment thereof and / or a HBV pre-S2 region or a fragment thereof of at least 6 amino acids, wherein the polypeptide comprises an antibody that recognizes pre-S1 or pre-S2 regions of HBV.

The polypeptide of claim 1, comprising a tetanus toxin C fragment of at least 100 amino acids.

The polypeptide of claim 1, comprising a full-length fragment C.

The polypeptide of claim 1, 2 or 3, which comprises a fragment of the pre-S1 region of at least 20 amino acids and / or a fragment of the pre-S2 region of at least 20 amino acids.

A polynucleotide which encodes for a polypeptide according to any one of the preceding claims.

A vector comprising the polynucleotide of claim 5, directed linked to a regulatory sequence.

7. The vector of claim 6, wherein said control.

The (surrogate side) sequence comprises the htrA promoter sequence.

A host cell comprising the vector of claim 6 or 7.

The host cell of claim 8, which is a bacterium.

A vaccine composition comprising a polypeptide according to any one of claims 1 to 4, a polynucleotide according to claim 5, or a vector according to claim 6 or 7, together with a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.

11. A method of treating or preventing HBV infection in a human or animal comprising administering to a human or animal an effective amount of a polypeptide of any one of claims 1 to 4, a polynucleotide of claim 5, or a vector of claim 6 or 7.

A method for preparing antibodies that recognize epitopes within the pre-S1 or pre-S2 regions of HBV, comprising administering the polypeptides of any one of claims 1 to 4, the polynucleotide of claim 5, or the vector of claim 6 or 7 to a mammal. .

The antibody prepared by the method of claim 12.

14. A method of treating HBV infection in a human or animal comprising administering an effective amount of the antibody of claim 13 to a human or animal.