CZ20011905A3

CZ20011905A3 - Způsob separace nukleových kyselin do populací

Info

Publication number: CZ20011905A3
Application number: CZ20011905A
Authority: CZ
Inventors: Oystein Ihle; Terje Einar Michaelsen; Berit Johne
Original assignee: Axis-Shield Poc As
Priority date: 1998-11-30
Filing date: 1999-11-30
Publication date: 2002-03-13
Also published as: WO2000032812A1; NO20012630D0; ATE259426T1; GB9826247D0; ES2212681T3; BR9915809A; NO20012630L; US20040253584A1; JP2002531099A; DE69914804T2; DK1144692T3; CA2353103A1; EP1144692A1; AU771985B2; DE69914804D1; CN1344331A; EP1144692B1; AU1398000A

Description

Popisuje se způsob separace fragmentů nukleových kyselin. Zejména se popisuje způsob separace z populace molekul nukleových kyselin, které jsou značeny nebo jsou schopné být značeny části, kterou je možné imobilizovat na matrici.

Dosavadní stav techniky

Manipulace s DNA je základ většiny biotechnologických metod. Manipulace DNA v typickém případě zahrnuje štěpení endonukleázami za použiti specifických restrikčních enzymů, které štěpí DNA na fragmenty. Pak následuje čištěni fragmentů DNA, začleněni požadovaného fragmentu do klonovacích vektorů a transfer těchto vektorů do nepřirozených hostitelů za účelem biologická informace a/nebo exprese jakým je terapeutický produkt.

exprimovat a spojovat přičemž vzniká začleněné DNA do eukaryontní proteiny v bakteriích.

molekuly DNA nebo fragmenty je biotechnologie. Tyto polymerázovou řetězcovou prostředkem ve výzkumu hodnotná produktu, například

To umožňuje

Schopnost štěpit moderní základ fragmenty DNA se reakcí (PCR), a v průmyslové metoda umožňuje amplifikovat specifické za použiti specifických krátkých primerů často tvoři která je nyní běžným biotechnologii. Tato molekuly DNA způsoby nukleových kyselin za vzniku velkého množství DNA, která se pak může dále upravovat například za použiti dřivé uvedených metod klonování.

Metody zpracováni nukleových kyselin, které zahrnují použití molekul DNA vytvořených například způsoby dříve uvedeným štěpením restrikčnimi enzymy nebo PCR nejsou často účinné, což je způsobeno alespoň z části přítomností nežádoucích molekul DNA. Takové „nežádoucí molekuly zahrnují například vektor DNA, což je výsledek štěpení, zejména neúplné *<····· · · · ·· « · • / · · · ·· · · ·· · <·· · ···· ··· ’» · ··· · · · · · ·· • · · · ···· · ·· • · ·· ·· ·· · « · · · excize začleněného fragmentu DNA z rekombinantní molekuly, částečně štěpených restrikčních fragmentů nebo jiných vedlejších produktů štěpení molekul DNA restrikčními enzymy, nadbytek PCR primerů, nesprávně ligovaných molekul nukleových kyselin, které jsou vedlejšími produkty manipulace nukleových kyselin a produktů PCR, které jsou výsledkem nesprávné hybridizace primeru PCR s templátovou nukleovou kyselinou.

Kvalita primárního konečného produktu

DNA je rozhodující pro úspěch dalších manipulací, jako je ligace a transformace bakteriálních nebo eukaryontních hostitelských buněk.

Schopnost separovat směsi molekul nukleových kyselin, jako jsou směsi molekul nebo fragmentů DNA do různých populací, čímž se odstraní to, co se považuje za „nežádoucí nebo kontaminující populace z požadované nebo cílové molekuly nukleové kyseliny by tak zesílila účinnost dalšího zpracování nebo dalších kroků použití takových vytvořených molekul nukleových kyselin.

Způsoby čištění molekul nukleových kyselin jako třídy, jsou známy v oboru. Existují však omezeně dostupné způsoby, které mohou separovat směsi molekul nukleových kyselin, jako jsou směsi obsahující několik různých molekul DNA, do různých populací. V obecném případě se tyto metody opírají o separaci molekul nukleových kyselin nebo fragmentů podle velikosti například způsoby elektroforézy na agarózovém nebo polyakrylovém gelu, pak následuje čištění požadované molekuly nebo fragmentu. Tyto metody mají řadu nedostatků. Jedním limitujícím faktorem je kapacita samotného gelu, která limituje množství separovaného DNA. DNA potřebuje být zviditelněna na gelu obecně způsobem barvení etidiumbromidem. Kromě toho, že je etidiumbromid pro uživatele toxický, může se podílet na snížení kvality nukleové kyseliny tak, že použití při dalších aplikaci může být obtížné. Izolace molekul nukleových kyselin dělených na gelu elektroforézou není také účinné a vede k podstatným ztrátám, často alespoň 20 % DNA.

·« ···· ·· ·· ·· · ·ο· · · ·· · · ··· ' · · · · ·· ·· · • · ··· ·· ··· · · • · · · ···· · · · • · · · ·· · · ·· ···

Způsoby gelové elektroforézy jsou také časově náročné. DNA je křehká molekula a je náchylná k působení endonukleáz a exonukleáz. Poměrně dlouhý proces elektroforetické separace, během kterého je DNA náchylná k rozpadu, může tak být ke škodě integrity DNA a ovlivňuje účinnost dalšího zpracování. Takové separační metody jsou tak neúčinné a nákladné. Existuje tak nutnost vytvořit novou metodu, která alespoň částečně separuje molekuly nukleových kyselin do různých populací. Vynález takové metody popisuje.

Podstata vynálezu

Podle vynálezu existuje způsob alespoň částečné separace molekul nukleové kyseliny ve vzorku do populací, kde populace je značena nebo schopná být značena částí, kterou je možnou imobilizovat na matrici. Uvedená metoda obsahuj e kontakt nukleové kyseliny ve vzorku s matricí, přičemž značené molekuly se zachytí na matrici a tím se oddělí od neznačených molekul.

Tato metoda je daleko jednoduší než dříve v textu uvedená metoda elektroforetická separace a je také rychlejší. Tato metoda je také méně nákladná a vykazuje vyšší účinnost a nevykazuje nedostatky spojené s elektroforetickou separací.

Způsob se zakládá na skutečnosti, že značené molekuly nukleové kyseliny se zachytí na matrici, což znamená, že se imobilizují nebo zůstávají na matrici, což způsobuje oddělení od neznačených molekul, které zůstávají v roztoku.

Způsob podle vynálezu se může použít k separaci neznačených molekul nukleové kyseliny (cílové molekuly) od značených nežádoucích molekul nukleové kyseliny, které jsou zachyceny na matrici, přičemž cílové molekuly zůstávají volné v roztoku. To je výhodné v případě, kde požadované cílové molekuly nukleové kyseliny jsou určeny pro další zpracování, • · · · například dalšími metodami genetické manipulace, protože tyto metody umožňují provést další kroky, aniž je nutné eluovat nebo jinak uvolnit požadované molekuly nukleové kyseliny z matrice a také je možné se vyhnout, je-li to nutné, odstranění značky z molekul nukleové kyseliny. Tato metoda tvoří hlavní předmět vynálezu. Popsaný způsob se však také může použít při oddělení značených molekul nukleové kyseliny od neznačených nežádoucích fragmentů nukleové kyseliny, přičemž cílové molekuly se zachytí na matrici a nežádoucí molekuly nukleové kyseliny zůstávají v roztoku. Navíc je možné metodu použít ke shromáždění všech separovaných frakcí nukleové kyseliny pro různé účely použití.

Termín „molekula nukleové kyseliny znamená libovolnou molekulu nukleové kyseliny zahrnující DNA, RNA, cDNA a hybridní sloučeniny, jako jsou sloučeniny obsahující nukleové kyseliny a peptidy, jako peptidové nukleové kyseliny (PNA). V případě DNA zahrnují dvouřetězcové a jednořetězcové molekuly a libovolnou syntetickou molekulu DNA nebo RNA a hybridní molekuly DNA/RNA (to znamená molekuly, kde jeden řetězec je DNA a druhým řetězcem je RNA) . Termín „cílová nebo „požadovaná DNA znamená molekulu nukleové kyseliny, která je určena k izolaci nebo separaci z jiných molekul nukleové kyseliny. V souladu s vynálezem termín „tag znamená část, která se může připojit k molekule nukleové kyseliny nebo se na ni navázat nebo se do ní začlenit nebo jí může být nesena nebo může být součástí nukletodivé sekvence molekuly nukleové kyseliny nebo může být jiným způsobem spojena s molekulou nukleové kyseliny a slouží jako prostředek oddělení značené populace molekul nukleových kyselin ze vzorku, který obsahuje nukleové kyseliny, kde jedna určitá populace je značena tímto způsobem a jiná populace není značena. Značka umožňuje frakcionaci směsi nukleových kyselin, přičemž značené molekuly se oddělují od neznačených molekul zachycením za použití matrice. Značka se může začlenit do molekuly nukleové φ · · · · · · φ φ φ φ · φ •C ♦ · · · · · · · Φφ ♦□ · · φφφφ φ φ · • · φφφ φφ φφφ · φ • •φφ φφφφ ·· · • · ·· ·· φ · φ φ φφφ kyseliny, to znamená, že může být částí molekuly nukleové kyseliny, může být například čászí upraveného nukleotidu a může se začlenit do molekuly nukleové kyseliny během syntézy nebo může být součástí sekvence molekuly nukleové kyseliny, a v tomto případě se samotná nukleové kyselina nazývá značenou nebo značka může být zachycena nebo vázána na molekulu nukleové kyseliny například kroky následujícími po syntéze například adicí terminálních nukleotidů nebo navázáním na rozeznávanou sekvenci se sekvencí nukleové kyseliny, přičemž nukleové kyselina bez zachycené značky se popisuje jako „schopná být značena.

Způsob se může použít k separaci nebo k frakcionaci libovolných dříve uvedených tříd nukleové kyseliny nebo jejich směsí. Výhodné provedení vynálezu popisuje frakcionaci molekul DNA nebo fragmentů ve vzorku, která alespoň částečně separuje vzorek do různých populací molekul nukleové kyseliny. Příklady takových metod zahrnují separaci určitých restrikčních fragmentů od DNA štěpené resorikčním enzymem, například molekuly DNA vytvořené PCR nebo molekuly rekombinantní DNA a tzv. „čištění reakcí PCR. To znamená odstranění produktů PCR, které jsou výsledkem nesprávné hybridizace primeru. Tato metoda má také další využití a může se například použit k separaci lineární a kruhové nukleové kyseliny při diagnostické PCR a in vitro balení bakteriofága.

Částí užívanou ke značení molekul nukleové kyseliny v souladu se způsobem podle vynálezu může být libovolná část, která je schopna značit molekulu nukleové kyseliny a imobilizat se na matrici.

Imobilizace může být buď přímá nebo nepřímá interakce s matricí. Značka tak může žýz samotná odpovědná za imobilizaci na matrici nebo značka může působit prostřednictvím vložené nebo navázané části, která je • · * «t Ό· ·

•9 99 99 9 odpovědná za interakci s matricí, jako je vazebný partner vhodný pro značku.

Vynález tak popisuje způsob alespoň částečné separace molekul nukleové kyseliny ve vzorku do populací, kde populace je značena nebo je schopna být značena části, jenž je schopna se imobilizovat na matrici buď přímo nebo nepřímo prostřednictvím vazebného partnera vhodného pro značku, přičemž uvedená metoda zahrnuje kontakt nukleové kyseliny ve vzorku s matricí nebo v případě, že značka interaguje nepřímo s matricí prostřednictvím vazebného partnera, s vazebným partnerem vhodným pro značku a s matricí, čímž značené molekuly jsou zachyceny na matrici a tak se oddělí od neznačených molekul.

Podstata značky závisí alespoň částečně na molekulách, které se separuji a na použití matrice. Příklady vhodných značek zahrnují části, které se mohou začlenit do molekuly biotin, nukleové kyseliny, jsou to například ligandy jako fluorescein nebo steroidy nebo molekuly podobné steroidům, jako je digoxygenin nebo jednotlivých nukleotidů v které se mohou použít k modifikaci molekule nukleové kyseliny a části jako proteiny. Mohou to být například proteiny, které mají afinitu k určitému vazebnému místu v molekule nukleové kyseliny.

Značka se pak může zavést do molekuly nukleové kyseliny během její syntézy, například prostřednictvím značeného nukleotidu nebo po nukleotidů na jeden konec reakce. V závislosti na syntéze například adicí značených například způsoby enzymatické použité matrici značka může interagovat nepřímo prostřednictvím vazebného partnera vhodného pro a tak působí tag, který jako vazebné činidlo.

slouží k imobilizaci značky na matrici

Vazebný partner může samotný interagovat přímo s matricí nebo může interagovat cestou dalšího vazebného činidla, kdy · · 9 9 · ét *7 · · · · · · ···

I* · ··· · · ··· ·· <· · · · · · · · ··· • · ·· ·· ♦♦ · · »·· značené molekuly mohou procházet postupnými nebo konkurujícími vazebnými kroky, aby umožnily značené molekule se zachytit na matrici.

V jednom provedení vynálezu může být značka malá molekula ligandu. V tomto případě značená molekula nukleové kyseliny se imobilizuje na matrici v souladu s vynálezem pomocí vazebného partnera na ligand, který se může imobilizovat na matrici ve formě matrice odvozené od vazebného partnera nebo který může sloužit jako separující vazebná skupina k imobilizaci značky na matrici.

V jednom provedení takové metody se vzorek nukleové kyseliny nejdříve přivede do kontaktu v roztoku s vazebným partnerem ligandové značky, který se váže pouze na značené molekuly nukleových kyselin a molekuly značených nukleových kyselin vázaných na vazebném partneru se pak extrahují pomocí matrice s afinitou pro vazebného partnera. V jiném provedení vynálezu se vazebný partner nejdříve imobilizuje na matrici a pak je v kontaktu se vzorkem nukleové kyseliny, přičemž na membráně zůstanou pouze značené molekuly nukleové kyseliny.

V tomto provedení vynálezu se vazebný partner může imobilizovat na matrici za použití běžných metod vhodných pro daný typ matrice a vazebného partnera, které zahrnují přímou chemickou vazbu, jako je kovalentní vazba, adsorpce nebo afinitní navázání.

Jedním příkladem ligandové značky, která se může použít podle vynálezu, je biotin. V oboru jsou známy i jiné značky.

V případě, že se jako ligand použije biotin, vazebným partnerem je avidin nebo streptavidin a matrice musí vykazovat afinitu vůči proteinům a proto je schopna zachytit streptavidin nebo avidin a libovolné molekuly, na které se streptavidin a avidin váží. Avidin a streptavidin se mohou také použít jako vazebný partner v případě biotinu. Když se dále v textu zmíní streptavidin, což je bakteriální protein, je zřejmé, že se může použít také avidin. Biotin je možné snadno začlenit do nukleotidů a určité biotinylované nukleotidy jsou běžně dostupné. Také jsme zjistily, že použití biotinu jako značky podle vynálezu je velmi účinné. Biotin vzhledem k tomu reprezentuje preferovanou značku podle vynálezu.

V jednom provedení vynálezu, kde se jako ligand používá biotin, biotinylované molekuly nukleové kyseliny se mohou nejdříve inkubovat v roztoku se streptavidinem, přičemž streptavidin jako vazebný partner se bude vázat na molekuly nukleové kyseliny obsahující biotin a tvořit vazebný komplex. Tyto značené molekuly se zachyceným streptavidinem se pak následně imobilizují pomocí matrice schopné selektivně imobilizovat proteiny, zatímco tato matrice není schopna zmobilizovat nukleové kyseliny alespoň za použitých podmínek, čímž se ze vzorku separují molekuly nukleové kyseliny obsahující biotin.

V jiném příbuzném provedení vynálezu, kde se jako značka používá biotin, samotná matrice bude obsahovat vázaný nebo zachycený streptavidin. V takovém případě kdy vzorek nukleové kyseliny v roztoku je v kontaktu s matricí molekuly značené biotinem drží na matrici a neznačené molekuly zůstávají volně v roztoku.

V jiném provedení vynálezu značka může být ligandem jako je fluorescein nebo digoxigenin nebo antigen. Tyto značky se mohou zachytit na matrici pomocí vazebných partnerů vhodných pro tyto značky. Mohou to být například protilátky proti značce, buď polyklonální nebo monoklonální, nebo fragment takové protilátky. V případě, že ligand je steroid zachycení se může uskutečnit pomocí protilátky nebo jejího fragmentu nebo receptoru pro steroid nebo pro jeho fragment, který *· ···· ·· 999 · β ···· · ,· ·

V · * · · · ·4 ♦ · • · ···*&«·«· · • · · · « · · · · · ·

99 99 99 99999 vykazuje vazebné vlastnosti steroidu. Tyto způsoby zachycení se mohou využít podobným způsobem jako shora uvedený streptavidin s matricí, která vykazuje afinitu vůči streptavidinu.

V dalším provedení vynálezu značkou může být protein, upřednostňuje se protein vázající nukleovou kyselinu, který má ve značené molekule nukleové kyseliny specifickou rozeznávanou sekvenci. Příklady takových proteinů, které se vážou na nukleovou kyselinu, zahrnují transkripční faktor AP-1, který se váže na rozeznávací sekvenci AP-1, protein myb, který se váže na specifickou krátkou rozeznávací sekvenci a proteinový represor láci, který se váže na sekvenci operátoru lac.

V příbuzném provedeni vynálezu se na značku může pohlížeL jako na sekvenci nebo sekvence nukleové kyseliny v molekule nukleové kyseliny, jako je specifická rozeznávaná sekvence. Takové sekvenční značky mohou vykazovat afinitu vůči proteinu, který se váže na matrici. Příklady zahrnují shora zmiňovanou rozeznávanou sekvenci AP-1, na kterou se AP-1 jako vazebný partner může vázat, čímž způsobuje navázání na matrici vázající protein. Podobně protein myb jako vazebný partner se může vázat na specifickou krátkou rozeznávanou sekvenci jako značku a protein láci jako vazebný partner se může vázat na sekvenci operátora jako značka.

V takových provedeních vynálezu vzorek obsahující molekuly nukleové kyseliny, které zahrnují proteinovou rozeznávanou sekvenci se mohou nejdříve dále značit v roztoku kontaktem s proteinem rozeznávaným specifickou sekvencí a pak vzorek je v kontaktu s matrici, na které jsou zachyceny značené molekuly, přičemž neznačené molekuly, to znamená molekuly bez vázaného proteinu, zůstávají v roztoku. V jiném případě protein vázající DNA se může imobilizovat na matrici a pak se může použít k zachycení nukleové kyseliny z roztoku podobným způsobem jako shora v textu popsané metody, které používají streptavidin.

V každém z těchto provedení vynálezu se protein podílí na zachycení populace molekul nukleové kyseliny buď jako samotné značky nebo jako vazebného partnera vhodného pro značku (jako je protilátka nebo streptavidin). To je výhodné, protože to umožňuje použít jako matrici materiály citlivé vůči proteinu, přičemž se upřednostňují materiály, které vykazují selektivní navázání proteinů a které se nevážou na nukleové kyseliny, • alespoň za použitých podmínek, čímž se zaručí, že neznačené molekuly se nezachytí na membránu a neoddělí se od vzorku. Protein se může zachytit matricí a vázat se řadou interakcí, které zahrnují například iontovou interakci, hydrofóbní interakcí a afinitní navázání.

Matrice se může vyskytovat v libovolné fyzikální formě a řada jich je známa v oboru, například listy papíru, gely, filtry, membrány, vlákna, trubičky, mikrotitrační destičky, kolony, částice a mohou se skládat s částí nebo mohou být porézní. Porézní materiály jako jsou filtry a membrány jsou vhodné pro separační metody podle vynálezu buď odfiltrují nežádoucí značenou DNA nebo umožňují shromáždit žádanou značenou DNA. Příklady zahrnují vzorky, kde neznačená populace je určena pro další zpracování a kde značená populace nukleové kyseliny obsahující „nežádoucí populaci se může zachytit z roztoku na membráně, poněvadž tento způsob přímo směřuje k filtraci vzorku přes membránu nabízející účinnou a rychlou metodu záchytu a současně oddělení populace neznačené nukleové kyseliny do filtrátu a tak nabízí přímou cestu do dalšího stádia manipulace. Porézní materiály, jako jsou membrány, tak obsahují preferovanou matrici vhodnou pro použití podle vynálezu.

Porézní materiály se tak mohou vhodně použít pro odfiltrování nežádoucích značených molekul nukleové nebo ke shromáždění žádaných značených molekul kyseliny nukleové kyseliny.

Takové matrice se mohou použít jako část zařízení pro jednoduchou nebo vícestupňovou separaci nebo jako součást jiných kroků, jako je detekce, proces hodnocení nebo kvantifikace DNA nebo libovolného jiného produktu. Tyto porézní matrice se mohou začlenit do separačního zařízení jako centrifugační zkumavky, mikrotitrační destičky, kazety nebo injekční stříkačky a v závislosti na vzorku a dalším zpracování se do sériového uspořádání může začlenit jeden nebo více takových zařízení.

Taková zařízení se mohou obsluhovat manuálně, semi-automaticky nebo zcela automaticky.

V jednom provedení vynálezu se může použít NycoCard™. V případě, že značený fragment nukleové kyseliny je sekvence nebo molekula, která se má detekovat, může se po navázání například na protein s afinitou vůči značce zachytit přímo na membráně vázající protein upevněné v zařízení NycoCard. Takové zařízení bude zahrnovat vhodnou membránu s absorpčním polštářem, jako je celulózový papír umístěný na jedné straně, aby se zesílil průchod kapalného vzorku membránou. V jednom provedení vynálezu propustný list papíru se může umístit přes druhou stranu membrány a díry umožní aplikovat vzorky na membránu v případě, že se analyzuje více vzorků. V případě, že se eliminují značené sekvence a shromáždí se neznačené nukleové kyseliny, filtr vázající protein se může použít jako pre-filtr umístěný přes filtr vázající nukleovou kyselinu vrstvený do zařízení NycoCard tak, že nežádoucí značené molekuly se zachytí na pre-filtru a požadované neznačené molekuly zůstávají na filtru, který váže nukleové kyseliny.

Matrice může obsahovat různé materiály vhodné pro tyto účely zahrnující polymerní materiály, jako je například celulóza, polystyren, agaróza, latex, které se mohou ··· ·*·· ··· • · ··· ·· ··· · · ···· ···· ·· · • · ·· ·· · ♦ ·· ··· derivatizovat nebo upravovat tak, aby došlo k zachyceni samotné značky nebo vazebného partnera značky, který působí jako spojovací činidlo mezi značkou a matrici. Tak například se materiál může ošetřit potažením látkou, která vykazuje například afinitu vůči značce něco vazebným partnerem nebo spoj ovacím činidlem užívaným k zprostředkování zachycení značky. Je výhodné, když matrice specifická pro značku ve srovnání že neznačené molekuly nej scu nebo vazebný partner bude s nukleovou kyselinou tak, matrici.

zachyceny na

V preferovaném provedení podle ynálezu proces zachycení zahrnuje protein, buď kde která má proteinového vazebného značka nebo je to látka, partnera, který slouží ke spojení značky s matricí a matrice je náchylná navázání proteinů.

Příklady jsou známy v oboru a zahrnují známé matrice vázající protein potažené polyméry, které vykazuj i specifickou afinitu k proteinům alespoň za použitých podmínek. Matrice se může substituovat vazebným partnerem nebo může vazebného partnera nést, což se popisuje v dokumentu WO 90/04786. Může být zahrnuto přímé chemické navázání, jako je kovalentní vazba, adsorpce nebo afinitní navázání. Zvláště se preferují membrány, které obsahuji polyméry vázající protein, jako jsou ty popsané v dokumentu WC 98/23630, EP-0524800 a EP

0580305, například Centriflex™ od firmy Edge Biosystems, USA.

Separačni metoda podle vynálezu je zvláště vhodná tam, kde se vzorek dělí na frakce a shromažďují se neznačené molekuly nukleových kyselin v roztoku za účelem dalšího zpracování. Způsob se však také může použít tam, kde pro další zpracování se shromažďují značené molekuly nukleových kyselin. V případě, že se shromažďuji značené molekuly, musí se uvolnit z matrice a v závislosti na použité metodě zachycení se také musí uvolnit z vazebného partnera pro značku. Používaný způsob • · · · · ♦ · ♦ · · · · · uvolnění může záviset na podstatě značky a na jejím vazebném partneru a typu a síle jejich vzájemných vazebných sil.

Reakční podmínky vybrané pro krok uvolnění se mohou také vybrat jako prevence uvolňované značené nukleové kyseliny ze spojení s matricí nebo s jeho vazebným partnerem. Příklady takových metod jsou známy v oboru. S cílem uvolnění značených molekul nukleových kyselin z matricového vazebného komplexu se mohou měnit chemické nebo fyzikální podmínky. Příklady chemických metod zahrnují měnící se iontovou sílu nebo hodnotu pH, adici chelatačních činidel a použití kompetetivních volných molekul značek nebo jejich chemicky příbuzných molekul, molekul obsahujících značky nebo části podobné značce, molekuly nebo ionty, které mění konformaci vazebného partnera, čímž omezují, eliminují nebo modifikují interakci značka-vazebný partner, přidání detergentů nebo disociačních činidel nebo aplikací enzymů. Příklady fyzikálních metod zahrnují změny teploty, sonikaci, vibraci. Může se použít libovolná kombinace těchto fyzikálních a chemických metod.

V závislosti na síle interakce mezi značkou a jejím vazebným molekulu partnerem je možné uvolnit značku nebo značenou z vazebného partnera nebo z matrice způsobem přidání nadbytku značky, která soutěží se značenou DNA o místa zachycení na vazebného partnera pro značku nebo matrici a uvolněni značené DNA se může jednoduše provést vymytím.

V případě, že značka je fluorescein a vazebný partner je protilátka proti fluoresceinu, pak komplex fluorescein-DNA se může uvolnit z matrice adicí volného fluoresceinu do roztoku. Tam, kde interakce vazebný partner-značka, vazebný partnermatrice nebo značka-matrice je silná, přidání volné značky není vždy účinné při porušení interakce. V tomto případě se mohou použít jiné metody, jako je degradace vazebného partnera například pomocí pH nebo enzymů takovým způsobem, že se uvolní z matrice. Uvolnění se může také provést porušením matrice, ·· ···· · · ·· ·· · ·· · · · · · ···· • · · ···· ··· * · ··· ·· ··· · · ···· ···· ·· · • · · · · · · · ·· · · · přičemž vzniká forma, která není schopna vázat proteiny. K tomu může dojít použitím chemických činidel tak, že se uvolní komplex protein-DNA nebo protein-značka-DNA nebo chemickým způsobem, který poruší interakci nebo jinak ovlivní afinitu mezi proteinem a matricí.

Vazebný pár biotin-streptavidin vykazuje zvláště silné interakce a tak není náchylný k porušení pomocí přidání volného biotinu. Tak v případě, že značka je biotin a značená DNA je zachycena na matrici pomocí avidinu nebo streptavidinu biotinylovaná DNA se nemůže uvolni“ z membrány přidáním volného biotinu. Tato metoda se však může použít tam, kde značka je derivát biotinu s nižší vazebnou afinitou než biotin vůči streptavidinu. V tomto případě značená DNA se může uvolnit z matrice přidáním volného biotinu. Ten může soutěžit s biotinylovanou DNA o místa zachycení na streptavidin a uvolněná biotinylovaná DNA se může jednoduše z matrice vymýt.

V závislosti na použité značce může být nezbytné začlenit krok, kdy se značená DNA určená pro další zpracování uvolní z vazebného partnera vhodného pro značku, který slouží k imobilizaci značené DNA na matrici. Příklady zahrnují přidání chemických látek nebo iontů nebo aplikaci fyzikálních podmínek schopných redukovat vazebné síly mezi značkou a jejím vazebným partnerem a pak shromáždit uvolněnou DNA.

Způsob podle vynálezu se může použít řadou různých aplikací, které zahrnuji analytické, preparační a diagnostické použití, jejichž příklady se popisují dále v textu. Jiné aplikace jsou dobře známé v oboru.

Důležitou aplikací vynálezu je štěpení a ligace molekul DNA, jako je separace určitých produktů štěpeni restrikčními enzymy a separace ligovaných kruhových molekul DNA z jiných produktů ligačních reakcí.

······ ·· · · ·· · • · ···· ···· • · · · · · ··· • ··· ·· ··· · · ··· · · · · · · · • · · · ·· ·· ·· ··· jakovou jednou aplikaci podle vynálezu je manipulace fragmentů štěpených restrikčnim enzymem DNA zvláště v případě, kde je nutný specifický fragment pro další zpracování, přičemž je nutná separace z jiných produktů enzymatické reakce. Separační metoda umožňuje separovat populaci lineárních molekul DNA, které jsou značeny na obou koncích, od neznačených molekul. Značené molekuly se mohou značit během syntézy na příklad za použití značených nukleotidů jako jsou biotinylované nukleotidy například ve formě biotinylovaných primerů nebo molekuly se mohou značit enzymaticky metodami značení konců, které jsou dobře známy v oboru.

Vynález poskytuje metodu pro alespoň částečnou separaci směsi fragmentů DNA štěpených restrikčnim enzymem, kde počáteční materiál je molekula lineární DNA, která je značena nebo je schopná být značena blízko jednoho nebo obou konců s částí schopnou imobilizace na matrici. Uvedená metoda zahrnuje štěpení molekuly DNA restrikčnim enzymem následovaným kontaktem vzorku s matricí, přičemž značené molekuly, které pochází z konce počátečního materiálu jsou zachyceny na matrici a tak se separují od neznačených molekul.

Tato metoda je zvláště vhodná pro separaci produktů štěpení DNA produkované PCR vzhledem ke způsobu syntézy. Při způsobu PCR amplifikace DNA se použily dva specifické oligonukleotidové primery, přičemž jeden z nich je komplementární s 5' koncem kódujícího řetězce a proto s ním hybridizuje tak, že v přítomnosti DNA polymerázových enzymů se může syntetizovat kopie sekvence celé délky. Tato kopie bude mít primární oligonukleotid řetězců syntetizované DNA na PCR syntetické metody se specifických molekul nebo genetickou manipulaci, kde sp štěpením restrikčnim enzymem začleněný do každého ze dvou 5'konci každého řetězce. Takové často používají při přípravě fragmentů DNA pro následnou icifický fragment se může získat delšího produktu PCR. Jak se ·· ···· · · ·· • · · · · · · • · · · · · · zmiňuje shora v textu tyto následné manipulace jsou často neúčinné, protože přítomnost v následných krocích, jako je ligační směs jiných produktů ze štěpení restrikčním enzymem, jako jsou zvláště štěpené produkty a neštěpené molekuly DNA. Za okolností, kdy existuje vnitřní fragment produktu PCR celé délky, který se bude dále zpracovávat „nežádoucí vedlejší produkty štěpení restrikčním enzymem bude zahrnovat alespoň jeden konec produktu PCR plné délky, přičemž metoda podle vynálezu se může použít k ovlivnění alespoň jedné částečné separace produktu od fragmentů, kreré obsahují konec sekvence a neštěpené molekuly využívající značené primery biotinylovaných primerů. Tímto způsobem se mohou například odstranit značené vzorku nukleové kyseliny, v roztoku, který obsahuj e požadovaný vnitřní fragment, který, protože nezahrnuj e konec pro začlenění PCR primeru, nebude značen.

Dalším aspektem vynálezu týkající se metodologie PCR je tzv. čištění produktů reakce PCR. To znamená odstranění nežádoucích produktů, které zahrnují produkty, které jsou výsledkem nesprávné hybridizace primerů. Čím je větší templát nukleové kyseliny, tím to může bý“ větší problém. Tuto metodu lze využít tam, kde existují místa rozeznávaná restrikčními enzymy nebo jiné štěpitelné sekvence, na koncích nebo blízko koncům vzorku amplifikované nukleové kyseliny pomocí reakce PCR.

Metoda zahrnuje použití primerů PCR, které jsou značeny nebo jsou schopny být značeny a které jsou komplementární s konci amplifikované sekvence a tak jsou schopny hybridizovat s templátovou nukleovou kyselinou a které se také překrýváj í pouze částečně s každým jediným restrikčním místem.

S použitím primerů, které jsou komp1eme n t á r n i s celou sekvencí rozeznávanou restrikčním enzymem, a také s ní hybridizují, každá molekula nukleové kyseliny produkovaná reakcí PCR ponese • · ···· ·· · · · · · • · · ···· ···· ··· · ♦ · · ··· • · ··· ·· ··· · · ···· ···· ·· · • · · · ·· ·· ·· ··· místo rozeznávané restríkčním enzymem bez ohledu na to, zda primer hybridizuje s požadovanou sekvencí nebo zda produkt PCR je výsledkem nesprávné hybridizace primeru. Za použití primerů, které hybridizují pouze z částí místa rozeznávaného restríkčním enzymem v templátu, je pouze v produktech PCR, které se získaly hybridizací, kde místo rozeznávané restríkčním enzymem se rekonstituuje v produktu PCR. Pak použitím značených primerů nebo primerů, které jsou schopny značení, je možné čistit produkty reakce PCR uskutečněním reakce PCR a následným štěpením uvedených produktů určitými restrikčními enzymy specifickými pro uvedené jediné restrikční místo. Při takovém štěpení restríkčním enzymem jsou správné produkty pouze ty, co jsou štěpeny, a protože štěpení vede k odstranění primeru a značky, jsou to ty, který se mohou separovat od nežádoucích produktů extenze PCR, které když nejsou štěpeny restrikčními enzymy si ponechávají značku.

Vynález popisuje způsob alespoň částečné separace správného a požadovaného produktu amplifikace PCR z PCR produktů, které vznikly na základě nesprávné hybridizace primeru PCR na templát, kde uemplátová nukleová kyselina obsahuje místo rozeznávané jediným restríkčním enzymem na konci templátu a primer PCR, který je značen nebo je schopen být značen, je komplementární se sekvencí na templátu, který se částečně rozšířil do jedinečného restrikčního místa. Metoda obsahuje amplifikaci templátu pomocí PCR, štěpením produktů PCR restríkčním enzymem, který je specifický pro uvedené místo rozeznávané jediným restríkčním enzymem a kontakt výsledného produktu s matricí, která je sohcpna maskovat značku, čímž značené molekuly nukleové kyseliny se zachytí na matrici, čímž se separují od neznačených molekul.

Místo	rozeznávané jediným restríkčním enzymem znamená
restrikční	enzymy, které mají pouze jedno rozeznávané místo
v molekule	templátové nukleové kyselině, ale také zahrnují

······ ·· ♦ · ·· · • · · · · · ···· • · ···· ··· speciální případ, kde přítomno na každém konci stejné templátu.

V jednom provedení vynálezu restrikční místo může být molekula templátové nukleové kyseliny, která se má amplifikovat pomocí PCR, začleňuje pouze jediné restrikční místo pouze do jednoho z konců. Když se produkty reakce ošetři čištění produktů PCR do hybridizace primeru, která zahrnuje toto tímto enzymem vede to k stupně, který je který hybridizuje s jediné místo, jenž závislý oblastí částečnému na stupni templátu, je odpovědné za nesprávnou hybridizaci. V tomto provedeni vynálezu to je primer, který se prodloužil do místa rozeznávaného jediným restrikčním enzymem, který je značen nebo je schopen být značen.

V preferovaném provedení vynálezu templát amplifikovaný PCR začleňuj e místo jediného restrikčního enzymu na každém konci.

Tato místa mohou být restrikční enzym.

To znamená restrikční místa pro enzym, který stejný štěpí templát a jsou místa kopie PCR dvakrát, jednou na pro různé restrikční enzymy, každém konci nebo to enzymů vykazuje v templátu pouze jediné kdy každý z uvedených rozeznávané místo a tyto dvě místa jsou každé na každém konci templátu.

V této metodě umístění každého jediného restrikčního místa ve vztahu ke konci templátu nukleové kyseliny závisí alespoň z části na určitém restrikčním enzymu, protože různé enzymy mají různou minimální vzdálenost od konce pro účinné štěpení restrikčním enzymem. Tyto reference jsou známy v oboru a jsou popsány například v katalogu výrobců restrikčních enzymů. V obecném případě restrikční místo bude alespoň ve vzdálenosti jedné báze od konce. Volba enzymu a jeho poloha se může snadno stanovit odborníkem na základě znalostí v oboru a podle informací výrobce. V obecném případě se restrikční místo bude nacházet alespoň v minimální vzdálenosti od konce, aby mohlo dojít k účinnému štěpení odpovídajícím enzymem Příklady uvedených minimálních vzdáleností jsou alespoň jedna báze od konce pro BamHI a alespoň šest bázi od konce pro Ndel. Minimální vzdálenosti se mohou zjistit z publikovaného katalogu výrobců restrikčních enzymů, například katalog firmy New England Biolabs 1999 a v publikaci Moreira and Nořen, Biotechiques 19, 56-59 (199) .

Pak použitím nebo známých v oboru se konstrukcí pomocí metod rekombinace DNA j ediného templát obsahující místo restrikčního enzymu blízko každého konce je možné odstranit nežádoucí PCR produkty, které jsou výsledkem hybridizace primerů PCR v polohách na templátu jiném nesprávné než jsou určeny.

V případě, že oba primery jsou značeny nebo jsou schopny být značeny, všechny produkty

PCR se budou zpočátku značit na obou koncích. Vystavením produktů

PCR štěpení restrikčním enzymem vybraným ze shora uvedených restrikčních enzymů, které mají jediná rozeznávací místa na každém konci templátu buď současně nebo postupně, molekuly, které se neštěpí nebo se štěpí pouze na jednom konci zůstávají značeny jako bude konec ze správného produktu PCR, který se vytvořil štěpením restrikčním enzymem. Tyto se mohou separovat od požadovaného produktu, který bude mít oba primery odstraněné a tak nebude dále obsahovat značku nebo část schopnou být značena. To má výhodu, že se zabrání vynaložení velkého množství času a materiálů k vyladění reakce PCR, jak je potřeba v případě gelové elektroforézy nebo jiných metod separující produkty PCR podle velikosti. Alespoň částečného čištění je možné dosáhnout, jestliže pouze jeden ze dvou primerů PCR je značen nebo je schopný být značen.

Je vhodné, aby značka byl biotin, kdy produkty PCR před a po štěpení restrikčním enzymem jsou v kontaktu se streptavidinem a pak značené molekuly vázané se streptavidinem se separují matricemi vázajícími protein od neznačených molekul. V jiném případě streptavidin se může nanést na samotnou matrici, jak se popisuje shora v textu. V tomto ·· · ♦ ·» ·· · · ··· • · · ···· · ·· · • · · «······ • · · · · ·· · · · ·· • · · · · · * · · ·· • · ·· ·· · · * ···· určitém provedeni vynálezu se značka může připojit do libovolné polohy na primer, pokud 3'konec primeru je dostupný pro prodloužení polymerázou PCR. Je vhodné, když značka se může zachytit na 5' konci primeru, protože přidání značky do této polohy nezpůsobuje problémy při syntéze. Navíc se věří, že značka umístěná na 5'konci primeru bude s menší pravděpodobností interferovat s aktivitou PCR polymerázy a také že může být vhodnější pro zachyceni v libovolných zde popsaných metodách zachycení.

Příklad je zobrazen dále v textu:

5’-tttactggatcctag

3¹-aaatgacctaggatc ttacgtacattaatcgg-3¹aatgcatgtaattagcc-5¹

Tento fragment má dvě jediná restrikční místa, jedno pro enzym BamHI nalevo (ggatcc) a jedno pro enzym AsnI napravo (attaat). Aby se tento fragment amplifikoval obvyklým způsobem, připraví se dva primery značené biotiny na jejich 5'koncích, jak je zobrazeno dále v textu:

BamHI primer: 5 ¹ -biotin-tttactggatcctag-3 ¹AsnI primer: 5 ’ -biotin-ccgattaatgtacgtaa-3 '

Použitím těchto primerů v reakci PCR v typickém případě vzniká řada produktů, což je způsobeno nesprávnou hybridizací primerů během PCR.

Primery BamHI a AsnI zcela vnášejí nukleové rozeznávané sekvence do jejich sekvencí. Následkem toho každý fragment DNA produkovaný reakcí PCR za použití uvedených primerů má místa rozeznávaná restrikčním enzymem BamHI a AsnI. Všechny fragmenty produkované v reakci PCR budou štěpeny enzymem BamHI a AsnI, přičemž vznikají správné produkty (to znamená požadované produkty) a vedlejší produkty.

Použitím trochu kratších primerů v provedení podle vynálezu se mohou velmi účinně odstranit všechny nechtěné vedlejší produkty.

Příklad používaných krátký primer pro

BamHI:

krátký primer pro

AsnI:

primerů je:

5'-biotin-tttactgga-3 '

5'-biotin-ccgatt-3 ' tyto primery pouze částečně přesahují rozeznávaná místa pro restrikční enzymy.

Proto pouze hybridizací na jejich nukleová místa budou tvořit úplné místo rozeznávané enzymem.

V důsledku toho pouze správné (to znamená žádané) fragmenty produkované reakcí PCR jsou schopny být štěpeny oběma restrikčními enzymy.

Čtyři možné skupiny produktů PCR, které budou výsledkem použiti primerů (symbol B znamená biotinová značka) jsou následuj ící:

' -Btttactggatcctag-----ttacgtacattaatcgg 3 ' - aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagccB-S' (správný fragment - dvě restrikční místa) ¹ -Btttactggtag

3'- aaatgaccatc ttacgtacattaatcgg-3' aatgcatgtaattagccB-5' (nesprávný fragment - pouze jedno restrikční místo (AsnI))

5' -Btttactggatcctag------ttacgtacaatcgg-3 ' ' - aaatgacctaggatc------aatgcatgttagccB-5 ' (nesprávný fragment - pouze jedno restrikční místo (BamHI))

5' -Btttactggatag ' - aaatgacctatc ttacgtacaatcgg-3’ aatgcatgttagccB-5¹ (nesprávný fragment - žádné restrikčni místo (AsnI))

Při štěpení pomocí restrikčních enzymů AsnI a BamHI vznikají následující fragmenty:

5'-Btttactg gatcctag

3'- aaatgacctag gatc ttacgtaca ttaatcgg-3' aatgcatgtaatt agccB-5' (správné fragment - dvě restrikčni místa - odstranily se oba biotiny) ' -Btttactggtag------ttacgtaca ttaatcgg-3 '

3'- aaatgaccatc------aatgcatgtaatt agccB-5' (nesprávný fragment - pouze jedno restrikčni místo (AsnI)

- odstranil se pouze jeden biotin)

5'-Btttactg gatcctag 3'- aaatgacctag gatc ttacgtacaatcgg-3' aatgcatgttagccB-5' (nesprávný fragment pouze jedno restrikčni místo (BamHI)

- odstranil se pouze jeden biotin)

5'-Btttactggatag

3'- aaatgacctatc ttacgtacaatcgg-3 ' aatgcatgttagccB-5 ' (nesprávný fragment - žádné restrikčni místo - neodstranil se žádný biotin, nedochází k restrikci).

Ve směsi všech fragmentů zmiňovaných shora v textu pouze jeden fragment ten správný bude bez

Přidáním streptavídinu k fragmentům a zachyceného biotinu.

kontaktem reakčních produktů s matricí vázající protein například průchodem centriflexovou membránou se izoluje pouze správný fragment a v případě centriflexové membrány bude membránou procházet bez komplikací.

Rozdíl mezi použitím krátkých primerů (to znamená primerů, které se neúplně prodlužují do místa restrikčního enzymu na « « • · · •· ···· φ · β

• » ·· ··· templátu) a dlouhých primerů (který začleňují kompletní místo restrikčního enzymu) je zřejmý. V případě dlouhých primerů všechny fragmenty dokonce i chybné by měly mít zavedená restrikční místa pro restrikční enzymy AsnI a BamHI. V tom případě není možné rozlišit mezi správným a chybným produktem reakce PCR.

Způsob se může také použít k separaci produktů molekul DNA štěpených restrikčními enzymy, které jsou buď lineární nebo se linearizovaly a které jsou značeny ne svém jednom nebo obou koncích pomocí metod pro značení konců, které jsou dobře známy v oboru, například za použití enzymů. Jedním příkladem je enzym terminální deoxynukleotidyltransferáza (TdT), která se může použít samotná nebo spolu s DNA polymerázou I (Klenow fragment), přičemž se přidávají značené nukleotidy, například nukleotidy značené biotinem nebo fluoresceinem nebo dioxigeninem, na volné hydroxylové skupiny 3'konců lineární molekuly DNA, čímž se přidá značka na 3' konce. V případě, že lineární DNA se vystaví trávení restrikčními enzymy, tvoří se tupé konce nebo vykazuje zkrácené 3'konce, pak pouze TdT je potřebný k označení 3'konců. Když však 5' konec je zkrácený a 3'konec je zapuštěný je potřeba použít enzym, jako je Klenow fragment, k vyplnění zapuštěného konce a ke zvýšení účinnosti.

V případě, že značka je biotin, vzorek může být nejdříve v kontaktu se streptavidinem v roztoku a pak vzorek prochází membránou vázající protein, na kterou se váže streptavidin a čímž zachycuje nechtěné, značené molekuly nukleových kyselin a požadované fragmenty zůstávají v roztoku a ve formě vhodné pro další manipulaci.

To reprezentuje podstatnou výhodu ve srovnání se současnými postupy, které jsou běžné a zahrnují separaci směsi štěpenou restrikčními enzymy na agarózovém gelu, vizualizaci fragmentů barvením etidiumbromidem, vyříznutím fragmentu DNA a • · · ·

jeho izolace z gelu, což časově náročný postup a zahrnuje větší nebezpečí vystavení DNA aktivitě nukleáz.

Další aplikace tohoto aspektu podle vynálezu je v oboru štěpení restrikčními enzymy PC?, amplif ikovaných produktů. Existují okolnosti, kde je nutné provést částečné štěpení restrikčními enzymy, to znamená s omezeným množstvím enzymu. Přípravky restrikčních enzymů často obsahují malé množství endonukleáz, které mohou degradován konce nově štěpené DNA, což může snížit kvalitu fragmentu a způsobit obtížnosti při další manipulaci, jako je ligace DNA například do expresivního vektoru. Takové problémy způsobené kontaminací endonukleáz se však mohou minimalizovat použitím omezeného množství restrikčního enzymu a zkrácením ir.rubační doby. Problémem však je, že výsledné štěpení bude zahrnovat nežádoucí vedlejší produkty štěpení restrikčními produkty, jako jsou pouze částečně štěpené molekuly a neštěpené molekuly. Způsob podle vynálezu však umožňuje využití částečného štěpení syntézou substrátu pro štěpení restrikčr.í- enzymem pomocí PCR za použití primerů DNA značených ciotinem tak, že libovolná molekula DNA nebo fragment, který zahrnuje alespoň jeden konec (jako je neštěpená molekula nebo částečně štěpená molekula) se mohou odstranit nebo izolovat pomocí vhodné matrice, přičemž zůstává roztok obohacený vnitřním restrikčním fragmentem.

Další aplikace separační metody založené na značce podle vynálezu je při diagnostice pomoci PCR. Je známo použití PCR pro detekci mutací, které zahrnuji mutace, které se liší pouze jedním nukleotidem, jenž se objevují při srpkovité anémii. V některých případech velikost fragmentu PCR bude indikovat přítomnost i nebo absence určité mutace budou vyžadovat další metody následující po počátečním PCR provedeném se vzorkem pacienta za účelem diagnostikovat, zda je ve vzorku mutace přítomna nebo ne. Je to například restrikční analýza a/nebo sekvenování. To může být finančně nákladné, protože jsou často • · · · • · nutné nákladné chemikálie, jako jsou peptidové tyto metody časově náročné, což zdravotního stavu pacienta.

za použití reakcí PCR kyseliny a k oddáleni metody se také jsou zj ištění podstatně metod podle záchytných alespoň jednoho primeru zj ednodušuj i vynálezu pomocí

PCR, který je značen nebo nukleové přispívá

Existuj ící značených za použití je schopný být značen. Použitím značených primeru nejsou nutné další kroky a přítomnost mutace může být detekována za použití jediného kroku amplifikace PCR.

Tak metoda aplikovaná s diagnostickým PCR je schopna nahradit nutnost sekvenovat produkty PCR v souladu se současnými diagnostickými metodami. V tomto provedení vynálezu primer určený pro hybridizaci a prodloužení 3' konce vzorku je značen nebo je schopen být značen takovým způsobem, že zůstává na 3ΌΗ skupině a může tak být prodloužen v reakci PCR a je specifický pro mutovanou nukleovou kyselinu. Jinými slovy primer hybridizuje se sekvencí v nukleové kyselině, která je ve stádiu nemoci změněna. V jiném případě 3'primer může hybridizovat se sekvencí normální nukleové kyseliny.

V jednom provedeni vynálezu se může metoda použít k detekci mutace v jedné bázi, přičemž 3'konec primeru odpovídá mutované bázi. V případě mutaci ve více bazích 3'konec primeru může odpovídat libovolné z mutovaných baží.

V případě, že mutace je známa, v jedné verzi tohoto provedení vynálezu se provedou dvě reakce PCR s jedním vzorkem DNA. Každá reakce používá stejný primer pro 5'konec vzorku, ale odlišný 3'primer. Jeden primer hybridizuje na normální DNA a je schopen poskytnout extenzí DNA a a druhý komplementární sekvenci nukleové kyseliny je odpovídající mutované sekvenci.

produkt odpovídající normální a specifický pro mutovanou schopen poskytnout produkt V případě PCR mutovaný cíl používající značený primer vhodný pro mutovanou DNA, PCR • · • » • · · ·

amplifikační	produkty budou začleňovat značku, zatímco
v reakci PCR	za použití normálního primeru bude nesprávně

spárovaná báze na 3'konci primeru, který se odstraní PCR

polymerázou,	jako je Taq polymeráza a jestliže 3'báze je
značena její	odstranění odstraní značku nebo část, která je
schopna být	značena, kterou nese. Produkt PCR pak nebude

obsahovat značku. Pouze produkty PCR reakce mutantní nukleové kyseliny jsou značeny nebo jsou schopny být značeny a mohou se detekovat za použití libovolné ze shora uvedených metod.

K opačné situaci dochází v případě PCR extenze normální DNA, která neobsahuje detekovatelné specifické mutace. V tomto případě to jsou PCR produkty získané za použití mutantního primeru, kde 3'nukleotid primeru je nesprávně párován a odstraněn spolu se značkou, která se nemůže detekovat v reakčním produktu plné délky, zatímco produkt užívající normální primer bude zahrnovat značku nebo část schopnou být značena, která se pak může detekovat.

V tomto provedení vynálezu značka nebo část schopná být značena je 3'bázi nebo je na ni zachycena takovým způsobem, že 3'OH je stále možné prodloužit PCR polymerázou.

Vynález dále popisuje způsob diagnostické PCR, kde testovaný vzorek se odděleně vystaví reakcím PCR, kde mutace, je-li přítomná je v sekvenci, se kterou je 3'primer komplementární. První PCR reakce používající 3'primer komplementární s normální cílovou nukleovou kyselinou a druhá PCR reakce používající 3'primer komplementární s mutantním cílem, kde 3'nukleotid mutantního primeru odpovídá jednomu z nukleotidů, který je mutován v mutantní nukleové kyselině, každý z uvedených 3'primerů nesoucí značku nebo je schopen být značen na 3'nukleotidu primeru, kde se detekuje přítomnost nebo absence značky v reakci PCR.

•V ·«·· ·· ·· ·· · • · · · · · ««·· ·· · · · · · · · • ··· ·· ··· · · ··· ···· ·· · • · · · ·· ·« · · · · ·

V nejjednoduším provedeni vynálezu 3'primery jsou značeny například biotinem, které se mohou detekovat za použití libovolné z popsaných metod. Příklady metod detekující biotinylované PCR produkty zahrnují přidání streptavidinu a filtraci pře membránu vázající protein, kde se detekuje zachycená DNA, nebo zlatých částic potažených streptavidinem, jak se popisuje v dokumentu EP-0564494 a průchod membránou, jako je nitrocelulózová membrána, například jako v shora uvedeném systému NycoCard™. V případě menších fragmentů PCR je výhodné, když membrána je potažena polylyzinem, aby se zlepšila kapacita navázání DNA. V takových detekčních metodách produkty PCR reakce se budou všechny vázat na membránu, ale pouze reakční produkty značené biotinem se zachytily na zlatých částicích a tak dojde ke vzniku detekčního signálu. V jiné metodě se může k reakčním produktům PCR přidat streptavidin a směs prochází pře centriflexovou membránu. Jestliže se v materiálu, který prochází membránou, nedetekuje žádná DNA pak DNA se zachytí na membráně a tak bude biotinylovaná.

Za okolností, kdy primer samotný není značen, ale je schopný být značen, značka se musí přidat před detekčním krokem.

V jiném provedení vynálezu se jediná PCR reakce může provést za použití značeného primeru, který je specifický pro buď normální nebo mutovanou sekvenci. Přítomnost značky v produktech PCR se indikuje přítomnost nebo absence mutace v závislosti na skutečnosti, zda primer je specifický pro normální nebo mutantní DNA. Jestliže značený primer je specifický pro normální DNA, produkt PCR s normální DNA je značený, zatímco produkt PCR s mutantní DNA není značený. Jestliže Značený primer je specifický pro mutantní DNA, PCR produkt normální DNA nebude značen, zatímco produkty PCR s mutantní DNA budou značený a tak detekovatelné. Zatímco probíhající duplikátni reakce PCR poskytují více jistoty, jediná PCR alespoň indikuje přítomnost nebo nepřítomnost mutace.

Vynález popisuje způsob diagnostické PCR mutace v molekule nukleové kyseliny, ve které se detekovala přítomnost nebo absence mutace ve vzorku nukleové kyseliny, zatímco se používá 3'primer specifický pro buď normální nebo mutantní nukleovou kyselinu, kde uvedený primer je komplementární s oblastí nukleové kyseliny, kde existuje rozdíl v bázi mezi normální a mutovanou DNA s 3'koncem primeru odpovídajícímu poloze ve vzorku, kde existuje rozdíl mezi normální a mutantní DNA, primer je značen nebo je schopen být značen, přičemž se detekuje přítomnost nebo absence značky v produktu PCR.

Také je možné provést alespoň jednu předběžnou diagnózu za použití 3'primeru, která je specifická pro normální DNA.

Vynález popisuje způsob diagnostikování PCR, kdy se s testovaným vzorkem provede PCR s primery komplementárními s normální cílovou DNA, kde primer pro extenzi 3'konce cílové DNA hybridizuje se sekvencí, kde je mutovaný 3'nukleotid. 3'primer nesoucí značku nebo který je schopen být značen na 3'nukleotidu , kde se detekuje přítomnost značky v produktu reakce PCR.

Nepřítomnost detekovatelné značky v produktu indikuje, že vzorek neobsahuje normální DNA.

Příklad detekující mutaci jediné báze je následující:

V tomto případě 3'konec primeru pro extenzi 3'konce vzorku se připojí na mutovanou DNA na templátu.

Předpokládá se případ, kde se musí stanovit, zda pacient má normální nebo abnormální genetickou mutaci.

Sekvence normální DNA genu je:

• · ·· ·· «··

5'-ccccatg

3'-ggggtac atgacctaggAccacct-3’ tactggatccTggtgga-5 '

DNA pacienta vypadá jak tato:

' -ccccatg---------atgacctaggCccacct-3 ' ³ ' -ggggtac---------tactggatccGggtgga-5 '

Mutace je přítomna. Znalost pacientovi DNA není nezbytné testovat. Za účelem diagnostikovat mutaci je třeba znát normální podmínky.

Primery jsou potřebné za účelem provést PCR, jeden primer se hybridizuje do oblasti 5'konce a jeden do oblasti 3'konce. Primer 5'konce je shodný v případě obou pacientů s mutací nebo bez:

primer Nol: 5'- ccccatg-3'

V případě 3^zoblasti primer párující se s normální DNA je následuj ící:

No2normal: 5'- aggtggt-3'

Jestliže je mutace známa, primer se může konstruovat: No2abnormal: 5'- aggtggg-3'

Aby metoda fungovala poslední nukleotid 3'konce se značil biotinem, jestliže zůstane, je schopen se v reakci PCR prodlužovat (na 3'konci má volnou hydroxyskupinu).

Primery 3'konce jsou následující:

No2normal: 5'-aggtggtB-3'

No2abnormal: 5'-aggtgggB-3' (symbol B je biotin)

Produkty PCR získané za použití těchto primerů v případě normální DNA jsou:

• · · · • · (primery Nol+No2normal) ' -ccccatg---------atgacctaggAccacct-3 ' ' -ggggtac---------tactggatccTggtgga-5 ¹ biotin (primery Nol+No2normal)

5'-ccccatg

3'-ggggtac atgacctaggAccacct-3¹ tactggatccTggtgga-5' + biotin

Pouze použití primeru Nc2normal v případě normální templářové DNA dá vzniku biotinylovaným PCR produktům. PCR enzymy odstraní biotin z primeru No2abnormal, přičemž vzniká nebiotinylovaný produkt.

Produkty PCR se získaly za použití těchto primerů v případě abnormální DNA:

(primery Nol+No2abnormal) ¹ -ccccatg---------atgacctaggCccacct-3 ' ' -ggggtac---------tactggatccGggtgga-5 ’ biotin (primery Nol+No2normal) ' -ccccatg atgacctaggCccacct-3¹

3'-ggggtac tactggatccGggtgga-S'

Jak se uvádí shora v textu, ale naopak.

Přítomnost biotinylovaného produktu ukáže, zda pacient nese mutaci nebo ne.

Specifický příklad diagnostické PCR v případě srpkovité anemie způsobené mutací jedné báze je následující: V tomto příkladu je primer označen biotinem. To je jeden příklad • * · · • · « · značky, která se může použit ale není omezující, mohou se použít i další značky.

Normální lidský hemoglobin AI má sekvenci DNA pro první exon (kódující část) genu beta-globulinu haplotypu Al, která začíná:

Normální DNA:

atg gtg cac ctg act cct gag gag aag tet gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc agg ..· která se překládá na normální aminokyselinovou sekvenci:

MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG

V případě lidského onemocnění srpkovitá anémie je sekvence DNA prvního exonu genu beta-globulinu haplotyp S začíná následovně:

DNA při onemocnění srpkovitá anémie:

atg	gtg	cac ctg act	cct gtg gag aag	tet gcc	gtt	act	gcc
ctg	tgg	ggc aag gtg	aac gtg gat gaa	gtt ggt	ggt	gag	gcc
ctg	ggc	agg ...
která	se	překládá	aminokyselinovou	sekvenci	onemocnění

srpkovité anémie:

MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG. · .

Porovnání normální DNA a ukazuje, že substituce jediné báze je dostatečná ke transformaci normálního genu hemoglobinu na abnormální hernoglóbinový gen, který je znám, že způsobuje vážný stav srpkovité anémie. Kodon gag mutuje na kodon gtg způsobuj ící nahrazení kyselé aminokyseliny glutamová kyselina nepolární aminokyselinou valin.

• · · · · · ·· · · ·· • · · ···· ··· ·· · · · ♦ · ·· ···· ···· ·· «· · · · · · · · · ·

Aby se detekovala přítomnost nebo absence této mutace, izoluje se genomová DNA a jestliže to je nezbytné amplifikuje se PCR před diagnostickou PCR běžným způsobem.

Primery užívané při amplifikaci části genu hemoglobinového beta řetězce jsou založeny na sekvenci DNA dané programem EMBEL-ID-HSBETGLOB.

Genu hemoglobinového beta řetězce (dále v textu je zobrazen jako oddělené triplety) předchází intronová sekvence (intron 1) a po něm následuje jiná sekvence (intron 2) . Oba introny jsou dále v textu označeny italikou.

Část intronů (podtrženo) se používá pro konstrukci primerů (popisuje se dále v textu).

gca taaaagt cagggcagagcca tctat tgc ttacatt tgc t tc tga ca caa ctgt

erttcactaccaacctcaaacacracacc

atg

grg

cac

ctg

act cct

gag

aag

tet

gcc

gtt

act

gcc

ctg

tgg

ggc

aag

gtg aac

gtg

gat

gaa

gtt

ggt

gag

gcc

ctg

ege

agg

ggcaggt tggta tcaaggt tacaagacaggttžaaggagaccaa tagaaactgggc atgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgccta ttggtctattttcccacc. . .

Nekódující introny jsou lemovány kódující částí genu. Druhý intron odděluje kódující sekvenci od další části kódující sekvence.

Aby se amplifikovala první kódující část genu pro pozdější diagnostickou PCR, mohou se použít dva primery, například hybridizace s introny 1 a 2. Sekvence hybridizující z primery je označena shora v textu podtrženou italikou.

Primer 1: 5' -ctagcaacctcaaacagacacc-3'

Primer 2:5’ -gtaaccttgataccaacccgcc-3'

Primery se používají pouze při amplifikaci pomocí PCR k dosažení většího množství templátu DNA pro postup diagnostické PCR a tak nepotřebuje být biotinylována nebo upravena žádným způsobem.

V případě diagnostické PCR, protože podstata mutace je známa, mutace jedné báze v kodonu 6 exonu, se navrhly tři primery odpovídající normální a abnormální DNA (srpkovitá anémie):

Primer odpovídající normálnímu hemoglobinu:

PrimerN: 5'- atg gtg cac ctg act cct ga-biotin-OH

Primer odpovídající hemoglobinu onemocnění srpkovitá anémie: PrimerS: 5'-atg gtg cac ctg act cct gt-biotin-OH

Primer pro druhý konec genu:

Primer2: 5'-gtaaccttgataccaacctgcc-3' (to může být stejný primer jako se používá při amplifikaci, není značen ani upravován).

Pak se uskuteční diagnostický test s primery pro krok 1 a se vzorkem DNA nebo se vzorkem amplifikovaným PCR.

Provedly se dvě reakce PCR

a) PCR používající PrimerN + Primer2:

b) PCR používající PriemrS + Primer2:

U produktů PCR z reakcí PCR a) a b) se pak testuje přítomnost biotinu, jak se popisuje dříve v textu.

Výsledky testování dvou reakcí PCR a) a b) mohou mít jeden ze čtyř možných závěrů ilustrovaných dále v textu.

• 4 ···· ·· tf • · · · · « · · · · · ·

Biotinylovaný produkt	PCR ano nebo ne	interpretace
PCR # a (primerN+primerí)	PCR # b (primerS+primerí)	(diagnóza
ano	ano	přítomny obě varianty normální i srpkovité anémie (neškodné heterozygotní podmínky)
ne	ne	není přítomen normální gen (neznámá mutace v kodonu 6, muže reprezentovat další onemocnění)
ano	ne	je přítomen pouze normální gen (neexistuje mutace v kodonu 6, zdravý j edinec)
ne	ano	pouze mutovaná varianta (drepanocyt) v kodonu 6 (možné letální homozygotní podmínky)

Tato metoda se může také použít při diagnóze mutací více baží, jak se ilustruje dále v textu opět v případě srpkovité anémie.

Mutace více bází (podtržené tučné písmo) v prvním exonu genu beta-globulinu je zobrazeno v sekvenci DNA:

atg gtg cac ctg act cct aas. gag aag tet gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc agg .·· která se překládá na aminokyselinou sekvenci

MVHLTPNEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG. . .

Primer, jako je PrimerN popsaný shora v textu, se může použít k odhalení, zda je přítomen normální gen. Aby se diagnostikovala potencionální přítomnost mutace požaduje se primer schopný detekovat mutaci.

Jeden primer, který se může použít odpovídá mutovanému hemoglobinu a je následující:

5' -atggtgcacctgactcctaac^biotin+DH

Tento primer identifikuje přesně mutaci „acc v kodonu 6.

Jiný primer, který se může použít je

5'-atggtgcacctgactcctaYbiotin^OH

Takový primer se může použít k identifikaci všech mutací v kodonu 6, které začínají bází „a.

Reakce PCR se uskutečnily s normálním PimeremN a s jedním nebo více primery, které odpovídají (to znamená, jsou komplementární s) mutované sekvenci.

Tato metoda se může použít pro libovolnou mutaci ve známé sekvenci normálního genu a mutace hemoglobinu drepanocytu je dána jako příklad. Kde jsou známy běžné mutace v populaci, řada primerů se může použít pro vymezení bodu, kde se mutace opravdu nachází.

Další využití metody podle vynálezu je vyříznutí a separace fragmentů DNA z rekombinantní molekuly pro další zpracování. Příbuzným aspektem je vyříznutí a separace vektorové DNA pro použití při dalším zpracování klonováním. Existuje nutnost vytvořit účinné metody získání linearizovaných fragmentů DNA vysoké kvality, aby se daly dále klonovat nebo jinak biotechnologicky zpracovávat. Jak je známo v oboru, vektory, jako jsou plazmidy a viry obsahují vedle vhodných elementů pro řízení replikace a transkripce jedno nebo více klonovacích míst pro začlenění heterologní DNA pro propagaci a expresi. Stejně jako se používají restrikčni enzymy pro začlenění heterologního fragmentu do klonovacího vektoru, aby se připravil rekombinantní vektor, restrikčni enzymy se také používají k vystřižení heterologního fragmentu určeného pro další genetickou manipulaci nebo k vystřižení vektorového elementu určeného pro další manipulaci. Takové vektory obsahují molekuly kruhové DNA. Ty zahrnují doplňkový fragment, často polylinker a fragment, který zahrnuje shora v textu uvedené řídící sekvence. Při jedné metodě rekombinantní vektor mající začleněný heterologní fragment DNA se štěpí restrikčním enzymem za účelem vystřihnout začleněný fragment DNA, tak vzniká směs molekul lineární DNA zahrnující doplňující fragment samotného vektoru, inzert a také částečně štěpené molekuly rekombinantní DNA. Metoda podle vynálezu se může použít tam, kde doplňkový (nebo vektorový) element v molekule rekombinantní DNA, ze kterého se může vyříznout heterologní inzert, zahrnuje specifickou proteinovou rozeznávanou sekvenci, jako je rozeznávaná sekvence AP-1. Při metodě podle vynálezu produkty štěpících reakcí pomocí restrikčních enzymů přijdou do kontaktu v roztoku s proteinem, pro který je nukleová kyselina specifická, v tomto případě AP1, a pak prochází přes protein selektivní membránu, která zachytí ty molekuly nukleové kyseliny, na které je navázaný AP-1, a v roztoku zůstanou pouze ty molekuly DNA, které obsahují heterologní začleněnou DNA a tak nemají rozeznávací sekvenci AP-1.

• · • · · · • ·

V jiném příbuzném provedení vynálezu se může metoda použít k separaci linearizované formy samotného vektoru určeného pro další zpracování. To znamená vektoru, který se linearizoval pomoci štěpení restrikčním enzymem a ze kterého se vyřízl doplňkový fragment.

Takový vektorový fragmnet se pak může použít pro začlenění nebo ligaci heterologní DNA, která po cirkulizaci se může použít pro další aplikace, jako je transformace hostitelských buněk.

V jednom příkladu doplňkový fragment je polylinkrem nebo ho zahrnuje, přičemž polylinker obsahuje unikátní místa rozeznávaná restrikčním enzymem. Vektor se štěpí jedním z těchto enzymů, přičemž se molekula linearizuje. Konec linearizované molekuly se pak může značit za použití shora uvedených enzymatických metod. Výhodné je pro zjednodušení dalších manipulací, aby jediným štěpícím enzymem byl ten, který tvoří přesah na 3'konci. V tomto případě konec molekuly lineárního vektoru může být značen přidáním značených nukleotidů, jako jsou biotinylované nukleotidy pomocí TdT. Jestliže enzym tvoří přesah na 5'konci, pak, aby se protáhl 3'konec, je navíc potřeba Klenow fragment. Zjistily jsme, že tato metoda je účinná, zvláště, kde se používá velké množství DNA, to znamená větší než 10 μς. Jestliže existuje značený linearizovaný vektor, ten se pak štěpí jedním nebo více restrikčními enzymy, přičemž jsou výhodné enzymy, které rozeznávají jediná místa v doplňkovém fragmentu jedno na každé straně původního místa štěpení. Tímto způsobem se fragmenty značí a požadovaný fragment, který není značen se může separovat pomocí metod podle vynálezu z doplňkového fragmentu. Tak když vzorek prochází filtrem zcela štěpený vektor prochází membránou.

Při další aplikaci způsob podle vynálezu se může použít k odstranění neproduktivních ligačních produktů z ligační • · · · · · • · směsi .

ligázy reakce

Kovalentní spojení dvou fragmentů DNA za použití DNA je základ biotechnologie. V obecném případě zahrnuje inzerci malých fragmentů nebo inzertů že konečný ligační ligační

DNA do větší vektorové DNA. Je důležité, produkt se správně cirkularizuje, aby se zabránilo degradaci v transformovaných hostitelských buňkách, bakteriální hostitelské buňky.

nemají využití a v hostitelské jako jsou lineární ligační produkty bakterii nepřežijí.

výsledkem je více

Tak

Naneštěstí ligační reakce nejsou účinné, lineárních produktů. To také snižuje účinnost cirkularizováných produktivních ligačních pohlcení produktů do mikroorganizmu E.

coli. Lineární produkty se tak mohou považovat za kontaminanty nebo reakce. Účinnost transformace s vedlej ší produkty ligační ligovanými produkty se tak může zesílit, jestliže bude možné odstranit nežádoucí lineární ligační produkty z reakční směsi před transformací. V současné době neexistuje dostupná metoda.

Na základě polymorfní podstaty kruhových produktivních nemohou vyříznout z gelů. Vynález pak ligačních produktů, se popisuje takové metody.

Vynález popisuje způsob separace lineárních molekul nukleové kyseliny od kruhových ve vzorku uvedenou metodou, která zahrnuje zavedení značky na konec lineární molekuly nukleové kyseliny, kde uvedená značka je schopna být mobilizována na matrici přímou interakcí s matricí nebo nepřímou interakcí pomocí vazebného partnera na značku a kontakt vzorku s matricí nebo kde značka interaguje nepřímo s matricí, s vazebným partnerem pro značku a s matricí, čímž uvedené značené molekuly lineární nukleové kyseliny jsou imobilizované na matrici.

Metoda podle vynálezu se v tomto případě může aplikovat, protože všechny molekuly DNA přítomné v ligační směsi, jiné než požadované kruhové molekuly mají volné konce s exponovaným a reaktivním fosfátem a hydroxylovými skupinami. Ty mohou mít ··«·*· · · · ·· · · ·· · · · · · ···· ··· ···· · · · • 9 ··· ·· ··· ··

9*9* ···« ··* * * · · *9 ·· ·· ··· značené konce shora uvedenými enzymatickými metodami se značenými nukleotidy, jako jsou nukleotidy značené biotinem. Kruhové molekuly se nemohou značit, protože nemají reaktivní 3'hydroxylové skupiny, na které se může zachytit značka. Tímto způsobem značené lineární molekuly se mohou zachytit na matrici a tím se mohou separovat z ligovaných kruhových molekul, které zůstávají v roztoku a mohou se použít pro další zpracování, jako je transformace hostitelských buněk.

V dalším provedení vynálezu se metoda může použít při in vivo balení bakteriofágových částic, jako je fág lambda a knihovny vykazující fága. Bakteriofág se může balit buď in vitro, přičemž virová DNA se smísí dohromady s různými proteinovými komponenty obalu viru in vitro a dojde ke komplementaci viru nebo do bakterie, kdy virová DNA se zavede do vhodné bakterie, která poskytuje nezbytné proteinové komponenty potřebné pro komplemenzaci viru. Balení in vitro je rychlejší než metoda transformace bakterií. Balení virů je možné dosáhnout řádově v minutách na rozdíl od tranformace bakterií, která probíhá 1 až 2 dny. Je to však méně účinná metoda ve srovnání s transformací bakterií, zvláště v případě balení fágové DNA, která se manipulovala. Například lambda DNA, do které se začlenila heterologní DNA, kde existuje experimentální indikace, že účinnost balení se může snížit 10³/ gg DNA ve srovnání s lineární DNA, která vznikla z molekulové manipulace s neupraveným lineárním virem lambda. Tato omezená účinnost vznikla alespoň částečně na základě přítomnosti vedlejších produktů manipulace DNA. Bude tak výhodné, jestliže se tyto vedlejší produkty mohou odstranit dříve než dojde k balení, přičemž zvýšení účinnosti balení in vitro a umožní použít tuto metodu místo bakteriální transformační metody, což umožňuje rychlejší a tak účinnější způsob. Metoda podle vynálezu umožňuje použít značkového systému, aby se značily • · · · • · · ···· < · · ·· · ···· ·· • · · · · · · · · · ·· ·· · · * · ·· · nechtěné fragmenty, což je umožňuje separovat od požadovaných ligačnich produktů.

Metoda využívá přítomnosti míst cos na fágovém genomu. To jsou jednořetězcové komplementární oblasti DNA, jedna na každém konci genomu lambda, který při inzerci lineární DNA lambda do bakteriálních buněk se vzájemně váží a vzniká cirkulární genom, který se může replikovat a který není náchylný k degradaci bakteriálních exonukleáz , jako bude lineární DNA.

V tomto provedení vynálezu před do vektoru lambda 3'konce vektoru lambda se přidáním dideoxynukleotidu spolu s vhodnou kterou je například Klenow klonováním heterologní DNA blokují například DNA polymerázou, účinně odstraňuje

OH-skupiny z nereaktivní vodík, který reaktivní fragment, který

3'míst cos, ponechávají pouze nemůže být ani prodloužený ani značený. Když se provedla klonovací reakce, molekuly DNA se vystavily adici značek, které jsou schopny být adovány pouze na 3'hydroxylové skupiny. Tímto způsobem vzniká pouze správně ligované produkty, které nezahrnují reaktivní skupinu 3ΌΗ, která nebude značena. Všechny další molekuly DNA zahrnující vektorové fragmenty a fragment, který se bude klonovat, budou vykazovat reaktivní 3'OH skupinu, která se bude značit. Poněvadž jde pouze o správně ligované molekuly DNA, které se nemohou značit, mohou se jednoduše separovat od nežádoucích produktů za použití libovolné ze zde popsaných metod.

Vynález popisuje způsob in vitro balení rekombinantního fága, kde vektor DNA se štěpí jedním nebo více restrikčními enzymy , 3'OH skupiny vektoru DNA se blokují, vektor a DNA se začlení a jsou v kontaktu za podmínek vhodných pro ligaci fragmentů DNA a ligační produkty se značí s částí schopnou se připojit na reaktivní 3'OH skupiny následované separací značených a neznačených molekul.

• · · · ·· · · · · ·· • ·

Blokování 3ΌΗ skupin znamená, že 3 ΌΗ skupina není přítomna nebo je chráněna nebo upravena nějakým způsobem, že nemůže být dále prodloužena.

V jednom vhodném provedení vynálezu značkou je biotin, který se přidal k reaktivním 3'OH skupinám ve formě biotinylovaného nukleotidu pomocí enzymů například pomocí Klenow fragmentu.

V jednom provedení vynálezu 3' konce vektoru jsou nejdříve blokovány například dideoxynukleotidem a vektor se pak štěpí enzymem, který má jediné rozeznávané místo ve vektoru. Rozeznávané místo se nachází mezi dvěmi rozeznávacími místy, která se používají pro klonování. Příkladem takového restrikčního enzymu je EcoRI. Účel počátečního štěpení restrikčním enzymem je umožnění všech molekul vektorové DNA, které nejsou v následně štěpeny, odstranit je značením. Vektor se pak štěpí ve dvou polohách, dvěma enzymy, které mají jediná místa štěpení ve vektoru, která budou tvořit klonovací místo. Vedle vytvoření vektorových fragmentů pro klonování se může získat řada částečně štěpených restrikč.ních produktů, které se mohou odstranit pomocí značky například značka může být biotin, pomocí navázání streptavídinu, jak se popisuje shora v textu. Fragment(y) DNA pro klonování se pak ligují do vektoru DNA lambda. Aby se odstranily všechny nechtěné reakční produkty, všechny exponované 3'konce se označily například pomocí biotinu. Správné ligační produkty nemají 3 ΌΗ skupiny a mohou být značeny a mohou se tak oddělit od všech značených molekul zde popsanými metodami.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Značení konců štěpených fragmentů DNA se zkráceným

5' koncem DNA

Činidla:

41444« »9·· • « 4 ···«· • · 4 · · · ·4 e · pg DNA lambda štěpené restrikčním enzymem

HindlII (Gibco jednotek polymerázy DNA I, velký Klenow fragment (New

England Biolabs #210S) μΐ pufru pro DNA polymerázu I, velký Klenow fragment (New

England Biolabs) nmol biotin-14-dCTP (Gibco 19518-018) nmol dATP (gibco

10216-018) nmol dTTP

10219-012) nmol dGTP přidá se 100 μΐ destilované vody.

Reakční směs se inkubuje při teplotě 25 °C po dobu 45 minut.

Reakční směs prochází kolonou S400 HR Microspin přidalo se 10 pg streptavidinu se nechalo inkubovat při teplotě 25 °C.

Reakční směs se pak nanesla na kolonu

Centriflex (Edge popisuje výrobce, nechala se difundovat skrz membránu, jak pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody, která se horizontálně obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx G.

Eluát se analyzoval na 1% agarózovém (FMC #50080) gelu elektroforézou, obarvil se etidiumbromidem, jak se popisuje v publikaci Maniatis, Molecular Cloning: A 2^nd ed. 1989.

laboratory manual

Na gelu nelze spatřit žádné stopy DNA lambda, což indikuje, že konec značených lineárních molekul se zachyceným streptavidinem zůstal na membráně.

» ·» · · ♦ ♦ ··

Příklad 2: Značení tupého konce a zkráceného fragmentů

Činidla:

μρ Low DNA Mass™ Ladder (Gibco 10068-13) jednotek terminální deoxynukleotidylové rekombinantni (Gibco 10533-016) μΐ pufru pro terminální deoxynukleotidylové • · ♦ · · · * »9 · · · » · · »

3'konce DNA transferázy, transferázy, rekombinantni (Gibco) nmol biotin-14-dCTP (Gibco 19518-018) přidá se 100 μΐ destilované vody

Reakční směs se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 45 minut.

Reakční směs procházela kolonou S200 HR MikroSpin (Pharmacia-Amersham 275120-01) a přidalo se 10 μο streptavidinu (Pormega #7041). Směs se inkubovala po dobu 5 minut při teplotě 25 °C.

Reakční směs se nanesla na kolonu Centriflex (Edge Biosystems #73883) a nechala se difundovat membránou jak popisuje výrobce, pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody, která se horizontálně obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx G.

Za účelem kontroly se leuát testoval elektroforézou na 2% agarózovém (FMC #50080) gelu elektroforézou, obarvil se etidiumbromidem, jak se popisuje v publikaci Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory manual 2^nd ed. 1989.

···

Příklad 3: Příprava vektorové PNA odstraněním doplňkového fragmentu

Vektor Cantab 5E obsahující testovaný inzert (PharmaciaAmersham 279401-01) se připravil za použití maxiprep Qiagen (Qiagen #12166).

Vektor Cantab 5E obsahuje jediná restrikční místa v případě enzymů Sfil, Notl a Bsr.I. Místa pro enzymy Sfil a BsmI se nacházejí na libovolné straně místa Notl.

Činidla:

pg vektoru Cantab 5E, jak se popisuje shora v textu jednotek endonukleázy Notl (Boehringer-Mannheim 1014714) μΐ pufru pro endonukleázu Notl ((Boehringer-Mannheim 1014714) a přidá se 50 μΐ vody.

Směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 37 ^QC.

Reakční směs prošla kolonou S400 HR MicroSpin (PharmaciaAmersham 275140-01), pak se přidaly následující činidla:

jednotek polymerázy DNA I, velký Klenow fragment (New England Biolabs #210S) μΐ pufru pro DNA polymerázu I, velký Klenow fragment (New England Biolabs) nmol biotin-14-dCTP (Gibco 19518-018) a přidá se 100 μΐ destilované vody.

Reakční směs se inkubuje při teplotě 25 °C po dobu 45 minut.

► · «*·« ·· · · · · · · ·· · * * · · · ♦ · · ·· • · · · · μ a · a «· ··

9 9 9 9 9 9 9 9 9· • 9 ·· · · 9 · 9 9 9 9

Reakční směs prochází kolonou S400 HR Microspin (Pharmacia-Amersham 275140-01).

Vzorek reakční směsi (5 μς) se ředil na 50 μΐ a nanesl se na kolonu Centiflex (Edge Biosystems #73883) a nechala se difundovat membránou, jak popisuje výrobce. Pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody, která se horizontálně obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx G.

Za účelem kontroly se eluát testoval elektroforézou na 2% agarózovém (FMC #50080) gelu, obarvil se etidiumbromidem, jak

se popisuje v publikaci Maniatis, Molecular	Cloning: A
laboratory manual 2^nd	ed. 1989.
Na gelu nelze	spatřit žádné	stopy DNA	lambda, což
indikuje, že konec z	načených lineárních molekul	se zachyceným
streptavidinem zůstal	na membráně.
Reakční směs	procházela kolonou S400	HR MikroSpin
(Pharmacia-Amersham	275140-01) a	j ednotlivé	alikvóty se
ošetřily následovně:
(1) 33 μΐ reakční směsi	se umístilo do	oddělené zkumavky (1), do
které se přidalo:

jednotek restrikčního enzymu BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315) μΐ pufru pro restrikční enzym BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315) a 50 μΐ destilované vody.

Směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 65 °C (2)

··	9999	··	99	• ·	9
•	•	•	• ·	9 9	•	•	• ·
•	♦	9	• »	• »	•	A	*
•	•	• ·	9 ·	• ·	• β	e	•
• * ·		• A	··	« ·			• · ·

Část reakční směsi o objemu 33 μΐ se umístila do oddělené zkumavky (2), do které se přidalo:

jednotek restrikčního enzymu Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) μΐ pufru pro enzym Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) a 50 μΐ destilované vody.

Směs se inkuboval po dobu jedné hodiny při teplotě 50 °C.

(3)

Část reakční směsi o objemu 33 μΐ se umístila do oddělené zkumavky (3), do které se přidalo:

Směs se inkuboval po dobu jedné hodiny při teplotě 50 °C. Reakční směs procházela kolonou S400 HR MikroSpin (PharmaciaAmersham 275140-01) a do reakční směsi přidalo:

jednotek BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315) μΐ pufru pro restrikčního enzymu BsmI (Boehringer-Mannheim 1292315) a 50 μΐ destilované vody.

Směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 65°C.

Každá ze tří reakčních směsí se čistila na oddělené koloně MikroSpin S400 a do každé směsi se přidalo 10 μg streptavidinu (Promega #7041) a směsi se inkubovaly po dobu 5 minut při teplotě 25 °C.

Každá reakční směs se nanesla na kolonu Centiflex ( (Edge Biosystems #73883) a nechala se difundovat membránou jak

··	····	··	• to	··	•
• «	•	• *	f	• * ·	• ·
• ·	•	•	• ·
• ·	• ·	• *		• · «	•
• ·	• ·	• *	•	• « ·
··	··	··	··	·»	·· ·

popisuje výrobce, pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody, membrána se horizontálně obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx g.

Tři reakční směsi se zkoumaly elektroforézou na 2% agarózovém (FMC #50080) gelu, který se obarvil etidiumbromidem.

Pouze u třetího reakčního vzorku bylo možné spatřit na gelu čištěnou vektorovou DNA. Vzorky 1 a 2 nevykazují detekovatelné stopy DNA. To ukazuje, že skrz membránu prošel pouze správný štěpený vektor.

Příklad 4: Štěpení biotinylovaných fragmentů

Produkt PCR vznikl amplifikací konstrukce scFV za použití biotinylovaných PCR primerů vysoké kvality.

Konstrukce scFV je fragment obsahující 800 párů baží, který obsahuje místa rozeznávaná restrikčním enzymem Sfil a Notl ve 40 a 760 bázích.

μς produktu PCR se smíchal s 2 μς streptavidinu (Promega #7041) a směs se inkubovala při teplotě 25 °C po dobu 5 minut.

·· ···· ·· ·· ·· ·

Z 4«3 ·* · *··,.: Z I • ·· · · ·· · · · · ·· ·· ·· ·· ·· ···

Jednotlivé alikvóty se ošetřily následovně:

(1) μρ produktu PCR se vneslo do oddělené zkumavky (1) a přidalo se jednotek endonukleázi Notl (Boehringer-Mannheim 1014714) μύ pufru restrikčního enzymy Notl a μΐ destilované vody a vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C.

(2)

Jiné 3 μρ produktu PCR se vloží do zvláštní zkumavky (2) a přidá se jednotek restrikčního enzymu Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) μΐ pufru pro enzym Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) a 50 μΐ destilované vody a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 50°C.

(3) μρ produktu PCR se daly do zvláštní zkumavky (3) a přidalo se jednotek restrikčního enzymu Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) μΐ pufru pro enzym Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) a 50 μΐ destilované vody a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 50°C.

Pak reakce procházela kolonou S400 MicroSpin a do reakční směsi se přidalo:

jednotek endonukleázi Notl (Boehringer-Mannheim 1014714) μΐ pufru pro enzym Notl (Boehringer-Mannheim 1014714) a 50 μΐ destilované vody a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C.

Každá ze tří reakčních směsí se čistila na oddělené koloně MikroSpin S400 a do každé směsi se přidalo 10 pg streptavidinu (Promega #7041) a směsi se inkubovaly po dobu 5 minut při teplotě 25 °C.

Každá reakční směs se nanesla na kolonu Centriflex (Edge Biosystems #73883) a nechala se difundovat membránou jak popisuje výrobce, pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody, která se horizontálně obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx g.

Pouze ze třetího reakčního vzorku bylo možné spatřit na gelu čištěnou vektorovou DNA. Vzorky 1 a 2 nevykazují detekovatelné stopy DNA. To ukazuje, že skrz membránu prošel pouze vnitřní fragment a fragmenty obsahující konec zůstaly na membráně.

Příklad 5: Štěpení nebiotinylovaného fragmentu PCR

Produkt PCR vznikl amplifikací konstrukce scFV za použití biotinylovaných primerů pro PCR vysoké kvality.

μρ produktu PCR se smíchalo s 2 μρ streptavidinu (Promega #7041) a směs se inkubovala při teplotě 25 °C po dobu minut, jak se popisuje v příkladu 4.

• · · ·

Reakční směs se kontrolovala elektroforézou na 2% agarózovém (FMC #50080) gelu, který se obarvil etidiumbromidem.

Produkt PCR se detekoval na gelu, což ukazuje, že nezůstal zachycený na membráně.

Ke 3 pg produktu PCR se přidalo:

jednotek terminálni deoxynukleotidylové transferázy, rekombinantní (Gibco 10533-016) μΐ pufru pro terminálni deoxynukleotidylové transferázy, rekombinantní (Gibco) nmol biotin-14-dCTP (Gibco 19518-018) a 100 μΐ destilované vody

Reakční směs se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 45 minut.

Reakční směs procházela kolonou S200 HR MikroSpin (Pharmacia-Amersham 275120-01) a přidalo se 10 pg streptavidinu (Pormega #7041). Směs se inkubovala po dobu 5 minut při teplotě 25 °C.

Reakční směs se nanesla na kolonu Centriflex (Edge

Biosystems #73883) a nechala se difundovat membránou jak popisuje výrobce, pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody, která se horizontálně obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx G.

Za účelem kontroly se eluát testoval elektroforézou na 2% agarózovém (FMC #50080) gelu, obarvil se etidiumbromidem.

Na gelu nelze spatřit žádné stopy produktu PCR, což indikuje, že zůstal na membráně.

Jednotlivé tři alikvóty se ošetřily následovně:

(1) μρ produktu PCR se vneslo do oddělené zkumavky (1) a přidalo se jednotek endonukleázy Notl (Boehringer-Mannheim 1014714)

p.L pufru restrikčniho enzymy Notl a a 50 μΐ destilované vody a vše se inkubovalo po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C.

(2)

Jiné 3 μρ produktu PCR se přidají do zvláštní zkumavky (2) a přidá se jednotek restrikčniho enzymu Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) μΐ pufru pro enzym Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) a 50 μΐ destilované vody a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 50°C.

(3) μς produktu PCR se daly do zvláštní zkumavky (3) a přidalo se 20 jednotek restrikčniho enzymu Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) μΐ pufru pro enzym Sfil (Boehringer-Mannheim 1288032) a 50 μΐ destilované vody a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 50°C.

• · · · • · · · · ·

·· · · ·· ··

jednotek endonukleázy Notl (Boehringer-Mannheim 1014714) μΐ pufru pro enzym Notl (Boehringer-Mannheim 1014714) a 50 μΐ destilované vody a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C.

Každá reakční směs se nanesla na kolonu Centriflex (Edge Biosystems #73883) a nechala se difundovat membránou jak popisuje výrobce, pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody a horizontálně se obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx g.

Tři reakční směsi se kontrolovaly elektroforézou na 1% agarózovém (FMC #50080) gelu, který se obarvil etidiumbromidem.

Pouze u třetího reakčního vzorku bylo možné spatřit na gelu čištěný produkt PCR. vzorky 1 a 2 nevykazují detekovatelné stopy DNA. To ukazuje, že skrz membránu prošel pouze vnitřní fragment a fragmenty obsahující konec zůstaly na membráně.

Příklad 6: Odstranění lineární DNA z populace molekul kruhové a lineární DNA

Jako počáteční materiál kruhová DNA se použil klonovaci vektor pUC19, který vykazuje jediné místo rozeznávané restrikčním enzymem HindlII a které se nachází v polylinkerovém klonovacím místě.

K 5 μς vektorové DNA pUC19 (New England Biolabs #301-lS) se přidalo:

• · · * « ··· · · • · ·· · ···· • · · · · ·· · • · · · · ·· · • · ·♦ ·· ·· ··· jednotek restrikčního enzymu HindlII (New England Biolabs #104S) μΐ pufru pro enzym HindlII (New England Biolabs) a 50 μΐ destilované vody.

Směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C.

Reakce prošla kolonou MikroSpin S00 HR a reakční směs se přidala k:

μΐ DNA vektoru pUC19 (New England Biolabs #301-lS) jednotek polymerázy DNA I, velký Klenow fragment (New England Biolabs #210S) μΐ pufru pro DNA polymerázu I, vělký Klenow fragment (New

England Biolabs) nmol biotin-14-dCTP (Gibco 19518-018) nmo1 dAT P (gibco 10216-018) nmol dTTP (Gibco 10219-012) nmol dGTP (Gibco 10218-014) a 100 μΐ destilované vody.

Reakční směs se inkubuje při teplotě 25 °C po dobu 45 minut.

Reakční směs prochází kolonou S400 HR Microspin (Pharmacia-Amersham 275140-01), přidalo se 10 pg streptavidinu (Promega #7041) a vše se nechalo inkubovat při teplotě 25 °C.

Reakční směs se pak nanesla na kolonu Centriflex (Edge

Biosystems #73883) a nechala se difundovat skrz membránu, jak popisuje výrobce, pak následuje centrifugace při 10 OOOx g po dobu 30 vteřin. Na membránu se naneslo 10 μΐ destilované vody a horizontálně se obrátila o 180°a znovu se provedla centrifugace při 10 OOOx G.

• · ♦ · · · • ·

Eluát se analyzoval na 1% agarózovém (FMC #50080) gelu elektroforézou, obarvil se etidiumbromidem, jak se popisuje v publikaci Maniatis, Molecular Cloning: A laboratory manual 2^nd ed. 1989.

Na agarózovém (FMC #50080) gelu je možné detekovat pouze kruhový vektor, což indikuje, že prošel membránou a na membráně se zachytila lineární DNA.

Příklad 7: Balení fágu lambda in vitro za použití předem štěpeného vektoru lambda

Použil se předem štěpený vektor Uni-ZAP® XR (Stratagene, kat. č. 236612).

Činidla:

μς předem štěpeného vektoru lambda dideoxyguanozintrifosfát (konečná koncentrace 200 μΜ) dideoxyadenozintrifosfát (konečná koncentrace 200 μΜ)

Klenow fragment (10 jednotek) pufr NEB EcoPol v celkovém objemu 30 μΐ

Reakční směs se inkubovala při teplotě 24 °C po dobu 20 minut.

Reakční směs prošla kolonou S400 HR MicroSpin, přičemž se odstranily proteiny a nukleotidy a do čištěné reakční směsi se přidalo:

200 ng předem připraveného inzertu DNA T4 DNA ligázy pufru pro NEB T4 ligázu v objemu 40 μΐ • · *··· · · ·· ·* · • 5½...... :

• · · · · · > · · · * «··· · ·· * · · · · 4 4 ♦ · · · ♦· ···

Reakční směs se inkubovala při teplotě 16 °C po dobu 48 hodin.

Reakční směs prošla kolonou S400 HR MicroSpin a do čištěné reakční směsi se přidalo:

biotinem značený dCTP (5 nmol) biotinem značený dATP (5 nmol) dTTP (konečná koncentrace 200 μΜ) dGTP (konečná koncentrace 200 μΜ) Klenow fragment (10 jednotek) pufr NEB v objemu 50 μΐ.

Reakční směs se inkubovala při teplotě 24 °C po dobu 20 minut.

Reakční směs prošla kolonou S400 ER MicroSpin a do čištěné reakční směsi se přidal streptavidin a reakční směs se nanesla na kolonu Centriflex, jak se popisuje v příkladu 2.

Další zpracování se provádí podle instrukcí balení inzertu firmy Stratagene. Ligace dává vyšší počet dostupných bakteriofágů, než se zjistilo v případě standardní metody, jak je možné vidět při počtu tvorby plaků u bakterií.

Příklad 8: Balení in vitro fágu lambda za použití neštěpeného vektoru lambda

Použil se neštěpený vektor Uni-ZAPD XR (Stratagene), který obsahuje testovaný inzert.

Činidla:

μρ neštěpeného vektoru lambda dideoxyguanozintrifosfát (konečná koncentrace 200 μΜ) dideoxyadenozintrifosfát (konečná koncentrace 200 μΜ) φ « irt» · · · * * · · • « ♦ · · « · ···· :5$ . : :.:::

« · · · · · * · ·· · ·· ·· «« ·♦ ···

Klenow fragment (10 jednotek) pufr NEB EcoPol v celkovém objemu 20 μΐ

Reakční směs se inkubovala při teplotě 24 °C po dobu 20 minut. Tato reakce blokuje 3'konce vektoru.

restrikční enzym EcoRI (20 jednotek) pufr NEB EcoRI v objemu 30 μΐ.

Reakční směs se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 120 minut. V této směsi se vektor štěpí na přibližně stejné kousky.

biotinem značený dATP (5 nmol)

dTTP	(konečná	koncentrace	200	μΜ)
dCTP	(konečná	koncentrace	200	μΜ)
dGTP	(konečná	koncentrace	200	μΜ)

Klenow fragment (10 jednotek) pufr NEB v objemu 40 μΐ.

Reakční směs se inkubovala při teplotě 24 °C po dobu 30 minut. V této reakci biotin značil lambdu trávenou restrikčnim enzymem EcoRI.

Do reakční směsi se přidalo:

r« #·♦·

49·· * 9 9 9 9 9 99 •57Í *· · I * ·^β<· · · * • · 9 9 9 9 9 9·« • 4 ·· 99 99 ♦♦· restrikčni enzymy Xbal a Xhol (20 jednotek každého) v pufru

NEB 2 v objemu 50 μΐ. Tato reakce vytvořila klonovací místo.

Reakční směs se inkubovala při teplotě 37 °C po dobu 60 minut.

Reakční směs prošla kolonou S400 HR MicroSpin a do čištěné reakční směsi se přidal streptavidin a reakční směs se nanesla na kolonu Centriflex, jak se popisuje v příkladu 2. V tomto kroku se streptavidin váže na neštěpený vektor.

200 ng předem připraveného inzertu DNA

T4 DNA ligázy pufru pro NEB T4 ligázu v objemu 60 μΐ

Reakční směs se inkubovala při teplotě 16 °C po dobu 48 hodin.

biotinem značený dCTP (5 nmol) biotinem značený dATP (5 nmol) dTTP (konečná koncentrace 200 μΜ) dGTP (konečná koncentrace 200 μΜ) Klenow fragment (10 jednotek) pufr NEB v objemu 7 0 μΐ.

Reakční směs se inkubovala při teplotě 24 °C po dobu 20 minut. V této reakci jsou značeny všechny exponované 3'OH konce, které nebyly dříve blokovány.

Reakční směs prošla kolonou S400 HR MicroSpin a do čištěné reakční směsi se přidal streptavidin a reakční směs se nanesla na kolonu Centriflex, jak se popisuje v příkladu 2. To separuje značené molekuly od neznačených.

Příklad 8: Čištění re-amplifikační reakce PCR

a) Úprava vektoru Cantab5E (Pharmacia) za účelem získání

Cantab5E^BamHI(1)

Vektor Cantab5E (1 μς) se štěpil přidáním 10 jednotek restrikčního enzymu BamHI a 10 μΐ pufru NEB BamHI v celkovém reakčním objemu 100 μΐ. Směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Reakční směs se separovala na 1 % agarózovém gelu a fragment s nejvyšší molekulovou hmotností se izoloval běžnou extrakční metodou z gelu. K 500 ng izolovaného velkého fragmentu se přidala 1 Weissova jednotka T4 DNA ligázy a 5 μΐ pufru NEB ligázy v celkovém reakčním objemu 50 μΐ a směs se inkuboval a po dobu jedné hodiny při teplotě 24 °C. Ligační směs se transformovala do buněk TGI za použití elektroporace a bakteriální buňky se inkubovaly přes noc na agaru, který obsahuje ampicilin (100 μρ/πιΐ). Izolovala se DNA z bakterií, které tvoří kolonie a ověřila se velikostí a restrikčními enzymy, aby obsahovala pouze jediné restrikční místo rozeznávané BamHI. Tato DNA se nazývá Cantab5E^{BamHI ί1)} .

b) Použití upraveného vektoru Cantab5E^BamHI(1) jako templátu při PCR

Činidla:

μρ vektoru Cantab5E^BamHI(1) směs dNTP (od firmy Finnzyme, konečná koncentrace 200 μΜ) μΐ pufru pro expanzi s vysokou přesností pmol primeru, restrikčním místem částečně překrývá s který se částečně překrývá afilll, 30 pmol primeru 2, jediným restrikčním místem BamHI s jiným který se a přidá se 100 μΐ vody.

Reakce PCR se zahřála na teplotu 96 °C po dobu minut a pak se přidal 1 μΐ enzymu pufru pro expanzi s vysokou přesnosti (Boehringer-Mannheim AG).

Reakční směs prochází 20-ti cykly v teplotním cyklovači za následujících podmínek:

první dvě minuty při teplotě 96°C cyklů při následuj ících podmínkách vteřin při teplotě

55°C vteřin

Produkt při při

PCR teplotě teplotě

72°C °C se po elektroforéze na agaróze identifikoval barvením etidiumbromidem. V typickém případě se pozorovaly nežádoucí vedlejší produkty.

Reakční směs po provedených cyklech prochází skrz kolonu

S400 HR MicroSpin.

Čištěný produkt PCR enzymů AflIII a BamHI přidání streptavidinu a se štěpil za použití restrikčnich normálním postupem, pak reakční směs se nanesla následuj e na kolonu

Centriflex (jak se popisuje v přikladu

2) . Na agarózové štěpený produkt PCR elektroforéze je možné vidět pouze správně a nežádoucí nečistoty zůstaly na matrici vázající protein.

Příklad 10: Použití DNA obsahující biotin při diagnostickém

PCR srpkovité anémie

DNA sekvence prvního exonu (kódující část) genu betaglobulinu haplotyp Al normálního lidského hemoglobulinu Al začíná:

Normální DNA:

atg

gtg

cac

ctg

act

cct gag

gag

aag

tet

gcc

gtt

act

gcc

ctg

tgg

ggc

aag

gtg

aac gtg

gat

gaa

gtt

ggt

gag

gcc

ctg

ggc

agg

. . .

která se překládá na normální aminokyselinovou sekvenci:

mvhltpeeksavtalwgkvnvdevggealg ...

V případě lidského onemocnění srpkovitou anémii sekvence

DNA prvního exonu genu beta-globulinu haplotyp S začíná:

DNA při onemocnění srpkovitou anémii:

atg gtg cac ctg tgg ggc ctg act cct gtg gag aag gtg aac gtg gat aag tet gcc gtt act gcc gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc agg .·· která se překládá na aminokyselinovou sekvenci při onemocněni srpkovitou anémii:

MVHLTPVEKSAVTALWC-KVNVDEVGGEALG...

Porovnání normální DNA a DNA spojené s onemocněním srpkovitá anémie ukazuje, že substituce jediné báze je dostatečná při transformaci normálního genu hemoglobulinu na abnormální gen, což způsobuje vážné stádium onemocnění srpkovitá anémie.

nahrazení kyselé

Kodon gag mutuje na kodon gtg, což způsobuje aminokyseliny glutamová kyselina nepolární aminokyselinou valin.

Aby se detekovala přítomnost nebo absence této mutace, izolovala se genomová DNA a jestliže je to nezbytné,

	·· · · · · ·· ·· · · · -·· · ···· ···· Ol · · ···· ·· · ·· · · ·· ·· · · · ♦ ·
amplifikovala se	pomocí PCR vhodným způsobem dříve než se

provedla diagnostická PCR.

(a) Izolace DNA pacienta

Běžný kit (GFX Genomic Blood DNA Purification kit, Pharmacia-Amersham #27-9603-01) se použil podle doporučeni výrobce k izolaci genomové DNA z krevního vzorku pacienta.

Jestliže se získalo dostatek DNA pokračuje se podle příkladu 10(c). Jestliže ne, je nutné provést krok amplifikace PCR části genu řetězce hemoglobinu beta (příklad 10 (b)) .

(b) Krok amplifikace

Izolovaná

DNA amplifikovala, aby (je možný pokud není dostatek získaná podle příkladu se zvýšilo množství DNA pro další zpracování, jak je zobrazeno dále v textu.

Směs

250 ng genomové

DNA μΐ expanzní pufru s vysokou věrností nmol dNTP

2é pmol popisuj e každého amplifikačního primeru (Primerl se dále v textu) a Primer2, přidá se

100 μΐ vody.

jednotky enzymu pro expanzní PCR s vysokou přesností se používá při 30 cyklech PCR za následujících standardních podmínek:

horký start při teplotě 96 °C hybridizace při teplotě 56 °C po dobu 30 vteřin polymerizace při teplotě 72 °C po dobu jedné minuty denaturace 96 °C po dobu 30 vteřin.

• · · · · · · · · · ·· • · · · · · · • ·

Primery užívané při amplífikaci části genomu řetězce hemoglobinu beta jsou založené na sekvenci DNA dané vyhledávacím programem EMBEL, když identifikátoru EMBL-ID:HSBETGLOB'.

se vyhledává na jediném

Genu řetězce hemoglobinu beta (zobrazený jako oddělené triplety) předchází intronová sekvence (intron 1) a je následována jinou sekvencí (intron 2), přičemž oba introny , jsou označeny dole v textu italikou.

» Část intronů (podtrženo) se použilo ke konstrukci primerů (popisuje se dále v textu).

gcataaaagtcagggcagagccatctattgctzacatttgcttctgacacaactgt gttcactaacaacctcaaacagacaoc atg gtg cac ctg act cct gag gag aag tet gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc agg agcagattgctatcaaggttacaaqacaqqtttaaqgaqaccaatagaaactgggc atgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgccta ttggtctattttcccacc. . ·

Nekódující introny jsou lemovány kódující oblastí genu. Druhý intron odděluje kódující sekvenci od další části kódující sekvence, která je dále po směru exprese genu.

Aby se amplifikovala první kódující část genu pro pozdější diagnostické PCR, použily se dva primery, například pro navázání na introny 1 a 2. Hybridizační sekvence primerů je označena shora v textu podtrženou italikou.

Primer 1: 5’ -ctagcaacctcaaacagacacc-3 ' p-rimer 2: 5' -gtaaccttgataccaacctgcc-3¹

Primery se užívají pouze při amplifikační PCR, aby se získalo více templátové DNA vhodné pro diagnostickou PCR a tak není nutné ji značit biotinem nebo jinak upravovat.

(c) Diagnostická PCR krok 1 - Konstrukce primerů

V případě diagnostické PCR, protože podstata mutace je známa, jde o mutaci jediné báze v kodonu 6 exonu, se navrhly tři primery odpovídající normální a abnormální (srpkovitá anémie) DNA:

Primer odpovídající normálnímu hemoglobinu:

PrimerN: 5'-atg gtg cac ctg act cct ga-biotin-OH

Primer odpovídající hemoglobinu onemocnění srpkovité anémie: PrimerS: _ .

5'-atg gtg cac ctg act cct gt-biot^n

Primer pro druhý konec genu

Primer2: 5¹-gtaaccttgataccaacctgcc-3' (To může být stejný primer, jako se používá při amplifikačním kroku příkladu 10(b), není značen ani se neupravuje).

Krok 2 - diagnostický test s primery pro krok 1 a produkt PCR z příkladu 10(b)

Dvě reakce PCR se uskutečnily za použití stejných podmínek jako v příkladu 10 (b) .

a) PCR za použití PrimerN + Primerí:

100 ng DNA produktu PCR z příkladu 10(b) μΐ expanzního pufru s vysokou přesností nmol dNTP pmol každého amplifikačního primerů (PrimerN a Primer2) jednotky enzymu vhodného pro expanzní PCR s vysokou přesností přidá se 100 μΐ vody.

b) PCR za použití primerS a Primer2:

jako v případě reakce PCR (a) , ale s amplifikačním primerem AB replikačním primerem N.

Produkty PCR z reakcí PCR a) a b) se čistily použitím kolon S400HR MicroSpin, jak se popisuje v příkladu 1. Produkty se pak testovaly za účelem zjištění přítomnosti biotinu pomocí centriflexové membrány, jak se popisuje v přikladu 1. Reakční směs se rozdělila do dvou částí. Nadbytek streptavidinu (5 μς) se přidal do 9/10 reakčních směsí a směs se inkubovala při teplotě 25 °C po dobu 5 minut jako v příkladu 1, pak se vše naneslo na centriflexovou membránu jako v příkladu 1. Sebraný eluát se analyzoval na agarózovém gelu jako v příkladu 1 za účelem zjištěni přítomnosti produktu DNA. Zbývající 1/10 reakčních směsí, která nepřišla do kontaktu se streptavidinem se nanesla paralelně na agarózový gel jako kontrolní vzorek.

Výsledky z testování dvou reakcí PCR a) a b) mohou mít čtyři možné výstupy ilustrované dále v textu.

Biotinylovaný produkt PCR ano nebo ne	interpretace (diagnóza
PCR # a (primerN+primerí)	PCR # b (primerS+primer2)
ano	ano	přítomny obě varianty normální i srpkovité anémie (neškodné heterozygotní podmínky)
ne	ne	není přítomen normální gen (neznámá mutace v kodonu 6, muže reprezentovat jiné onemocnění)
ano	ne	je přítomen pouze normální gen (neexistuje mutace

» · · · » · · « · · · 4

-_·· · · ♦ · · ··· 6¾ ; . i i .**· · í í ·· · · · · ·· · · · · ·

		v kodonu 6, zdravý j edinec)
ne	ano	pouze mutovaná varianta (drepanocyt) v kodonu 6 (možné letální homozygotní podmínky)

Metodu je také možné použit při diagnostice mutací více bází, jak se ilustruje dále v textu, opět v případě srpkovité anémie.

Příklad 11: Diagnostické PCR srpkovité anémie (mutace více bází)

Vícenásobná mutace (značeno podtržené a tučným písmem) v prvním exonu genu beta-globulinu je zobrazena v sekvenci DNA:

atg gtg cac ctg act cct aac gag aag tet gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc agg ..· která se přepisuje na aminokyselinovou sekvenci:

mvhltpneksavtalwgkvnvdevggealg. . .

Ačkoli se změnily tři báze, k dezekci mutace se použila podobná metoda jako v příkladu 10.

Jako v příkladu 10 se PrimerN použil k zjištění, zda je přítomen normální gen. Za účelem diagnózy potencionální přítomnosti mutace se zkonstruovaly dva primery.

Jeden primer, který odpovídá mutovanému hemoglobinu, je následuj ící:

Primer AB2a

Tento primer identifikuje přesnou mutaci „acc” v kodonu 6.

Druhý primer je Primer AB2b ' -Atggrgr^^rtgarf ccta-bÍC~Ín-OH

Tento primer může identifikovat všechny mutace v kodonu 6, který začíná bází „a.

Reakce PCR se uskutečnily s normálním PrimeremN a jedním nebo více primery odpovídajícími (to znamená, že je komplementární s) mutovanou sekvenci za použití podmínek podle příkladu 10.

Tato metoda se může použít pro libovolnou mutaci ve známé sekvenci normálního genu a jako jeden příklad se popisuje mutace hemoglobinu při srpkovité anémii. Kde jsou známy běžné mutace, které je možné vidět v populaci, k určení přesného místa mutace se může použít řada primerů.

Příklady 12 až 22

Příklady 1 až 11 se opakovaly v systému NycoCard, který nese membránu vázající protein nahrazující centriflexovou kolonu vhodnou pro odstranění nebo izolaci molekul DNA značených biotinem nebo v komplexu se streptavidinem.

67:

«>« r···

Seznam sekvencí (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 15 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; cílový fragment pro primer

BamHI (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

tttactggat cctag (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka^umělá sekvence; cílový fragment pro primer

Asn I (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:

ttacgtacat taatcgg (2) Informace o SEQ ID NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kysel
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; cílový fragment pro primer

Asn I (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

ccgattaatg tacgtaa (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 14 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; nesprávné restrikční místo ve fragmentu (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:

ttacgtacaa tcgg (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 11 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina • · • · • · · · · · • · · • · · • · · · • · · ·

	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(0)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(0)	Jiné informace:
	/poznámka=umělá sekvence; nesprávné
		ve fragmentu
(xi)	Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
tttactggta	g
Informace o	SEQ ID NO:
(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 12 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(0)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

restrikčni /poznámka=umělá sekvence; nesprávné místo restrikčni místo ve fragmentu

Popis sekvence:

SEQ ID NO: 6:

tttactggat ag (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 11 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

• · · · • · « ·

ΊΟ /poznámka=umělá sekvence; správné restrikční místo ve fragmentu (komplementární řetězec) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

gatccagtaa a (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 13 párů baží
	(B)	TYP: nukleové kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; nesprávný restrikční g”fragment (komplementární řetězec) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

ttaatgtacg taa ₁ (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 11 párů baží
	(B)	TYP: nukleové kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; nesprávný restrikční fragment (komplementární řetězec) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

ctaccagtaa a

(2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 14 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kysel
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(li)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka^umělá sekvence; nesprávný fragment (komplementární řetězec) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

ccgattgtac gtaa (2) Informace o SEQ ID NO: 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

restrikční

	(A)	DÉLKA: 17 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11: atgacctagg accacct (2) Informace o SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 17 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

·· · · · · · · • · · · »· · (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

atgacctagg cccacct (2) Informace o SEQ ID NO: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 93 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60 gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg (2) Informace o SEQ ID NO: 14:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 30 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens
(xi)	Popis sekvence: SEQ	ID NO: 14:
Met	Val His	Leu Thr Pro Glu Glu	Lys Ser Ala Val	Thr Ala Leu Trp
1		5	10	15
Gly	Lys Val	Asn Val Asp Glu Val	Gly Gly Glu Ala	Leu Gly
		20	25	30

(2) Informace o SEQ ID NO: 15:

(i)	CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 93 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA

(vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 15:

atggtgcacc tgactcctgt ggagaagtct gccgttac~g ccctgtgggg caaggtgaac 60 gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93 (2) Informace o SEQ ID NO: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 30 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: protein (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANIZMUS: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 16:

Met Val· His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp 15 10 15

Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly

25 30 (2) Informace o SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 306 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

	74	• · · · · • · • · · • · · <
	(D) TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH MOLEKULY: DNA
(Vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A) ORGANIZMUS: Homo	sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 17:

gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttctgacac aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac accatggtgc acctgactcc tgaggagaag tctgccgtta 120 ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggggca 180 ggttggratc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcatgtggag 240 acagagaaga ctcttgggtt tctgataggc actgactctc tctgcctatt ggtctatttt 300 ccca.cc

306 (2) Informace o SEQ ID NO: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) DRUH ŘETĚZCE:

(D) TOPOLOGIE:

(ii) DRUH MOLEKULY: DNA (ix) ZNAKY:

(D) Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 18:

ctagcaacct caaacagaca cc (2) Informace o SEQ ID NO: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 22 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; primer i

(xi)

Popis sekvence: SEQ ID NO: 19:

gtaaccttga taccaacctg cc (2) Informace o SEQ ID NO: 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 20 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(li)	DRUH	MOLEKULY: DNA
ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka^umělá sekvence; primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 20:

atggtgcacc tgactcctga (2) Informace o SEQ ID NO: 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 20 párů baží
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(0)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 21:

atggtgcacc tgactcccgt (2) Informace o SEQ ID NO: 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 22 párů baží

	(B)	TYP: nukleová ky
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 22:

gtaaccttga taccaacctg cc (2) Informace o SEQ ID NO: 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 93 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 23:

atggtgcacc tgactcctaa cgagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60 gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93 (2) Informace o SEQ ID NO: 24:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A)	DÉLKA: 30 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	DRUH	MOLEKULY: protein
(vi)	PŮVODNÍ ZDROJ:
	(A)	ORGANIZMUS: Homo sapiens

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 24:

Trp • · • ·

•

• ·

• · · ·

• Φ

•

• ·

Met

Val

His

Leu

Thr

Pro

Asn

Glu

Lys

Ser

Ala Val

Thr

Ala

Leu

1

5

10

15

Gly

Lys

Val

Asn

Val

Asp

Glu

Val

Gly

Glu Ala

Leu

Gly

20

25

30

(2) Informace o SEQ ID NO: 25:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)	DÉLKA: 21 párů bázi
	(B)	TYP: nukleová kyselina
	(C)	DRUH ŘETĚZCE:
	(D)	TOPOLOGIE:
(ii)	i DRUH	MOLEKULY: DNA
ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 25:

atggtgcacc tgactcctaa c (2) Informace o SEQ ID NO: 26:

(iii) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) (B)	DÉLKA: 19 párů baží TYP: nukleová kyselina DRUH ŘETĚZCE: TOPOLOGIE:
	(C) (D)
(iv)	DRUH	MOLEKULY: DNA
(ix)	ZNAKY:
	(D)	Jiné informace:

/poznámka=umělá sekvence; primer (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 26:

atggtgcacc tgactccta

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob pro alespoň částečnou separaci molekul nukleových kyselin ve vzorku do populacích, vyznačuj ící se tím, že populace je značena nebo je schopná být značena proteinem nebo ligandem schopným být imobilizován na matrici, kde značka interaguje přímo s matrici a uvedený způsob zahrnuje kontakt vzorku, který obsahuje nukleovou kyselinu, s matricí, přičemž značené molekuly jsou zachyceny matricí a tím se separují od neznačených molekul.

Způsob podle nároku vyznačuj ici může nebo tím, ž začlenit ligand, do značka je protein molekuly který má afinitu nebo ligand, který se kyseliny, nebo protein pro molekulu nukleové kyseliny.

3.

Způsob podle nároku 1 nebo se tím, ž ligand vyznačuj vybral z biotinu

2, ící nebo fluoresceinu.

4 . Způsob podle vyznačuj libovolného ící se t í z nároků 1 až 3, antigen. m, že značka je 5. Způsob podle nároku 1 nebo 2, v y z n a č u j i c i se tím, ž < a proteinem je protein vázaj ici nukleovou kyselinu. 6. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačuj ící se t í m, že matrice je ve formě listů papíru, gelů, filtrů, membrán, vláken, trubiček, mikrotitračnich destiček, kolon , částic.

• · · · · · · ··· • · ··· ·· · · · · · • · · · ···· ·· · • · · · · · ·· · · · · ·

7 . Způsob podle m, že nároku matrice je 6, vyzná porézní materiál. č u j í c í se t i 8 . Způsob podle nároku 7, vyzná č u j í c í se t í m, že matrice se začlenila do separačního zařízení vybraného z centrifugačních zkumavek,

mikrotitračních destiček, kazet a injekcí.

9. Způsob podle libovolného z nároků 6 až 8, vyznačující se tím, že absorpční polštář se nachází na uvedeném porézním materiálu a list papíru nepropouštějící kapalinu se nachází na lícní straně uvedeného absorpčního polštáře, který ho odděluje od porézního materiálu, a list papíru nepropouštějící kapalinu, který má jednu nebo více děr, se nachází na lícní straně uvedeného porézního materiálu, který ho odděluje od uvedeného absorpčního polštáře, přičemž testovaný vzorek se aplikuje do jedné z uvedených děr a absorpcí do uvedeného absorpčního polštáře difunduje v příčném směru uvedeným porézním materiálem.

10. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že slouží k alespoň částečné separaci produktu štěpení restrikčním enzymem nebo k čištění produktů reakce PCR.

11. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 10 pro alespoň částečnou separaci směsi fragmentů DNA štěpené restrikčním enzymem, kde počáteční materiál je molekula lineární DNA, která je značena nebo je schopna být značena na jednom nebo obou koncích nebo v jejich blízkosti částí, jenž je schopná být imobilizována na matrici, přičemž uvedený způsob obsahuje vystavení molekuly DNA štěpení restrikčnímu enzymu následované kontaktem vzorku s matricí, čímž značené molekuly, které pocházejí z konce počátečního materiálu

4 φ φ · · · · · ·· · φ φ φφ φφ φφ ·· ··· jsou zachyceny matrici a tím se separují od neznačených molekul.

12. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 11 pro alespoň částečnou separaci správného a požadovaného produktu amplifikace PCR od produktů PCR, které jsou výsledkem nesprávné hybridizace primerů PCR na templát, vyznačující se tím, že templátová molekula nukleové kyseliny obsahuje jediné místo rozeznávané restrikčním enzymem na konci nebo směrem ke konci templátu a primer PCR, který je značen nebo je schopný být značen, je komplementární se sekvencí na templátu, který se prodlužuje částečně do jediného restrikčního místa, přičemž způsob zahrnuje amplifikaci templátu pomocí PCR, štěpení produktů PCR restrikčním enzymem specifickým pro uvedené jediné místo rozeznávané restrikční enzym a kontakt výsledného produktu s matricí schopnou zachytit značky, čímž jsou značené molekuly nukleové kyseliny zachyceny matricí a separují se od neznačených molekul.

13. Způsob se t podle i m, že nároku 12, v y z n a konci č u j i primerů. c i značka je zachycena na 5' 14 . Způsob podle libovolného z nároků 1 až 9_r v y z n a č u j i c i se tím, že je vhodný pro diagnos tické PCR. 15. Způsob diagnostické PCR podle nároku 14, v y z n a č u j i c i s e tím, že testovaný vzorek : se

odděleně vystaví reakcím PCR, ve které mutace, je-li přítomná, je v sekvenci, se kterou je komplementární 3'primer, přičemž první reakce PCR používá 3'primer komplementární s normální cílovou nukleovou kyselinou a druhá reakce PCR používá 3'primer komplementární s mutantním cílem, kde 3'nukleotid mutantního primerů odpovídá jednomu z nukleotidů, který je mutován v mutantní nukleové kyselině, přičemž každý z uvedených 3'primeru nese značku nebo je schopen být značen na 3'nukleotidu primeru, ve kterém se detekuje přítomnost nebo absence značky v produktech reakce PCR.

16. Způsob diagnostické PCR mutací v molekule nukleové kyseliny podle nároku 14, vyznačující se tím, že se detekuje přítomnost nebo absence mutace ve vzorku nukleové kyseliny, kde se používá 3'primer specifický buď pro normální nebo mutantní nukleovou kyselinu a uvedený primer je komplementární s oblastí nukleové kyseliny a kde existuje rozdíl v bázi mezi normální a mutovanou DNA s 3'koncem primeru odpovídájičímu poloze ve vzorku, kde existuje rozdíl mezi normální a mutantní DNA, přičemž primer je značen nebo je schopen být značen a detekuje se přítomnost nebo absence značky v produktu PCR.

17. Způsob diagnostické

PCR podle nároku

14, vyznačující se tím, že testovaný vzorek se vystavil PCR s primery komplementárními s normální cílovou DNA, ve které primer prodlužující 3'konec cíle hybridizuje se sekvencí, jejíž 3'nukleotid je v mutantu mutován, a 3'primer nese značku nebo je schopen být značen na 3'nukleotidu, ve kterém se detekuje přítomnost značky reakčního produktu PCR.

18. Způsob podle libovolného z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že je vhodný pro separaci lineárních molekul DNA od kruhových molekul.

19. Způsob separace lineárních molekul od kruhových molekul nukleové kyseliny ve vzorku podle nároku 18, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení značky na konec molekul lineární nukleové kyseliny, kde uvedená značka je schopna být imobilizována na matrici přímou interakcí s matricí nebo nepřímou interakcí pomocí

20.

21.

······ ·< ···· ♦ • · · ·«······ ··· ···· · ·· • · · · · ·· * · · ·· • · · · ···· · ·· ·· »» · · · · ·· · · · vazebného partnera pro značku, a kontakt vzorku s matrici nebo, v případě, že značka interaguje s matricí nepřímo, s vazebným partnerem pro značku a s matricí, čímž jsou uvedené značené lineární molekuly nukleové kyseliny imobilizovány na matrici.

Způsob podle libovolného z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že je vhodný pro in vitro balení bakteriofágových částic.

Způsob in vitro balení rekombinantního fága podle nároku 20, vyznačující se tím, že vektor DNA se štěpí jedním nebo více restrikčními enzymy, 3'OH-skupiny vektorové DNA se blokují, vektor a DNA pro začlenění přijdou do kontaktu za podmínek vhodných pro fragmentů DNA a ligační produkty jsou značeny ligaci částí schopnou zachytit se na reaktivní 3'OH skupinách a pak následuje separace značených a neznačených molekul.

22.

23.

Způsob in vitro balení rekombinantního fága, vyznačující se tím, že vektorová DNA se štěpí jedním nebo více restrikčními enzymy, 3'OH-skupiny vektorové DNA se blokují, vektor a DNA určené pro začlenění přijdou do kontaktu za podmínek vhodných pro ligaci fragmentů DNA a ligační produkty jsou značeny částí schopnou zachytit se na reaktivní 3'OH skupinách a pak následuje separace značených a neznačených molekul.

Způsob in vitro balení rekombinantního fága, vyznačující se tím, že vektorová DNA se štěpí jedním nebo více restrikčními enzymy, 3'OH-skupiny vektorové DNA se blokují, vektor a DNA určené pro začlenění přijdou do kontaktu za podmínek vhodných pro ligaci fragmentů DNA a populace ligačních produktů je značena částí schopnou zachytit se na reaktivních 3' OH skupinách, kde tato část je schopna být imobilizována na matrici, • «•*•4 · · · · ···

4 · · · 4 · 4 Λ· 4

4 4 4 · 4 4 4 ··

4 444 44 444 ·4

4«4 · 4 · 4 444

44 ·· 44 44 44 444 ligační produkty jsou v kontaktu s matricí a pak následuje separace značených a neznačených molekul zachycením značených molekul na matrici.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se tím, že populace ligačních produktů je značena částí schopnou imobilizovat se na matrici buď přímo nebo nepřímo prostřednictvím vazebného partnera pro značku, přičemž uvedený způsob zahrnuje kontakt ligačních produktů s matricí nebo, v případě, že značka interaguje nepřímo s matricí pomocí vazebného partnera, s vazebným partnerem pro značku a s matricí, čímž se značené molekuly zachytí na matrici a oddělí od neznačených molekul.

25. Způsob separace lineárních molekul nukleové kyseliny od kruhových molekul ve vzorku, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje zavedení značky na konec molekuly lineární nukleové kyseliny, kde uvedená značka je schopna být imobilizována na matrici přímou interakcí s matricí nebo nepřímou interakcí pomocí vazebného partnera pro značku, a kontakt vzorku s matricí nebo, v případě, že značka interaguje nepřímo s matricí, s vazebným partnerem pro značku a s matricí, přičemž značené lineární molekuly nukleové kyseliny jsou imobilizovány na matrici.

26. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 25, vyznačující se tím, že značka je část, j která se může začlenit do molekuly nukleové kyseliny nebo která vykazuje afinitu pro molekulu nukleové kyseliny.

27. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 26, v y z n a č u j í c í set í m, že značka interaguj e nepřímo s matricí.

• « *» v · · · • « · · · • · • ·

28 . Způsob podle libovolného z nároků 23 až 2 6, v y z n a č u j i c i se tím, ž e značka interaguj e nepřímo s matricí pomocí vazebného partnera pro značku. 29. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 28, v y z n a č u j i c i se tím, ž e značka j e ligand.

λ 30. Způsob se ti podle m, že nároku ligand se vyb 29, ral vyznačuj ící z biotinu a fluoresceinu. 31. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 28, v y z n a č u j i c i set í m, , ž e značka je steroid nebo molekula podobná steroidu • 32. Způsob podle nároku 31, vyznač u j í c í se t í m, že steroid je digcxygenin. 33. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 28, v y z n a č u j í c i se t i m, ž e značka je antigen. 34 . Způsob podle libovolného z nároků 23 až 28, - v y z n a č u j í c i se t i m, ž e značka je protein. - 35. Způsob podle nároku 34, vyznač u j i c i se t í m, že protein je protein vázající nukleovou kyselinu • • 36. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 28, v y z n a č u j i c i set i m, ž e značka je molekula J nukleové kyseliny 37 . Způsob podle libovolného z nároků 23 až 30, v y z n a č u j í c í set í m, ž e značka je biotin a je zachycena pomocí streptavidinu nebo avidinu. 38. Způsob podle libovolného z nároků 23 až 37,

vyznačující se tím, že matrice je ve formě • 9 Λ · » · • · · · · * · ·· · ···· ·«·· • · « · ♦ · · · · • · · · · ·· · · · · * ««·· «··· · * · «· ·· · · · · · · · 1 · listů papíru, gelů, filtrů, membrán, vláken, trubiček, mikrotitračnich destiček, kolon, částic.

39. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že matrice je porézní materiál.

40. Způsob podle nároku 39, vyznačuj i c i se tím, že matrice se začlení do separačního zařízení vybraného z centrifugačních zkumavek, mikrotitračnich *

destiček, kazet a injekcí.

i

41. Způsob podle libovolného z nároků 38 až 40, vyznačující se tím, že absorpční polštář se nachází na uvedeném porézním materiálu a list papíru nepropouštějící kapalinu se nachází na lícní straně uvedeného absorpčního polštáře, který ho odděluje od uvedeného porézního materiálu a list papíru nepropouštějící kapalinu, který má jednu nebo více děr, se nachází na lícní straně uvedeného porézního materiálu, který ho odděluje od uvedeného absorpčního polštáře, přičemž testovaný vzorek se aplikuje do jedné z uvedených děr a absorpcí do uvedeného absorpčního polštáře difunduje v příčném směru uvedeným porézním materiálem.

42. Způsob konstrukce genové knihovny nebo knihovny vyjadřující fága, vyznačující se tím, že zahrnuje použití způsobu podle nároku 22.

43. Způsob alespoň částečné separace molekul nukleové kyseliny ve vzorku do populací, vyznačuj ící se tím, že populace je značena nebo je schopná být značena částí schopnou imobilizovat se na matrici, přičemž uvedená metoda zahrnuje kontakt vzorku obsahujícího nukleovou kyselinu s matricí, čímž jsou značené molekuly zachyceny matricí a tak se separují od neznačených molekul, přičemž matrice je ve formě listů papíru, gelů, filtrů, • to to · · to • · to · · · * ··« « « · « · ♦ · « · · •« ·· «· ·· ·· ♦ » · membrán, vláken, zkumavek, mikrotitračních destiček, kolon, částic a matrice je porézní materiál a absorpční polštář se nachází na uvedeném porézním materiálu a list papíru nepropouštějící kapalinu se nachází na lícní straně uvedeného absorpčního polštáře, který ho odděluje od uvedeného porézního materiálu, a list papíru nepropouštějící kapalinu, který má jednu nebo více děr se nachází na lícní straně uvedeného porézního materiálu, který ho odděluje od uvedeného absorpčního polštáře, přičemž testovaný vzorek se aplikuje do jedné z uvedených děr a absorpcí do uvedeného absorpčního polštáře difunduje v příčném směru uvedeným porézním materiálem.

44. Způsob podle nároku 43, vyznačuj ící se tím, že populace molekul je značena nebo je schopna být značena částí schopnou se imobilizovat na matrici buď přímo nebo nepřímo pomocí vazebného partnera pro značku, přičemž uvedený způsob zahrnuje kontakt nukleové kyseliny obsažené ve vzorku s matricí nebo v případě, že značka interaguje nepřímo s matricí pomocí vazebného partnera, s vazebným partnerem pro značku a matricí, čímž se značené molekuly zachytily na matrici a

tak se separují od neznačených molekul. 45. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 44 v y z n a č u j lei setím, že značka je část

která se může začlenit do molekuly nukleové kyseliny nebo která má afinitu pro molekulu nukleové kyseliny.

46. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 4 5, v y z n a č u j í c í set i m, ž e značka interaguj e přímo s matricí. 47. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 45, v y z n a č u j í c i set i m, ž e značka interaguj e nepřímo s matricí pomocí vazebného partnera pro značku.

· ··φ ·« ·· «· · «Φ·Φ Φ Λ · «· » · ‘ · · ·· 4 · · · · I * «·« · « · · Λ 9 · · · ·Φ Φ · ·

48 . Způsob podle libovolného z nároků 43 až 47, v y z n a č u j í c i se tím, ž e značka je ligand. 49. Způsob podle nároku 48, vyznač u j í c i *- se t í m, že ligand se vybral z biotinu nebo fluoresceinu. 50. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 4 7, ♦ v y z n a č u j í c í se tím, ž e značka je steroid 1 nebo molekula podobná steroidu. 51. Způsob podle nároku 50, vyznač u j i c i se t í m, že: steroid je digoxygenin. 52. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 47, v y z n a č u j i c í se tím, ž e značka je antigen. 53. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 47, v y z n a č u j í c i se tím, ž e značka je protein. 54. Způsob podle nároku 53, vyznač u j í c i se t í m, že protein je protein vázající nukleovou - kyselinu • 55. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 47, v y z n a č u j i c í se tím, ž e značka je molekula * nukleové kyseliny • i 56. Způsob podle libovolného z nároků 43 až 4 9, v y z n a č u j í c i se tím, ž e značka je biotin a je zachycena pomocí streptavidinu nebo avidinu. 57 . Způsob diagno stické PCR, vyznač u j i c i se t í m, že testovaný vzorek se odděleně vystavil

reakcím mutace,

PCR, je-li přítomná, je přičemž ve kterých kterou je komplementární 3'primer, první reakce PCR používá 3'primer komplementární s normální v sekvenci, se *· ···· ·· ·· »· «· · · · · Ίv «3 « · » · * · ·· • · · · · · · · · · ·· ···· ···· · ** • · ·« · < «· «· ··· cílovou nukleovou kyselinou a druhá reakce PCR používá 3'primer komplementární s mutantním cílem, kde 3'nukleotid mutantního primeru odpovídá jednomu z nukleotidů, který je mutován v mutantní nukleové kyselině, přičemž každý z uvedených 3'primerů nese značku nebo je schopen být značen na 3'nukleotidu primeru a detekuje se přítomnost nebo absence značky v produktech reakce PCR.

58. Způsob diagnostické PCR mutací v molekule nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že se detekuje přítomnost nebo absence mutace ve vzorku nukleové kyseliny, kde se používá 3'primer specifický buď pro normální nebo mutantní nukleovou kyselinu a uvedený primer je komplementární s oblastí nukleové kyseliny, kde existuje rozdíl báze mezi normální a mutovanou DNA s 3'koncem primeru odpovídajícímu poloze ve vzorku, kde existuje rozdíl mezi normální a mutantní DNA, přičemž primer je značen nebo je schopen být značen a detekuje se přítomnost nebo absence značky v produktu PCR.

59. Způsob diagnostické PCR, vyznačuj ící se tím, že testovaný vzorek se vystavil PCR s primery komplementárními s normální cílovou DNA, kde primer prodlužující 3'konec cíle hybridizuje se sekvencí, jejíž 3'nukleotid je v mutantu mutován a 3'primer nese značku nebo je schopen být značen na 3'nukleotidu, a detekuje se přítomnost nebo absence značky v reakčním produktu PCR.