CZ2001196A3 - Zařízení pro detekci jedné nebo několika fluorescenčních složek a použití tohoto zařízení - Google Patents

Abstract

Zařízení pro detekci jedné nebo několika fluorescenčních složek, kde uvedené složky jsou obsaženy v médiu, přičemž toto médium je obsaženo ve vedení, např. v kapiláře (14). Zařízení zahrnuje prostředek pro excitování fluorescenčních složek světlem, např. argonový iontový laser (16). Uvedené médium a kapilára (14) tvoří konstrukci, která je transparentní pro excitační a emitované fluorescenční světlo argonového iontového laseru (16), a uvedené zařízení zahrnujejednu nebo několik takových konstrukcí, je zlepšeno ponecháním alespoň části emitovaného fluorescenčního světla, aby bylo vedeno z ozařovací zóny prostřednictvím úplného odrazu (TIR) v uvedené konstrukci a snímáno zjednoho konce této konstrukce, v komoře (18), přes kondenzorovou čočku (19), skleněné dolní propusti (20), do objektivu kamery (21).

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká zlepšení v typu zařízení, která jsou používána pro detekci fluorescenčních složek.

Dosavadní stav techniky

Fluorescenční detekce nebo fluorometrie je dobře zavedenou a často používanou metodou v analytické chemii.

Hlavními znaky fluorescenční detekce jsou velká selektivita a vysoká citlivost a tato metoda je často aplikována pro detekci stopových složek ve vzorcích různých typů. Fluorescenční detektory sestávají obecně ze tří hlavních podsystémů: i) excitačního světelného zdroje a přidružené

I optiky, ii) měrné kyvety, a iii) snímací optiky a světelného detektoru. Světelný zdroj generuje světlo, které excituje fluorescenční složky. Nejčastěji používanými světelnými zdroji jsou vysokointenzitní lampy, jako například xenonové výbojky nebo lasery. Excitační optika převádí světlo od i

světelného zdroje k ozařovací zóně, kde světlo excituje vzorek. Nejčastěji je používána zaostřovací optika, ale rovněž může být použita například vláknová optika (s optickými vlákny) a další druhy vlnovodů. Když je použít / laserový světelný zdroj, může být zaostřovací optika v některých případech vypuštěna. Vzorek může obsahovat jednu nebo několik fluorescenčních složek. Vzorek je obecně přítomen v médiu, například v kapalném roztoku, které je dále obsaženo v nějakém typu měrné kyvety. Měrnou kyvetou může, například, být komora, do které je vzorek nejprve vložen, potom detekován, přičemž je stacionární, a nakonec je vyjmut.

* · • · ** • · • · · • · · · » ···« · ·

Kyvetou může rovněž být část nějakého typu vedení, skrz které je vzorek transportován do a z ozařovací zóny. Snímací optika snímá emitované fluorescenční světlo účinným způsobem a transportuje toto světlo do světelného detektoru. Rovněž pro snímací optiku jsou běžně používány zaostřovací prvky, ale rovněž může být použito například vláknové optiky.·Snímací a rovněž excitační optika může rovněž zahrnovat nějaký typ zařízení, jako je například monochromátor nebo jeden či několik filtrů, pro selekci nebo rozptyl vlnových délek. Excitace je nejčastěji prováděna na jedné vlnové délce nebo několika dobře definovaných vlnových délkách nebo alternativně může být excitační vlnová délka skenována. Detekce může být prováděna na jedné nebo několika diskrétních vlnových délkách nebo intervalech vlnových délek, nebo snímaných či rozptýlených v intervalu vlnových délek, nebo může být detekováno celkové množství emitovaného světla. Selektivní detekce vlnových délek zvyšuje univerzálnost a selektivitu fluorometrie a je nutným předpokladem v aplikacích, jako je například čtyřbarevná sekvenční analýza DNA. Existuje mnoho různých typů světelných detektorů, jako jsou například fotodiody, diodová pole, zařízení CTD (zařízení s přenosem nábojů, včetně zařízení CCD (zařízení s nábojovou vazbou) a zařízení CID (zařízení s injekcí náboje}}, a fotonky s fotonásobičem.

Jedním z nejběžnějších a nejdůležitějších využití fluorometrie je detekční metoda ve spojení a analytickými metodami, ve kterých je vzorek obsažen a transportován v určitém typu vedení. Takové analytické metody zahrnují, ale nejsou omezeny na, CE (kapilární elektroforéza), LC (kapalinová chromatografie) a FIA (průtoková analýza se

4 4 4 » »·«« • · 4

4

4 • 4 4444 vstřikováním). V této souvislosti bude předkládaný vynález převážně diskutován ve spojení s CE, ale aplikace na další analytické metody jsou osobám v oboru znalým zcela zjevné. CE je dobře zavedená separační metoda s možností analýzy velmi malých množství vzorku a poskytující velmi vysokou účinnost separace.

Fluorescenční detekce, a zejména LIF (laserem indukovaná fluorescence), je bobře zavedenou detekční technikou pro CE. Lasery mají dvě hlavní výhody: i) vysokou intenzitu světla, a ii) schopnost zaměřit laserový paprsek na malý bod uvnitř kapiláry. Je důležité, že velikost světelného paprsku v bodě excitace nepřispívá k rozšíření pásma: šířka CE špíček může vyžadovat průměry paprsků o velikosti 10 pm nebo méně. V nejběžnějším a dobře zavedeném optickém nastavení a ortogonálním nastavení je kapilára ozařována laserem a emitované světlo je snímáno v 90° vzhledem ke směru laserového paprsku. Hlavní snahou je, za účelem maximalizace citlivosti, maximalizovat účinnost snímání světla a minimalizovat množství rušivého světla přiházejícího do světelného detektoru. Vysoká účinnost snímání je obecně dosahována prostřednictvím použití snímací optiky s velkou numerickou aperturou. Termín rušivé světlo je v tomto popisu použit pro označení všech typů nechtěného detekovaného světla. Rušivé světlo může být do určité míry vyloučeno prostřednictvím použití spektrálních a/nebo prostorových filtrů. Elektroforézní kapiláry jsou často chráněny polymerním potahem, například polyimidem, který musí být odstraněn předtím, než může být provedena fluorescenční detekce. Rozptyl primárně laserového světla může nastat, pokud jsou na stěně kapiláry ponechány polymerní nebo jiné • 9

9

9 9 • 9999 99 9 • 9 9 9 9 · >9 částice, pokud je stěna poškrábána, nebo pokud uvnitř stěny nebo média uvnitř kapiláry existují cizorodé prvky. Navíc dochází k rozptylu světla na každém optickém rozhraní podle Fresnelova zákona odrazu. Přesněji tedy válcové sloupce běžně používané v CE představují problém, protože rozptylují světlo rovněž v 90° vzhledem ke směru laserového paprsku. Většina materiálů také rozptyluje světlo pružným (Rayleighovým) Ramanovým molekulárním rozptylem. Rozptýlené primární světlo může často být, ale ne ve všech případech, účinně vyloučeno prostřednictvím spektrální filtrace nebo rozložení vlnových délek. Sekundární světlo s posunutou vlnovou délkou může představovat vážnější problém. Nepružný (Stokesův posunutý) Ramanův rozptyl nebo fluorescenční vyzařování od Částic polymeru nebo nečistot na stěně sloupce, od stěny sloupce samotné, od média, ve kterém je obsažen vzorek, nebo od nečistot v médiu či ve vzorku samotném, nemusí být snadno vyloučitelný spektrální filtrací nebo rozložením vlnových délek. Může být dosaženo prostorové filtrace prostřednictvím, například, snímací optiky a apertur s malou ohniskovou hloubkou. Snímání světla je prostorově soustředěno do oblasti média, zatímco světlo vystupující z jiných oblastí je vyloučeno.

Pro vysoce účinné separační metody, využívající sloupce s malými průměry a malé vzorky a poskytující velmi

5 úzká analytická pásma v detektoru, jako je například mikro LC a zejména CE, je nezbytným požadavkem, aby detekce byla prováděna na sloupci a aby detekční objem byl tak malý, jak je možné. Použití vnější detekční kyvety s průměrem větším než je průměr sloupce povede na rozšíření pásma a vazba na takovou kyvetu obecně způsobí mrtvé objemy, což vede na další • 9 • ·

9999

9 • 99 9

999 9 9 9 • « 9 9 9 ·· 9 «9 rozšíření pásma. Maximální přípustný detekční objem pro, například, vysoce účinnou CE separaci na 100 pm sloupci může být řádově nebo méně než 2 ní.

Jedním navrženým zařízením pro maximalizaci účinnosti 5 snímání světla a minimalizaci rušivého světla je souohmskový fluorescenční mikroskop [Ju, J. a kol., Anal. Biochem. 1995, 231, 131-40]. Laserový paprsek je odražen dichroickým děličem světla s dolní propustí a zaostřen objektivem mikroskopu na velmi malý bod, řádově o velikosti 10 pm, uvnitř kapiláry.

¹⁰ Emitované fluorescenční světlo je snímáno stejným objektivem, ale je přenášeno skrz dělič světla do detekční optiky. Zaostřením snímací optiky přesně dovnitř kapiláry jsou minimalizovány příspěvky rušivého světla způsobené stěnou kapiláry. Umístěním apertury do ohniskového bodu snímaného fluorescenčního světla může být rušivé světlo dále omezeno prostřednictvím prostorové filtrace. Vysoká účinnost snímání světla je dosažena použitím objektivu mikroskopu s velkou numerickou aperturou. Nevýhody tohoto zařízení zahrnují nutnost dodržení velmi přísných mechanických tolerancí a velmi pečlivého optického vyrovnaní, a citlivost na, například, vibrace. Tyto nevýhody jsou důsledkem použité malé ohniskové hloubky. Navíc pro válcové kapiláry vzniká problém se zaostřením světla a snímáním světla ve vnitřku tělesa postrádajícího kruhovou symetrii.

Dalším navrženým zařízením pro optimalizaci citlivosti detekce je plášťová průtoková kyveta [Swerdlow, H.

a kol., Anal. Chem. 1991, 63, 2835-41; Chen, D. Y. a kol·., J.

Chromatogr. 1991, 559, 237-46] . Analyzát, který má být detekován je vypuštěn z kapiláry a excitován bezprostředně 30 vně konce kapiláry v toku pufru proudícího skrz vysoce čistou • φ • φ • Φ ·φ·φ • φ * · · φ »·· • · φ φ · ·· φ φφ křemennou kyvetu. Protože analyzát je detekován za kapilárou, příspěvky rušivého světla od stěny kapiláry jsou vyloučeny. Navíc, protože křemenná kyveta může být zkonstruována s plochými optickými povrchy, je vyloučen problém s rozptylem světla, který je spojen se zakřivenými povrchy. Vysoké účinnosti snímání světla je dosaženo prostřednictvím použití snímací optiky s velkou numerickou aperturou. Použití tohoto zařízení vyžaduje velmi pečlivou kontrolu podmínek průtoku a impedancí průtoku, aby se udržela integrita toku analyzátu.

Navíc přítomnost částic, bublinek nebo nečistot v pufru plášťové průtokové kyvety může vést na velká množství rušivého světla.

Aby se zvýšila průchodnost vzorků CE analýzy, jako například pro hromadnou sekvenční analýzu DNA, je žádoucí spouštět CE v mnoha kapilárách současně. Taková multiplexm analýza s sebou přináší vážné dodatečné optické a geometrické problémy, pokud se týká fluorescenční detekce. Nejčastěji je množství kapilár uspořádáno vedle sebe paralelním způsobem, takže pole kapilár tvoří rovinné pole v detekčním bodě.

Běžné sloupcové ortogonální nastavení může být aplikováno pro detekci pole kapilár [Ueno, K. a kol.,

Proceedings of the Society of Photo-Optical Instrumentation

Engineers 1997, 2985, 4-18]. Vznikají zde ale problémy s ozařováním. Pokud je rovinné pole kapilár ozařováno, například, množstvím paralelních laserových paprsků nebo do řádky zaostřeným laserovým paprskem, excitující světlo může tvořit rovinu, která je kolmá k rovině pole kapilár. S touto geometrií zde není ponechán ortogonální směr pro snímání světla. Úhel 90° mezi excitujícím a emitovaným světlem může 30 být získán nakloněním pole kapilár, ale taková konstrukce φφφ φφφ φ • φ φ φφ φφφ

Φ φ φ · φφφ «· φφφφ φ φφφ • · φ φφφφ φ φ φ φφ φ vede na vytvořeni nadměrného rušivého světla a rovněž na problémy s účinnosti snímáni světla. Jako alternativa může být pole kapilár ozařováno jedním jediným laserovým paprskem ve stejné rovině jako je pole, přičemž tento laserový paprsek dopadá na různé kapiláry postupným způsobem [Anazawa, T. a kol., Anal. Chem. 1996, 68, 2699-2704; Yeung, E. S. a kol.,

US patent č. 5,741,411, 1998]. S touto konstrukcí může být snímací optika umístěna v 90’ vzhledem k vstupnímu paprsku. Protože ale vstupní paprsek bude dopadat na množství optických rozhraní, bude se vytvářet množství rušivého světla. Navíc, protože určitá energie laseru je ztracena na každém rozhraní, dostupná energie laseru bude rychle klesat, jak laserový paprsek postupuje skrz množství kapilár, což vede snížený fluorescenční signál. Dále, protože laserové paprsky jsou divergentní (rozbíhavé), není možné udržet přesné zaostření paprsku na prodlouženou vzdálenost.

Výsledkem je, že určité kapiláry budou ozářeny ne tak přesně zaostřeným paprskem, což může způsobit rozšíření detekčního pásma a ztrátu separačního rozlišení elektroforézních vrcholů.

Princip souohniskového mikroskopu může být rovněž aplikován pro detekci pole kapilár [Mathies, R.A. a kol., US patent č. 5,274,240, 1993; Kheterpal, I. a kol.,

Electrophoresis, 1996, 17, 1852-59]. V tomto případě musí být 2 5 zaostřený laserový paprsek skenován přes pole kapilár (nebo obráceně). Je tedy potřebné použít pohyblivé části v detektoru, což není žádoucí, zejména s ohledem na požadované přísné mechanické tolerance a citlivost na vibrace. Navíc, protože laserová energie je sdílena v čase mezí všemi různými 30 kapilárami, je pracovní cyklus na kapiláru malý, což snižuje • · · * ···· · · · • · · ♦· ···· celkovou účinnost snímání světla na kapiláru. Tyto problémy jsou zvýrazněny zejména tehdy, když jsou použita velká pole kapilár.

Pro detekci pole kapilár může být rovněž aplikována plášťová průtoková kyveta [Takahashi, S. a kol., Anal. Chem. 1994, 66, 1021-26; Dovichi, N. J. a kol., US patent č. 5,741,412, 1998; Takahashi, S. a kol·., US patent č.

5,759,374, 1998], Jsou s tím ale spojené specifické nevýhody. Opět nemůže být použito jednoduché ortogonální nastavení, jak bylo diskutováno výše. Jednou možností je ozařovat rovinné pole toků analyzátu ortogonálně s rovinou světla (například řádek zaostřeného laserového paprsku), a snímat emitované světlo ve stejné rovině jako je pole kapilár, to jest snímaní na konci vzhledem ke kapilárám. Základní optická omezení ale limitují účinnost snímání světla z rozšířené řady objektů (to jest konců kapilár). Aby se zmenšil nejdelší rozměr pole konců kapilár, je alternativou uspořádat kapiláry v třírozměrném poli, to jest ve svazku, ale potom laserový paprsek bude interagovat se vzorky přes prodlouženou vzdálenost, což může vést na rozbíhání, ztrátu zaostření a rozšíření detekčního pásma. Rovněž těsné uspořádání množství kapilár do svazku může mít za následek rozšíření pásma v důsledku neúčinné disipace Jouleova tepla. Navíc plášťová průtoková detekce ve spojení s poli kapilár přináší extrémní nároky na propracovanost, řízení a tolerance průtokového systému.

Bylo rovněž navrženo více-kapilárové zařízení pro sekvenční analýzu DNA, založené na příčném ozařování a vedení emitovaného fluorescenčního světla prostřednictvím úplného odrazu (TIR) v kapilárách [Takubo, K., JP patent č. 10019846, • · * • ···· • · • · ·· ···· ·· ·· ·

1998] . Nebyl ale navržen žádný optický potah na kapilárách, takže TIR podmínky nebudou dodrženy. Protože index lomu (Rl) gelu uvnitř kapilár ve nejpraktičtějších případech bude přibližně stejný jako Rl elektrolytického pufru, do kterého jsou ponořeny konce kapilár, většina světla bude unikat radiálně skrz obvod kapilár a nedosáhne konců kapilár. Rovněž svazkování kapilár bez optického potahu bude způsobovat vznik vážných optických přeslechů mezi kapilárami, což opět zabrání většině světla v dosažení konce kapiláry, ve které bylo emitováno. Navíc, svazkování kapilár celou cestu od injekčního konce k detekčnímu bodu bude způsobovat vznik značného Jouleova tepla, což nepříznivě ovlivní rozlišení elektroforézy.

Vláknová optika může být rovněž použita pro přenos excitačního světla a snímání emitovaného světla [Quesada, M. A. a kol., Elektroforéza, 1996, 17, 1841-51]. Vyrovnání velkého počtu jednotlivých vláken a kapilár ale s sebou přináší obrovské množství práce. Navíc lze očekávat, Že množství rušivého světla překročí množství takového světla u souohniskového snímacího zařízení nebo u plášťové průtokové kyvety.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je založen na myšlence, že zařízení pro detekci jedné nebo několika fluorescenčních složek, kde uvedené složky jsou obsaženy v médiu, přičemž toto médium je obsaženo ve vedení, uvedené zařízení zahrnuje prostředek pro excitování fluorescenčních složek světlem, uvedené médium a vedení tvoří konstrukci, která je transparentní pro excitační a emitované fluorescenční světlo, *· «

«*· * · · · · · · • · · · · · ··« ♦ · · · · · ·· ··«· · a uvedené zařízení zahrnuje jednu nebo několik takových konstrukcí, může být zlepšeno ponecháním alespoň části emitovaného fluorescenčního světla, aby bylo vedeno z ozařovací zóny prostřednictvím úplného odrazu (TIR) v uvedené konstrukci a snímáno z jednoho konce této konstrukce.

Takové zařízení nabízí jednoduchost a robustnost, pokud se týká mechaniky, optiky a manipulace s kapalinami, a rovněž vysokou účinnost snímání světla, nízké množství rušivého světla a snadnou upravitelnost pro detekci pole , · i ' kapilar.

Pro světlo postupující v materiálu s indexem lomu a dopadající na povrch materiálu s indexem lomu n₂ pod úhlem a vzhledem k normále k povrchu, dochází k TIR (úplnému odrazu} pokud:

n₁.sina > n₂

To znamená, že n, musí být vetší než n₂. Za podmínek TIR je všechno světlo v principu odraženo zpět do prvního materiálu. Pro odraz pod úhly menšími než a je nějaké světlo odraženo a nějaké přeneseno.

V jednom aspektu tedy předkládaný vynález navrhuje zařízení, jehož podstata spočívá v tom, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a koncem pro snímání světla uvedené konstrukce je dostatečně velká pro umožnění světelným 25 paprskům vystupujícím z ozařovací zóny, které nesplňují podmínky TIR, aby byly účinně odvedeny ze světlo vodící části uvedené konstrukce před dosažením konce pro snímání světla. Takové zařízení zajišťuje, že pouze světlo vedené prostřednictvím TIR skrz konstrukci bude snímáno a detekováno na konci konstrukce. Prostřednictvím použití vhodného

Η 4 » « <

uspořádání většina z excitačního, primárního světla a část z rušivého (rozptýleného) světla může být přinucena, aby nesplnila podmínky pro TIR a aby byla přenesena ze světlo vodící konstrukce před dosažením konce pro snímání světla.

V dalším aspektu předkládaný vynález navrhuje zařízení, jehož podstata spočívá v tom, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a koncem pro snímání světla uvedené konstrukce je alespoň čtyřnásobně, nebo výhodně alespoň osminásobně, nebo obzvláště výhodně alespoň šestnáctinásobně, větší než největší průřezový rozměr světlo vodící části uvedené konstrukce. Pokud je uvedená vzdálenost čtyřikrát větší, většina ze světla, které dosáhne konce pro snímání světla, bude vystavena alespoň jednomu jevu odrazu. Protože ale vyloučení světla, které není podroben TIR, je mnohem účinnější při vícenásobných jevech odrazu, jsou mnohem výhodnější hodnoty osminásobku nebo šestnáctinásobku.

Navíc, pokud ozařování probíhá v bezprostřední blízkosti konce pro snímání světla, rozptyl a ohyb primárního excitačního světla může v důsledku hranových jevů způsobit zvýšené úrovně rušivého světla. Dokonce, například, dobře zaostřený laserový paprsek má konečný rozsah a takové jevy mohou nastat v blízkosti ostrých hran. Předkládaný vynález poskytuje prostředek pro vyloučení takovýchto jevů.

Výraz složky je použit pro označení jakékoliv fluorescenční entity, jako jsou molekuly, ionty, supramolekulární seskupení, micely, částice, nebo celé buňky nebo části buněk. Výraz médium je použít pro označení kapaliny s vysokou nebo nízkou viskozitou, polotuhého gelu, nebo tuhého materiálu. Výraz vedení je použit pro označení jakékoliv podlouhlé entity fyzicky obsahující uvedené médium, • · · · 4 4 * 4 · · • ♦ · · · ♦ 4444 4 · « φ • 4 4 4 4 4 4 « · ·· 4444 44 # 44 ·« ve které mohou být přenášeny uvedené složky, jako je například bez jakéhokoliv omezení, trubice, kapilára, sloupec, nebo kanálek vytvořený, například rovněž bez omezení, ve skle, křemenu, křemíku nebo organickém polymeru.

V jednom určitém případě je vedením separační sloupec pro CE nebo LC. Uvedené médium může nebo nemusí být transportováno uvnitř uvedeného vedení. Excitační světlo může být v ultrafialovém, viditelném, téměř infračerveném nebo infračerveném rozsahu. Výraz konstrukce je použit pro označení jakékoliv entity zahrnující a fyzicky definující uvedené vedení a uvedené médium. Termín světlo vedoucí část konstrukce označuje tu část konstrukce, která skutečně vede světlo a může označovat médium, vedení, nebo médium a vedení. Výraz transparentní znamená, že materiál musí být schopen přenášet světlo s nízkými ztrátami, to jest neabsorbuje mnoho a nerozptyluje mnoho na relevantních vlnových délkách. Výraz konec pro snímání světla konstrukce označuje ten konec konstrukce, kde vedené světelné paprsky opouštějí konstrukci a mohou být snímány a detekovány optickými prostředky. Tento režim snímání světla vylučuje odpojení světla od konstrukce prostřednictvím jakéhokoliv vnějšího optického odváděče před dosažením konce konstrukce. Příkladem takového odváděče může být optické vlákno připojené na konstrukci. V jednom určitém případě je koncem pro snímání světla jeden konec separačního sloupce pro CE nebo LC. Termín ozařovací zóna označuje místo, ve kterém excitační, primární světlo interaguje s konstrukcí a excituje fluorescenční složky.

Výhody předkládaného vynálezu budou zřejmější z následující diskuze výhodného ovlivňování různých aspektů a provedení vynálezu. Vysvětlující příklady budou převážně

• 9 *

9

9*9 • 9 9 • 999

9 ·

9« 9999 •99 9 999· 9 9 odkazovat na detekci ve spojení s CE, jak ale bude zcela zřejmé osobám v oboru znalým, předkládaný vynález není omezen pouze na tuto detekci.

Následující popis příkladných provedení bude učiněn ve spojení s odkazy na připojené výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Obr.l znázorňuje schematický náčrtek světlo vedoucí konstrukce, ve které RI (index lomu) vedení je větší než RI média;

Obr. 2 znázorňuje schematický náčrtek světlo vedoucí konstrukce, ve které RI vedení je menší než RI média;

Obr. 3 znázorňuje schematický náčrtek spektrálního rozkladu světla snímaného z kapilár;

Obr. 4 znázorňuje diagram postupu paprsků pro světlo vystupující z různých míst ve světlo vedoucí konstrukci;

Obr.5 znázorňuje schematický náčrtek excitačního světla zaostřeného před dosažením kapiláry;

Obr. 6 znázorňuje schematický náčrtek množství kapilár uspořádaných ve formě rovinného pole;

Obr. 7 znázorňuje schematický náčrtek světla, které je částečně rozptýleno před dosažením rovinného pole kapilár;

Obr. 8 znázorňuje schematický náčrtek rovinného pole kapilár, které jsou uspořádány do čtvercového pole na koncích pro snímání světla;

• · · • » ♦ • · ♦ ·· ··· • · · · ϊ 4 · • * · * * ··«« • · · · · · • · ·· »

Obr. 9 znázorňuje schematický náčrtek hustě uspořádaného pole kapilár, zobrazeného na světelném detektoru;

Obr.10 znázorňuje schematický náčrtek řídce uspořádaného pole kapilár, zobrazeného na světelném detektoru;

Obr.11 je schematické znázornění zařízení použitého v příkladech;

IQ Obr.12 znázorňuje stopu fluorescenčního signálu, zaznamenaného během čerpání roztoku fluoresceinu skrz kapiláru;

Obr.13 znázorňuje obrazy konce pro snímání světla kapiláry během čerpání vody respektive fluoresceinu;

Obr.14 znázorňuje elektroferogram injekce fluoresceinu; a

Obr.15 znázorňuje DNA sekvenci získanou se zařízením „„ podle obr. 11.

Příklady provedení vynálezu

V jednom provedení vynálezu index lomu (Rl) média, obsahujícího fluorescenční složky, je nižší než Rl vedení, obsahujícího toto médium. Navíc Rl vedení je větší než Rl materiálu obklopujícího vedení. To může být ilustrováno prostřednictvím, například, velmi běžného případu vodného roztoku v kapiláře z taveného křemenu, kde tato kapilára je obklopena, například, vzduchem nebo polymerem s nízkým Rl. V tomto případě TIR nebude probíhat na hranicí mezi médiem a vedením, ale na hranici mezi vedením a obklopujícím • · · ···* · · *· • · · · · · ···· * · · · ··· · · · » » » ·· ···· ·♦ · ·· »·« materiálem (a do určité míry na hranici mezi vedením a médiem). Absorbance obklopujícího materiálu nemusí být příliš velká a odrazový povrch obklopujícího materiálu nemusí být příliš rozptylující, protože to ovlivní nepříznivě účinnost

TIR. Světlo bude vedeno jak v médiu tak i ve vedení. Příklad takového provedení je znázorněn na obr. 1, kde fluorescenční světlo, emitované z ozařovací zóny 3, je vedeno skrz vedení X a médium 2 do konce A pro snímání světla.

Ve výhodné variantě tohoto provedení je vedení vyrobeno ze skla, taveného křemenu, křemenu nebo organického polymeru. To jsou velmi běžné a praktické konstrukční materiály pro vedení a z optického hlediska umožňují použití velkého rozsahu různých médií, včetně vody a mnoha organických rozpouštědel.

V jednom aspektu této varianty má vedení potah z organického polymeru. Potah, například, CE kapilár zajišťuje dostatečnou robustnost vedení pro většinu praktických manipulací a chrání vedení před znečištěních a poškrábáním. Navíc může tento polymerický potah vytvořit dobře definovaný

0 optický povrch s vysokou kvalitou. Výhodně je vedení vyrobeno z taveného křemenu a potahem je fluoropolymer. Použití kapilár z taveného křemenu je dobře zavedeno v praxi CE a vysoce čistý tavený křemen je vynikajícím optickým materiálem. Fluoropolymery obecně mají nízký index lomu, což umožňuje velkou účinnost snímání světla.

Použitím transparentního polymerického potahu s vysokou optickou kvalitou není nutné odstraňovat tento potah v ozařovací zóně. Excitační světlo může být jednoduše vedeno skrz potah a na vedení. Použitý potah nesmí být vysoce fluorescenční na použitých vlnových délkách. Nejběžnějším • · · · •··♦· · · • · *· ·«·· • · ·· ·· · potahovým materiálem pro kapiláry v CE je polyimid. Tento materiál je fluorescenční a není transparentní a musí být odstraněn před excitováním. Odstraňování potahu představuje speciální, komplikovaný krok celého procesu. Po odstranění potahu jsou kapiláry mechanicky velmi křehké a povrch kapilár je citlivý na nečistoty a poškrábání. Malé, zbývající polyimidové částice mohou způsobovat nárůst velkých hodnot rozptylu světla a fluorescence pozadí.

V dalším aspektu předkládané varianty vynálezu vedení ¹⁰ nemá potah, ale je obklopeno kapalinou nebo plynem. Tímto způsobem může být krok potahování zcela vypuštěn. V CE kapalina může nebo nemusí být jedním z elektrolytických roztoků. Vedením může být, například, nepotažený konec potažené kapiláry. Použitím plynu je dosaženo nejnižší možné 15 hodnoty Rl okolního materiálu. To umožňuje nejúčinnější snímání světla prostřednictvím TIR a použití nej širšího rozsahu materiálů pro vedení.

V dalším provedení předkládaného vynálezu je Rl uvedeného média větší než Rl vedení, takže TIR probíhá na hranici mezi médiem a vedením. Tato hranice musí mít dobrou optickou kvalitu. Navíc TIR může nebo nemusí probíhat na hranici mezi vedením a materiálem obklopujícím vedení. První případ je analogický výše popisovanému provedení. V druhém případě by obklopující materiál měl být absorpční a/nebo by 25 měl mít vyšší Rl než vedení. Toto provedení umožňuje použití dalších kombinací materiálů pro vedení a médium. Příklad tohoto provedení je znázorněn na obr. 2, kde fluorescenční světlo emitované z ozařovací zóny 3 je vedeno skrz médium 2.

ke konci 4 pro snímání světla.

¹⁹ · 9 9 9 9 9 1 ’ · * 9 9 9 9999 · · « ¹ · 9 9 9 9 · <

·· ·»·9 99 9 99

V jedné variantě tohoto provedení je hlavní složkou média voda a vedení je vyrobeno z organického polymeru, výhodně fluoropolymeru nebo silikonpolymeru. Tato varianta umožňuje použití jednoduchého, levného polymerického trubkoví. Protože vedení v tomto případě nevede světlo, vnější tvar a rozměry vedení nejsou v centru pozornosti. Vedením může být, například, kanálek v kusu polymerického materiálu.

V další variantě tohoto provedení je hlavní složkou média organická kapalina a vedení je vyrobeno z anorganického materiálu, výhodně ze skla, taveného křemenu, nebo křemenu. Tato varianta umožňuje použití velkého rozsahu různých médií pouze s tím omezením, že RI je větší než RI vedení. Jednou takovou myslitelnou kombinací je dimetylsulfoxid v kapiláře z taveného křemenu.

V jednom provedení vynálezu má vedení tvar dutého válce. Tento tvar je výhodný pro účinný přenos světla prostřednictvím TIR. Analogicky jako u optických vláken může být světlo přenášeno na dlouhé vzdálenosti ve válcových světelných vedeních. Válcové uspořádání je velmi běžným případem; vedením může být, například, kruhová CE kapilára,

LC sloupec, nebo kus LC nebo FIA trubkoví. Navíc je v praxi jednoduché zkonstruovat systémy s válcovými světelnými vedeními.

Pro toto provedení je možné přímo vypočítat účinnost snímání světla zařízení. Rovnice pro numerickou aperturu (N.A.) optických vláken je:

2, 0,5 ,n„ _ ^z v ^coating '

N.A.

• · · • «««· • » • ♦ • ♦ ► ·*·«

Tak lze například zjistit, že jiné hodnoty N.A. mohou být získány pro jiné kombinace materiálů, kde například pro světelné vedení s Rl jádra o hodnotě 1,36 (například pufr nebo hydrogel na bázi vody) a Rl potahu o hodnotě 1,31 (například fluoropolymer) je N.A. 0,37, což odpovídá optickému vláknu s velkou N.A. Zjevně může tedy zařízení podle vynálezu poskytovat odpovídající účinnost snímání světla. Navíc taková hodnota N.A. je kompatibilní s běžnou snímací optikou, jako například kondenzátorovými čočkami.

Snímací optika se stejnou nebo větší N.A. byla uváděna v některých ortogonálních a souohniskových nastaveních. Světlo, opouštějící válcovou křemíkovou kapiláru skrz válcový vnější povrch, se ale bude značně rozbíhat při průchodu rozhraní křemík/vzduch, takže skutečná účinnost snímání světla u takových systémů může být podstatně nižší.

Ve výhodné variantě tohoto provedení je vnitřní průměr válce menší než nebo roven 500 pm, nebo je obzvláště výhodně menší než nebo roven 100 pm. To je případ, například, kapilárních sloupců a kapilárního trubkoví pro mikro-LC a pro

CE. Předkládaný vynález poskytuje tedy prostředek pro účinné snímání, vedení a detekci světla dokonce i pro trubkoví s velmi úzkým vrtáním.

V jednom provedení vynálezu je světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, spektrálně rozloženo.

Spektrální rozložení zlepšuje univerzálnost a selektivitu zařízení. Výhodně je spektrální rozložení provedeno prostřednictvím jednoho nebo několika hranolů, mřížek nebo optických filtrů. Může být výhodné nejprve snímat a kolimovat světlo opouštějící světlo vedoucí konstrukci prostřednictvím 30 zaostřovací optiky. Primární světlo může být odblokováno, • · · · · » · • · · · »«*·· • · · * · · • ♦ • · » • · · ·· ·*« například, interferenčními filtry nebo dolními propustmi. Příklad takového provedení je znázorněn na obr. 3, kde světlo, vystupující z kapiláry 5., je snímáno čočkou 6 a spektrálně rozloženo hranolem Ί_ před zaostřením druhou čočkou

6 na světelný detektor 8L

V jednom provedení vynálezu světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, je detekováno prostřednictvím detektoru obrazu světla, výhodně CTD nebo pole fotodiod.

Tento obrazový detektor sestává z několika obrazových prvků detektoru a je schopen poskytnout obraz geometrického rozložení světla. Použitím takového detektoru může být získán obraz světla opouštějícího světlo vedoucí konstrukci v různých polohách a úhlech. To může být výhodné v některých případech, například, pro vyloučení rušivého světla nebo při 15 použití množství světlo vedoucích konstrukcí.

V jednom provedení vynálezu je světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, prostorově rozloženo, výhodně prostřednictvím použití apertury nebo prostřednictvím vyloučení části detekovaného obrazu. Apertura je běžně používána při fotografování nebo v mikroskopii pro provádění prostorově rozložené detekce světla. Obrazový detektor může provádět stejnou úlohu: pouze ty obrazové prvky, které obsahují požadovanou informaci, jsou čteny nebo ukládány do paměti, zatímco signál z ostatních obrazových prvků je 25 vyloučen. Samozřejmě, že prostorové rozlišení může být rovněž prováděno prostřednictvím selekce vhodné velikosti a umístění ne-obrazového detektoru (jako je například jedna fotodioda), ale to může být často shledáno nepraktickým.

3Q Příklad výhodného ovlivňování tohoto provedení je ilustrován prostřednictvím výpočtu postupu paprsků, který je • · • ♦ · • · · ·· ·»»· • · · « i ’ϊ • ··«« φφφ φ • ♦ · · φ ♦ ·· ·· znázorněn diagramem na obr. 4. Výpočet je proveden pro válcové vedení s vnějším průměrem 375 pm, vnitřním průměrem 100 pm, RI 1,46, které je naplněno médiem s RI 1,36 ve vnitřním kanálku, a které je obklopeno vzduchem. Na obr. 4a je znázorněn diagram výpočtu postupu paprsků, provedeného pro množství světelných paprsků vystupujících ze středu konstrukce, což je případ emitování fluorescenčního světla ve vnitřním kanálku. Tento obrázek, ilustrující průřez kapiláry, znázorňuje rozložení dovnitř odražených světelných paprsků uvnitř kapiláry v určité vzdálenosti od ozařovací zóny.

Paprsky postupují převážně v blízkosti středu kapiláry a intenzita světla je zejména vysoká uvnitř gelem naplněného, vnitřního kanálku. Obr. 4b znázorňuje diagram stejného výpočtu pro množství paprsků vystupujících z místa v blízkosti vnějšího povrchu konstrukce, což případ rušivého (rozptýleného) primárního světla dopadajícího na vnější povrch. Paprsky postupují převážně v blízkosti obvodu kapiláry. Zobrazením konce konstrukce na obrazovém detektoru a selekcí pouze těch obrazových prvků, které pokrývají středovou oblast, může být rozptýlené rušivé světlo do značné míry vyloučeno, zatímco současně se velmi účinně snímá fluorescenční světlo. Zjevně tedy předkládaný vynález poskytuje prostředek pro účinné oddělení rušivého světla, vystupujícího z oblastí vně média, od fluorescenčního světla, vystupujícího z vnitřku média, prostřednictvím prostorového rozlišení s použitím nastavení uvedeného v příkladu nebo jednoho z množství jiných nastavení.

V jednom provedení vynálezu je excitačním světlem světlo z laseru. Lasery mají tu výhodu, že mají vysokou intenzitu světla a zároveň dobře definované excitační vlnové • » • 4 4

944 94 4

4 4

44 «· *

• ·

4949 délky. Navíc může být laserové světlo snadno zaostřeno na velmi malé rozměry, což je výhodné ve spojení s úzkými kapilárami. Pro účely předkládaného vynálezu poskytuje vysoce kolimované světlo z laseru ještě speciální výhodu: geometrie ozařování může být snadno řízena a množství primárního světla ve vazbě se světelným vedením prostřednictvím TIR může být udržováno velmi malé.

V jednom provedení vynálezu je excitační světlo zaostřeno ve směru paralelním se směrem vedení emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené světlo vedoucí konstrukce. Výhodně by šířka excitačního paprsku (v uvedeném směru) měla být menší než 500 pm a zvláště výhodně by měla být menší než 200 pm. Například pro diskrétní kapiláru je světlo zaostřeno v axiálním směru, což je stejný směr, kterým 15 je světlo vedeno. Ve většině případů tento směr splývá se směrem přenosu vzorku ve vedení. Je důležitá malá axiální excitační délka a malý excitační objem, například v CE, kde účinnost separace je vysoká a analytická pásma jsou velmi úzká. Navíc excitační světlo může nebo nemusí být zaostřeno

0 ve dvou směrech prostřednictvím běžné, kruhové čočky. Pro množství kapilár a jiných konstrukcí může být světlo zaostřeno pouze v jednom směru (řádkové zaostření) prostřednictvím válcové čočky. Příklad tohoto provedení je znázorněn na obr. 5, kde je excitační světlo zaostřeno 25 prostřednictvím čočky 9 před dosažením kapiláry 5. Obousměrná šipka znázorňuje směr, ve kterém je světlo vedeno v kapiláře.

V jednom provedení vynálezu je úhel mezi směrem šíření excitačního světla a směrem vedení emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené světlo vedoucí ³⁰ konstrukce dostatečně velký, výhodně ortogonální nebo téměř • · · 9 9 • · 999« 9 9 • 9 • 9 •· ·*·· ortogonální, pro zabránění tomu, aby jakákoliv ne-rozptýlená složka excitačního světla byla opticky spřažena do směru vedení světlo vedoucí konstrukce prostřednictvím úplného odrazu. Aby se udržela úroveň rušivého rozptýleného světla nízká, mělo by být množství primárního, excitačního světla spřaženého do světelného vedení prostřednictvím TIR udržováno tak nízko, jak jen je možné. Zjevnou cestou pro dosažení tohoto úkolu je udržení úhlu a pro excitační světlo na tak malé hodnotě, jak jen je možné, což odpovídá ortogonálnímu nebo téměř ortogonálnímu ozařování. Pro dobře kolimovaný paprsek a nízký úhel a je možné (při ignorování rozptylu světla) udržet množství primárního světla spřaženého prostřednictvím TIR na extrémně nízké hodnotě.

V jednom provedení vynálezu je množství uvedených konstrukcí uspořádáno ve formě pole, výhodně rovinného nebo téměř rovinného pole, v ozařovací zóně. To může být případ, například multiplexované CE. Protože světlo je vedeno prostřednictvím TIR uvnitř každé samostatné konstrukce, je předkládaný vynález velmi vhodný pro detekci pole.

0

Předkládaný vynález má několik výhod, pokud se týká takové multiplexované detekce, jak ostatně bude diskutováno níže. Příklad takového provedení lze nalézt na obr. 6, kde je množství kapilár £ uspořádáno ve formě rovinného pole, jak je znázorněno v různých pohledech.

V jedné variantě tohoto provedení je excitační světlo prostorově rozloženo přes uvedené pole. Tato varianta je obzvláště výhodná ve spojení s rovinnými poli. Směr excitačního světla je ortogonální nebo téměř ortogonální vzhledem k rovinnému poli. Světlo je geometricky rozloženo ³⁰ přes pole, výhodně prostřednictvím jedné nebo několika čoček, • φ ·· φφφφ ·· · • · · φ φ φ • · · φφφφ » φ φ • · φ φ φ ·· · φφ rozšiřovače paprsku nebo ohybového tvarovače paprsku. Světlo může nebo nemusí být zaostřeno ve směru ortogonálním vzhledem ke směru rozložení, například prostřednictvím válcové čočky. Tato geometrie ozařování poskytuje velmi jednoduché a čisté ozáření: excitační světlo prochází skrz velmi málo optických povrchů, což má za následek malé množství rozptylového nebo rušivého světla. Naproti tomu excitační světlo, postupující v rovině rovinného pole, bude dopadat na množství konstrukcí postupným způsobem a bude procházet mnoha optickými povrchy, což způsobuje nárůst velkého množství rozptylového čí rušivého světla. Navíc, přestože laserové paprsky mohou být úzce zaostřeny, laserové paprsky jsou rozbíhavé. Čím úžeji je laserový paprsek zaostřen, tím rozbíhavějším se stává. Aby se udržela axiální excitační délka nebo excitační objem malý, je podstatné udržet interakční délku mezi paprskem a množstvím konstrukcí malou. To je dosaženo, když je excitační délka ortogonální nebo téměř ortogonální vzhledem k rovinnému poli, ale ne když paprsek dopadá na množství konstrukcí postupným způsobem. Příklad této varianty je znázorněn na obr. 7, kde světlo z laseru 10 je prostorově rozloženo do dvou rozměrů prostřednictvím rozšiřovače 11 paprsku a zaostřeno do jednoho rozměru prostřednictvím válcové čočky 12 před dosažením rovinného pole kapilár 5.. Vyšrafované oblasti znázorňují přibližný rozsah laserového paprsku z různých pohledů.

5

V další variantě tohoto provedení je excitační světlo skenováno přes uvedené pole. Opět může být směr excitačního světla ortogonální nebo téměř ortogonální vzhledem k rovinnému poli. Tímto způsobem je excitační světlo síleno mezi různými konstrukcemi v čase spíše než aby bylo sdíleno v prostoru. Světlo je výhodně zaostřeno ve dvou směrech φ φ • · · * φ φ •Φ φφφφ • φ φ φ • φ φφφφ • φ φ φφ · • · φ • φ φ • · φ ·· φφφ prostřednictvím jedné nebo několika běžných, kruhových čoček. Bud' může být skenován světelný paprsek, nebo může být skenováno pole. Jednou alternativou je umístit množství konstrukcí v kruhovém poli a otáčet optiku uvnitř tohoto pole. Tato varianta má stejné výhody jako předcházející varianta. Je rovněž možné použít kombinace těchto dvou variant, například skenovací systém v kombinaci s ohybovým děličem paprsku.

V jednom provedení vynálezu konce pro snímání světla θ uvedeného pole, výhodně rovinného nebo téměř rovinného, konstrukcí jsou geometricky přeuspořádány tím způsobem, že je to výhodné pro účinné snímání světla, výhodně ve formě dvojrozměrného pole. Základní optická omezení limitují účinné snímání světla z rozšířeného rovinného pole, například, konců ,

kapilár. Čočky s vysokou numerickou aperturou snímají vysoce účinně z lokalizované oblasti; čočky s nízkou numerickou aperturou mají menší účinnost snímání, ale širší záběr pohledu. Prostřednictvím přeuspořádání konců konstrukcí, například kapilár, do mnohem kompaktnější formy, například θ čtvercového, obdélníkového, nebo jiného mnohostranného pole, se stává možným snímat světlo z většího počtu konstrukcí s vysokou účinností. Jako příklad může být uvedeno, že hustě uspořádané rovinné pole se 100 CE kapilárami s vnějším průměrem 0,5 mm je široké 50 mm a způsobuje potíže, pokud se týká snímání světla. Na druhou stranu, pokud jsou konce kapilár přeuspořádány do hustě uspořádaného čtvercového pole, jeho největší rozměr bude potom pouze 5 mm, což usnadňuje podstatně účinné snímání světla. Prostřednictvím využití principů pro vedení světla podle předkládaného vynálezu je θ možné přeuspořádat geometrické nastavení množství konstrukcí • » · • ···· • · · ·· · ·· ··· • * • · * • 9 ·♦·· mezi ozařovací zónou a konci pro snímání světla. Množství kapilár, například z taveného křemene, může být snadno přeuspořádáno z rovinného pole na čtvercové pole na vzdálenosti několika centimetrů prostřednictvím mírného ohnutí kapilár. Takové mírné ohnutí podstatně neovlivní schopnost kapilár vést světlo. Uspořádání množství konstrukcí do dvojrozměrného pole již v ozařovací zóně způsobí problémy, pokud se týká zaostření laserových paprsků na prodloužené vzdálenosti a pokud se týká rozptylu světla, způsobeného excitačním světlem dopadajícím na mnoho optických povrchu, jak bylo diskutováno výše. Příklad tohoto provedení je znázorněn na obr. 8, kde je množství kapilár 5. uspořádáno v rovinném poli v ozařovací zóně 3., ale přeuspořádáno do čtvercového pole na koncích 4, pro snímání světla.

Je možné uvést, že husté uspořádání mnoha kapilar obecně způsobuje rozšíření pásma v důsledku neúčinné disipace Jouleova tepla spojeného se separacemi v CE. V předkládaném případě jsou ale kapiláry hustě uspořádány pouze za místem excitace, takže Jouleovo teplo neovlivní účinnost měřené separace.

V jedné variantě tohoto provedení je uvedené dvojrozměrné pole hustě uspořádáno a snímané světlo je spektrálně rozloženo prostřednictvím jednoho nebo několika optických filtrů. Pokud je hustě uspořádané dvojrozměrné pole zobrazeno na povrch obrazového detektoru, může obraz zaujímat značnou kontinuální plochu na povrchu a nemusí zde zůstat dostatek prostoru na povrchu pro disperzí vlnových délek jednotlivých konstrukcí v jednom rozměru prostřednictvím, například hranolu nebo mřížky. V tomto případě můře být spektrální rozložení získáno prostřednictvím jednoho nebo

4

4444 ·

• 4 · i · Í Í • · 4444 44 · • · 4 4 4 ·· 4 44

444 několika filtrů, například jedné nebo několika horních či dolních propustí nebo interferenčních filtrů. Filtry mohou být uspořádány, například jako sled filtrů [Kheterpal, I. a kol., Electrophoresis, 1996, 17, 1852-59] nebo na otáčejícím se filtračním kole. Příklad této varianty je znázorněn na obr. 9. Obr. 9a ilustruje množství kapilár 5, které jsou hustě uspořádány. Obr. 9b ilustruje světlo z kapilár 5, snímané čočkou 6, a vedené skrz filtr 13 na otočném filtračním kole před zobrazením na detektoru 8., Obr. 9c znázorňuje obraz pole kapilár na detektoru v jednom definovaném okamžiku.

V další variantě tohoto provedení je uvedené dvojrozměrné pole dostatečně řídké pro umožnění, aby snímané světlo bylo spektrálně rozloženo na povrchu obrazového detektoru prostřednictvím jednoho nebo několika hranolů nebo 15 mřížek. Obraz na povrchu obrazového detektoru se stava dostatečně řídkým, takže je zde prostor v obrazu jednotlivých konstrukcí pro spektrální rozlišení v jednom směru. Příklad této varianty je znázorněn na obr. 10. Obr. 10a ilustruje množství kapilár 5., které jsou řídce uspořádány. Obr. 10b

0 znázorňuje světlo z kapilár, snímané čočkou 6. a vedene skrz hranol 1 před zobrazením na detektoru 8.. Obr. 10c ilustruje spektrálně rozložený obraz pole kapilár na detektoru. Kruhové obrazy jednotlivých kapilár jsou roztaženy v důsledku zobrazení různých barev na různých místech na detektoru.

²⁵

V jednom provedení vynálezu, využívajícím množství uvedených konstrukcí, mohou být jednotlivé konstrukce identifikovány spřažením světla prostřednictvím úplného odrazu do konstrukcí v nějakém bodě jiném, než je konec pro snímání světla, a snímáním světla z konců pro snímání světla 30 uvedených konstrukcí. Pokud například je velké množství CE • · • · • · ·· *

···♦ «·· kapilár uspořádáno dohromady do svazku a zobrazeno na konci pro snímání světla, může být obtížné identifikovat, který injekční konec přísluší ke specifickému zobrazenému konci pro snímání světla. Prostřednictvím nasvícení světla, například ze svítící diody (LED), na každou kapiláru v určitém okamžiku na injekčním konci, ponechání tohoto světla, aby bylo vedeno ke konci pro snímání světla prostřednictvím TIR, a monitorování obrazu na detektoru může být tento problém vyřešen. Stává se tedy možným uspořádat do svazku velký počet kapilár dohromady ne-systematickým a náhodným způsobem a identifikovat jednotlivé kapiláry následně potom.

Navíc k tomu, co bylo vysvětleno výše, je zcela zřejmé, že zařízení podle předkládaného vynálezu ve srovnání s sloupcovým ortogonálním optickým nastavením poskytuje jednoduchý a účinný prostředek pro dosažení vysoké účinnosti snímání světla a pro separaci primárního světla a rušivého rozptylového světla od emitovaného fluorescenčního světla, zejména ve spojení s multiplexovanou detekcí. Ve srovnání se souohniskovým mikroskopem není ohnisková vzdálenost kritická

0 a tak je podstatně vyšší robustnost s ohledem na mechanické tolerance, optické vyrovnání a, například, vibrace. Pro multiplexovanou detekci nejsou potřebné žádné pohybující se části pro předkládaný vynález. Ve srovnání s plášťovou průtokovou kyvetou předkládaný vynález neukládá tak vysoké požadavky na propracovanost řešeni, řízení a tolerance průtokového systému, a tak nabízí podstatně vyšší stupeň robustnosti. Navíc toto zařízení podle předkládaného vynálezu nabízí jednoduché řešení problému ozařování množství kapilár.

Úplně odražené světlo může být v principu odpojeno od konstrukce skrz její obvod prostřednictvím vnějšího optického • 9 *· 9999

999 • · · * * 9 • · 9 9999 <9 φ • 9 · 9 9 ·· 9 .· odváděče a snímáno před dosažením konce konstrukce. Takovým odváděčem může být například optické vlákno připojené na konstrukci. Takové odpojení nebo odvedení má ale několik nevýhod. Konstrukce nesmí být potažena nebo potah musí být odstraněn v místě odvádění. RI média nesmí být vyšší, než je RI vedení. Optické odvedení neposkytuje jakýkoliv prostředek pro vyloučení rušivého rozptýleného světla, podobně jako například plášťová průtoková kyveta a souohniskový mikroskop. Protože prostorová informace je ztraceno při odvedení, je vyloučení rušivého rozptylového světla nemožné prostřednictvím prostorového rozlišení. Navíc, protože rušivé rozptylové světlo může postupovat převážně v blízkosti obvodu konstrukce a fluorescenční světlo převážně v blízkosti středu, může odvádění skrz obvod konstrukce vést na zvýšení množství rušivého rozptylového světla. Navíc také optické vyrovnání velkého počtu odváděčů s množství konstrukcí s sebou přináší obrovské množství práce a odváděče mohou zabírat značné množství prostoru, což způsobuje, že oto uspořádání je méně vhodné pro multiplexovanou detekci.

0

Existuje několik aplikací zařízení podle předkládaného vynálezu. Bude uvedeno pár příkladů, ale využitelnost není omezena pouze na tyto příklady a další aplikace budou zcela zřejmé pro osoby v oboru znalé. Zařízení může být použito pro detekci složek s přirozenou fluorescencí 2 5 a rovněž složek označených jedním nebo několika fluorofory. Přirozená fluorescence v UV oblasti je vykazována, například, aminokyselinami tryptofan a tyrosin. Označování se dvěma fluorofory může odkazovat například na použití fluoroforů s přenosem energie, s jedním dárcovským a jedním přijímacím fluoforem [Ju, J. a kol., Nátuře Medicíně 1996, 2, 246-49].

• 4

Zařízení může být použito pro detekci ve spojení s jakoukoliv metodou zahrnující přenos uvedených složek přes ozařovací zónu uvnitř uvedeného vedení. Takové metody jsou zcela běžné při chemické a biochemické analýze. Vzorek může být, například, přenášen uvnitř délky kapilárního trubkoví prostřednictvím tlaku, elektroosmotického proudění, nebo migrace v elektrickém poli. Zařízení může být, například, použito pro detekci ve spojení s kapilární elektroforézou, včetně kapilární zónové elektroforézy, kapilární gelové elektroforézy, micelární elektrokinetické kapilární chromatografie a kapilárního izoelektrického zaostřování, kapilární elektrochromatografie, kapalné chromatografie, nebo průtokové injekční analýzy. Zařízení může být použito pro detekci ve spojení s analýzou nukleových kyselin, například ve spojení se sekvenční analýzou DNA. Jednou obzvláště zajímavou aplikací je vysokokapacitní sekvenční analýza DNA prostřednictvím CE v polích kapilár.

Způsob podle vynálezu bude v následujícím popisu ilustrován prostřednictvím neomezujících příkladů.

PŘÍKLADY

Zařízení, použité v příkladech, je znázorněno na obr. 11. Ve všech příkladech byly použity fluoropolymerem potažené válcové kapiláry 14 z taveného křemenu s vnitřním průměrem 100 pm a s vnějším průměrem 375 pm (TSU100375, Polymicro, Phoenix, Arizona, USA). Injekční konec kapiláry byl uložen do kapalinou naplněné komory 15. Světlo z argonového iontového laseru 16 (2013-150ML, Uniphase, San Jose, California, USA) , vyzařujícím převážně na 488 a 514 nm, bylo zaostřeno Čočkou 17 a ozařovalo kapiláru pod úhlem 90°. Energie laseru, dopadající na kapiláru, byla odhadnuta na přibližně 3 mW.

Polymerický potah nebyl odstraněn v ozařovací zóně. Axiální ozařovací délka laseru v kapiláře byla odhadnuta na 25 pm a detekční objem byl tedy odhadnut na 0,2 nl. Světlo bylo vedeno přibližně 5 cm ke konci kapiláry, který byl umístěn do kapalinou naplněné komory 18. Světlo vystupující z konce kapiláry bylo snímáno na konci prostřednictvím kondenzátorové čočky 19 (063098, Spindler & Hoyer, Gottingen, Germany). Primární světlo bylo odfiltrováno jednou nebo dvěma skleněnými dolními propustmi 20 (OG 530, Schott Glaswerke, Mainz, Germany). Světlo bylo snímáno prostřednictvím 50mm objektivu 21 kamery (Series E 1/1.8, Nikon, Tokyo, Japan) na povrch CCD 22 (TE/CCD-1024-TKB/1, Princeton Instruments, Trenton, New Jersey, USA). V některých experimentech byl mezi skleněný filtr (dolní propust) a objektiv kamery (fotografického přístroje) vložen hranol 23 (336675, Spindler & Hoyer) pro dosažení spektrálního rozložení. Snímané obrazy byly ukládány a vyhodnocovány prostřednictvím softwaru WinView (Princeton Instruments) a PC kompatibilním s IBM.

Příklad 1

V tomto příkladu byl z optického nastavení vypuštěn hranol 23 a snímané světlo nebylo spektrálně rozloženo. Nejprve byla voda čerpána kontinuálně skrz kapiláru po dobu několika minut prostřednictvím tlakovaného vzduchu. Potom 0,7 nM roztok fluoresceinu (16630-8, Aldrich, St. Louis,

Missouri, USA) ve vodě byl čerpán stejným způsobem. Doba expozice fotografického přístroje (kamery) byla 1 s. Zaznamenaná stopa je znázorněna na obr. 12. Získaný signál byl vypočítán jako rozdíl mezi počtem pulzů, sečtených na množství obrazových prvků, pro fluorescein a vodu. Šum byl vypočítán jako standardní odchylka cd vodního základu.

φ

Detekční limit koncentrace (braný jako 3x šumu) byl 2,7 pM a detekční limit hmoty byl 550 ymolů. Příklad ilustruje účinné snímání a detekci fluorescenčního světla a demonstruje vynikající detekční limit získaný se zařízením.

Na obr. 13 jsou znázorněny obrazy konce kapiláry.

Obr. 13a znázorňuje obraz pro čistou vodu. Hlavním znakem je kruh světla v blízkosti obvodu sloupce v důsledku rozptylu světla na vnějším povrchu. Obr. 13b znázorňuje obraz pro fluorescein. Hlavním znakem je přibližně Gaussův vrchol v průběhu světla ve středu sloupce v důsledku emise fluorescenčního světla. Tento vrchol je superponován na pozadí ve tvaru kruhu. Zjevně je, pouze čtením obrazových bodů v blízkosti středu možné, vyloučit rušivé rozptylové světlo prostřednictvím prostorové filtrace.

Příklad 2

V tomto příkladu byl použit hranol 23. Sloupec byl naplněně hydrogelem (póly(dimetylakrylamid), 7% T, 4% C) s křížovou vazbou. Délka kapiláry od injekčního konce k ozařovací zóně byla přibližně 30 cm. Kapalinové komory byly naplněny pufrem sestávajícím z o,l M Tris, 0,1 M boritanu, 2 mM EDTA, a 7 M močoviny. 0,084 nM roztok fluoresceinu (F-1130, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA) ve vodě bylo elektrokineticky injektováno při 4 kV p dobu 20 sekund a podrobeno elektroforéze při 5 kV. Doba expozice byla 0,6 s. Obr. 14 znázorňuje část elektroferogramu. Detekční limit koncentrace pro vrchol fluoresceinu byl 70 fM. Tento příklad opět demonstruje vynikající schopnost detekce zařízení.

Příklad 3 • · · · · · · » · • · · · · · ·»»· · « · • · · ··· « · ·· ···· ·· · *» »· ·

Bylo použito stejné optické nastavení, sloupce a podmínek elektroforézy, jako v předcházejícím příkladu. Vzorkem byl vzorek DNA pro cyklickou sekvenční analýzu, vysrážený v etanolu a rozpuštěný ve vodě. Příměry byly označeny čtyřmi různými fluorofory (FAM, JOE, TAMRA, ROX) (Genpak, Brighton, UK) a drženy pohromadě před analýzou. Jednotlivé obrazové prvky CCD-čipu byly sloučeny dohromady do větších obrazových prvků. Spektrum každého datového bodu bylo zaznamenáváno jako spektrum deseti těchto větších obrazových bodů v přibližné oblasti 520 až 670 nm. Kalibrace vlnových délek byla prováděna nasvícením světla ze svítících diod (LED) se známou vlnovou délkou na injekční konec a zaznamenáním získaného spektra. Sekvence byla vyhodnocena prostřednictvím identifikace počtu čistých vrcholů každé báze od známé sekvence a použitím spektra těchto vrcholů jako reprezentativního spektra čistých bází. Potom bylo vypočítáno bázová skladba zbytku elektroferogramu prostřednictvím matematického přepočtu těchto kalibračních spekter na každý z datových bodů. Obr. 15 znázorňuje takto získanou bázovou sekvenci. Přesnost řazení bází je odhadnuta na 96 až 98 % v oblasti 40 až 450 bází. Příklad ilustruje vynikající schopnost detekce, zanedbatelné přispění k rozšíření detekčního pásma, a schopnost rozlišení vlnových délek zařízení podle vynálezu, a zjevně demonstruje použitelnost pro sekvenční analýzu DNA.

Předkládaný vynález samozřejmě není omezen na aspekty, provedení a varianty specificky popsané výše, nebo na specifické příklady, ale aniž by byl opuštěn obecný vynálezecký koncept, který je definován připojenými nároky, lze provést množství změn a modifikací vynálezu.

Claims (9)

1. Zařízení pro detekci jedné nebo několika fluorescenčních složek, kde uvedené složky jsou obsaženy v médiu, přičemž toto médium je obsaženo ve vedení, uvedené zařízení zahrnuje prostředek pro excitování fluorescenčních složek světlem v ozařovací zóně a prostředek pro snímání a detekcí fluorescenčního světla emitovaného uvedenými fluorescenčními složkami, uvedené médium a vedení tvoří konstrukci, která je transparentní pro excitační a fluorescenční světlo emitované uvedenými fluorescenčními složkami, a uvedené zařízení zahrnuje několik takových konstrukcí, vyznačující se tím, že uvedené vedení je vyrobeno z taveného křemene, křemene nebo organického polymeru, přičemž toto vedení má vnější potah z organického polymeru, který má index lomu menší, než je index lomu taveného křemene, křemene nebo organického polymeru, a tento potah je transparentní pro excitační světlo, takže alespoň část emitovaného fluorescenčního světla je vedena od ozařovací zóny prostřednictvím úplného odrazu v uvedených konstrukcích a snímána z jednoho konce uvedených konstrukcí.

2. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené vedení je vyrobeno z taveného křemene a má potah z fluoropolymeru.

3. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že hlavním komponentem uvedeného média je voda a že uvedené vedení je vyrobeno z organického polymeru.

4. Zařízení podle nároku 3, vyznačující se tím, že organickým polymerem je fluoropolymer nebo silikonpolymer.

• * » · 4 4 4 4 4 • · 44 4*44*44 4 4 • 4 4*4 444 • 4 4444 44 4 44 44

5. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že hlavním komponentem uvedeného média je organická kapalina, a uvedené vedení je vyrobena ze skla, taveného křemene nebo křemene.

6. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že 5 množství uvedených konstrukcí je uspořádáno ve formě rovinného pole v ozařovací zóně.

7. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, že excitační světlo je prostorově rozloženo přes uvedené pole ^0 prostřednictvím jedné nebo několika čoček, rozšiřovače paprsku, nebo ohybového tvarovače paprsku.

8. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, že excitační světlo je skenováno přes uvedené pole.

. _c 9. Zařízení podle nároku 6, vyznačující se tím, že konce 15 pro snímání světla uvedeného pole jsou geometricky přeuspořádány ve formě dvojrozměrného pole.

10. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že světlo, které je snímáno z konce uvedené konstrukce, je detekováno

20 prostřednictvím obrazového detektoru světla.

11. Zařízení podle nároku 10, vyznačující se tím, že obrazovým detektorem světla je zařízení s přenosem nábojů nebo pole fotodiod.

25 12. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje prostředek pro spektrální rozlišení světla, které je snímáno z konce uvedené konstrukce.

13. Zařízení podle nároku 12, vyznačující se tím, že prostředkem pro spektrální rozlišení je jeden nebo několik hranolů, mřížek nebo optických filtrů.

φ φ φ φφφφ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ • φ φφ ·♦·· φφφ

14. Zařízeni podle nároku 9, vyznačující se tím, že snímané světlo je spektrálně rozloženo prostřednictvím jednoho nebo několika optických filtrů.

15. Zařízení podle nároku 9, vyznačující se tím, že uvedené dvojrozměrné pole je dostatečně řídce uspořádané pro umožnění snímanému světlu, aby bylo spektrálně rozloženo na povrchu obrazového detektoru prostřednictvím jednoho nebo několika hranolů nebo mřížek.

16. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že navíc zahrnuje prostředek pro prostorové rozlišení světla, které je snímáno z konce uvedené konstrukce.

17. Zařízení podle nároku 16, vyznačující se tím, že světlo je prostorově rozloženo prostřednictvím použití apertury nebo 15 prostřednictvím vyloučeni části detekovaného obrazu.

18. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že excitační světlo je zaostřeno ve směru paralelním ke směru vedení emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené

2Q světlo vedoucí konstrukce.

19. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že excitační světlo je světlo z laseru.

20. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že úhel mezi směrem šíření excitačního světla a směrem vedení 25 emitovaného fluorescenčního světla podél uvedené světlo vedoucí konstrukce je ortogonální pro zabránění jakékoliv ne-rozpýlené ne-rušivé složce excitačního světla, aby byla opticky spřažena do směru vedení světlo vedoucí konstrukce prostřednictvím úplného odrazu.

• 9 9 9999 9 9 9 *9 999* 9999 9 9 · 9

999 · · · <99

99 999« 99 9 99 99

21. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a koncem pro snímání světla uvedené konstrukce je dostatečně velká pro umožnění světelným paprskům, vystupujícím z ozařovací zóny, které nesplňují

5 podmínky úplného odrazu, aby byly účinně přeneseny mimo světlo vedoucí část uvedené konstrukce před dosažením konce pro snímání světla.

22. Zařízení podle nároku 21, vyznačující se tím, že vzdálenost mezi ozařovací zónou a konce pro snímání světla uvedené konstrukce je alespoň čtyřikrát, alespoň osmkrát, nebo alespoň šestnáctkrát, větší než největší průřezový rozměr světlo vedoucí části uvedené konstrukce.

23. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené

5 vedení má tvar dutého válce.

24. Zařízení podle nároku 23, vyznačující se tím, že vnitřní průměr válce je menší než nebo roven 500 pm, nebo menší než nebo roven 100 pm.

25. Zařízení podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje prostředek pro identifikací jednotlivých konstrukcí prostřednictvím spřažení světla prostřednictvím úplného odrazu do konstrukcí v určitém místě jiném, než je konec pro snímání světla, a prostřednictvím snímání uvedeného světla z konců pro snímání světla uvedených konstrukcí.

26. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci složek s přirozenou fluorescencí nebo složek označených jedním nebo několika fluorofory.

• 9 9 · » » W * - V

9 9 9 «9 99·«··« 9 9

DT 999 999 99« □ i «9 9999 9· 9 99 99

27. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení s jakoukoliv metodou zahrnující přenos uvedených složek skrz ozařovací zónu uvnitř uvedeného vedení.

28. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení 5 s kapilární elektroforézou, včetně kapilární zónové elektroforézy, kapilární gelové elektroforézy, micelární elektrokinetické kapilární chromatografie a kapilárního izoelektrického zaostřování, kapilární elektrochromatografie, kapalné chromatografie, nebo průtokové injekční analýzy.

29. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení s analýzou nukleových kyselin.

30. Použití zařízení podle nároku 1 pro detekci ve spojení se sekvenční analýzou DNA.