CZ20013149A3

CZ20013149A3 - Léčivo proti chronické obstrukční pulmonární chorobě a způsob jeho výroby

Info

Publication number: CZ20013149A3
Application number: CZ20013149A
Authority: CZ
Inventors: Siegfried B. Christensen Iv.; Mary S. Barnette; Theodore J. Torphy
Original assignee: Smithkline Beecham Corporation
Priority date: 1999-03-01
Filing date: 2000-03-01
Publication date: 2002-04-17
Also published as: IL144992A0; KR20010102459A; AU3386900A; PL352816A1; MA25522A1; AP2001002248A0; ID29888A; AU772583B2; EP1156799A4; DZ3019A1; OA11842A; EA200100930A1; AR042369A1; ZA200107186B; CA2366036A1; BR0008603A; HK1043935A1; NO20014222L; SK12372001A3; HUP0200288A3

Description

Oblast techniky

Vynález se týká léčiva pro profylaxi nebo léčbu chronické obstrukční pulmonární choroby na bázi inhibitoru PDE 4, který má definovaný terapeutický poměr. Vynález se také týká způsobu výroby tohoto léčiva.

Tento vynález se týká sloučenin, které převážně inhibují nebo se váží na jednu formu isoenzymu fosfodiesterazy označovaného 4 (dále jen PDE 4), přičemž vykazují shodnou nebo výhodně nižší vazbu nebo inhibicí druhé formy enzymu a jsou tedy užitečné při léčbě chronické obstrukční pulmonární choroby. Tyto formy isoenzymu, přičemž se má za to, že jde o odlišné formy navzájem nepřeveditelných konformací stejného enzymu, ačkoliv to nebylo prokázáno, se liší svou vazebnou afinitou pro rolipram, což je archetypální inhibitor PDE 4. Rolipram se s vysokou afinitou váže na místo jedné formy, ale s nízkou na katalytické místo druhé formy. V tomto případě se jedna forma označuje jako vazebné místo pro rolipram s vysokou afinitou a druhá forma se identifikuje jako místo s nízkou vazebnou afinitou pro rolipram. Způsob selektivní léčby chronické obstrukční pulmonární choroby inhibicí převážně formy s nízkou afinitou katalytického místa isoenzymu PDE 4 je též popsán. Způsob léčby chronické obstrukční pulmonární choroby zahrnující podávání sloučeniny převážně se vážící na vazebné místo s nízkou afinitou je také popsán. Způsob selektivní léčby astmatu navozeného cvičením (EIA) inhibicí převážně formy s nízkou afinitou katalytického místa isoenzymu PDE 4 je rovněž popsán.

• · ··· ··· ♦ · · • · · · ·«·· ·· ····

- Ia Dosavadní stav techniky

Fosfodiesterázy cyklických nukleotidů (PDE) představují rodinu enzymů, které hydrolyzují všudypřítomného nitrobuněčného druhého posla, adenosin 3',5’-monofosfát

(CAMP) a guanosin 3'

-monofosfát (cGMP) na jejich odpovídající inaktivní 5'-monofosfátové metabolity. Má se za to, že existuje alespoň 9 rozličných tříd isoenzymů PDE, přičemž každá z nich má jedinečné fyzikální a kinetické charakteristiky a každá představuje produkt jiné rodiny genů. Jsou rozlišeny číslicemi od 1 do 9.

Cílový enzym v tomto vynálezu je isoenzym PDE 4 ve všech jeho různých formách a úplné doméně své distribuce ve všech buňkách. Je to cAMP selektivní enzym s nízkou hodnotou K_m (cAMP K_m = 1 až 5 μΜ) , který je jen velmi málo aktivní vůči cGMP (K_m větší než 100 μΜ). Příslušníci této třídy isoenzymů mají zajímavé charakteristiky v tom, že existují ve dvou nebo více vzájemně nepřeveditelných nebo pomalu převeditelných formách, které váží rolipram a jiné inhibitory PDE 4 v jiném řádu potencí. Produkt stejného genu tedy může existovat ve více než jednom katalyticky aktivním konformačním stavu. Je důležité, že relativní podíly různých vazebných forem se mohou lišit v závislosti na typu tkáňové buňky. Například zánětlivé buňky mohou obsahovat relativně velký podíl formy, která váže rolipram s nízkou afinitou, zatímco mozkové a parietální buňky mohou obsahovat relativně vysoký podíl formy, která váže rolipram s vysokou afinitou.

Obzvláštním zájmem tohoto vynálezu je role, kterou isoenzymy této třídy hrají při zánětu a v hladké svalovině dýchacích cest. Studie naznačují, že hraje prominentní roli při regulaci cAMP v široké škále buněk zánětu (tj. mastocytech, basofilech, eosinofilech, neutrofilech a monocytech) a hladké svalovině dýchacích cest. Předmět tohoto vynálezu je zvláště použitelný na buňky zánětu a hladké svalovině dýchacích cest, přičemž

- J - ·· · · ·· ·· » ·· • · · · · ·· • · · · » « · ··· • · · · *· ·· · φφ ··· ··♦ f ·· obzvláště jde o typ isoenzymu exprimovaný v lidských monocytech. Je tomu tak proto, že cyklický AMP slouží jako druhý posel k inhibici chemotaxe a aktivace buněk zánětu. Navíc cAMP zprostředkovává uvolnění hladké svaloviny dýchacích cest. Toto ve spojení s hlavní rolí PDE 4 při metabolizaci cAMP poskytuje základ pro zkoumání inhibitorů PDE 4: svou schopností zvýšit obsah cAMP v leukocytech a hladké svalovině dýchacích cest mohou inhibitory PDE 4 mít protizánětlivé a bronchodilatační účinky.

Inhibitory PDE v současnosti používané při léčbě zánětu a jako bronchodilatátory, léčiva jako theofylin a pentoxyfylin, inhibují isoenzymy PDE bez rozlišení ve všech tkáních. Tyto sloučeniny vykazují vedlejší účinky, zjevně v důsledku toho, že neselektivně inhibují všechny nebo většinu tříd isoenzymů PDE ve všech tkáních. To je třeba brát v potaz při hodnocení terapeutického profilu těchto sloučenin. Cílový chorobný stav může být takovými sloučeninami účinně léčen, ale mohou se objevit nežádoucí druhotné účinky, které, pokud by se jim dalo vyhnout nebo mohly být minimalizovány, by zvýšily celkový terapeutický účinek tohoto přístupu k léčbě jistých chorobných stavů. Bráno souhrnně tato informace naznačuje, že vedlejší účinky spojené s použitím standardních neselektivních inhibitorů PDE se mohou snížit cílením nových isoenzymově selektivních inhibitorů na PDE převažující v tkáni nebo buňce, o niž jde. Ačkoliv teoreticky isoenzymově selektivní inhibitory PDE by měly představovat zlepšení ve srovnání s neselektivními inhibitory, dosud testované selektivní inhibitory nejsou prosty vedlejších účinků vytvářených jako přesah inhibice příslušného isoenzymu v nepříhodné tkáni nebo ve tkáni, která není cílem. Například klinické studie se selektivním inhibitorem PDE rolipramem, který byl ; · ··<*·· «·· ·· ··· ··· β· ♦·· vyvinut jako antidepresivum, ukazují, že má psychotropni aktivitu a způsobuje gastrointestinální účinky, např.

pálení žáhy, nauzeu a zvracení. Existují náznaky, že vedlejší účinky denbufylinu, dalšího inhibitoru PDE 4 cíleného na léčbu demence navozené mnohočetnou infarzaci, mohou rovněž zahrnovat páleni žáhy, nauzeu a zvracení. U těchto vedlejších účinků se má za to, že se objevují v důsledku inhibice PDE 4 ve specifických oblastech centrální nervové soustavy a gastrointestinálniho systému.

t

V roce 1986 Schneider a kolektiv popsal přítomnost a charakteristiky vazebných stereoselektivních míst pro [³H]-rolipram s vysokou afinitou v homogenátech krysích mozků. Ačkoliv se mělo za to, že tato vazebná místa představují katalytické místo „na kalmodulinu nezávislé cAMP fosfodiesterázy (tj. PDE 4) krysího mozku, byla v datech zřejmá nápadná anomálie. Za podobných, i když nikoli shodných podmínek data ukázala, že rolipram má K_d = 1 nM, přičemž aktivitu PDE 4 krysího mozku inhiboval při hodnotě Κι = 1 μΜ. Byl zde tedy tisícinásobný rozdíl v afinitě rolipramu k vazebnému místu oproti jeho účinku na katalytickou aktivitu. Ačkoliv nebyly stanoveny všeobecné vztahy struktury a aktivity (SAR) inhibice PDE a kompetice o vazbu [³H]-rolipramu, zdálo se, že podstatný rozdíl v potenci rolipramu jako inhibitoru PDE 4 ve srovnání s jeho potencí na vazebném místě zpochybnil validitu předpokladu, že obě aktivity se odehrávají na stejném místě molekuly.

V důsledku této hádanky bylo zahájeno několik studií. Jedna z nich usilovala o stanovení toho, zda místo pro vazbu rolipramu s vysokou afinitou existuje na stejném proteinu jako katalytické místo cAMP. Další studie

5··· 4 ··· · ** · 4 4 « Λ · · · · ·4 4

44· · * 4 ®4

4 4 4» 4 » · » 44 · 4 · ··4 ·»· · 4 44 4 444 4 · ·»· usilovala ο stanovení, zda vztahy struktury a aktivity pro inhibici PDE 4 jsou či nejsou stejné jako vztahy struktury a aktivity pro kompetici s vazebným místem pro rolipram s vysokou afinitou. Třetí studie podnikla pokus o osvětlení biologického významu, pokud zde nějaký vůbec je, těchto zjištění, obzvláště pokud se může týkat vývoje nových lékových terapií.

Při shromažďování dat z několika stanovení bylo zřejmé, že na lidské monocytární rekombinantní PDE 4 (hPDE 4) existují alespoň dvě vazebné formy na něž se inhibitory váží. Jedním z vysvětlení těchto pozorování je, že hPDE 4 existuje ve dvou rozdílných formách. Jedna váže látky podobné rolipramu a denbufylinu s vysokou afinitou, zatímco druhá váže tyto sloučenin s nízkou afinitou. Na tomto místě se rozlišují tyto formy tím, že se označují jako forma vážící rolipram s vysokou afinitou (HPDE 4) a forma vážící rolipram s nízkou afinitou (LPDE 4).

Důležitost tohoto nálezu spočívá v odhalení, že sloučeniny, které mocně soutěží o formu vážící rolipram s vysokou afinitou (HPDE 4) mají více vedlejších účinků nebo silnější vedlejší účinky, než formy, které silněji soutěží o formu vážící rolipram s nízkou afinitou (LPDE 4). Další údaje ukazují, že sloučeniny lze zacílit na formu PDE 4 vážící rolipram s nízkou afinitou a že tato forma se liší od vazebné formy, k níž má rolipram vysokou vazebnou afinitu. Bylo zjištěno, že pro inhibitory působící na formu vážící rolipram s vysokou afinitou ve srovnání s inhibitory působícími na formu vážící rolipram s nízkou afinitou existují rozdílné vztahy struktury a aktivity. Navíc tyto dvě formy zdá se mají různé funkční role. Sloučeniny, které interagují s formou vážící rolipram s nízkou afinitou, tedy

- 6 • ·· · • 4 * · · · · • · · 4 • · 4 4 · · • · 4 · 4 44 4·· · zdá se máji protizánětlivou aktivitu, zatímco sloučeniny, které interagují s formou vážící rolipram s vysokou afinitou vyvolávají vedlejší účinky nebo tyto vedlejší

účinky silněji vykazují.

Pro tato zjištění neexistuje žádné jasné vysvětlení. Nicméně se navrhuje, že PDE 4 může existovat ve dvou rozdílných terciárních nebo kvarterních stavech. U obou forem se má za to, že jsou katalyticky aktivní. Rolipram se váže na jedno katalytické místo jedné formy s vysokou afinitou, která je zde definována jako afinita mající Ki nižší než 10 nM, a na druhou formu s nízkou afinitou, která je zde definována jako afinita mající Ki vyšší než 100 nM.

Užitečným důsledkem těchto zjištění je, že je nyní možné identifikovat sloučeniny, které převážně inhibují cAMP katalytickou aktivitu tam, kde enzym je formě, která váže rolipram s nízkou afinitou, čímž snižuji vedlejší účinky, které jsou zjevně spojeny s inhibici formy, která váže rolipram s vysokou afinitou.

Chronická obstrukční pulmonární choroba je střešní pojem často používaný k popisu dvou stavů trvalé choroby dýchacích cest - chronické bronchitidy a emfyzému. Chronická bronchitida a emfyzém jsou nejčastěji způsobeny kouřením, přibližně 90 % pacientů s chronickou obstrukční pulmonární chorobou jsou nebo byli kuřáci. Ačkoliv u přibližně 50 % kuřáků se vyvine chronická bronchitida, pouze u 15 % kuřáků se vyvine ochromující obstrukce dýchacích cest. Jistí další savci, obzvláště koně, také trpí chronickou obstrukční pulmonární chorobou.

- 7 Obstrukce dýchacích cest spojená s chronickou obstrukční pulmonární chorobou je progresivní, může být doprovázena hyperaktivitou dýchacích cest a může být částečně reversibilní. Nespecifická přehnaná odpověď dýchacích cest může také při vývoji chronické obstrukční pulmonární choroby hrát roli a může sloužit k predikci zrychlení zhoršování plicní funkce u kuřáků.

Chronická obstrukční pulmonární choroba je významnou příčinou smrti a invalidity. V současnosti je to čtvrtá nejčastější příčina úmrtí ve Spojených státech amerických a v Evropě. Návody k léčbě nabádají k časné detekci a k zavedení programů k přerušení kouření k nápomoci snížení morbidity a mortality v důsledku této choroby. Časná detekce a diagnóza jsou z mnoha důvodů obtížné.

Rozvoj chronické obstrukční pulmonární choroby trvá roky, přičemž kuřáci často jakýkoli škodlivý účinek kouření popírají, přisuzujíce časné varovné známky zvýšené dusnosti projevům stárnutí. Podobně nejsou akutní epizody bronchitidy často praktickým lékařem rozpoznány jako časné známky chronické obstrukční pulmonární choroby. Mnoho pacientů vykazuje znaky více než jedné choroby (např. chronické bronchitidy nebo astmatické bronchitidy), což činí přesnou diagnózu obtížnou, obzvláště v raném stadiu . Mnoho pacientů rovněž nevyhledává lékařskou pomoc dokud nejsou stiženi závažnějšími symptomy spojenými se sníženou plicní funkcí, jako je dyspnea, trvalý kašel a tvorba hlenu. V důsledku toho velká většina pacientů není diagnostikována nebo léčena dokud se nedostane do pokročilejšího stadia nemoci.

• ·· ····

Tento vynález tedy poskytuje lepší terapeutický index stran chronické obstrukční pulmonární choroby oproti vedlejším účinkům.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je použití inhibitoru specifického vůči PDE 4 pro výrobu léčiva pro profylaxi nebo léčbu chronické obstrukční pulmonární choroby, kde inhibitor má poměr hodnot IC^q okolo 0,1 nebo vyšší pokud jde o hodnotu IC₅₀ formy PDE 4, která váže R-rolipram s vysokou afinitou děleno IC₅₀ katalytické formy PDE 4, která váže R-rolipram s nízkou afinitou, s vyloučením cis-[4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylatu].

Předmětem tohoto vynálezu také je způsob výroby tohoto léčiva, jehož podstata spočívá v tom, že inhibitor má poměr hodnot IC5Q okolo 0,1 nebo vyšší pokud jde o poměr hodnoty IC₅₀ pro kompetici s vazbou 1 nM [³H]-R-rolipramu na formu PDE 4, která váže rolipram s vysokou afinitou vůči hodnotě IC_5Q pro inhibici katalytické aktivity formy PDE 4, která váže rolipram s nízkou afinitou za použití 1 M [³H]-cAMP jako substrátu.

Detailní popis vynálezu

Tento vynález umožňuje provádět způsob profylaxe nebo léčby chronické obstrukční pulmonární choroby, přičemž se minimalizují gastrointestinální nebo psychotropní účinky, kterýžto způsob zahrnuje podávání subjektu, který to potřebuje, účinného množství sloučeniny, která má poměr IC₅₀ okolo 0,1 nebo vyšší pokud jde o IC₅₀ katalytické formy PDE • ·

- 8a -

4, která váže rolipram s vysokou afinitou děleno IC₅₀ formy, která váže rolipram s nízkou afinitou.

Chronická obstrukční pulmonární choroba je charakterizována chronickým zánětlivým procesem v plicích, vyznačeným zvýšením aktivace a/nebo počtu alveolárních makrofágů, T-buněk CD8+ a neutrofilů. S ohledem na terapii chronické obstrukční pulmonární choroby je nejdůležitější schopnost postihnout transport a aktivaci neutrofilů. 0 neutrofilech se má za to, že v patofyziologii chronické obstrukční pulmonární choroby hrají ústřední roli. Aktivace neutrofilů vede k uvolnění četných mediátorů zánětu a proteináz, z nichž nejdůležitější je neutrofilní elastáza, která přispívá k progresivní fibróze, stenóze dýchacích cest a destrukci plicního parenchymu, což vede k urychlenému zhoršování funkce dýchacích cest. Neutrofilní elastáze je také mocným sekretagogem hlenu a může tedy přispívat k charakteristické hypersekreci hlenu, která charakterizuje chronickou obstrukční pulmonární chorobu.

- 9 • ·«·· · <· ♦ *'· · · • « · · · » · ··« ·· ·· · »·· ·» »··

Sloučeniny podle tohoto vynálezu mají výrazný účinek na

M.

arfivitu neutrofilu, prostřednictvím inhibice chemotaxe neútrofilů a degranulace in vitro. U zvířecích modelů předložené sloučeniny snižují extravasaci neútrofilů z oběhu, plicní sekvestraci a edematózní odpovědi na četná zánětlivá poškození in vivo.

Další aktivity, které mohou přispívat k terapeutické aktivitě inhibitorů PDE 4 při chronické obstrukční pulmonární chorobě zahrnují bronchodilataci a modulaci plicní neuronální aktivity. Ačkoliv je stupeň reversibility snížení průtoku vzduchu dýchacími cestami při chronické obstrukční pulmonární chorobě nízký, může mít malé zvýšení akutní positivní účinek, stejně jako postupná redukce sklonu poklesu, která může vést k výraznému účinku na kvalitu života pacientů stižených chronickou obstrukční pulmonární chorobou. Schopnost inhalovaných muskarinových antagonistů navodit klinicky významná zlepšení plicní funkce u chronické obstrukční pulmonární choroby, alespoň akutně, naznačuje, že velká složku reversibilní obstrukce dýchacích cest při této chorobě je spjata s dysregulací plicních nervů. Ačkoliv dosud nebyly do detailu studovány, mohou inhibitory PDE 4 také modulovat aktivitu epitelu dýchacích cest, což je bohatý zdroj prozánětlivých inediátorů, které se uvolňují při poškozeních z vnějšího prostředí (např. kouři) a inhibují hyperplasii vaskulární hladké svaloviny, což je strukturální změna v konečném stadiu chronické obstrukční pulmonární choroby, která je spjata se selháním pravého srdce.

Pro účely tohoto vynálezu je katalytické místo cAMP, které váže rolipram s nízkou afinitou označováno jako vazebné místo „s nízkou afinitou (LPDE 4) a druhá forma

- 10• ·

• · * · · · ····· ······ ♦· · tohoto katalytického místa, které váže rolipram s vysokou afinitou označováno jako vazebné místo „s vysokou afinitou (HPDE 4).

K určení a vyhodnocení vazebných stanovení pro [³H]-rolipram se provedou počáteční experimenty. Detaily této práce jsou uvedeny v příkladu 1 uvedeném dále.

K určení, zda jak vazebná aktivita s velkou afinitou, tak vazebná aktivita s nízkou afinitou spočívají v produktu stejného genu se známými postupy transformují kvasinky a během 6-hodinové fermentace se provede exprese rekombinantní PDE 4. Western-blot analýza za použití protilátky proti PDE 4 ukáže, že množství exprimované PDE 4 se zvyšuje s časem dosahujíc maxima po 3 hodinách růstu. Navíc více než 90 % imunoreaktivního produktu je v supernatantu kvasinkových lysátů získaném při vysoké rychlosti (100 000 x g). Spolu s expresí proteinu se monitoruje vazba [³H]-rolipramu a aktivita PDE. Aktivita PDE 4 se exprimuje současně s vazebnou aktivitou pro rolipram, což ukazuje, že obě funkce existují na produktu stejného genu. Podobně výsledkům analýzy Western-blot je více než 85 í rolipramem inhibovatelné aktivity a vazebné aktivity pro [³H]-rolipram nalezeno ve frakci kvasinkového supernatantu.

Celkově většina rekombinantní PDE 4 exprimované v tomto systému existuje jako LPDE 4 a pouze malá frakce jako HPDE 4. V důsledku toho inhibice katalytické aktivity rekombinantní PDE 4 primárně odráží působení sloučenin na LPDE 4. Inhibice katalytické aktivity PDE 4 tak tedy může použita jako index potence sloučenin vůči LPDE 4. Potence sloučenin vůči HPDE 4 může být stanovena vyšetřením jejich schopnosti soutěžit o [³H]—(-)rolipram. K vyvinutí vztahů

- 11 struktury a aktivity (SAR) jak pro vazebná místa pro rolipram s nízkou afinitou, tak pro vazebná místa pro rolipram s vysokou afinitou se ve dvou systémech stanovení stanoví potence zvolených sloučenin. Výsledky experimentů za použití standardních sloučenin se uvedou v tabulce. Podle očekávání jisté sloučeniny jsou jasně potentější při soutěži s [³H]-rolipramem na místě, pro něž rolipram vykazuje vazbu s vysokou afinitou ve srovnání s jiným místem, na kterém se rolipram váže s nízkou afinitou. Korelace vztahu struktury a aktivity mezi vazbou s vysokou afinitou a s nízkou afinitou je slabá, takže se dospěje k závěru, že vztah struktury a afinity pro inhibici vazby pHj-rolipramu s vysokou afinitou se liší od vztahu struktury a afinity pro inhibici vazby rolipramu s nízkou afinitou. Tabulka I poskytuje výsledky z této studie vztahu struktury a aktivity.

Tabulka I

Sloučenina	IC₅₀ nízké afinity	IC50 vysoké afinity	Poměr vysoká/ nízká
1-(5-tetrazol)-3-(3-cyklopen- tyloxy-4-methoxyfenyl)- cyklopentan	1,1	0,002	0,0018
cis-[3-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklopentan-l-karboxylat]	2,7	0,021	0,0078
N-[2-(3-cyklopentyloxy-4-me- thoxyfenyl) ethyljoxamid	0, 89	0,012	0,013
R-rolipram	0,31	0,004	0,013
N-[2-(3,4-bisdifluormethoxy-	1,6	0,4	0,25

fenyl) ethyljoxamid
Ro 20-1724	2,6	0,19	0,07
S-rolipram	1,1	0,095	0,086
(R)-(+)-1-(4-brombenzyl)-4- -[ (3-cyklopentyloxy)-4-methoxy- fenyl]-2-pyrrolidon	4,0	0, 45	0,11
1-(4-aminobenzyl)-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)-2-imidazolidinon	1,4	0,1	0,07

Tabulka I - pokračování

Sloučenina	IC50 nízké afinity	IC50 vysoké afinity	Poměr vyso ká/ nízká
denbufylin	0,29	0,05	0,17
3-(cyklopentyloxy-4-methoxyf enyl) -1- (4-N' -[N2-kyan-S-methylisothioureido]benzyl) -2-pyrrolidon	0,1	0, 03	0,30
(R)-( + )-1-(4-brombenzyl)-4- -[ (3-cyklopentyloxy)-4-methoxyf enyl]-2-pyrrolidon	0,06	0,02	0,33
IBMX	29,1	20,3	0,698
(S)-(-)-ethyl-[4-(3-cyklopen- tyloxy-4-methoxyfenyl)pyrro- lidin-2-yliden]acetat	0,46	0,45	0, 98
papaverin	10	10	1,0
cis-[4-kyan-4-(3-cyklopentyl- oxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-	0,095	0,110	1,1

- 13 ♦ · ·

-1-karboxylat]
cis-[4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-ol]	0,021	0,04	2,0
(R) - ( + ) -ethyl-[4- (3-cyklopen- tyloxy-4-methoxyfenyl)pyrro- lidin-2-yliden]acetat	0,14	0, 3	2,143
2-karbomethoxy-4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-on	0,140	0,5	3,571
trekvinsin	1,6	5,0	3,125

Tabulka I - pokračováni

Sloučenina	ic₅₀	IC50	Poměr
	nízké	vysoké	vysoká/
	afinity	afinity	nízká
dipyridamol	5,2	32, 5	6,25

Denbufyiin je 7-acetonyl-l,3-dibutylxanthin připravený firmou SmithKline Beecham. Papaverin je l—[(3,4— -dimethoxyfenyl)methyl]-6,7-dimethoxyisochinolin. Trekvinsin je 2,3,6,7-tetrahdro-2-(mesytilimino)-9,10-dimethoxy-3-methyl-4H-pyrimido[6, l-a]isochinolin-4-on. Dipyridamol je generický název 2,2', 2,2 '-[ (4,8-dipiperidinopyrimido[5, 4-d]pyrimidin-2, 6-diyl) dinitrilojtetraethanol.

Tyto výsledky ilustrují, že některé ze sloučenin mohou selektivně inhibovat tzv. formu s nízkou afinitou ve srovnání s formou s vysokou afinitou a naopak. Význam tohoto zjištění spočívá v tom, že je uskutečnitelné

• ·

4«· • 4 · ·4

44 • 444·

444 «4 4« 4 · minimalizovat vedlejší účinky sestrojením nebo volbou sloučenin, které selektivně (přednostně) inhibuji jedno místo, čímž ovlivňuje požadovaná odpověď tak, že se vyloučí další, nežádoucí odpověď nebo se alespoň minimalizuje necílená odpověď na stupeň, na kterém neinteraguje se zamýšlenou léčbou do nepřijatelné míry.

Bez ohledu na tuto práci původci nedefinovali základ pro odlišné vztahy struktury a aktivity (SAR) pro vazbu rolipramu s vysokou afinitou a vazbu rolipramu s nízkou afinitou u isoenzymu PDE 4. Bylo však zjištěno, že pokud sloučenina vykazuje poměr IC₅₀ okolo 0,1 nebo vyšší, vypočteno jako poměr IC₅₀ formy vázající rolipram s vysokou afinitou děleno IC50 formy vázající rolipram s nízkou afinitou, bude mít přijatelný terapeutický index. To znamená, že nyní je možno úspěšně léčit řadu imunitních a zánětlivých chorob, přičemž se vůbec neovlivní jiné fyziologické jevy nebo jen přijatelnou měrou. Na tomto místě nejvýhodnější ztělesnění vynálezu inhibuje vazebné místo rolipramu s nízkou afinitou jako prostředek k léčbě zánětlivých a alergických chorob.

Sloučeniny

Tento vynález se týká těch sloučenin, jejichž poměr IC50 (vysoká/nizká vazba) je okolo 0,1 nebo vyšší. To zahrnuje jakékoli a veškeré sloučeniny, které jsou inhibitory PDE 4 jak sám o sobě ukázal zde uvedený test, a které v těchto nebo podobných stanoveních vykazují poměr uvnitř definovaného rozmezí, obzvláště jsou předmětem ty sloučeniny, které nejsou veřejně známy a/nebo nejsou testovány nebo o nich před datem podáním této přihlášky není známo, že jsou inhibitory PDE 4.

- 15 Výhodným postupem k selekci užitečných sloučenin je rozpoznání těch sloučenin, které mají poměr IC₅₀ okolo 0,1 nebo vyšší poměr hodnoty IC50 pro kompetici s vazbou 1 nM [³H]-rolipramu na formu PDE 4, která váže rolipram s vysokou afinitou vůči hodnotě IC50 pro inhibici katalytické aktivity formy, která váže rolipram s nízkou afinitou za použití 1 μΜ [³H]-cAMP jako substrátu.

Příklady sloučenin, které vyhovují standardu poměru IC₅₀ jsou uvedeny v tabulce 1 uvedené výše stejně jako v US patentech čísel 5 448 686, 5 605 923 a 5 552 438. Každá z těchto přihlášek je zde zahrnuta formou odkazu ve své celistvosti jako kdyby byla zahrnuta do tohoto dokumentu.

Výhodnými sloučeninami podle tohoto vynálezu j sou sloučeniny, které mají poměr IC50 vyšší než 0,5 a obzvláště sloučenin, které mají poměr vyšší než 1,0. Sloučeniny jako je cis-[4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylat], 2-karbomethoxy-4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl)cyklohexan-l-on a cis-[4-kyan-4-(3-cyklopropylmethoxy-4-difluormethoxyfenyl )-cyklohexan-l-ol] jsou příklady struktur, které se přednostně vážou na místo s nízkou afinitou a které mají poměr IC₅₀ 0,1 nebo vyšší.

Předložené sloučeniny a farmaceuticky přijatelné soli se mohou podávat standardním způsobem k léčbě indikovaných chorob, například orálně, parenterálně, sublingválně, dermálně, transdermálně, rektálně, inhalačně nebo bukálně. Dá se použít také prostředek s řízeným uvolňováním.

- 16• 9 9 9 9 9 · 9 9 9

9 9 · 9 · ·

999 · 9 9 ♦ 9 9 9

9 9 9 9 9 »01 99 ··· 999 09 9*9

Předložené sloučeniny a farmaceuticky přijatelné soli, které jsou aktivní při orálním podání mohou být formulovány jako sirupy, tablety, kapsle, prostředek s řízeným uvolňováním nebo pokroutky. Sirupový prostředek bude obecně sestávat ze suspenze nebo roztoku sloučeniny nebo soli v kapalinovém nosiči, například ethanolu, oleji z podzemnice olejně, olivovém oleji, glycerinu nebo vody s příchutí nebo barvivém. Pokud je prostředek ve formě tablety, může se použít jakýkoli farmaceutický nosič rutině používaný pro výrobu tuhých prostředků. Příklady takových nosičů zahrnují stearat hořečnatý, bílou hlinku, mastek, želatinu, arabskou gumu, kyselinu stearovou, škrob, laktózu a sacharózu. Pokud je prostředek ve formě kapsle, je vhodná jakákoli rutinní enkapsulace, například za použití výše uvedených nosičů v tuhé želatinové kapslové skořápce. Tam, kde je prostředek ve formě měkké želatinové skořápkové kapsle, může se použít jakýkoli farmaceutický nosič rutinně používaný pro výrobu disperzí nebo suspenzí, například vodné gumy, celulózy, křemičitany nebo oleje, který se inkorporuje do skořápky měkké želatinové kapsle.

Typické parenterální prostředky sestávají z roztoku nebo suspenze sloučeniny nebo soli ve sterilním vodném nebo nevodném nosiči případně obsahujícím parenterálně přijatelný olej, například polyethylenglykol, polyvinylpyrrolidon, lecithin, arašídový olej nebo sezamový olej .

Typické prostředky pro inhalaci jsou ve formě roztoku, suspenze nebo emulze, které lze podávat jako suchý prášek nebo ve formě earosolu za použití obvyklého

- 174 · vyháněcího plynu, jako je dichlordifluormethan nebo trichlorfluormethan.

Typické dermální a transdermálni prostředky zahrnuji obvyklé vodné nebo nevodné vehikulum, například krém, mazání, locio nebo pastu nebo jsou ve formě medikované náplasti, emplastra nebo membrány.

Výhodně je prostředek ve formě dávkové jednotky, například tablety, kapsle nebo odměřené dávky, aby si pacient mohl podat jednu dávku.

Každá dávková jednotka pro orální podání obsahuje vhodně od 0,3 mg do 60 mg/kg a výhodně od 1 do 30 mg/kg sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli. Výhodné dávky zahrnují 10 a 15 mg/kg pro léčbu chronické obstrukčni pulmonární choroby. Každá dávková jednotka pro parenterální podání zahrnuje vhodně od 0,1 do 100 mg/kg sloučeniny nebo její farmaceuticky přijatelné soli. Každá dávková jednotka pro intranasální podání zahrnuje vhodně od 1 do 400 mg/kg a výhodně od 10 do 200 mg na osobu. Topický prostředek obsahuje vhodně od 0,01 do 5,0 % předložené sloučeniny.

Aktivní složka se může podávat od 1- do β-krát za den, dostatečně k tomu, aby vykázala požadovanou aktivitu. Výhodně se aktivní složka podává asi 1- až 2-krát denně, výhodněji 2-krát denně.

Pokud se sloučeniny podle tohoto vynálezu podávají v souladu s předloženým vynálezem, neočekávají se žádné nepřijatelné toxikologické účinky.

- 18Následujici příklady jsou poskytnuty k ilustraci toho, jak vyrobit a použít tento vynález. Nejsou žádným způsobem a do žádného stupně zamýšleny k omezení rozsahu tohoto vynálezu. Pokud jde o to, co si původci vyhrazují obraťte se prosím na dále uvedené patentové nároky.

Příklady provedení vynálezu

Následujících 8 stanovení provedených na 5 živočišných druzích se použije k získání dat podporujících volbu sloučenin s poměrem IC50 okolo 0,1 nebo vyšším. Těmito stanoveními jsou: stimulace tvorby kyseliny v isolované králičí parietální žláze, inhibice degranulace indukované FMLP (uvolňování peroxidázy) v lidských neutrofilech, inhibice tvorby O2~ indukované FMLP v morčecích eosinofilech, inhibice tvorby TNF_a indukované LPS v lidských monocytech, navození zvracení u psů, inhibice bronchokonstrikce u morčat navozené antigenem, zvrat hypotermie u myší navozené reserpinem a inhibice tvorby TNF_a indukované LPS v adoptivně přenesených lidských monocytech u myší. Tato stanovení a data jsou uvedena dále.

Statistická analýza

K vyšetření hypotézy, že inhibice místa PDE 4 s nízkou afinitou je spojena s protizánětlivými působeními této třídy sloučenin, přičemž inhibice místa s vysokou afinitou je spojena s navozením jistých vedlejších účinků, stanovili původci schopnost různých inhibitorů PDE 4 blokovat funkci buňky zánětu jak in vitro, tak in vivo a schopnost těchto sloučenin navodit vedlejší účinky v modelech in vitro a in vivo. Pro srovnání schopnosti inhibitorů PDE 4 vykázat daný terapeutický účinek nebo

- 19• · vedlejší účinek s jejich schopností inhibovat místo PDE 4 s nízkou afinitou proti jejich schopnosti inhibovat místo PDE 4 s vysokou afinitou, srovnali původci potenci těchto sloučenin ve stanoveních in vitro a in vivo s jejich potencí vůči katalytické aktivitě isolovaného enzymu nebo místu s vysokou afinitou lineární korelací (r²) nebo korelací řádu (Sperman's Rho) Lineární korelace vede k otázce, zda potence sloučeniny při inhibici buď místa s nízkou afinitou nebo místa s vysokou afinitou se může použít k předpovědi schopnosti vykázat protizánětlivý nebo vedlejší účinek. Řádová korelace testuje, zda řádová potence při navození daného protizánětlivého nebo vedlejšího účinku je podobná řádu potence při inhibici místa s nízkou afinitou nebo místa s vysokou afinitou. Jak r¹, tak Sperman's Rho se vypočítají za použití počítačového programu STÁT View II firmy Macintosh.

PDE 4 proti vazbě rolipramu s vysokou afinitou

Přiklad 1

Stanovení vazby fosfodiesterázy a rolipramu

Příklad IA

U isolované lidské monocytární PDE 4 a hrPDE (lidská rekombinantní PDE 4) bylo zjištěno, že existují převážně ve formě s nízkou afinitou. Aktivita testovaných sloučenin vůči formě PDE 4 s nízkou afinitou tedy může být stanovena za použití standardních stanovení katalytické aktivity PDE 4 při využití 1 μΜ [³H]-cAMP jako substrátu (Torphy a kol., J. of Biol. Chem., 267, č. 3, 1798 - 1804 (1992)).

- 204 4 φ « * · · • 4·

44 •· · 'Ji« · 4

Jako zdroj proteinu se použijí supernatanty získané při vysoké rychlosti z krysích mozků. Připraví se enantiomery [³H]-rolipramu na specifickou aktivitu 94,92xl0⁴ Bq/ml. Standardní podmínky stanovení se modifikují od publikovaného postupu tak, aby byly shodné s podmínkami stanovení PDE, kromě trváni cAMP: 50 mM Tris HCI (pH 7,5), 5 mM MgC12 a 1 nM [³H]-rolipramu (Torphy a kol., J. of Biol. Chem., 267, č. 3, 1798 - 1804 (1992)). Stanovení se provádí 1 hodinu při teplotě 30 °C. Reakce se ukončí a navázaný ligand se od volného ligandu oddělí za použití zachytávače buněk Brandel. Kompetice o místo s vysokou afinitou za podmínek, které jsou shodné s podmínkami použitými k měřeni aktivity PDE s nízkou afinitou, kromě toho, že [³H]-cAMP a [³H]5'-cAMP nebyly přítomny. Data uvedená v tabulce 1, str. 11 se generují za použití protokolu popsaného v příkladu IA.

Příklad 1B

Měření aktivity fosofodiesterázy

Aktivita fosfodiesterázy se stanoví za použiti stanovení scintilační proximity (SPA) [³H]-cAMP nebo enzymového stanoveni scintilační proximity [³H]-cGMP podle popisu dodavatele (Amersham Life Sciences). Reakce se provádějí na desce s 96 jamkami při teplotě místnosti v 0,1 ml reakčního pufru obsahujícího (konečné koncentrace): 50 mM Tris HCI (pH 7,5), 8,3 mM MgCl₂, 1,7 mM EGTA, [³H]-cAMP nebo [³H] -cGMP (přibližně 2000 dpm/mol) enzym a různé koncentrace inhibitorů. Stanovení se nechá běžet 1 hodinu a ukonči se přidáním 50 μΐ SPA kuliček křemičitanu yttria za

- 21 přítomnosti síranu zinečnatého. Desky se protřepou a nechají se stát 20 minut při teplotě 20 °C. Tvorba radiologicky označeného produktu se stanoví scintilační spektrometrií. Aktivity PDE 3 a PDE 7 se stanoví za použití 0,05 μΜ [³H]-cAMP, zatímco PDE 4 se stanoví za použití 1 μΜ [³H]-cAMP jako substrátu. Aktivity PDE 1B, PDE 1C, PDE 2 a PDE 5 se stanoví za použití 1 μΜ [³H]-cGMP jako substrátu.

Stanovení vazby [³H]-rolipramu

Stanovení vazby [³H]-rolipramu se provede modifikací postupu, který popsal Schneider a spolupracovníci, viz Nicholson a kol., Trends in Pharmacol. Sci., 12, 19 - 27 (1991) a McHale a kol., Mol. Pharmacol., 39, 109 - 113 (1991). R-rolipram se váže na katalytické místo PDE 4, viz Torphy a kol., Mol. Pharmacol., 39, 376 - 384 (1991). V důsledku toho kompetice o vazbu [³H]-rolipramu poskytne nezávislé potvrzení potencí inhibice PDE 4 neznačených kompetitorů. Stanovení se provádí při teplotě 30 °C 1 hodinu v 0,5 μΐ pufru obsahujícího (konečné koncentrace): 50 mM Tris HCI (pH 7,5), 5,5 mM MgCl₂, 0,05 % hovězího sérového albuminu, 2 nM [³H]-R~rolipramu (5,7 x 104 dpm/pmol) a různé koncentrace radiologicky neznačených inhibitorů. Reakce se zastaví přidáním 2,5 ml ledově studeného pufru (bez [³H]-R-rolipramu) a rychlou vakuovou filtrací (Brandel Cell Harvester) přes filtry Whatman GF/B, které jsou napuštěny v 0,3% polyethylaminu. Filtry se promyji dalšími 7,5 ml studeného pufru, vysuší a čítají kapalinovou scintilační spektrometrií.

Příklad 2

• · · «* ··«

Akumulace aminopyrinu

Jisté methylxanthiny a jiné neselektivní inhibitory PDE zvyšují u různých druhů sekreci kyseliny. Jisté selektivní inhibitory PDE 4, např. rolipram a Ro 201724, zvyšují sekreci kyseliny u krys, obzvláště pokud se podají v kombinaci s aktivátorem adenylátcyklázy, jako je histamin. Toto zvýšení sekrece kyseliny je doprovázeno zvýšením akumulace cAMP indukované histaminem. Tato sdělená informace se testuje k určení, zda tento jev existuje. Schopnost sloučenin indukovat sekreci kyseliny se koreluje s jejich schopností vůči místu s nízkou afinitou nebo s vysokou afinitou. Stanovení použité v této přihlášce je akumulace slabé báze, radiologicky značeného aminopyrinu, o němž existují zprávy, že slouží jako biochemický markér zvýšené sekrece kyseliny. Stanovení následuje:

Příprava žaludeční žlázy

Králíci obou pohlaví se usmrtí zlomením vazu a vyjme se žaludek. Sliznice se odřízne od korpusu, kraniální a antrální části žaludku se dají stranou. Žaludeční žlázy se isolují modifikací postupů, které popsali Berglindh a Obrink (1976) a Sack a Spenney (1982) . Sliznice se rozemele a natráví kolagenázou k isolaci žaludečních žláz. Natrávené žlázy se zfiltruji, promyjí a resuspendují 1 : 15 (objemově) v inkubačním médiu následujícího složení: NaCI, 132,4 mM, KC1, 5,4 mM, Na₂HPO₄, 5,0 mM, NaH₂PO₄, 1,0 mM, MgSO₄, 1,2 mM, CaCl₂, 1,0 mM,. NaHCO₃, 12,0 mM, králičí sérový albumin, 2 mg/ml, dextróza, 2 mg/ml, hodnota pH 7,4.

Akumulace aminopyrinu

- 23 ··* ·

Ke stanoveni sekrece kyseliny se žaludeční žlázy v kombinaci s [¹⁴C]-aminopyrinem, různými koncentracemi selektivních inhibitorů PDE 4 a prahovou koncentraci histaminu (0,3 až 1,0 μΜ) inkubují při teplotě 37 °C v horizontální třepačce (110 cyklů/minutu) 20 minut podle postupu, který popsali Sack a Spinney (1982). Vzorky se odstředí a stanoví se radioaktivita v alikvotech frakci supernatantu a pelet. Poměry aminopyrinu se vypočítají podle popisu, který uvedli Sack a Spinney (1982). Data se vyjádří jako procento odpovědi navozené maximální koncentraci histaminu (100 μΜ). Hodnoty EC₅₀ se stanoví lineární interpolaci za použiti maximální odpovědi získané pro každou sloučeninu.

Příklad 3

Vyhodnocení emetického potenciálu selektivních inhibitorů PDE u psů

Psi plemene Mongrel (n = 5 pro každou studii) obojího pohlaví se získají z chovné stanice. Po celonočním hladovění se psi nakrmí polovinou plechovky psí stravy (Big Bet) alespoň 30 minut před provedením studie. Do véna cephalica kterékoli přední nohy se umístí kanyla k podáni léčiv. Kanyla se před podáním experimentální sloučeniny propláchne 1 ml fyziologického roztoku (0,9%). Sloučeniny se rozpustí buď ve směsi polyethylenglykolů a fyziologického roztoku nebo 100% polyethylenglykolů a podají se v objemu 1,0 až 2,0 ml/10 kg. K zajištění toho, že celá dávka vstoupí do oběhu se kanyla propláchne dalším 0,5 až 1,0 ml fyziologického roztoku. Zvířata se vrátí do klece na pozorování po dobu 1 hodiny. U každého psa se sleduje zvedání žaludku nebo zvracení a čas po podání sloučeniny,

24. · ·» • · »· · * > » » · · * ·<·« · · * · * e · » · · • « · · · ··· · » kdy toto chováni bylo pozorováno. Na konci doby pozorování se zvíře vrátí do původní klece. Každý den studie je oddělen 7 dny. Každá sloučenina se podává ve zvyšujících se dávkách následujícího dne studie až se pozoruje emetický účinek. V tomto okamžiku se zvíře ze studie vyloučí a vyšší dávky se vyhodnotí pouze u těch psů, kteří dosud neodpověděli.

Data se vyjádří jako kumulativní procento psů odpovídajících na každou dávku podle popisu v ůliteratuře pro kvantální křivky dávkové odpovědi. Hodnota EC₅₀ se vypočítá za použití probitové analýzy.

Příklad 4

Stanoveni na morčecích eosinofilech

Isolace a čištění eosinofilů

Samcům morčat (Hartley, Hazelton Labs) se před použitím každý týden po dobu 4 až 6 týdnů injikuje 1 ml koňského séra. Zvířata se anestetizují směsí ketamin/xylazin (88 mg, 12 mg/ml, 0,4 ml/kg alespoň 24 hodin po injekci koňského séra). Po navození anestezie se peritoneální dutina promyje 50 ml teplého sterilního fyziologického roztoku (0,9%). Lavážní kapalina se shromáždí za použití katetru 14 G do 50ml plastových kuželovitých zkumavek do odstředivky. Morčata se nechají probrat z anestezie a po dvou týdnech odpočinku se mohou použit znovu.

Z lavážní kapaliny se odstředěním (400 x g, 10 minut) isolují buňky a resuspendují se ve 35 ml fosfátem

-25♦ · · · · ·· ·· · · ·· • Λ · ··

Φ β · « ·· • » » ·· • · · · · · ·· · · · pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) a podlijí se 10 ml isotonického přípravku Percoll (1,075 g/ml). Tato suspenze se 30 minut odstřeďuje při 300 x g. Peleta obsahující hlavně eosinofily s erytrocyty se promyje fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem a erytrocyty se lyžují. Tyto buňky se resuspendují v médiu RPMI 1640 s 20 % fetálního hovězího séra a inkubují se přes noc pří teplotě 37 °C ve zvlhčovaném inkubátoru s 5% obsahem CO2. Příštího dne se buňky promyji a resuspendují ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku ke stanovení životaschopnosti buněk (vyloučení tryptanové modři) a čistotu.

Tvorba superoxidového aniontu (O₂)

Vyčištěné eosinofily (životaschopnost větší než 95 % a čistota vyšší než 90 %) se resuspendují ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku s 20 mM pufru HEPES (pH 7,4) a 0,1 % želatiny v koncentraci 1 až 2 x 10⁶ buněk/ml. Eosinofily (1 x 10⁵) se přidají na desku s 96 jamkami a inkubují se přibližně 1 hodinu při teplotě 37 °C.

Inhibitory PDE 4 se přidají na 10 minut před započetím reakce. Reakce se započne přidáním cytochromu C (160 μΜ) a formylMet-Leu-Phe (fMLP) (30 nM) za nepřítomnosti nebo přítomnosti 60 jednotek superoxiddismutázy (SOD). Redukce cytochromu C se monitoruje na odečítači desek Dynatech MR 7000 při 550 nm s referencí při 630 nm v různých časových intervalech. Rychlost tvorby O2^- se stanoví lineární regresní analýzou za použití čisté absorbance jamek za nepřítomnosti nebo přítomnosti superoxiddismutázy v různých časových okamžicích. Výsledky se vyjádří jako procento kontrolní tvorby O₂ opravené na bazální uvolňování.

Jelikož maximální pozorovaná inhibice je 60 %, log IC30 se

- 26vypočítá za použití lineární interpolace koncentrace a 30% vymezení.

Příklad 5

Bronchokonstrikce u morčat

Samci morčat kmene Hartley (200 až 250 g/4 týdny, Hazelton Research, Denver, PA) se senzitizují i.m. injekcí 0,35 ml 5% (hmotnost/objem) roztoku ovalbumin/fyziologický roztok do každého stehna (0,7 ml celkem) ve dny 1 a 4. Morčata lze použít po 25. dni.

Postup experimentu

Smaci morčat kmene Hartley (600 až 800 g,

Hazelton) aktivně senzitizovaní vůči ovalbuminu se anestetizují pentobarbitalem sodným (40 mg/kg i.p.) přibližně 10 až 15 minut před zákrokem. Jugulární véna, karotida a trachea se kanylují (polymerové pryskyřicové radiologicky neprůhledné katetry Deseret Intracath® Vialon® (Deseret Medical, Inc., Sandy, UT), 22 Ga a 19 GA nebo PE tubing 260) pro podání léčiva, měření tlaku krve a dýchání. K minimalizaci cholinergních vlivů se provede bilaterální vagotomie. Zvířata se paralyzují (pankuroniumbromid, 0,1 mg/kg i.v.) a dýchání (45 vdechů za minutu) se provádí dýchacím přístrojem Harvard Rodent Respirátor (model 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA). Změny tlaku v dýchací trubici se měří pomocí odbočky z tracheální kanyly pomoci převodníku Elcomatic (Buxco Electronics, Sharon, CT). Dechový objem se nastaví k nastolení tlaku v odbočce 8 cm vodního sloupce (asi 5 kubických centimetrů vzduchu z místnosti) Tlak krve se měří pomocí přístroje Statham

- 27• ♦ · * · • ·· ·· ··· ··· ·· P23XL Physical Pressure Transducer (Viggo-Spectramed, Oxnard, CA). Tlaky se zaznamenávají na přístroji Grass Model 7D Polygraph (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Zvířat se během experimentu zahřívají na zahřívacím stole k udržení tělesné teploty.

Testované sloučeniny nebo vehikulum se podávají intravenózně 10 minut před antigenním podnětem. V čase 0 se podá 0,1 mg/kg ovalbuminu intravenózně. Na vrcholu antigenní odpovědi se intravenózně podá další dávka antigenu, 0,2 mg/kg ovalbuminu. Poté co se dosáhne vrcholné antigenní odpovědi na kumulativní dávku 0,3 mg/kg ovalbuminu, podá se nasycený roztok KC1, 1 kubický centimetr/kg intravenózně, což navodí maximální bronchokonstrikci.

Přiklad 6

Inhibice TNF_anavozeného LPS v lidských monocytech

Studie in vitro

Ke stanovení, zda inhibice TNF_amá vztah k inhibici LPDE 4 nebo HPDE 4 se sleduje řada inhibitorů PDE 4, které mají rozpětí potenci pro LPDE 4 a HPDE 4 na jejich schopnost inhibovat tvorbu TNF_av lidských monocytech stimulovanou lipopolysacharidy (LPS) in vitro. Použití primárních lidských buněk k tomuto sledování se považuje za mimořádně důležité za předpokladu, že různé druhy se zdá se dramaticky liší v relativním příspěvku LPDE 4 a HPDE 4 k hydrolýze cAMP v buňkách zánětu.

Způsoby

- 28 • · · · · ·· • ··· · 9 · · ·· • · * · ·· ··· ·· ··» ··* ·♦

Inhibice TNF_a se stanoví v monocytech z lidské periferní krve, které se vyčistí (Collata) z čerstvě získaných z povlaků vytvořených ze sražených leukocytů nebo zbytků po plasmaferéze z krve normálních lidských dárců. Monocyty se umístí v hustotě 1 x 10⁶ buněk/ml média/jamka do mnohočetných desek s 24 jamkami. Buňky se nechají 1 hodinu adherovat, po kteréžto době se supernatant odsaje a přidá se 1 ml čerstvého média (RPMI-1640 obsahující 1 % fetálního telecího séra a penicilin/streptomycin v koncentraci 10 jednotek/ml). Buňky se inkubují 45 minut za přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných sloučenin v koncentracích v rozmezí od 1 nM do 1 mM před přidáním LPS (E. coli. 055:B5, Sigma Chemicals) k získání konečné koncentrace 100 ng/ml. Testované sloučeniny se solubilizují a naředí směsí 50 : 50 dimethylsulfoxid/ethanol tak, že konečná koncentrace rozpouštědla v médiu kultury monocytů je 0,5 % dimethylsulfoxidu a 0,5 % ethanolu. Po 14 až 16 hodinách kultivace při teplotě 37 °C v atmosféře s 5 % C0₂se z monocytů odstraní supernatanty kultury a odstředí se při 100 x g k odstranění buněčných zbytků. Stanovení cytokinu se provede buď bezprostředně nebo se supernata.nty kultury skladují při teplotě -70 °C do stanovení.

Hladiny TNF_a se měří za použití ELISA (Winston) za použití myší monoklonální protilátky proti lidskému TNF„ (viz dále) jako zachytávací protilátky a polyklonální králičí protilátky proti lidskému TNF_a jako druhé protilátky. K detekci se přidá kozí s peroxidázou spojená protikráličí protilátka (Boehringer mannheim, katalogové č. 605222) následovaná substrátem pro peroxidázu (1 mg/ml orthofenylendiaminu s 0,1 % peroxidu močoviny). Hladiny 'TNF«ve vzorcích se vypočítají ze standardní křivky

sestrojené pomoci rekombinantního TNF_a vytvořeného v E.

coli. Monoklonálni protilátky proti lidskému TNF_a se připraví ze slezin myší kmene BALB/c imunizovaných rekombinantním lidským TNF_a modifikací způsobu, který popsal Kohler a Millstein (Nátuře, 256, 495 - 497 (1975).

Polyklonální králičí protilátky proti lidskému TNF_ase připraví imunizací novozélandských bílých králíků rekombinantním lidským TNF_a emulgovaným v kompletním

Freundově adjuvantu.

Způsoby in vivo suprese tvorby lidského TNF_a s využitím modelu adoptivní peritonitidy

Polovina jednotky heparinizované venózni celé krve se odebere od zdravých dobrovolníků, kteří neužívají žádné léky. Oddělí se polymorfonukleární leukocyty vrstvením krve na prostředek Histopaque-1077 odstřeďovánim při 800 x g po dobu 30 minut při teplotě 25 °C. Podíl obsahující lymfocyty/monocyty se zachytí a dvakrát se promyje DPBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) bez iontů vápníku a hořčíku při frekvenci otáček 1000 za minutu po dobu 10 minut při teplotě 25 °C. Peleta se resuspenduje v 5 ml Dulbeccově fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku bez iontů vápníku a hořčíku, vrství se v 5 ml roztoku Percoll připraveném v médiu RPMI 1640, které je prosté séra, při teplotě 25 °C a odstřeďuje se při 550 x g 30 minut při teplotě 25 °C. Plovoucí vrstva monocytů se dá stranou a dvakrát promyje Dulbeccovým fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem bez iontů vápníku a hořčíku při teplotě 25 °C. Monocyty se také isolují stejným postupem z balení Source Leukocytes. Monocytové přípravky obsahují od 65 do 90 % monocytů a

(vyloučeni životaschopnost buněk je vyšší než 97 % trypanové modři).

Myši kmene BALB/c (Charles River laboratories, Wilmington, MA) po skupinách 4 nebo 5 jedinců se chovají v zařízeni bez bariér. Myším o hmotnosti 18 až 25 g stejného věku se injikuje 0,5 ml 6 až 10 x 10⁶ monocytů/ml do peritonea za použití lehkého tlaku na stříkačku jehlou 23 ga, aby monocyty byly vystaveny minimálním smykovým silám a stresu. Během 2 minut po podání monocytů se myši ošetří vehikulem nebo sloučeninou orálním podáním po dobu 15 minut. Zvířatům se poté injikuje intraperitoneálně (i.p.) 0,2 ml endotoxinu o koncentraci 125 mg/ml (E. coli., typ W, Difco) rozpuštěného v Dulbeccově fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku bez iontů vápníku a hořčíku. 2 hodiny nato se zvířata usmrtí udušením v oxidu uhličitém a intraperitoneálně se injikuje Dulbeccův fosfátem pufrovaný fyziologický roztok bez iontů vápníku a hořčíku (4 °C). Peritoneum se mírně masíruje a výplach se odejme a vloží do polypropylenových zkumavek v ledové lázni. Vzorky se vyčeří odstředěním (12 500 x g po dobu 5 minut při teplotě 4 ° C) . Supernatanty se slijí do nových zkumavek (mohou se skladovat při teplotě -20 °C) a pomocí ELISA se stanoví na obsah lidského a myšího TNF_a. Hodnoty ED₅₀ se vypočítají standardními postupy.

Příklad 7

Způsoby s použitím lidských neutrofilů

Isolace a čištění

Neutrofily (PMN) se isolují z heparinizované krve stupňovitým odstřeďováním za použiti přípravku Ficoll (Histopaque 1077) následovaným dextranovou sedimentací k odstranění erytrocytů. Jakékoli zbývající erytrocyty se lýzuji vodou po dobu 30 sekund a isotonicita se obnoví za použití 10X DB-PBS (hmotnost/objem Ca²⁺ nebo Mg²⁺) .

Neutrofily se isolují odstředěním a promyjí se znovu IX DBPBS před stanovením počtu buněk a jejich životaschopnosti, (vyloučení trypanové modři). Počet buněk se upraví na 0,75 až 1,5 x 10⁶ buněk/ml v závislosti na jednotlivém dárci.

Degranulace (uvolnění myeloperoxidázy)

Alikvot (0,1 ml) výše uvedené buněčné suspenze se inkubuje v roztoku Earles balanced Salt Solution obsahujícím 20 mM pufru HEPES (pH =7,4) a 0,1 % želatiny za přítomnosti 5 μρ/πιΐ cytochalasinu B po dobu 5 minut při teplotě 37 °C v protřepávané vodní lázni. Buňky se předem ošetřují dalších 5 minut různými koncentracemi selektivních inhibitorů PDE 4 a PGE₂ (3 až 10 nM) před přidáním fMLP (30 nM). Přidá se fMLP a inkubace pokračuje dalších 30 minut. Reakce se ukončí umístěním vzorků na led následovaným odstředěním. Frakce supernatantu se dá stranou a skladuje se zmrazená (-30 °C) do stanovení myeloperoxidázové aktivity.

Stanovení myeloperoxidázové aktivity

Myeloperoxidázové aktivita se stanoví za použití o-dianisidinu jako substrátu a křenové peroxidázy jako standardu. Alikvot (50 μΐ) supernatnatu se inkubuje se 100 μΐ substrátu (o-dianisidin, 0,53 mM, peroxid vodíku, 0,147 mM, konečná koncentrace) v 50mM sodnofosforečném pufru (pH

- 32= 6,0). reakce se ukonči přidáním 50 μΐ 4M kyseliny sírové. Tvorba produktu se stanoví měřením absorbance při 410 nm a aktivita se stanoví srovnáním se standardní křivkou za použití křenové peroxidázy. Data se vyjádří jako procento kontroly (množství myeloperoxidázy uvolněné za přítomnosti PGE2 samotného). Jelikož maximální inhibice pozorovaná pro většinu sloučenin byla 30 %, logaritmické hodnoty (IC₁₅) se vypočítají za použití interpolace koncentrací s 15% vymezením.

Přiklad 8

Zvrat hypotermie navozené reserpinem u myší

Samci myší kmene CF-1 nebo BALB/c se jednotlivě isolují v drátěných klecích. Před předběžným ošetřením reserpinem (10 mg/kg i.p.) se každé myši změří rektální teplota. 4 hodiny po aplikaci reserpinu se zaznamenají rektální teploty a jednotlivým zvířatům se podají různé dávky (orálně) buď testovaných sloučenin, vehikula nebo rolipramu (10 mg/kg). Rektální teploty se poté měří každých 30 minut po dobu 2 hodin. Data se vyjádří jako změna teploty od teploty pozorované 4 hodiny po podání reserpinu (teploty poklesnou přibližně 10 až 15 °C pod základní úrovně). Křivky závislosti účinku na dávce se sestrojí za použití změn teploty zaznamenaných 90 a 120 minut po ošetření. Hodnoty ED50 se stanoví probitovou analýzou nebo lineární regresí pomocí 6 až 9 zvířat. Pro srovnání schopnosti sloučenin zvrátit hypotermii navozenou reserpinem s jejich schopností inhibovat vazbu s nízkou afinitou nebo vazbu s vysokou afinitou se hodnoty Ed₅o a IC50 vyjádří jako záporná logaritmická hodnota.

Přiklad 9

Vztah mezi biologickou funkcí a inhibici PDE 4

Ke zjištění, zda jisté biologické účinky inhibice PDE 4 jsou spjaty s inhibici Buď LPDE 4 nebo HPDE 4 se provede srovnání mezi schopností sloučenin navodit účinek a schopností sloučenin inhibovat LPDE 4 nebo HPDE 4 za použití lineární a řádové korelace. Tyto korelace mohou být ovlivněny několika faktory:

1) stabilitou sloučenin

2) schopností sloučenin vstupovat do buněk

3) v in vivo studiích biologickou dostupností sloučenin

4) korelačními hodnotami, zvláště lineární korelace jsou citlivé na rozdíly v potencích, čím je větší rozmezí hodnot potencí, tím snáze se změří významná lineární korelace.

Tyto výstrahy byly vzaty v úvahu při analyzování a sumarizování korelace mezi inhibici LPDE 4 nebo HPDE 4 a biologickou funkcí v různých systémech stanovení.

Použití buněk zánětu, suprese monocytární tvorby TNF_a a inhibice tvorby superoxidu v morčecích eosinofilech vykazuje lepší korelaci s inhibici LPDE 4 a nikoli HPDE 4. Dále prevence antigenem navozené bronchokonstrikce in vivo lépe koreluje s inhibici LPDE 4 než s inhibici HPDE 4. V tomto modelu in vivo zdá se inhibitory PDE 4 působí prevencí degranulace mastocytů (Underwood a kol., v tislku) . Inhibice fuknce buněk zánětu však není vždy spjata s inhibici LPDE 4, protože bylo nalezeno, že inhibice degranulace neútrofilů lépe koreluje s inhibici HPDE 4 než

- 34• · * ♦ • · ··· · ♦ · · • · • · • · ·· · s inhibici LPDE 4. Zdá se tedy, že část, nikoli však veškerá suprese aktivity buněk zánětu je spjata s inhibici LPDE 4. Naproti tomu usnadněni sekrece kyseliny, navození zvracení a zvrat hypotermie navozené reserpinem (měřítko psychotropního potenciálu inhibitorů PDE 4) lépe koreluje s inhibici HPDE 4 a nikoli s inhibici LPDE 4. Většina potenciálních vedlejších účinků této třídy sloučenin je tedy spjata s inhibici HPDE 4.

Tato zjištění tedy naznačují, že sloučeniny, které především inhibují LPDE 4 budou mít příznivé protizánětlivé účinky se sníženým potenciálem vykazovat nežádoucí vedlejší účinky. Selekce sloučenin s poměrem IC₅₀okolo 0,1 nebo vyšším pokud jde o IC50 katalytické formy PDE 4, která váže rolipram s vysokou afinitou dělenou IC₅₀katalytické formy PDE 4, která váže rolipram s nízkou afinitou (HPDE 4/LPDE 4) by měla vést ke zvýšení jejich terapeutického indexu, tj. léčivý účinek se maximalizuje a škodlivý účinek se minimalizuje.

Pro určení, zda tato selekční vodítko skutečně povede k nalezení sloučenin se zlepšeným terapeutickým účinkem se vyhodnotí 3 modely srovnávající terapeutický účinek s vedlejším účinkem. Tyto modely zahrnují in vitro srovnání schopnosti sloučenin potlačit tvorbu TNF_av isolovaných lidských monocytech s jejich schopností stimulovat sekreci kyseliny v isolovaných parietálních žlázách a dvě in vivo srovnání zkoumající schopnost sloučenin zabránit vzniku antigenem navozené bronchokonstrikce u morčat a schopnost vyvolat zvracení u psů a schopnost potlačit tvorbu TNF_a v adoptivním přenosovém modelu u myší a jejich schopnost zvrátit reserpinem navozenou hypotermii u myší.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití inhibitoru specifického vůči PDE 4 pro výrobu Léčiva pro profylaxi nebo léčbu chronické obstrukční pulmonární choroby, kde inhibitor má poměr hodnot IC₅₀ okolo 0,1 nebo vyšší pokud jde o hodnotu IC_5Q formy PDE 4, která váže R-rolipram s vysokou afinitou děleno IC_5Q katalytické formy PDE 4, která váže R-rolipram s nízkou afinitou, s vyloučením cis-[4-kyan-4-(3-cyklopentyloxy-4-methoxyfenyl)cyklohexan-l-karboxylatu].
2. Způsob výroby podle nároku 1,vyznačující se tím, že inhibitor má poměr hodnot IC_5Q okolo 0,1 nebo vyšší pokud jde o poměr hodnoty IC₅₀ pro kompetici s vazbou 1 nM [³H]-R-rolipramu na formu PDE 4, která váže rolipram s vysokou afinitou vůči hodnotě IC_5Q pro inhibici katalytické aktivity formy PDE 4, která váže rolipram s nízkou afinitou za použití 1 M [³H]-cAMP jako substrátu.
3. Způsob výroby podle nároku 1 nebo 2,vyznačuj Ιοί se tím, že uvedený poměr hodnot IC₅₀ je 0,5 nebo vyšší.
4. Způsob výroby podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že uvedený poměr hodnot IC5Q je 1,0 nebo vyšší.