CZ20014181A3

CZ20014181A3 - Farmaceutický prostředek obsahující protilátku a pouľití protilátky

Info

Publication number: CZ20014181A3
Application number: CZ20014181A
Authority: CZ
Inventors: Nobufusa Serizawa; Kimihisa Ichikawa; Hiroko Yoshida
Original assignee: Sankyo Company Limited
Priority date: 1999-05-24
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2002-03-13
Also published as: US20020103212A1; MXPA01012206A; NZ515598A; EP1180369A4; CN1364090A; CN1191861C; NO20015711L; ZA200109575B; IL146566A0; HK1042049A1; TR200103396T2; AU4948600A; HUP0201333A2; PL352159A1; HUP0201333A3; CA2373992A1; NO20015711D0; BR0010909A; WO2000071160A1; RU2222347C2

Description

Farmaceutický prostředek obsahující protilátku a použití protilátky

Oblast techniky

Vynález popisuje nový farmaceutický prostředek vhodný pro profylaxi a/nebo léčbu revmatoidní artritidy.

autoimunního onemocněni nebo

Dosavadní stav techniky

Fyziologické odumírání buněk jako výsledek normální přeměny buněk v živém organizmu se nazývá apoptóza a odlišuje se od patologického odumírání buněk, což je nekróza (popisuje se v publikaci Kerr et al. , (1972) Br. J. Cancer, 26, 239).

Apoptóza je druh tzv. programového odumírání buněk, které se pozoruje u jistých buněk, které jsou předem naprogramovány odumírat v živém organizmu. Apoptóza se charakterizuje mimo jiné zakřivením povrchu buněk, kondenzací jaderného chromatinu a fragmentací chromozomální DNA.

Apoptóza má důležitou úlohu při diferenciaci lymfocytů (T buňky) buňky a B autoantigen. Věří se, vytvořených selháním eliminací buněk, které rozeznávají že výskyt autoreaktivních lymfocytů apoptózy při diferenciaci lymfocytů (popisuje se v publikaci Nakazama et al., (1995), Mebio, 12 (10), 78-86) způsobuje autoimunní onemocnění.

Ukázalo se, že na apoptóze se podílejí různé molekuly, které zahrnují Fas (popisuje se v publikaci Zonehara S., et al., (1989), J. Exp. Med., 169, 1747-1756), receptor faktoru nekrózy nádoru (popisuje se v publikaci Loetscher, H., et al., 61, 351-359), CD40 (popisuje se v publikaci al., (1993), Nátuře, 364, (1990), Cell, Tsubata, T . , et

645-648' perferin/granyzm A (popisuje se v publikaci Jenne D. E. et al., (1988), Immunol. Rev. 103, 53-71). Fas je transmembránový protein přítomný na buněčném povrchu a vázající se na extrabuněčnou doménu proteinu, který se nazývá „ligand Fas, přičemž vyvolává apoptózu v buňkách.

Ukázalo se, že některé monoklonální protilátky proti Fas mají cytotoxickou aktivitu a vyvolávají apoptózu v buňce stejným způsobem jako ligand Fas a tak se stávají činidlem pro léčbu autoimunního onemocnění, AIDS a neoplazmy (popisuje se v dokumentu přihlášky patentu Hei 2-237 935 (Kokai) a mezinárodní patentové přihlášky v Japonsku Hei 5-503 281 (Kokai).

Naopak revmatizmus, zvláště revmatoidní artritida, je onemocnění, které je doprovázeno různými abnormalitami v imunity způsobené vnitřními a externími faktory. Základní patologickou změnou je proliferace synoviálních buněk a uvažuje se, že poruchu proliferace synoviálních buněk doprovází zánětlivá buněčná infiltrace a eroze kosti. Porušení tkání v okolí kloubů, které jsou postižené revmatickou artritidou, je způsobené abnormalitami při produkci cytokinu v zánětlivých synoviálních buňkách. Když se zkoumá stádium kloubu pacienta trpícího revmatizmem, pozoruje se neobvyklá proliferace synoviálních buněk, proliferace synoviálního vilusu, synoviální buňky se vyskytují ve více vrstvách a podobně (popisuje se v publikaci Daniel J. McCarty (1985) „Arthritis and allied conditions. A textbook of rheumatology 10^th Edition, Lea and Febiger). Při farmakoterapii revmatizmu se v současné době hlavně používá protizánětlivé činidlo a činidlo regulující imunitu, jako je steroid nebo podobně. V případě, že takový nadbytek je možné kontrolovat určitou aktivní látkou, předpokládá se, že takovou aktivní látku je možné použít jako činidlo pro léčbu revmatizmu.

Je známo, že proliferace synoviálních buněk při revmatizmu není mimo kontrolu, ale je spontánně kontrolována (popisuje se v publikaci Daniel J. McCarty (1985) v „Arthritis and allied conditions. A textbook of rheumatology 10^th Edition, Lea and Febiger). Dále je zřejmé, že apoptóza je u revmatických • · ·· · pacientů způsobena synoviálními buňkami a antigen Fas se nachází na membráně synoviálních buněk. V publikaci Nakajima, T., et al., (1995) Arthritis Rheum. 38, 485-491) a Aono et th

Japan rheumatic society summary collection (1994),

487 page and Heise 6 Japan cancer society generál meeting reports 1994, 338 page) se zjištivalo, zda se v synoviální buňce vyvolala apoptóza, když se k normálně proliferujíci synoviální buňce, která pochází z pacienta trpícího přidá protilátka proti lidskému Fas vykazující aktivitu. Zjistilo se, že v revmatizrnem, cytotoxickou proliferujících synoviálních buňkách, které abnormálně pocházej í z pacienta trpícího revmatizmem, probíhá apoptóza vyšší rychlostí ve srovnání nepocházejí z pacienta se synoviálními buňkami, které trpícího revmatizmem. Podobně, protilátka proti lidskému Fas může selektivně vyvolat apoptózu nikoliv pouze u lymfocytů, ale také u abnormálně se proliferujících synoviálních buněk a proto je možné je použít jako činidlo pří léčbě revmatizmu.

Zjistilo se několik druhů myších monoklonálních protilátek proti Fas (popisuje se v publikaci Yonehara, S., et al., (1989) J. Exp. Med. 169, 1747-1756, (1989), Science, 245, 301305 (1989) a podobně). Dále, jak se popisuje shora v textu, se uvádí, že protilátka v synoviálních buňkách pocházejících z pacienta trpícího revmatizmem vyvolává apoptózu in vitro (popisuje se v publikaci 38^th Japan rheumatic society summary collection (1994), p. 487, a Japan cancer society generál meeting reports (1994), p. 338). Dále se zjistilo, že některé protilátky proti Fas jsou účinné a bezpečné při léčbě ve zvířecím modelu autoimunního onemocnění nebo artritidy (popisuje se v dokumentu přihlášky patentu č. 0 909 816).

revmatické evropského

Je známo, artritidou je že účinnost léčby pacienta s revmatickou možné zvýšit použitím methotrexátu a monoklonální protilátky cA2 proti faktoru nekrózy nádoru a (TNFa) (popisuje se v publikaci Carden, 7^th International rheumatism symposium summary (1998) p. 12-13). Synergický účinek protilátky proti Fas a methotrexátu je obecně známý.

Jestliže existuje látka, která zesiluje účinek protilátky proti Fas je možné ji použít jako činidla při profylaxi a/nebo léčbě autoimunního onemocnění nebo revmatické artritidy, přičemž množství protilátky proti Fas, které je nutné použít, se může snížit společným použitím uvedené látky a protilátky proti Fas. Tímto způsobem se může snížit možnost, že pacient se stane tolerantním vůči protilátce proti Fas, což může být výsledek produkce protilátek proti Fas v těle pacienta. Podobně je nutné vytvořit profylaktické nebo terapeutické činidlo obsahující kombinaci protilátky proti Fas a látky zvyšující účinnost protilátky proti Fas, kterou je možné použít po dlouhý čas.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku protilátku proti Fas, která vykazuje aktivitu vyvolávající apoptózu a látku, která vykazuje aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu. Je výhodné, aby protilátka proti lidskému Fab byla monoklonální protilátka CHll, monoklonální protilátka proti lidskému Fas HFE7A produkovaná hybridomem mys-myš HFE7A (FERM BP-5828) nebo jejich humanizované formy.

Je výhodné, když se shora uvedená látka vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující hydrofolátovou reduktázu, vybrala ze skupiny obsahující methotrexát, edatrexát, epiroprim, iometrexol, pyritrexim, trimetrexát, brodimoprim, MX-68, N-[4-[3-(2,4-diamino-6,7-dihydro-5H-cyklopenta[d]pyrimidin-5-yl) propyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N—[[5—[2 — (2-amino-l, 4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxopyrido[2,3-d]-pyrimidin-6-yl) ethyl]-2-thienyl]karbonyl]-L-glutamovou kyselinu, ·

* ·

(R) -N-[[5-[2- (2-amino-l, 4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxopyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl]ethyl]karbonyl]-L-glutamovou kyselinu, (S) —2—[[[4 — -karboxy-4-[[4-[[ (2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl]amino]benzoyl]amino]butyl]amino]karbonyl]benzoovou kyselinu, N-[4-[3[ (2,4-diamino-lH-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) pro-pyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, 2,4-diamino-6-(N-(4-(fenyl-sulfonyl)benzyl)methylamino)chinazolin, 2,4-diamino-5-[4-[3-(4-aminof enyl-4-sulf onylfenylamino) propoxy]-3,5-dimethoxybenzyl]pyrimidin, N-[4-[4- (2,4-diamino-5-pyrimidinyl) butyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N-[4-[4-(2,4-diamino-6-pteridinyl) ethyl]benzoyl]-4-methylen-DL-glutamovou kyselinu a diamidchlorid N-(lmethylethyl)-N'[3-(2,4,5-trichlorof enoxy) propoxyjimidodikarbonimidu (PS15). Z nich je nejvýhodnější methotrexát. Zjistilo se, že účinnost monoklonální protilátky proti Fas, která vykazuje účinek vyvolávající apoptózu, se může zvýšit použitím látky, která vykazuje aktivitu folátového antagonisty nebo aktivity inhibující dihydrofolátové reduktázy.

Termín „aktivita vyvolávající apoptózu znamená aktivitu vyvolávající apoptózu v buňce, která exprimuje protein Fas na povrchu buněčné membrány tím, že se naváže na protein Fas.

Protilátka proti lidskému proteinu Fas používaná jako první aktivní složka farmaceutického prostředku podle vynálezu je ta, která se může zvláště vázat na lidský protein Fas a vykazuje účinek vyvolávající apoptózu. Výhodné příklady takových protilátek proti lidskému proteinu Fas zahrnují monoklonální protilátku proti lidskému Fas CH11 a monoklonální protilátku proti lidskému Fas CH11 a monoklonální protilátku proti lidskému Fas HFE7A, které se produkují hybridomem myšmyš HFE7A (FERM BP-5828), nebo jejich humanizované formy (popisuje se v dokumentu přihlášky evropského patentu č. 0 909 816) . Navíc monoklonální protilátka proti lidskému Fas podle vynálezu zahrnuje rekombinanty těchto monoklonálních protilátek proti Fas, které vykazují účinek shodný s těmito

monoklonálními protilátkami. Vynález však také popisuje tzv. humanizované protilátky upravené použitím technologie rekombinace genů tak, že imunogennost vůči člověku je snížena aniž se sníží schopnost shora uvedených monoklonálních protilátek proti Fas vázat se na protein Fas a jeho aktivita vyvolávající apoptózu.

Termín „látka vykazující antagonistickou aktivitu nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu znamená farmaceuticky přijatelnou látku, která vykazuje aktivitu antagonisticky inhibující metabolizmus kyseliny listové, což je nutný proces při syntéze DNA v buňce. Výhodný příklad takové látky zahrnuje:

methotrexát (vzorec I)

(I)

Ί • 9 · ·· · ·· ·· ··· · · · · ···· • · · · · · · · · · ·· ♦ ·· ··· ·· ···· edatrexát (popisuje se v dokumentu britského patentu č. GB 2 058 770 B) vzorce II)

epiroprim (popisuje se v dokumentu přihlášky mezinárodního patentu č. WO92/8461, vzorce III)

iometrexol (popisuje se v dokumentu přihlášky mezinárodního patentu č. WO86/5181, vzorce IV)

(IV) • * • · · • ♦ · • · · · • · · · · · • · · pyritrexim (popisuje se v dokumentu přihlášky evropského patentu č. 21 292 vzorce V)

(V) trimetrexát (popisuje se v dokumentu přihlášky britského patentu č. GB 1 345 502, vzorce VI)

brodimoprim (popisuje se v dokumentu přihlášky britského patentu č. GB 1 449 387, vzorce VII) h₃c

(VII)

MX-68 (popisuje se v dokumentu přihlášky mezinárodního patentu č. WO97/34 606, vzorce VIII)

N-[4-[3- (2,4-diamino-6, 7-dihydro-5H-cyklopenta[d]pyrimidin-5-yl) propyl]benzoyl]-L-glutamová kyselina (popisuje se v publikaci J. Med. Chem. (1994) 37, 1616-1624, vzorce IX)

N-[[5-[2- (2-amino-l, 4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxopyrido[2,3-d]-pyrimidin-6-yl) ethyl]-2-thienyl]karbonyl]-L-glutamová kyselina (popisuje se v dokumentu přihláška evropského patentu č. 343 801, vzorce X)

• · · • © *

9 9 9

9 9999

9

9 9 9 9 9 9

9 99 9999

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 ·»· ·· 9999

N- ((2,4-diamino-3,4,5,6,7,8-hexahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl)ethyl)-2-thienylkarbonyl-L-glutamová kyselina (popisuje se v publikaci Summary U. . Cancer research society , 88^th annual convention (1997) ž. 660, vzorce XI)

(xi) (S) -2-[[[4-karboxy-4-[[4-[[ (2,4-diamino-6-pteridinyl)methyl]amino]benzoyl]amino]butyl]amino] karbony ljbenzoová kyselina (popisuje se v dokumentu přihláška evropského patentu č. 345 308, vzorce

(XII)

N—[4—[3—[ (2,4-diamino-lH-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) propyl]benzoyl]-L-glutamová kyselina (popisuje se v dokumentu přihlášky evropského patentu č. 334 636, vzorce XIII)

H₂N

(ΧΠΙ)

O

2,4-diamino-6-(N-(4-(fenylsulfonyl)benzyl)methylamino)chinazolin (popisuje se v publikaci Summary of U.S. cancer research society, annual convention (1992) č. 2458, vzorce XIV)

2,4-diamino-5-[4-[3-(4-amínofenyl-4-sulfonylfenylamino)propoxy]-3,5-dimethoxybenzyl]pyrimidin (popisuje se v dokumentu přihlášky evropského patentu č. 231 888, vzorce XV)

N—[4 —[4— (2, 4-diamino-5-pyrimidinyl) butyl]benzoyl]-L-glutamová kyselina (popisuje se v dokumentu přihlášky mezinárodního patentu č. WO95/9845, vzorce XVI)

(XVI) ·· · ·« ► · ♦ · β · ► · · · · · ’ · *··· · · · • · · * ·· * 99 λ

99

9 fl

9999

Ν-[4-[3- (2, 4-diamino-5-pyrimidinyl) propyl]benzoyl]-L-glutamová kyselina (popisuje se v dokumentu přihlášky mezinárodního patentu č. WO95/9845, vzorce XVII)

°v^/0H

H f

N—f—H <

OH

N-[4-[2- (2,4-díamino-6-pteridinyl) ethyl]benzoyl]-4-methylen-DL-glutamová kyselina (popisuje se v dokumentu přihlášky evropského patentu č. WO91/10 666, vzorce XVIII)

diamidchlorid N-(1-methýlethyl) -N'[3-(2,4,5-trichlorofenoxy) propoxyjimidodikarbonimidu (PS15) (popisuje se v dokumentu přihlášky mezinárodního patentu č. WO93/16 037, vzorce XIX) h₃c. xh₃

Cl • · »··· •· ·· * · · I • · 4

I · «

I · · » · ··· ·

Je známo, že všechny tyto folátového antagonisty dihydrofolátovou reduktázu methotrexát nejvýhodnější látky vykazují aktivitu nebo aktivitu inhibující

Mezi shora uvedenými látkami je látkou, která je obsažena ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu je možné získat vytvořením vhodné směsi monoklonální protilátky proti proteinu Fas, která vykazuje aktivitu vyvolávající apoptózu v buňkách exprimujících protein Fas, a látky, která vykazuje aktivitu nebo folátového antagonisty dihydrofolátovou reduktázu.

Monoklonální protilátka aktivitu inhibuj ící proti proteinu Fas se může produkovat způsoby dobře známými v oboru za použití například molekuly obsahující extrabuněčnou doménu lidského proteinu Fas jako antigenu. Například monoklonální protilátka HFE7A, která je jedna z výhodných monoklonálních potilátek a bude obsažena ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu, se získala imunizací myši, která neobsahuje protein Fas, lidským proteinem Fas. Pak se buňky sleziny myší fúzovaly s buňkami myšího myelomu a kultivoval se výsledný hybridom. Hybridom se může specificky získat následujícími metodami.

Příprava monoklonální protilátky zahrnuje alespoň následující kroky:

(a) čištění biomakromolekuly vhodné pro použití jako antigenu, (b) příprava buněk produkujících protilátku po imunizaci zvířete za použití injekcí antigenu, odebrání vzorků krve a testování titru protilátek za účelem stanovit, kdy je nutné odebrat slezinu, (c) příprava buněk myelomu, (d) fúze buněk produkujících protilátky a buněk myelomu, (e) výběr hybridomů produkujících žádané protilátky, (f) příprava jediného buněčného klonu (klonování), fc · fc · fc • fc··· • ·* »· ·· * · · fc • fcfcfc • fcfcfc fc • fcfc· »«· *· ···· (g) dále je možná kultivace buněk hybridomů nebo pěstování zvířat, do kterých se transplantovaly buňky hybridomů za účelem přípravy monoklonálních protilátek ve velkém objemu a (h) testování biologických aktivit a specifity nebo testování vlastností značícího činidla takto připravených monoklonálních protilátek.

Způsob přípravy monoklonální protilátky proti Fas se popisuje dále v textu více detailněji. Vynález se neomezuje na uvedené způsoby přípravy protilátek. Mohou se také použít další buňky produkující protilátky , jako jsou slezinné buňky a myelom.

(a) Čištění antigenů

Rekombinantní protein (zde se nazývá jako „rekombinantní lidský protein Fas), účinný jako antigen, může být obsažen v transfekční opičí buněčné linii COS-1 s expresívním vektorem phFAS-AIC2, který kóduje fúzní protein obsahující extrabuněčnou doménu lidského proteinu Fas a extrabuněčnou doménu receptorů myšího interleukinu-3 (IL3R) (popisuje se v publikaci Nishimura, Z., et al., (1995), J. Immunol., 154, 4395-4403) za účelem exprese a získání a částečného čištění produktu exprese. Plazmid phFas-AIC2 se zkonstruoval začleněním DNA kódující lidský Fas a myší fúzní protein IL3R do pME18S, který slouží jako expresívní vektor pro zvířecí buňky. Jak se poznamenalo shora v textu používané materiály, jako je DNA kódující protein Fas, vektor a hostitel, nejsou omezeny na uvedené materiály.

Například lidský protein Fas a myší fúzní protein IL3R produkovaný v supernatantu kultury transformovaných buněk COS1 transfekovaných plazmidem phFas-AIC2 se mohou zvláště čistit chromatografií s výměnou iontů za použití kolony Resource Q (vyrobeno firmou Pharmacia).

• · · · • · · · ···· ·· · ·· · • · ···· ··· ···· · • · · ··· ··· ·· · · · ··· ·· ····

Čištěny Fas získaný z buněčných membrán lidských buněčných linií se může také použít jako antigen. Dále vzhledem k primární struktuře proteinu Fas je známo (popisuje se v publikaci Itoh, N., et al., (1991), Cell, 66, 233-243), že peptid obsahující známou aminokyselinovou sekvenci se může chemicky syntetizovat způsobem, který je dobře znám v oboru, a může se použít jako antigen.

(b) Příprava buněk produkujících antigen

Imunogen produkovaný v kroku (a) se smíchal s adjuvans, jako je Freundovo úplné nebo neúplné adjuvans a alum, a s touto směsí se imunizovalo experimentální zvíře. Vhodné experimentální zvíře může být myš, která neexprimuje protein Fas, jenž se může produkovat způsobem popsaným v publikaci Senju, S., et al., (1996), International Imunology, 8, 423).

Vhodné způsoby aplikace pro imunizaci myši zahrnují subkutánní, itraperitoneální, intravenózní, intradermální a intramuskulární injekci, přičemž se preferuje subkutánní a intraperitoneální injekce.

Imunizace se může provést jedinou dávkou nebo několika opakovanými dávkami ve vhodných intervalech (výhodný je interval 1 až 5 týdnů). U imunizovaných zvířat se monitoroval titr protilátek v jejich séru a zvíře s dostatečně vysokým titrem protilátky se vybralo jako zdroj buněk produkujících protilátky. Výběr zvířete s vysokým titrem činí následný proces více účinným. Buňky pro následnou fúzi se v obecném případě získaly ze zvířete 3 až 5 dní po konečné imunizaci.

Způsoby testování titru protilátek zahrnují různé dobře známé techniky, jako je radioimunologický test (RIA), enzymatický imunologický test na pevné fázi (ELISA), fluorescenční protilátkový test a test pasivní hemaglutinace. Preferují se testy RIA a ELISA z důvodu citlivosti detekce, rychlosti, přesnosti a možnosti automatizace.

Stanovení titru protilátek se může provést například testem ELISA následujícím způsobem. Nejdříve se čištěný a částečně čištěný protein Fas adsorbuje na povrch pevné fáze, jako je destička vhodná pro test ELISA obsahující 96 prohlubní. Pak se zbývající povrch zablokuje, aby nedošlo k navázání proteinu Fas, proteinem, který není příbuzný s antigenem, jako je bovinní sérový albumin (BSA). Po promytí se povrch prohlubní dostane do kontaktu se sériově ředěnými vzorky první protilátky (například myší sérum), aby se umožnilo navázání protilátky proti proteinu Fas ve vzorcích na antigen. Přidala se enzymem značená anti-myší protilátka, která slouží jako sekundární protilátka, aby se navázala na myší protilátku. Po promytí se přidal substrát pro enzym a titr protilátek se pak může odhadnout stanovením změn absorbance způsobené vyvíjením barvy, což je způsobeno rozkladem substrátu nebo podobně.

(c) Příprava buněk myelomu

V obecném případě buňky z myších buněčných linií slouží jako zdroj buněk myelomu například myši rezistentní na 8azaguanin (získáno z myší BALB/c) kmenů P3X63Ag8U.l (P3-U1) (popisuje se v publikaci Zelton, D. E., et al., Current Topics in Microbiology and Immunology, 81, 1-7 (1978)), P3/NSl-Ag4l(NS-l) (popisuje se v publikaci Kohler, G., et al., European

J. Immunology, 6, 511-519 (1976)), Sp/0-Agl4 (SP-2) (Shulman, Μ. , et al., Nátuře, 276, 269-270 (1978)), P3X63Ag8.653(653) (popisuje se v publikaci Shulman, M., et al., Nátuře, 276, 269-270 (1978), P3X63Ag8.653(653) (Kearney, J. F., et al., J. Immunology, 123, 1548-1550 (1979)) a P3X63Ag8(X63) (Horibata,

K. and Harris, A. W., Nátuře, 256, 495-497 (1975)). Vybraná buněčná linie se subkultivovala ve vhodném kultivačním médiu, jako je 8-azaguaninové kultivační médium (kultivační médium RPMI-1640 doplněné glutaminem, 2-merkaptoethanolem, gentamicinem, fetálním telecím sérem (FCS) a 8-azaguaninem), • · · · · · · • · · · · ·· * • · · · · · • · · · · · ·

Iscovo modifikované Dulbeccovo médium (IMDM) nebo Dulbeccovo modifikované „Eagle médium (DMEM). Buňky se pak subkultivovaly v normálním kultivačním médiu, jako je kultivační médium ASF104 (Ajinomoto, K. K.), které obsahuje 10 % FCS, 3 až 4 dni před fúzí za účelem potvrdit, že alespoň 2xl0⁷ buněk je v den fúze dostupných.

(d) Buněčná fúze

Používané buňky produkující protilátky jsou buňky plazmy a lymfocyty, které jsou jejich prekurzorové buňky. Tyto buňky je možné získat z libovolné vhodné části zvířete. Typickými oblastmi jsou slezina, lymfatické žlázy, periferní krev nebo jejich libovolná vhodná kombinace. Nejběžněji se používají buňky sleziny.

Po poslední zesilovací injekci tkáň, ve které jsou přítomny buňky produkující protilátky, jako je slezina, se získala z myší, které mají předem stanovený titr protilátek, za účelem přípravy buněk produkujících protilátky, jako jsou buňky sleziny. V současné době nejvíce užívaná metoda fúze buněk sleziny s buňkami myelomu připravených v kroku (c) používá polyethylenglykol, který vykazuje relativně nízkou toxicitu a použitý postup fúze je jednoduchý. Příklad tohoto postupu je následující.

Buňky sleziny a myelomu se dobře promyly kultivačním médiem, které neobsahuje sérum (takové jako je RPMI 1640), nebo fyziologickým roztokem pufrovaným fosforečnanem (PBS) a pak se smíchají tak, že poměr slezinných buněk a buněk myelomu je přibližně 5 : 1 a 10 : 1 a pak se buňky centrifugovaly. Po té, co se supernatant vylil a buňky tvořící pelet podstatně vyschly, se přidal po kapkách za stálého míchání 1 ml kultivačního média, které neobsahuje sérum a obsahuje 50 % (hmotn./objem) polyethylenglykolu (molekulová hmotnost je 1 000 až 4 000) . Následně se pomalu přidá 10 ml kultivačního média bez séra a pak se směs centrifuguje. Supernatant se opět odstraní a buňky v peletu se suspendují ve vhodném množství kultivačního média HAT, které obsahuje roztok hypoxanthinu, aminopterinu a thymidinu (HAT) a myší interleukin-2 (IL-2). Suspenze se pak přenese do prohlubní kultivačních destiček (destičky) a inkubuje se v přítomnosti 5 % atmosféry (objem/objem) C0₂ při teplotě 37 °C po dobu přibližně 2 týdny, přičemž se přidá kultivační médium HAT, je-li to vhodné.

(e) Výběr hybridomů

V případě, že kmen myeomu je rezistentní na 8-azaguanin, to znamená, že neobsahuje enzym tranferázu hypoxanthinguaninfosforibosylu (HGPRT), jakékoliv nefúzované buňky myelomu a libovolné fúze myelom-myelom nejsou schopny přežít v kultivačním médium HAT. Na druhou stranu vzájemné fúze buněk produkujících protilátky stejně jako hybridomy buněk produkujících protilátky s buňkami myelomu mohou přežít, ale vykazují pouze omezenou dobu života. Podobně kontinuální inkubace v kultivačním médiu HAT vede k selekci pouze požadovaných hybridomů.

Výsledné hybridomy pak tvoří kolonie a pak se transformují do kultivačního média HAT, které neobsahují aminopterin (kultivační médium HT). Pak se sesbíraly alikvóty supernatantů kultury, aby se stanovil titr protilátek proti proteinu Fas. Může se použít například test ELISA. Když se používá shora uvedený fúzní protein, jako antigen v testu ELISA, je také nezbytné eliminovat klony produkující protilátky, které se specificky váží na extrabuněčnou doménu receptoru myšího IL3. Přítomnost nebo absence takového klonu se může ověřit například v testu ELISA za použití receptoru myšího IL3 nebo jeho extrabuněčné domény jako antigenu.

Ačkoliv shora popsaný postup výběru je popsán s použitím buněčné linie rezistentní na 8-azaguanin, je možné použít jiné buněčné linie s vhodnými modifikacemi použitého kultivačního média.

• · · · · · · (e) Klonování

Hybridomy, které vykazují produkci specifických protilátek za použití metody podobné té, která se popisuje v kroku (b) za účelem stanovit titr protilátek, se pak přenesly na jinou destičku za účelem klonování. Vhodné klonovací metody zahrnují: metodu limitujícího ředění, při které jsou hybridomy ředěny tak, že obsahují jednu buňku v jedné prohlubni destičky, a pak se kultivují na měkkém agaru, kdy se kolonie získaly po kultivaci v kultivačním médiu ve formě měkkého agaru. Dále je možné použít metodu, při které se používá k získání jediné buňky za účelem kultivace mikromanipulátor, a metodu „třídit a klonovat”, kdy se oddělují jednotlivé buňky. Limitující ředění je nejjednoduší a také nejčastěji používaná metoda.

Postup klonování podle například metody limitujícího ředění se opakuje 2 až 4 krát v případě každé prohlubně, přičemž se stanoví titr protilátek a klony vykazující stabilní titry protilátek se vybraly jako hybridomy produkující monoklonální protilátky proti proteinu Fas. Hybridomy produkující protilátky proti myšímu proteinu Fas se vybraly podobnou metodou, aby se získala buněčná linie produkující monoklonální protilátky. Myší protein Fas vhodný pro tento účel je například fúzní protein exprimovaný kultivací zvířecích buněk transfekovaných expresívním vektorem pME18SmFas-AIC. Tento plazmid má DNA kódující fúzní obsahující extrabuněčnou doménu myšího proteinu extrabuněčnou doménu receptoru v publikaci Nishimura, Z., et al.,

4395-4403). Jiné zdroje myšího proteinu Fas zahrnují čištěný myší proteinu Fas a buňky, které exprimují na svém povrchu myší protein Fas.

Hybridomy myš-myš HFE7A, které produkují monoklonální protilátky proti proteinu Fas a jsou výhodné jako aktivní protein

Fas a myšího 113 (popisuje (1995), J. Immunol., 154, • · · · · složka farmaceutického prostředku podle vynálezu, se uložily v instituci National Institute Bioscience and Human Technology 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japonsko, 19.2.1997 podle Budapešťské dohody o ukládání mikroorganizmů s přístupovým číslem FERM BP-5828. Podobně, když se připravuje protilátka použitím hybridomu myš-myš HFE7A, příprava se může uskutečnit následujícím postupem, který začíná od kroku (g) popsaného dále v textu, přičemž kroky (a) až (f) se vypustily.

(g) Kultivace hybridomu za účelem přípravy monoklonální protilátky

Hybridom získaný klonováním se pak kultivoval v normálním kultivačním médiu, nikoliv v médiu HT. Kultivace ve velkém měřítku se může provést v kultivační nádobě za stálého míchání za použití kultivačních nádob s velkým objemem. Supernatant získaný z kultury o velkém objemu se čistil vhodnou metodou, jako je gelová filtrace, která je dobře známa v oboru, přičemž se získají monoklonální protilátky proti proteinu Fas, které slouží jako profylaktické nebo terapeutické činidlo podle vynálezu. Hybridom také může růst intraperitoneálně v syngenní myši, jako je myš BALB/c nebo myš Nu/Nu, aby se získalo velké množství ascitů, které obsahují monoklonální protilátku, která slouží jako profylaktické nebo terapeutické činidlo podle vynálezu. Čištění se také provede použitím běžně dostupné sady pro čištění monoklonálních protilátek (jako je například sada MabTrap GII, Pharmacia).

Monoklonální protilátky se připravily způsobem popsaným shora v textu, které vykazují vysokou specifitu k lidskému a myšímu proteinu Fas.

(h) Testování monoklonálních protilátek

Stanovení izotypu a podtřídy takto získané monoklonální protilátky se provedlo následujícím způsobem. Vhodné identifikační metody zahrnují Ouchterlonyho metodu, test ELISA • · · ·· · ·· ·· • · · ···· · · · · ···· · · · · · · • · ···· ··· · · · · · • · · · · · ··· ·* ♦ t· ··· ·· ···· a RIA. Ouchterlonyho metoda je jednoduchá, ale vyžaduje zvýšení koncentrace roztoku v případě, že koncentrace monoklonální protilátky je nízká. Když se použije test ELISA nebo RIA, supematant kultury může reagovat přímo s antigenem adsorbovaným na pevné fázi a se sekundárními protilátkami, které vykazují specifitu pro různé izotypy imunoglobulinů a podtřídy, aby se identifikoval izotyp a podtřída monoklonální protilátky. Způsob použití běžně dostupné sady k identifikaci, jako je sada „Mouše Typer Kit (vyrábí Bio-Rad Laboratories, lne.) je jednoduchý.

Kvantifikace proteinu se může provést Folin-Lowryho metodou nebo výpočtem založeným na absorbanci při vlnové délce 280 nm (1,4(OD 280)= imunoglobulin 1 mg/ml).

DNA kódující těžké a lehké řetězce monoklonálních protilátek proti proteinu Fas, které se přednostně používají jako aktivní složka ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu, se mohou získat přípravou mRNA z buněk hybridomů, které produkují monoklonální protilátky proti proteinu Fas. Zmíněná mRNA se přemění na cDNA reverzní transkriptázou a pak se izoluje DNA kódující těžké a lehké řetězce protilátek. Extrakce mRNA se může provést metodou za použití guanidin thyokyanátu - horký fenol, metody guanidinthiokyanátu HCl nebo podobně. Preferuje se metoda guanidinthiokyanát-clorid česný. Příprava mRNA z buněk se v obecném případě uskuteční následujícím způsobem: nejdříve se připraví celkové množství mRNA a pak se čistí mRNA z celkové mRNA za použití poly(A)⁺RNA čistící matrice, jako jsou částice oligo(dT) celulózy a částice oligo(dT)latexu. V jiném případě se může RNA připravit přímo z buněčného lyzátu za použití uvedené matrice. Metody přípravy celkového množství RNA zahrnují centrifugací v gradientu alkalické sacharózy (popisuje se v publikaci Dougherty, W. G. And Hiebert, E. (1980), Virology, 101, 466474), metodu za použití guanidinthiokyanátu-fenolu, metodu za použití guanidinthiokyanát trifluorocesný a metodu za použití fenol-SDS. Upřednostňuje se způsob guanidinthiokyanát a chlorid česný (popisuje se v publikaci Chirgwin, J. M., et al., (1979), Biochemistry, 18, 5294-5299).

Takto získaná poly(A)⁺RNA se může použít jako templát při reakci s reverzní transkriptázou, aby se připravila jednořetězcová cDNA, která se pak může přeměnit na dvouřetězcovou cDNA. Vhodné metody zahrnují metodu používající nukleázu SI (popisuje se v publikaci Efstratiadis. A., et al., (1976), Cell, 7, 279-288), metoda podle Gubler-Hoffmana (popisuje se v publikaci Gubler., U., and Hoffman, B. J., (1983), Gene, 25, 263-269) a způsob podle Okayama-Berga (popisuje se v publikaci Okayama., H., and Berg, P., (1982) Mol. Cell. Biol., 2, 161-170). Preferovaná metoda však zahrnuje polymerázovou řetězcovou reakci (PCR) (popisuje se v publikaci Saiki, R. K. et al., (1988), Science, 239, 487-49) za použití jednořetězcové cDNA, jako templátu, jmenovitě „RT PCR .

Dvouřetězcová cDNA získaná shora popsaným způsobem se pak integrovala do klonovacího vektoru a výsledný rekombinantní vektor se pak může použít k transformaci mikroorganizmu, jako je E. coli. Transformant se může vybrat za použití rezistence na tetracyklin nebo ampicilin. Jestliže se použil mikroorganizmus E. coli, účinná transformace se může provést metodou podle Hanahana (popisuje se v publikaci Hanahan, D., (1983), J. Mol. Biol., 166, 557-580). Rekombinantní vektor se může zavést do kompetentních buněk, které se vystavily působení chloridu vápenatého, chloridu hořečnatého nebo chloridu rubidného. Jestliže se jako vektor použije plazmid, je nezbytné, aby plazmid nesl gen rezistence na určitý lék, jak se popisuje shora v textu. Je možné použít jiný nástroj pro klonování, jako je fág lambda.

Za účelem vybrat transformanty, které nesou cDNA kódující podjednotku protilátky proti proteinu Fas, se mohou použít různé metody, jako například ty, co se popisují shora v textu.

pouzivajíci ·· · ·* · ·· ·· • · · · ♦ · · · · · · ···· · · · · * · • ······· · · · · · · ··· · · · · · · ·· ♦ ·· ··· ·« ····

Když se cDNA specificky amplifikuje shora uvedenou metodou RTPCR, mohou se tyto kroky přeskočit.

(1) Způsob pomoci PCR

Jestliže se ozřejmila celá nebo část aminokyselinové sekvence požadovaného proteinu, pak se syntetizují oba oligonukleotidové primery odpovídající částem aminokyselinové sekvence a používají se při metodě PCR (popisuje se v publikaci Saiki, R. Κ. , et al., (1988), Science, 239, 48749), aby se amplifikoval požadovaný fragment DNA kódující podjednotku lehkého a těžkého řetězce monoklonální protilátky proti lidskému proteinu Fas. Templátovou DNA může být například cDNA syntetizovaná reverzní transkripcí z mRNA hybridomu, který produkuje monoklonální protilátku proti lidskému proteinu Fas HFE7A (FERM BP-5828).

Takto syntetizovaný fragment DNA se může buď přímo integrovat do plazmidového vektoru za použití běžně dostupné sady nebo se může značit například ³²P, ³⁵S nebo biotinem a pak se použije jako sonda pro hybridizaci kolonií nebo plaků, aby se získal požadovaný klon.

Monoklonální protilátka proti proteinu Fas HFE7A se ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu preferuje jako aktivní složka a je jí imunoglobulin Gl (označuje se jako IgGl). Uvedený imunoglobulin obsahuje podjednotku těžkého (řetězec yl) a lehkého řetězce (řetězec κ) . Částečná aminokyselinová sekvence každé podjednotky uvedené shora v textu se může přednostně stanovit izolací každé podjednotky dobře známou metodou, jako je elektroforéza a kolonová chromatografie a sekvenování N-terminální aminokyselinové sekvence každé podjednotky za použití automatického sekvenátoru proteinu (například PPSQ-10, vyrobený firmou Shimadzu Seisakusho, Corp.).

Izolace cDNA kódující každou podjednotku monoklonální protilátky proti proteinu Fas z vhodných tranformantů ♦ » 9 99 99

9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9

999 99 99 9 9 * · · • · ♦ • · · ♦ • · ···· • · · získaných shora v textu se může uskutečnit metodou dobře známou v oboru (Maniatis, T., et al., „Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (1982)). Oblast DNA kódující požadovanou podjednotku se může vystřihnout z plazmidové DNA po separaci frakce odpovídající vektorové DNA z buněk.

(2) Testování za použití syntetické oligonukleotidové sondy

Jestliže se objasnila celá nebo část aminokyselinové sekvence požadovaného proteinu (sekvence se může vyskytovat v libovolné části proteinu a kontinuální aminokyseliny), je specifická a obsahuje mohou se syntetizovat oligonukleotidy odpovídající této sekvenci a mohou se použít jako sonda (po značení s ³²P, ^J3S, biotinem nebo podobně) , která hybridizuj e s DNA pocházející z transformanta, jenž je imobilizovaný na nitrocelulózové membráně, čímž se vyberou pozitivní kmeny. Jako sondu je možné použít jeden oligonukleotid, který se syntetizoval na základě frekvence kodonů v hostiteli, nebo směsi možných oligonukleotidů. V pozdějším případě počet užívaných oligonukleotidů se může redukovat za použití inosinu.

Tímto způsobem získaná DNA se může sekvenovat například chemicky modifikovanou metodou podle Maxama-Gilberta (popisuje se v publikaci Maxam, A. M. and Gilbert., W., (1980) v „Methods in Enzymology 65, 499-576), metodou dideoxyzakončení řetězce (popisuje se v publikaci Messing J., and Vieíra J. (1982) Gene, 19, 269-276) nebo podobně.

V současné době je rozšířené použití automatizovaných sekvenátorů DNA za použití fluorogenního barviva. Těmito přístroji je například sekvenační robot „CATALYST 800 a model DNA sekvenátorů 373 vyrobený firmou Perkin-Elmer Japan, lne..

Použitím systémů, jako jsou ty, které se popisují shora v textu se provede stanovení sekvence DNA účinně a bezpečně. Na základě dat o takto stanovených nukleotidových sekvencích < 0* 00 «· «00*

0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 «00 00 0000 «0 0 00 ·· · 0 0 0 0 0 0 0 0

0 0000 00 0 • « · 0 0 « «0

DNA podle vynálezu a dat o N-terminálních aminokyselinových sekvencích těžkého a lehkého řetězce se může stanovit celá aminokyselinová sekvence těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky podle vynálezu.

Konstrukce mutantu, kde je deletována jedna nebo více aminokyselin v aminokyselinové sekvenci se může uskutečnit například kazetovou mutací (popisuje se v publikaci Toshimitsu Kíshimoto, „Shin-Seikagaku Jikken Kouza 2: Kakusan III Kumikae DNA Gijutsu, „ 242-251).

Takové sekvence DNA se mohou připravit chemickou syntézou za použití běžné metody, jako je metoda používající triester fosfitu (popisuje se v publikaci Hunkapiller, M., et al., (1984), Nátuře, 310, 105-111). V případě každé samotné aminokyseliny jsou známy kodony a specifický kodon požadované aminokyseliny může být vybrán libovolně nebo podle frekvence výskytu daného kodonu v hostiteli. Částečná modifikace nukleotidové sekvence se může provést běžnou metodou, jako je místně specifická mutageneze využívající syntetické oligonukleotidové primery kódující požadované modifikace (Mark, D. F. et al. , (1984), Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666).

Zda DNA může hybridizovat s DNA kódující lehký nebo těžký řetězec monoklonální protilátky proti proteinu Fas, která je výhodná jako aktivní složka farmaceutického prostředku podle vynálezu, se může stanovit například použitím sondy DNA značené (a-³²P)dCTP nebo metodou náhodných primerů (popisuje se v publikaci Feinberg, A. P., and Vogelstein, B. (1983), Anal. Biochem., 132, 6-13), pomocí metody posunu jednořetězcového zlomu (popisuje se v publikaci Maniatis, T., et al., (1982), v „Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) nebo podobným způsobem. Vhodná metoda je následuj ící.

Nejdříve se stanovovaná DNA adsorbuje na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu, aby se například, je-li to nezbytné, • « ···· • · ·« *· ·

9 99

9 9

9 9 9 * 9 9 9

99 999

99 » 9 9

9 9

9999 vystavila působení alkalické látky a pak se fixuje na membránu teplem nebo ozářením UV. Membrána se dále ponoří do prehybridizačního roztoku, který obsahuje 6 x koncentrovaný SSC (1 x koncentrovaný SSC je roztok obsahující 0,15 M NaCl a 0,015 M citrát tri-sodný), 5% (objem/objem) Denhartův roztok a 0,1 % (objem/objem) dodecylsulfát sodný (SDS) a směs se inkubovala při teplotě 55 °C po dobu 4 hodiny nebo déle. Pak se předem připravená sonda přidala do stejného prehybridizačního roztoku v množství, aby se konečná specifická aktivita rovnala 1 x 10⁶ cpm/m, pak následovala inkubace při teplotě 60 °C přes noc. Následně se membrána promyla při teplotě místnosti opakovaně s 6 x koncentrovaným roztokem SSC po dobu 5 minut a dále s 2 x koncentrovaným roztokem SSC po dobu 20 minut a pak se provede autoradiografie.

Použitím shora uvedené metody DNA hybridizovatelná s DNA kódující těžký a lehký řetězec monoklonální protilátky proti Fas, která se preferuje jako aktivní složka farmaceutického prostředku podle vynálezu, se může izolovat z libovolné knihovny cDNA nebo genomové knihovny (popisuje se v publikaci Maniatis, T., et al., (1982), „Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY).

Integrace takto získané DNA do expresívního vektoru umožňuje transformaci prokaryontních nebo eukaryontních hostitelských buněk, což umožňuje exprimovat DNA v hostitelské buňce.

Vhodné prokaryontní hostitelské buňky jsou například mikroorganizmus E. coli, Bacillus subtílis a podobně. Za účelem exprimovat v takových hostitelských buňkách uvedený gen, se mohou tyto hostitelské buňky transformovat plazmidovým vektorem, který obsahuje replikon odvozený z druhů kompatibilních s hostitelem, jmenovitě jde o počátek replikace a promotorovou sekvenci, jako je lac UV5. Tyto vektory přednostně mají sekvence schopné udělit transformované buňce selekční fenotyp. Vhodný kmen mikroorganizmu E. coli je kmen JM109 získaný z organizmu E. coli K12. Vhodné vektory zahrnují pBR322 a série plazmidů pUC. Mohou se dále využívat další známé kmeny a vektory. Vhodné promotory zahrnují promotor tryptofanu (trp), laktózy (lac), tryptofanlaktózy (tac), lipoproteinu (lpp), promotor lambda(λ)PL, který se získal z bakteriofága a promotor elongačního faktoru polypeptidového řetězce Tu (tufB).

Preferovaný kmen mikroorganizmu Bacillus subtílis je kmen 207-25 a preferovaným vektorem je pTUB228 (popisuje se v publikaci Ohmura, K. , et al., (1984), J. Biochem. , 95, 8793). Vhodný promotor je regulační sekvence genu a-amylázy mikroorganizmu Bacillus subtílis. Je-li to nutné, sekvence DNA kódující signál peptidové sekvence α-amylázy může být spojena s DNA podle vynálezu, aby se umožnilo extrabuněčné vylučování.

Eukaryontní hostitelé zahrnují buňky z obratlovců a z kvasinek. Příkladem používaných buněk obratlovců je opičí (popisuje se v publikaci Gluzman, Y., 175-182). Vhodní kvasinkoví buněční pekařské kvasinky (Saccharomyces cerevisiae), methylotrofní kvasinky (Pichia pastoris) a kvasinky Schizosacharomyces pombe. Buňky uvedené shora v textu se v obecném případě používají jako hostitelské buňky.

V obecném případě požadavky na vhodné expresívní vektory v případě buněk obratlovců jsou pak ty, které obsahují: promotor obvykle uložený proti směru exprese genu, který buněčná linie COS-1 (1981), Cell, 23, hostitelé zahrnují se a

exprimuje, místo sestřihu místo

RNA, polyadenylační terminační místo transkripce a počátek replikace, je-li to nutné. Vhodným plazmidem je například pSV2dhfr, obsahující časný promotor SV40 (popisuje se v publikaci Subramani, s., et al., (1981), Mol. Cell., Bio., 1, 854-864).

Vhodné expresívní vektory v případě kvasinek obsahují například promotor genu dehydrogenázy alkoholu (popisuje se například v publikaci Bennetzen, J. L. and Halí, B. D., ··· ·· · ·· β · • · · ···· ···· • « · · ·· · ·· · • · ···· <·· · · · · · » · · ··· · · · ·· · ·· «·· ·· ···· (1982), J. Biol. Chem., 257, 3018-3025) nebo promotor metabolického enzymu galaktózy (například gal 10) (popisuje se v publikaci Ichikawa, K. et al., (1993), Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1686-1690). Jestliže je to nutné sekvence DNA kódující signální peptidovou sekvenci kvasinkového genu může být spojena s DNA, aby se exprimovala za účelem umožnit extrabuněčnou sekreci.

V případě, že se jako hostitelské buňky používají buňky

COS-1, expresívní vektory vhodně obsahují počátek replikace SV40, umožňující anatomickou replikaci, transkripční promotor, transkripční terminační signál a místo sestřihu RNA. Uvedené expresívní vektory se mohou použít k tranformaci buněk COS-1 pomocí libovolné vhodné metody, jako je způsob používající DEAE dextran (popisuje se v publikaci Luthman. H. and Magnusson. G. (1983), Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308), precípitační metoda DNA-fosforečnan vápenatý (popisuje se v publikaci Graham, F. 1. and Van der Eb, A. J. , (1973),

Virology, 52, 456-457) a způsob elektrické pulzní elektroporace (popisuje se v publikaci Neumann, E. et al., (1982), EMBO J. , 1, 841-845). Požadovaný transformant se může získat uvedenými metodami.

Upřednostňuje se, aby buňky COS-1 se společně transfekovaly s dvěma expresívními vektory: jeden obsahující DNA kódující těžký řetězec a druhy obsahující DNA kódující lehký řetězec, za vzniku transformantu, který produkuje rekombinantní protilátku proti proteinu Fas. Způsob produkující rekombinantní protilátku proti proteinu Fas se neomezuje pouze na popsané způsoby. Je také možné například zkonstruovat pouze jeden expresívní vektor obsahující DNA kódující lehký nebo těžký řetězec, který se exprimoval současně, a transfekovat s ním buňky COS-1.

Požadované transformanty získané shora popsanými metodami se mohou kultivovat použitím běžných metod, přičemž rekombinantní protilátka proti proteinu Fas se exprimuje buď gn ······· ·· ♦ z? · · ···· · · · ···· · • · · · · · · · * ·· · · · · · · · · · · · · v buňce nebo mimo buňku. Vhodné kultivační médium zahrnuje různé běžně používaná kultivační média v závislosti na vybraném hostiteli. Vhodné médium pro buňky COS-1 zahrnuje RPMI-1640 a Dulbeccovo modifikované „Eagle médium (DMEM), které se může doplnit, je-li to nutné, fetálním telecím sérem (FCS).

Kultivační teplota při kultivaci transformantu může být libovolná vhodná teplota, která znatelně nesnižuje schopnost buňky syntetizovat protein a je v rozmezí 32 °C až 42 °C, přičemž se upřednostňuje teplota 37 °C. Je-li to nutné, kultivace může být účinná v atmosféře obsahující 1 až 10 % (objem/objem) oxidu uhličitého.

Frakce obsahující protein protilátky proti proteinu Fas produkovaný uvnitř nebo vně buňky transformantu, jak se popisuje shora v textu, se může izolovat a čistit různými metodami separace podle fyzikálních a chemických vlastností proteinu, které jsou známé v oboru. Vhodné specifické metody separace zahrnují: ošetření běžně užívanými pecípitačními činidly vhodnými pro protein, různé metody chromatografie, jako je ultrafiltrace, chromatografie s molekulovým sítem (gelová filtrace), adsorpční chromatografie, chromatografie s výměnou iontů, afinitní chromatografie a HPLC, dialýza a jejich kombinace. Podle metody popsané shora v textu, vysoce čistý rekombinant protilátky proti proteinu Fas se produkuje s vysokým výtěžkem.

Za účelem potvrdit, že rekombinant protilátky proti proteinu Fas připravený shora popsanou metodou se specificky váže na protein Fas, se test ELISA může přednostně provést způsobem podobným způsobu, který se popisuje shora v textu, pro hodnocení titru protilátky u imunizované myši.

Na druhou stranu sloučenina vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu, jako jsou například sloučeniny reprezentované shora uvedenými vzorci I až XIX se mohou produkovat způsobem • « • fc · • · · · · forem zahrnují prášku, syrupu popsaným v literatuře. Je možné stanovit, zda jiné sloučeniny vykazují aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu podle metod, které potvrzují aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu.

Farmaceutický prostředek podle vynálezu obsahující shora uvedené látky jako aktivní složky se může použít jako činidlo vhodné pro profylaxi a/nebo léčbu autoimunního onemocnění nebo revmatoidní artritidy. Takové profylaktické nebo terapeutické činidlo se může aplikovat v různých formách. Příklady takových orální aplikaci tablet, kapsulí, granulí, nebo podobně nebo parenterální aplikaci, aplikaci injekcí, kapačkou, čípky nebo podobně.

Množství protilátky proti lidskému proteinu Fas a dávka látky, která vykazuje aktivitu folátového antagonisty nebo aktivity inhibující dehydrofolátovou reduktázu ve farmaceutickém prostředku podle vynálezu může kolísat v závislosti na aktivitě obsažené v každé protilátce nebo v každé používané látce. V případě, že protilátka CH11 nebo HFE7A se používá jako protilátka proti lidskému proteinu Fas a methotrexát se používá jako látka, která vykazuje aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu, je výhodné, že farmaceutický prostředek podle vynálezu se připraví jako roztok obsahující 0,1 až 100 ng/ml CH11 nebo HFE7A a 0,05 až 5 nM methotrexátu.

Dávka bude kolísat v závislosti na faktorech, jako jsou stav, věk a tělesná hmotnost pacienta, ale obvykle se může aplikovat v množství od 0,1 mg do 1 000 mg v jedné dávce, jako množství protilátky proti lidskému proteinu Fas subkutánní, intramuskulární nebo intravenózní injekcí.

Úspěšnost léčby autoimunního onemocnění nebo revmatické artritidy farmaceutického prostředku podle vynálezu se může kontrolovat kultivací buněk (například zásobního roztoku lidských lymfocytů HPB-ALL) (popisuje se v publikaci Morikawa,

S., et al., (1978) Int. J. Cancer 21, 166-170), Jurkatových buněk (American Type Culture č. TIB-152), synoviálních buněk, které pocházejí z pacienta trpícího revmatickou artritidou nebo podobně) v kultivačním médiu, do kterého se přidal farmaceutický prostředek, a stanovila se jejich schopnost přežít pomocí testů, jako je MTT (popisuje se v publikaci Green, L. M., et al. (1984) J. Immunological Methods 70, 257268) nebo test XTT, který se popisuje v sekci příkladů. Farmaceutický prostředek podle vynálezu může zahrnovat apoptózu samo reaktivních lymfocytů, což je jeden z hlavních případů autoimunního onemocnění. V synoviálních buňkách, které abnormálně proliferují v částech poznamenaných revmatoidní artritidou, přičemž se může aplikovat nižší dávka protilátky proti proteinu Fas ve srovnání s případem, kde se aplikuje pouze samotná protilátka proti proteinu Fas. V přihlášce evropského patentu č. 0 obsahující protilátku se uvádí, proteinu že prostředek Fas účinný

909 816 proti v experimentech, kde se používají shora uvedené kultivované buňky, je také účinný při léčbě autoimunního onemocnění a revmatoidní artritidy ve zvířecím modelu.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je graf zobrazující synergický účinek monoklonální protilátky proti lidskému proteinu Fas CH11 a methotrexátu při vyvolání apoptózy v buňkách.

Na obrázku č. 2 je graf zobrazující synergický účinek monoklonální protilátky proti lidskému proteinu Fas HFE7A a methotrexátu při vyvolání apoptózy v buňkách.

Na obrázku č. 3 je graf vykazující schopnost buněk přežít v přítomnosti methotrexátu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Jako protilátka proti proteinu Fas se použila monoklonální protilátka proti lidskému proteinu Fas HFE7A nebo CHll (vyrobená Igaku eseibutsugaku kenkzusho K. K.) popsaná v přihlášce evropského patentu č. 0 909 816.

Zásobní roztok lidských lymfocytů HPB-ALL (popsaný v publikaci Morikawa, S., et al., (1978 Int. J. Cancer 21, 166-170) se kultivoval v kultivačním médiu RPMI 1640, které obsahuje 10% FCS (vyrobeno firmou Gibco B. R. L. Corporation) při teplotě 37 °C v přítomnosti 5% plynného oxidu uhličitého po dobu tří dnů a 50 μΐ kultury (2,5 x 10⁵ buněk v 50 μί) se přeneslo do každé prohlubně mikrotitrační destičky s 96 prohlubněmi (vyrobeno firmou Sumitomo Bakelite Co., Ltd.). Pak se přidalo 50 μΐ kultivačního média RPMI obsahující methotrexát (vyrobeno firmou Sigma Chemical Company) a do každé prohlubně se přidala protilátka proti proteinu Fas (CHll nebo HFE7A, 0,001 mg/ml roztoku se třikrát sériově ředilo) a destičky se inkubovaly při teplotě 37 °C.

Buňky v prohlubních na destičce, kam se přidala protilátka CHll, se udržovaly při teplotě 37 °C přes noc. Na druhé straně buňky na destičce, ke kterým se přidala protilátka HFE7A, se po kultivaci po dobu jedné hodiny, promyly kultivačním médiem RPMI a pak se do jedné prohlubně přidalo 100 μΐ kultivačního média RPMI, které obsahuje 1 μρ/ιηΐ protilátky proti myšímu IgG (vyrobeno firmou Biosource Corporation). Buňky se kultivovaly při teplotě 37 °C po dobu jedné hodiny a pak se promyly kultivačním médiem RPMI, které neobsahuje sérum. Pak se do každé prohlubně přidalo 100 μΐ kultivačního média RPMI, které obsahuje 0,05 nM methotrexátu, a buňky se kultivovaly při teplotě 37 °C přes noc. Pak se do každé prohlubně přidalo 50 μΐ 25 μΜ PMS (methosulfát fenazinu, Sigma Chemical Company), které obsahuje 1 mg/ml XTT (2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)2H-tetrazolium-5-karboxyanilid zwitterion, Sigma Chemical

Company) (konečná koncentrace: 250 μρ/ιηΐ jako v případě XTT a 5 • · · · · ·· · · · · ···· · · · ·· · • ······· · · · · · · μΜ jako v případě PMS) . Destička se pak inkubovala po dobu 3 hodin při teplotě 37 °C a v každé prohlubni se měřila absorbance při vlnové délce 450 nm, aby se mohla vypočítat schopnost buněk přežít, přičemž se jako index použila redukční schopnost mitochondrií.

Schopnost buněk přežít se vypočítala pro každou prohlubeň podle následující rovnice:

schopnost přežít (%) = 100 x (a-b)/(c-b), kde symbol „a” je absorbance testované prohlubně, symbol „b je absorbance prohlubně, která neobsahovala buňky a symbol „c je absorbance prohlubně, kam se nepřidala žádná protilátka.

Jako výsledek je zřejmé, že aktivita vyvolávající apoptózu protilátky CH11 byla podstatně zvýšena přidáním 0,05 nM methotrexátu nebo vyšší koncentrací (zobrazeno na obrázku č. 1, kde zkratka „MTX reprezentuje methotrexát) . Aktivita protilátky HFE7A vyvolat apoptózu se také zvýšila přidáním 0,05 nM methotrexátu (popisuje se na obr. č. 2) . Když se nepřidaly protilátky proti proteinu Fas, ale přidal se pouze methotrexát, neprokázala se skoro žádná změna ve schopnosti buněk přežít (popisuje se na obr. č. 3).

Ukázalo se, že aktivita protilátky proti proteinu Fas vyvolávající apoptózu se znovu zesílila přidáním methotrexátu a počet buněk, které mohou způsobit autoimunní onemocnění se může redukovat nižší dávkou protilátka proti proteinu Fas ve srovnání s běžnými metodami.

Činidlo pro profylaxi a/nebo léčbu podle vynálezu se může použít ve formě ampule sterilního roztoku nebo suspenze, která obsahuje protilátku proti lidskému proteinu Fas a látku vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu ve vodě nebo v jiném farmaceuticky přijatelném roztoku. Specificky například 0,5 mg protilátky proti lidskému proteinu Fas a methotrexát (konečná • ♦ koncentrace 0,05 nM) se rozpustilo v jednom litru vody, přičemž se vytvořil roztok vhodný pro zavedení injekcí, který se sterilně naplnil do ampulí a ty se zatavily.

V jiném případě se může sterilní prášek (přednostně připravený lyofilizací protilátky proti lidskému proteinu Fas a látky, která vykazuje aktivitu folátového antagonisty nebo aktivity folátového antagonisty nebo aktivity inhibující dihydrofolátovou reduktázu) naplnit do ampulí, které se mohou ředit těsně před použitím farmaceuticky přijatelným roztokem.

Průmyslová využitelnost

Jak se popisuje shora v textu, vynález popisuje farmaceutický prostředek použitelný jako činidlo pro profylaxi a/nebo léčbu autoimunního onemocnění nebo revmatické artritidy. V souladu s vynálezem používané množství protilátka proti proteinu Fas může být sníženo použitím látky, která vykazuje aktivitu folátového antagonisty nebo aktivity inhibující dihydrofolátovou reduktázu spolu s protilátkou proti proteinu Fas. Čímž se snižuje možnost, že se pacient stává tolerantní vůči protilátce proti proteinu Fas, jako výsledek produkce protilátek proti protilátce proti proteinu Fas v těle pacienta. Proto je farmaceutický prostředek podle vynálezu použitelný jako excelentní činidlo při profylaxi a/nebo léčbě autoimunního onemocnění nebo revmatické artritidy, které je možné používat po dlouhou dobu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický se tím, prostředek, vyznačuj ící ž e zahrnuje jako aktivní složky protilátku proti lidskému proteinu vyvolávající apoptózu, a folátového antagonísty

Fas, která vykazuje aktivitu látku, která vykazuje aktivitu nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu, přičemž relativní množství uvedených aktivních složek je takové, že vykazují současně působící aktivitu vyvolávající apoptózu.

Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka CH11, HFE7A nebo jejich humanizované protilátky.

Farmaceutický prostředek podle nároku 1 nebo
2, vyznačující se tím, že protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální humanizovaná protilátka. Farmaceutický prostředek vyznačuj ící protilátka CH11 nebo její podle se tím, lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka proti lidskému proteinu Fas HFE7A produkovaná hybridomem myš-myš HFE7A (FERM BP5828) nebo její humanizovaná potilátka.

Farmaceutický prostředek podle libovolného nároku 1 až 4, vyznačující se tím, že látka, která vykazuje aktivitu folátového antagonísty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu se vybrala ze skupiny obsahující methotrexát, edatrexát, epiroprim, iometrexol, pyritrexim, trimetrexát, brodimoprim, MX-68, N-[4-[
3-(2,
4nároku 1 nebo 2, ž e protilátka proti • 9

9 9 9

9 9 9 9

9 9 9 9 9

9 99999 9 9

99 9 9

-diamino-6,7-dihydro-
5H--cyklopenta[d]pyrimidin-5-yl)propyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N-[[5-[2-(2-amino-1,4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxopyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl) ethyl]-2-thienyl]karbonyl]-L-glutamovou kyselinu, (R)-N—[[5—[2 — (2-amino-l, 4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxopyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl]ethyl]-2-thienyl]karbonyl]-L-glutamovou kyselinu, N-((2,4-diamino-3,4,5,6,7,8-hexahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl)ethyl)-2-thienyl-karbonyl-L-glutamovou kyselinu, (S) -2-[[[4-karboxy-4-[[4-[[ (2,4-diamino-6-pteridinyl) methyl]amino]benzoyl]amino]butyl]amino]karbonyl]benzoovou kyselinu, N-[4-[3[ (2,4-diamino-lH-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) propyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, 2,4-diamino-6-(N-(4-(fenylsulfonyl)benzyl)methylamino)chinazolin, 2,4-diamino-5-[4-[3- (4-amíno-f enyl-4-sulf onylf enyl amino) propoxy]-3,5-dímethoxybenzyljpyrimidin, N-[4-[4- (2,4-diamino-5-pyrimidinyl) butyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N-[4-[3-(2,4-diamino-5-pyrimidinyl)propyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N-[4-[2- (2,4-diamino-6-pteridinyl) ethyl]benzoyl]-4-methylen-DL-glutamovou kyselinu a diamidchlorid N-(1-methylethyl)-N' -[3- (2,4,5-trichlorofenoxy) propoxyjimidodikarbonimidu (PS15) .
6. Farmaceutický prostředek podle libovolného z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že látka vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu je methotrexát.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka CHll, HFE7A nebo jejich humanizovaná protilátka a látka vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu je methotrexát.

• « • · · ·» • ♦ · · * · • · · · · · • ······· · • · · · · ·· · ·· ·
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 1 ve formě roztoku, vyznačující se tím, že protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka CHll, HFE7A nebo jejich humanizovaná protilátka v koncentraci 0,1 až 100 ng/ml a látka vykazující aktivitu anatgonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu je methotrexát v koncentraci 0,05 až 5 nM.
9. Použití protilátky proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu a látky vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu při výrobě léčivého přípravku vykazujícího aktivitu vyvolávající apoptózu, přičemž relativní množství uvedených aktivních složek je takové, že vykazují současně působící aktivitu vyvolávající apoptózu.
10. Použití podle nároku 9, kde protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazuje aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka CHll, HFE7A nebo jejich humanizovaná protilátka.
11. Použití podle nároku 9 nebo 10, kde protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka CHll nebo její humanizovaná protilátka.
12. Použití podle nároku 9 nebo 10, kde protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka proti lidskému proteinu Fas HFE7A produkovaná hybridomem myš-myš HFE7A (FERM BP5828) nebo jejich humanizovaná protilátka.
13. Použití podle libovolného z nároků 9 až 12, kde látka vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu se vybrala ze skupiny, která zahrnuje methotrexát, edatrexát, epiroprim, iometrexol, pyritrexim, trimetrexát, brodimoprim, MX-68, ·♦ * ·· • · · · · · • · · » · * • · 4444 4 · · • 4 4 4 4

N-[4-[3- (2, 4-diamino-6, 7-dihydro-5H-cyklopenta[d]pyrimidin-5-yl) propyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N-[[5-[2-(2-amino-l, 4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxopyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl) ethyl]-2-thienyl]karbonyl]-L-glutamovou kyselinu, (R)-N—[[5—[2 — (2-amino-l, 4,5,6,7,8-hexahydro-4-oxopyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl]ethyl]-2-thienyl]karbonyl]-L-glutamovou kyselinu, N-((2,4-diamino-3,4,5,6,7,8-hexahydropyrido[2,3-d]pyrimidin-6-yl)ethyl)-2-thienyl-karbonyl-L-glutamovou kyselinu, (S) -2-[[[4-karboxy-4-[[4-[[ (2,4-diamino-6-pteridinyl) methyl]amino]benzoyl]amino]butyl]amino]karbonyl]benzoovou kyselinu, N-[4-[3- (2,4-diamino-lH-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-5-yl) propyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, 2,4-diamino-6-(N-(4-(fenyl-sulfonyl)benzyl)methylamino)chinazolin, 2,4-diamino-5-[4-[3-(4-amino-fenyl-4-sulfonylfenylamino)propoxy]-3, 5-dimethoxybenzyl]pyrimidin, N-[4-[4- (2,4-diamino-5-pyrimidinyl) butyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N-[4-[3-(2,4-díamino-5-pyrimidinyl)propyl]benzoyl]-L-glutamovou kyselinu, N-[4-[2- (2,4-diamino-6-pteridinyl) ethyl]benzoyl]-4-methylen-DL-glutamovou kyselinu a diamidchlorid N-(1-methylethyl) -N'[3- (2,4,5-trichlorofenoxy)propoxy]imidodikarbonimidu (PS15).
14. Použití podle libovolného z nároků 9 až 13, kde látka vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu je methotrexát.
15. Použití podle nároku 9, kde protilátka proti lidskému proteinu Fas vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je protilátka CHll, HFE7A nebo jejich a látka nebo dihydrofolátovou reduktázu je methotrexát.
16. Použití podle nároku 9, kde léčivý přípravek je ve formě roztoku, ve kterém protilátka proti lidskému proteinu Fas monoklonální humanizovaná folátového vykazující aktivitu aktivitu inhibující protilátka antagonisty *« * *« • · · · * · • · · · · · • ·····♦· · » · · · * ·« · ·· · ·· ·« • » 4 • 9 • · • · · ·» ···· vykazující aktivitu vyvolávající apoptózu je monoklonální protilátka CH11, HFE7A nebo jejich humanizovaná protilátka v koncentraci 0,1 až 100 ng/ml, a látka vykazující aktivitu folátového antagonisty nebo aktivitu inhibující dihydrofolátovou reduktázu je methotrexát v koncentraci 0,05 až 5 nM.

Použití podle libovolného z nároků 9 až 16, kde uvedený léčivý přípravek je vhodný pro použití při profylaxi a/nebo léčbě autoimunního onemocnění nebo revmatoidní artritidy.