CZ20014444A3 - Protein Akt pro pouľití k indukci exprese VEGF - Google Patents

Description

Protein Akt pro použití k indukci exprese VEGF

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká proteinu Akt pro použití k indukci exprese VEGF a přípravků pro vyvolání terapeutické angiogeneze. Konkrétně se týká indukce exprese VEGF (růstového faktoru vaskulárního endotelu) pomocí serin/threoninové proteinkinázy Akt. Farmaceutický přípravek podle vynálezu obsahuje nukleovou kyseliny kódující protein Akt.

Dosavadní stav techniky

Angiogeneze

Angiogeneze je biologický proces, který vede k vývoji nových krevních cév. Tento proces zahrnuje různé typy interakcí buňka-buňka, buňka-matrix a buňka-cytokin (Melillo et al., 1997, Cardiovascular Research 35:480-489; Lewis et al., 1997, Cardiovascular Research 35:490-497). Vytváření nové cévní (vaskulární) sítě v dospělém organismu je velmi vzácné. Avšak nové cévy se objevují při určitých patologických stavech jako je např. ischémie, záněty, hojení poranění, růst nádoru, diabetická retinopatie, revmatoidní artritida, psoriáza a chronická poranění.

Terapeutická angiogeneze zahrnuje záměrnou stimulaci vývoje nových krevních cév pomocí vhodných angiogenních růstových faktorů. Terapeutickou angiogenezi lze využít k léčení různých ischemických stavů nebo k podpoře léčení poranění. Různé ischemické stavy postihují srdce, dolní končetiny, kožní laloky, periferní nervy, kosti nebo štěpy • * (transplantáty). K typickým ischemickým onemocněním patří cerebrovaskulární ischémie, renální ischémie, pulmonární ischémie, ischémie končetin, onemocnění periferních artérií, intermitentní klaudikace (přerušované kulhání při bolesti v lýtkových svalech), ischemická kardiomyopatie a ischémie myokardu (viz také WO 97/14307).

Bylo ukázáno, že různé faktory projevují angiogenní aktivitu. K takovým faktorům patří např. bazický a kyselý růstový faktor fibroblastů (bFGF a aFGF), FGF-5 (Patent US č. 5,661,13 3), růstový faktor endotelových buněk (Pu et al., 1993, Circulation 88:208-2156), angiopoetin a VEGF (viz přehledné články Melillo et al., 1997 a Lewis et al., 1997).

Angiogeneze se považuje za nezbytný předpoklad pro růst a perzistenci solidních tumorů a jejich metastáz (Patent US č. 5,854,205). Pro stimulaci angiogeneze tumory zesilují (upregulate) produkci různých angiogenních faktorů, včetně VEGF.

VEGF

Růstové faktory buněk vaskulárního endotelu (Vascular endothelial cell growth factor, VEGF) představují skupinu angiogenních polypeptidů, které jsou členy proteinové růstových faktorů pocházejících z destiček (platelet-derived growth factors). Tyto proteiny jsou glykosylované kationtové dimery s molekulovou hmotností přibližně 4:6 až 48 kDa. NA rozdíl od ostatních angiogenních faktorů VEGF obsahuje přirozenou signální sekvenci, která umožňuje sekreci tohoto faktoru z intaktních buněk. K alternativním jménům VEGF patří také označení faktor cévní permeability (vascular permeability factor, VPF) a růstový faktor indukovaný c-fos (c-fos induced growth, FIGF).

·· ·· • · ·

Byly identifikovány různé formy VEGF, např VEGF121 (Patent US č. 5,219,739), VEGFi₆₅ (Patent US č. 5,332,672), VEGFi₈₉ (Patent US č. 5,240,848), VEGF₂₀₆, VEGF-2 (WO 95/24473; WO 96/39515), VEGF-B (Patenty US č. 5,607,918 a 5,840,693), a VEGF-D (WO 97/12972) . Bylo ukázáno, že různé formy VEGF jsou mitogenní pro buňky cévního endotelu a podporují vytváření kolaterálních krevních cév a průtok krve v ischemické tkáni.

Bylo ukázáno, že ionty přechodných kovů, jako např. CoCl₂, zvyšují expresi genu VEGF a stimulují vaskularizaci (Patent US č. 5,480,975).

Akt

Proteiny Akt jsou serin/threonin proteinkinázy, které se podílejí na apoptóze (programované buněčné smrti). Nedávno byly zkoumány dvě intracelulární signální dráhy zúčastněné v regulací přežívání/smrti buněk. Aktivace kinázy 1 stimulující apoptózu (ASK1) vede k apoptóze buněk různých typů (Ichijo et al. 1997), zatímco signální dráha zahrnující fosfoinositidyl-3-kinázu (PI3K) a Akt vede k ochraně buněk (cytoprotekci). Bylo ukázáno, že aktivita ASK1 je indukována nádorovým nekrotickým faktorem alfa (TNFa) nebo ligací Fas (Ichijo et al. 1997, Chang et al. 1998). Nadměrná exprese (overexpression) ASK1 dominantní negativní mutanty inhibuje apoptózu indukovanou TNFa nebo ligací Fas, což ukazuje, že ASKl hraje významnou roli při apoptickém odumírání buněk indukovaném TNFa nebo ligací Fas. Molekulární mechanismy, kterými ASKl indukuje apoptózu, však nejsou známy. Bylo ukázáno, že ektopická exprese ASKl vede k aktivaci různých stresem aktivovaných signálních drah, jako jsou např. dráhy MKK4/JNK a MKK6/p38, které zřejmě zprostředkovávají ASKl-indukovanou apoptózu (Ichijo et al. 1997).

Dráha PI3K/Akt se zdá být důležitá pro regulaci přežívání/smrti buněk (Kulík et al. Franke et al 1997, Kauffmann-Zeh et al, Hemmings 1997. Dudek et al. 1997).

Faktory pro přežívání buněk, jako je růstový faktor destiček (platelet derived growth factor, PDGF), nervový růstový faktor („nerve growth factor, NGF) a inzulínu podobný růstový faktor 1 („insulin-like growth factor 1, IGF-1), podporují přežívání buněk za různých podmínek tím, že indukují aktivitu PI3K (Kulík et al. 1997, Hemmings 1997). Aktivce PI3K vede k tvorbě fosfatidylinositol-(3,4,5)-trifosfátu (Ptdlns(3,4,5)P3), který se váže na a indukuje aktivitu serin/threonin kinázy Akt obsahující AH/PH doménu (Franke et al. 1995,

Hemmings 1997b, Downward 1998, Alessi et al. 1996). Specifické inhibitory PI3K nebo dominantní negativní Akt mutanty ruší přežívání podporující aktivitu těchto růstových faktorů nebo cytokinů. Navíc vnesení konstitutivně aktivní PI3K nebo Akt mutace podporuje přežívání buněk v podmínkách, za kterých by normálně buňky podlehly apoptotické smrti (Kulík et al. 1997, Dudek et al. 1997). Tato pozorování ukazují, že signální dráha PI3K/Akt má významnou úlohu v regulaci přežívání buněk a apoptózy.

Byly identifikovány dvě isoformy humánní proteinkinázy Akt, Aktl a Akt2, popsané v odborné literatuře (Staal, 1987). Třetí forma humánní Akt, označená jako Akt3, byla popsána v prozatímní patentové přihlášce US č. 60/125,108. Ještě další isoforma Akt byla popsána v Nakatani et al. , 1999 (Biochem. Biophys. Res. Comm. 257, 906-910) . Byla také identifikována Akt sekvence laboratorního potkana (Konishi et al. 1995).

Serin-473 na C-konci humánního Aktl je kritický pro jeho regulaci (Stokeo et al. 1997; Stephens et al. 1998). Po stimulaci růstovým faktorem je aktivován PI3K. Produkt PI3K, Ptdlns (3,4,5)-P, váže Aktl, a způsobuje translokaci Aktl cytoplazmy do blízkosti vnitřní cytoplazmatické membrány, kde je fosforylován na zbytcích Thr308 a Ser473 (Downward, 1998) . Fosforylace těchto aminokyselinových zbytků je kritická pro aktivaci Aktl. Bylo ukázáno, že nedávno identifikovaná proteinkináza PDK1 je zodpovědná za fosforylaci Thr308, zatímco kináza (případně kinázy) zodpovědná za fosforylaci Ser473 nebyla dosud identifikována (Stokeo et al. 1997,

Stephens et al. 1998).

Genová terapie

Genová terapie v podstatě znamená, že nedostatky nebo abnormality (mutace, chybná exprese apod.) se napravují tím, že se do pacienta vnese nová genetická informace, konkrétně např. do nemocí zasaženého orgánu nebo tkáně pacienta. Tato genetická informace se vnáší buďto in vitro do buněk a tyto modifikované buňky se pak zpětně vracejí do těla pacienta, a nebo na vhodném místě přímo in vivo. V odborné literatuře byly popsány různé techniky transfekce buněk a přenosu genů (viz např. Roemer a Friedman, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211) , zahrnující transfekci nahé DNA, a různé techniky přenosu komplexů DNA a DEAE-dextranu (Pagano et al., J.Virol. 1 (1967) 891), DNA a jaderných proteinů (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), DNA a lipidů (Felgner et al., PNAS 84 (1987)

7413), využití liposomů (Fraley et al., J.Biol.Chem. 255 (1980) 10431) a další metody. Nedávno se objevila nová slibná alternativa pro techniku fyzikální transfekce, a sice využití virů jakožto vektorů pro přenos genů. Byly testovány různé druhy virů, např. retroviry, herpetické viry, adeno-asociované viry a adenoviry, zda mají schopnost infikovat určité buněčné populace.

Byla navržena genová terapie angiogeneze specificky užívající sekvence kódující VEGF (Melillo et al., 1997; Lewis et al. , 1997). Intraarteriální nebo intramuskulární podávání plazmud obsahujícího cDNA pro VEGF3.65 zvyšovalo kolaterální průtok krve u modelu králíků s ischemií zadních končetin (Tsurumi et al. , 1996, Circulation 94:3281-3290; Takeshita et al. , 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun. 227:628-635).

Plazmidy obsahující cDNA pro humánní VEGF121, VEGFi₆₅ a VEGF₁₈₉ projevují také angiogenní aktivitu na tomto modelu, jak ukázaly Takeshita et al., 1996, Lab. Invest. 75:487-501; a

WO 97/14307). Podobně také replikačně defektní adenoviry, které obsahovaly sekvenci kódující VEGF₁₆s indukovaly neovaskularizaci u myší (Muhlhauser et al., 1995, Circ. Res.

77: 1077-1086). U lidí plazmidy obsahující sekvenci pro VEGF₁₆₅ indukovaly angiogenezi v ischemických končetinách (Isner et al. , 1996, Lancet 348: 370-374) a v poškozeném srdci (viz

Time, January 1 1, 1999, pp. 68-73).

Předkládaný vynález se týká alternativních způsobů stimulace angiogeneze k přímému podávání sekvence kódující VEGF. Konkrétně původce neočekávaně zjistil, že produkce VEGF je indukována proteinem Akt. Takže předkládaný vynález se týká stimulace exprese VEGF v buňkách tím, že se do buněk vnese protein Akt. Výhodně se jedná o buňky přítomné v pacientovi trpícím ischemickou chorobou, přičemž výsledkem je prospěšné vytváření kolaterálních krevních cév.

Publikace, které jsou citovány v předkládané přihlášce, nepředstavují automaticky dosavadní stav techniky.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobů a přípravků pro stimulaci exprese VEGF v buňkách. Konkrétně je vynález založen na tom, že původce neočekávaně zjistil, že protein Akt je schopen stimulovat expresi VEGF v buňkách. Výhodně se jedná o buňky přítomné v pacientovi trpícím ischemickou chorobou, přičemž výsledkem je prospěšné vytváření kolaterálních krevních cév.

První předmět vynálezu se týká způsobů indukce exprese VEGF tím, že se do buňky podává protein Akt. Přitom to může být jakýkoliv protein Akt. Výhodně jde o humánní protein Akt. Výhodněji je to humánní protein Aktl, Akt2 nebo Akt3.

VEGF, který se tvoří po podání proteinu Akt je jakákoliv forma VEGF, která je schopná stimulovat angiogenezi. Výhodné formy VEGF jsou VEGF_i21, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆ , VEGF-2, VEGF-B nebo VEGF-D.

Jeden aspekt vynálezu se týká podávání proteinu Akt do buněk. Ve výhodném provedení se nukleová kyselina kódující protein Akt, operativně spojená s kontrolní expresní sekvencí, podá do buňky. Tato nukleová kyselina je částí plazmidového nebo virového vektoru. K výhodným virovým vektorům patří retroviry, adenoviry, adeno-asociované viry, herpetické viry a virus vakcínie.

Protein Akt nebo nukleová kyselina kódující protein Akt se mohou podávat samotné nebo v kombinaci s ionty přechodných kovů nebo s vasodilatačními činidly. Protein Akt nebo nukleová kyselina kódující protein Akt se také mohou podávat společně s nukleovou kyselinou kódující druhý angiogenní faktor operativně spojenou s kontrolní expresní sekvencí. K výhodným angiogenním faktorům patří VEGF, bazický a kyselý růstový faktor fibroblastů, růstový faktor endotelových buněk a angiopoetin. Podle jiného aspektu vynálezu se do buňky podává více než jeden protein Akt.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu indukce exprese VEGF v buňkách u pacienta trpícího ischemickou nemocí tím, že se mu podává protein Akt. Ischemická nemoc je např.

• · · · · cerebrovaskulární ischémie, renální ischémie, pulmonární ischémie, ischémie končetin, ischémie myokardu a ischemická, idiopatická nebo hypertrofická kardiomyopatie.

Protein Akt může být jakýkoliv protein Akt. Výhodně jde o humánní protein Aktl, Akt2 nebo Akt3.

VEGF, který se tvoří po podání proteinu Akt je jakákoliv forma VEGF, která je schopná stimulovat angiogenezi. Výhodné formy VEGF jsou VEGF₁₂i, VEGF₁₆₅, VEGFi₈₉, VEGF₂₀₆ , VEGF-2, VEGF-B nebo VEGF-D.

Jeden aspekt vynálezu se týká podávání proteinu Akt pacientovi. Ve výhodném provedení se pacientovi podává nukleová kyselina kódující protein Akt, operativně spojená s kontrolní expresní sekvencí. Tato nukleová kyselina je částí plazmidového nebo virového vektoru. K výhodným virovým vektorům patří retroviry, adenoviry, adeno-asociované viry, herpetické viry a virus vakcínie. Výhodné provedení vynálezu se týká podávání nukleové kyseliny kódující protein Akt přímo do srdeční tkáně transprikardiální chirurgickou cestou nebo perkutánním podáním pomocí katetru.

Protein Akt nebo nukleová kyselina kódující protein Akt se mohou pacientovi podávat samotné nebo v kombinaci s ionty přechodných kovů nebo s vasodilatačními činidly. Protein Akt nebo nukleová kyselina kódující protein Akt se také mohou podávat společně s nukleovou kyselinou kódující druhý angiogenní faktor operativně spojenou s kontrolní expresní sekvencí. K výhodným angiogenním faktorům patří VEGF, bazický a kyselý růstový faktor fibroblastů, růstový faktor endotelových buněk a angiopoetin. Podle jiného aspektu vynálezu se pacientovi podává více než jeden protein Akt.

Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických přípravků, které obsahují nukleovou kyselinu kódující protein Akt, přechodný kov a/nebo vazodilatační činidlo a farmaceuticky přijatelné vehikulum. Nukleová kyselina je částí plazmidového nebo virového vektoru. K výhodným virovým vektorům patří retroviry, adenoviry, adeno-asociované viry, herpetické viry a virus vakcínie.

Další aspekt vynálezu se týká inhibice angiogenze u pacienta trpícího nádorovým onemocněním, a sice tím, že se inhibuje aktivita Akt, čímž se inhibuje tvorba VEGF. Hladina Akt se může snížit vnesením Akt antisense nukleových kyselin do buněk pacienta v podmínkách, kdy tyto antisense nukleové kyseliny hybridizují v buňkách s Akt mRNA. Hladina Akt může být také snížena vnesením intracelulárního vazebného proteinu, jako je např. jednořetězcová protilátka Fv (scFv), který se specificky váže na Akt v buňkách pacienta v množství dostatečném k tomu, aby se navázal na Akt a inaktivoval ho. V ještě dalším provedení vynálezu je aktivita Akt snížena tím, že se podává nukleová kyselina kódující dominantní negativní formu Akt. Výhodně antisense nukleová kyselina, intracelulární vazebný protein nebo nukleová kyselina kódující intracelulární vazebný protein nebo dominantní negativní formu Akt jsou podány přímo do buněk nádoru.

Popis obrázků

Obr. 1: Konstrukce aktivované mutanty Akt3

Obr. 1A: Schéma představující aktivovaný Akt3: úplná sekvence kódující humánní Akt3 byla fúzována ve shodném čtecím rámci s myrystylační signální sekvencí z humánního genu Src (Myr) na N-konci a dále byla fúzována ve shodném čtecím rámci se značkou HA (HA-tag) na C- konci (viz příklady).

Obr. 1B: Ektopická exprese aktivovaného Akt3 v buňkách HEK293. Buňky HEK293 byly transfekovány buďto samotným • ♦· ·· · ··· · ♦ ··· • · * · · • · · · · · • · · · · ·«·»·«· ·· ··· expresním plazmidem CMV6-MyrAkt3HA nebo (CMV6). 24 hodin po transfekci byly připraveny buněčné lyzáty a byly provedeny imunobloty (imunopřenosy) s protilátkami a-HA.

Obr. 1C: Aktivovaný Akt3 má Akt aktivitu. Buňky HEK2 93 byly transfekovány expresním plazmidem pro aktivovaný Akt3 (MyrAkt3HA) nebo samotným expresním vektorem (CMV6). 24 hodin po transfekci byly připraveny buněčné lyzáty a byla provedena imunoprecipitace s protilátkami anti-HA. Aktivita kinázy Akt3 v imunopeletech byla měřena pomocí substrátového peptidu získaného z GSK3. Bkgd: základní (background) hladina pro netransfekované buňky, CMV6: buňky transfekované CMV6, Akt3cak: buňky transfekované expresním plazmidem pro konstitutivně aktivovaný Akt3 (CMV6-MyrAkt3HA). (viz příklady).

Obr. 2: Akt zvyšuje sekreci VEGF-165 z buněk HeLa

HeLa buňky byly transfekovány expresním plazmidem pro aktivovaný myší Aktl (Aktl), aktivovaný humánní Akt 3 (Akt3) nebo samotným vektorem CMV6. Jedne den po transfekci byly buňky přeneseny do málo mitogenního média (DMEM-0,5%FBS). Po 16 hodinách bylo kultivační médium odebráno a byl proveden VEGF ELISA test. Dráha A: buňky (na 6-jamkových kultivačních miskách) byly transfekovány 0,4 gg DNA vektoru CMV6; dráha Aktl: buňky (na 6-jamkových kultivačních miskách) byly transfekovány 0,4 gg expresního plazmidu CMV6mAktlcak, dráha Akt3: buňky (na 6-jamkových kultivačních miskách) byly transfekovány expresním plazmidem pro aktivovaný humánní Akt3 (Akt3).

Obr. 3: Akt zvyšuje expresi VEGF-165 v humánního buňkách hladkého svalstva koronární artérie a buňkách kosterního svalstva • · · · • · • · • · • ♦ · · · «

Obr. 3A: Buňky humánního kosterního svalstva (HSKMCs) byly infikovány rekombinantním adenovirem pro zelený fluoreskující protein (AV-GFP), konstitutivně aktivní myší Aktl (AVmAktl cak) nebo konstitutivně aktivní humánní Akt3 (AV-hAkt3cak) v koncentraci 3 x 10⁸ VP/ml přen noc (VP: virové částice). Jeden den po infekci bylo odebráno médium a byla změřena hladina VEGF pomocí testu ELISA.

Obr. 3B: Buňky humánního koronárního hladkého svalstva (HCASMCs) byly infikovány AV-GFP, AVmAktlcak, AV-hAkt3cak v koncentraci 3 x 10⁸ VP/ml přen noc. Jeden den po infekci bylo odebráno médium a byla změřena hladina VEGF pomocí testu ELISA pro humánní VEGF.

Obr. 3C: HCASMCs byly infikovány uvedenými vir yv koncentraci 3 x 10⁸ VP/ml přes noc. Jako kontrola byly neinfikované buňky přeneseny do hypoxických podmínek. Po jednom dni byla z těchto buněk izolována celková RNA a exprese VEGF byla detekována Northernovým přenosem (Northern blot).

Obr. 4: Akt zvyšuje expresi VEGF v kardiomyocytech potkanů

Neonatální kardiomyocyty byly infikovány rekombinantním adenovirem pro zelený fluoreskující protein (AV-GFP), konstitutivně aktivní myší Aktl (AV-mAktlcak) nebo konstitutivně aktivní humánní Akt3 (AV-hAkt3cak) v koncentraci 3xl0⁷ VP/ml přes noc. Jako kontrola byly užity neinfikované buňky přenesené do hypoxických podmínek na 24 hodin. Po jednom dni byla z těchto buněk izolována celková RNA a exprese VEGF byla detekována Northernovým přenosem (Northern blot).

Předkládaný vynález výhodně poskytuje přípravky ke stimulaci exprese VEGF v buňkách. Tudíž vynález umožňuje léčení ischemických onemocnění pacientů tím, že umožňuje

první aspekt exprese VEGF stimulovat vytváření kolaterálních krevních cév v ischemické tkáni. Konkrétně bylo ukázáno, že protein Akt stimuluje expresi angiogenního proteinu VEGF. Takže předkládaného vynálezu se týká stimulace v buňkách tím, že se do buněk vnese protein Akt. Ve výhodném provedení se do buněk vnese nukleová kyselina kódující protein Akt.

Vynález se týká léčení pacientů trpících ischemickým onemocněním, přičemž toto léčení spočívá v tom, že se pacientovi podává protein Akt. Výhodně se pacientovi podává nukleová kyselina kódující protein Akt, přičemž výsledkem je prospěšné vytváření kolaterálních krevních cév v ischemických tkáních pacienta.

Různé aspekty předkládaného vynálezu jsou dále ještě podrobněji popsány. Cílem tohoto uspořádání popisu vynálezu je, aby bylo usnadněno porozumění vynálezu, a nijak tudíž předkládaný vynález neomezuje.

Definice

V popisu předkládaného vynálezu se pro vysvětlení vynálezu užívají termíny, které jsou následně podrobněji definovány.

V popisu specifických provedení vynálezu se užívá termín přibližně, což znamená v rozmezí 20 %, výhodně 10 %, a nejvýhodněji v rozmezí 5 % dané hodnoty nebo rozsahu.

Termín nukleová kyselina se týká polymerní sloučeniny obsahující kovalentně navázané podjednotky zvané nukleotidy. Nukleová kyselina je polyribonukleová kyselina (RNA) a polydeoxyribonukleová kyselina (DNA), přičemž obě mohou tvořit jednořetězcové nebo dvojřetězcové molekuly. DNA je cDNA, genomová DNA, syntetická DNA a nebo semi-syntetická DNA.

Termín gen označuje soubor nukleotidů, který kóduje polypeptid, přičemž jde o cDNA nebo genomovou DNA.

Termín rekombinántní molekula DNA označuje DNA molekulu, která byla upravena metodami genového inženýrství (molekulární biologie).

Vektor je jakýkoliv prostředek pro přenos nukleových kyselin do hostitelské buňky. Vektor může být replikon, ke kterému je připojen další DNA segment, takže se replikuje také připojený segment. Přitom replikon je jakýkoliv genetický element (např. plazmid, fág, kosmid, chromosom, virus), který funguje jako autonomní jednotka replikace DNA in vivo, to znamená, která je schopná sama řídit svou replikaci. Vektor zahrnuje jak virové tak i nevirové prostředky pro vnesení nukleových kyselin do buněk in vitro, ex vivo nebo in vivo. K virovým vektorům patří retroviry, adeno-asociované viry, poxviry, bakuloviry, virus vakcínie, virus Herpes simplex, virus Epstein-Barrové a adenoviry, které budou ještě podrobněji popsány dále. K nevirovým vektorům patří plazmidy liposomy, elektricky nabité lipidy (cytofektiny), komplexy DNA-protein a biopolymery. Kromě nukleové kyseliny může vektor obsahovat navíc jeden nebo více regulačních úseků a/nebo selekčních markérů užitečných pro selekci, měření a monitorování výsledků přenosu nukleové kyseliny (tj . do jaké tkáně byla nukleová kyselina přenesena, jaké je trvání exprese apod.).

Termín klonovací vektor označuje replikon, jako je např. plazmid, fág nebo kosmid, ke kterému byl připojen další DNA segment, takže se replikuje i tento připojený segment. Klonovací vektory mohou být schopny replikace v jednom typu buněk a exprese v druhém typu buněk (tzv. kyvadlové vektory).

Termín kazeta označuje segment DNA, který byl vložen do vektoru ve specifických restrikčních místech. Segment DNA kóduje požadovaný polypeptid, přitom kazeta a specifická restrikční místa jsou konstruovány tak, aby bylo zajištěno vložení kazety ve shodném čtecím rámci vhodném pro transkripci a translaci.

Buňka byla transfekována exogenní nebo heterologní DNA, když taková DNA byla vnesena do buňky. Buňka byla transformována exogenní nebo heterologní DNA, když transfekovaná DNA způsobuje fenotypovou změnu. Transformující DNA může být integrovaná (tj . je kovalentně navázaná) do chromozomové DNA vytvářející genom buňky.

Termín molekula nukleové kyseliny označuje polymerní formy fosfátesterů ribonukleosidů (adenosin, guanosin, uridin nebo cytidin; čili molekula RNA) nebo deoxyribonukleosidů (deoxyadenosin, deoxyguanosin, deoxythymidin nebo deoxycytidin; čili molekula DNA), nebo jakékoliv jejich fosfoesterové anology, jako jsou např. fosforothioáty a thioestery, a to buďto v jednořetězcové formě nebo ve formě dvoj řetězcové šroubovice. Dvoj řetězcové formy mohou obsahovat DNA-DNA, DNA-RNA a RNA-RNA. Termín molekula nukleové kyseliny, konkrétně molekula DNA nebo molekula RNA, se týká pouze primární a sekundární struktury molekuly, a nijak neomezuje konkrétní terciární formu dané molekuly. Takže tento termín zahrnuje dvoj řetězcovou DNA, která se vyskytuje inter alia jako lineární nebo cirkulární molekula DNA (např. jako restrikční fragment, plazmid nebo chromosom). Při popisu struktury konkrétní dvoj řetězcové molekuly DNA je popsána sekvence netranskribovaného řetězce DNA (tj. řetězce, který je sekvenčně homologní s mRNA) obvyklým způsobem ve směru od 5'-konce ke 3'-konci. Termín rekombinantní molekula DNA

• · · · · · • · · označuje molekulu DNA, která byla jakkoliv upravena metodami genetického inženýrství (molekulární biologie).

Molekula nukleové kyseliny je hybridizovatelná s jinou molekulou nukleové kyseliny, jako je např. cDNA, genomová DNA nebo RNA, když se jednořetězcová forma této molekuly nukleové kyseliny může spojit s jinou molekulou nukleové kyseliny za vhodných podmínek teploty a iontové síly roztoku (viz Sambrook et al.). Podmínky dané teplotou a iontovou sílou roztoku určují tzv. stringence (přísnost) podmínek hybridizace. Pro předběžný screening homologů nukleových kyselin se užívají méně přísné hybridizační podmínky, tj. podmínky s nízkou stringencí, které odpovídají Tm 55° C, např. hybridizaci v roztoku 5x SSC, 0,1% SDS, 0,25% mléko a žádný formamid; nebo 30% formamid, 5x SSC, 0,5% SDS. Hybridizace v podmínkách střední stringence odpovídající vyšší Tm je např. 40% formamid a 5x nebo 6x SCC. Hybridizační podmínky s vysokou stringencí odpovídající nej vyšší Tm jsou např. 50% formamid a 5x nebo 6x SCC. Hybridizace vyžaduje, aby dvě molekuly nukleové kyseliny obsahovaly komplementární sekvence, avšak v závislosti na stringencí hybridizačních podmínek je možný určitý počet neshodných bází. Vodná stringence pro hybridizaci nukleových kyselin také závisí na délce molekul a na míře jejich komplementarity, což je odborníkům dobře známo. Čím je větší míra podobnosti nebo homologie mezi dvěma nukleotidovými sekvencemi, tím vyšší je hodnota Tm pro hybridy nukleových tyto sekvence. Relativní stabilita Tm) hybridů nukleových kyselin roste v následující posloupnosti: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Pro hybridy delší než 100 nukleotidů byly odvozeny rovnice pro výpočet Tm (viz Sambrook et al., str. 9.50-0.51). Pro hybridizaci kratších nukleových kyselin, tj. oligonukleotidů, je pozice neshodných bází mnohem důležitější a délka kyselin obsahujících (odpovídající vyšší oligonukleotidu určuje jeho specificitu (viz Sambrook et al. , str. 11.7-11.8). Výhodně je nejmenší délka hybridizovatelné nukleové kyseliny alespoň 10 nukleotidů, výhodněji alespoň 15 nukleotidů a ještě výhodněji alespoň 20 nukleotidů.

Ve specifickém provedení vynálezu termín standardní hybridizačni podmínky označuje Tm 55° C, a dále podmínky výše popsané. Výhodně Tm je 60° C; ještě výhodněji Tm je 65° C.

Termín oligonukleotid označuje nukleovou kyselinu, obsahující obecně alespoň 18 nukleotidů, která je hybridizovatelné s molekulou genomové DNA, cDNA nebo mRNA, které kódující Akt. Oligonukleotid může být označen např. ³²P-nukleotidem nebo nukleotidem, ke kterému je kovalentně navázaná značka, např. biotin. V jednom provedení vynálezu je užit značený oligonukleotid jako sonda pro detekci přítomnosti nukleové kyseliny kódující Akt. V jiném provedení jsou oligonukleotidy (z nichž jeden nebo oba jsou značeny) užity jako primery v PCR (polymerázové řetězové reakci), buďto pro klonování celého Akt nebo jeho fragmentu, nebo pro detekci přítomnosti nukleové kyseliny kódující Akt. V dalším provedení oligonukleotid podle vynálezu vytváří trojšroubovici s molekulou Akt DNA. Obecně se oligonukleotidy připravují synteticky, výhodně pomocí automatického syntetizátoru nukleových kyselin. Tudíž lze připravit i oligonukleotidy obsahující analogy fosfodiesterových vazeb, jako např. thioesterové vazby, a další.

Kódující sekvence DNA je dvoj řetězcová sekvence DNA, která je transkribovaná a translatovaná do polypeptidů v buňce in vitro nebo in vivo když je umístěna pod kontrolu vhodné regulační sekvence. Hranice kódující sekvence jsou určeny počátečním kodonem (start-kodonem) na 5'-konci (aminokonci) a stop-kodonem translace na 3'-konci (karboxylovém konci). Kódující sekvence může obsahovat, avšak není omezena pouze na ně, prokaryotické sekvence, cDNA z eukaryotické mRNA, sekvence genomové DNA z eukaryot (např. savčí DNA), a dokonce i syntetické DNA sekvence. Pokud je kódující sekvence určena pro expresi v eukaryotické buňce, pak polyadenylační signál a sekvence pro terminaci transkripce jsou obvykle umístěny na 3'-konci kódující sekvence.

Transkripční a translační kontrolní sekvence jsou regulační DNA sekvence, jako např. promotory, enhancery, terminátory apod., které umožňuji a regulují expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. V eukaryotické buňce polyadenylační signál je kontrolní sekvence.

Promotorové sekvence je regulační úsek DNA, který je schopen vázat RNA polymerázu v buňce a iniciovat transkripci ve směru k 3¹-konci (downstream) ležící kódující sekvence. Pro definici předkládaného vynálezu je promotorové sekvence navázaná svým 3¹-koncem k místu iniciace transkripce a pokračuje směrem k 5¹-konci (upstream), přitom obsahuje minimální počet baží nebo elementů nutných k iniciaci transkripce v míře detekovatelné nad základní hladinou. Uvnitř promotorové sekvence se nachází místo iniciace transkripce (definované např. Sl-nukleázovým mapováním) a také domény vázající proteiny (kanonické sekvence) zodpovědné za vazbu RNA polymerázy.

Kódující sekvence je tzv. pod kontrolou, tj. je řízena kontrolními sekvencemi transkripce a translace v buňce, když RNA polymeráza transkribuje kódující sekvenci do mRNA, která je pak sestříhána (pokud kódující sekvence obsahuje introny) a translatována do proteinu kódovaného kódující sekvencí.

Termín homologní (ve všech gramatických podobách a formách) se týká vztahu mezi proteiny, které mají společný evoluční počátek, včetně proteinů z tzv. proteinových superrodin (např. suprrodina imunoglobulinů) a homologních proteinů z různých biologických druhů (např. lehký řetězec myosinu atd.) (Reeck et al. , 1987, Cell 50:667). Takové proteiny (a geny, které je kódující) mají sekvenční homologii, což se odráží ve vysokém stupni podobnosti sekvencí. .

Termín sekvenční podobnost (ve všech gramatických podobách) se týká stupně identity nebo míry, v jaké si odpovídají dvě sekvence nukleové kyseliny nebo dvě aminokyselinové sekvence, které nesdílejí shodný evoluční počátek (viz Reeck et al.). Avšak v obecném smyslu a také v předkládané přihlášce se termín homologní, ještě doplněný příslovcem např. vysoce týká pouze podobnosti sekvencí, a nezahrnuje jejich společný evoluční počátek.

Ve specifickém provedení vynálezu jsou dvě sekvence DNA v podstatě homologní nebo v podstatě podobné, když alespoň 50 % (výhodně alespoň 75 %, a nej výhodněji alespoň 90 nebo

%) nukleotidů v definovaném úseku DNA se shoduje. Sekvence v podstatě homologní mohou být identifikovány porovnáním sekvencí užitím standardního softwaru, který je veřejně dostupný v sekvenčních databázích, nebo pomocí Southernovy hybridizace, např. hybridizace za stringentních podmínek definovaných pro konkrétní systém. Určení vhodných hybridizačních podmínek je v kompetenci odborníka (viz např. Maniatis et al. , DNA Cloning, Vols. I & II, Nucleic Acid Hybridization).

Termín antisense nukleová kyselina označuje sekvenci nukleotidů, která je komplementární k sense sekvenci. Termíny antisense a sense nukleové kyseliny jsou odborníkům známy. Antisense nukleové kyseliny se mohou užít k inhibici nebo blokování exprese polypeptidu kódovaného sense řetězcem.

Transkripční a translační kontrolní sekvence jsou regulační DNA sekvence, jako např. promotory, enhancery, tohoto typu sekvence se signální vyskytuj e kyseliny.

přirozeně (homologní která reguluje Regulační úsek terminátory apod., které umožňují expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. V eukaryotické buňce je dalším typem kontrolní sekvence polyadenylační signální sekvence.

Signální sekvence je vložena na začátek kódující sekvence proteinu, který má být exprimován na povrchu buňky. Tato sekvence kóduje signální peptid, ležící na N-konci zralého polýpeptidů, a tento signální peptid řídí hostitelskou buňku, aby translokovala polypeptid. Termín translokační signální sekvence se také užívá k označení sekvence. Translokační signální ve spojení s různými proteiny nativními pro eukaryotické i prokaryotické organismy, a často jsou funkční v obou typech organismů.

Regulační úsek znamená sekvenci nukleové kyseliny, expresi jiné sekvence nukleové obsahuje sekvence, které jsou zodpovědné za expresi určité nukleové kyseliny úsek) nebo obsahuje sekvence odlišného původu, zodpovědné za expresi jiného proteinu, nebo dokonce syntetické sekvence (heterologní úsek). Konkrétně to může být sekvence z eukaryotického nebo virového genu nebo z nich odvozená sekvence, která specificky nebo nespecificky stimuluje nebo potlačuje transkripci genu indukovatelným nebo neindukovatelným způsobem. K regulačním úsekům patří počátek replikace, místa sestřihu RNA, promotory, enhancery, sekvence pro terminaci transkripce (terminační sekvence), signální sekvence směřující polypeptid do sekretorické metabolické dráhy v cílové buňce, a také promotory.

Regulační úsek z heterologního zdroje je regulační úsek, který není v přírodním (přirozeném) stavu spojen s nukleovou kyselinou, která je exprimována. K heterologním regulačním úsekům patří regulační úseky z jiného biologického • · druhu, z jiného genu, hybridní regulační sekvence, a také regulační sekvence, které se nevyskytují v přírodě, ale které byly zkonstruovány odborníkem.

Heterologní DNA označuje DNA, která v přírodním stavu není obsažena v buňce nebo v není lokalizována v chromozomálním místě v buňce. Výhodně k heterologním DNA patří geny, které jsou pro danou buňku cizí (cizorodé).

Homologní rekombinace označuje vložení cizorodé DNA sekvence do jiné molekuly DNA, např. vložení vektoru do chromosomu. Výhodně je vektor pro homologní rekombinaci zaměřen do specifického místa v chromosomu. Pro specifickou homologní rekombinaci obsahuje vektor dostatečně dlouhé úseky homologní se sekvencemi chromosomu, aby bylo možné komplementární navázání vložení vektoru chromosomu. DElší úseky homologie a vyšší míra sekvenční podobnosti zvyšují účinnost homologní rekombinace.

Polypeptid je polymerní sloučenina obsahující kovalentně navázané aminokyselinové zbytky. Aminokyseliny mají následující obecnou strukturu:

H

R-C-COOH

I nh₂

Aminokyseliny jsou klasifikovány do sedmi skupin podle postranního řetězce R:

(1) alifatický postranní řetězec, (2) postranní řetězec obsahuje hydroxylovou (OH) skupinu, (3) postranní řetězec obsahuje atomy síry, (4) postranní řetězec obsahuje kyselou nebo amidovou skupinu, (5) postranní řetězec obsahuje bazickou skupinu, (6) postranní řetězec obsahuje aromatický kruh, a

(7) prolin, což je aminokyselina, kde postranní řetězec je fúzován s aminoskupinou. Polypeptid podle vynálezu výhodně obsahuje alespoň 14 aminokyselin.

Protein je polypeptid, který má funkční nebo strukturní roli v živé buňce.

Varianta polypeptidu nebo proteinu je jakýkoliv analog, fragment, derivát nebo mutanta, která je odvozena z polypeptidu a uchovává si alespoň jednu biologickou vlastnost polypeptidu nebo proteinu. V přírodě existují různé varianty polypeptidu nebo proteinu. Tyto varianty jsou alelické varianty charakteristické rozdíly v nukleotidové sekvenci strukturního genu kódujícího protein, nebo jsou výsledkem odlišného sestřihu nebo zahrnují odlišné posttranslační modifikace. Odborník je schopen připravit varianty mající jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí, adicí nebo přesunů. K těmto variantám inter alia patří:

(a) varianty, kde jeden nebo více aminokyselinových zbytku je nahrazen konzervativní nebo nekonzervativní aminokyselinou, (b) varianty, kde je k polypeptidu nebo proteinu přidána jedna nebo více aminokyselin, (c) varianty, kde jedna nebo více aminokyselina obsahuje substituovanou skupinu, (d) varianty, kde polypeptid nebo protein je fúzován s jiným polypeptidem, např. sérovým albuminem.

Metody přípravy těchto variant, včetně genetických (suprese, delece, mutace atd.), chemických a enzymatických postupů, jsou odborníkům dobře známy.

Jestliže takové alelické variace, analogy, fragmenty, deriváty, mutanty a modifikace, včetně alternativně sestřižených forem mRNA nebo alternativních post-translačních modifikací poskytují deriváty polypeptidu, který si uchovává • · jakoukoliv biologickou vlastnost polypeptidu, pak také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Heterologní protein označuje protein, který se přirozeně v buňce netvoří.

Dvě aminokyselinové sekvence jsou v podstatě homologní nebo jsou v podstatě podobné, když je více než 40 % aminokyselin identických nebo více než 60 % aminokyselin je podobných (funkčně identických). Výhodně jsou podobné nebo homologní sekvence identifikovány přiřazením užitím např. programu pileup z programového balíku GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin).

Termín odpovídající označuje podobné nebo homologní sekvence, aú je určitá pozice identická nebo odlišná od sekvence, se kterou se srovnání podobnosti nebo homologie provádí. Přiřazení sekvencí nukleových kyselin nebo aminokyselin pro srovnání může obsahovat mezery. Takže termín odpovídající se týká sekvenční podobnosti a nikoliv číslování aminokyselinových zbytků nebo nukleotídových bází.

Geny kódující proteiny Akt

Předkládaný vynález se týká užití proteinu nebo polypeptidu Akt, nebo nukleové kyseliny kódující protein nebo polypeptid Akt, ke stimulaci exprese VEGF v buňkách. Výhodně je Akt humánní protein nebo polypeptid Akt3, včetně úplné (plné délky) nebo přirozeně se vyskytující formy Akt, nebo jakéhokoliv jeho fragmentu schopného stimulovat expresi VEGF.

Termín Akt v předkládané přihlášce označuje polypeptid Akt, a akt označuje gen, který kóduje refers to a gen kódující polypeptid Akt.

Odborníkům jsou již známy různé myší a humánní sekvence Akt (viz např. Coffer et al. , 1991, Eur. J. Biochem. 201:47523 aminokyselinovou Výhodná sekvence ami nokys e1i novou

481; Jones et al. , 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. 88:4171-4175;

Bellacosa et al., 1993, Oncogen, 8:745-754; GenBank Accession

Nos. M63167, X61037 a X65687; a prozatímní patentová přihláška US č. 60/125,108). Výhodně je Akt humánní Aktl (SEKVENCE ID. Č. 11), Akt2 (SEKVENCE ID. Č. 12) nebo Akt3 (SEKVENCE ID. Č. 2). Výhodný Akt podle vynálezu obsahuje sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2 nukleové kyseliny podle vynálezu kóduje sekvenci uvedenou zde jako SEKVENCE ID. Č. 2, SEKVENCE ID. Č. 11 nebo SEKVENCE ID. Č. 12. Výhodněji nukleová kyselina obsahuje sekvenci uvedenou jako SEKVENCE ID. Č. 1. Akt může být také získán z jiného než humánního zdroje.

Podle předkládaného vynálezu je možné užít v oboru obvyklé postupy molekulární biologie, mikrobiologie a techniky rekombinantní DNA (metody genového inženýrství), které jsou odborníkům známy. Tyto různé metody byly plně popsány v odborné literatuře, viz např. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (zkráceně zde citován jako Sambrook et al., 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I a

II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization [B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)]; Transcription And Translation [B.D.

Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; Animal Cell Culture [R.I. Freshney, ed. (1986)]; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]; B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, lne. (1994).

Geny kódující Akt, aú již jako genomová DNA nebo cDNA, mohou být izolovány z jakéhokoliv zdroje, zejména z humánní cDNA knihovny nebo genomové knihovny. Obecné metody pro izolaci genu akt jsou odborníkům známy, a byly popsány (viz např. Sambrook et al., 1989).

Tudíž jakékoliv zvíře může být potenciálním zdrojem nukleové kyseliny pro molekulární klonování genu akt. DNA se získá standardním postupem, který je odborníkům v oboru znám, z klonované DNA (např. z tzv. DNA knihovny), výhodně se získá z cDNA knihovny připravené z tkání, kde je vysoká hladina exprese požadovaného proteinu (např. srdce, pankreas a kosterní svalstvo), chemickou syntézou, klonováním cDNA nebo genomové DNA nebo jejich fragmentů, purifikovaných z požadovaných buněk (viz např. Sambrook et al., 1989, Glover,

D.M. (ed.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL

Press, Ltd., Oxford, U.K. Vol. I, I)]. Klony odvozené z genomové DNA obsahují kromě úseků kódující DNA také regulační a intronové úseky DNA, klony získané z cDNA neobsahují intronové sekvence. Bez ohledu na zdroj, gen je pak klonován do vektoru vhodného pro množení genu.

Jakmile jednou byly získány fragmenty DNA, identifikace specifických DNA fragmentů obsahujících požadovaný gen akt může být provedena řadou způsobů. Tak např. DNA fragmenty mohou být screenovány metodou hybridizace nukleových kyselin se značenou sondou (Benton a Davis, 1977, Science 196:180; Grunstein a Hogness, 1975, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 72:3961). Fragmenty DNA v podstatě homologní se sondou pak budou hybridizovat. Jak již bylo zmíněno výše, čím větší je míra homologie, tím přísnější podmínky (tj . podmínky s vyšší stringencí) se užijí. Ve specifickém provedení vynálezu se užije Northern hybridizace pro identifikaci mRNA sestřihových variant genu akt.

Další selekce se provádí na základě vlastností genu, např. zda gen kóduje proteinový produkt mající isoelektrické nebo elektroforetické vlastnosti nebo a aminokyselinovou nebo částečnou aminokyselinovou sekvenci proteinu Akt podle vynálezu. Takže detekce genu může být proveden testem založeným na fyzikálních, chemických nebo imunologických vlastnostech exprimovaného produktu. Tak např. mohou být selektovány cDNA klony nebo DNA klony hybridizující s příslušnou mRNAs, které produkují protein, která má podobnou nebo identickou elektroforetickou migraci; chování při isoelektrické fokusaci nebo při nerovnovážné pH gelové elektoforéze, proteolytické štěpné mapy, nebo antigenní vlastnosti jaké jsou zámy u Akt. Ve specifickém provedení je exprimovaný protein rozpoznáván polyklonální protilátkou, která byla připravena proti epitopu specifickému pro humánní Akt.

Předkládaný vynález se také týká použití genů (např. cDNA) kódujících alelické varianty, sestřihové varianty, analogy a deriváty Akt, které mají schopnost stimulovat expresi VEGF. Příprava a použití derivátů a analogů Akt spadá do rozsahu předkládaného vynálezu. Takové varianty, analogy, deriváty a homology si uchovávají svou schopnost stimulovat expresi VEGF.

Deriváty Akt mohou být připraveny změnou kódující sekvence nukleové kyseliny jednou nebo více substitucemi, adicemi nebo delecemi, které poskytují funkčně ekvivalentní molekuly. Výhodně se připravují takové deriváty, které mají zlepšenou nebo zvětšenou funkční aktivitu vzhledem k nativnímu

Vzhledem k degenerovanosti nukleotidové kódující sekvence (resp. genetického kódu) se mohou pro realizaci předkládaného vynálezu užít i jiné sekvence DNA, které kódující v podstatě stejné aminokyselinové jako gen akt, včetně aminokyselinových sekvencí obsahujících jednoduché aminokyselinové varianty. K nim patří, avšak bez omezení,

alelické geny, homologní geny z jiných biologických druhů a nukleotidové sekvence obsahující celý nebo část genu akt, který byl změněn substitucí různých kodonů, které v sekvenci kódují stejné aminokyselinové zbytky, jde tedy o tzv. umlčené záměny.

Podobně k derivátům Akt podle vynálezu patří, avšak bez omezení, deriváty obsahující jako primární aminokyselinovou sekvenci celou nebo část aminokyselinové sekvence proteinu Akt včetně změněné sekvence, kde jsou aminokyselinové zbytky nahrazeny funkčně ekvivalentními aminokyselinovými zbytky, takže dochází ke konzervativním aminokyselinovým substitucím. Tak např. jeden aminokyselinový zbytek v sekvenci může být naharzen jiným aminokyselinovým zbytkem s podobnou polaritou, který působí jako funkční ekvivalent, což vede k umlčené záměně. Substituty aminokyselin v sekvenci se vyberou z ostatních členů příslušné třídy aminokyselin, do které patří původní aminokyselina. Tak např. k nepolárním (hydrofobním) aminokyselinám patří alanin, leucin, isoleucin, valin, prolin, fenylalanin, tryptofan a methionin.

Aminokyseliny obsahující aromatický kruh jsou fenylalanin, tryptofan a tyrosin. K polárním neutrálním aminokyselinám patří glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin a glutamin. K pozitivně nabitým (bazickým) aminokyselinám patří arginin, lysin a histidin. K negativně nabitým (kyselým) aminokyselinám patří kyselina asparagová a kyselina glutamová. Tyto alterace aminokyselin nemění zjevnou molekulovou hmotnost stanovenou elektroforézou na polyakrylamidovém gelu nebo isoelektrický bod proteinu nebo polypeptidu.

Zvláště výhodné substituce jsou:

Lys za Arg a naopak, takže se udržuje pozitivní náboj,

- Glu za Asp a naopka, takže se udržuje negativní náboj, Ser za Thr, takže se udržuje volná -OH skupina,

Gin za Asn, takže se udržuje volná CONH₂ skupina.

Aminokyselinové substituce mohou být také provedeny s cílem vnést aminokyselinu se zvláště výhodnými vlastnostmi. Tak např. cys může být vnesen proto, aby se přidalo potenciální místo pro vytvoření disulfidického můstku s jiným Cys. His se může vnést jako zvláště katalytické místo (His může totiž působit jako kyselina nebo báze a je nej běžnější aminokyselinou v biochemické katalýze). Pro může být vnesen pro svou zvláštní planární strukturu, která indukuje β-ohyby ve struktuře proteinu.

Geny kódující deriváty a analogy Akt podle vynálezu mohou být připraveny různými způsoby, které jsou odborníkům známy. Úpravy (manipulace) , které k nim vedou, se mohou odehrát na úrovni genu nebo proteinu. Tak např. klonovaná sekvence genu Akt může být modifikována jakoukoliv strategií v oboru známou (Sambrook et al. , 1989). Sekvence může být štěpena ve vhodných místech restrikčními endonukleázami, pak případně dále enzymaticky modifikována, izolována a ligována in vitro. Při přípravě genu kódujícího derivát nebo analog Akt je třeba věnovat péči zajištění toho, že modifikace genu zůstává ve shodném translačním čtecím rámci jako gen Akt, a že není přerušen translačním stop-signálem v úseku, kde je kódována požadovaná aktivita.

Navíc sekvence nukleové kyseliny kódující Akt může být mutována in vitro nebo in vivo, aby se vytvořila a/nebo zrušila iniciační a/nebo terminační sekvence translace, nebo aby se vytvořily variace v kódujícím úseku a/nebo aby se vytvořila nová restrikční místa nebo zrušila již existující stará, pro usnadnění dalších modifikací in vitro. Výhodně takové mutace zvyšují funkční aktivitu mutovaného genu Akt. Pro mutagenezi lze užít jakoukoliv metodu v oboru známou, včetně in vitro místně-cílené mutageneze (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551; Zoller a Smith, 1984, DNA 3:479-488; Oliphant et al. , 1986, Gen 44:177; Hutchinson et al., 1986, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83:710), použití linkerů TAB® (Pharmacia), přičemž tento výčet není omezující. PCR metody jsou výhodné pro místně cílenou mutagenezi (viz Higuchi, 1989, Using PCR to Engineer DNA, in PCR Technology' Principles and Applications, for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp. 61-70).

Identifikovaný a izolovaný gen se pak vloží do vhodného klonovacího vektoru. Může se použít velký počet systémů vektor-hostitel, které jsou odborníkům známy. K vhodným vektorům, avšak bez omezení, patří plazmidy nebo modifikované viry, ale vektorový systém které kompatibilní K příkladům musí být se užívají s hostitelskými buňkami, vhodných vektorů, aniž by výčet byl omezující, patří bakteriofágy E. coli, jako jsou např. lambda deriváty, nebo plazmidy, jako jsou např. deriváty plazmidu pBR322 nebo deriváty plazmidu pUC, např. tedy vektory pGEX, pmal-c, pFLAG atd.. Vložení (inzerce) do klonovacího vektoru se provede např. ligací DNA fragmentu do klonovacího vektoru s komplementárními kohezivními konci.

Jestliže komplementární restrikční místa ve fragmentu DNA nejsou přítomna v klonovacím vektoru, konce DNA molekuly mohou být enzymaticky modifikovány. Alternativně mohou být jakkoliv požadovaná restrikční místa vytvořena ligací nukleotidových sekvencí (linkerů) na konce fragmentu DNA;

linkery obsahují specifické chemicky oligonukleotidy kódující sekvence rozpoznávacích míst restrikčních endonukleáz. Rekombinantní molekuly se vnášejí do hostitelských buněk metodou transformace, transfekce, infekce, elektroporace a dalšími, takže se připraví mnoho kopií sekvence genu. Výhodně je klonovaná sekvence přítomna tyto ligované syntetizované «· **

v kyvadlovém vektorovém plazmidu, který umožňuje namnožení v klonovacích buňkách, např. E. coli, a usnadňuje purifikaci pro následné vnesení do vhodné expresní buněčné linie, pokud je to požadováno. Tak např. může být připraven kyvadlový vektor, což je vektor schopný replikace ve více druzích organismů, pro replikaci jak v E. coli tak i v Saccharomyces cerevisiae, a sice tak, že se spojí sekvence plazmidu z E. coli se sekvencemi kvasinkového plazmidu 2μ.

Exprese polypeptidů Akt

Nukleotidová sekvence kódující Akt, nebo jeho antigenní fragment, derivát, analog nebo jeho funkční derivát včetně chimérického proteinu, se vloží do vhodného expresního vektoru, tj . vektoru, který obsahuje nezbytné elementy pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující protein. Takové elementy se nazývají promotory. Takže nukleová kyselina podle vynálezu je operativně spojena s promotorem v expresním vektoru podle vynálezu. Jak sekvence cDNA tak sekvence genomové DNA může být klonována a exprimována pod kontrolou takových regulačních sekvencí. Expresní vektor také vhodně obsahuje replikační počátek.

Nezbytné transkripční a translační signály poskytne rekombinántní expresní vektor nebo jsou obsaženy již v nativním genu kódujícím Akt a/nebo v úsecích obklopujících tento gen. V jednom výhodném provedení vynálezu je exprese Akt omezena na kardiomyocyty tím, že je užit promotor specifický pro srdeční tkáň a/nebo vektor se specifickým tropismem pro srdeční buňky.

K potenciálním systémům hostitel-vektor patří (aniž by výčet byl omezující) systémy jako jsou savčí buňky infikované viry fnapř. virem vakcínie, adenovirem atd.); hmyzí buňky infikované virem (např. bakulovirem) ; mikroorganismy jako jsou kvasinky obsahující kvasinkové vektory, a nebo baktérie transformované bakteriofagovou DNA, plazmidovou DNA nebo kosmidovou DNA. Expresní elementy vektorů se liší svou účinností a specificitou. V závislosti na použitém systému hostitel-vektor je možné užít některý z vhodných transkripčních a translačních elementů.

Rekombinantní protein Akt nebo jeho funkční fragmenty, deriváty, chimérické konstrukty nebo analogy, jsou exprimovány chromozomálně, po integraci kódující sekvence homologní rekombinací. Pro dosažení vysoké hladiny stabilní exprese lze užít jakýkoliv z mnoha známých amplifikačních systémů (viz Sambrook et al. , 1989).

Buňky obsahující rekombinantní vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující Akt se kultivují ve vhodném kultivačním médiu v takových podmínkách které vedou k expresi Akt v buňkách. Kteroukoliv z již popsaných metod pro inzerci klonované DNA do klonovacího vektoru lze užít pro konstrukci expresních vektorů obsahujících vhodné transkripční a translační kontrolní signální sekvence a sekvence kódující protein. K takovým metodám patří techniky syntetické rekombinantní DNA in vitro a rekombinace in vivo (genetická rekombinace) .

Nukleová kyselina kódující polypeptid Akt je operativně spojená a řízená s jakýmkoliv vhodným, odborníkovi známým, regulačním úsekem, tj . úsekem obsahujícím element promotor/enhancer, avšak tyto regulační elementy musejí být funkční v cílovém nádoru, který byl vybrán pro expresi. Regulační úseky obsahují promotorovy úsek pro funkční transkripci v hostitelské buňce; a také úsek situovaný na 3'-konci požadovaného genu, který nese signál pro terminaci transkripce a polyadenylační místo. Všechny tyto zmíněné elementy tvoří expresní kazetu.

K promotorům vhodným pro použití v předkládaném vynálezu patří jak konstitutivní promotory tak i regulované (indukovatelné) promotory. Mohou to být promotory přirozeně zodpovědné za expresi příslušné nukleové kyseliny. Mohou to být také promotory z heterologních zdrojů. Konkrétně to mohou být promotorové sekvence z eukaryotických nebo virových genů. Tak např. promotorové sekvence pocházející z genomu buňky, která má být infikována. Obdobně i promotorově sekvence pocházející z genomu viru, jako je např. adenovirus (ElA a MLP) , cytomegalovirus nebo virus Rousova sarkomu (RSV) . Navíc může být promotor modifikován připojením aktivační nebo regulační sekvence nebo sekvence umožňující tkáňově specifickou nebo převládající expresi (promotor z enolázy nebo GFAP apod.). Pokud nukleová kyselina neobsahuje promotorovou sekvenci, pak se do ní promotor vloží.

K příkladům promotorů užitečných pro předkládaný vynález patři všudypřítomné promotory (jako je např. promotor HPRT, vimentinu, aktinu, tubulinu); intermediátní vláknité promotory (např. promotor desminu, neurofilament, keratinu, GFAP), promotory terapeutických genů (např. typu MDR, CFTR, faktoru VIII), tkáňově specifické promotory (např. promotor aktinu v buňkách hladkého svalstva), promotory přednostně aktivované v dělících se buňkách, promotory odpovídající stimul (např. receptor steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové), transkripční modulátory regulované tetracyklinem, bezprostředně časné geny cytomegaloviru (CMV), retrovirové LTR; metalothionein, SV-40, adenovirus Ela, a hlavní pozdní promotor adenoviru (MLP). Tetracyklinem regulované transkripční modulátory a promotory CMV byly popsány v patentové přihlášce WO 96/01313, a patentech US 5,168,062 a 5,385,839, jejichž obsah je vložen formou odkazu.

• ·

Konkrétně exprese proteinu Akt může být řízena jakýmkoliv vhodným, odborníkovi známým, regulačním úsekem, tj . úsekem obsahujícím element promotor/enhancer, avšak tyto regulační elementy musejí být funkční v cílovém nádoru, který byl vybrán pro expresi. K vhodným promotorům pro řízení genové exprese podle vynálezu patří (přičemž tento výčet není omezující) časná promotorovy úsek SV40 (Benoist a Chambon, 1981, Nátuře 290:304-310), promotor obsažený v 3' dlouhé terminální repetici, LTR, viru Rousova sarkomu (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787797), promotor thymidinkinázy z herpes viru (Wagner et al. , 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78:14411445), regulační sekvence metallothioneinového genu (Brinster et al. , 1982, Nátuře 296:39-42); prokaryotické expresní vektory jako je např. β-laktamázový promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) nebo promotor tac (DeBoer, et al. , 1983; Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25); viz také článek Useful proteins from recombinant bacteria Scientifi American, 1980, 242:74-94); promotorové elementy z kvasinke nebo jiných hub jako je např. promotor Gal4, promotor ADC (alkoholdehydrogenázy), promotor PGK (fosfoglycerolkinázy), promotor alkalické fosfatázy; a také transkripční kontrolní úseky genů zvířat, které vykazují tkáňovou spécificitu a byly užity např. v transgenních zvířatech: kontrolní úsek genu elastázy I, který je aktivní v hroznovitých buňkách pankreatu (Swift et al. , 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al.,1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425515); kontrolní úsek insulinového genu, který je aktivní v beta-buňkách pankreatu (Hanahan, 1985, Nátuře 315:115-122), kontrolní úsek imunoglobulinového genu, který je aktivní v lymfatických buňkách (Grosschedl et,al., 1984, Cell 38:647658; Adames et al., 1985, Nátuře 318:533-538; Alexaer et al.,

1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), kontrolní úsek z viru nádoru mléčné žlázy myší, který je aktivní ve tkáni varlat a prsu a v lymfatických buňkách a mastocytech (Leder et al. , 1986, Cell 45:485-495), kontrolní úsek genu pro albumin, který je aktivní v játrech (Pinkert et al., 1987, Gens a Devel.

1:268-276), kontrolní úsek genu pro alfa-fetoprotein, který je aktivní v játrech (Krumlauf et al. , 1985, Mol. Cell. Biol.

5:1639-1648; Hammer et al. , 1987, Science 235:53-58), kontrolní úsek genu pro alfa-l-antitrypsin, který je aktivní v játrech {Kelsey et al. , 1987, Gens a Devel. 1:161-171), kontrolní úsek genu pro beta-globin, který je aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1985, Nátuře 315:338340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94), kontrolní úsek genu pro myelinový bazický protein, který je aktivní v oligodendrocytech mozku (Readhead et al., 1987, Cell 48:703712), kontrolní úsek genu pro myosinový lehký řetězec 2, který je aktivní v kosterním svalstvu (Sari, 1985, Nátuře 314:283286), a kontrolní úsek genu pro hormon uvolňující gonadotropiny, který je aktivní v hypothalamu (Mason et al. , 1986, Science 234:1372-1378).

Výhodně je exprese Akt omezena na kardiomyocyty tím, že se užije promotor specifický pro srdce nebo vektor se specifickým tropismem pro srdeční buňky.

Expresní vektory obsahující nukleové kyseliny kódující protein Akt lze identifikovat pěti různými postupy:

(a) PCR amplifikací požadované plazmidové DNA nebo specifické mRNA, (b) Hybridizací nukleových kyselin, (c) Podle přítomnosti nebo absence genu pro selekční markér, (d) Analýzou užitím vhodných restrikčních endonukleáz, (e) Expresí vložené sekvence.

• · » • · · · • ♦ ·

V první uvedené metodě se nukleové kyseliny amplifikují v PCR (polymerázové řetězové reakcí) a pak se detekuje amplifikovaný produkt. V druhé metodě se přítomnost cizorodého genu vloženého do expresního vektoru detekuje pomocí hybridizace nukleových kyselin užitím sondy, která obsahuje sekvenci homologní se sekvencí vloženého markerového genu. Ve třetí metodě se rekombinantní systém vektor/hostitel identifikuje a selektuje na základě přítomnosti určitých funkcí selekčních markérů (např. β-galaktosidázová aktivita, thymidinkinázová aktivita, resistence k antibiotikům, transformovaný fenotyp, vytváření okluzních tělísek v bakulovirech apod.) způsobených vložením cizorodého genu do vektoru. Jiný příklad je takový, že nukleová kyselina kódující Akt je vložena do genu pro selekční markér a pak jsou rekombinanty obsahující Akt inzert identifikovány na základě absence této markerové genové funkce. Ve čtvrté metodě jsou rekombinantní expresní vektory identifikovány štěpením vhodnými restrikčními enzymy. V páté metodě jsou rekombinantní expresní vektory identifikovány testováním na aktivitu, biochemické nebo imunologické vlastnosti genového produktu exprimovaného v rekombinantách, za předpokladu, že exprimovaný protein zaujímá funkčně aktivní konformaci.

Pro expresi Akt DNA sekvence se může využít široké spektrum kombinací hostitel/expresní vektor. Užitečné expresní vektory jsou tvořeny např. segmenty chromosomální, non-chromosomální a syntetické DNA sekvence. K vhodným vektorům patří deriváty SV40 a známých bakteriálních plazmidú, např. E. coli plazmidy col El, pCRI, pBR322, pMalC2, pET, pGEX (Smith et al. , 1988, gen 67:31-40), pMB9 a jejich deriváty, plazmidy jako je RP4; fágová DNA, např. četné deriváty fágu 1, např. NM989, a další fágové DNA, např., M13 a DNA z vláknitých jednořetězcových fágů; kvasinkové plazmidy jako je např. plazmid 2m a jeho deriváty; vektory vhodné pro eukaryotické buňky, jako např. vektory vhodné pro hmyzí nebo savčí buňky; vektory získané kombinací plazmidové a fagové DNA, jako je např. plazmid, který byl modifikován tak, aby užíval fagovou DNA nebo jiné expresní kontrolní sekvence; a další.

Tak např. v bakulovirovém expresním systému se mohou využít jak nefúzní transferové vektory, jako je (avšak výčet není omezující) např. pVL941 (klonovací místo BamHI; Summers) , pVL1393 (klonovací místo BamHI, Smál, Xbal, EcoRI, Notl, XmalII, BglII a Pstl; Invitrogen) , pVL13 92 (klonovací místo BglII, Pstl, Notl, XmalII, EcoRI, Xbal, Smál a BamHI; Summers a Invitrogen), a pBlueBacIII (klonovací místo BamHI, BglII, Pstl, Ncol a HindlII, s možností rekombinantního screeningu systémem modrá/bílá; Invitrogen), tak i fúzní transferové vektory, jako je (avšak výčet není omezující) např. pAc700 (klonovací místa BamHI a KpnI, kde BamHI rozpoznávací místo začíná v iniciačním kodonu; Summers) ; pAc701 a pAc702 (stejné jako pAc700, s odlišným čtecím rámcem), pAc360 (klonovací místo BamHI 36 párů bází downstream od polyhedrinového iniciačního kodonu; Invitrogen (195)), a pBlueBacHisA, -B, -C (tři různé čtecí rámce, s klonovacími místy BamHI, BglII, Pstl, Ncol a HindlII, a N-koncovým peptidm pro purifikaci pomocí ProBond, a systémem modrá/bílá pro rekombinantní screening plaků; Invitrogen (220) ) .

Savčí expresní vektory vhodné pro použití v předkládaném vynálezu zahrnují vektory s indukovatelným promotorem, jako je např. promotor genu dihydrofolátreduktázy (DHFR), tedy např. jakýkoliv expresní vektor s DHFR expresním vektorem, nebo koamplifikační vektor s DHFR/methotrexat, jako je pED (klonovací místo Pstl, Sáli, Sbal, Smál a EcoRI, přičemž vektor exprimuje jak klonovaný gen tak i DHFR; Kaufman,

Current Protocols in MolecularBiology, 16.12 (1991). Nebo koamplifikační vektor glutaminsynthetáza/methionisulfoximin, jako je např. pEE14 (klonovací místo HindlII, Xbal, Smál, Sbal, EcoRI, a Bclll, vektor exprimuje jak klonovaný gen tak i glutaminsyntázu; Celltech). V jiném provedení vynálezu vynálezu se může užít vektor, který řídí episomální expresi pod kontrolou viru Epstein-Barrové (EBV) , jako je pREP4 (klonovací místo BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, HindlII, Nhel, PvuII, a KpnI, konstitutivní promotor z dlouhé terminální repetice viru Rousova sarkomu (RSV-LTR), hygromycinový selekční markér; Invitrogen), pCEP4 (klonovací místo BamHI, Sfil, Xhol, Notl, Nhel, HindlII, Nhel, PvuII a KpnI, konstitutivní promotor bezprostředně časného genu humánního cytomegaloviru (hCMV), hygromycinový selekční markér; Invitrogen), pMEP4 (klonovací místo KpnI, Pvul, Nhel, HindlII, Notl, Xhol, Sfil, BamHI, indukovatelný promotor genu pro methallothionein Ha, hygromycinový selekční markér, Invitrogen), pREP8 (klonovací místo BamHI, Xhol, Notl, HindlII, Nhel a KpnI, promotor RSV-LTR, histidinylový selekční markér, Invitrogen), pREP9 (klonovací místo KpnI, Nhel,

HindlII, Notl, Xhol, Sfil a BamHI, promotor RSV-LTR, G418 selekční markér; Invitrogen), a pEBVHis (promotor RSV-LTR, selekční markér, N-koncový peptid pomocí pryskyřice ProBond a štěpitelný Invitrogen). Selektovatelné savčí expresní vektory pro použití podle vynálezu zahrnují pRc/CMV (klonovací místo HindlII, BstXI, Notl, Sbal a Apal, G418 selekce; Invitrogen), pRc/RSV (klonovací místo HindlII, Spěl, BstXI, Notl, Xbal, G418 selekce; Invitrogen), a další. Savčí expresní vektory založené na viru vakcínie (viz Kaufman, 1991) pro použití podle vynálezu zahrnují (avšak výčet není omezující) pSC 11 (klonovací místo Smál, TK- a β-gal selekce) , pMJ601 hygromycinový puri f ikovatelný enterokinázou;

(klonovací místo Sáli, Smál, AflI, Narl, BspMII, BamHI, Apal, Nhel, SacII, KpnI, a HindlII; TK- a β-gal selekce), a pTKgptFIS (klonovací místo EcoRI, Pstl, Sáli, Acd, HindlI, Sbal, BamHI a Hpa, TK nebo XPRT selekce).

Kvasinkové expresní systémy mohou být také užity pro expresi proteinu Akt podle předkládaného vynálezu. Např. nefúzní vektor pYES2 (klonovací místa Xbal, Sphl, Shol, Notl, GstXI, EcoRI, BstXI, BamHI, Sad, KpnI a HindlII; Invitrogen) nebo fúzní vektory pYESHisA, B, C (klonovací místo Xbal, Sphl, Shol, Notl, BstXI, EcoRI, BamHI, Sad, KpnI a HindlII, N-koncový peptid purifikovatelný pomocí pryskyřice ProBond a štěpitelný enterokinázou; Invitrogen) , abychom zmínili alespoň dva vektory využitelné podle vynálezu.

Jakmile byla jednou určitá rekombinantní DNA molekula identifikována a izolována, pro její namnožení se může užít několik různých metod, které jsou odborníkům známy. Po etablování vhodného hostitelského systému a vhodných kultivačních podmínek se rekombinantní expresní vektory namnoží a připraví v požadovaném množství. Jak bylo již výše vysvětleno, k použitelným expresním vektorům patří (aniž by tento výčet byl omezující) následující vektory nebo jejich deriváty: humánní nebo zvířecí viry jako je např. virus vakcínie nebo adenovirus; hmyzí viry jako jsou bakuloviry; kvasinkové vektory; bakteriofágové vektory (např. fág lambda) , a plazmidové a kosmidové DNA vektory.

Navíc může být vybrán hostitelský buněčný kmen, který moduluje expresi vložená sekvence, nebo specifickým způsobem modifikuje a opracovává genový produkt. Různé hostitelské buňky mají charakteristické a specifické mechanismy pro translační a post-translační opracování a modifikace proteinů.

Vhodné buněčné linie nebo hostitelské systémy se vyberou tak, aby se zajistily požadované modifikace a opracování exprimovaného cizorodého proteinu. Exprese v kvasinkách může poskytnout biologicky aktivní produkt. Exprese v eukaryotických buňkách zvyšuje pravděpodobnost nativního uspořádání (prostorové struktury) proteinu. Navíc exprese v savčích buňkách poskytuje nástroj pro rekonstituci aktivity Akt. A dále různé expresní systémy vektor/hostitel v různé míře ovlivňují reakce opracování proteinu jako např. proteolytické štěpení.

Vektory se vnášejí do požadovaných hostitelských buněk metodami, které jsou v oboru známy, jako je např. transfekce, elektroporace, mikroinjekce, transdukce, buněčná fúze, precipitace s DEAE dextranem, kalciumfosfátová precipitace, lipofekce (lysosomová fúze), užití genového děla nebo transportérů DNA vektorů (viz např. Wu et al. , 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu a Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263:1462114 624; Hartmut et al. , patentová přihláška Kanady č. 2,012,311, podaná 15. března 1990) .

Rozpustné formy proteiny mohou být získány odběrem kultivačního média nebo solubilizací inkluzních tělísek, např. působením detergentů, a pokud je to třeba ještě sonikací nebo jiným mechanickým procesem. Solubilizované nebo rozpustné proteiny se pak izolují různými postupy, které jsou odborníkům známy, jako je např. elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (PAGE), isoelektrická fokusace, dvojrozměrná gelová elektroforéza, různé typy chromatografie (např. chromatografie na iontoměniči, chromatografie na afinitní, imunoafinitní a rozdělovači koloně), centrifugace, diferenční solubilita, immnoprecipitace a další standardní techniky purifikace proteinů.

Genová terapie a transgenní vektory

Jak již bylo diskutováno výše, předkládaný vynález se týká schopnosti proteinů Akt stimulovat expresi VEGF, proteinu, který indukuje angiogenezi. Tudíž se předkládaný vynález týká také genové terapie, která spočívá v tom, že se podává nukleová kyselina kódující protein Akt pacientovi trpícímu ischemickým onemocněním. K ischemickým onemocněním patří, jak již bylo uvedeno, cerebrovaskulární ischémie, renální ischémie, pulmonární ischémie, ischémie končetin, onemocnění periferních artérií, intermitentní klaudikace, ischémie myokardu, a ischemická, idiopatická nebo hypertrofická kardiomyopatie.

Nukleová kyselina kódující Akt, kde je to vhodné vložena do vektoru, a farmaceutické přípravky, které ji obsahují, se užívají k léčení ischemické tkáně. Užijí se pro přenos expresi genů in vivo v jakémkoliv typu ischemické tkáně, zejména v tkáni srdce. Navíc může být léčení cíleno podle konkrétní nemoci, která je léčena (transfer do určité tkáně je určen zejména výběrem vektoru a exprese zas výběrem určitého promotoru). Nukleové kyseliny nebo vektor podle vynálezu se u lidí nebo zvířat výhodně užívají k in vivo intracelulární proteinů Akt schopných stimulovat expresi VEGF proteinů. Předkládaný vynález tak umožňuje specificky, lokálně a účinně léčit ischémii.

Nukleová kyselina kódující protein Akt se podává samotná nebo v kombinaci s nukleovou kyselinou kódující angiogenní faktor. Ke známým angiogenním faktorům patří bazický a kyselý růstový faktor fibroblastů (bFGF a aFGF), FGF-5 (patent US 5,661,133), růstový faktor endotelových buněk (Pu et al. , 1993, Circulation 88:208-2156), angiopoetin a VEGF (viz přehledné články Melillo et al., 1997 a Lewis et al. , 1997). Bylo identifikováno několik forem VEGF, jako je VEGF121 (Patent US 5,219,739), VEGF165 (Patent US 5,332,672); VEGF189 (Patent US 5,240,848), VEGF206, VEGF-2 (WO 95/24473; WO 96/39515); VEGF-B (Patenty US 5,607,918 a 5,840,693), a VEGF-D (WO 97/12972). Nukleová kyselina kódující protein Akt se může podávat také v kombinaci s iontem přechodného kov jako je např. CoCl2, který, jak bylo ukázáno, zvyšuje expresi genu VEGF a stimuluje vaskularizaci(Patent US 5,480,975).

Jak již bylo diskutováno výše, vektor je jakkoliv prostředek pro přenos nukleových kyselin podle vynálezu do hostitelských buněk: Výhodné vektory jsou virové vektory, jako jsou např. retroviry, herpetické viry, adenoviry, a adenoasociované viry. Takže gen kódující protein nebo polypeptid Akt je vnesen do buněk in vivo, ex vivo nebo in vitro užitím virového vektoru nebo přímým vnesením DNA.

Exprese ve vybrané (zaměřené) cílové tkáni může být způsobena zaměřením transgenního vektoru do specifických buněk, jako je tomu při užití virového vektoru nebo receptorového ligandu, nebo užitím tkáňově-specifického promotoru, nebo současným užitím obou způsobů.

Virové vektory obecně užívané pro in vivo zaměřování a terapeutické postupy jsou vektory založené na DNA a retrovirové vektory. Metody konstrukce a využití virových vektorů jsou odborníkům známy [viz např. Miller a Rosman, BioTechniques 7:980-990 (1992)]. Vhodně jsou virové vektory replikačně defektní, tzn. nejsou schopně autonomní replikace v cílové buňce. Obecně řečeno, genom replikačně defektních virových vektorů, které se užívají podle vynálezu, postrádá alespoň jeden z úseků, které jsou nezbytné pro replikaci viru v infikované buňce. Tyto úseky mohou být eliminovány (jako celek nebo částečně) tím, že se vyřadí jejich funkce, a to jakýmkoliv způsobem, který je odborníkům znám. K těmto způsobům patří úplné odstranění, substituce (jinou sekvencí, • · · » · · · • · »· · * · zejména vloženou nukleovou kyselinou), částečná delece nebo adice jedné nebo více bází v úseku nezbytném pro replikaci. Tyto způsoby se provádějí in vitro (s izolovanou DNA) nebo in šitu, s využitím metod genového inženýrství nebo působení mutagenních činidel. Výhodně si replikačně defektní viry ponechávají sekvenci ze svého genomu, která je nezbytná pro enkapsidaci (zabalení) virových částic.

K DNA virovým vektorům patří atenuované (oslabené) nebo defektní DNA viry, jako jsou (avšak výčet není omezující) např. virus herpes simplex (HSV), papillomavirus, virus

Epstein-Barrové (EBV), adenovirus, adeno-asociovaný virus (AAV) , virus vakcínie apod. Výhodné jsou takové defektní viry, které úplně nebo téměř úplně postrádají virové geny. Defektní virus není po vnesení do buňky replikačně kompetentní, tudíž nezpůsobuje produktivní virovou infekci. Použití defektních virových vektorů umožňuje podávání do buněk ve specifické lokalizované oblasti, a to bez obav, že by virus infikoval jiné buňky. Takže je možné specificky zaměřovat jen určitou tkáň. K příkladům konkrétních vektorů patří (aniž by výčet byl omezující) vektor defektního herpes viru 1 (HSV 1) [Kaplitt et al. , Molec. Cell. Neurosci. 2:320-330 (1991)], vektor defektního herpes viru postrádající gen pro glykoprotein L publikace RD 371005 A] , nebo další vektory [Mezinárodní

29. Září publikovaná 2. Dubna 1994]; atenuované adenovirové vektory jako je např. vektor popsaný v Stratford-Perricaudet et al. [J. Clin. Invest. 90:626-630 (1992); a také La Salle et al. ,

Science 259:988-990 (1993)); a vektory defektních adenoasociovaných adenovirů [Samulski et al., J. Virol. 61:30963101 (1987); Samulski et al. , J. Virol. 63:3822-3828 (1989);

al. , Mol. Cell. Biol.

[Patentová defektních WO 94/21807, herpes virů publikovaná patentová přihláška 1994; WO 92/05263,

Lebkowski et

8:3988-3996 (1988)].

Výhodně se při podávání in vivo užívá vhodná imunosupresivní léčba společně s virovým vektorem, např. adenovirovým vektorem, aby se zabránilo imuno-deaktivaci virového vektoru a transfekovanch buněk. Např. se podávají imunosupresivní cytokiny, jako je např. interleukin-12 (IL-12), interferon-γ (IFN-γ) nebo anti-CD4 protilátka, pro zablokování humorální nebo buněčné imunitní reakce na virový vektor [viz např. Wilson, Nátuře Medicine (1995)]. Navíc je vhodné užít virové vektory, které jsou upraveny tak, aby exprimovaly co nejmenší počet antigenu.

Přirozeně vynález předpokládá pro terapeutické použití podávání takového vektoru, který zajistí expresi terapeuticky účinného množství Akt. Termín terapeuticky účinné množství zde označuje množství, které je dostatečné k tomu, aby vedlo k významnému zlepšení klinicky významného ischemického onemocnění.

Adenovirové vektory

Ve výhodném provedení vynálezu je vektorem adenovirový vektor. Adenoviry jsou eukaryotické DNA viry, které mohou být modifikovány pro účinný přenos nukleových kyselin podle vynálezu do buněk různých typů. Existují různé sérotypy adenovirů. Z těchto sérotypů jsou podle vynálezu výhodné humánní adenoviry typu 2 a typu 5 (Ad 2 Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (viz WO 94/26914). K adenovirům zvířecího původu, které lze užít pro realizaci předkládaného vynálezu, patří psí, kravské, myší (např. Mávl, Beard et al. , Virology 81), ovčí, prasečí, ptačí a opičí (např. Výhodné adenoviry zvířecího původu jsou výhodněji je to adenovirus CAV2 (např.

(1990) adenoviry. adenoviry,

SAV) psí kmen

Manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)).

Výhodně replikačně defektní adenovirové vektory podle vynálezu obsahují ITR, tj. enkapsidační sekvence, a požadovanou nukleovou kyselinu. Nejvýhodněji přinejmenším úsek El adenovirového vektoru je nefunkční. Delece v úseku El výhodně zahrnuje nukleotidy 455 až 3329 v sekvenci adenovirus Ad5 (PvuII-BglII fragment) nebo 382 až 3446 (HinfII-Sau3A fragment). Další úseky mohou být také modifikovány, zejména úsek E3 (WO 95/02697), úsek E2 (WO 94/28938), úsek E4 (WO 94/28152, WO 94/12649 a WO 95/02697), nebo také kterýkoliv z pozdních genů LI až L5.

Ve výhodném provedení vynálezu má adenovirový vektor deleci v úseku El (Ad 1.0). Příklady adenovirů s delecí v El jsou popsány např. v EP 185,573, který je zahrnut formou odkazu. V jiném výhodném provedení vynálezu má adenovirový vektor delece v úsecích El a E4 (Ad 3.0). Příklady adenovirů s delecemi v E1/E4 jsou popsány v WO 95/02697 a WO 96/22378, které jsou zahrnuty formou odkazu. V ještě dalším výhodném provedení vynálezu má adenovirový vektor deleci v úseku El, kam byl vložen úsek E4 a požadovaná nukleová kyselina (viz FR 94/13355, je vložen formou odkazu).

Replikačně defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu se připravují metodami, které jsou odborníkům známy, (viz Levrero et al. , gen 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham,

EMBO J. 3 (1984) 2917) . Zejména se připravují homologní rekombinací mezi adenovirem a plazmidem, který nese krmě jiného požadovanou sekvenci DNA. K homologní rekombinací dojde po kotransfekci adenovirů a plazmidu do vhodné buněčné linie. Vhodná buněčná linie by měla především (i) být uvedenými elementy, a (ii) komplementovat část genomu defektního adenovirů, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo vzniku rekombinace. K příkladům výhodných linií, obsahovat replikačně transformovatelná sekvence schopné ·· ·· které lze užít k realizaci předkládaného vynálezu, patří buněčná linie humánních embryonálních ledvinných buněk 293 (Graham et al. , J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), které obsahují levostrannou část genomu adenoviru Ad5 (12 %) integrovanou ve svém genomu, a buněčné linie schopné komplementovat funkce El a E4, které byly popsány v mezinárodních patentových přihláškách WO 94/26914 a WO 95/02697. Rekombinantní adenoviry se izolují a purifikují standardními metodami užívanými v molekulární biologii, které jsou odborníkům dobře známy.

Vektory adeno-asociovaných virů

Adeno-asociované viry (AAV) jsou DNA viry relativně malé velikosti, které se integrují trvalým a místně specifickým způsobem do genomu buňky, kterou infikovaly. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by ovlivnily jejich růst, morfologii nebo diferenciaci, a zjevně se nepodílejí na žádné nemoci u lidí. Genom AAV byl klonován, sekvencován a charakterizován. Je tvořen přibližně 4700 bázemi a obsahuje na každém konci úsek invertované terminální repetice (inverted terminál repeat, ITR) velikosti 145 bází, který slouží jako replikační počátek viru. Zbytek virového genomu je rozdělen na dva esenciální úseky, které nesou enkapsidační funkci: levostranná část genomu, která obsahuje gen rep nutný pro replikaci viru a expresi virových genů; a pravostrannou část genomu, která obsahuje gen cap kódující proteiny virové kapsidy.

Použití vektorů odvozených z AAV pro přenos genů in vitro a in vivo bylo popsáno např. v dokumentech WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941 a EP 488 528. Tyto publikace popisují různé konstrukty odvozené z AAV, ve kterých byl deletován gen rep a/nebo cap a nahrazen požadovaným genem, a použití těchto konstruktů pro in vitro přenos požadovaného genu (v buněčných kulturách) nebo pro in vivo přenos (přímo do organismu). Replikačně defektní rekombinantní AAV podle vynálezu se připravují kotransfekcí plazmidu obsahujícího požadovanou nukleovou kyselinu obklopenou dvěma sekvencemi invertované terminální repetice (ITR) z AAV, a plazmidu nesoucího enkapsidační geny AAV (rep a cap), do buněčné linie, která je infikována humánním pomocným virem (helper virus) jako je např. adenovirus. Rekombinantní AAV jsou produkovány a purifikovány standardními postupy, které jsou odborníkům známy.

Předkládaný vynález se proto také týká rekombinantních virů odvozených AAV, jejichž genom obsahuje sekvence nukleové kyseliny kódující Akt3 obklopené ITR z AAV. Vynález se dále také týká plazmidu, které obsahují sekvence nukleové kyseliny kódující Akt3 obklopené dvěma ITR z AAV. Tyto plazmidy mohou být použity pro přenos sekvencí nukleových kyselin, přičemž plazmid může být podle potřeby vložen do liposomového vektoru (tzv. pseudovirus).

Retrovirové vektory

V jiném výhodném provedení vynálezu je gen vložen do retrovirového vektoru, např. jak byly popsány v následujících publikacích: Aerson et al. , Patent US č. 5,3 99,346; Mann et al., 1983, Cell 33:153; Temin et al, Patent US č. 4,650,764; Temin et al. , Patent US č. 4,980,289; Markowitz et al. , 1988, J. Virol. 62:1120; Temin et al., Patent US č. 5,124,263; EP 453242, EP178220; Bernstein et al. Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689; Mezinárodní patentová přihláška WO 95/07358, publikovaná 16. Března 1995, Dougherly et al.; Kuo et al., 1993, Blood 82:845.

Retroviry jsou integrující se viry, které infikují dělící se buňky. Retrovirový genom obsahuje dva úseky LTR, • · · » · · · • <

enkapsidační sekvenci a tří kódující úseky (gag, pol a env) . V rekombinantních retrovirových vektorech jsou geny gag, pol a env obecně řečeno deletovány, celé nebo jejich části, a jsou nahrazeny požadovanou heterologní sekvencí nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být konstruovány z různých typů retrovirů, jako je např. HIV, MoMuLV (myší virus Moloneyho leukémie), MSV (myší virus Moloneyho sarkomu), HaSV (virus Harveyho sarkomu) SNV (virus nekrotizující slezinu); RSV (virus Rousova sarkomu) a Friendův virus. Defektní retrovirové vektory byly např. popsány v WO 95/02697.

Pro konstrukci rekombinantních retrovirů obsahujících sekvence nukleových kyselin se připravují plazmidy, které obsahují LTR, enkapsidační sekvenci a kódující sekvenci. Takový konstrukt se pak užije k infekci tzv. sbalovací (pakážovací) buněčné linie, což jsou buňky schopné doplnit v trans retrovirové funkce chybějící v plazmidu. Obecně sbalovací buněčné jsou schopné exprimovat geny gag, pol a env. Sbalovací buněčné linie byly popsány v dosavadním stavu techniky, jedná se např. o buněčnou linii PA317 (viz US 4,861,719); buněčnou linii PsiCRIP (WO 90/02806) a buněčnou linii GP⁺envAm'12 (WO 89/07150) . Navíc rekombinántní retrovirové vektory mohou obsahovat modifikace v úsecích LTR pro supresi transkripční aktivity a také extenzívní enkapsidační sekvence, které mohou obsahovat část genu gag (Bender et al. , J. Virol. 61 (1987) 1639). Rekombinántní retrovirové vektory se purifikuji standardními postupy, které jsou odborníkům známy.

Retrovirové vektory se konstruují tak, aby byly účinné jako infekční virové částice nebo aby prošly jediným cyklem transfekce. V prvním případě je virus modifikován tak, aby si uchoval všechny svoje geny s výjimkou genů zodpovědných za schopnost onkogenní transformace, a aby exprimoval heterologní gen. Neinfekční virové vektory se připravují narušením virového sbalovacího signálu, ale zachovávají si strukturní geny nutné pro sbalení společně vneseného viru, který obsahuje heterologní gen a sbalovací signál. Takže produkované virové částice již neprodukují další virové částice.

Cílený přenos genů byl popsán v mezinárodní patentové přihlášce WO 95/28494, publikované v říjnu 1995.

Nevirové vektory

Alternativně se vektory in vivo vnášejí do buněk tzv. lipofekcí. V uplynulém desetiletí se ve velké míře užívaly liposomy pro zabalení a transfekci nukleových kyselin in vitro. Syntetické kationtově lipidy připravené kvůli snížení problémů spojených s transfekci zprostředkovanou liposomy byly užity pro přípravu liposomů pro in vivo transfekci gen kódující markér [Felgner; et. al. , Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413-7417 (1987); Mackey, et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031 (1988); Ulmer et al. , Science 259:1745-1748 (1993)]. Použití kationtových lipidů podporuje obalení negativně nabité nukleové kyseliny a také podporuje fúzi s negativně nabitou buněčnou membránou [Felgner a Ringold, Science 337:387-388 (1989)]. Zvláště výhodné lipidové sloučeniny a přípravky vhodné pro přenos nukleových kyselin byly popsány v patentových dokumentech WO 95/18863 a WO 96/17823 a patentu US 5,459,127. Použití lipofekce pro in vivo vnášení exogenních genů do specifických orgánů má jisté praktické výhody. Molekulární zaměřování liposomů do specifických buněk představuje jednu prospěšnou oblast využití. Je jasné, že cílená transfekce konkrétních buněk by byla zvláště výhodná ve tkáních s heterogenitou buněk jako je např. pankreas, játra, ledviny a mozek. Lipidy mohou být pro účel zaměřování chemicky konjugovány s dalšími molekulami (viz

Mackey, et. al. , výše). Na lipidy mohou být chemicky navázány zaměřovači peptidy, např. hormony nebo neurotransmitery, a proteiny jako např. protilátky, nebo nepeptidové molekuly.

Další molekuly mohou být užitečné pro usnadnění in vivo transfekce nukleových kyselin, a sice např. kationtové oligopeptidy (např. WO 95/21931), peptidy odvozené z DNA vazebných proteinů (např. WO 96/25508), nebo kationtové polymery (např. WO 95/21931).

Je také možné vnášet vektory in vivo ve formě nahé plazmidové DNA (viz patenty US č. 5,693,622, 5,589,466 a 5,580,859). Vektory nahé DNA se vnášejí do hostitelských buněk některou z metod, které jsou odborníkům známy, jako je např. transfekce, elektroporace, mikroinjekce, transdukce, buněčná fúze, precipitace precipitace s DEAE-dextraném, s kalciumfosfátem, použití genového děla nebo transportérů

DNA vektorů [např. Wu et al. , J. Biol. Chem. 267:963-967 (1992); Wu a Wu, J. Biol. Chem. 263:14621-14624 (1988);

Hartmut et al., patentová přihláška Kanady č. 2,012,311, podaná 15. Března 1990; Williams et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:2726-2730 (1991)]. Lze také využít přenos DNA zprostředkovaný receptory [Curiel et al. , Hum. gen Ther. 3:147-154 (1992); Wu a Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] . K výhodným vektorům pro přenos nahé DNA patří plazmid pCOR mající podmíněný replikační počátek (viz WO 97/10343), a minikruhový plazmid postrádající replikační počátek a markerový gen (WO 96/26270).

Farmaceutické přípravky a jejich podávání

Předkládaný vynález se týká farmaceutických přípravků.

Tyto přípravky obsahují protein nebo polypeptid Akt nebo nukleovou kyselinu kódující protein nebo polypeptid Akt, jak byly definovány v předchozím textu, a farmaceuticky přijatelný nosič nebo vehikulum. Přípravky podle vynálezu jsou zvláště výhodné k formulaci biologického materiálu pro genovou terapii. Ve výhodném provedení vynálezu přípravky obsahují nukleové kyseliny kódující humánní protein nebo polypeptid Akt.

Přípravek podle vynálezu obsahuje protein Akt nebo nukleovou kyselinu kódující protein Akt. A navíc může přípravek obsahovat nukleovou kyselinu kódující angiogenní faktor.

Ke známým angiogenním faktorům patří bazický a kyselý růstový faktor fibroblastů (bFGF a aFGF), FGF-5 (patent US 5,661,133), růstový faktor endotelových buněk (Pu et al. , 1993, Circulation 88:208-2156), angiopoetin a VEGF (viz přehledné články Melillo et al. , 1997 a Lewis et al. , 1997). Bylo již identifikováno několik forem VEGF, jako je VEGF₁₂₁ (Patent US 5,219,739), VEGFi₆₅ (Patent US 5,332,672); VEGF₁₈₉ (Patent US 5,240,848), VEGF₂₀₆ , VEGF-2 (WO 95/24473; WO 96/39515); VEGF-B (Patenty US 5,607,918 a 5,840,693), a VEGF-D (WO 97/12972). Přípravek může dále obsahovat ion přechodného kov jako je např. CoCl_2/ který, jak bylo ukázáno, zvyšuje expresi genu VEGF a stimuluje vaskularizaci (Patent US 5,480,975). Protein Akt nebo nukleová kyselina se mohou podávat také společně s vasodilatačním činidlem. K vhodným příkladům vasodilatačních činidel (vasodilatans) patří nitrovasodilatans (jako je např. nitroprussid a nitroglycerin) , nespecifická vasodilatans (např. hyrdralizin a papaverin), agonisté adenosinového receptoru, činidla blokujííc kalciové kanályf, alfa-blokátory (např. prazosin), endogenní vasodilateční peptidy nebo příbuzné peptidové analogy (např. substance P, CGRP), aktivátor K kanálů, inhibitory ACE nebo blokátory angiotensinového receptoru, • · ⁵⁰ blokátory endothelinového receptoru nebo inhibitory ECE, a vasodilatační prostaglainy.

Jakýkoliv vektor podle vynálezu, ať již virový nebo nevirový, je výhodně při užití in vivo ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo vehikulu. Termín farmaceuticky přijatelný se týká sloučeniny nebo přípravku, které jsou fyziologicky tolerovány a nevyvolávají při podání člověku alergické nebo podobné nežádoucí reakce jako je např. podráždění žaludku nebo nevolnost. Termín farmaceuticky přijatelný výhodně znamená, že příslušná látka byla schválena odpovídajícími úřady, ať již státními nebo federálními, pro veterinární a zejména humánní farmaceutické použití a je uvedena v Lékopisu USA nebo jiném všeobecně uznávaném lékopise. Termín nosič označuje ředidla, adjuvans, excipienty nebo jiná vehikula, s nimiž je sloučenina podle vynálezu podávána. K takovým farmaceutickým nosičům patří např. sterilní kapalina jako je voda nebo olej, ať již minerálního, živočišného, rostlinného nebo syntetického původu, jako je např. podzemnicový olej, sojový olej, minerální olej, sezamový olej a další. Voda nebo vodné roztoky solí a vodný roztok dextrózy a glycerolu se výhodně užívají jako nosiče, zejména pro injikovatelné roztoky. Vodné farmaceutické nosiče jsou přehledně popsány v publikaci E.W. Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu jsou formulovány pro topické, perorální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární nebo i j iné podávání.

Výhodně farmaceutické přípravky podle vynálezu obsahují farmaceuticky přijatelná vehikula pro injekční přípravky. To jsou zejména sterilní, isotonické solné roztoky (fosforečnan a difosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý a obsahujících 10⁴ až 10¹⁴ pfu, výhodně 10⁶ až 10 horečnatý apod., nebo jejich směsi). Nebo jde výhodně o suché, výhodněji lyofylizované přípravky, které po přidání sterilní vody nebo fyziologického roztoku vytvoří injikovatelný přípravek.

Přípravky jsou výhodně ve sterilním, isotonickém solném roztoku (fosforečnan a difosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý a hořečnatý apod., nebo jejich směsi), nebo jsou to suché přípravky, výhodně lyofylizované přípravky, které po přidání, je-li to vhodné, sterilní vody nebo fyziologického roztoku vytvoří injikovatelný přípravek

Výhodné sterilní injikovatelné přípravky jsou roztoky nebo suspenze v netoxickém parenterálně přijatelném rozpouštědle nebo ředidle. K příkladům takových farmaceuticky přijatelných nosičů patří roztok soli, pufrovaný roztok soli, isotonický roztok soli (fosforečnan a difosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý a hořečnatý apod., nebo jejich směsi), Ringerův roztok, dextróza, voda, sterilní voda, glycerol, etanol a kombinace těchto látek. Jako rozpouštědlo nebo suspendační médium se obvykle užívají 1,3-butanol a sterilní stálé oleje. Jakýkoliv nedráždivý stálý olej se může užít, včetně syntetických mono- nebo diglyceridů. Mastné kyseliny jako např. kyselina olejová, jsou také využitelné pro přípravu injikovatelných přípravků.

Dávky nukleových kyselin podle vynálezu, buďto samotných nebo vložených do vektoru, použité pro podávání, se musí upravit v závislosti na různých parametrech, jako je zejména způsob podávání, léčená nemoc, exprimovaný gen, očekávaná doba léčení apod. Obecně lze říci, že v případě rekombinantních virů podle vynálezu, jsou formulovány a podávány v dávkách ¹⁰ pfu. Termín forming unit) charakterizuje infekčnost pfu (plaque (infekční sílu) roztoku viru a stanovuje se testem infekce vhodné buněčné kultury, obecně po 48 hodinách jako počet plaků infikovaných buněk. Metody stanovení pfu titru viru jsou dobře popsány v odborné literatuře

Přípravky podle vynálezu se podávají parenterálně nebo transmukosálně, např. perorálně, nasálně nebo rektálně, nebo transdermálně. Výhodné je podávání parenterální, např. intravenózní injekcí, a také např. (aniž by výčet byl omezující) infraarteriolární, intramuskulární, intradermální, subkutánní, intraperitoneální, intraventrikulární, a intrakraniální. Přípravky se mohou také podávat injekcí přímo do léčeného místa, zejména do srdce.

Výhodný způsob podávání do srdce je podávání injekcí přímo do srdce (viz patenty US 5,693,622 a 5,661,-133). Srdce se přitom monitoruje některou ze známých zobrazovacích metod, jako je např. magnetická resonance nebo počítačová tomografie, a terapeutický přípravek se podává stereotaktickou injekcí např. do ischemických úseků myokardu.

Výhodně je exprese Akt omezena na kardiomyocyty, a sice užitím promotoru specifického pro srdce nebo vektoru se specifickým tropismem pro srdeční buňky.

Podávání do srdce se může také provádět pomocí katetru. Různé porézní, balónkové, dvojité balónkové nebo hydrogelové katetry byly popsány např. v patentech US 5,851,521, 5,652,225, 5,328,470, 5,698,531, 5,707,969, 5,830,879 a 5,674,192.

V ještě dalším výhodném provedení vynálezu se farmaceutický přípravek obsahující polypeptid Akt nebo nukleovou kyselinu kódující polypeptid Akt podává pomocí terapeutického systému s řízeným uvolňováním léčiva. Např. nukleová kyselina nebo polypeptid se podává pomocí intravenózní infúze, implantovatelné osmotické pumpy, transdermální náplasti, liposomů apod. V jednom výhodném provedení vynálezu je užita pumpa [viz Langer, výše; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al. ; N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)]. V jiném výhodném provedení vynálezu se užívá polymerní materiál [viz Medical Applications of Controlled Release, Longer a Wise (eds.), CRC Press: Boča Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug product Design a Performance, Smolen a Balí (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger a Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); viz také Levý et al. , Science 228:190 (1985); During et al. , Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al. , J.Neurosurg. 71:105 (1989)]. V ještě dalším výhodném provedení vynálezu je systém s řízeným uvolňováním umístěn do blízkosti terapeutického cíle, tj . např. srdce, aplikují se pak jen části dávky, než jaká by byla potřeba při systémovém podávání [viz např. Goodson, in Medical Applications Controllled Release, viz výše, vol. 2, pp. 115-138 (1984)]. Další systémy s řízeným uvolňováním léčiva jsou uvedeny v přehledné publikaci Langera [Science 249:1527-1533 (1990)].

Takže přípravky podle vynálezu se podávají intravenózně, intraarteriálně, intraperitoneálně, intramuskulárně nebo subkutánně. Alternativně jsou přípravky formulovány pro nasální nebo perorální podávání. Konstantní přívod biologického materiálu je možné zajistit poskytnutím terapeuticky účinné dávky (tj. dávky, která způsobí metabolickou změnu u pacienta) v potřebných intervalech, např. jedenkrát denně, každých 12 hodin apod. Tyto parametry závisí na závažnosti onemocnění a dalších faktorech jako je např. úprava diety, pohlaví, hmotnost a věk pacienta a další faktorech, které odborník snadno určí.

Předkládaný vynález se týká také způsobů inhibice angiogeneze u pacientů trpících nádorovým onemocněním tím, že se inhibuje hladina Akt a tím se inhibuje tvorba VEGF. Hladina Akt se může snížit vnesením Akt antisense nukleových kyselin do buněk pacienta v podmínkách, kdy tyto antisense nukleové kyseliny hybridizují v buňkách s Akt mRNA. Hladina Akt může být také snížena vnesením intracelulárního vazebného proteinu, jako je např. jednořetězcová protilátka Fv (scFv), který se specificky váže na Akt v buňkách pacienta v množství dostatečném k tomu, aby se navázal na Akt a inaktivoval ho. V jiném provedení vynálezu je aktivita Akt snížena tím, že se podává nukleová kyselina kódující dominantní negativní formu Akt. Výhodně se antisense nukleová kyselina, intracelulární vazebný protein nebo nukleová kyselina kódující intracelulární vazebný protein nebo dominantní negativní formu Akt podávají přímo do buněk nádoru.

Antisense sekvence podle vynálezu je komplementární k sekvenci kódující protein Akt a tlumí nebo blokuje expresi proteinu Akt. Ve výhodném provedení vynálezu je to antisense polynukleotidová molekula. Příprava a použití antisense polynukleotidů, DNA kódující molekuly antisense RNA a použití antisense oligonukleotidů bylo popsáno např. v mezinárodní přihlášce WO 92/15680, která je vložena formou odkazu.

Antisense nukleové kyseliny podle vynálezu jsou výhodně RNA schopně specificky hybridizovat s celou nebo částí DNA sekvence kódující protein Akt, nebo s odpovídající messenger RNA. Antisense sekvence podle předkládaného vynálezu se odvodí ze sekvence DNA, jejíž exprese v buňce vede k tvorbě RNA komplementární k celé nebo části humánní Akt mRNA. Tyto antisense sekvence se připraví expresí celé nebo části sekvence kódující protein Akt v opačné orientaci (EP 140 308). Jakákoliv délka antisense sekvence je vhodná pro realizaci vynálezu pokud je schopná tlumit nebo blokovat expresi Akt. Výhodně jsou antisense sekvence dlouhé alespoň 20 nukleotidů.

• · ·

V jiném aspektu tohoto výhodného provedení vynálezu nukleová kyselina kóduje antisense RNA molekuly. V tomto výhodném provedení je nukleová kyselina operativně spojena se signály, které umožňují expresi sekvence nukleové kyseliny, a je vnesena do buňky výhodně jako rekombinantní vektor, který bud exprimovat antisense nukleovou kyselinu jakmile vstoupí do buňky. Příkladem vhodných vektorů jsou plazmidy, adenoviry, adeno-asociované viry, retroviry, a herpetické viry.

Další výhodné provedení vynálezu se týká specifické inhibice angiogeneze prostřednictvím inhibice aktivity Akt, kdy se exprimuje sekvence nukleové kyseliny kódující intracelulární vazebný protein schopný v transfekované buňce selektivní interakce s Akt. Dokumenty WO 94/29446 a WO 94/02610 (které jsou celé zahrnuty formou odkazu), popisují transfekci buněk geny kódujícími intracelulární vazebný protein. K intracelulárním vazebným proteinům patří jakýkoliv protein schopný selektivní interakce nebo vazby s proteinem Akt v buňce, ve které je exprimován, a funkci navázaného proteinu Akt. Výhodně vazebný protein protilátka nebo fragment protilátky.

Dokument WO 94/02610 popisuje přípravu protilátek a identifikaci nukleových kyselin kódujících určitou protilátku. Užitím proteinu Akt nebo jeho fragmentu se připraví monoklonální protilátka specifická k proteinu metodami, které jsou odborníkům známy. Pak se připraví způsoby podle vynálezu vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující intracelulární vazebný protein nebo jeho část, a schopný exprese v hostitelské buňce. Vhodné vektory a způsoby přenosu nukleové kyseliny kódující intracelulární vazebný protein do buněk obsahujících Akt jsou stejné jaké byly popsány v předchozím textu. Sekvence nukleové kyseliny kódující intracelulární Akt vazebný protein mohou navíc obsahovat sekvenci kódující tím neutralizovat je intracelulární • · · · · · • · · lokalizační signál pro cílení intracelulárního vazebného proteinu do místa v buňce, kde se vyskytuje Akt a/nebo sekvenci zajišťující lokalizaci intracelulárního vazebného proteinu v plazmatické membráně. Lokalizační signál nebo inzerční sekvence mohou být umístěny kdekoliv na intracelulárním vazebném proteinu, pokud to nenarušuje vazbu s Akt. Příklady lokalizačních signálů jsou uvedeny např. v WO 94/02610.

V dalším výhodném provedení vynálezu je Akt aktivita snížena podáváním nukleové kyseliny kódující dominantní negativní formu Akt. Příklady dominantních negativních forem Akt byly popsány např. v Fujio et al. , 1999 (J. Biol. Chem.

274(23):16349-16354), Wang et al., 1999 (Mol. Cell Biol. 19(6): 4008-4018), Jiang et al. , 1999 (Proč. Nati: Acad. Sci.

96(5): 2077-2081), a Gerber et al. , 1998 (J. Biol. Chem. 273 (46) : 30336-30343) .

Výhodným organismem, kterému se podává biologický materiál podle vynálezu, je člověk, ale může to být i jakékoliv zvíře. Farmaceutické přípravky podle vynálezu jsou určeny také pro veterinární použití, zejména pro podávání savci, jako jsou (aniž by výčet byl omezující) např. domácí zvířata jako kočka nebo pes, hospodářská zvířata jako kráva, kůň, koza, ovce, prase, divoká zvířata (ať již volně v přírodě nebo držená v zoologické zahradě), laboratorní zvířata jako myš, potkan, králík, koza, ovce, prase, pes, kočka a další, ale i pro podávání ptákům, jako např. kuřata, krocani, zpěvní ptáci a další.

Předkládaný vynález je dále podrobněji vysvětlen pomocí příkladů. Tyto příklady mají ilustrativní funkci a vynález nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Obecné metody molekulární biologie použité v příkladech j sou popsány v odborné

T. et al., Molecular Spring Harbor (2nd Ed. 1989);

Cold

Metody tradičně užívané v molekulární biologii, jako je např. preparativní extrakce plazmidové DNA, centrifugace plazmidové DNA cesiumchloridovém gradientu, elektroforéza na agarózovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů užitím fenolu nebo fenol/chloroformu, ethanolová nebo isopropanolová precipitace DNA v solném roztoku, transformace Escherichia coli a další j sou odborníkům dobře známy a literatuře [viz např. Maniatis

Klonování, a Laboratory Manual,

Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982;

Ausubel F.M. et al. (eds), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1987].

K obvyklým klonovacím vektorům patří plazmidy typu pBR322 pUC a fágy série M13, které jsou běžně komerčně dostupné (např. Besda Research Laboratories).

Pro ligaci se fragmenty DNA separovaly podle velikosti elektroforézou na agarózovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovaly fenolem nebo směsí fenol/chloroform, precipitovaly ethanolem a inkubovaly v přítomnosti fágové T4 DNA ligázy (Biolabs) podle doporučení výrobce.

Zaplnění přečnívajících 5'-konců se provedlo pomocí Klenowova fragmentu E. coli DNA polymerázy I (Biolabs) podle doporučení výrobce.

Odstranění přečnívajících 3'-konců se provedlo v přítomnosti fágové T4 DNA polymerázy (Biolabs) podle doporučení výrobce, odstranění přečnívajících 5'-konců se provedlo pomocí řízeného působení S1 nukleázy.

In vitro mutageneze cílená pomocí syntetických oligonukleotidú byla provedena postupem, který vyvinuli Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] a užitím soupravy od firmy Amersham.

Enzymatická amplifikace fragmentu DNA v PCR byla provedena podle publikovaného postupu (Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al. , Science 230 (1985) 13501354; Mullis K.B. a Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335350] užitím DNA termální cykleru (Perkin Elmer Cetus) podle instrukcí výrobce.

Verifikace nukleotidových sekvencí byla provedena sekvencováním podle Sangera et al. [Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] užitím soupravy od firmy Amersham.

Plazmidové DNAs byly purifikovány užitím soupravy Plazmid Purification System od firmy Qiagen podle instrukcíé výrobce.

Příklad 1

Klonování humánního Akt3

Tento příklad popisuje klonování nukleové kyseliny Akt3 protein.

Příklad 1.1: Screening cDNA knihovny na Akt3

Prohledávání databází odhalilo, že jeden humánní cDNA klon obsahuje úsek humánní cDNA sekvence, který je homologní, ale odlišný od humánní Aktl a Akt2. Pro izolaci úplné kódující sekvence této dosud neznámé humánní isoformy Akt (označena jako humánní Akt3) byl proveden screening humánní cDNA knihovny srdeční tkáně pomocí cDNA sondy odpovídající 5'-UTR úseku a kódujícímu úseku N-konce humánního Akt3.

Humánní cDNA klon (ID# 479072) byl zakoupen od firmy Genome System lne. Jeden fragment této DNA, která obsahuje část 5'-UTR (netranslatovaný úsek) a část 5'-kódující sekvence humánního Akt3, byl amplifikován v polymerázové řetězové reakci (PCR) užitím následujících oligonukleotidových primerú:

AKT3-5'UTR-F3 (5'-TCC AAA CCC TAA AGC TGA TAT CAC-3';

sekvence id. č. 3) a

AKT3-C-R1 (5'—CCT GGA TAG CTT CTG TCC ATT C-3'; sekvence id. č. 4). Sonda cDNA byla značena pomocí [oc-P32]dCTP užitím značící soupravy Random Primer DNA labeling kit (Boerhinger Mannheim) podle instrukcí výrobce. Sonda byla purifikována užitím chromatografické centrifugační kolonky od firmy Bio-Rad podle instrukcí výrobce.

Více než jeden milion fágových klonů bylo na počátku užito při screening cDNA knihovny (Clontech, katalog. č. HL5027t). Hostitelské buňky XLl-B byly inokulovány ve 37 °C přes noc v LB médiu (přidán 20 mg/ml tetracyklin, 0,2% maltóza a 10 mM MgCl₂) . Fágová infekce a otisk na membránu byly provedeny postupem, jak je popsán v příručce Maniatis; 1989. Membrány byly denaturovaný, renaturovány a zapečeny, pak prehybridizovány v hybridizačním roztoku 4 hodiny při 65 °C. Denaturovaná forma sondy značené P32 (10 minut tepelné denaturace) byla přidána pro hybridizaci přes noc. Po hybridizaci byly membrány postupně oplachovány v 2x SSC/0,1% SDS, lxSSC/0,1%SDS a 0,5xSSC/0,l% SDS při 65°C. Membrány byly usušeny na vzduchu a exponovány na rentgenové filmy Kodak. Po tomto primárním screeningu byly pozitivní klony selektovány v sekundárním a terciárním screeningu. Výsledné pozitivní fágy byly purifikovány, a fágová DNA byla konvertována na plazmidovou DNA užitím hostitelských buněk BM25.8-25 (Boerhinger Mannheim) podle instrukcí výrobce.

Dva pozitivní klony byly vybrány pro úplné sekvencování a další charakterizaci. Jeden z těchto klonů (klon #9) obsahuje část 5¹-UTR a N-koncovou kódující sekvenci (aa 1 až 127) humánního Akt3. Druhý klon (klon #1) obsahuje většinu humánní Akt3 sekvence (aa 15 až C-konec) a 3'-UTR. Úplná cDNA (plné délky) sekvence byla vytvořena fúzí těchto dvou částečných sekvencí. Úplná sekvence kódující humánní Akt3 je zde uvedena jao sekvence id. č. 1. Odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena jako sekvence id. č. 2. Akt3 je kratší než Aktl a Aktl, a mezi Akt3 a Aktl nebo Aktl a C-koncem molekuly není žádná významná homologie. Zejména posledních 14 aminokyselin v C-koncovém úseku humánního Akt-3 se odlišuje od aminokyselin přítomných v humánním Aktl a Aktl.

Příklad 2

Konstrukce expresních plazmidú Akt3

Tento příklad popisuje konstrukci expresního plazmidú pro aktivovaný Akt3. První dva částečné cDNA klony (klon #1 a klon #9, popsané výše) byly fúzovány a byla tak získána úplná kódující sekvence AKT3. DNA obsahující humánní Src myristylační sekvenci byla fúzována k N-konci úplné Akt3 sekvence. Sekvence značky HA-tag byla fúzována k C-konci úplné Akt3 sekvence (pro detekci exprese). Tato chimérická sekvence MyrAkt3HA byla vložena pod kontrolu promotoru CMV. Celý konstrukt byl nazván CMV6-MyrAkt3HA (Obr. IA).

Příklad 2.1: CMV6-MyrAktHA

Tento příklad popisuje konstrukci plazmidú schopných exprimovat Akt3 a konstitutivně aktivní formu humánního Akt3.

Úplná kódující sekvence Akt3 byla získána PCR amplifikací

klonu #1 užitím následujících	primerů:
hAKT3cl9-PCRS(F):	(5'-	ATG	AGC	GAT	GTT	ACC	ATT	GTG AAA
GAA GGT TGG GTT CAG AAG	AGG	GGA	GAA	TAT	ATA	AAA	AAC	TGG AGG
CCA AG - 3 ' ; sekvence	id.	sz c.	5) ,	který obsahuje	kóduj ící

sekvence prvních 24 aminokyselin Akt3, a hAKT3cll-PCR3 (R) : (5' - TTA TTT TTT CCA GGT ACC CAG CAT

GCC - 3'; sekvence id. č. 6).

Pro vytvoření konstitutivně aktivní formy Akt3 byla úplná kódující sekvence Akt3 amplifikována v PCR s následujícími primery:

MyrAKT3Ha-Fl(5' - GCG CGC GAA TTC CCA CCA TGG GTA GCA ACA AGA GCA AGC CCA AGG ATG CCA GCC AGC GGC GCC GCA GCA GCG ATG TTA CCA TTG TGA AAG - 3'; sekvence id. č. 7), který obsahuje Kozákovu sekvenci (CCACC); myristylační sekvenci z humánního src (podtržena) a prvních 8 aminokyselin z humánního Akt3 (tučně), a

MyrAKT3Ha-R (5' - GCG CGC GGG CCC TTA GGC GTA GTC GGG GAC GTC GTA CGG GTA TTT TTT CCA GTT ACC CAG CAT GCC - 3'; sekvence id. č. 8), který obsahuje kódující sekvenci značky HA-tag (tučně). PCR produkt byl naštěpen EcoRI/Apal a subklonován do EcoRI/Apal míst plazmidu pCDNA3.1, čímž byl připraven pCDNA3Myr-Akt-HA. Kódující sekvence MyrAktHA byla také PCR amplifikována a subklonována do Kpnl/EcoRI míst vektoru CMV6. Pro tuto PCR reakci byly použity následující primery:

CMV6-AKT3cat-F (5' - CGG GGT ACC ACC ATG GGT AGC AAC AAG

AGC AAG CCC AAG GAT GCC AGC CAG - 3'; sekvence id. č. 9}, a

CMV6-AKT3cat-R (5' - CCG GAA TTC TTA GGC GTA GTC GGG

GAC GTC - 3'; sekvence id. č. 10). Plazmid byl verifikován sekvencováním shrnuto, DNA antibiotik).

(DNA:LipofectAmine = lmg směs DNA/LipofectAmine

Příklad 2.2: Exprese humánního AKT3

Tento příklad popisuje expresi humánního AKT3 ve tkáňové kultuře. Buňky HEK293 a COS-7 byly kultivovány v médiu DME obsahujícím 10% fetální hovězí sérum (FBS). Buňky byly kultivovány při 37° C v inkubátoru s 5% CO₂.

Plazmid CMV6-[MyrAkt3HA byl transientně transfekován do buněk HEK293. Jako kontrola byly transfekovány buňky HEK293 vektorem CMV6. Jeden den před transfekci byly buňky naředěny na hustotu 0,2 x 10⁶/cm³. Transfekce hbyla provedena s pomocí LipofectAmine (Gibco BRL) podél instrukcí výrobce. Stručně byla rozmíchána v médiu DME (bez séra a Pak byl přidán přípravek LipofectAmine : 4ml) . Po krátkém promíchání byla ponechána 30 minut při teplotě místnosti. Buňky pak byly opláchnuty v lxPBS, a exponovány směsi DNA/Lipof ectAmine po 3 hodiny. Po transfekci byly buňky dvakrát opláchnuty v lxPBS a přeneseny do média DMEM-10% FBS.

hodin po transfekci byly buňky lyžovány. Lyzáty byly imunoprecipitovány anti-HA protilátkami, a kinázová aktivita imunopeletů byla stanovena pomocí peptidú získaných z GSK-3, downstream cíle pro Aktl (Cross et al. 1995). In vitro kinázový test Akt byl proveden podle Cross et al. (Cross et al, 1995) 24 hodin po transfekci. Buňky byly opláchnuty dvakrát v roztoku 1 x PBS a lyžovány v lyzovacím pufru (50mM Tris/HCl, pH 7,4, lmM EDTA, lmM EGTA, 0,5mM Na₃V0₄, 0,1% β-merkaptoethanol, 1% Triton X-100, 50mM NaF, 5mM hydrogenfosforečnan sodný, lOmM glycerofosfát sodný, 0,5mM PMSF, 2pg/ml aprotinin, 2mg/ml leupeptin, a lmM mikrocystin). Nerozpustné materiály byly odstraněny centrifugací ve 4°C po 1 minutu. Buněčné lyzáty byly inkubovány s polyklonální anti-HA protilátkou (BABCO) 1 hodinu ve 4° C na rotační plošině.

Perličky agarózy a Proteinem A byly přidány k lyzátům na 1 hodinu. Po imunoprecipitaci byly pelety opláchnuty třikrát promývacím roztokem A (lyzovací pufr doplněný na 0,5M NaCl), třikrát promývacím roztokem B (50mM Tris/HCl, pH 7,4, 0,03% Brij35, 0,lmM EGTA a 0,1% β-merkaptoethanol), a třikrát v kinázovém pufru (20mM MOPS, pH 7,2, 25mM β-glycerofosfát sodný pH 7,0, lmM Na₃VO₄, lmM DTT) . Po opláchnutí byly pelety resuspendovány ve 40 μΐ kinázové reakční směsi [lOOmM ATP, 0,1 mg/ml substrátový peptid Crosstide (ITBI), 20mM MgCl₂, lOmM inhibitor proteinkinázy A/PKI (UBI), a lOmCi (g-32P)-ATP]. Reakce pak probíhala ve 30° C po 30 minut. Po dokončení reakce byla směs krátce centrifugována a 30 μΐ supernatantu bylo naneseno na kruhy nitrocelulózového papíru (Gibco BRL) . Nitrocelulózové papíry pak byly opláchnuty třikrát 180mM kyselinou fosforečnou (každé oplachování 10 minut) a dvakrát v acetonu (každé oplachování 2 minuty). Radioaktivita zachycená na papíru pak byla změřena scintilačním zařízením. Kinázová aktivita přítomná ve vzorcích transfekovaných CMV6[MyrAkt3HA] byla 20 x vyšší než aktivita přítomná v buňkách transfekovaných kontrolním vektorem CMV6, která bylapodobná bazální aktivitě v tomto testu (obr. 1B).

Pro testování exprese MyrAkt3HA v transfekovaných buňkách byly lyzáty připravené z transfekovaných buněk imunoblotovány s anti-HA protilátkou. Buněčné lyzáty byly připraveny stejně jak bylo popsáno výše, a rozděleny elektroforézou na SDS polyakrylamidovém gelu. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózové membrány, které byly přes noc inkubovány v blokovacím roztoku (lxPBS, 0,2% Tween 20, 5% sušené odtučněné mléko) ve 4° C. Membrány pak byla inkubovány s myší monoklonální anti-HA protilátkou (ředění 1:500 v blokovacím roztoku) po 3 hodiny při teplotě místnosti. Po opláchnutí třikrát v blokovacím roztoku (po 15 minutách) , membrány byly inkubovány s anti-myší IgG protilátkou konjugovanou s HRP (ředění 1:1000 v blokovacím roztoku) po 1 hodinu při teplotě místnosti. Po opláchnutí třikrát v blokovacím roztoku (po 10 minutách) a třikrát v lxPBS s 0,2% Tween 20, byly membrány vyvíjeny v systému ECL (PIERCE) podle instrukcí výrobce a exponovány na rentgenové filmy Kodak. Jak je ukázáno na obr. 1C, silný pás přibližné velikosti 60 kD (obdobná velikosti MyrAkktlHA, data neuveden) je přítomen ve vorcích transfekovaných CMV6-[MyrAkt3HA], avšak chybí ve vzorcích transfekovaných CMV6 (negativní kontrola). Závěrem údaje ukazují, že transfekce CMV6-[MyrAkt3HA) vede k funkční aktivitě Akt.

Příklad 3

Stimulace exprese VEGF

Příklad 3.1: Buněčné kultury

HeLa buňky (ATCC) byly kultivovány v médiu DME s 10% fetálním hovězím sérem (FBS). Buňky byly kultivovány ve 37° C, v inkubátoru s 5% CO₂. Humánní buňky kosterního svalstva (HSKMC) a humánní buňky hladkého svalstva koronárních cév (HCSMC) byly zakoupeny od firmy Clonetics Corporation.

Kardiomyocyty z novorozených potkanů byly izolovány užitím soupravy Myocyte Isolation System (Worthington Biochemical Co.) . Stručně shrnuto, srdce odebraná z 1- až 3denních potkanů byla rozdercena, naštěpena trypsinem (ve výsledné koncentraci 50 μg/ml) inkubací přes noc ve 4° C, pak následovala digesce kolagenázou ve 37° C po 45 minut. Po trituraci byla směs filtrována buněčné síto. Po krátké centrifugaci byly buňky resuspendovány v nanášecím médiu (DMEM:M199 = 4:1, 10% tepelně inaktivované koňské sérum, 5% fetální hovězí sérum, lx suplement inzulín-transferrinselenium (Gibco BRL) a lxGentamicin, 100 gg/ml Brdu) na hustotu 0,3xl0⁶ buněk/ml) . Po 24 hodinách byly přeneseny na slabě mitogenní médium (DMEM:M199 = 4:1, lxGentamicin).

Příklad 3.2: Transfekce

Jeden den před transfekci byly buňky naředěny na hustotu 0,2xl0⁶ cells/cm². Transfekce byla provedena užitím LipofectAminu (Gibco BRL) podle instrukcí výrobce. Stručně, požadované DNA byly rozmíchány v médiu DME (bez séra a antibiotik) a byl přidán LipofectAmin (DNA:LipofectAmine =1 μg : 4 μΐ). Po krátkém vortexování byla směs DNA/LipofectAmin ponechána 30 minut při teplotě místnosti. Buňky byly jedenkrát opláchnuty lxPBS, a pak exponovány ve směsi DNA/LipofectAmine po 3 hodiny. Po transfekci byly buňky opláchnuty dvakrát v lxPBS a přeneseny do média DMEM-10%FBS.

3.3 Konstrukce rekombinantních adenovirů

Rekombinantní adenovirus obsahující konstitutivně aktivní humánní Akt3 (hAkt3cak) byl konstruován jak popsali Crouzet et al. (1997) (Proč. Nati. Acad. Sci. USA. Vol. 94, 1414-1419). cDNA pro konstitutivně aktivní humánní Akt3 (obsahující myristylační sekvenci z c-src na N-konci) byla subklonována do pXL2996 (Tento plazmid byl nazván pXL2996-hAkt3cak). Expresní kazeta pro hAkt3cak z pXL2996-hAkt3cak byla subklonována do kyvadlového vektoru pXL3474. Tento kyvadlový plazmid pro hAkt3cak a DNA plazmid pro adenovirovou β-gal (pXL3215) byly elektroporací vneseny do bakteriálních buněk JM83.

Po proběhnutí dvojité homologní rekombinace byla plazmidová DNA adenovirus-hAkt3cak purifikována na gradientu CsCl. Tato DNA pak byla linearizována štěpením restriktázou PacI a pak transfekována do buněk 293 užitím LipofectAminu.

Tři týdny po transfekci byl rekombinantní adenovirus obsahující hAkt3cak (AV-hAKT3cak) izolován a amplifikován v buňkách 293. Virový titr byl stanoven testem cytoplasmatické toxicity (CPA).

Rekombinantní adenovirus obsahující konstitutivně aktivní myší aktl (AV-mAktlcak) připravený staardním postupem (popsaným výše) poskytl Dr. Kenneth Walsh (Boston, MA).

Před virovou infekcí byl virus naředěn v médiu pro tkáňovou kulturu na koncentraci 3xl0⁷/ml) . 1 ml tohoto média obsahujícího virus byl přidán na 6-jamkovou kultivační destičku a 8 ml tohoto média obsahujícího bylo přidáno na každou 100-mm kultivační misku. Po infekci přes noc byl nadbytečný virus spláchnut promytím v lxPBS a buňky byly přeneseny na normální médium.

Příklad 3.4: Test ELISA

Humánní VEGF ELISA test byl proveden pomocí komerčně dostupné detekční soupravy VEGF-165 ELISA (od firmy R&D Systems, lne.; cat. DVE00) . Kultivační médium bylo odebráno a krátce centrifugováno: vzorky pak byly naneseny do příslušné jamky po přidání ředidla RD1W. Destičky pak byly inkubovány dvě hodiny při teplotě místnosti. Každá jamka pak byla propláchnuta třikrát oplachovacím pufrem. Pak byl do každé jamky nanesen konjugát anti-VEGF na dvě hodiny při teplotě místnosti. Pak byly opakovány stejné proplachovací kroky jaké byly zmíněny dříve. Byl přidán substrát a destičky byly inkubovány 20 minut při teplotě místnosti. Optická denzita byla měřena čtečkou mikrotitračních destiček při nastavení na 450 nm, a korekce vlnové délky byla nastavena na 540 nm.

• ·

Po a

Příklad 3.5: Izolace RNA a Northern blot

Celková RNA byla izolována pomocí soupravy reagencií

Ultraspec pro izolaci RNA (Biotecx). Stručně shrnuto, po 1 ml roztoku Ultraspec bylo přidáno k buňkám na lOOmm miskách pro tkáňové kultury. Pak byly buňky seškrábnuty z misek a přeneseny do Eppendorfových zkumavek zbavených Rnázy. přidání 200 μΐ chloroformu byla směs vortexována centrifugována ve 4° C. Vodný roztok (tj . horní vrstva) byl odebrán a RNA byla precipitována stejným objemem isopropanolu. Po opláchnutí 70% ethanolem a osušení byla RNA rozpuštěna ve vodě ošetřené DEPC. 2 0 μg celkové RNA bylo separováno na 1% agarózovém gelu. Po elektroforéze a přenosu na membránu (''blotování) byla RNA na membráně zesítěna ozářením UV světlem. Hybridizace byla provedena se sondou značenou P32, která byla připravena značením pomocí soupravy pro značení DNA s náhodnými primery Random Primer DNA labeling kit (Boehringer Mannheim). Po byla membrána postupně promyta

0,lxSSC/0,1%SDS, a nakonec přes noc exponována na rentgenový film Kodak.

hybrídizaci v 65°C 2xSSC/0,1%SDS a

Příklad 3.6: Akt zvyšuje expresi VEGF v transfekovaných buňkách

HeLa buňky byly transfekovány expresním plazmidem pro aktivovaný myší Aktl (CMV6-mAktlcak) , aktivovaný humánní Akt3 (CMV6-hAkt3) nebo vektorem CMV6 (jako kontrola). Po transfekci byly buňky přeneseny na slabě mitogenní médium (DMEM s 0,5% fetálním hovězím sérem). Po 16 hodinách bylo médium z transfekovaných buněk odebráno a testováno v testu ELISA pro humánní VEGF-165. Jak je ukázáno na obr. 2, hladina VEGF v médiu buněk transfekovaných Aktl nebo Akt3 byla významně vyšší než hladina v médiu z kontrolních buněk transfekovaných vektorem CMV6. Tyto údaje demonstrují, že konstitutivně aktivní Aktl nebo Akt3 indukuje expresi VEGF-165 v buňkách HELA.

Příklad 3.7: AV-mAktlcak a AV-hAkt3cak indukují expresi VEGF v humánních buňkách kosterního svalstva a hladkého svalstva koronární artérie

Humánní buňky kosterního svalstva (HSKMC) a humánní buňky hladkého srdečního svalstva (HCASMC) byly infikovány rekombinantními adneoviry exprimujícími buďto myší Aktl (AV-mAktlcak) nebo konstitutivně aktivní humánní Akt3 (AV-hAKT3cak). Jako kontrola byly buňky infikovány AV-GFP, který exprimuje zelený fluorescenční protein. Jeden den po infekci bylo odebráno kultivační médium a hladina VEGF v médiu byla stanovena testem ELISA. Jak je ukázáno na obr. 3A, jak AV-mAKTlcak tak AV-hAKT3cak významně zvýšily expresi VEGF-165 HSKMC, zatímco infekce AV-GFP měla jen nearný nebo žádný účinek. A dále, jak je ukázáno na obr. 3B, AVmAktl a AVhAkt3cak indukoval VEGF-165 v humánních buňkách hladkého svalstva koronární artérie (HCASMCs).

Pro vyhodnocení účinku Akt na VEGF mRNA, byly buňky HCASMC infikovány adenovirem exprimujícím mAktlcak, hAkt3cak, nebo GFP. Jako pozitivní kontrola byly buňky přeneseny na hypoxické médium na 24 hodin. Celková RNA byla izolována a byla analyzována Northern hybidizací na přítomnost VEGF. Jak je ukázáno na obr. 3C, hypoxie významně indukovala expresi VEGF. Navíc AV-mAktlcak a AV-hAkt3cak, avšak nikoliv AV-GFP, významně zvýšily hladinu VEGF mRNA. Tato data ukazují, že Akt zvyšuje expresi VEGF zvýšením hladiny mRNA.

Příklad 3.8: AV-mAKTlcak a AV-hAKt3cak indukují expresi VEGF v kardiomyocytech

Kardiomyocyty z novorozených potkanů byly infikovány adenovirem kódujícím mAktlcak (AVmAktlcak) , myší Aktl divokého typu (AV-mAktlwt), hAkt3cak (AV-hAkt3cak) nebo AV-GFP (jako kontrola). Jako pozitivní kontrola byly neinfikované buňky inkubovány v hypoxických podmínkách po 24 hodin. Jeden den po infekci byla z buněk izolována RNA a exprese VEGF byla detekována Northern blot analýzou. Jak je ukázáno na obr. 3, AV-mAKtlcak nebo AV-hAkt3cak významně zvýšily expresi VEGF v kardiomyocytech, zatímco AV-GFP nebo AV-mAktlwt měly jen nepatrný nebo žádný účinek na expresi VEGF-165.

Předmět vynálezu není nijak omezen zde uvedenými specifickými výhodnými provedeními vynálezu. Různé modifikace jsou odborníkovi zřejmé na základě zde uvedeného popisu a obrázků. Avšak i tyto modifikace spadají do rozsahu vynálezu definovaného připojenými patentovými nároky.

Je třeba připomenout, že všechny uvedené hodnoty v bázích nebo polypeptidu či a také molekulové hmotnosti nukleových kyselin nebo polypeptidu jsou přibližné a jsou uvedeny pro ilustraci popisu.

Zde citované publikace jsou celé zahrnuty formou velikostí nukleových kyselin proteinů v aminokyselinách, odkazu.

7C

Seznam citované literatury Aams JM. et al. 1998. The Bcl-2 portein family: arbiters of cell survival. Science. Vol281(5381): 1322-1326.

Alessi DR. et al. 1996. Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. EMBO J. Voll5(23): 6541-6551.

Barinaga M. 1998a. Is apoptosis key in Alzheimer’s disease? Science Vol281:1303-1304.

Barinaga M. 1998b. Stroke-damaged neurons may commit cellular sucide. Science Vol281: 13021303.

Chang HY et al. 1998. Activation of apoptosis signál- regulating kinase (ASK1) by the adapter protein DAXX. Science. Vol281 (5384): 1860-1863.

Cross DA. et al.1995. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by insulin mediated by protein kinase B. Nátuře Vol378(6559):785-789.

Downward J. 1998. Mechanisme and consequences of activation of protein kinase B/Akt. Curr. Opin. Cell Biol. Vol 10(2): 262-267

Dudek H. et al. 1997. Regulation ofneuronal survival by the serine-threonine protein kinase Akt. Science Vol275(5300): 661-665.

Franke TF. et al. 1995. The protein kinase encoded by the Akt proto-oncogene is a target of PDGFactivated phosphatidylinositol 3-kinase. Cell Vol81(5): 727-736.

Franke TF. et al. 1997. PDK: downstream AKTion blocks apoptosis. Cell Vol88(4): 435-437. Hemmings BA. 1997a. Akt signalling: linking membrane events to life and death decisions. Science

Vol275(5300): 628-630.

Hemmings BA. 1997b. PtdIns(3.4.5)P3 gets its message across. Science Vol277: 534.

Ichijo H. et al. 1997. Induction of apoptosis by ASK1, a mammalian MAPKKK that activates SAPK/JNK and p38 signaling pathways. Science. Vol 275: 90-94.

Kauffinann-Zeh A. et al. 1997. Suppression of c-Myc-induced apoptosis by Ras signalling through PI(3)K and PKB. Nátuře Vol385(6616): 544-548.

Klippel A. et al.1997. A specific product of phosphatidylinositol 3-kinase directly activates the protein kinase Akt through its pleckstrin homology domain. Mol. Cell Biol. Vol 17(1): 338344.

Konishi H. et al. 1995. Molecular cloning and characterization of a new member of the RAC protein kinase family: association of the pleckstrin homology domain of three types of RAC protein kinase with protein kinase C subspecies and beta gamma subunits of G proteins. Biochem. Biophys. Res. Comm. Vol. 216(2): 526-534.

Kulik G. et al. 1997. Antiapoptotic signalling by the insulin-like growth factor I receptor, phosphatidylinositol 3-kinase, and Akt. Afo/. Cell Biol. Vol 17(3): 1595-1606.

MacLellan WR. et al. 1998. Death by design: programmed cell death in cardiovascular biology and diseases. Circ. Res. Vol81(2): 137-144.

Okubo Y. et al. 1998. Insulin-like growth factor-1 inhibits the stress-activated protein kinase/c-Jun Nterminal kinase. JBiol. Chem. Vol273: 25961-25966.

Pullen N. et al. 1998. Phosphorylation and activation of p70S6K by PDK1. Science Vol279: 707-710. Sambrook J., Fritsch EF. & Maniatis T. 1989. Moleucular Cloning (2^nd edition).

Staal SP. 1987. Molecular cloning of the Akt oncogene and its human homologues AKT1 and AKT2:

amplification of AKT1 in a primary human gastric adenocarcinoma. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. Vol84(14): 5034-5037.

Stephens L. et al. 1998. Protein kinase B kinases that mediated phosphatidylinositol 3,4,5triphosphate-dependent activation of protein kinase B. Science VÓ1219: 710-714.

Stokoe D. et al. 1997. Duál role of phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphate in the activation of protein kinase B. Science Vol277: 567-570.

Thomberry NA. et al. 1998. Caspases: enemies within. Science Vol281: 1312-1316.

SEZNAM SEKVENCI <160> 12 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1570 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (126)..(1523) <400> 1 gtcgacgttg caggctgagt catcactaga gagtgggaag ggcagcagca gcagagaatc 60 caaaccctaa agctgatatc acaaagtacc atttctccaa gttgggggct cagaggggag 120 tcatc atg age gat gtt acc att gtg aaa gaa ggt tgg gtt cag aag agg 170 Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gin Lys Arg

10 15

gga gaa

tat Tyr

ata Ile

aaa Lys 20

aac tgg Asn Trp

agg Arg

cca Pro

aga Arg 25

tac Tyr

ttc ctt

ttg aag Leu Lys 30

aca Thr

218

Gly

Glu

Phe

Leu

gat

ggc

tca

ttc

ata

gga

tat

aaa

gag

aaa

cct

caa

gat

gtg

gat

tta

266

Asp

Gly

Ser

Phe

Ile

Gly

Tyr

Lys

Glu

Lys

Pro

Gin

Asp

Val

Asp

Leu

35

40

45

cct

tat

ccc

ctc

aac

aac

ttt

tca

gtg

gca

aaa

tgc

cag

tta

atg

aaa

314

Pro

Tyr

Pro

Leu

Asn

Asn

Phe

Ser

Val

Ala

Lys

Cys

Gin

Leu

Met

Lys

50

55

60

aca Thr

gaa Glu 65

ega cca

aag Lys

cca Pro

aac aca ttt Asn Thr Phe 70

ata Ile

atc aga tgt

ctc Leu

cag Gin

tgg Trp

362

Arg

Pro

Ile

Arg 75

Cys

act

act

gtt

ata

gag

aga

aca

ttt

cat

gta

gat

act

cca

gag

gaa

agg

410

Thr

Thr

Val

Ile

Glu

Arg

Thr

Phe

His

Val

Asp

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

80

85

90

95

gaa

gaa

tgg

aca

gaa

gct

atc

cag

gct

gta

gca

gac

aga

ctg

cag

agg

458

Glu

Glu

Trp

Thr

Glu

Ala

Ile

Gin

Ala

Val

Ala

Asp

Arg

Leu

Gin

Arg

100

105

110

caa

gaa

gag

gag

aga

atg

aat

tgt

agt

cca

act

tca

caa

att

gat

aat

506

Gin

Glu

Glu

Glu

Arg

Met

Asn

Cys

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Ile

Asp

Asn

115

120

125

ata

gga

gag

gaa

gag

atg

gat

gcc

tet

aca

acc

cat

cat

aaa

aga

aag

554

Ile

Gly

Glu

Glu

Glu

Met

Asp

Ala

Ser

Thr

Thr

His

His

Lys

Arg

Lys

130

135

140

aca

atg

aat

gat

ttt

gac

tat

ttg

aaa

cta

cta

ggt

aaa

ggc

act

ttt

602

Thr

Met

Asn

Asp

Phe

Asp

Tyr

Leu

Lys

Leu

Leu

Gly

Lys

Gly

Thr

Phe

145

150

155

ggg

aaa

gtt

att

ttg

gtt

ega

gag

aag

gca

agt

gga

aaa

tac

tat

gct

650

Gly

Lys

Val

Ile

Leu

Val

Arg

Glu

Lys

Ala

Ser

Gly

Lys

Tyr

Tyr

Ala

160

165

170

175

atg

aag

att

ctg

aag

aaa

gaa

gtc

att

att

gca

aag

gat

gaa

gtg

gca

698

Met

Lys

Ile

Leu

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ile

Ala

Lys

Asp

Glu

Val

Ala

180

185

190

cac

act

cta

act

gaa

age

aga

gta

tta

aag

aac

act

aga

cat

ccc

ttt

746

His

Thr

Leu

Thr

Glu

Ser

Arg

Val

Leu

Lys

Asn

Thr

Arg

His

Pro

Phe

195

200

205

tta

aca

tcc

ttg

aaa

tat

tcc

ttc

cag

aca

aaa

gac

cgt

ttg

tgt

ttt

794

Leu

Thr

Ser

Leu

Lys

Tyr

Ser

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Phe

210

215

220

gtg

atg

gaa

tat

gtt

aat

ggg

ggc

gag

ctg

ttt

ttc

cat

ttg

tcg

aga

842

Val

Met

Glu

Tyr

Val

Asn

Gly

Gly

Glu

Leu

Phe

Phe

His

Leu

Ser

Arg

225

230

235

gag

cgg

gtg

ttc

tet

gag

gac

ege

aca

cgt

ttc

tat

ggt

gca

gaa

att

890

Glu

Arg

Val

Phe

Ser

Glu

Asp

Arg

Thr

Arg

Phe

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ile

240

245

250

255

gtc Val

tet Ser

gcc ttg Ala Leu

gac tat Asp Tyr 260

cta cat

tcc gga

aag Lys

att Ile

gtg Val

tac Tyr

cgt Arg 270

gat Asp

938

Leu

His

Ser

Gly 265

ctc

aag

ttg

gag

aat

cta

atg

ctg

gac

aaa

gat

ggc

cac

ata

aaa

att

986

Leu

Lys

Leu

Glu

Asn

Leu

Met

Leu

Asp

Lys

Asp

Gly

His

Ile

Lys

Ile

275

280

285

aca

gat

ttt

gga

ctt

tgc

aaa

gaa

ggg

atc

aca

gat

gca

gcc

acc

atg

1034

Thr

Asp

Phe

Gly

Leu

Cys

Lys

Glu

Gly

Ile

Thr

Asp

Ala

Ala

Thr

Met

290

295

300

aag

aca

ttc

tgt

ggc

act

cca

gaa

tat

ctg

gca

cca

gag'

gtg

tta

gaa

1082

Lys

Thr

Phe

Cys

Gly

Thr

Pro

Glu

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu

Val

Leu

Glu

305

310

315

gat

aat

gac

tat

ggc

ega

gca

gta

gac

tgg

tgg

ggc

cta

ggg

gtt

gtc

1130

Asp

Asn

Asp

Tyr

Gly

Arg

Ala

Val

Asp

Trp

Trp

Gly

Leu

Gly

Val

Val

320

325

330

335

atg

tat

gaa

atg

atg

tgt

ggg

agg

tta

cct

ttc

tac

aac

cag

gac

cat

1178

Met

Tyr

Glu

Met

Met

Cys

Gly

Arg

Leu

Pro

Phe

Tyr

Asn

Gin

Asp

His

340

345

350

gag

aaa

ctt

ttt

gaa

tta

ata

tta

atg

gaa

gac

att

aaa

ttt

cct

ega

1226

Glu

Lys

Leu

Phe

Glu

Leu

Ile

Leu

Met

Glu

Asp

Ile

Lys

Phe

Pro

Arg

355

360

365

aca

ctc

tet

tea

gat

gca

aaa

tea

ttg

ctt

tea

ggg

ctc

ttg

ata

aag

1274

Thr

Leu

Ser

Ser

Asp

Ala

Lys

Ser

Leu

Leu

Ser

Gly

Leu

Leu

Ile

Lys

370

375

380

gat

cca

aat

aaa

ege

ctt

ggt

gga

gga

cca

gat

gat

gca

aaa

gaa

att

1322

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Asp

Asp

Ala

Lys

Glu

Ile

385

390

395

atg

aga

cac

agt

ttc

ttc

tet

gga

gta

aac

tgg

caa

gat

gta

tat

gat

1370

Met

Arg

His

Ser

Phe

Phe

Ser

Gly

Val

Asn

Trp

Gin

Asp

Val

Tyr

Asp

400

405

410

415

aaa

aag

ctt

gta

cct

cct

ttt

aaa

cct

caa

gta

aca

tet

gag

aca

gat

1418

Lys

Lys

Leu

Val

Pro

Pro

Phe

Lys

Pro

Gin

Val

Thr

Ser

Glu

Thr

Asp

420

425

430

act

aga

tat

ttt

gat

gaa

gaa

ttt

aca

get

cag

act

att

aca

ata

aca

1466

Thr

Arg

Tyr

Phe

Asp

Glu

Glu

Phe

Thr

Ala

Gin

Thr

Ile

Thr

Ile

Thr

435

440

445

cca cct gaa aaa tgt cag caa tca gat tgt ggc atg ctg ggt aac tgg Pro Pro Glu Lys Cys Gin Gin Ser Asp Cys Gly Met Leu Gly Asn Trp

450 455 460 aaa aaa taa taaaaagtaa gtttcaatag ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa Lys Lys

465

1514

1570 <210> 2 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ser Asp Val Thr Ile

Val

Lys Glu Gly Trp Val Gin Lys Arg Gly

1

5

10

15

Glu

Tyr

Ile

Lys

Asn

Trp

Arg

Pro

Arg

Tyr

Phe

Leu

Leu

Lys

Thr

Asp

20

25

30

Gly

Ser

Phe

Ile

Gly

Tyr

Lys

Glu

Lys

Pro

Gin

Asp

Val

Asp

Leu

Pro

35

40

45

Tyr

Pro

Leu

Asn

Asn

Phe

Ser

Val

Ala

Lys

Cys

Gin

Leu

Met

Lys

Thr

50

55

60

Glu

Arg

Pro

Lys

Pro

Asn

Thr

Phe

Ile

Ile

Arg

Cys

Leu

Gin

Trp

Thr

65

70

75

80

Thr

Val

Ile

Glu

Arg

Thr

Phe

His

Val

Asp

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

Glu

85

90

95

Glu

Trp

Thr

Glu

Ala

Ile

Gin

Ala

Val

Ala

Asp

Arg

Leu

Gin

Arg

Gin

100

105

110

Glu

Glu

Glu

Arg

Met

Asn

Cys

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Ile

Asp

Asn

Ile

115

120

125

Gly

Glu

Glu

Glu

Met

Asp

Ala

Ser

Thr

Thr

His

His

Lys

Arg

Lys

Thr

130

135

140

Met

Asn

Asp

Phe

Asp

Tyr

Leu

Lys

Leu

Leu

Gly

Lys

Gly

Thr

Phe

Gly

145

150

155

160

Lys

Val

Ile

Leu

Val

Arg

Glu

Lys

Ala

Ser

Gly

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Met

165

170

175

Lys

Ile

Leu

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ile

Ala

Lys

Asp

Glu

Val

Ala

His

180

185

190

Thr

Leu

Thr

Glu

Ser

Arg

Val

Leu

Lys

Asn

Thr

Arg

His

Pro

Phe

Leu

195

200

205

Thr

Ser

Leu

Lys

Tyr

Ser

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Phe

Val

210

215

220

Met

Glu

Tyr

Val

Asn

Gly

Gly

Glu

Leu

Phe

Phe

His

Leu

Ser

Arg

Glu

225

230

235

240

Arg

Val

Phe

Ser

Glu

Asp

Arg

Thr

Arg

Phe

Tyr

Gly

Ala

Glu

Ile

Val

245

250

255

Ser

Ala

Leu

Asp

Tyr

Leu

His

Ser

Gly

Lys

Ile

Val

Tyr

Arg

Asp

Leu

260

265

270

Lys

Leu

Glu

Asn

Leu

Met

Leu

Asp

Lys

Asp

Gly

His

Ile

Lys

Ile

Thr

275

280

285

Asp

Phe

Gly

Leu

Cys

Lys

Glu

Gly

Ile

Thr

Asp

Ala

Ala

Thr

Met

Lys

290

295

300

Thr

Phe

Cys

Gly

Thr

Pro

Glu

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu

Val

Leu

Glu

Asp

305

310

315

320

Asn

Asp

Tyr

Gly

Arg

Ala

Val

Asp

Trp

Trp

Gly

Leu

Gly

Val

Val

Met

325

330

335

Tyr

Glu

Met

Met

Cys

Gly

Arg

Leu

Pro

Phe

Tyr

Asn

Gin

Asp

His

Glu

340

345

350

Lys

Leu

Phe

Glu

Leu

Ile

Leu

Met

Glu

Asp

Ile

Lys

Phe

Pro

Arg

Thr

355

360

365

Leu

Ser

Ser

Asp

Ala

Lys

Ser

Leu

Leu

Ser

Gly

Leu

Leu

Ile

Lys

Asp

370

375

380

Pro

Asn

Lys

Arg

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Asp

Asp

Ala

Lys

Glu

Ile

Met

385

390

395

400

Arg

His

Ser

Phe

Phe

Ser

Gly

Val

Asn

Trp

Gin

Asp

Val

Tyr

Asp

Lys

405

410

415

Lys

Leu

Val

Pro

Pro

Phe

Lys

Pro

Gin

Val

Thr

Ser

Glu

Thr

Asp

Thr

420

425

430

Arg

Tyr

Phe

Asp

Glu

Glu

Phe

Thr

Ala

Gin

Thr

Ile

Thr

Ile

Thr

Pro

435

440

445

Pro

Glu

Lys

Cys

Gin

Gin

Ser

Asp

Cys

Gly

Met

Leu

Gly

Asn

Trp

Lys

450

455

4 60

Lys

4 65

<210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 3 tccaaaccct aaagctgata tcac 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence % · · · · · <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 4 cctggatagc ttctgtccat tc 22 <210> 5 <211> 74 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 5 atgagcgatg ttaccattgt gaaagaaggt tgggttcaga agaggggaga atatataaaa 60 aactggaggc caag 74 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 6 ttattťtttc caggtaccca gcatgcc 27 <210> 7 <211> 90 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 7 gcgcgcgaat tcccaccatg ggtagcaaca agagcaagcc caaggatgcc agccagcggc 60 gccgcagcag cgatgttacc attgtgaaag 90 <210> 8 <211> 66 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 8 gcgcgcgggc ccttaggcgt agtcggggac gtcgtacggg tattttttcc agttacccag 60 catgcc ‘ 66 <210> 9 <211> 51 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 9 cggggtacca ccatgggtag caacaagagc aagcccaagg atgccagcca g 51 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: syntetické oligonukleotidové primery <400> 10 ccggaattct taggcgtagt cggggacgtc 30 <210> 11 <211> 480 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11

Met Asn Glu Val Ser Val Ile Lys Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly

1

5

10

15

Glu

Tyr

Ile

Lys

Thr

Trp

Arg

Pro

Arg

Tyr

Phe

Leu

Leu

Lys

Ser

Asp

20

25

30

Gly

Ser

Phe

Ile

Gly

Tyr

Lys

Glu

Arg

Pro

Glu

Ala

Pro

Asp

Gin

Thr

35

40

45

Leu

Pro

Pro

Leu

Asn

Asn

Phe

Ser

Val

Ala

Glu

Cys

Gin

Leu

Met

Lys

50

55

60

Thr

Glu

Arg

Pro

Arg

Pró

Asn

Thr

Phe

Val

Ile

Arg

Cys

Leu

Gin

Trp

65

70

75

•

80

Thr

Thr

Val

Ile

Glu

Arg

Thr

Phe

His

Val

Asp

Ser

Pro

Asp

Glu

Arg

85

90

95

Glu

Glu

Trp

Met

Arg

Ala

Ile

Gin

Met

Val

Ala

Asn

Ser

Leu

Lys

Gin

100

105

110

Arg

Ala

Pro

Gly

Glu

Asp

Pro

Met

Asp

Tyr

Lys

Cys

Gly

Ser

Pro

Ser

115

120

125

Asp

Ser

Ser

Thr

Thr

Glu

Glu

Met

Glu

Val

Ala

Val

Ser

Lys

Ala

Arg

130

135

140

Ala

Lys

Val

Thr

Met

Asn

Asp

Phe

Asp

Tyr

Leu

Lys

Leu

Leu

Gly

Lys

145

150

155

160

Gly

Thr

Phe

Gly

Lys

Val

Ile

Leu

Val

Arg

Glu

Lys

Ala

Thr

Gly

Arg

165

170

175

Tyr

Tyr

Ala

Met

Lys

Ile

Leu

Arg

Lys

Glu

Val

Ile

Ile

Ala

Lys

Asp

180

185

190

Glu

Val

Ala

His

Thr

Val

Thr

Glu

Ser

Arg

Val

Leu

Gin

Asn

Thr

Arg

195

200

205

His

Pro

Phe

Leu

Thr

Ala

Leu

Lys'

Tyr

Ala

Phe

Gin

Thr

His

Asp

Arg

210

215

220

Leu

Cys

Phe

Val

Met

Glu

Tyr

Ala

Asn

Gly

Gly

Glu

Leu

Phe

Phe

His

225

230

235

240

Leu

Ser

Arg

Glu

Arg

Val

Phe

Thr

Glu

Glu

Arg

Ala

Arg

Phe

Tyr

Gly

245

250

255

Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val

Tyr Arg Asp 275

Ile Lys Ile 290

Ala Thr Met 305

Val Leu Glu

Gly Val Val

Gin Asp His 355

Phe Pro Arg 370

Leu Lys Lys 385

Lys Glu Val

Val Val Gin

Glu Val Asp 435

Thr Ile Thr 450

Asp Gin Arg 465

260 265

Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met 280

Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys 295

Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro 310

Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala 325 330

Met Tyr Glu Met Met Cys Gly 340 345

Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile 360

Thr Leu Ser Pro Glu Ala Lys 375

Asp Pro Lys Gin Arg Leu Gly 390

Met Glu His Arg Phe Phe Leu 405 410

Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe 420 425

Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu 440

Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser 455

Thr His Phe Pro Gin Phe Ser 470

270

Leu Asp Lys Asp Gly His 285

Glu Gly Ile Ser Asp Gly 300

Glu Tyr Leu Ala Pro Glu 315 320

Val Asp Trp Trp Gly Leu * 335

Arg Leu Pro Phe Tyr Asn 350

Leu Met Glu Glu Ile Arg 365

Ser Leu Leu Ala Gly Leu 380

Gly Gly Pro Ser Asp Ala 395 400

Ser Ile Asn Trp Gin Asp 415

Lys Pro Gin Val Thr Ser 430

Phe Thr Ala Gin Ser Ile 445

Leu Gly Leu Leu Glu Leu 460

Tyr Ser Ala Ser Ile Arg 475 480 <210> 12 <211> 465 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 12

Met 1

Ser Asp Val Thr Ile Val Lys 5

Glu Gly 10

Trp Val Gin

Lys Arg Gly 15

Glu

Tyr

Ile

Lys

Asn

Trp

Arg

Pro

Arg

Tyr

Phe

Leu

Leu

Lys

Thr

Asp

20

25

30

Gly

Ser

Phe

Ile

Gly

Tyr

Lys

Glu

Lys

Pro

Gin

Asp

Val

Asp

Leu

Pro

35

40

45

Tyr

Pro

Leu

Asn

Asn

Phe

Ser

Val

Ala

Lys

Cys

Gin

Leu

Met

Lys

Thr

50

55

60

Glu

Arg

Pro

Lys

Pro

Asn

Thr

Phe

Ile

Ile

Arg

Cys

Leu

Gin

Trp

Thr

65

70

75

80

Thr

Val

Ile

Glu

Arg

Thr

Phe

His

Val

Asp

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

Glu

85

90

95

Glu

Trp

Thr

Glu

Ala

Ile

Gin

Ala

Val

Ala

Asp

Arg

Leu

Gin

Arg

Gin

100

105

110

Glu

Glu

Glu

Arg

Met

Asn

Cys

Ser

Pro

Thr

Ser

Gin

Ile

Asp

Asn

Ile

115

120

125

Gly

Glu

Glu

Glu

Met

Asp

Ala

Ser

Thr

Thr

His

His

Lys

Arg

Lys

Thr

130

135

140

Met

Asn

Asp

Phe

Asp

Tyr

Leu

Lys

Leu

Leu

Gly

Lys

Gly

Thr

Phe

Gly

145

150

155

160

Lys

Val

Ile

Leu

Val

Arg

Glu

Lys

Ala

Ser

Gly

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Met

165

170

175

Lys

Ile

Leu

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ile

Ala

Lys

Asp

Glu

Val

Ala

His

180

185

190

Thr

Leu

Thr

Glu

Ser

Arg

Val

Leu

Lys

Asn

Thr

Arg

His

Pro

Phe

Leu

195

200

205

Thr

Ser

Leu

Lys

Tyr

Ser

Phe

Gin

Thr

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Phe

Val

210

215

220

Met

Glu

Tyr

Val

Asn

Gly

Gly

Glu

Leu

Phe

Phe

His

Leu

Ser

Arg

Glu

225

•

230

235

240

Arg

Val

Phe Ser

Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val

245

250

255

Ser

Ala

Leu

Asp

Tyr

Leu

His

Ser

Gly

Lys

Ile

Val

Tyr

Arg

Asp

Leu

260

265

270

Lys

Leu

Glu

Asn

Leu

Met

Leu

Asp

Lys

Asp

Gly

His

Ile

Lys

Ile

Thr

275

280

285

Asp

Phe

Gly

Leu

Cys

Lys

Glu

Gly

Ile

Thr

Asp

Ala

Ala

Thr

Met

Lys

290

295

300

Thr

Phe

Cys

Gly

Thr

Pro

Glu

Tyr

Leu

Ala

Pro

Glu

Val

Leu

Glu

Asp

305

310

315

320

Asn

Asp

Tyr

Gly

Arg

Ala

Val

Asp

Trp

Trp

Gly

Leu

Gly

Val

Val

Met

325

330

335

Tyr

Glu

Met

Met

Cys

Gly

Arg

Leu

Pro

Phe

Tyr

Asn

Gin

Asp

His

Glu

340

345

350

Lys

Leu

Phe

Glu

Leu

Ile

Leu

Met

Glu

Asp

Ile

Lys

Phe

Pro

Arg

Thr

355

360

365

Leu

Ser

Ser

Asp

Ala

Lys

Ser

Leu

Leu

Ser

Gly

Leu

Leu

Ile

Lys

Asp

370

375

380

Pro

Asn

Lys

Arg

Leu

Gly

Gly

Gly

Pro

Asp

Asp

Ala

Lys

Glu

Ile

Met

385

390

395

400

Arg

His

Ser

Phe

Phe

Ser

Gly

Val

Asn

Trp

Gin

Asp

Val

Tyr

Asp

Lys

405

410

415

Lys

Leu

Val

Pro

Pro

Phe

Lys

Pro

Gin

Val

Thr

Ser

Glu

Thr

Asp

Thr

420

425

430

Arg

Tyr

Phe

Asp

Glu

Glu

Phe

Thr

Ala

Gin

Thr

Ile

Thr

Ile

Thr

Pro

435

440

445

Pro

Glu

Lys

Cys

Gin

Gin

Ser

Asp

Cys

Gly

Met

Leu

Gly

Asn

Trp

Lys

450 455 460

Claims (41)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Protein Akt pro použití k indukci exprese VEGF v buňce.
2. 2. Protein Akt podle nároku 1, který je vybrán ze skupiny obsahující Aktl, Akt2 a Akt3.
3. 3. Protein Akt podle nároku 2, kde protein Akt je Akt3.
4. 4. Protein Akt podle nároku 1, kde VEGF je vybrán ze skupiny obsahující VEGF₁₂₁, VEGF₁₆₅, VEGF₁₈9, VEGF₂o6/ VEGF-2, VEGF-B a VEGF-D.
5. 5. Nukleová kyselina kódující protein Akt operativně spojená s kontrolní expresní sekvencí pro použití k indukci exprese VEGF v buňce.
6. 6. Nukleová kyselina podle nároku 5, kde nukleová kyselina je součástí plazmidového nebo vírového vektoru.
7. 7. Nukleová kyselina podle nároku 6, kde nukleová kyselina je součástí plazmidu.
8. 8. Nukleová kyselina podle nároku 6, kde virový vektor je vybrán ze skupiny obsahující retroviry, adenoviry, adeno-asociované viry, herpetické viry a virus vakcínie.
9. 9. Nukleová kyselina podle nároku 5, kde protein Akt je v buňce konstitutivně exprimován.

   • · • · · ·
10. 10. Kombinace proteinu Akt a iontů přechodného kovu, kombinace proteinu Akt a vazodilatačního činidla nebo kombinace proteinu Akt, iontů přechodného kovu a vazodilatačního činidla pro použití k indukci exprese VEGF v buňce.
11. 11. Kombinace první nukleové kyseliny kódující protein Akt operativně spojené s expresní kontrolní sekvencí a druhé nukleové kyseliny kódující angiogenní faktor operativně spojené s expresní kontrolní sekvencí pro použití k indukci exprese VEGF v buňce.
12. 12. Kombinace podle nároku 11, kde angiogenní faktor je vybrán ze skupiny obsahující VEGF, kyselý růstový faktor fibroblastů, bazický růstový faktor fibroblastů, růstový faktor endotelových buněk a angiopoetin.
13. 13. Kombinace podle nároku 12, kde VEGF je vybrán ze skupiny obsahující VEGF₁₂₁, VEGFi₆₅, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆ , VEGF-2, VEGF-B a VEGF-D.
14. 14. Kombinace podle nároku 12, kde angiogenní faktor je růstový faktor endotelových buněk.
15. 15. Kombinace alespoň dvou různých forem proteinu Akt pro použití k indukci exprese VEGF v buňce.
16. 16. Protein Akt podle nároku 1, kde buňka je v pacientovi trpícím ischemickým onemocněním.
17. 17. Protein Akt podle nároku 16, kde ischemické onemocnění je cerebrovaskulární ischémie, renální ischémie, pulmonární • ·· · · ·· · · ·· · « · · · · · · ·· · • · · · ··· · · · • · · · ·· ···· ·· ···· ischémie, ischémie končetin, ischémie myokardu nebo ischemická, idiopatická nebo hypertrofická kardiomyopatie.
18. 18. Protein Akt pro použití k indukci exprese VEGF v buňkách pacienta trpícího ischemickým onemocněním.
19. 19. Protein Akt podle nároku 18, kde protein Akt je vybrán ze skupiny obsahující Aktl, Akt2 a Akt3.
20. 20. Protein Akt podle nároku 19, kde protein Akt je Akt3.
21. 21. Protein Akt podle nároku 18, kde VEGF je vybrán ze skupiny obsahující VEGF₁₂i, VEGFi₆₅, VEGFi₈₉, VEGF₂₀₆ , VEGF-2, VEGF-B a VEGF-D.
22. 22. Nukleová kyselina kódující protein Akt operativně spojená s kontrolní expresní sekvencí pro použití k indukci exprese VEGF v buňkách pacienta trpícího ischemickým onemocněním.
23. 23. Nukleová kyselina podle nároku 22, kde nukleová kyselina je součástí plazmidového nebo virového vektoru.
24. 24. Nukleová kyselina podle nároku 23, kde nukleová kyselina je součástí plazmidu.
25. 25. Nukleová kyselina podle nároku 23, kde virový vektor je vybrán ze skupiny obsahující retroviry, adenoviry, adeno-asociované viry, herpetické viry a virus vakcínie.
26. 26. Nukleová kyselina podle nároku 22, kde protein Akt je v buňce konstitutivně exprimován.
27. 27. Kombinace proteinu Akt a iontů přechodného kovu, kombinace proteinu Akt a vazodilatačního činidla nebo kombinace proteinu Akt, iontů přechodného kovu a vazodilatačního činidla pro použití k indukci exprese VEGF v buňkách pacienta trpícího ischemickým onemocněním.
28. 28. Kombinace podle nároku 27, kde ischemické onemocnění je cerebrovaskulární ischémie, renální ischémie, pulmonární ischémie, ischémie končetin, ischémie myokardu nebo ischemická, idiopatická nebo hypertrofická kardiomyopatie.
29. 29. Kombinace první nukleové kyseliny kódující protein Akt operativně spojené s expresní kontrolní sekvencí a druhé nukleové kyseliny kódující angiogenní faktor operativně spojené s expresní kontrolní sekvencí pro použití k indukci exprese VEGF v buňkách pacienta trpícího ischemickým onemocněním.
30. 30. Kombinace podle nároku 29, kde angiogenní faktor je vybrán ze skupiny obsahující VEGF, kyselý růstový faktor fibroblastů, bazický růstový faktor fibroblastů, růstový faktor endotelových buněk a angiopoetin.
31. 31. Kombinace podle nároku 30, kde VEGF je vybrán ze skupiny obsahující VEGF₁₂₁, VEGFi₆₅, VEGF₁₈₉, VEGF₂₀₆ , VEGF-2, VEGF-B a VEGF-D.
32. 32. Kombinace podle nároku 30, kde angiogenní faktor je růstový faktor endotelových buněk.
33. 33. Kombinace alespoň dvou různých forem proteinu Akt pro použití k indukci exprese VEGF v buňce pacienta trpícího ischemickým onemocněním.
34. 34. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu kódující protein Akt, přechodný kov a/nebo vazodilatační činidlo a farmaceuticky přijatelné vehikulum.
35. 35. Farmaceutický přípravek podle nároku 34 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je součástí plazmidového nebo virového vektoru.
36. 36. Farmaceutický přípravek podle nároku 35 vyznačující se tím, že nukleová kyselina je součástí plazmidu.
37. 37. Farmaceutický přípravek podle nároku 35 vyznačující se tím, že virový vektor je vybrán ze skupiny obsahující retroviry, adenoviry, adeno-asociované viry, herpetické viry a virus vakcínie.
38. 38. Akt antisense nukleová kyselina pro použití k inhibici aktivity Akt u pacienta trpícího nádorovým onemocněním vedoucí k inhibici tvorby VEGF a inhibici angiogeneze.
39. 39. Intracelulární vazebný protein, který se specificky váže na protein Akt v buňkách pacienta v množství dostatečném k inaktivaci Akt, pro použití k inhibici aktivity Akt u pacienta trpícího nádorovým onemocněním vedoucí k inhibici tvorby VEGF a inhibici angiogeneze.
40. 40. Intracelulární vazebný protein podle nároku 39, kde intracelulární vazebný protein je jednořetězcová Fv protilátka (scFv).
41. 41. Nukleová kyselina kódující dominantní negativní formu Akt pro použiti k inhibici aktivity Akt u pacienta trpícího nádorovým onemocněním vedoucí k inhibici tvorby VEGF a inhibici angiogeneze.