CZ2001649A3 - Způsob výroby derivátů (2R)-piperidinu - Google Patents

Abstract

Je popsán způsob výroby derivátů (R)-piperidinu obecného vzorce I a VII, ve kterém R1 znamená hydroxy, amino nebo C].6alkoxy a R3 4 znamená hydroxy nebo amino. Deriváty (R)- piperidinu se získají z derivátů (RS)-piperidinu obecného vzorce II, ve kterém R2 znamená hydroxy, amino nebo Cp 6alkoxy, v přítomnosti stopových prvků, pomocí mikroorganismů nebo pomocí bezbuněčných enzymů, získaných z těchto mikroorganismů

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nového způsobu výroby derivátů (2R)-piperidinu pomocí mikroorganismů nebo bezbuněčných enzymů získaných z těchto mikroorganismů.

Dosavadní stav techniky

Deriváty (2R)-piperidinu, jako například kyselina (R)-pipekolinová, jsou důležité stavební kameny synthésy pro biologicky aktivní látky, jako například stimulační látky pro vyplavování růstového hormonu (WO-A-9513069) nebo prostředky proti úzkosti (DE-A-3702943).

V EP-A-686 698 se popisuje biotechnologický způsob výroby S-a-aminokarboxylových kyselin, například kyseliny S-a-pipekolinové přeměnou racemických amidů kyselin RS-a-aminokarboxylových pomocí mikroorganismů rodu Klebsiella a Pseudomonas, přičemž vzniknou také odpovídající amidy kyselin R-a-aminokarboxylových. Pro získání čistých amidů kyselin R-a-aminokarboxylových se však musí S-a-aminokarboxylové kyseliny odstranit relativně nákladnými postupy.

Je rovněž známý biotechnologický způsob výroby kyseliny (R)-pipekolinové kultivací mikroorganismů rodu Alcaligenes v mediu obsahujícím kyselinu (RS)-pipekolinovou (Mochizuki Κ., Yamazaki Y., Maeda H.: Agric. Biol. Chem., 1988, 52(5),1113). Nedostatkem tohoto způsobu je to, že se získá kyselina (R)-pipekolinová ve směsi s kyselinou (S)-2-aminoadipovou a po vzniku kyseliny aminoadipové se musí oddělit.

kyseliny (R)-pipekolinové je popsán (J.Org.Chem.,1994,59,2075-2081). Zde se estery přeměňují pomocí isolovaných z Aspergillus niger na požadovaný

Způsob výroby esterů R.J.Kazlauskasem a spol. odpovídající racemické stereoselektivních lipás

- 2 00 0 0 0 0 produkt. Nevýhodou pří tomto postupu je, že jsou požadované produkty ve špatné enantiomerní čistotě a získají se v nízkých výtěžcích. Navíc je třeba také velmi značná množství enzymu.

JP-A-63 248 393 popisuje způsob výroby kyseliny (R)-pipekolinové z racemické kyseliny pipekolinové pomocí mikroorganismů rodu Pseudomonas, Kurthia nebo Alcaligenes. Nevýhodou tohoto postupu jsou dlouhé reakční doby.

Úkolem předloženého vynálezu je odstranit tyto nevýhody a poskytnout jednoduchý způsob výroby derivátů (2R)-piperidinu, kterým se mohou docílit velké výtěžky a který je možné použít při velkovýrobě.

Tento úkol se řeší novým biotechnologickým způsobem podle nároku

1.

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsob výroby derivátů (2R)-piperidinu obecných vzorců I a VII

kde R¹ znamená hydroxy, amino nebo C₁_₆~alkoxy a R⁴ zanmená hydroxy nebo amino.

9

9

9

9

- 3 Podle vynálezu se používají mikroorganismy, které mají tu vlastnost, že jako jediný zdroj dusíku zužitkují amidy kyselin α-aminokyrboxylových ve formě racemátu nebo jeho opticky aktivních isomerů obecného vzorce III • 99 9*9 99

9999 99 «9 9999 99 9

(III) kde A znamená spolu s ~NH a -CH popřípadě substituovaný 5- nebo 6-členný nasycený heterocyklycký kruh. Takové mikroorganismy jsou ve stavu techniky známé a podrobně popsané v EP-A-686 698.

Výhodné mikroorganismy se shora popsanými vlastnostmi jsou mikroorganismy rodu Klebsiella a Pseudomonas. Obvzláště výhodně se používají mikroorganismy druhu Pseudomonas putida, zejména druhu Pseudomonas putida s označením DSM 9923, rovněž i jejich funkčně ekvivalentní varianty a mutanty.

Mikroorganismy druhu Pseudomonas putida s označením DSM 9923 byly uloženy podle Budapešťské úmluvy 20.04.1995 u Německé sbírky mikroorgansimů a buněčných kultur GmbH (DSM), Mascherodeweg lb, D-38124 Braunschweig.

Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí mikroorganismy, které mají v podstatě stejné vlastnosti a funkce jako původní mikroorgansimy. Takové varianty a mutanty mohou vzniknout náhodně, například UV-ozářením.

Bylo s překvapením shledáno, že tyto mikroorganismy nebo jejich bezbuněčné enzymy odbourávají, a v případě mikroorganismů zužitkují jako jediný zdroj uhlíku a energie, S-isomery u derivátů (RS)-piperidinu obecného vzorce II

• ·

- 4 kde R² znamená hydroxy, amino nebo C₁_g-alkoxy, v přítomnosti stopových prvků a za aerobních podmínek při otevření kruhu. Po dostatečné reakční době, obvykle po 1 až 48 hod., je pak v reakčním mediu už jen málo nebo nejsou vůbec žádné cyklické S-a-aminokarboxylové kyseliny nebo jiné rušivé vedlejší produkty s otevřeným řetězcem, jako je S-2-aminoadipová kyselina. Deriváty (2R)-piperidinu akumulované při reakci obecného vzorce I

IV kde R¹ znamená hydroxy, amino nebo C₁_₆~alkoxy, lze pak bez potíží isolovat, zejména bez nákladných separačních postupů.

C-L-g-alkoxy znamená zde a v dalším alkoxyskupinu s 1 až 6 atomy uhlíku s přímým nebo rozvětveným řetězcem. Jmenovitě lze připomenout methoxy, ethoxy, propoxy, isopropoxy, butoxy, isobutoxy, terč.-butoxy, pentoxy a jeho isomery a stejně jako hexoxy a jeho isomery.

Enzymy pro bezbuněčný systém lze získat v oboru známým rozvolněním mikroorganismů. Lze použít například metody s ultrazvukem, s tlakovým zařízením podle Frenche nebo s použitím lysozymů. Tyto bezbuněčné enzymy mohou být také imobilizovány na vhodném nosiči.

Pod pojmem stopové prvky se rozumějí například zinek, mangan, kobalt, měd', nikl, molybden, vápník, hořčík, bor, železo nebo síra, přičemž optimální složení stopových prvků závisí na použitém mikroorganismu. Výhodně se používají dohromady zinek, mangan, kobalt, měd', nikl, molybden, vápník, hořčík, bor, železo a síra.

Účelně se přeměna derivátů (RS)-piperidinu obecného vzorce II • «

- 5 ·«· ···· ·· provádí s rostoucími mikroorganismy.

Výhodné substráty obecného vzorce II jsou kyselina (RS)-pipekolinová, ethylester kyseliny (RS)-pipekolinové, propylester kyseliny (RS)-pipekolinové a amid kyseliny (RS)-pipekolinové.

Pod pojmem aerobní podmínky se rozumějí podmínky kultury, při kterých jsou mikroorganismy zásobeny kyslíkem. To lze docílit například u protřepávaných kultur vzdušným kyslíkem nebo u submersních kultur přifoukáním molekulárního kyslíku nebo vzdušného kyslíku.

Přeměna se může uskutečnit bez obvyklého pěstování přímo přidáním mikroorganismů k derivátům (RS)-piperidinu obecného vzorce II. Jinak se může přeměna uskutečnit po obvyklém pěstování mikroorganismů s vhodným zdrojem uhlíku a energie. Jako zdroj uhlíku a energie se zde mohou použít například cukry, karboxylové kyseliny, cukerné alkoholy nebo aminokyseliny. Jako cukry se mohou použít hexosy jako například glukosa nebo pentosy. Jako karboxylové kyseliny se mohou použít di- nebo trikarboxylové kyseliny, popř. jejich soli, jako například kyselina citrónová nebo sukcinát. Jako cukerný alkohol lze použít trojmocný alkohol jako je například glycerin. Jako aminokyselinu lze použít glutamát.

Výhodně se reakce provádí bez obvyklého pěstování přímo přidáním mikroorganismů k derivátům (RS)-piperidinu obecného vzorce II.

Při reakci mohou mikroorgansimy zužitkovat (S)-isomer derivátu (RS)-piperidinu obecného vzorce II jako jediný zdroj uhlíku a energie.

Jako medium pro způsob podle vynálezu mohou sloužit media obvyklá v oboru jako jsou media obsahující minerální soli, například medium obsahující minerální sůl podle Kulla a spol. (Arch.Microbiol. 135,1-7,1983), media popsána v tabulce 1 • 4 • 4 « 4 4 4 4

9 9 4 4 4

44 4 4 4 44 4444

4 nebo nízkomolární pufry, jako například 10 až 100 mM fosfátový pufr, do kterých se přidaly potřebné stopové prvky. Výhodně se postup provádí v mediích podle tabulky 1.

Účelně se podmínky volí tak, aby mikroorganismy výhodně zužitkovali S-isomer derivátů (RS)-piperidinu vzorce II jako zdroj uhlíku a energie. Výhodně tedy medium vedle sloučeniny II neobsahuje žádné jiné sloučeniny lehce zužitkovatelné jako zdroj uhlíku a energie.

Účelně se reakce provádí při jednorázovém, opakovaném nebo kontinuálním přidávání derivátů (RS)-piperidinu obecného vzorce II. Přidávání derivátů (RS)-piperidinu obecného vzorce II se provádí tak, aby koncentrace nepřesáhla 30 % hmotn., výhodně 10 % hmotn., obvzláště výhodně 5 % hmotn.

Hodnota pí-I media je účelně v rozmezí od 4 do 9, výhodně od 6 do 8. Účelně se reakce provádí při teplotě od 15 do 80 °C, výhodně od 25 do 40 °C.

Jaký produkt obecného vzorce I se při reakci získá závisí na volbě výchozího materiálu a reakčních podmínkách, zejména na reakční době a přívodu kyslíku.

Vychází-li se z kyseliny (RS)-pipekolinové [derivát (RS)-piperidinu II, kde R² znamená hydroxy], lze získat pouze kyselinu (2R)-pipekolinovou. Vychází-li se z amidu kyseliny (RS)-pipekolinové [derivát (RS)-piperidinu II, kde R² znamená amino], lze získat jak amid kyseliny (2R)-pipekolinové, tak kyselinu (2R)~ -pipekolinovou. Vychází-li se z esteru kyseliny (RS)-pipekolinové [derivát (RS)-piperidinu II, kde R² znamená C₁_₆alkoxy], lze získat jak ester kyseliny (2R)-pipekolinové, tak kyselinu (2R)-pipekolinovou.

Jestli se z amidu kyseliny (RS)-pipekolinové získá amid kyseliny (2R)-pipekolinové nebo kyselina (2R)-pipekolinová, lze například řídit reakční dobou. Tak se při přeměně amidu kyseliny (RS)-pipekolinové pomocí mikroorganismů podle vynálezu akumuluje nejprve amid kyseliny (2R)-pipekolinové, který se může popřípadě isolovat. Po delší době reakce se pak z amidu kyseliny (2R)-pipekolinové vytvoří kyselina. Reakci lze sledovat analyticky, například chromatografleky. Podobně to platí při reakci esterů kyseliny (RS)-pipekolinové, kdy se nejprve akumuluje ester kyseliny (2R)-pipekolinové a pak kyselina.

Po obvyklé reakční době od výhodně 1 až 48 hodin se získají v mediu deriváty (2R)-piperidinu obecného vzorce I, výhodně kyselina (R)-pipekolinová, amid kyseliny (R)-pipekolinové a ethyl- a isopropylester kyseliny (R)-pipekolinové ve velmi vysokém až kvantitativním výtěžku.

Takto získané deriváty (2R)-piperidinu obecného vzorce I se dají isolovat obvyklými metodami, jako například oddělením biomasy, okyselením, chromatografií, elektrodialýzou nebo krystalizací.

Průběh reakce lze také alternativně regulovat pomocí přívodu kyslíku. Jestliže se má například z amidu kyseliny (RS)-pipekolinové nebo esteru kyseliny (RS)-pipekolinové vyrobit kyselina (R)-pipekolinová, reakce se účelně provádí za aerobních podmínek až po akumulaci amidu kyseliny (R)-pipekolinové, popř. esteru kyseliny (R)-pipekolinové jak je shora uvedeno, a pak se zastaví přívod kyslíku, čímž se vytvoří kyselina.

Přeměna derivátu kyseliny (RS)-pipekolinové obecného vzorce V (V)

kde R³ znamená amino nebo C₁__galkoxy, přičemž C^galkoxy má shora uvedený význam, na kyselinu (R)-pipekolinovou vzorce IV

(IV) » · · · • · · · ···· «« » · · se tedy uskuteční přes derivát kyseliny (R)-pipekolinové obecného vzorce VI

(VI) kde R^J má shora uvedený význam, který se v mediu přechodně akumuluje s rostoucím enantiomerním přebytkem a který se popřípadě může isolovat. Jestliže se má vyrobit derivát kyseliny (R)-pipekolinové obecného vzorce VI z derivátu kyseliny (RS)-pipekolinové obecného vzorce V, pak se po akumulaci isoluje. Jestliže se má vyrobit kyselina (R)-pipekolinová vzorce IV z z derivátu kyseliny (RS)-pipekolinové obecného vzorce V, reakce se účelně provádí až po akumulaci derivátu kyseliny (R)-pipekolinové obecného vzorce VI za aerobních podmínek a pak se zastaví přívod kyslíku.

Pro zjištění, zda se v mediu akumuloval derivát kyseliny (R)-pipekolinové obecného vzorce VI, lze reakce analyticky sledovat, například chromatograficky. Reakce se má ukončit, jakmile se dosáhne maximální akumulace derivátu kyseliny (R)-pipekolinové obecného vzorce VI.

Další součást vynálezu je další přeměna, redukce, derivátů kyseliny (2R)-pipekolinové obecného vzorce VI na deriváty (2R)-piperidinu obecného vzorce VII

(VII) kde R⁴ znamená hydroxy nebo amino.

Jako redukční činidlo se obvykle používá hydrid alkalického kovu nebo hydrid kovu alkalické zeminy, jako např. hydrid hlinitolitný, borohydrid sodíku, hydrid hlinitosodný, hydrid hlinitodra- 9 ?>’hiý, borohydrid hořečnatý nebo borohydrid vápenatý. Zejména se používá hydrid hlinitolitný.

Pedukce se účelně provádí při teplotě od 0 do 100 °C, výhodně při teplotě zpětného toku odpovídajícího rozpouštědla.

Jak je v oboru známo, může se redukce provádět v polárním organickém rozpouštědle, jako například v etheru. Jako ethery jsou vhodné například diethylether, dipropylether, tetrahydrofuran nebo 1,4-dioxan.

Po obvyklé reakční době od 1 do 16 hod. se pak mohou požadované produkty obecného vzorce VII, jako (R)-2-(aminoethyl)píperidin nebo (R)-2-(hydroxymethyl)piperidin, isolovat pomocí známých metod zpracování.

Tabulka 1

Medium 1
(NH4)2so4	2,0	g/i
Na2HPO4	2,0	g/l
kh2po4	1,0	g/i
NaCl	2,0	g/i
MgCl2.6H2O	0,4	g/i
CaCl2.2H20	14.5	mg/l
FeCl3.6H2O	0.8	mg/1
ZnSO4.7H2O	O,1	mg/l
MnCl2.4H2O	0,09	mg/1
H3BO3	0,3	mg/l
CoC12.6H20	0,2	mg/1
CuC12.2H2O	0,01	mg/1
NíC12.6H2O	0,02	mg/1
Na2Mo04.2H2O	0,03	mg/1
FeSO4.7H2O	2,0	mg/1
EDTA-Na2.2H20	5,0	mg/1

0 0 0 « « 00 00 0 • «0 0 · · · · 0 000 000 00 0 00 0 *0 0 · 0 0 0 «0 0 0

000 000 000 0000 00 00 0000 00 00»

Medium 2 kh₂po₄ nh₄ci (NH₄)₂SO₄ Na₂SO₄ MgCl₂.6H₂O CaCl₂.2H₂O ZnSO₄.7H₂O MnCl₂.4H₂O h₃bo₃

CoC1₂.6H₂0 CuC1₂.2H₂O NÍCl₂.6H₂O Na₂Mo0₄.2H₂O FeSO₄.7H₂O EDTA-Na₂.2H₂0

Medium 3

Na₂SO₄

Na₂HPO₄ kh₂po₄

NaCl

MgCl₂.6H₂O CaCl₂.2H₂0 FeCl₃.6H₂O ZnSO₄.7H₂O MnCl₂.4H₂O H₃ ^b°3

CoCl₂.6H₂O CuCl₂.2H₂O NÍC1₂.6H₂O Na₂Mo0₄.2H₂O FeSO₄.7H₂O EDTA-Na₂.2H₂0

1,3 g/1
5,0	g/1
2,0	g/1
0,25 g/1
0,8	g/i
0,16 g/1
9,0	mg/1
4,0	mg/1
2,7	mg/1
1,8	mg/1
1,5	mg/1
0,18 mg/1
0,2	mg/1
30,0	mg/1
175,	0 mg/1

o,i g/1
2,0	g/i
1,0	g/1
2,0	g/i
0,4	g/i
14, E	> mg/1
0,8	mg/1
0,1	mg/1
0,09 mg/1
0,3	mg/1
0,2	mg/1
0,01 mg/1
0,02 mg/1
0,03 mg/1
2,0	mg/1
5,0	mg/1

• · ·« * * * <

• · a

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Výroba kyseliny (R)-pipekolinové z kyseliny (RS)-pipekolinové

1.1 v kultuře za třepání

Vil Erlenmeyerově baňce se ke 400 ml media 1 a kyseliny (RS)-pipekolinové o koncentraci 1,5 % přidal Pseudomonas putida DSM 9923. Obsah se inkuboval při 30 °C a na třepačce při 140 otáčkách/min. Po 24 hodinách se bezbuněčný supernatant testoval při OD650 3,7 pomocí HPLC na obsah kyseliny (R)-pipekolinové.

Kyselina (R)-pipekolinová se získala ve výtěžku > 45 %, vztaženo na vnesenou kyselinu (RS)-pipekolinovou, a s ee-hodnotou > 99 %.

1.2 ve fermentoru

V 500 ml Erlenmeyerově baňce se šikanami se ke 100 ml media 3 a kyseliny (RS)-pipekolinové o koncentraci 1 % přidal Pseudomonas putida DSM 9923. Obsah se inkuboval 16 hod. při 30 °C a na třepačce při 140 otáčkách/min. Do 51 fermentoru s 3 1 media 2 a kyselinou (RS)-pipekolinovou o koncentraci 1,5 % (45 g) se přidala předkultura Pseudomonas putida DSM 9923. Po 7 hodinách se v průběhu 5 hodin kontinuálně přidávalo dalších 45 g kyseliny (RS)-pipekolinové jako 10 % ního roztoku. Po dalších 4 hodinách se biotransformace ukončila bezbuněčný supernatant se testoval pomocí HPLC na obsah kyseliny (R)-pipekolinové. Kyselina (R)-pipekolinová se získala v kvantitativním výtěžku a s ee-hodnotou > 97 %.

Příklad 2

Výroba kyseliny (R)-pipekolinové z ethylesteru kyseliny (RS)pipekolinové

Ve 100 ml Erlenmeyerově baňce se šikanami se ke 40 ml media 3 a ethylesteru kyseliny (RS)-pipekolinové o koncentraci 1,5 % přidal Pseudomonas putida DSM 9923. Obsah se inkuboval při 30 °C na třepačce při 140 otáčkách/min. Po 26 hodinách se bezbuněčný supernatant testoval při OD650 2,0 pomocí HPLC na obsah kyseliny (R)-pipekolinové. Kyselina (R)-pipekolinová se získala ve výtěž- 12 ku > 45 %, vztaženo na vnesený ethylester kyseliny (RS)-pipekolinové, a s ee-hodnotou > 80 %. Po 44 hodinách se při OD650 3,2 získala enantiomerně čistá kyselina (R)-pipekolinová.

Příklad 3 • 4 4 · 44

Výroba amidu kyseliny (R)-pipekolinové z amidu kyseliny (RS)pipekolinové v protřepávané kultuře

Ve 100 ml Erlenmeyerově baňce se šikanami se ke 40 ml media a amidu kyseliny (RS)-pipekolinové Pseudomonas putida DSM 9923. Obsah třepačce při 140 otáčkách/min. Po supernatant testoval při OD650 3,0 o koncentraci 1,5 % přidal se inkuboval při 30 °C na 20 hodinách se bezbuněčný pomocí HPLC na obsah amidu kyseliny (R)-pipekolinové. Amid kyseliny (R)-pipekolinová se získal ve výtěžku > 45 %, vztaženo na vnesený amid kyseliny (RS)-pipekolinové, a s ee-hodnotou > 99 %.

Příklad 4

Výroba amidu kyseliny (R)-pipekolinové a kyseliny (R)-pipekolinové z amidu kyseliny (RS)-pipekolinové ve fermentoru Pseudomonas putida DSM 9923 se pěstoval přes noc na mediu 3 s 20 g/1 glutamátu ve fermentoru. Při hodnotě OD650 14 se přidal 1 % amid kyseliny (RS)-pipekolinové. Po 2 hodinách se podle GC-analýzy vyskytoval prakticky enantiomerně čistý amid kyseliny (R)-pipekolinové. Kyselina pipekolinová se neprokázala.

Jeden vzorek tohoto roztoku se za uzavření přívodu vzduchu inkuboval v třepací skříni při 37 °C a 140 otáčkách/min. Po 48 hodinách se podle GC-analýzy vyskytovala enantiomerně čistá kyselina (R)-pipekolinová. Amid kyseliny pipekolinové už se nedal prokázat.

Příklad 5

Výroba kyseliny (R)-pipekolinové z amidu kyseliny (RS)-pipekolinové v protřepávané kultuře

Ve 100 ml Erlenmeyerově baňce se šikanami se ke 40 ml media

- 13 ♦ ·4· ·· a amidu kyseliny (RS)-pipekolinové Pseudomonas putida DSM 9923. Obsah třepačce při 140 otáčkách/min. Po supernatant testoval při OD650 3,9 o koncentraci 1 % přidal se inkuboval při 30 °c na 26 hodinách se bezbuněčný pomocí GC.

Byla zjištěna kyselina (R)-pipekolinové s ee-hodnotou > 98 výtěžku ca 10 %.

ve

Příklad 6

Výroba isopropylesteru kyseliny (R)-pipekolinové z isopropylesteru kyseliny (RS)-pipekolinové v protřepávané kultuře

V 500 ml Erlenmeyerově baňce se šikanami se ke 100 ml minimálního media 3 přidal isopropylester kyseliny (RS)-pipekolinové o koncentraci 4 g/1 a Pseudomonas putida DSM 9923. Obsah se inkuboval při 30 °C na třepačce při 140 rpm. Po 4,5 hodinách se bezbuněčný supernatant testoval při OD650 1,4 pomocí GC na obsah a na enantiomerní přebytek kyseliny pipekolinové a isopropylesteru kyseliny pipekolinové. Isopropylester kyseliny (R)-pipekolinové byl nalezen enantiomerně čistý a o výtěřku 88 %, vztaženo na vnesený isopropylester kyseliny (RS)-pipekolinové. Jako vedlejší produkt byla nalezana enantiomerně čistá kyselina (R)-pipekolinové v málo procentech.

Po oddělení biomasy centrifugaci (20 min. při 8000 *g) se vodní roztok zahustil ve vakuu na třetinu, hodnota pH se upravila na 10 30 %ním hydroxidem sodným a ihned se třikrát extrahovala vždys 20 ml diethyletheru. Spojené organické fáze se sušily a zahustily se síranem sodným. Přivedením kyseliny chlorovodíkové vykrystalizovalo 0,195 g isopropylesteru kyseliny (R)-pipekolinové jako hydrochloridu (výtěžek 80 %, ee > 98 % lt. GC).

Příklad 7

Výroba kyseliny (R)-pipekolinové z isopropylesteru kyseliny (RS)-pipekolinové

V 500 ml Erlenmeyerově baňce se šikanami se ke 100 ml minimálního media 3 a isopropylesteru kyseliny (RS)-pipekolinové

- 14 00 00 ♦ 0 · 0 0 0 0 0 0 · 0 0 0 • 000 0000 00 o koncentraci 4 g/1 přidal Pseudomonas putida DSM 9923. Obsah se inkuboval při 30 °C na třepačce při 140 rpm. Po 7,5 hodinách se při OD650 1,4 odebral vzorek a inkuboval bez vzduchu. Po 22 hodinách se bezbuněčný supernatant testoval pomocí GC na obsah a na enantiomerní přebytek kyseliny pipekolinové a isopropylesteru kyseliny pipekolinové. Kyselina (R)-pipekolinové byla nalezena enantiomemě čistá a o výtěřku 80 %, vztaženo na vnesený isopropylester kyseliny (R)-pipekolinové. Jako vedlejší produkt byl nalezan enantiomemě čistý isopropylester kyseliny (R)-pipekolinové v málo procentech.

Příklad 8

Redukce amidu kyseliny (R)-pipekolinové na (R)-2-(aminomethyl)piperidin

Ve 21 baňce se suspendovalo pod dusíkovou atmosférou 11,8 g lithiumaluminiumhydridu v 500 ml diethyletheru. Při 5 °C se pomalu přidávalo 20 g amidu kyseliny (R)-pipekolinové (viz příklad 3). Směs se 3 hodiny míchala při teplotě místnosti a pak 5 hodin pod zpětným tokem. Po ochlazení na teplotu místnosti se postupně pomalu přikapalo 12 ml vody, 12 ml 15 %ního hydroxidu sodného a 36 ml vody. Směs se míchala při pokojové teplotě až se stala sněhobílou. Přidalo se 120 g síranu sodného a přes noc se míchalo při teplotě místnosti. Pevná látka se odfiltrovala a čtyřikrát promyla pokaždé s 250 ml diethyletheru. Spojené organické fáze se zahustily ve vakuu. Získalo se 12,5 g (R)-2-(aminomethyl)piperidinu jako nažloutlý olej (obsah: 66 % podle GC). Destilace při 52-53 °C/1,8 kPa poskytla 3,6 g (20 %) (R)-2~(aminomethyl)piperidinu čistého podle GC jako bezbarvou kapalinu.

Příklad 9

Redukce isopropylesteru kyseliny (R)-pipekolinové na (R)-2-(hydroxymethyl)piperidin

Ve 250 ml baňce se suspendovalo pod dusíkovou atmosférou 0,2 g lithiumaluminiumhydridu ve 20 ml diethyletheru. Při 5 °C se • 9

9 9

9

9«

9 « «

9 9 • ♦ 9

9 9

9999 99 •99 99 9999 pomalu přidávalo 90 mg hydrochloridu isopropylesteru kyseliny (R)-pipekolinové. Směs se 1 hodinu míchala při teplotě místnosti a pak 4 hodiny pod zpětným tokem. Po ochlazení na teplotu místnosti se postupně pomalu přikapalo 0,2 ml vody, 0,2 ml 15 %ního hydroxidu sodného a 0,4 ml vody. Směs se míchala při pokojové teplotě až byla sněhobílá. Přidaly se 2 g síranu sodného a směs se přes noc míchala při teplotě místnosti Pevná látka se odfiltrovala a čtyřikrát promyla pokaždé s 20 ml diethyletheru. Spojené organické fáze se zahustily ve vakuu. Získalo se 47 mg (R)-2-(hydroxymethyl)pipe- ridinu jako lehce žlutý olej (obsah: 95 %, ee > 97 % podle GC).

Claims (8)

1. NÁROKY upravené nároky

   1. Způsob výroby derivátů (2R)-piperidinu obecného vzorce I (I) kde R¹ znamená hydroxy, amino nebo C-^g-alkoxy,v yznačujíc i se tím, že se na derivát (RS)-piperidinu obecného vzorce II kde R² znamená hydroxy, amino nebo C1_g-alkoxy a R¹ a R² mohou být stejné nebo rozdílné s tím, že když je R¹ amino, R² není hydroxy nebo C1_₆~alkoxy a když je R¹ C₁_₆-alkoxy, R² není hydroxy nebo amino, působí rostoucími mikroorganismy, které jsou schopné jako jediný zdroj dusíku zužitkovat amidy kyselin α-aminokyrboxylových ve formě racemátu nebo jednoho z jeho opticky aktivních isomerů obecného vzorce III (III) kde A znamená spolu s -NH a -CH popřípadě substituovaný 5- nebo 6-členný nasycený heterocyklický kruh, v přítomnosti stopových prvků a za aerobních podmínek, přičemž se S-isomer derivátu (RS)-piperidinu II zužitkuje, popřípadě odbourává jako zdroj uhlíku a energie při štěpení kruhu.

   to to

   - 17 upravené nároky
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím že se jako substrát vzorce II používá kyselina (RS)-pipekolinové, ethylester kyseliny (RS)-pipekolinové, isopropylester kyseliny (RS)-pipekolinové nebo amid kyseliny (RS)-pipekolinové.
3. 3. Způsob podle jednoho z nároků 1 nebo 2, vyznaču jící se tím, že se reakce provádí s mikroorganismy rodu Pseudomonas, zejména druhu Pseudomonas putida.
4. 4. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 3, vyznačujíc se tím, že se reakce provádí s mikroorganismy druhu Pseudo· monas putida (DSM 9923) nebo jejich funkčně ekvivalentními variantami nebo mutanty.
5. 5. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 4, vyznačujíc se tím, že se přidání derivátu kyseliny (RS)-pipekolinové obecného vzorce II provádí tak, že koncentrace nepřesáhne 30 % hmotnostních.
6. 6. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 5, vyznačujíc se tím, že se reakce provádí při hodnotě pH od 4 do 9 a při teplotě od 15 do 80 °C.
7. 7. Způsob výroby kyseliny (R)-pipekolinové vzorce IV

   OH (IV) vyznačující se tím, (RS)-pipekolinové obecného vzorce V že se na derivát kyseliny

   O , , kde R znamená amino nebo C₁_₆~alkoxy, jako substrát působí rostoucími mikroorganismy, které jsou schopné zužitkovat amidy a-aminokarboxylových kyselin ve formě racemátu nebo jednoho z jeho opticky aktivních isomerů obecného vzorce III ·· 41 • 4 » 4

   4 4 «

   4 4 4

   4 4*

   494« 4« upravené nároky (III) kde A znamená spolu s -NH a -CH popřípadě substituovaný 5- nebo 6-členný nasycený heterocyklycký kruh, jako jediný zdroj dusíku, v přítomnosti stopových prvků a za aerobních podmínek, přičemž se reakce provádí až do nahromadění odpovídajícího derivátu kyseliny (R)-pipekolinové vzorce VI .0 (VI)

   R³ kde má R³ shora uvedený význam, který se může popřípadě isolovat, za aerobních podmínek, přičemž se S-isomer derivátu (RS)-piperidinu V zužitkuje, popřípadě odbourává jako zdroj uhlíku a energie při štěpení kruhu, a pak se zastaví zásobování kyslíkem.

   Způsob výroby derivátů (2R)-piperidunu obecného vzorce VII (VII) ,R' kde R⁴ znamená hydroxy nebo amino, vyznačující se tím, že se v prvním stupni derivát kyseliny (RS)-pipekolinové obecného vzorce V • 9

   9 9 9

   4 4 • · 9« • · 9 9 « 9 · » 9 9
8. 9 9 9 • 9« 9 94 • 4 94

   9 9 9 9

   4 » 9 • · 9

   99 9 9 99

   9 4

   99 9 kde R³ znamená amino nebo C₁_₆~alkoxy, jako substrát přeměňuje rostoucími mikroorganismy, které jsou schopné zužitkovat amidy a-aminokarboxylových kyselin ve formě racemátů nebo jednoho z jeho opticky aktivních isomerů obecného vzorce III (III) kde A znamená spolu s -NH a -CH popřípadě substituovaný 5- nebo 6-členný nasycený heterocyklycký kruh, jako jediný zdroj dusíku, v přítomnosti stopových prvků a za aerobních podmínek, za kterých se S-isomer derivátu (RS)-piperidinu V zužitkuje, popřípadě odbourává jako zdroj uhlíku a energie při štěpení kruhu, na derivát kyseliny (R)-pipekolinové obecného vzorce VI íf.....f

   R³ (VI) kde R³ znamená amino nebo C₁_₆~alkoxy, a ten se ve druhém stupni redukuje na požadovanou sloučeninu obecného vzorce VII.