CZ2001794A3 - Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy s fruktosyltransferázovou aktivitou a jejich pouľití - Google Patents

Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy s fruktosyltransferázovou aktivitou a jejich pouľití Download PDF

Info

Publication number
CZ2001794A3
CZ2001794A3 CZ2001794A CZ2001794A CZ2001794A3 CZ 2001794 A3 CZ2001794 A3 CZ 2001794A3 CZ 2001794 A CZ2001794 A CZ 2001794A CZ 2001794 A CZ2001794 A CZ 2001794A CZ 2001794 A3 CZ2001794 A3 CZ 2001794A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nucleic acid
plant
acid molecule
fructosyltransferase
cells
Prior art date
Application number
CZ2001794A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ300084B6 (cs
Inventor
Arnd G. Heyer
Jochen Rehm
Regina Wendenburg
Original Assignee
Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissensc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissensc filed Critical Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissensc
Publication of CZ2001794A3 publication Critical patent/CZ2001794A3/cs
Publication of CZ300084B6 publication Critical patent/CZ300084B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Jellies, Jams, And Syrups (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Fodder In General (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

Molekuly nukleové kyseliny kóduj ící s fruktosyltransferázovou aktivitou a jejich použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódující polypeptidy mající fruktosyltransferázovou enzymatickou aktivitu. Dále se vynález týká vektorů a hostitelů, obsahujících takové molekuly nukleové kyseliny. Také se týká způsobů přípravy fruktosyltransferázy a výroby p.olyfruktózy inulínového typu v různých hostitelských organizmech nebo in vitro, a také fruktosyltransferázy kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu, které mohou být využity pro výrobu polyfruktózy inulínového typu.
Dosavadní stav techniky
Ve vodě rozpustné lineární polymery nalézají mnoho způsobů využití, např. je lze užít ke zvýšení viskozity vodných systémů, jako detergenty, suspendační činidla nebo pro urychlení sedimentace a vytváření komplexů, ale také pro vázání vody. Polymery založené na sacharidech, např. fruktosylové polysacharidy, jsou zvláště zajímavým výchozím materiálem, neboř jsou biologicky degradovatelné.
Kromě jejich použití jako obnovitelných surovin pro průmyslovou výrobu, fruktosylové polymery jsou zajímavé jako aditiva do potravin, např. jako sladidla. Pro různé aplikace jsou potřebné polymery s různou délkou řetězce. Zatímco výhodné polymery pro potravinářský průmysl jsou krátké nebo • · • · · · • · · středně dlouhé, pro technické • · · · • · · · · · e • · · · ···· ·» · · · · « « • · · · · · ·· ···· ·· ··· surfaktanty, jsou potřebné polymerizace (DP) .
použití, např.
j ako polymery s vysokým stupněm
Byly popsány různé způsoby přípravy fruktanových polysacharidu v rostlinách tím, že se exprimovaly fruktosyltransferázy bakteriálního původu nebo polyfruktózy se střední délkou řetězců tím, že se exprimovaly fruktosyltransferázy rostlinného původu. Např. PCT/US89/02729 popisuje možnost vytvářet sacharidové polymery, zejména dextran nebo polyfruktózu, v transgenních rostlinách, zejména v plodech transgenních rostlin. Pro přípravu takto modifikovaných rostlin bylo navrženo použití levansacharázy z mikroorganismů, zejména Aerobacter levanícum, Streptococcus salivarius a Bacillus subtilis, nebo dextransacharázy z Leuconostoc mesenteroid.es. Avšak nebyla popsána ani příprava aktivních enzymů, ani produkce levanu nebo dextranu v transgenních rostlinách.
PCT/EP93/0211 popisuje způsob přípravy transgenních rostlin, které exprimují gen lsc pro levansacharázu z gramnegativní bakterie Erwinia amylovora. Tyto rostliny vytvářejí vysokomolekulární silně rozvětvený levan.
PCT/NL93/00279 popisuje transformaci rostlin chimérickými geny, které obsahují gen sacB z Bacillus subtilis. Tyto rostliny tvoří rozvětvený levan.
Bakteriální fruktosyltransferáza použitá v PCT/US89/02729, PCT/EP93/02110 a PCT/NL93/00279 syntetizuje levan, což je β-2,β vázaný fruktosylový polymer, který má četná větvení typu β-2,1. Avšak vzhledem k četnému větvení má levan rozhodné nevýhody pro technické využití, a je tudíž mnohem méně žádán jakožto výchozí materiál na rozdíl od • · • · • · · · • · · · ··· · • · · ····· · ·· ···» ··« • · · · · · · • · ···· ·· ··· ·« *
inulínu, který má β-2,1 vazby. V současnosti je znám jen jeden bakteriální gen, jehož produkt se podílí na syntéze inulínu, a sice jde o gen ftf ze
Streptococcus mutans.
PCT/NL93/00279 popisuje transformaci rostlin tímto genem, které syntetizovaly vysokomolekulární inulin, ale v tak malém množství, že není vhodné k průmyslovému využití.
PCT/EP97/02195 popisuje také způsob přípravy transgenních rostlin s genem ftf ze
Streptococcus mutans.produkuj ících inulin. Stejně jako u rostlin popsaných v PCT/NL93/00279 byl však výtěžek inulínu nízký. Je sice možné exprimovat gen, který byl předem upraven, v transgenních rostlinách, ale výtěžek inulínu z transgenních rostlin je tak nízký, že rostliny nejsou vhodné pro průmyslové využití.
Kromě toho PCT/NL96/00012 popisuje DNA sekvence, které kódují enzymy syntetizující sacharidy a také přípravu transgenních rostlin pomocí těchto sekvencí, sekvence popsané ve vynálezu pocházejí z Helianthus tuberosus.
Podle
PCT/NL96/00012 se sekvence mohou užít k k modifikaci profilu fruktanů u petúnie, bramboru i samotné Helianthus tuberosus.
Exprese sekvence popsané ve vynálezu, která kóduje sacharózofruktosyltranferázu (SST) závislou na sacharóze nebo frukotsyltransferázu, v transgenních rostlinách umožňuje produkci inulínu.
Průměrný stupeň polymerizace inulínu je
DP=S až DP=10.
takovým stupněm polymerizace nemůže být inulin považován za polymer s dlouhým řetězcem.
Způsob popsaný
PCT/NL96/00012 nedovoluj e produkovat vysokomolekulární inulin.
Nedávno Rehm a kol. (J. Bacteriology 180 (1998) , 13051310) popsali produkci oligosacharidu v kvasinkách po vnesení
SST z Aspergillus foetidus. Avšak polymerizační stupeň produktu byl pouze DP = 3.
A · • · · ·
DE 197 08 774.4 se týká produkce 1-kestózy a nystózy užitím enzymů s fruktosylpolymerázovou aktivitou. V transgenních rostlinách se tak mohou tvořit tri- a tetrasacharidy. Výtěžek byl vysoký a u bramboru odpovídal buněčnému obsahu sacharózy. Avšak nebyla popsána produkce inulínů s delším řetězcem.
Syntéza polyfruktóz v houbách byla také diskutována v mnoha publikacích.
Např. Barthomeuf a Pourrat (Biotechnology Letters 17 (1995) ,
911-916) popsali přípravu enzymu s fruktosyltransferázovou aktivitou z
Penícillium rugulosum. Preparát však vykazoval různé enzymatické aktivity a nejednalo se tudíž o čistou fruktosyltransferázu.
DNA sekvence genu pro fruktosyltransferázu není známa. Cairns a kol. (New Phytologist 129 (1995), 299-308) popsal přechodnou syntézu tri-, tetra- a pentasaccharidů ze sacaharózy v kultivačním médiu Monographella nivalis. odpovídající enzymatická aktivita se zdá být zejéna hydrolytické povahy, neboť, polyfruktózy jsou opět degradovány s rostoucím vyčerpáním substrátu. Jelikož není známa žádná DNA sekvence, není možné zhodnotit, spoléhajíc na homologii s fruktofuranosidázami (invertázami), zda jde skutečně o fruktosyltransferázu v pravém smyslu nebo o invertázu.
U houby Aspergillus sydowi IAM 2544 bylo ukázáno, že je schopná vytvářet polyfruktózy inulinového typu. Harada a kol. (in: Nishinari and Doi (Eds.), Food Hydrocolloids: Structures, Properties and Functions, Plenům, New York (1994), 77-82) popsali syntézu inulinu pomocí konidií Aspergillus sydowi. 125 g konidií bylo inkubováno ve 25 1 20 % roztoku sacharózy a vytvořený produkt byl purifikován pomocí HPLC. Avšak tento proces není vhodný pro průmyslovou výrobu inulinu ve velkém měřítku. Maramatsu a kol. (Agric.
·· ·· · · · · · · ·· ···· · · * ··· • · · ····· ·· • Φ ···· ···· • · · ·· ··· ·· ···· ·· ··· ·· ·
Biol. Chem. 52 (1988), 1303-1304) popsali produkci fruktooligosacharidů pomocí mycelií téže houby (A. sydowi IAM 2544). Stupeň polymerizace byl v takovém případě 3 až 13. Enzymy zúčastněné v této syntéze byly jen částečně purifikovány nebo nebyly purifikovány vůbec. Aminokyselinové sekvence nebo DNA sekvence příslušných enzymů nejsou známy.
Návod pro purifikaci proteinů buďto nebyl popsán nebo byl popsán neúplně.
Cílem proto bylo poskytnout molekuly nukleové kyseliny a způsoby, které umožňují vytvářet geneticky modifikované organismy schopné produkovat polyfruktózu inulinového typu, tohoto cíle bylo dosaženo v předkládaném vynálezu.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález se týká molekul nukleové kyseliny kódujících fruktosyltransferázu, které jsou vybrány ze skupiny obsahující:
a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou zde jako sekvence identifikačního čísla (id. č.) 2,
b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódujícího úseku uvedeného v sekvenci id. č. 1 odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,
c) molekuly nukleové kyseliny hybridizující s řetězcem komplementárním k molekulám nukleové kyseliny uvedeným v bodech a) nebo b), a
d) molekuly nukleové kyseliny, jejichž nukleotidové sekvence se liší od sekvencí uvedených v c) díky • · • · · · degeneraci genetického kódu, a také všechny molekuly nukleové kyseliny, které jsou k nim komplementární.
Sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 1 kóduje fruktanfruktosyltransferázu závislou na sacharóze z Aspergillus sydowi, která v rostlinné buňce syntetizuje polyfruktany inulinového typu s dlouhým řetězcem. Překvapivě bylo zjištěno, že je možné produkovat polyfruktany inulinového typu s dlouhým řetězcem s dobrým výtěžkem v hostitelském organismu, zejména když se sekvence podle vynálezu užití v tran.sgen.nich rostlinách, bakteriích nebo houbách.
V rámci předkládaného vynálezu byl vypracován postup purifikace enzymu z Aspergillus sydowi. Enzym byl purifikován do homogenity, aby bylo možné stanovit sekvenci aminokyselin. Na základě aminokyselinových sekvencí byly připraveny oligonukleotidové primery pro polymerázovou řetězovou reakci (PCR) . Pomocí těchto primerů byly amplifikovány genové fragmenty, které pak byly použity pro screening cDNA knihoven. Bylo připraveno několik molekul cDNA se sekvenční homologií s PCR produkty. Většina takto získaných molekul obsahovala inzerty stejné velikosti. Úplnost cDNA molekuly byla potvrzena funkční expresí sekvence DNA v Saccharomyces nebo bramboru.
Purifikace enzymů, návrh oligonukleotidových primerů pro PCR, identifikace molekul cDNA a heterologní exprese jsou popsány v příkladech, izolovaná sekvence DNA a z ní odvozená proteinová sekvence jsou zde uvedeny jako sekvence id. č. 1 a
2. Sekvence DNA podle vynálezu je první popsaná sekvence kódující fruktanfruktosyltransferázu závislou na sacharóze z * · · · ·· ···· ·· ···· ··« · · • · · ····· ·· • · · · · · • · · · · • · ···· ·· · · · hub. Sekvence DNA a jí kódovaná proteinová sekvence se významně liší od sekvencí již známých fruktosyltranferáz.
tak např. je ze pouze
22,6% a
39% identita fruktosyltransferázou z Aspergillus naeslundii lev j hlediska proteinové a DNA sekvence, v uvedeném pořadí.
Přestože je zde 64% a
60,6% identita z hlediska proteinové a
DNA sekvence z invertázou
Aspergillus niger, protein kódovaný tímto genem má zcela jinou aktivitu. Takže bylo ukázáno, že molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu a fruktosyltransferázy, které kódují, jsou molekuly, které nebyly dosud popsány.
V kontextu předkládaného vynálezu fruktosyltransferázou se rozumí protein, který β-2,1-glykosidické a/nebo fruktózovými jednotkami.
je schopen katalyzovat spojení β-2,6-glykosidické vazby mezi
Přenášené fruktosylové zbytky pocházejí ze sacharózy.
Reakci katalyzovanou fruktanfruktosyltransferázou závislou na sacharóze podle vynálezu lze znázornit následujícím schématem:
n(G-F) —> G - Fn + (n-l)G kde G = glukóza, F = fruktóza a G - F = sacharóza, tzn. enzym přenáší fruktózový zbytek ze sacharózy na polyfruktan, který je vytvářen z molekuly sacharózy pomocí β-2,1-glykosidické vazby, přičemž se mohou vyskytnout i vazby β-2,6 glykosidické.
Polypeptid kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu s fruktosyltransferázovou aktivitou vede k syntéze polyfruktózy a v rostlinné buňce zejména k polyfruktóze inulínového typu (v popisu nazývané též jen inulín).
Termín polyfruktóza podle vynálezu označuje polyfruktan
se stupněm polymerizace DP > 4, výhodně DP > 6 a specificky DP > 8. Polyfruktóza inulínového typu nebo zkráceně inulín označují podle vynálezu fruktanový polymer s dlouhým řetězcem, tj. molekulu, kde jsou jednotky vázány hlavně β-2,1-glykosidickou vazbou, ale případně se vyskytuje i větvení β-2,6. Termín „dlouhý řetězec v této souvislosti znamená, že stupeň polymerizace (DP) je větší než 20, výhodně větší než 50, výhodněji větší než 100 a nej výhodně ji větší než 200. Fruktosylový polymer může nést terminální glukózový zbytek, který je navázán prostřednictvím C-l OH skupiny glukózy a C-2 OH skupiny fruktosylového zbytku. V tomto případě jeden fruktosylový polymer obsahuje jednu molekulu sacharózy.
Pokud je enzym podle vynálezu užit pro syntézu polyfruktanu in vitro, získá se oligomerní produkt (DP=4 až 10) .
Enzym kódovaný molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu lze odlišit od známých fruktosyltransferáz prostřednictvím katalyzované reakce. tak např. známé rostlinné SST katalýzují reakci:
G-F+G-F—»G-F-F+G.
Avšak fruktosyltransferázy závislé na fruktanu z rostlin katalýzují následující reakci:
G-Fn + G-Fm—>G- Fn+1 + G - Fm.iz přičemž tato reakce je plně reverzibilní.
Bakteriální fruktosyltransferázy, např. kódované genem sacB gene z Bacillus subtilis také katalyzují reakci typu nG - F —> G - Fn + (n-1) G.
Avšak tyto enzymy produkují levan, polyfruktan vázaný β-2,F-glykosidickými vazbami s β-2,1-větvením • · • · · · • · · · «·· ···· • · · ··«·· ·· · ·· ···· «··· * • · · ·· ···» • · ···· ·· · · · ·· ··
Zatímco protein (FTF) kódovaný genem f tf ze
Streptococcus mutans indukuje syntézu inulínu s molekulovou hmotností několik milionů Daltonů. Avšak gen ftf nebo kódovaný protein nevykazují významnou homologii se sekvencí nukleové kyseliny uvedenou jako sekvence id. č. 1 (pouze 37,3 %) nebo aminokyselinovou sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 2 (jen 22,6 %).
Podle předkládaného vynálezu termín „hybridizace znamená hybridizaci za obvyklých podmínek, výhodně za stringentních podmínek, jak jsou např. popsány v publikaci Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Příkladem stringentních podmínek je: 50% formamid, 5 x SSC, 5 x Denhardtův roztok, 40 mM hydrogensfosforečnan sodný, pH 6,8; 0.5% (hmot../objem) BSA,
1% (hmot. /obj em) SDS, 0.1 mg/ml DNA ze spermatu sledu, při hybridizační teplotě 42°C a následném promývání filtrů v 0.5 x SSC/0.5% SDS při 60°C.
Příkladem obvyklé hybridizace v nestringentních podmínkách je hybridizace stejná jak je popsána výše, s výjimkou toho, že místo 50% formamidu se užije 30% formamid a následně jsou filtry promývány v 2 x SSC/0.5% SDS při 56°C.
Molekuly nukleové kyseliny hybridizující s molekulami podle vynálezu mohou být izolovány z genomických nebo cDNA knihoven připravených především z hub. Takové molekuly nukleových kyselin mohou být identifikovány a izolovány pomocí molekul podle vynálezu nebo jejich fragmentů nebo reverzních komplementárních molekul, např. hybridizaci ve standardních podmínkách (viz např. Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Molekuly • ·
nukleové kyseliny se mohou užít jako hybridizační sonda, která má přesně a nebo v podstatě sekvenci jako je sekvence id. č. 1 nebo její fragmenty. Fragmenty použité pro hybridizaci mohou být také syntetické fragmenty, které byly připraveny obvyklou metodou, a jejichž sekvence je v podstatě identická se sekvencí molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu.
K molekulám hybridizujícím s molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu patří také fragmenty, deriváty a alelické varianty molekul nukleové kyseliny popsaných výše, které kódují protein podle vynálezu. Termín „fragmenty podle vynálezu znamená části molekul nukleové kyseliny, které jsou dostatečně dlouhé na to, aby kódovaly proteiny s fruktosyltransferázovou aktivitou. Termín „derivát podle vynálezu znamená, že sekvence této molekuly se liší od výše popsaných molekul v jedné nebo více pozicích, avšak vykazuje vysoký stupeň homologie s těmito sekvencemi. Homologie znamená alespoň 40% sekvenční identitu, zejména alespoň 60% identitu, výhodně alespoň 80% identitu a ještě výhodně nejméně 90% identitu. Proteiny kódované těmito nukleovými kyselinami výhodně mají alespoň 60% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvenci id. č. 2, výhodně alespoň 70%, zvláště 80% a nej výhodněji 95% identitu. Odchylky od sekvence molekul nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být způsobeny např. delecemi, substitucemi, inzercemi a/nebo rekombinací. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být i jiné deriváty sekvencí pocházejících z hub. Derivatizace takových sekvencí může být potřebná k tomu, aby se optimalizovala exprese v určitých hostitelských buňkách.
Molekuly nukleových kyselin, které jsou homologické s molekulami pospanými výše a představují deriváty těchto • · ·* · · · · · · ·· · • ♦ · · · · ► · · · · • · · · · · · · ·· • · ···· «··· * • · φ 9 9 9 · · ·· ···· ·· ··· ·· ·« molekul, jsou obvykle variace těchto molekul, které vykazují stejnou biologickou funkci. Tyto variace jsou buďto přirozeně se vyskytující variace nebo jsou vneseny specifickou mutagenezí. Variace mohou být také synteticky připravené sekvence. Alelické varianty jsou buďto přirozeně se vyskytující varianty, nebo varianty připravené synteticky nebo technikami rekombinantní DNA.
Proteiny kódované různými variantami molekul nukleové kyseliny podle vynálezu mají výhodně určité společné vlastnosti, jako je např. enzymatická aktivita, molekulová hmotnost, imunologická reaktivita, konformace nebo fyzikální vlastnosti jako je elektroforetická mobilita při gelové elektroforéze, chromatografické vlastnosti, sedimentační koeficient, rozpustnost, spektroskopické vlastnosti, stabilita, pH optimum nebo teplotní optimum.
Ve výhodném provedení molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu kódují polypeptid mající vlastnosti fruktosyltransferázy z hub, zejména výhodně z Aspergillus, a nejvýhodněji fruktosyltransferázy z Aspergillus sydowi.
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu jsou molekuly DNA nebo RNA. Příklady odpovídajících molekul DNA jsou molekuly genomické DNA nebo cDNA. Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být izolovány z přírodních zdrojů, např. z hub, zejména z Aspergillus, a nejvýhodněji z Aspergillus sydowi, nebo se syntetizují známými metodami. Je také možné vnést různé mutace do molekul nukleové kyseliny podle vynálezu metodami známi v molekulární biologii (viz např. Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Vnesení mutací indukuje syntézu proteinů s potenciálně změněnými biologickými vlastnostmi. Jeden z * · · · 4 4 4· 4 *» ·· 4
4··· 4 · * ···*
4 ····« « « fc přístupů je vytvářet deleční mutanty,
4·· 44 ···* ·· 4444 *4 444 ·4 *·· kde molekuly nukleové kyseliny mají progresivní delece na 5- nebo
3-konci kódujícího úseku DNA, což vede k syntéze proteinů odpovídajícím způsobem zkrácených.
Dalším přístupem je specificky vytvářet enzymy lokalizované v různých kompartmentech díky připojení různých signálních sekvencí.
Aby bylo dosaženo lokalizace proteinů podle vynálezu v cytosolu, není třeba k sekvenci id. č. 2 přidávat žádnou signální sekvenci.
Na druhé straně mohou být vneseny bodové mutace do takových pozic, kde modifikace aminokyselinové sekvence ovlivní např. enzymatickou aktivitu nebo regulaci enzymu.
Tímto způsobem lze připravit např. mutanty s modifikovanou Km hodnotou, nebo mutanty, které již nepodléhají allosterické regulaci nebo kovalentní modifikaci, které se obvykle v buňce vyskytuj í.
Kromě toho se mohou vytvořit mutanty s modifikovanou substrátovou nebo produktovou specificitou. Navíc se mohou vytvořit i mutanty s modifikovaným profilem aktivita-teplota.
Pro genetické manipulace v prokaryotických buňkách se molekuly nukleových kyselin podle vynálezu nebo jejich fragmenty integrují do plazmidů, které umožňují mutagenezi nebo modifikaci sekvence rekombinací DNA sekvencí. Pomocí v oboru známých metod (viz např. Sambrook a kol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (1989)
Cold Spring
Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY) lze provést záměnu baží nebo lze přidat přírodní nebo syntetickou sekvenci. Aby bylo možné připoj it
DNA fragmenty, k fragmentům se mohou připojit adaptéry nebo linkery. Navíc lze využít manipulací, které nabízejí různá restrikční místa nebo kterými lze odstranit nadbytečnou DNA nebo restrikční místa.
»·
Φ · · · «
• « ' - » • < · · ♦ «f « < ♦ ♦ ·« • · · ·· • * · · · · 8
Kdekoliv mohou být užitečné inzerce, delece nebo substituce, je možné užít metody mutageneze in vitro, „opravy primeru, restrikce nebo ligace. Pro analýzu se obvykle užívá sekvencování, analýza restrikčních fragmentů a další biochemické a molekulárně biologické metody.
Dále se vynález týká vektorů, které obsahují molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu. Výhodně jsou tyto vektory plazmidy, kozmidy, viry, bakteriofágy a další vektory, které jsou v oboru známy.
Výhodně jsou molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu operativně spojeny ve vektoru podle vynálezu s regulačními elementy, které dovolují transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách. Tak např. vektory podle vynálezu obsahují následující elementy:
1. Promotor, který zaručuje transkripci „downstream ležícího kódujícího úseku v buňce hostitelského organismu, a případně také zesilovací elementy.
2. Kódující úsek fúzovaný s promotorem, který obsahuje alespoň jeden otevřený čtecí rámec pro translaci polypeptidu. V předkládaném vynálezu je kódujícím úsekem molekula nukleové kyseliny podle vynálezu.
3. Případně další sekvence fúzované s kódujícím úsekem, např. signál pro terminaci transkripce, pokud jsou vyžadovány pro úspěšnou genovou expresi v určitém hostitelském organismu, nebo signální sekvence ovlivňuj ící subcelulární lokalizaci genového produktu nebo indukující sekreci proteinu.
Takové vektory mohou obsahovat ještě další geny jako jsou např. markerové geny umožňující selekci vektoru ve vhodné hostitelské buňce ve vhodných podmínkách. Exprese • · · · • · · · • · *
A · • 9 » i » molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu • ·· « ·· · · • ·· • ·* • «4 · · zahrnuj e transkripci nukleové kyseliny do translatovatelné RNA.
Regulační prvky umožňující expresi v prokaryotické buňce a v eukaryotické buňce jsou odborníkům známy. K možným regulačním elementům vhodným pro expresi molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu v prokaryotické hostitelské buňce patří např.
promotory PL, lac, trp nebo tac
E. coli.
Zvláště výhodné je užití promotoru lacZ, který je
E. coli indukovatelný IPTG.
Příklady regulačních elementů vhodných pro expresi v eukaryotické buňce jsou promotory A0X1 a GAL1 v kvasinkách, a promotory
CMV, SV40 a RSV, a zesilovače (enhancery) CMV,
SV4 0 nebo globinověho intronu v savčích nebo jiných živočišných buňkách. Pro expresi v kvasinkách je zvláště výhodné užití promotoru genu alkoholdehydrogenázy ze
Saccharomyces cerevisiae, který je v kvasinkách vysoce aktivní. Další vhodné systémy lze najít popsané ve stavu techniky, např.
v Sambrook, Molecular Cloning, A
Laboratory
Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Ν.Y., a v
Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology (1989), Green
Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.
Regulační elementy pro expresi molekul nukleové kyseliny podle vynálezu v rostlinné buňce jsou v principu jakýkoliv promotor, enhancer, terminátor apod., které j sou aktivní v rostlinné buňce. Promotor může být vybrán např.
tak, že dochází ke konstitutivní expresi nebo k expresi některých pletivech, nebo jen v určitém momentě vývoje j en v rostlině nebo jen v určitém okamžiku determinovaném vnějšími faktory. Vzhledem k dané rostlině může být promotor buďto homologní nebo heterologní.
K vhodným promotorům patří např. 35S
RNA promotor z
US 5,352,605) a f ♦ ubiquitinový promotor (viz patent US 5,614,399) pro konstitutivní expresi, promotor patatinového genu B33 (RochaSosa, EMBO J. 8 (1989) , 23-29) pro expresi specifickou pro hlízy bramboru, nebo promotor, který zajišťuje expresi jen ve fotosynteticky aktivním pletivu, např. promotor ST-LS1 (Stockhaus, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947;
Stockhaus, EMBO J. 8 (1989) , 2445-2451) , promotor Ca/b např. patenty US 5,656,496,
US 5,639,952,
Bansal, Proč.
Nati.
Acad. Sci.
promotor genu malé podj ednotky
Rubisco SSU (viz napr.
US 5,034,322,
US aktivovány podmínkách
Avšak mohou se užít i promotory, které j sou jen (viz zejména zajímavé v určitém např. WO promotory čase v závislosti na vnějších
93/07279).
V tomto směru j sou proteinů tepelného šoku. Také se mohou užít promotory specifické pro semena, jako např.
promotor USP z
Vida faba, které umožňují specifickou expresi v semenech Vicia faba i jiných rostlin (Fiedler, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Báumlein, Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467) . Kromě toho mohou být užity promotory specifické pro plody, jak byly např. popsány v mezinárodní patentové přihlášce WO 91/01373. Pro expresi v dozrávajících plodech rajčete jsou např. vhodné cis-regulační elementy polygalakturonázového promotoru, které jsou aktivní ve vnějším nebo vnitřním perikarpu (Nicholass a kol., Plant
Mol. Biol. 28 (1995), 423-435; Montgomery a kol., Plant Cell
5 (1993) , 1049-1062) . Další promotor specifický pro plody u
rajčete popsali Van Haaren a kol. (Plant Mol . Biol. 21
(1993) , 625-640) .
Kromě toho se mohou užít promotory pro expresi
specifickou v endospermu, j ako j e např. promotor
glutelinového genu (Leisy, Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41• 4
50; Zheng, Plant J. 4 (1993), 357-366), promotor HMG pšenice, promotor USP. promotor fazeolinového genu nebo promotory zeinových genů z kukuřice (Pedersen, Cell 29 (1982), 1015-1026; Quattrocchio, Plant Mol. Biol. 15 (1990), 81-93) nebo promotor genu „shrunken-1 (sh-1) kukuřice (Werr, EMBO J. 4 (1985), 1373-1380).
Exprese molekul nukleové kyseliny podle zvláště výhodná v takových částech rostliny, vynálezu je které mají zvýšený obsah sacharózy. Takovými orgány j sou např.
kořen cukrové řepy nebo stéblo cukrové třtiny nebo čiroku cukrového. Zvláště výhodné jsou proto promotory řídící expresi právě v těchto orgánech, jako je např. patatinový promotor B33 v Solárium tuberosum. Pro specifickou expresi ve stonku cukrové třtiny může být použit ubiquitinový promotor v kombinaci s prvním intronem.
Vektory podle vynálezu mohou obsahovat další funkční jednotky, kterě ovlivňují stabilitu vektoru v hostitelském organismu, jako je např. bakteriální replikační počátek nebo tzv. 2-mikron-DNA pro stabilizaci a autonomní replikaci v kvasinkách. Také mohou být přítomny sekvence „pravé hranice a „levé hranice z T-DNA z Agrobacterium, které dovolují stabilní integraci do genomu rostlin. Také mohou být přítomny terminační sekvence, které slouží ke správné terminaci transkripce nebo připojení poly-A konce k transkriptu, která má stabilizující funkci pro transkript. takové elementy jsou dostatečně popsány v odborné literatuře (např. Gielen, EMBO J. 8 (1989), 23-29) a jsou volně vyměnitelné.
Ve výhodném provedení molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu obsahuje úsek, který obsahuje funkční signální sekvenci pro sekreci kódovaného enzymu. Takové sekvence jsou známy. Příkladem signálního •i « · · · · · • · » ♦ · * ·· · · · · · · * » · » · peptidu, který dovoluje lokalizaci proteinu ve vakuole, je signální peptid karboxypeptidázy Y z kvasinky (CPY). Odpovídající gen byl popsán např. v Valls a kol. (Cell 48, 887-899) . Rostlinné signální sekvence jsou např. signální sekvence z genu lektinu ječmene (Raikhel and Lerner, Dev. Genet. 12 (1991), 255-269) nebo sekvence 43 aminokyselin z N-koncového úseku fytohemaglutininu z fazolu (Tague a kol., Plant Cell 2 (1990), 533-546). Příkladem C-koncového signálního peptidu je signální peptid chitinázy (Neuhaus a kol., Plant J. 5 (1994), 45-54).
Výhodná signální sekvence je např. signální sekvence genu proteinázového inhibitoru II z bramboru. Avšak je možné vybrat jakoukoliv signální sekvence, která vede k sekreci daného polypeptidu ve vybraném hostiteli. Secernovaná fruktosyltransferáza se pak získává z kultivačního média a užívá se pro syntézy in vitro.
Ve zvláště výhodném provedení molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu obsahuje úsek, který obsahuje funkční signální sekvenci pro lokalizaci ve vakuole rostlinné buňky, výhodně jde o signální sekvenci patatinového genu z bramboru (Sonnewald, Plant. J. 1 (1998),
95-106). To umožňuje subcelulární lokalizaci fruktosyltransferázy ve vakuole geneticky modifikovaných rostlinných buněk a rostlin, např. cukrové řepy a bramboru, a tudíž akumulaci vysokomolekulární polyfruktózy inulínového typu ve vakuole. Další signální sekvence pro lokalizaci ve vakuole byly popsány např. v publikacích Matusoaka (Journal of Experimental Botany 50 (1999), 165-174), Chrispeels (Cell (1992), 613-616), Matsuoka (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88 (1991), 834-838), Bednarek (Plant Cell 3 (1991), 1195-1206) a Nakamura (Plant Phys. 101 (1993), 1-5).
• ·
V jiném provedení předkládaného vynálezu molekula nukleové kyseliny obsažená ve vektoru podle vynálezu obsahuje úsek, který kóduje signální sekvenci pro lokalizaci v plastidu rostlinné buňky. Jako taková signální sekvence může být užita sekvence ferrodoxin: NADP(+)-oxidoreduktázy (FNR) ze špenátu. Tato sekvence obsahuje 5''netranslatované úseky a také sousední sekvenci tranzitního peptidu sekvence cDNA plastidového proteinu NADP(+)-oxidoreduktázy (FNR) ze špenátu (nukleotidy -171 to +165; Jansen,
Current Genetics 13 (1988),
517-522). Jako signální sekvence se také může užít transitní peptid voskovitého proteinu z kukuřice plus prvních 34 aminokyselin ze zralého voskového proteinu (Klósgen, Mol.
Gen. Genet.
217 (1989), 155-161). Ve výhodném provedení vynálezu je užit transitní peptid voskového proteinu z kukuřice bez prvních 34 aminokyselin zralého proteinu.
Ve zvláště výhodném provedení se vynález týká plazmidů pSK-asl, pll2-asl, pA7-asl, p35-asl, p35-s3-asi, j ej ichž konstrukce je popsána v příkladech (viz obr. 1 až
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu expresní vektory podle vynálezu dovolují produkci polyfruktóz inulínového typu v různých hostitelských organismech, zejména v rostlinách, bakteriích a houbách. Kódované enzymy se mohou užít i mimo hostitelský organismus k produkci polyfruktóz inulínového typu. To znamená, že je zejména možné použít molekuly nukleových kyselin podle vynálezu k přípravě proteinů jimi kódovaných v jakémkoliv hostiteli, aby se z hostitelských buněk získal protein a/nebo kultivační médium, které se pak užijí pro in vitro syntézu inulínu.
Tak např. konstrukt, který obsahuje promotor alkoholdehydrogenázy a molekulu nukleové kyseliny podle vynálezu se užije pro transformaci Saccharomyces cerevisiae.
• ·
Jelikož kvasinky nejsou schopny přijímat sacharózu, užijí se buňky, které exprimují přenašeč sacharózy díky vnesené heterologní sekvenci DNA. Příprava takových buněk byla popsána např. v publikaci Riesmeier a kol. (EMBO J. 11 (1992), 4705-4713). Kvasinky transformované výše popsaným konstruktem vytvářejí polyfruktózy s dlouhým řetězcem inulínového typu.. Jelikož fruktosyltransferáza z Aspergillus sydowi neobsahuje signální peptid, není secernována. Polyfruktózy s dlouhým řetězcem se tudíž tvoří uvnitř kvasinkové buňky. Tyto kvasinky obsahující polyfruktózy mohou být užity přímo jako přísada do krmivá. Pokud mají být polyfruktózy získávány z kultivačního média, musí se molekula nukleové kyseliny podle vynálezu fúzovat se signální sekvencí, aby došlo k sekreci.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká hostitelských buněk přechodně nebo trvale obsahujících molekuly nebo vektory podle vynálezu nebo z nich odvozených buněk. Termín hostitelské buňky se týká organismu, který je schopen in vitro přijmout rekombinantní DNA a případně syntetizovat proteiny kódované molekulami nukleové kyseliny podle vynálezu. Hostitelské buňky jsou prokaryotického nebo eukaryotického původu. Termín prokaryotický zahrnuje všechny baktérie, které mohou být transformovány nebo transfekovány molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu a výhodně umožňují expresi proteinu s fruktosyltransferázovou aktivitou. K prokaryotickým hostitelským buňkám patří jak gram-negativní tak i gram-pozitivní baktérie jako např.
E. coli,
S. typhimurium,
Serratia marcescens a Bacillus subtilis. Termín eukaryotický zahrnuje buňky hmyzu, hub, rostlin, zvířat nebo lidí. Výhodné jsou buňky z hub, např.
takové, které se mohou užít pro fermentaci jako např.
Saccharomyces, zvláště výhodně buňky S. cerevisiae, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Pichia apod. Výhodně jsou houbové buňky z hub rodu Aspergillus a zvláště výhodně z druhu Aspergillus niger. Zvláště zajímavá je exprese fruktosyltransferázy podle vynálezu v těchto buňkách v kombinaci se sekretorickou signální sekvencí, např. signální sekvencí patatinového genu nebo genu 1-SST z Aspergillus foetidus (Rehm a kol., J. Bac. 180 (1998), 13051319), která umožňuje sekreci fruktosyltransferázy do média. Výhodně se užijí buňky, které mají sníženou nebo nemají žádnou aktivitu secernovanou invertázovou aktivitu. K druhům hub, které nemají vlastní inverertázovou aktivitu, patří např. Trichoderma reesei. Protokol pro expresi β-fruktofuranosidázy (invertázy z A. niger) byl popsán např. v Bergés a kol. (Curr. Genet. 24 (1993) , 53-59) .
Molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu, které kódují protein s fruktosyltransferázovou aktivitou, nebo odpovídající vektor, mohou být vneseny transfekcí nebo transformací do hostitelských buněk, a sice metodami, které jsou odborníkům známy. Postupy, jak připravit fúzní, operativně spojené geny a exprimovat je ve vhodných hostitelských buňkách jsou odborníkům známy a byly popsány např. v publikacích Sambrook a kol. nebo Ausubel a kol. (viz výše) . Výhodné hostitelské buňky jsou buňky E. coli, hub, zejména kvasinek, a také rostlinné buňky.
Buňky podle vynálezu jsou výhodně charakterizovány tím, že vnesená nukleová kyselina je heterologní vzhledem k transformované buňce, tzn. že se přirozeně v této buňce nevyskytuje, nebo že je lokalizována v lokusu genomu odlišném od lokusu odpovídající přirozeně se vyskytující sekvence.
Když je molekula nukleové kyseliny podle vynálezu ·· ·· · · ···« · · ···« «·» · · · • · · ····· ·· • · · ·» · · · • · ···· · · ··· ·» * exprimována v rostlině, obecně je možné, aby syntetizovaný protein byl přítomen v kterémkoliv kompartmentu rostlinné buňky. Aby bylo dosaženo lokalizace ve specifickém kompartmentu, molekula nukleové kyseliny podle vynálezu se spojí s DNA sekvencí, která zajistí lokalizaci do požadovaného kompartmentu, jak již bylo popsáno výše. Takové sekvence jsou odborníkům známy (viz např. Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; RochaSosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29).
K hostitelům podle vynálezu tedy patří buňky transgenních rostlin, rostlinná pletiva a celé rostliny, které jsou transformované jednou nebo několika nukleovými kyselinami podle vynálezu, a také transgenní rostlinné buňky, které pocházejí z takto transformovaných buněk. Tyto buňky obsahují jednu nebo několik molekul nukleové kyseliny podle vynálezu, které jsou výhodně spojeny s DNA regulačními elementy, které umožňují transkripci v rostlinné buňce, zejména promotory. takové buňky mohou být odlišeny od přirozeně se vyskytujících rostlinných buněk tím, že obsahují alespoň jednu nukleovou kyselinu podle vynálezu, která se přirozeně nevyskytuje v takové buňce, nebo se liší tím, že taková molekula je lokalizována v lokusu genomu buňky, kde v přirozeném stavu lokalizována není, tj. je v jiném genomickém prostředí.
Ještě v jiném provedení vynálezu se předkládaný vynález týká rostlinných buněk obsahujících v cytosolu protein podle vynálezu. Pro toto provedení vynálezu se užije sekvence uvedená zde jako sekvence id. č. 2 bez dalších signálních sekvencí.
V jiném výhodném provedení se předkládaný vynález týká • · · · • >
rostlinných buněk obsahujících protein podle vynálezu v plastidech. Tiby byl protein podle vynálezu nasměrován do plastidu, molekula nukleové kyseliny nebo vektor podle vynálezu se modifikují výše popsaným způsobem.
Jelikož vakuola je obvykle schopna skladovat velká množství sacharózy, která slouží proteinu podle vynálezu jako substrát, tento kompartment je perfektně vhodný k tomu, aby byly vytvořeny rostlinné buňky, které díky aktivitě proteinu podle vynálezu tvoří polyfruktózu ve vakuole.
Ve zvláště výhodném provedení se předkládaný vynález týká rostlinných buněk obsahujících ve vakuole protein podle vynálezu. Bylo již vysvětleno výše, jak je třeba konstruovat molekuly nukleové kyseliny a vektory podle vynálezu, aby bylo dosaženo lokalizace proteinu podle vynálezu ve vakuole.
Transgenní rostlinné buňky a rostlinná pletiva se mohou regenerovat na celé, úplné rostliny metodami, které jsou odborníkům známy. Rostliny získané regenerací transgenních rostlinných buněk podle vynálezu jsou také předmětem předkládaného vynálezu. Dalším předmětem vynálezu jsou rostliny obsahující výše popsané transgenní rostlinné buňky. Rostliny podle vynálezu jsou obecně jakékoliv rostliny, výhodně jednoděložné nebo dvouděložné rostliny. Výhodně rostlinné buňky pocházejí z hospodářsky významných rostlin, tj. rostlin, které člověk pěstuje protože poskytují potraviny nebo jako technické, zejména průmyslové využití. Výhodně se vynález týká rostlin produkuj ící vlákna (např. len, konopí, bavlník), olejnin (např.
řepka, slunečnice, akumulujících cukry (např.
cukrová řepa, cukrová třtina, cukrový čirok, banány) a akumulujících proteiny (např.
luštěniny).
V jiném výhodném provedení se vynález týká pícnin • * · « · · • · · · • · · (např. krmných nebo pícních trav, vojtěšky, jetele a pod.), zeleniny (např. melouny, rajče, banány, čekanka, pór, chřest, karotka) nebo rostlin akumulujících škrob (pšenice, j ečmen, oves, žito, brambory, kukuřice, rýže, hrách, maniok, fazole mungo).
V dalším provedení vynálezu se vynález týká rostlinných buněk z rostlin obsahujících sacharózu (např. cukrová řepa, brambory, rýže, pšenice, cukrová třtina apod.). zejména výhodné jsou cukrová řepa, čekanka, rýže, kukuřice, brambory, cukrová třtina a pšenice. Vynález se také týká rozmnožovacího materiálu a sklizňových produktů z rostlin podle vynálezu, např. plodů, semen, hlíz, kořenových řízků, semenáčků, řízků, kalusů, buněčných kultur a pod.
Předkládaný vynález se také týká způsob přípravy transgenních rostlin, kdy
a) rostlinná buňka se geneticky modifikuje vnesením molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu a/nebo vektoru podle vynálezu,
b) z buňky se regeneruje rostlina, a případně
Termín geneticky modifikovaná podle předkládaného vynálezu znamená, že rostlinná buňka je modifikovaná ve své genetické informaci tím, že do ní byla vnesena molekula nukleové kyseliny podle vynálezu a že nukleové kyseliny podle vynálezu vede k fenotypové přítomnost nebo exprese modifikaci.
Fenotypová modifikace výhodně detekovatelnou modifikaci jedné nebo více znamená funkcí buňky. Tak např. geneticky modifikované rostliny podle vynálezu vykazují aktivitu proteinu podle vynálezu nebo zvýšenou fruktosyltransferázovou aktivitu.
Rostliny se mohou regenerovat podle kroku b) metodami, • * • · které jsou odborníkům dobře známy. Vytváření dalších rostlin v kroku c) podle vynálezu se provádí např. vegetativním rozmnožováním (např. regenerací úplných rostlin pomocí řízků, hlíz nebo kalusových kultur) nebo generativním rozmnožováním.
Generativní rozmnožování se výhodně tj . kříží se a rozmnožují se provádí řízeným způsobem, vybrané rostliny mající požadované specifické vlastnosti.
Předkládaný vynález se týká také rostlin získatelných způsobem podle vynálezu.
Předkládaný vynález se dále týká rostlinného rozmnožovacího materiálu také transgenních rostlin připravených způsobem podle vynálezu.
Termín rozmnožovací materiál podle vynálezu zahrnuje ty části rostliny, které jsou vhodné k přípravě následných generací buďto vegetativní nebo generativní cestou. Pro vegetativní rozmnožování jsou to např. plody, semena, semenáčky, protoplastové nebo buněčné kultury. Výhodným rozmnožovacím materiálem jsou hlízy a semena.
jiném provedení se vynález týká skliditelných částí rostlin kořeny, podle vynálezu, jako jsou např. poldy, listy, zásobní kořeny, květy, pupeny, výhonky nebo stonky, a výhodně semena nebo hlízy.
V dalším výhodném provedení se předkládaný vynález týká krmivá pro zvířata a/nebo potravin pro člověka, které obsahují skliditelné části rostlin podle vynálezu, výhodně semena nebo hlízy.
Výhodně rostlinné části podle vynálezu po konzumaci ma j í výhodu, že vykazují příznivý účinek na zdraví člověka nebo zvířete ve srovnání s odpovídajícími částmi rostlin, které nebyly geneticky modifikovány podle vynálezu.
To samé platí pro potraviny nebo krmivá podle vynálezu.
Konzumace • · « · · Φ · · 1 • ♦ · · ···· potravin podle vynálezu vede u člověka např. ke zlepšení složení intestinální flóry, zejména ke zvýšení obsahu bifidobaktérií ve střevu, což má pozitivní účinek na lidské zdraví (Izzo, Trends in Food Science & Technology 9 (1998), 255-257) . Tyto pozitivní účinky jsou výhodně profylaktické účinky nebo účinky podporující využití živin.
Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou způsoby přípravy hostitelských buněk, kdy jsou vhodné hostitelské buňky transformovány molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu nebo vektorem podle vynálezu. Způsoby transformace různých hostitelských buněk jsou odborníkům známy.
V dalším provedení se předkládaný vynález týká způsobů produkce fruktosyltransferázy, kdy se hostitel podle vynálezu kultivuje ve vhodných podmínkách pro expresi molekul nukleové kyseliny podle vynálezu a z kultury se pak izoluje fruktosyltransferáza, např. z buněk a/nebo případně kultivačního média. Ve výše zmíněných způsobech podle vynálezu se transformované nebo transfekované hostitelské buňky kultivují např. ve fermentoru, dokud není dosaženo optimální hustoty. Případně je, v případě indukovatelného promotoru, exprese proteinu kódovaného molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu indukována pouze na konci fermentační fáze. Protein exprimovaný tímto způsobem může být purifikován z média, buněčných lyzátů nebo frakce buněčných membrán známými metodami. Proteiny, které byly takto exprimovány, např. v mikroorganismech, se izolují a purifikují preparativní chromatografií nebo imunologickými purifikačními metodami, např. užitím monoklonálních nebo polyklonálních protilátek, které rozpoznávají protein kódovaný nukleovou kyselinou podle vynálezu. V této souvislosti je třeba zmínit, že protein s fruktosyltransferázovou aktivitou, který je • · · · · · • · ♦ · * · • · · * · • · · · · · • · » · · • · kódován molekulou obsahovat další nukleové kyseliny podle vynálezu, může funkční aminokyselinové sekvence, např.
proteinové značky (GST, GFP,
Flag, HA peptide,
His-tag) pocházející z heterologních proteinů nebo synteticky připravené.
Předkládaný vynález se dále týká proteinů, které mají fruktosyltransferázovou aktivitu, tj .
fruktosyltransferůz kódovaných molekulou nukleové kyseliny podle vynálezu nebo získatelných způsoby podle vynálezu.
Fruktosyltransferázy podle vynálezu se výhodně užíváj í k výrobě polyfruktóz inulínového typu.
Mohou se užít také pro přípravu protilátek, které jsou vhodné k detekci a/nebo purifikaci fruktosyltransferáz.
Dalším předmětem vynálezu jsou molekuly nukleové kyseliny, které specificky hybridizují s molekulami nukleových kyselin podle vynálezu nebo jejich fragmenty.
Tyto molekuly jsou výhodně oligonukleotidy dlouhé alespoň
10, výhodně 15 a zvláště výhodně alespoň 50 nukleotidů.
Tyto oligonukleotidy podle vynálezu se mohou užít naoř.
j ako primery pro
PCR (polymerázovou řetězovou j ako hybridizační sondy.
Ještě dalším předmětem předkládaného vynálezu způsoby výroby polyfruktóz, zvláště polyfruktóz j sou inullnového typu, kdy hostitelské buňky podle vynálezu, nebo hostitelské organismy, které je obsahují, jsou kultivovány v podmínkách, které umožňují expresi fruktosyltransferázy podle vynálezu a také syntézu polyfruktózy.
Užitím molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu je umožněno produkovat, a sice metodami genové technologie, polyfruktózy, zejména polyfruktózy inulínového typu, v takových organismech, ve kterých to dosud při použití • · • · • « · · ··.*«· ·· ···* - » • · · · · » · · · · · · · · · · “ ‘ konvenčních metod nebylo možné. Takže je možné exprimovat molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu v hostiteli jako jsou např. baktérie, houby nebo rostlinné buňky, aby se zvýšila aktivita odpovídající fruktosyltransferázy nebo aby se fruktosyltransferáza vnesla do buněk, kde normálně tento enzym není exprimován. Díky expresi nebo dodatečné expresi alespoň jedné molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu hostitelská buňka podle vynálezu syntetizuje polyfruktózu, zejména polyfruktózu inulínového typu. Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou proto polyfruktózy, zejména inulínového typu, získatelné z hostitelských buněk podle vynálezu nebo získatelné z rozmnožovacího materiálu a nebo v případě rostlin, získatelné z rostlin nebo skliditelných rostlinných produktů.
Předkládaný vynález se tudíž zejména týká způsobu výroby polyfruktóz, zvláště polyfruktóz inulínového typu, který obsahuje kroky, kdy:
a) kultivují hostitelské buňky podle vynálezu, nebo hostitel obsahující tyto buňky, v podmínkách, které dovolují produkci fruktosyltransferáz a reakci se sacharózou, případně dodanou z vnějšího prostředí buňky, nebo substrátem ekvivalentním polyfruktózám inulínového typu, a
b) polyfruktózy takto produkovaná se získají z kultivovaných hostitelských buněk, hostitelských organismů nebo z média.
Hostitelské buňky jsou výhodně rostlinné buňky a hostitelem jsou výhodně rostliny. Způsob získání polyfruktóz, zejména inulínového typu, z rostlin byl popsán např. v publikaci Vogel (in: Inulin and Inulin-containing Crops, • a • · · ·
Elsevier Science Publishers B.V. Amsterdam, A. Fuchs (Ed.) (1993) , 65-75) .
Dalším předmětem předkládaného vynálezu je in vitro způsob produkce polyfruktóz, zejména inulínového typu, který obsahuje kroky, kdy:
a) sacharóza nebo ekvivalentní substrát se přivede do kontaktu s fruktosyltransferázou podle vynálezu v podmínkách, které dovolují konverzi na polyfruktózu,
b) polyfruktóza takto připravená se získá.
Substrát ekvivalentní sacharóze je např. substrát, který je konvertován na sacharózu hostitelskou buňkou nebo jedním nebo více dalšími enzymy. K substrátům ekvivalentním sacharóze patří např. také di- nebo oligosacharidy, které alternativně mohou být užity jako substráty pro fruktosyltransferázu podle vynálezu. Příkladem takových cukrů je např. trisacharid rafinóza. Ale lze užít i derivatizovanou sacharózu. Výhodně inulín získaný výše popsaným způsobem je inulín s dlouhým řetězcem a výhodně má stupeň polymerizace DP > 20, výhodně DP > 50, zejména DP > 100, a zvláště výhodný stupeň polymerizace je DP > 200.
Předkládaný vynález se dále týká způsobů výroby polyfruktóz, zvláště inulínového typu, obsahujících krok, kdy se polyfruktóza extrahuje z jedné výše popsaný rostlin/rostlinných buněk podle vynálezu nebo z části rostlin podle vynálezu. Výhodně tyto způsoby obsahují krok sklizení pěstovaných rostlin a/nebo jejich částí před tím, než se provede extrakce polyfruktóz a zvláště výhodně krok pěstování těchto rostlin podle vynálezu před tím, než se sklidí. Vlastní způsoby extrakce polyfruktóz z rostlin nebo částí rostlin jsou odborníkům známy a byly popsány v odborné literatuře (Gibson, International Sugar Journal 96 (1994), • · • · · • · · · * · · 4* • « · » ► · · * • · ·♦·»· ~ · · 4 4 4» • · ···· 4 4···
381-387), Vogel, Stud. Plant Sci. 3 (1993), Inulin and Inulin-Containing Crops, 65-75).
Předkládaný vynález se také týká polyfruktóz, zejména polyfruktóz inulínového typu, které jsou získatelné z hostitelských buněk podle vynálezu způsobem podle vynálezu, jak byly popsány výše. Polyfruktózy se výhodně užívají k výrobě surfaktantů, pro zvýšení viskozity vodných systémů, jak detergenty, suspenzní činidla, pro urychlení sedimentace a vytváření komplexů, nebo aby vázaly vodu.
Hostitelské buňky podle vynálezu, které syntetizují polyfruktózu, zvláště polyfruktózu inulínového typu, se mohou užít jako potravinové nebo krmivové doplňky. Takové užití je výhodné, neboť, fruktany mají pozitivní účinek na zdraví (Roberfroid a kol., J. of Nutrition 128 (1998), 11
19; Kleesen a kol., Am. J. Clin. Nutr. 65 (1997), 1397-1402).
Předkládaný vynález se dále týká způsobu produkce polyfruktózy, zvláště inulínového typu, kdy se pro produkci polyfruktózy užije fruktosyltransferáza z houby nebo hostitelský organismus exprimující fruktosyltransferázu z houby. Výhodně se užije fruktosyltransferáza podle vynálezu nebo hostitelské buňky podle vynálezu. Předkládaný vynález poprvé ukázal, že je možné užít fruktosyltransferázu z houby k produkci polyfruktózy inulínového typu.
Nakonec se předkládaný vynález týká i použití fruktosyltransferázy z houby pro výrobu polyfruktózu, zejména polyfruktózu inulínového typu.
Odborníkovi je zřejmé, že tato a ještě další provedení vynálezu jsou zde popsána a jsou zahrnuta do popisu a příkladů předkládaného vynálezu. Další odborná literatura týkající se použitých metod a médií pro použití podle vynálezu může být nalezena ve stavu techniky ve veřejných knihovnách a např. na elektronických médiích. Pro tento účel lze využít např. veřejně přístupné databáze jako je např. Medline, která je přístupná prostřednictvím internetu např. na adrese: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Další databáze a adresy jsou odborníkům známy a lze je najít na internetu např. na adrese: http://www.lycos.com. Přehled informačních zdrojů týkajících se biotechnologických patentů nebo patentových přihlášek uvádí Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.
Přehled výkresů
Obr. 1 ukazuje konstrukci baktérií. vektoru pSK-asl pro transformaci
Obr. 2 ukazuje konstrukci vektoru pll2-asl pro transformaci
kvasinkových buněk.
Obr. 3 ukazuje konstrukci vektoru pA7-asl pro transformaci
rostlinných buněk.
Obr. 4 ukazuje konstrukci plazmidu p35-asi pro transformaci
rostlin.
Obr. 5 ukazuje konstrukci plazmidu p35-s3-asl pro transformaci rostlin.
Obr. 6 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě E. coli transformované pSK-asl. Dráha 1 je kontrolní pokus a vektorem bez inzertu pBluescript SK. Dráha 2 ukazuje experiment • · · * • · · • · · ♦ • · · .
·· · · · · ·« ··* « - s plazmidem pásl, kde kódující úsek asi není ve shodném čtecím rámci s genem lacZ. V tomto případě nedochází k translaci kódujícího úseku asi ve formě fúze s β-glukuronidázou, ale probíhá se sníženou účinností z endogenního startovacího kodonu. Dráhy 3 až 6 ukazují experimenty s různými transformanty konstruktu pSK-asl. Po nárůstu baktérií do ODS00 0,4 byly kultury indukovány 100 mM IPTG. Po dvouhodinové indukci byly buňky sklizeny a lyžovány v 50 mM fosforečnanu sodném s pH 6,0. Proteinové extrakty pak byly inkubovány 12 hodin s 6 00mM sacharózou ve 3 7 °C. Jako standardy pro chromatografii na tenké vrstvě byly v drahách 7 až 9 užity 1-kestóza (7), sacharóza (8) a fruktóza (9).
Obr. 7 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě transformovaných kvasinkových buněk obsahujících plazmid pll2-asl (dráha 2) nebo pll2-aslL (dráha 3). Vektor pll2-aslL obsahuje 5'-vedoucí sekvenci přenašeče (transportéru) sacharózy ze špenátu. Dráha 1 ukazuje kontrolní experiment s netransformovanými kvasinkami. fruktosyltransferázová aktivita byla detekována v proteinových extraktech z kvasinkových buněk. Jako standard byly užity fruktóza (dráha 4), směs 1-kestózy, nystózy a fruktosyl-nystózy (dráha 5) a sacharóza (dráha 6).
Obr. 8 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě rostlinných buněk obsahujících plazmid pA7-asl. Dráha 1 ukazuje transformaci vektorem bez inzertu pA7 (50 μg) ; dráhy až 5 ukazují transformaci vektorem pA7-asl (dráha 2: 10 μρ; dráha 3: 20 μρ; dráhy 4 a 5: 50 μg) . Jako standard byly užity směs 1-kestózy, nystózy a fruktosyl-nystózy (dráha 6) , sacharóza (dráha 7) a fruktóza (dráha 8) . V každém experimentu bylo užito 500,000 protoplastů. Protoplasty byly po transformaci inkubovány dva dny při 25 °C , pak byly proteinové extrakty získány v 50 mM fosforečnanu sodném s pH 6,0. a proteinové extrakty pak byly inkubovány 20 hodin s 5 0 0mM sacharózou ve 2 8 °C. Byly naneseny 4 μΐ při ředění 1/10.
Obr. 9 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě rostlin transformovaných konstruktem 35-asl. Náhodným způsobem bylo vybráno 12 rostlin. 20 mg listové hmoty bylo extrahováno ve 200 μΐ vody, pak byly naneseny 4 μΐ extraktu. Jako standard byly užity fruktóza (dráha F), sacharóza (dráha S) a směs 1kestózy, nystózy a fruktosyl-nystózy (dráha St).
Obr. 10 ukazuje analýzu chromatografií na tenké vrstvě rostlin transformovaných konstruktem 35-S3asl. Náhodným způsobem bylo vybráno 12 rostlin. 20 mg listové hmoty bylo extrahováno ve 200 μΐ vody, pak byly naneseny 4 μΐ extraktu. Jako standard byly užity fruktóza (dráha F) , sacharóza (dráha S) a směs 1-kestózy, nystózy a fruktosyl-nystózy (dráha St).
Obr. 11 ukazuje eluáty 400 až 0 mM síranem amonným z kolony s fenylsuperose, na kterou byl nanesen proteinový extrakt z Aspergillus sydowi obohacené fruktosyltransferázou (dráha E). V drahách označených M je markér velikostí. Molekulární hmotnosti markerových proteinů jsou ukázány vpravo v kDa.
Předkládaný vynález je ilustrován následujícími • Λ
« příklady.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Purifikace afl-SST z Aspergillus sydowi
Aspergillus sydowi IAM 2544 byl kultivován na médiu obsahujícím 2% sladový extrakt, 0,5% pepton a 2% sacharózu. Médium bylo zpevněno přidáním 2 % agaru. Spory byly vysety a kultura byla udržována při 25 °C, dokud plotny nebyly úplně suché. Konidie byly sklizeny z ploten a rozpuštěny v 50mM hydrogenfosforečnanu sodném s pH 6,0. Lýze konidií byla provedena trojitým průchodem Francouzskou tlakovou komůrkou. Pro purifikaci byl homogenát adsorbován na Sepharózu Q. navázaný protein byl eluován lineárním gradientem 0 až 1000 mM KC1. Sacharózolytické frakce byly získány mezi 500 a 700 mM KC1. Tyto frakce byly sloučeny a dialyzovány proti hydrogenfosofrečnanu sodnému s pH 6,0. Pro obohacení proteinu se opakovala adsorpce na Sepharose Q (objem lože 2 ml) a eluce do objemu 10 ml. Eluát byl upraven na 2M síran amonný a adsorbován na fenylsuperose. Po propláchnutí 2M síranem amonným byla provedena eluce 100 mM hydrogenfosofrečnanem sodným s pH 7,0 a lineárním gradientem 2M až 0M síranu amonného. Aktivní frakce byly získány v elučním gradientu mezi 400 a 0 mM síranem amonným. Získaná proteinová směs byla analyzována na SDS-PAGE. Výsledky jsou ukázány na obr. 11. Podobné obohacená sacharózolytickou aktivitou bylo popsáno, avšak s mycéliem Aspergillus sydowi,
v publikaci Muramatsu a Nakakuki (Biosci Biotech Biochem 59 (1995), 208-212). Purifikace neposkytla homogenní protein, který by byl vhodný např. pro sekvencování.
Pro identifikaci fruktosyltransferázy byl použit seminativní polyakrylamidový gel, na který byly naneseny vzorky obsahující 10 μg protein z eluátu z fenylsuperosové kolony v 0,1% SDS, 10% glycerolu a 50mM Tris pH 6,8. Po elektroforéze byl gel znovu pufrován třikrát po 10 minutách v 50mM hydrogenfosforečnanu sodném pH 6,0, 1 % Triton X100 a pak inkubován 30 minut v 50mM hydrogenfosforečnanu sodném pH 6,0, 1 % Triton X100 a 500 mM sacharóza. Gel byl pak povařen v 0,1% (hmot./objem) 2,3,5,-trifenyltetrazoliumchlorid (TTC), 0,5 M NaOH. TTC za těchto podmínek vytváří červené formazanové barvivo společně s redukovanými cukry. Označený protein pás na obr. 11 vznikl v důsledku sacharózolytické aktivity proteinu, který byl tímto identifikován jako fruktosyltransferáza z Aspergillus sydowi. Pás byl izolován z preparativního gelu, protein byl z gelu eluován a použit pro sekvencování. Jelikož je protein Nkoncově blokován, byla provedena štěpení endopeptidázami LysC a AspN, peptidy byly purifikovány na HPLC a pak podrobeny sekvencování podle Edmana. Byly získány následující sekvence:
LysC: VLPSTSQASEK (sekvence id. č. 3)
AspN: DDLVTYR (sekvence id. č. 4)
DPYVFQNHEV (sekvence id. č. 5)
Pro klonování genu byla zkonstruována cDNA knihovna ve fágu Lambda Zap II (Stragene, Heidelberg). Jelikož nebylo možné připravit RNA z konidií, byla RNA připravena z mycélia • · • · · · • · * « • · · < · · .
• · · · ·«·· • · · · · • · · « · · ·· ··· postupem podle Logemann a kol. (Anal. Biochem. 163 (1987),
Póly A+-RNA byla získána užitím soupravy polyATract
Systém (Promega, Madison, USA) . Syntéza cDNA a klonování do
Lambda
Zap II byly provedeny postupem podle pokynů výrobce s proteinovou sekvencí byly připraveny následující oligonukleotidové primery:
Primer aspl9down:
5'- GAYGAYYTNGTNACNTAYMG id.
Primer aspl9up:
5'-CKRTANGTNACNARRTCRTC (sekvence id.
7)
Primer asp31-down:
5'-GTNTTYCARAAYCAYGARG (sekvence id.
8)
Primer asp31up:
5'-TGRTTYTGRAANACRTANGG id.
Primer lyslup:
5'-GCYTGNSWNGTNSWNGG (sekvence id.
V PCR reakci s celou cDNA knihovnou jako templátem a kombinací primerů aspl9down/asp31up (teplota pro nasednutí primerů 40 °C) byl získán fragment velikosti 350 bp. Tento fragment byl po radioaktivním označení (Megaprime Kit,
Boehringer Mannheim, Mannheim) použit pro screening cDNA knihovny. Získané klony byly amplifikovány po vystřižení in vivo jako plazmidy pBluescript. cDNA inzerty byly porovnány po restrikčním štěpení a inzerty klonu byly plně sekvencovány. Sekvence cDNA inzertů je uvedena jako sekvence id. č. 1. Odvozená sekvence proteinu je uvedena jako sekvence id. č. 2.
Příklad 2
Příprava konstruktů obsahujících kódující úseky fruktosyltransferázy z hub vhodných pro transformaci různých prokaryotických a eukaryotických hostitelských buněk
Pro transformaci různých hostitelských buněk fruktosyltransferázou z hub byla připravena řada konstruktů metodami, které jsou v oboru molekulární biologie známé (Sambrook a kol., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Konstrukty jsou uvedeny na obr. 1 až 5. Konkrétně byly konstrukty připraveny následujícím způsobem:
pSK-asl je derivát pásl, který byl získán vystřižením in vivo z klonu Lambda Zap II cDNA knihovna Aspergillus sydowi. pásl obsahuje cDNA jakožto fragment EcoRI/Xhol. pSK-asl byl připraven z pásl štěpením BamHl a Smál, doplněním kohezivního konce BamHl a znovuspojením vektoru. Odstraněním 4 nukleotidů z kódujícího úseku asi vedlo k přepojení na čtecí rámec genu lacZ (Obr. 1).
pll2-asl
Do vektoru pll2AlNE (viz
Riesmeier a kol., EMBO J.
(1992), 4705-4713), který byl štěpen BamHl, doplněn a pak štěpen Notl, byl klonován fragment vektoru byla potvrzena štěpením HindlII, které asi z pásl (štěpeného Asp718, doplněného a pak znovu štěpeného Notl) (Obr. 2) .
pA7-asl byl připraven z pA7 klonováním kódujícího úseku z pásl jako fragmentu Smal/Asp718, jehož kohezivní konce byly doplněny, do doplněných míst Asp718 a
Smál ve vektoru. Správná orientace fragmentu ve • « poskytlo fragment velikosti přibližně 1900bp. pA7 je derivát pUC18, který obsahuje mezi místy EcoRI a Asp718 promotor 35S RNA z viru mozaiky květáku (CaMV; 528 bp; nt 6909-7437, Franck a kol., Cell 21 (1980), 285-294), a mezi místy Sphl a HindlII terminátor z genu oktopinsyntázy z Agrobacterium tumefaciens (Gielen a kol., EMBO J. 3 (1984), 835846) (Obr. 3).
p35-asl byl připraven z pBinAR ligací fragmentu asi z pásl (štěpeného Asp718/Notl a pak doplněného) do vektoru, který byl štěpen Smál. pBinAR je derivát pBinl9 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711), který obsahuje mezi místy EcoRI a Asp718 promotor 35S RNA viru mozaiky květáku (CaMV; 528 bp; nt 6909-7437, Franck a kol., tamtéž) a mezi místy Sphl a HindlII terminátor z genu oktopinsyntázy z Agrobacterium tumefaciens (Gielen a kol., EMBO J. 3 (1984), 835-846) (obr. 4).
p35-s3-asl byl klonován ve dvou krocích. Nejdříve byl fragment BamHI / Asp718 z pásl, jehož kohezivní konce byly zaplněny T4 polymerázou, byl klonován do vektoru pS3, který byl štěpen BamHI a pak doplněn. Tak byl získán pS3-asl. Vektor pS3 obsahuje PCR fragment z genu patatinu B33 (Rosahl a kol., Mol. Gen. Genet. 203 (1986), 214-220), obsahující nukleotidy 725 až 1400. PCR fragment j eopatřen restrikčním místem Asp718 (GGTACC) v poloze nt 725, sekvencí ATGG v poloze nt 1400, která v kombinaci s nt 1399 a 1400 poskytuje restrikční místo Ncol. PCR fragment je vložen mezi restrikční místa Asp718 a Smál. Z pS3-asl byl připraven t · · · * e .
· * * ♦ · * * * * * * « *·· ···· ·· ·'· * * fragment Sací (zaplněno)) / Xbal, který obsahuje fúzi S3-asl. Tento fragment byl klonován mezi restrikční místa Smál a Xbal v pBinAR (Obr. 5).
Odpovídající hostitelé byli transformováni standardními postupy. E. coli byly transformovány postupem podle Hanahan (J. Mol. Biol. 166 (1983), 557-580), Saccharomyces cerevisiae byly transformovány podle Dohmen a kol. (Yeast 7 (1991), 691692), transientní (dočasná) genová exprese v tabáku byla provedena postupme podle Damm and Willmitzer (Mol. Gen. Genet. 213 (1989), 15-20), trvala transformace brambor byla provedena postupem podle Dietze a kol. (in: Potrykus, I. and G. Spangenberg (Ed.). Gene transfer to plants. xxii+361 (1995), 24-29; Springer-Verlag: Berlin, Germany; New York,
New York, USA. ISBN 3-540-58406-4).
Příklad 3
Analýza fruktosyltransferázové aktivity transgenních hostitelských buněk nebo organismů exprimujících houbovou fruktosyltransferázu
Syntéza inulínu in vivo
Transgenní hostitelské buňky nebo organismy, které exprimují houbovou fruktosyltransferázu, byly kultivovány v médiu s obsahem 2 % sacharózy - pokud se nejednalo o rostlinné pletivo. V případě, že hostitelským organismem byly baktérie Escherichia coli K12, funkční gen cscB kódující sacharózapermeázu z E. coli byl vnesen jako konstrukt do vektoru pACYC184. V případě Saccharomyces • ♦ cerevisiae byl vnesen do vektoru pll2AINE (Riesmeier a kol. , EMBO J. 11 (1992), 4705-4713) gen pro sacharózový přenašeč. Buňky pak byly kultivovány alespoň 24 hodin v přítomnosti sacharózy, pak sklizeny a po opláchnutí v 50 mM hydrogenfosforečnanu sodném s pH 6,0 rozrušeny.
Rostliny exprimující fruktosyltransferázu z houby byly pěstovány v půdě. Po čtyřech týdnech byly odebrány vzorky z listů i jiných pletiv a extrahovány ve vodě, 1 ml vody/1 g čerstvé hmotnosti vzorku, v přítomnosti nerozpustného polyvinylpolypyrrolidonu, a buněčné zbytky byly odstraněny centrifugací. 4 μΐ každého extraktu bylo aplikováno na silikagel na již hotové DC filmy (Schleicher and Schůll, Dassel, Germany) a vyvinuty dvakrát ve směsi aceton/voda (87:13) . Pak byl proveden test na fruktosylové zbytky s močovinou a kyselinou fosforečnou jako činidly (Rober a kol., Planta 199 (1992), 528-536).
Syntéza inulínu in vitro
Buňky exprimující fruktosyltransferázy z houby byly rozrušeny v pufru obsahujícím: 50 mM hydrogenfosforečnan sodný, pH 6,0, 50 μΜ PMSF, 1 mM DTT, 10% (objem.)) ethylenglykol. Buněčné extrakty byly inkubovány v pufru obsahujícím: 50 mM hydrogenfosforečnan sodný, pH 6,0, 500 mM sacharózu, 50 μΜ PMSF, 1 mM DTT, 0.02% (hmot./obj em) NaN3, 10% (objem.)) ethylenglykol po 12 při 25°C. Směsi byly naředěny 1:10 ve vodě a pak 4 μΐ byly naneseny na již hotové silikagelové DC filmy (Schleicher and Schůll, Dassel, Germany) a vyvíjeny dvakrát ve směsi aceton/voda (87:13). Pak byl proveden test na fruktosylové zbytky s močovinou a kyselinou fosforečnou jako činidly (Rober a kol., Planta 199 • * (1992) , 528-536) .
Výsledky jednotlivých analýz jsou uvedeny na obr. 6 až 10. Na těchto obrázcích jsou ukázány silikagelové filmy po chromatografií na tenké vrstvě směsí nebo buněčných homogenátú a barvení na cukry obsahující fruktózu. Pomocí chromatografie na tenké vrstvě ve směsi aceton/voda (87:13) se sacharidy, mono-, oligo- i polymery rozdělí podle velikosti. Fruktóza migruje dále než sacharóza, která zase naopak migruje dále než kestóza atd. Oligomery s DP>7 a vyšším nejsou separovány a zůstávají na startu.
Na obr. 6 je vidět, že klony E. coli transformované vektorem pBluescript bez inzertu nejsou schopny přeměňovat sacharózu (dráha 1) , zatímco klony transformované plazmidem pásl syntetizují trisacharid kestózu. Klony transformované plazmidem pSK-asl jsou také schopné syntetizovat vyšší oligomery (dráhy 3 až 6) . Současně fruktózové zbytky jsou přenášeny na vodu, čímž se vytváří fruktóza. Tato přeměna je katalyzována SFT z Aspergillus sydowi.
Obr. 7 ukazuje, že proteinové extrakty z kvasinek transformovaných plazmidem 112-asi mohou syntetizovat fruktan. Aktivita fruktosyltransferázy je v těchto kvasinkách vyšší než v kvasinkách transformovaných konstruktem 112aslL. Tyto kvasinky, vzhledem k nižší fruktosyltransferázové aktivitě v průběhu času vymezeného pro experiment, syntetizovaly pouze trisacharidy. Velikost syntetizovaných fruktanů závisí na reakční době a na fruktosyltransferázóvé aktivitě.
Obr. 8 ukazuje, že velikost fruktanu syntetizovaného v extraktech z transformovaných tabákových protoplastů závisí při dané reakční době na fruktosyltransferázové aktivitě, což zase závisí na množství plazmidu pA7-asl užitého pro *
transformaci .
syntetizovány chromatografií
V drahách 3 až 5 oligo- a polymery nerozdělily. Totéž je vidět,
DP>7, platí pro extrakty z trvale transformovaných rostlin, jak je že byly které se rostlinné ukázáno na obr. 9 a 10.
* · · · ·
SEZNAM SEKVENCÍ
<210> 1
<211> 2197
<212> DNA
<213> Aspergillus sydowi
<400> 1
gaattcggca cgaggccgcc atgaagctcc cctcttcact ggacattctt ctcgccagac 60
aggcggttgg cggtactgag gtcgactacg actcaccacc ccctgacctg acgacgctcc 120
ctgagaactc gctgttcgag acctggagac ccaagatcca cgttctgccc ccaaatggcc 180
aaatcgggga cccatgcgct cattacaatg acccggcgac gggtttgttc catgtcggat 240
tcctccacaa tggcaccggc atttccagcg tctacaccga tgacctggtg acctatcgtg 300
atatcaatcc taacggcggc tacattattg ttgctggtgg ccccaatgac cccgaagccg 360
tctttgatgg atctgtcatc cccagcggaa tcgatgacct gcccacgctc ctttatacct 420
ctgtgacatc gttgccaatc cactggactc taccttatac ccccggaagc gagactcagt 480
cactggccgt aagtgacgat ggtggtcacc acttcgataa gcttgaccga ggcccagtca 540
ttccacttcc gccagatgga ctcgatgtta cagccttccg tgacccttat gtattccaga 600
accacgaggt agacgaagtt accggtagtg acccagatac atggtatgcc gccatatccg 660
ggggtgtcca tgatgtaggg cccggaatct ttctctaccg caaccaagac tcctcctttg 720
agaactggga atatctaggc gagtggtggc aagaacccgc caactcgact tggggtgacg 780
gcacttgggc caaacgctgg ggctacaatt tcgaaaccgg caacgtcttc tctctcgatc 840
gagaagggta caacgttgac ggccacacgt ttatgactat tggagttgag ggtgcatacg 900
cgcccatcca gccctcggtt acatctatgc atgccatgct gtgggcagcg ggaaatgttt 960
cctcagagaa tggcgaaaac gttaccttca cgccttatat ggccggtgct ttggactggg 1020
gcatggccgc atacgccggt gctggaaagg ttctacccag cacatctcag gcttctgaga 1080
agagtggagc gcccgaccgc ttcatctcgt gggtttggct tacaggtgat gaatttggtg 1140
ctgccgctgg atttcctgct gcccagcagg ggtggcagaa tactctcctg cttccgcgtg 1200
aattgagtat acacacaatc cagaatgtgg tcgacaacga actcatccac gagactgcat 1260
cctggcgtgt ggcagaacat ggcggcgaga ggagatctgg tggtgtcgag ctggagacac 1320
tgggaatcaa tattgcgagg gagacctacg atgcaatcgt ctcttctggg acctcgtttg 1380
aggagccttc gcgagacatt aatgaatccg gcaccattcc atttgagcgc tcgcccacta 1440
gcaggttctt cgcccttgaa gcccaaatct ccttccccca gtctgcgcga gactcggaag 1500
tccagtccgg atttcaaatc cttgcttctg aactcgagtg gacgacgatc tattatcagt 1560
tttcgaatga gtcgattgtc attgaccgta accacacaag tgctgcgtcc gagactacac 1620
• · ·
ctggtctcgg tactgtgact gagtctggcc gtatccggct tttcgatatc gcgggtggtt 1680
gcgatcatga tggacatggc ggccacgatg gcggcaacga tgatgaccac aacggtgacg 1740
gtgatcatag cggtgacggt gaccacaatg acgatgatga ccataacgtc gacggcgatg 1800
acaaggagcg tgctcgttac caaaagcgag atggcccttg cgataaagac catgataagg 1860
ttgagacatt ggatctcacc attgtcgtcg ataactcagt gcttgaagtt tacgccaact 1920
cacgatttgt ggtgtcgacc tgggttcggc cttggtacac caattcaacg gagattcgct 1980
tcttccacaa cggcgagggt gaggtcagct ttgacaacat tgcggttcat gatggtctgt 2040
atgatgcata tccggacagg gacaactgaa gatttcactg gttgatgtat tagcttgcga 2100
gctataaaga tggcgataat tagtagattt aatccaatga attacctgcc gagattgcag 2160
atttattctt acaaaaaaaa aaaaaaaaaa actcgag 2197
<210> 2
<211> 682
<212> PRT
<213> Aspergillus sydowi
<400> 2
Met Lys 1 Leu Pro Ser 5 Ser Leu Asp Ile Leu 10 Leu Ala Arg Gin Ala 15 Val
Gly Gly Thr Glu Val Asp Tyr Asp Ser Pro Pro Pro Asp Leu Thr Thr
20 25 30
Leu Pro Glu Asn Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro Lys Ile His Val
35 40 45
Leu Pro Pro Asn Gly Gin Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Tyr Asn Asp
50 55 60
Pro Ala Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Tyr Thr Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg Asp Ile Asn
90 95
Pro Asn Gly Gly Tyr 100 Ile Ile Val Ala 105
Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro
115 120
Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Thr Ser
130 135
Pro Tyr Thr Pro Gly Ser Glu Thr Gin
145 150
Gly Gly His His Phe Asp Lys Leu Asp
165
Pro Pro Asp Gly Leu Asp Val Thr Ala
180 185
Gin Asn His Glu Val Asp Glu Val Thr
195 200
Tyr Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val His
210 215
Leu Tyr Arg Asn Gin Asp Ser Ser Phe
225 230
Glu Trp Trp Gin Glu Pro Ala Asn Ser
245
Ala Lys Arg Trp Gly Tyr Asn Phe Glu
260 265
Asp Arg Glu Gly Tyr Asn Val Asp Gly
275 280
• ·
* « • a t- v · · • • « • · · • ·
Gly Pro Asn Asp 110 Pro Glu
Gly Ile Asp 125 Asp Leu Pro
Pro Ile 140 His Trp Thr Leu
Leu 155 Ala Val Ser Asp Asp 160
Gly Pro Val Ile Pro 175 Leu
Arg Asp Pro Tyr 190 Val Phe
Ser Asp Pro 205 Asp Thr Trp
Val Gly 220 Pro Gly Ile Phe
Asn Trp Glu Tyr Leu Gly
235 240
Trp Gly Asp Gly Thr 255 Trp
Gly Asn Val Phe Ser Leu
270
Thr Phe Met Thr Ile Gly
285
Val Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Ile Gin Pro Ser Val Thr Ser Met His
290
295
Ala Met 305 Leu Trp Ala Ala 310 Gly Asn Val Ser Ser Glu Asn Gly Glu 315 Asn 320
Val Thr Phe Thr Pro Tyr Met Ala Gly Ala Leu Asp Trp Gly Met Ala
325 330 335
Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Lys Val Leu Pro Ser Thr Ser Gin Ala Ser
340 345 350
Glu Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Trp Val Trp Leu Thr
355 360 365
Gly Asp Glu Phe Gly Ala Ala Ala Gly Phe Pro Ala Ala Gin Gin Gly
370 375 380
Trp Gin Asn Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Ser Ile His Thr Ile
385 390 395 400
Gin Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Ile His Glu Thr Ala Ser Trp Arg
405 410 415
Val Ala Glu His Gly Gly Glu Arg Arg Ser Gly Gly Val Glu Leu Glu
420 425 430
Thr Leu Gly Ile Asn Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Asp Ala Ile Val Ser
435 440 445
Ser Gly Thr Ser Phe Glu Glu Pro Ser Arg Asp Ile Asn Glu Ser Gly
450 455 460
Thr Ile Pro Phe Glu Arg Ser Pro Thr Ser Arg Phe Phe Ala Leu Glu
465 470 475 480
Ala Gin Ile Ser Phe Pro Gin Ser Ala Arg Asp Ser Glu Val Gin Ser
485 490 495
Gly Phe Gin Ile 500 Leu Ala Ser Glu Leu 505 Glu Trp Thr Thr Ile Tyr 510 Tyr
Gin Phe Ser Asn Glu Ser Ile Val Ile Asp Arg Asn His Thr Ser Ala
515 520 525
Ala Ser Glu Thr Thr Pro Gly Leu Gly Thr Val Thr Glu Ser Gly Arg
530 535 540
Ile Arg Leu Phe Asp Ile Ala Gly Gly Cys Asp His Asp Gly His Gly
545 550 555 560
Gly His Asp Gly Gly Asn Asp Asp Asp His Asn Gly Asp Gly Asp 575 His
565 570
Ser Gly Asp Gly Asp His Asn Asp Asp Asp Asp His Asn Val Asp Gly
580 585 590
Asp Asp Lys Glu Arg Ala Arg Tyr Gin Lys Arg Asp Gly Pro Cys Asp
595 600 605
Lys Asp His Asp Lys Val Glu Thr Leu Asp Leu Thr Ile Val Val Asp
610 615 620
Asn Ser Val Leu Glu Val Tyr Ala Asn Ser Arg Phe Val Val Ser Thr
625 630 635 640
Trp Val Arg Pro Trp Tyr Thr Asn Ser Thr Glu Ile Arg Phe Phe His
645 650 655
Asn Gly Glu Gly Glu Val Ser Phe Asp Asn Ile Ala Val His Asp Gly
660 665 670
Leu Tyr Asp Ala Tyr Pro Asp Arg Asp Asn
675 680
« · · • »
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Aspergillus sydowi
<400> 3
Val Leu Pro Ser Thr Ser Gin Ala Ser Glu Lys
10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Aspergillus sydowi
<400> 4
Asp Asp Leu Val Thr Tyr Arg
5
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> Aspergillus sydowi
<400> 5
Asp Pro Tyr Val Phe Gin Asn His
* · · • · « · • * « « *
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence
<400> 6
gaygayytng tnacntaymg 2 O
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence
<400> 7
ckrtangtna cnarrtcrtc 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence
<400> 8
• · • · · ·
gtnttycara aycaygarg
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence
<400> 9
tgrttytgra anacrtangg
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> Arteficiální sekvence
<220>
<223> Popis arteficiální sekvence: arteficiální sekvence
<400> 10
gcytgnswng tnswngg

Claims (24)

1. Molekula nukleové kyseliny kódující fruktosyltransferázu, která je vybrána ze skupiny obsahující:
a) molekuly nukleové kyseliny kódující protein obsahující aminokyselinovou sekvenci id. č. 2,
b) molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódujícího úseku uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 nebo odpovídající ribonukleotidovou sekvenci,
c) molekuly nukleové kyseliny hybridizují s řetězcem komplementárním k molekulám nukleové kyseliny podle a) nebo
b) , a
d) molekuly nukleové kyseliny jejichž nukleotidová sekvence se liší od sekvence molekuly nukleové kyseliny podle
c) v důsledku degenerace genetického kódu, a k nim komplementární molekuly.
2. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která je DNA nebo RNA.
3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo 2, která kóduje polypeptid z houby.
4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 3, kde houba je z rodu AspergiHus.
5. Vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.
6. Vektor podle nároku 5, kde molekula nukleové kyseliny je operativně spojena s regulačními prvky, které zajištují • · • · · · transkripci a syntézu translatovatelné RNA v prokaryotických a/nebo eukaryotických buňkách.
7. Vektor podle nároku 6, kde molekula nukleové kyseliny obsahuje úsek, který kóduje signální sekvenci, která ovlivňuje intra- nebo extracelulární lokalizaci fruktosyltransferázy.
8. Hostitelské buňky transformované molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 nebo které pocházejí z takových buněk.
9. Hostitelská buňka podle nároku 8, která je bakteriální buňka nebo buňka houby.
10. Rostlinná buňka, která je transformovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 nebo které pochází z takové buňky.
11. Způsob přípravy rostliny vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:
a) rostlina se geneticky modifikuje vnesením molekuly nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 a/nebo vektoru podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7, a
b) z buňky se regenerují rostliny, a případně
c) další rostliny se regenerují z rostliny podle b).
12. Rostlina obsahující rostlinné buňky podle nároku 10 nebo připravitelná způsobem podle nároku 11.
13. Rostlina podle nároku 12, která je užitková rostlina.
14. Rozmnožovací materiál rostliny podle nároku 12 nebo 13 obsahující rostlinné buňky podle nároku 10.
15. Skliditelné části rostliny podle nároku 12 nebo 13.
16. Krmivo pro zvířata nebo potraviny pro člověka vyznačující se tím, že obsahují skliditelné části rostlin podle nároku 15.
17. Způsob přípravy hostitelských buněk podle nároku 8 nebo 9 vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy vhodné buňky jsou transformovány molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7.
18. Způsob výroby fruktosyltransferázy, vyznačuj ící
se tím, že obsahuje krok, kdy se hostitelská buňka podle nároku 8 nebo 9 nebo rostlinná buňka podle nároku 10
kultivuj e v podmínkách, které dovolují syntézu fruktosyltransferázy, a fruktosyltransferáza se izoluje z kultivovaných buněk a/nebo z kultivačního média.
19. Fruktosyltransferáza kódovaná molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo připravitelná způsobem podle nároku 18.
20. Molekula nukleové kyseliny, která specificky hybridizuje s molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z nároků 1 • · až 4 nebo s jejím komplementárním řetězcem.
21. Způsob výroby polyfruktózy, zvláště inulínového typu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:
a) kultivují se hostitelské buňky podle nároku 8 nebo 9 nebo hostitel obsahující takové buňky v podmínkách, které dovolují produkci fruktosyltransferázy a přeměňující sacharózu případně přidanou nebo substrátový ekvivalent na polyfruktózu,
b) takto produkovaná polyfruktóza se získá z kultivovaných buněk, hostitele nebo kultivačního média.
22. Způsob výroby polyfruktózy, zvláště inulínového typu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy:
a) sacharóza nebo ekvivalentní substrát se přivede do kontaktu s fruktosyltransferázou podle nároku 19 v podmínkách, které dovolují přeměnu na polyfruktózu, a
b) získá se takto produkovaná polyfruktóza.
23. Způsob výroby polyfruktózy, zvláště inulínového typu, vyznačující se tím, že obsahuje krok, kdy se polyfruktóza extrahuje z rostlinné buňky podle nároku 10, z rostliny podle nároku 12 nebo 13 nebo z části takové rostliny.
24 . Způsob výroby surfaktantů vyznačuj ící s e tím , že obsahuje kroky a) a b) podle nároku 21 nebo 22 nebo extrakční krok podle nároku 23. 25 . Použití hostitelských buněk podle nároku 8 nebo 9 nebo ros tlinných buněk podle nároku 10 j ako
• · · · ♦
potravinového/krmivového doplňku.
26. Použití fruktosyltransferázy podle nároku 19 pro výrobu polyfruktózy, zejména polyfruktózy inulínového typu.
CZ20010794A 1998-09-02 1999-08-27 Molekuly nukleové kyseliny kódující fruktosyltransferázu, vektor, hostitelská bunka, zpusob její prípravy a použití, rostlinná bunka, rostlina, zpusob prípravy rostliny, rozmnožovací materiál, skliditelné cásti rostliny, fruktosyltransferáza, zpusob CZ300084B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19840028A DE19840028A1 (de) 1998-09-02 1998-09-02 Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen, und deren Verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2001794A3 true CZ2001794A3 (cs) 2002-01-16
CZ300084B6 CZ300084B6 (cs) 2009-01-28

Family

ID=7879587

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20010794A CZ300084B6 (cs) 1998-09-02 1999-08-27 Molekuly nukleové kyseliny kódující fruktosyltransferázu, vektor, hostitelská bunka, zpusob její prípravy a použití, rostlinná bunka, rostlina, zpusob prípravy rostliny, rozmnožovací materiál, skliditelné cásti rostliny, fruktosyltransferáza, zpusob

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6872555B2 (cs)
EP (1) EP1108037B1 (cs)
JP (1) JP4659983B2 (cs)
CN (1) CN1206357C (cs)
AR (1) AR021472A1 (cs)
AT (1) ATE412056T1 (cs)
AU (1) AU764741B2 (cs)
BR (1) BR9913390A (cs)
CA (1) CA2342115C (cs)
CY (1) CY1109797T1 (cs)
CZ (1) CZ300084B6 (cs)
DE (2) DE19840028A1 (cs)
DK (1) DK1108037T3 (cs)
ES (1) ES2312225T3 (cs)
HU (1) HU228010B1 (cs)
PL (1) PL202383B1 (cs)
PT (1) PT1108037E (cs)
WO (1) WO2000014246A1 (cs)
ZA (1) ZA200101737B (cs)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19840028A1 (de) 1998-09-02 2000-03-09 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen, und deren Verwendung
DE19857654A1 (de) 1998-12-14 2000-06-15 Max Planck Gesellschaft Beeinflussung des Blühverhaltens von Pflanzen durch Expression Saccharose-spaltender Proteine
US6791015B2 (en) 2000-10-30 2004-09-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Fructan biosynthetic enzymes
EP1346032A2 (de) * 2000-12-21 2003-09-24 Südzucker Aktiengesellschaft Verfahren zur herstellung von kohlenhydraten
US7364882B1 (en) 2004-09-24 2008-04-29 State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Portland State University Enzymatic reduction of a nitrile containing compound to the corresponding amine
WO2010061971A1 (ja) 2008-11-28 2010-06-03 興和株式会社 ピリジン－３－カルボキシアミド誘導体
TWI788655B (zh) 2015-02-27 2023-01-01 美商林伯士拉克許米公司 酪胺酸蛋白質激酶2(tyk2)抑制劑及其用途
ES2870920T3 (es) 2016-06-21 2021-10-28 X4 Pharmaceuticals Inc Inhibidores de CXCR4 y usos de los mismos
HRP20241163T1 (hr) 2018-04-24 2024-11-22 Merck Patent Gmbh Antiproliferacijski spojevi i njihova uporaba
EP3670659A1 (en) 2018-12-20 2020-06-24 Abivax Biomarkers, and uses in treatment of viral infections, inflammations, or cancer
WO2021106016A1 (en) * 2019-11-27 2021-06-03 Revelations Biotech Pvt Ltd Nucleic acids, vectors, host cells and methods for production of beta-fructofuranosidase from aspergillus niger
CN118745445B (zh) * 2024-08-07 2025-02-28 苏州仁晟新材料科技有限公司 一种丙酮酸乙酯的制备方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2806522B2 (ja) * 1987-09-04 1998-09-30 日本食品化工株式会社 分岐フラクトオリゴ糖の製造方法
JP2982372B2 (ja) * 1990-03-16 1999-11-22 味の素株式会社 ポリフラクタンを含有する飲料
PL178789B1 (pl) * 1992-12-28 2000-06-30 Stichting Scheikundig Onderzoe Sposób otrzymywania roślin transgenicznych, konstrukt DNA do tworzenia roślin transgenicznych, komórka rośliny transgenicznej oraz sposób otrzymywania fruktanów
AU682727B2 (en) * 1993-12-23 1997-10-16 Centro De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Fructosyltransferase enzyme, method for its production, and DNA encoding the enzyme
JP3628336B2 (ja) * 1996-03-11 2005-03-09 明治製菓株式会社 β―フルクトフラノシダーゼおよびその遺伝子、β―フルクトフラノシダーゼ遺伝子の単離法、β―フルクトフラノシダーゼの産生系、並びにβ―フルクトフラノシダーゼ変異体
DE19617687C2 (de) * 1996-05-03 2000-11-16 Suedzucker Ag Verfahren zur Herstellung transgener, Inulin erzeugender Pflanzen
DE19619236A1 (de) 1996-05-13 1997-11-20 Bayer Ag Abbau von biologisch abbaubaren Polyesteramiden mit Enzymen
DE19708774A1 (de) * 1997-03-04 1998-09-17 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme die Fructosylpolymeraseaktivität besitzen
CN1154720C (zh) * 1997-09-10 2004-06-23 明治制果株式会社 β-呋喃果糖苷酶及其基因
DE19749122A1 (de) * 1997-11-06 1999-06-10 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen
DE19840028A1 (de) 1998-09-02 2000-03-09 Max Planck Gesellschaft Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme, die Fructosyltransferaseaktivität besitzen, und deren Verwendung

Also Published As

Publication number Publication date
EP1108037A1 (de) 2001-06-20
PL202383B1 (pl) 2009-06-30
US20020064850A1 (en) 2002-05-30
DK1108037T3 (da) 2009-02-16
DE19840028A1 (de) 2000-03-09
ATE412056T1 (de) 2008-11-15
HU228010B1 (hu) 2012-08-28
US20050278806A1 (en) 2005-12-15
BR9913390A (pt) 2001-05-22
AU5971499A (en) 2000-03-27
PT1108037E (pt) 2008-11-03
US6872555B2 (en) 2005-03-29
US7906707B2 (en) 2011-03-15
HUP0104121A3 (en) 2005-11-28
EP1108037B1 (de) 2008-10-22
CN1317048A (zh) 2001-10-10
CZ300084B6 (cs) 2009-01-28
JP2002524079A (ja) 2002-08-06
JP4659983B2 (ja) 2011-03-30
CA2342115A1 (en) 2000-03-16
US20100011461A1 (en) 2010-01-14
ES2312225T3 (es) 2009-02-16
US7588922B2 (en) 2009-09-15
WO2000014246A1 (de) 2000-03-16
ZA200101737B (en) 2002-01-02
DE59914884D1 (de) 2008-12-04
AR021472A1 (es) 2002-07-24
PL346422A1 (en) 2002-02-11
CN1206357C (zh) 2005-06-15
HUP0104121A2 (hu) 2002-03-28
AU764741B2 (en) 2003-08-28
CY1109797T1 (el) 2014-09-10
CA2342115C (en) 2013-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7906707B2 (en) Nucleic acid molecules encoding enzymes having fructosyltransferase activity, and their use
JP3511027B2 (ja) 植物、真菌および微生物中で直鎖型α−１，４グルカンの合成を促進することができる酵素をコードするＤＮＡ配列
US6515203B1 (en) Nucleic acid molecules encoding enzymes having fructosyl polymerase activity
US7083963B2 (en) Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin
Ebskamp et al. Accumulation of fructose polymers in transgenic tobacco
HU227302B1 (en) Dna molecules that code for enzymes involved in strach synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules
BRPI9917852B1 (pt) Molécula de ácido nucléico codificadora de frutosiltransferase, vetor, célula hospedeira, produto alimentício, oligonucleotídeo, processo para produzir planta, preparar célula hospedeira, preparar frutosiltransferase, preparar polifrutose, ou preparar agentes tensoativos, e emprego de célula hospedeira, frutosiltransferase ou polifrutose
US20090197323A1 (en) Identification and characterization of a novel alpha-amylase from maize endosperm
JPH1084973A (ja) ラフィノース合成酵素遺伝子、ラフィノースの製造法及び形質転換植物
JP2006314326A (ja) 植物のラフィノース族オリゴ糖含量を低減させる方法

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20130827