CZ20021034A3 - Fibrinolyticky aktivní polypeptid - Google Patents

Fibrinolyticky aktivní polypeptid Download PDF

Info

Publication number
CZ20021034A3
CZ20021034A3 CZ20021034A CZ20021034A CZ20021034A3 CZ 20021034 A3 CZ20021034 A3 CZ 20021034A3 CZ 20021034 A CZ20021034 A CZ 20021034A CZ 20021034 A CZ20021034 A CZ 20021034A CZ 20021034 A3 CZ20021034 A3 CZ 20021034A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
leu
ser
asn
ala
asp
Prior art date
Application number
CZ20021034A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ298502B6 (cs
Inventor
Thomas Charles Boone
Huimin Li
Michael Benjamin Mann
Original Assignee
Amgen Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc. filed Critical Amgen Inc.
Publication of CZ20021034A3 publication Critical patent/CZ20021034A3/cs
Publication of CZ298502B6 publication Critical patent/CZ298502B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6402—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals
    • C12N9/6418—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from non-mammals from snakes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se vztahuje k fibrinolyticky aktivní metaloproteináze, která má v přírodě se nevyskytující sekvenci, k metodám její výroby a k jejímu použití v léčbě trombóz in vivo.
Dosavadní stav techniky
Fibroláza je enzymaticky aktivní polypeptid (konkrétně metaloproteináza), tvořený 203 aminokyselinami,který byl poprvé izolován purifikací z jedu hada Southern Copperhead (Patent USA č. 4, 610,879, vydaný 9.září 1986 (Markland et al.); a Guan et. Al., Archives of Biochemistry and Biophysics, svazek 289, číslo 2, strany 197-207 (1991) . Enzym vykazuje přímou fibrinolytickou aktivitu se slabou nebo žádnou hemoragickou aktivitou. Rozpouští krevní sraženiny tvořené z fibrinogenu nebo z plné krve.
Aminokyselinová sekvence fibrolázy byla určena a také byly popsány metody pro rekombinantní produkci v kvasinkách a použití pro úpravu tromboembolických podmínek in vivo. Randolph et al., Protein Science, Cambridge University Press (1992), strany 590-600 a Evropská patentová žádost č. 0 323 722 (Valenzuela et al.), publikovaná 12. července 1989.
Podstata vynálezu
Tento vynález poskytuje fibrinolytickou metaloproteinázu o aminokyselinové sekvenci, která se běžně v přírodě nevyskytuje (popsaná viz. SEQ ID NO:1 a také popisována zde jako novel acting thrombolytic (NAT). Také jsou poskytnuty sekvence nukleové kyseliny jako např. SEQ ID NO: 2 a její varianty, které kódují NAT.
• · · · · ······· · · • · · · ·· · · · · · • * · · ·· · · · · ·
Termín „zralý je používán v jeho konvenčním smyslu-označuje biologicky aktivní polypeptid, který byl enzymaticky zpracován in sítu v hostitelské buňce, vyštěpením zprepro oblasti.
Vzhledem k fibrinolytické aktivitě je NAT použitelný in vivo jako lyzační činidlo krevních sraženin při léčení trombóz u savců (včetně krys, prasat a člověka).
NAT polypeptid v tomto vynálezu jako léčebné činidlo poskytuje výhody oproti v přírodě se vyskytující fibroláze (např.fibrinolytický polypeptid nalezený v hadím jedu). U nativní fibrolázy je popsáno několik alternativních N-konců: QQRFP, EQRFP a ERFP (kde E značí cyklický glutamín nebo kyselinu pyroglutamovou). Přesněji, molekula fibrolázy, která začíná na N-konci sekvencí QQRFP, je degradována na 2 izoformy, které mají N-konce EQRFP a ERFP. Rekombinantní fibroláza vyráběná v kvasinkách je směs všech těchto 3 forem a tudíž není homogenní. Viz. Loayza et al, Journal of Chromatography, B 662, strany 227-243 (1994).
A navíc cyklický glutamín blokuje N-konec a znemožňuje tak sekvenování.
Ve srovnání s tím rekombinantní NAT (popisovaný v tomto vynálezu) poskytuje jednu formu: pouze jeden N-konec je typicky vyráběn. Výsledkem je větší homogenita koncového produktu ve srovnání s rekombinantní fibrolázou, což je výhodné, když jako konečné upotřebení jsou zamýšleny lékařské aplikace.
Stručný přehled obrázků na výkresech
Obrázek 1 zobrazuje v lineárním tvaru celou aminokyselinovou sekvenci NATu (Seq ID NO:3), skládající se z „ prepo oblasti (podtržená), která obsahuje „signální peptid, a zralý polypeptid (nepodtržený).
Podrobný přehled obrázků na výkresech
NAT může být vyráběn rekombinantní expresí molekuly nukleové kyseliny o SEQ ID NO:4, která kóduje kompletní aminokyselinovou • · sekvenci NATu (SEQ ID NO:3), včetně „prepo oblasti (nukleotidy 1173) a zralého polypeptidu (nukleotidy 784-1386), ve vhodném hostiteli. Následně po expresi, je prepo oblast v hostitelské buňce enzymaticky odštěpena a poskytuje zralý aktivní polypeptid (SEQ ID NO:1).
NAT je vyráběn v kvasinkách, jak bude vysvětleno detailněji níže.
Zralý polypeptid (SEQ ID NO: 1), který je takto vyráběn může mít a také nemusí jako koncovou aminokyselinu- methionin a to v závislosti na způsobu přípravy. Typicky je methionin, jako koncová aminokyselina přítomen, když je polypeptid vyráběn rekombinantně v nesekretujícím bakteriálním druhu (např. E.coli) jako hostiteli.
Kromě toho, molekula nukleové kyseliny o SEQ ID NO: 2, je také použitelná, protože je to degenerovaná sekvence a kóduje stejný polypeptid. Tento vynález zahrnuje také molekuly nukleové kyseliny, které mohou kódovat další aminokyseliny hraničící na 5'nebo 3'konci s oblastí která kóduje zralý polypeptid, stejně jako sekvence kódující alternativní pre/pro oblasti (např. sekvence zodpovědné za sekreci polypeptidu přes buněčné membrány) v místě nativní pre/pro oblasti, (např. nalezené v přírodě vyskytující se fibroláze). Další sekvence mohou také být nekódující sekvence, včetně regulačních oblastí jako promotor transkripce nebo translace, v závislosti na hostitelské buňce.
NAT může být připraven pomocí dobře známých rekombinantních technik, které jsou popsány blíže v Sambrook et al., Molecular cloning: Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY (1989) a/nebo v Aqusubel et al., editors, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers lne. and Wiley and Sons, New York (1994).
DNA molekula kódující polypeptid nebo jeho zkrácená verze, může být získána například pomocí metody: „screening genomové nebo cDNA knihovny, nebo pomocí PCR amplifikace. Následuje nahrazení kodónu, který kóduje N-koncové aminokyseliny QQR, kodónem pro serin (S).
Alternativně, může být molekula kódující NAT připravena chemickou syntézou, pomocí metod, které jsou dobře známé zkušeným chemikům. Popsány byly Engelsem et al. v Angew. Chem. Intl. Ed., Volume 28, strany 716-734 (1989). DNA je několik stovek nukleotidů • · · · · · ·· · • · · · · · · · 9 · # · · · · ······· · >
• · · * ·· · · · · · ·· * · ·· · ·· ·· dlouhá. Nukleové kyseliny delší než jedno sto nukleotidů mohou být syntetizovány stejnými metodami jako několik fragmentů a následně tyto fragmenty mohou být ligovány k sobě, tak aby vytvořily nukleotidovou sekvenci o žádané délce.
DNA molekula je vložena do příslušného expresního vektoru pro expresi ve vhodné hostitelské buňce.
Vektor je vybrán, tak aby fungoval v dané hostitelské buňce (např. vektor je kompatibilní s hostitelským buněčným aparátem, tak že dochází k expresi DNA).
Třebaže polypeptid může být exprimován v prokaryotické, kvasinkové, hmyzí (bakulovirový systém) nebo eukaryotické hostitelské buňce, kvasinka je upřednostněna, jak bude dále podrobněji vysvětleno.
Vektory používané k expresi NAT v jakékoliv hostitelské buňce mohou také obsahovat 5' hraničící oblast (zmiňovaná jako „promotér) a další regulační prvky prakticky připojené k DNA tak, aby byly exprimovány. Jsou to enhancery, začátek replikačního elementu, celá sekvence intronu, obsahující donorové a akceptorové vystřihovací místo, signální peptidová sekvence, sekvence pro vazbu ribozomu a polyadenylační sekvence, polylinkerová oblast pro inzerci nukleové kyseliny kódující NAT a selekční markér.
Každý z těchto elementů je diskutován dále.
Ne nutně, může vektor také obsahovat „tag sekvenci, např. oligonukleotidovou sekvenci lokalizovanou na 5'nebo 3'konci polypetid-kódující sekvence, která kóduje póly His (jako hexaHis) nebo krátké imunogenní sekvence ( jako c-myc nebo hemaglutininový epiptop, pro které jsou protilátky, včetně monoklonálních protilátek, komerčně dostupné. Tento tag je exprimován společně s NAT a může sloužit jako afinitní tag pro purifikaci tohoto polypeptidu z hostitelské buňky. Následně může být tag odstraněn z purifikovaného polypeptidu různými způsoby, například použitím selektivní peptidázy.
5' hraniční sekvence může být v přírodě se vyskytující sekvence, nebo může být homologní (např. ze stejného druh nebo rodu jako hostitelská buňka), heterogenní (např. z jiného druhu nebo rodu, než je hostitelská buňka), hybridní (např. kombinace
5'hraniční sekvence z více než jednoho druhu) nebo syntetická.
• · · · ·· · ···· · « * • < to·· toto····· · ···· ·· · ··· ·· · · toto a <·· ·>
Zdrojem může být jakýkoliv prokaryotický nebo eukaryotický organismus, nebo jakákoliv rostlina, za předpokladu, že 5' hraniční sekvence je funkční, a může být aktivován systémem hostitelské buňky.
Začátek replikace je většinou součástí prokaryotických expresních vektorů, které jsou komerčně dostupné, a napomáhá replikaci vektoru v hostitelské buňce. Amplifikace vektoru v určitém počtu kopií, může být v některých případech důležitá pro optimální expresi „NATu. Jestliže vybraný vektor neobsahuje začátek replikace, může být na základě známé sekvence chemicky syntetizován a následně vložen do vektoru.
Prvek konce transkripce je typicky lokalizován na 3'konci polypeptidové kódující sekvence a slouží k ukončení transkripce mRNA. Terminační prvek v prokaryotických buňkách je většinou G-C bohatý fragment následovaný polyT sekvencí. Tento prvek je snadno klonovatelný z knihovny nebo komerčně dostupný jako součást vektoru, a také může být připraven metodami syntézy nukleových kyselin.
Gen pro selekční markér kóduje protein nezbytný pro přežití a růst hostitelské buňky na selektivním kultivačním médiu. Typický selekční markerový gen kóduje proteiny, které (a) propůjčují resistenci na antibiotika nebo na jiné toxiny, například, ampicilin, tetracyklin nebo kanamycin v prokaryotických hostitelských buňkách, zeocin v kvasinkách a neomycin v savčích hostitelských buňkách; (b) doplněk auxotrofické deficience buněk; nebo (c) doplněk kritických živin nedostupných z komplexního média. Preferované selekční markéry používané při prokaryotické expresi jsou geny pro rezistenci na kanamycin, ampicilin a tetracyklin.
Ribozomální vazebný prvek, běžně nazývaný „Shine-Dalgarno sekvence (u prokaryotů) nebo „Kozák sekvence (pro eukaryoty), je nezbytný pro iniciaci translace mRNA. Tento prvek je typicky lokalizován na 3' konci od promotoru a na 5'konci od kódující sekvence polypeptidů, který je syntetizován.
„Shine-Dalgarno sekvence je variabilní, ale typicky obsahuje polypurin (např. vysoký obsah A-G). Mnoho „Shine-Dalgarno sekvencí bylo identifikováno, každá může být snadno syntetizována pomocí metod, které byly popsány a použita v prokaryotickém vektoru.
• · * · ••«Μ····» 4 4 4 4 4 · 4 ·« · • 4 4 · » ······· « « • · · · « « · ···«
4· ·· · · 4 · · · · „Kozák sekvence zahrnuje sekvence bezprostředně před a za iniciačním kodónem.
Preferovaná „Kozák sekvence je ta, která je asociovaná s vysokou účinností s iniciací translace v AUG start kodónu.
V těch případech, kdy je žádoucí aby NAT polypeptid byl sekretován z hostitelské buňky, může být signální sekvence použita k nasměrování polypeptidu ven z buňky, ve které byl syntetizován.
Signální sekvence je umístěna v kódující oblasti sekvence nukleové kyseliny, nebo přímo na 5' konci kódující oblasti. Mnoho signálních sekvencí bylo identifikováno a jakýkoli z nich funguje ve vybrané hostitelské buňce a může zde být použit. Tudíž, signální sekvence může být homologní nebo heterologní s polypeptidem.
Navíc signální sekvence může být chemicky syntetizována za použití metod popsaných výše.
Když je vektor zkonstruován a nukleová kyselina byla vložena do správného místa ve vektoru, celý vektor může být vložen do vhodné hostitelské buňky a dále amplifikován a/nebo polypeptid exprimován.
Jak již bylo zmíněno, hostitelské buňky mohou být prokaryotické (jako E.coli) nebo eukaryotické (jako kvasinkové buňky, nebo hmyzí nebo buňky obratlovců). Hostitelská buňka, ať již je to kvasinka nebo jiný hostitel, za vhodných podmínek může syntetizovat NAT, který může být později sbírán z kultivačního média (jestliže je hostitelskou buňkou sekretován do média), nebo přímo z hostitelských buněk, které ho produkují (jestliže není sekretován). Po sběru NAT polypeptidu může být purifikován použitím metod, jako je molekulární síťová chromatografie, afinitní chromatografie a podobné.
Výběr hostitelské buňky bude z velké míry záviset na způsobu, » jakým je buňka schopna sbalit NAT do jeho nativní sekundární a terciální struktury (např. správná orientace di-sulfidických můstků, apod.), tak aby byl biologicky aktivní. Přesto, dokonce když hostitelská buňka nesyntetizuje biologicky aktivní materiál, může být „sbalen po syntéze za použití vhodných chemických podmínek, takových, které jsou známy zkušeným chemikům. V tomto případě, může být správné „sbalení odvozeno z faktu, ze materiál je biologicky aktivní.
Vhodné hostitelské buňky, nebo tkáňové kultury mohou být savčí buňky, jako například buňky z vaječníku čínského křečka (CHO-Chinese hamster ovary cells) nebo 3T3 buňky. Vhodné savčí hostitelské buňky a metody transformace, kultivace, množení, screeningu, a výroby produktu a jeho purifikace jsou obecně známé.
Další vhodné savčí buněčné kultury jsou opičí COS-1 a COS-7 buněčné linie a CV-1 buněčná linie. Další případné savčí hostitelské buňky jsou buněčné linie primátů a hlodavců, včetně transformovaných buněčných linií. Vhodné jsou také normální diploidní buňky, buněčné druhy odvozené od in vitro kultivovaných primárních tkáňových linií, stejně jako primární explantáty. Kandidátní buňky by měly být genotypově deficitní v selekčním genu, nebo by měly obsahovat dominantně působící selekční gen.
Avšak i další savčí buněčné linie je možné použít, HeLa, myší L-929 buňky, 3T3 buňky odvozené od Swiss, Balb-c nebo NIH myších,
BHK nebo HaK buněčné linie z křečka.
Užitečné jsou také bakterie jako hostitelské buňky. Například různé druhy E.Coli (např. HB101, DH5a, DH10 a MC1061) jsou dobře známé jako hostitelské buňky používané v biotechnologii.
Různé druhy B.subtilis, Pseudomonas druhy, jiné druhy Bacillus, Streptomyces a jim podobné mohou být také použity. Navíc mnoho druhů kvasinkových buněk je také použitelných jako hostitelské buňky pro expresi polypeptidu prezentovaného v tomto vynálezu. Také hmyzí buňky mohou být použity jako hostitelské buňky. Popsáno například v „ Miller et al., Genetic Engineering, Volume 8, strany 277-298 (1986).
Inzerce (také nazývaná jako transformace nebo transfekce) vektoru do vybrané hostitelské buňky může být provedena pomocí kalcium fosfátu, elektroporací, mikroinjekcí, lipofekcí nebo DEAEdextranem.
Vybraná metoda musí funkčně korelovat s použitou hostitelskou buňkou. Tyto a jiné vhodné metody jsou známé zkušeným chemikům a popsány leckde (např. v Sambrook et al.)
Hostitelské buňky obsahující vektor mohou být kultivovány ve standardním médiu. Médium většinou obsahuje všechny nezbytné živiny pro růst a přežití buněk.
Vhodná média pro kultivaci E.coli jsou například Luria Broth (LB) a/nebo Terrific Broth (TB). Vhodná média pro kultivaci eukaryotických buněk jsou RPMI 1640, MEM, DMEM a všechny které mohou • · ♦ · ···« 9 9 9 • · * ···« 9 « 9 · * ♦ · 9999999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·· ·4 9 9 9 9 9 9 9 být doplněny sérem a/nebo růstovými faktory, které jsou nezbytné pro kultivaci dané buněčné linie. Vhodné médium pro kultivaci hmyzích buněk je Graceovo médium doplněné, je-li to nezbytné, yestolatem, hydrolyzátem laktoalbuminu a/nebo fetálním telecím sérem.
Antibiotika nebo jiné sloučeniny používané pro selektivní růst transformovaných buněk mohou být přidána jako doplněk do média. Sloučenina, která je použita pro selekci, je vybrána podle selekčního markéru, který je přítomen v plasmidu, kterým byla hostitelská buňka transformována. Například, když je selekční markér rezistence na kanamycin, tak se kanamycin přidává do kultivačního média.
Množství NATu vyprodukovaného hostitelskou buňkou se vyhodnocuje metodami běžně známými.
Jsou to metody jako Western blot , SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza, nedenaturující gelová elektroforéza, HPLC, imunoprecipitace, a/nebo stanovení aktivity jako stanovení gelového vazebného DNA posunu.
Je-li NAT sekretován z hostitelských buněk (vyjma gram negativních bakterií), většina proteinu se nachází v médiu. Je-li NAT sekretován z gram-negativních bakterií, určitá část se nalezne v periplasmě.
Není-li NAT sekretován nachází se v cytoplasmě.
V případě intracelulárního NATu se buňky mechanicky rozbijí.
Je-li NAT lokalizován v periplasmě, mechanické rozbití nebo osmotická úprava mohou být použity k uvolnění periplasmatického obsahu do pufrovaného roztoku. NAT je potom izolován přímo z roztoku. Vlastní izolace z roztoku může být provedena různými technikami. Je-li NAT syntetizován, tak obsahuje tzn. TAG , např. hexa-histidin, nebo jiný malý peptid buď karboxyl nebo amino konec, v podstatě může být purifikován v jednom kroku přes afinitní kolonovou chromatografii, kde náplň kolony je vysoce afinitní k „TAGu nebo přímo k polypeptidu (např. monoklonální protilátka).
Například poly-histidin se váže s vysokou afinitou a specificky k niklové afinitní koloně (např. Qiagen niklová kolona), která může být použita k purifikaci. (například v Ausubel et al., editors, current Protocols in Molecular Biology).
• · · · · 9 9 • · ···· · · · • » · · · · · · »
A · · · · ·····*· · >
• · ♦ · · · · · · · · * · · # · * · · · · ·
Na druhé straně, i když polypeptid nemá „TAG, nebo není vhodná protilátka, jiné dobře známé metody purifikace mohou být použity.
Jsou to iontoměničová chromatografie, fázově reverzní chromatografie, HPLC, nativní gelová elektroforéza v kombinaci s elucí z gelu a preparativní isoelektrická fokusace („Isoprime přístroj/technika, Hoefer Scientific). V některých případech dvě nebo i více těchto technik může být zkombinováno aby se docílilo vyšší čistoty.
Pro produkci NATu se s výhodou používají kvasinky, nejvýhodnější je druh Pichia (např. Pichia pastoris), kvůli jejich vyšší účinnosti při sbalování polypeptidu do původní struktury, ve srovnání s bakteriálními buňkami, např. E.coli. Vhodné rekombinantní metody pro expresi v kvasinkách jsou popsány v Patentu Spojených Států 4, 855, 231, (Stroman et al.), 4, 812, 405 (Lair et al.), 4,
818, 700 (Cregg et al.), 4, 885, 242 (Cregg), 4, 837, 148 (Cregg), které jsou začleněné uvnitř referencí.
Pichia buňky mohou být také použity na expresi fibrolázy z DNA molekul, které kódují tuto metaloproteinázu se stejnou efektivitou a takováto metoda představuje další hledisko předkládaného vynálezu.
Fibroláza je známá metaloproteináza, která byla popsána ve vědecké a patentové litetaruře, viz. Randolph et al., a Evropská patentová žádost č. 0 323 722, citovaná výše. Většinou je exprimována fibroláza o SEQ ID NO: 5, která je kódována cDNA molekulou SEQ ID NO: 6 (nebo variantami, které kódují stejnou aminokyselinovou sekvenci). Exprese fibrolázy v takovém to systému většinou navíc, kromě maturovaného polypeptidu (nukleotidy 7841392), zahrnuje DNA molekulu o SEQ ID NO: 7, která kóduje „prepo sekvenci (nukleotidy 1-783).
Chemicky modifikované varianty NATu, ve kterých je polypeptid navázán na polymer nebo jinou molekulu, aby vytvořil derivát, proto aby modifikoval vlastnosti, jsou také zahrnuty v rámci tohoto předkládaného vynálezu.
Výhodné, hlavně pro lidské léčebné účely, je derivatizovat NAT tak, že je připojena jedna nebo více chemických molekul na molekulu polypeptidu. Tyto molekuly mohou být různé ve vodě rozpustné polymery. Polymer musí být ve vodě rozpustný, protože NAT, ke kterému je připojen ve vodě , jakožto ve fyziologickém prostředí • · 0 · • · · · · · · · 4 • · · · · 0 » « « *0 0 0 · · · ·« · · * 0 0 ······· 0 0 ···· ·· 0 0 0 0 · •0 · · «0 0 «· · rozpustný. Ve vodě rozpustné polymery mohou být vybrány ze skupin sestávající se, například, z polyethylen-glykolu, kopolymerů ethylen-glycol/propylen-glykol, karboxy-methyl-celulosa, dextran, polyvinyl-alkohol, polyvinyl pyrolidon, poly-1,3-dioxalan, poly1,3, 6-trioxan, ethylen/anhydrid kyseliny maleinové kopolymer polyamino kyseliny (buď homopolymery, nebo náhodné či nenáhodné kopolymery (viz.dále u fúzních molekul) a dextran nebo póly (nvinylpyrolidon)polyethylen-glykol, homopolymery polypropylenglykolu, kopolymery polypropylenu oxid/ethylen oxid, polyoxyethylované polyoly, polystyren-maleat a polyvinyl-alkohol.
Polyethylen-glykol-propion-aldehyd je vhodný pro průmyslovou výrobu díky své stabilitě ve vodě.
Polymer může mít jakoukoliv molekulární hmotnost a může být rozvětvený nebo nerozvětvený. Pro polyethylen glykol je preferovaná molekulární hmotnost mezi 2 kilodaltony (kDa) a okolo 100 kDa (termín „okolo znamená, že při přípravě polyethylenglykolu některé molekuly váží více, jiné o něco méně než je stanovená molekulární hmotnost), což usnadní zacházení a průmyslovou výrobu. Jiné velikosti mohou být použity v závislosti na žádaném terapeutickém profilu (např. požadovaná délka doby uvolňování, účinky na biologickou aktivitu, jsou-li nějaké, usnadnění manipulace, stupeň, nebo nedostatek antigenicity nebo jiných známých efektů polyethylenglykolu na terapeutický protein.
Počet připojených molekul polymeru může být různý a zkušený chemik je schopný zjistit účinek na funkci. Může být použita derivatizace, jak mono-, tak i di-, tri-, tetra- nebo i kombinovaná, se stejnou nebo jinou chemickou molekulou (např. polymerem o jiné molekulové hmotnosti, než je polyethylenglykol).
Poměr molekul polymeru a molekul NAT polypeptidu kolísá, stejně jako kolísá jejich koncentrace v reakční směsi. Obecně, je optimální poměr (ve smyslu efektivity reakce zde není přebytek nezreagovaného polypeptidu nebo polymeru) určen faktory jako je požadovaný stupeň derivatizace (např. mono-, di-, tri-, atd.), molekulární hmotnost vybraného polymeru, je-li polymer rozvětvený či nikoliv a reakční podmínky.
Chemické skupiny by měly být připojeny k NAT s ohledem na jejich účinek na funkci nebo antigenní domény polypeptidu. Existuje • · · · · • · · · • · · · < · • · · 9 · *
9 99 99 velký počet metod pro vytvoření vazby, například viz, E- 0401 384 (spojení PEG k G-CSF) a Malík et al., Experimental Hematology,
Volume 20, strany 1028-1035 (1992) (popisující „pegylaci GM-CSF pomocí chloridu tresylového). Pro ilustraci, polyethylenglykol může být kovalentně navázán přes reaktivní skupiny aminokyselinových zbytků, jako volná amino nebo karboxylová skupina. Reaktivní skupiny jsou ty, ke kterým se aktivovaná molekula polyethylenglykolu (nebo jiné chemické skupiny) může vázat.
Aminokyselinové zbytky, které mají volné aminoskupiny mohou obsahovat lyzinové zbytky a N-koncový aminokyselinový zbytek.
Ty které mají volné karboxylové skupiny, mohou obsahovat zbytky kyseliny asparagové a glutamové a C-koncový aminokyselinový zbytek. Sulfohydrylové skupiny mohou být také použity jako reaktivní skupiny pro vazbu molekuly polyethylen-glykolu nebo jiných chemických skupin. V průmyslové výrobě je preferovaná vazba aminokyseliny jako je N-konec nebo lyzinová skupina.
Je potřeba se vyvarovat vazby na reaktivní skupiny, které jsou důležité pro vazbu receptoru, je-li navázání na receptor požadováno.
N-koncová chemicky modifikovaná derivatizace může být také požadována. Pro ilustraci, různé molekuly polyethylenglykolu mohou být vybrány (podle molekulové hmotnosti, rozvětvení, atd.), různý poměr molekul polyethylenglykolu s molekul polypeptidu v reakční směsi, typy „pegylace a metody pro získání vybraného Nkoncového pegylatovaného NATu.
Metodou k získání pegylatovaného N-konce (např. je-li nezbytné oddělení těchto sloučenin od jiných monopegylatovaných molekul) může být purifikace N-koncově pegylatovaného materiálu z populace pegylatovaných NAT molekul. Selektivní N-koncová chemická modifikace může být dosažena pomocí redukující alkylace, která využívá rozdílné reaktivity různých typů primárních amino skupin (lyzin versus N-konec), které jsou k dispozici pro derivatizaci. Viz PCT žádost WO 96/11953, publikováno 25. srpna 1996.
Za vhodných reakčních podmínek je dosažena podstatně selektivní derivatizace NATu na N-konci s karboxylovou skupinou, která obsahuje polymer. Například se může použít selektivní N-koncová pegylace NATu při pH, které pak zvýhodňuje rozdíly mezi ε-amino skupiny lysinových zbytků a α-amino skupiny N-konce polypeptidu. Díky této selektivní • · ·· ···· «· · • · · · · · « ··· • · ♦ * * ·«····· · 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 * · ·· ·· · «· 9 9 derivatizaci je připojení polymeru k polypeptidu kontrolováno: konjugace s polymerem probíhá převážně na N-konci polypeptidu a nevyskytuje se žádná významná modifikace jiných reaktivních skupin, jako je postranní řetězec amino skupin lyzinu. Při použití redukující alkylace může být použit jakýkoliv z polymerů popsaný výše, a měl by mít jedinou reaktivní aldehydovou skupinu pro spojení s polypeptidem.
Polyethylenglykol propionaldehyd, obsahující jediný reaktivní aldehyd, může být použit.
NAT nebo chemicky modifikované deriváty v souhlasu s vynálezem mohou být navrženy k in vivo aplikaci, nejlépe přes intratrombus. (např. přes lokalizované podání přímo na místo sraženiny v cévě, např. přes katetr). Systémové podávání není běžně preferováno, kvůli pravděpodobnosti, že přirozený a2 makroglobulin v celkovém krevním oběhu může vytvořit komplex s NAT, a tak zabrání interakci s fibrinem nebo fibrinogenem a sníží rozpuštění sraženiny. Ačkoliv mohou být případy, kdy větší množství NATu může být aplikováno, což převýší krevní hladiny a2 makroglobulinu, a tudíž umožní systémové podáváni.
Obecně, v rámci vynálezu farmaceutická sloučenina zahrnuje efektivní množství NATu společně s farmaceuticky přijatelnými ředidly, konzervačními činidly, rozpouštědly, emulgátory, adjuvans, a/nebo nosiči. „Efektivním množstvím je míněno množství dostatečné k produkci měřitelného biologického vlivu (např. trombolyticky efektivní množství, které způsobí rozpuštění krevní sraženiny nebo vznikající sraženiny léčí).
Typicky, NAT je ve vysoce purifikované formě a jakákoliv farmaceutická sloučenina, která bude použita jako pojidlo, bude před použitím normálně sterilizována, např. filtrací přes sterilní filtrační membrány.
Zkušený farmaceut bude schopný zjistit efektivní dávky podáváním a pozorováním požadovaného terapeutického vlivu. Určité vlivy dávek budou záviset na dané nemoci nebo stavu, který bude léčen, stejně jako na věku a celkovém zdravotním stavu příjemce, a který může být určen standardními klinickými postupy.
Kde je to možné, bude vhodné stanovit křivku farmaceutického složení odezvy na dávku, nejprve in vitro -jako bio-test a potom • ··«··· • φ · φ • · φφφφ φφφ • φφφ ΦΦΦΦΦ·· φ φ φφφ * · · « « · · ·· ·· · Φ· φ φ ve vhodném zvířecím modelu (in vivo) , před tím, než se začne s testováním na lidech. Zkušený praktický lékař, po zvážení léčebných souvislostí, typu léčené nemoci a jiných vhodných faktorů bude schopný zjistit správné dávkování bez přílišného úsilí. Typicky, praktický lékař bude podávat sloučeninu NAT dokud nebude dosaženo dávky, která způsobí požadovaný efekt (např. rozpuštění krevní sraženiny). Sloučenina může být podávána jako jednorázová dávka, nebo ve dvou a více dávkách (které mohou ale nemusí obsahovat stejné množství polypeptidu) v určitých časech, nebo kontinuálně.
NAT může být také použit pro přípravu protilátek podle standardních metod. Protilátky mohou být polyklonální, monoklonální, rekombinantní, chimérické, jedno-řetězcové a/nebo bi-specifické, apod. Aby se vylepšila pravděpodobnost produkce imunitní odpovědi, aminokyselinová sekvence NATu může být analyzována, aby se určila část molekuly, která by mohla být spojena se zvýšenou imunogenitou. Například, aminokyselinová sekvence může být podrobena počítačové analýze, aby se určily povrchové epitopy, podle metod Hopa a Wooda, v Proceedings of the National Academy of Science USA, Volume 78, strany 3824-3828 (1981).
Různé známé postupy mohou být použity pro produkci polyklonálních protilátek, které rozeznají epitopy NATu. Jako hostitel na produkci protilátky mohou být imunizována různá zvířata (bez omezení králíci, myši, krysy, atd.)
Různá adjuvans mohou být použita ke zvýšení imunologické odpovědi, v závislosti na hostitelském druhu, včetně a bez omezení Freundovo adjuvans, minerální gely jako je hydroxid hlinitý, (alum), povrchově aktivní látky, jako je lysolecitin, pluronové polyoly, polyanionty, peptidy, olejové emulse, hemocyanin z přílipky, dinitrofenol a potencionálně užitečné lidské adjuvans, jako je Bacilus Calmette-Guerin a Corynebacterinm parvum.
Pro přípravu monoklonálních protilátek účinných na NAT může být použita jakákoli technika, která umožňuje přípravu molekul protilátky v buněčné linii. Například, hybridomová metoda, původně vyvinuta Kohlerm a Milsteinem, která je popsána v Nátuře, Volume 256, strany 495-497 (1975), stejně jako trioma technika, metodika hybridomů lidských B-buněk popsaná Rozborem et al., v Immunology Today, Volume 4, strana 72 (1983) a EBV-hybridomová metodika •9 9999 * 9 • 99
0 0 0 0 • 9 · • 9 9 «9 9 • 9 9 9 • · 9 · produkce monoklonálních protilátek popsaná Coleem et al. v „Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., strany 77-96 (1985).Všechny tyto metody jsou použitelné pro přípravu monoklonálních protilátek v souladu s tímto vynálezem.
Protilátky tohoto vynálezu mohou být použity k léčebným účelům, jako je vazba a tím neutralizace nebo inhibice přebytečného množství NATu in vivo po podání. Protilátky mohou být dále použity k diagnostickým účelům, jako třeba ve značené formě k detekci přítomnosti NATu v tělních tekutinách, vzorcích tkáně nebo jiných extraktech, v souhlasu se známými diagnostickými metodami.
Příklady provedení vynálezu
Dále je vynález ilustrován následujícími příklady.
Příklad 1
Odvození sekvence NATu
Efektivní způsob výroby fibrolázy je exprimovat ji jako prefibrolázu, která je štěpena proteázou kex-2 na „prepo a „maturovanou část. (Získá se biologicky aktivní materiál („maturovaná fibroláza)).
V tomto uspořádání, vede syntéza a procesování prefibrolázy k sekreci maturované fibrolázy do kultivačního média. Skutečná sekvence v štěpeném místě je (...TKRjQQRF...) .
Kex-2 je endoproteáza která štěpí za dvěmi sousedními basickými aminokyselinami, v tomto případě lysinem (K)-argininem (R). Zralá fibroláza exprimovaná z DNA má, již výše zmíněný, N-koncový glutamínu (Q),který byl pozměněn deaminací a cyklizací na pyroglutamovou kyselinu (E). Tato chemická modifikace byla považována za nežádoucí, protože peptidy s N-koncovým cyklickým glutamínem (pyroglutamová kyselina) selhávaly při reakci v Edmanově odbourávání-aminokyselinovém sekvenování. Tudíž byly oba glutamíny (Q) na N-konci v sekvenci zralé fibrolázy odstraněny, a N-koncem se stal arginin (R). Protože kex-2 štěpí po dvou sousedních bazických aminokyselinách, jak bylo zmíněno, očekávalo se, že sekvence (...KRRF...), ukáže nejednoznačné místo pro štěpení kex-2.
• · φφ · · ·····«« « « • · * Φ Φ Φ
Proto byl N-koncový arginin (R ) (podtržený) nahrazen serinem (S) s výslednou sekvencí (...KRSF...) . Serin byl vybrán na základě potřeby vložení aminokyseliny, která usnadní štěpení kex-2, když se vyskytne na C-konci místa hydrolýzi. Rholam et al., European Journal of biochemistry, Volume 227, strany 707-714 (1995).
DNA sekvence preprofibrolázy byla modifikována metodou cílené mutageneze na N-konci kódující sekvence maturované fibrolázy, tak aby se nahradil kodón pro „QQR kodónem pro „S, použitím standardního PCR protokolu. Výsledkem je prepoNAT o aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO:3. Oligonukleotidy použité jako primery pro PCR reakce jsou sepsány dále a jejich homologie s cílovou sekvencí je také naznačena. Na začátku byly provedeny 2 PCR reakce za použití oligonukleotidů 1 a 4 v jednom páru a oligonukleotidy 2 a 3 v druhém páru primerů. Templátem byla DNA. PCR produkty těchto reakcí (601 a 815 nukleotidů dlouhé) byly následně přečištěny pomocí agarozové gelové elektroforézy a dále sloužily jako templát pro druhé kolo PCR za použití oligonukleotidů 1 a 2 jako primerů. Tento konečný PCR produkt (1372 nukleotidů dlouhý) byl štěpen restrikčními endonukleázami Xhol a Notl. Rozštěpená směs byla zbavena proteinu pomocí fenol/chloroformu a DNA vysrážena. Část této znovu získané DNA byla vložena do plazmidu pPICZa (Invitrogen, Carlsbad, CA, Katalogové č. VI95-20), který byl shodně naštěpen restrikčními endonukleázami Xhol a Notl, enzymaticky defosforylován a zbaven proteinu fenol/chloroformem.
Všechny další kroky byly prováděny podle příručky Expresního Kitu- Invitrogen Pichia (Invitrogen Corp., katalogové č. K1710-01). Produkty ligační reakce byly transformovány do E.coli pomocí elektroporace a ty selektovány na pevném médiu s zeocinem. Plasmid byl vyizolován a sekvence prefibrolázy byla ověřena DNA sekvenováním. Plasmid byl linearizován štěpením restrikční endonukleázou Pmel a dále transformován do Pichia pastoris
GS115his+. Rod GS115 je běžně his-, his+ genotyp byl obnoven transformací DNA, která kóduje divokou (wild-type) verzi genu bís4. Alternativně může být his+ druh získán komerčně od Invitrogenu (X-33 tkáňová kultura, katalogové č. C180-00). Úspěšně integrované komplexy byly selektovány jako kolonie rezistentní na zeocin. Kandidátní klony byly indukovány kultivačním médiem, které • 9 9··· • · 9 9 9 9 • · * 9 9 9 9
9 9999 9999 • 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 obsahovali methanol a kultura byla testována na produkci NATu na 420 % PAGE, barvením Coomassie.
Pro cílenou PCR mutagenezu byly použity následující oligonukleotidy:
Oligo 1 5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 8)
Oligo 2 5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3' (SEQ ID NO: 9)
Oligo 3 (SEQ ID NO: 10)
5'-TCCAATTAAACTTGACTAAGAGTCTTCCCACAAAGATACGTAC-3'
Oligo 4 (SEQ ID NO: 11)
5'-GTACGTATCTTTGTGGGAAAGATCTCTTAGTCAAGTTTAATTGG-3'
Umístění těchto oligonukleotidů je naznačeno níže na dvouvláknové sekvenci DNA (SEQ ID NO: 12 kódující nebo-li sens vlákno, SEQ ID NO: 13, komplementární nebo-li antisens vlákno) a korespondující aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO:14) fibrolázy (včetně prepo úseku). N-koncové a C-koncové oblasti maturované fibrolázy jsou označeny podtržením koncové aminokyselinové sekvence (QQRF a LNKP). N-koncová oblast (QQRF) je modifikována (nahrazení S za QQF). V oligonukleotidech 3 a 4, značí vložené pomlčky místo, kde byly vynechány kodóny kódující aminokyseliny QQ na N-konci fibrolázy.
4 * · 4 4
4 4 • 4 ·
4 * · · »
9 · • 4 ·
4 4 4 • 44«·· · ·
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCT
---------,+----------+---------+---------+.---------+---------+
TACTCTAAAGGAAGTTAAAAATGACGACAAAATAAGCGTCGTAGGAÓGCGTAATCGACGA
MRFPSIFTAV LFAASSALAA
CCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGT ---------+---------+---------+----------+---------+---------+
GGTCAGTTGTGATGTTGTCTTCTACTTTGCCGTGTTTAAGGCCGACTTCGACAGTAGCCA
PVNTTTE DETAQIPAEAVIG
TACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAAT
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ATGAGTCTAAATCTTCCCCTAAAGCTACAACGACAAAACGGTAAAAGGTTGTCGTGTTTA
YSDLEGDFDVAVL PFSNSTN
Oligo 1 5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'
AACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTA ——-----— —————— — 4—+
TTGCCCAATAACAAATATTTATGATGATAACGGTCGTAACGACGATTTCTTCTTCCCCAT
NGLLFINTTIASIAAKEEGV • 9 ·· ·
• · · · 9 9 9
9 9 *9999·· 9 9 • 99 · 9999 •9 9 99 99
Xhol I .
TCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTCTTCTATTATCTTGGAATCTGGTAACGTTAAC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
AGAGAGCTCTTTTCTCTCCGACTTCGAAGAAGATAATAGAACCTTAGACCATTGCAATTG
SLEKREAEASSIILESGNVN
GATTACGAAGTTGTTTATCCAAGAAAGGTCACTCCAGTTCCTAGGGGTGCTGTTCAACCA
----------h---------+---------+----------(-----------1----------+
CTAATGCTTCAACAAATAGGTTCTTTCCAGTGAGGTCAAGGATCCCCACGACAAGTTGGT
DYEVVYPRKVTPVPRGAVQP
AAGTACGAAGATGCCATGCAATACGAATTCAAGGTTAACAGTGAACCAGTTGTCTTGCAC
------------h-----------1-----------1-----------(-----------(----------+
TTCATGCTTCTACGGTACGTTATGCTTAAGTTCCAATTGTCACTTGGTCAACAGAACGTG
KYEDAMQYEFKVNSE.PVVLH
TTGGAAAAAAACAAAGGTTTGTTCTCTGAAGATTACTCTGAAACTCATTACTCCCCAGAT
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
AACCTTTTTTTGTTTCCAAACAAGAGACTTCTAATGAGACTTTGAGTAATGAGGGGTCTA
LEKNKGLFSEDYSETHYSPD
GGTAGAGAAATTACTACTTACCCATTGGGTGAAGATCACTGTTAGTACCATGGTAGAATC — --------------1--------—+---------+---------+---------+
CCATCTCTTTAATGATGAATGGGTAACCCACTTCTAGTGACAATGATGGTACCATCTTAG
GREITTYPLGEDHCYYHG RI gaaaacgatgctgactccactgcttctatctctgcttGtaacggtttgaagggtcatttc
---------+---------+---------+---------+---------+---------+ cttttgctacgactgaggtgacgaagatagagacgaacattgccaaacttcccagtaaag endadstasisacnglkghf aagttgcaaggtgaaatgtacttgattgaaccattggaattgtccgactctgaagcccat
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TTCAACGTTCCACTTTACATGAACTAACTTGGTAACCTTAACAGGCTGAGACTTCGGGTA
KLQGEMYLIEPLELSDSEAH ·· ··*·
GCTGTCTACAAGTACGAAAACGTCGAAAAGGAAGATGAAGCCCCAAAGATGTGTGGTGTT
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CGACAGATGTTCATGCTTTTGCAGCTTTTCCTTCTACTTCGGGGTTTCTACACACCACAA
AVYKYENVEKEDEAPKMCGV
Oligo 3 5'-TCCAATTAAACTTGACTAAG
ACCCAAAACTGGGAATCATATGAACCAATCAAGAAGGCCTTCCAATTAAACTTGACTAAG
--------------h----------H--------------------μ---------+
TGGGTTTTGACCCTTAGTATACTTGGTTAGTTCTTCCGGAAGGTTAATTTGAACTGATTC
Oligo 4 3'-GGTTAATTTGAACTGATTC
TQNWESYEPIKKAFQLNLTK
AGA------TCTTTCCCACAAAGATACGTAC-3'
AGACAACAAAGATTCCCACAAAGATACGTACAGCTGGTTATCGTTGCTGACCACCGTATG
---------'+---------+---------+---------+------«—+---------+
TCTGTTGTTTCTAAGGGTGTTTCTATGCATGTCGACCAATAGCAACGACTGGTGGCATAC TCT------AGAAAGGGTGTTTCTATGCATG-5'
R O O R F PQR YVQLVIVADHRM
AACACTAAATACAACGGTGACTCTGACAAAATCCGTCAATGGGTGCACCAAATCGTCAAC
---------+---------+---------+----------------+---------+
TTGTGATTTATGTTGCCACTGAGACTGTTTTAGGCAGTTACCCACGŤGGTTTAGCAGTTG
NTKYN GDSDKIRQWVHQIVN
ACCATTAACGAAATCTACAGACCACTGAACATCCAATTCACTTTGGTTGGTTTGGAAATC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
TGGTAATTGCTTTAGATGTCTGGTGACTTGTAGGTTAAGTGAAACCAACCAAACCTTTAG
TINEIYRPLNIQFTLVGLEI
TGGTCCAACCAAGATTTGATCACCGTTACTTCTGTATCCCACGACACTCTGGCATCCTTC
----------+---------+---------+---------+----------+---------+
ACCAGGTTGGTTCTAAACTAGTGGCAATGAAGACATAGGGTGCTGTGAGACCGTAGGAAG
WSNQDLITVTSVSHDTLASF • · « ««· * · • · · • ♦··· ·
GGTAACTGGCGTGAAACCGACCTGCTGCGTCGCCAACGTCATGATAACGCTCAACTGCTG ---------+---------+---------+---------+---------+---------+
CCATTGACCGCACTTTGGCTGGACGACGCAGCGGTTGCAGTACTATTGCGAGTTGACGAC
GNW RETDLLRRQRHDNAQLL
ACCGCTATCGACTTCGACGGTGATACTGTTGGTCTGGCTTACGTTGGTGGCATGTGTCAA
---------+---------+---------+---------+---------+ _.--------+
TGGCGATAGCTGAAGCTGCCACTATGACAACCAGACCGAATGCAACCACCGTACACAGTT
TAIDFDGDTVGLAYVGGMCQ
CTGAAACATTCTACTGGTGTTATCCAGGACCACTCCGCTATTAACCTGCTGGTTGCTCTG
---------+-------—+---------+---------+---------+---------+
GACTTTGTAAGATGACCACAATAGGTCCTGGTGAGGCGATAATTGGACGACCAACGAGAC
LKHSTGVI QDHSAINLLVAL
ACCATGGCACACGAACTGGGTCATAACCTGGGTATGAACCACGATGGCAACCAGTGTCAC — ------+.---------+--------—+---------+---------+---------+
TGGTACCGTGTGCTTGACCCAGTATTGGACCCATACTTGGTGCTACCGTTGGTCACAGTG
TMAHELGHNLGMNHDGNQCH
TGCGGTGCAAACTCCTGTGTTATGGCTGCTATGCTGTCCGATCAACCATCCAAACTGTTC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
ACGCCACGTTTGAGGACACAATACCGACGATACGACAGGCTAGTTGGTAGGTTTGACAAG
CGANSCVMA AMLSD QPSKLF
TCCGACTGCTCTAAGAAAGACTACCAGACCTTCCTGACCGTTAACAACCCGCAGTGTATC
---------+---------+---------+---------+---------+---------+
AGGCTGACGAGATTCTTTCTGATGGTCTGGAAGGACTGGCAATTGTTGGGCGTCACATAG
SDCSKKDYQT FLTVNNPQCI
Notl
CTGAACAAACCGTAAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGAT _________+---------+---------+-------------------+---------+
GACTTGTTTGGCATTCGCCGGCGGTCGAAAGATCTTGTTTTTGAGTAGAGTCTTCTCCTA
L N K P *AAAS .FLEQKLISEED ·» 4*·» •4 4444 ·
4444 44 4
4 4444 44 4
4 444 4444444 4 4 • 444 44 4 4444
44 ·· « 44 44
CTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCATTGAGTTTGTAGCCITAGACATGAC
---------Η-----------Η---------+---------+---------+---------+
GACTTATCGCGGCAGCTGGTAGTAGTAGTAGTAGTAACTCAAACATCGGAATCTGTACTG
LNSAVDHHHHHH*VCSLRHD
TGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAG
---------+----------h---------4----------+----------).---------+
ACAAGGAGTCAAGTTCAACCCGTGAATGCTCTTCTGGCCAGAACGATCTAAGATTAGTTC
CSSVQ. VGHLREDRSC*ILIK
AGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATT
---------+ —i-------+---------M----------+---------+---------+
TCCTACAGTCTTACGGTAAACGGACTCTCTACGTCCGAAGTAAAAACTATGAAAAAATAA CCTACAGTCTTACGGTAAACG-5' Oligo 2
RMSECHLPERCRLHF*YFFI
9999
9 9
9 9
9 9 9
9 9 9
99 ·* ···· ·> · • · · · 9 9
9 9 9 9 9 9 • · · · · 9 9 999 • · · · · · · ·· 99 99 9
Příklad 2
Exprese NATu v Pichia pastoris
Při pokusech exprimovat DNA NATu v E.coli, velmi slabé sbalení do sekundární struktury a požadavek na zředěné podmínky snížily efektivitu purifikace. Tyto a jiné úvahy vedly k použití druhu kvasinek Pichia pastoris jako hostitelské buňky. Kultura selektovaných buněčných klonů Pichia pastoris, které byly transfekovány cDNA prepo NATu (SEQ ID NO: 4) byla inokulována do 500 ml inokulačního růstového média, popsaného zde:
Na 1 litr média
Kvasničný extrakt 30,0 g
Fosforečnan draselný dihydrát 17,2 g
Glukóza 20,0 g
Biotin 0,004 g
Voda do 1 litru
Fosforečná kyselina, 85% upravit pH na 6,00
Transfekované P.pastoris byly inkubovány ve 30 °C ve třepačce po dobu 30-32 hodin. Přibližně 1% (hmotnostní) výsledné kultury bylo použito jako inokulum do 10-ti litrového fermentoru. Fermentor obsahoval sterilní základní soli a glukózu (níže) . Dvanáct mililitrů na litr PTM4 solí (PTM4 je roztok stopových kovů obsahující síran měďný pentahydrát, jodid sodný, síran hořečnatý monohydrát, molybdan sodný dihydrát, kyselina boritá, chlorid kobaltnatý hexahydrát, chlorid zinečnatý, síran železnatý heptahydrát, d-biotin, kyselina sírová a purifikovaná voda) bylo přidáno do litrové dávky média po sterilizaci fermentoru. Růstová teplota ve fermentoru byla 30°C. pH ve fermentoru bylo regulováno hydroxidem amonným a kyselinou fosforečnou na hodnotu 6.00. Zinek ze zinečnatých solí, které byly přidány do média byly inkorporovány do NATu jako součást struktury metaloproteinázy.
Základní soli na litrovou dávku média
Fosforečná kyselina, 85% 26,7 ml
Síran vápenatý 0,93 g
Síran draselný 18,2 g
Síran hořečnatý-7 H2O 14,9 g
·· ··
Hydroxid draselný Glukóza
Voda
4,13 g 30,0 g do 1 litru
Kultura se nechá růst, dokud není veškerá glukóza spotřebována (17 až 20 hodin). Potom se začne se „sytící fází. „Sytící médium je tvořeno glukózou a 12 ml PTM4 solí na 1 litr. Indukce sycení se sestává z glukózy, 25% metanolu, a 12 ml PTM4 solí na 1 litr. Při indukci je teplota reaktoru 20°C. Indukční fáze trvá 60 až 75 hodin. Upravená média byla sklizena a buněčné zbytky byly vyhozeny.
Příklad 3
Purifikace NATu z Pichia pastoris
Kvasinková živná půda z Příkladu 2 byla vyčištěna a upraveno pH na 6,5 a vodivost 10-20mS/ cm. Živná půda byla nalita na imobilizovanou kovovou afinitní pryskyřici, která byla naplněna mědí a ekvilibrována fosfátovým pufrem (PBS). Pryskyřice byla opláchnuta v PBS a vymývána gradientem imidazolu (0-100 mM) v PBS. Frakce, které obsahovaly maturovaný NAT (SEQ ID No:l) byly dány dohromady a ředěny dokud vodivost nebyla nižší než 1,5 mS/cm, pH 6,4. Ředěný vzorek byl nalit na SP Sefarózovou pryskyřici (Amersham Pharmacia Biotech, lne., Piscataway, NJ) , která byla ekvilibrována 10 mM 2-(Nmorfolino)ethan-sírovou kyselinou (MES). Kolona byla omyta pomocí MES a eluována a vymyta pomocí gradientu NaCl (0-500mM) v MES.
Frakce, které obsahovaly NAT byly dány dohromady a uschovány.
Příklad 4
Trombolýza v akutní trombóze v krysí krkavici, porovnání NATu s Urokinázou
Aby se prokázala biologická aktivita a funkční jednoznačnost maturovaného NATu (SEQ ID NO:1) byly provedeny farmakologické studie na krysách. Anodovým proudem bylo vytvořeno ohniskové poškození na jedné krkavici. Toto poškození vyvolalo do 15 minut vytvořeni okluzivni krevní sraženiny. Po vytvoření trombu, byla tepna ještě po 30 minut pozorována, zda je okluze krkavice stabilní. Poté byl aplikován intravenózně heparin a aspirin, aby se předešlo šíření trombu. Zvířata byla léčena pomocí intra-arteriálních infuzí testované látky. Byl sledován průtok krve krkavicí během podávání testovaného materiálu, takže úspěšné rozpuštění krevní sraženiny mohlo být detekováno a také mohl být zaznamenán čas lýzy. Procenta pokusů, kdy byla sraženina rozpuštěna byly zaznamenány a vypočítán průměr pouze u těch, kde byla sraženina úspěšně rozpuštěna. Protože je měřen hemoragický potenciál testované látky, všechna krev která byla vyloučena z operačního místa byla sbírána gázovými tampóny. Tampóny byly umístěny do roztoku detergentu, aby se rozpustily červené krvinky a množství uvolněného hemoglobinu bylo poté měřeno spektrofotometricky.
Podle množství vysušeného hemoglobinu byly vypočítány ztráty krve. Data získaná v testech jsou uvedena v tabulce dále.
Table 1
Výskyt lýzy krevní sraženiny, čas za který došlo k rozpuštění sraženiny a operační ztráty krve (průměr ± standardní odchylka)
VÝSKYT LÝZY <%) ČAS (min) KREVNÍ ZTRÁTY (ml)
FYZIOLOGICKÝ ROZTOK (n=6) 0% ( 0 ze 6) NEMĚŘENO 0,10 ±0,23
Urokináza 25 U/ min (n=15) 33% (5 z 15) 55,3 ± 15,9 1,06 ± 1,59
Urokináza 250 U/ml (n=15) 86 % (13 z 15) 33,5 ± 15,3 1,43 ± 1,45
NAT 2mg (n=14) 78% (11 z 14) 6,3 ± 5,8 0,96 ± 0,77
Tyto studie prokazují, že NAT je biologicky aktivní na zvířecím modelu v in vivo lýze krevní sraženiny.
Dále, rozpuštění krevní sraženiny bylo dosaženo ve značně kratším čase a s menšími ztrátami krve z operačního místa, v porovnání s urokinázou. Tak profil aktivity NATu může být odlišen od třídy plasminogen-aktivátorů trombolytických činitelů •» · • · (reprezentovaných urokinázou), tak že rozpuštění krevní sraženiny NATem proběhne rychleji a se sníženými hemoragickými komplikacemi.
Fibrinolytická aktivita NATu je srovnatelná s firolázou. A navíc, jak bylo zmíněno výše, stabilita N-konce NATu vede k větší homogenitě koncového produktu při rekombinantní expresi, což je nesporná výhoda (např. N-konec se v čase nemění na směs různých forem, což vytváří stabilnější polypeptid).
99 9
Obrázek 1
MRFPSIFTAV
YSDLEGDFDV
SLEKREAEAS
KYEDAMQYEF
GREITTYPLG
KLQGEMYLIE
TONWESYEPI
KYNGDSDKIR
NQDLITVTSV
IDFDGDTVGL
AHELGHNLGM
CSKKDYQTFL
LFAASSALAA
AVLPFSNSTN
SIILESGNVN
KVNSEPWLH
EDHCYYHGRI
PLELSDSEAH
KKAFQLNLTK
QWVHQIVNTI
SHDTLASFGN
AYVGGMCQLK
NHDGNQCHCG
TVNNPQCILN
PVNTTTEDET
NGLLFINTTI
DYEWYPRKV
LEKNKGLFSE
ENDADSTASI
AVYKYENVEK
RSFPQRYVQL
NEIYRPLNIQ
WRETDLLRRQ
HSTGVIQDHS
ANSCVMAAML
KP
AQIPAEAVIG
ASIAAKEEGV
TPVPRGAVQP
DYSETHYSPD
SACNGLKGHF
EDEAPKMCGV
VIVADHRMNT
Etlvgleiws
RHDNAQLLTA
AINLLVALTM
SDQPSKLFSD • · ···· · · • · · · • · · * · · · · • · · · · ©-· ·· ♦·
Seznam sekvencí <110> Boone, Thomas C.
Li, Huimin Mann, Michael B.
<120> Fybrinolyticky aktivní polypeptid <130> A-596 <140> 09/411,329 <141> 1999-10-01 <160> 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 201 PRT <213> umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: NAT (analog fibrolázy z Agkistrodon contortrix) <400> 1
Ser 1 Phe Pro Gin Arg 5 Tyr Val Gin Leu Val 10 Ile Val Ala Asp His 15 Arg
Met Asn Thr Lys 20 Tyr Asn Gly Asp Ser 25 Asp Lys Ile Arg Gin 30 Trp Val
His Gin Ile 35 Val Asn Thr Ile Asn 40 Glu Ile Tyr Arg Pro 45 Leu Asn Ile
Gin Phe 50 Thr Leu Val Gly Leu 55 Glu Ile Trp Ser Asn .60 Gin Asp Leu Ile
Thr 65 Val Thr Ser Val Ser 70 His Asp Thr Leu Ala 75 Ser Phe Gly Asn Trp 80
Arg Glu Thr Asp Leu 85 Leu Arg Arg Gin Arg 90 His Asp Asn Ala Gin 95 Leu
Leu Thr Ala Ile 100 Asp Phe Asp Gly Asp 105 Thr Val Gly Leu Ala 110 Tyr Val
Gly Gly Met 115 Cys Gin Leu Lys His 120 Ser Thr Gly Val Ile 125 Gin Asp His
Ser Ala 130 Ile Asn Leu Leu Val 135 Ala Leu Thr Met Ala 140 His Glu Leu Gly
His 145 Asn Leu Gly Met Asn 150 His Asp Gly Asn Gin 155 Cys His Cys Gly Ala 160
• ·
Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gin Pro Ser Lys Leu
165 170 175
Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gin Thr Phe Leu Thr Val Asn
180 185 190
Asn Pro Gin Cys Ile Leu Asn Lys Pro
195 200 <210> 2 <211> 603 <212> DNA <213> umělá sekvence <220>
<223> pOpis umělé sekvence: kódující NAT (analog fibrolázy) <400> 2 tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60 tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatqgtcaa caccattaac 120 gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180 caagatttga tcaccgttac ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240 cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300 gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360 tctactggtg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420 cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480 aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540 tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600 ccg 603 <210> 3 <211> 462 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> pOpis umělé sekvence: Nativní pro-NAT (analog fibrolázy)
<400> 3 Met Arg 1 Phe Pro Ser 5 Ile Phe Thr Ala Val 10 Leu Phe Ala Ala Ser 15 Ser
Ala Leu Ala Ala. 20 Pro Val Asn Thr Thr 25 Thr Glu Asp Glu Thr 30 Ala Gin
Ile Pro Ala 35 Glu Ala Val Ile Gly 40 Tyr Ser Asp Leu Glu 45 Gly Asp Phe
Asp Val 50 Ala Val Leu Pro Phe 55 Ser Asn Ser Thr Asn 60 Asn Gly Leu Leu
• · · • · ··· · • ·· ·
Phe 65 Ile Asn Thr Thr Ile 70 Ala Ser Ile Ala Ala 75 Lys Glu Glu Gly Val 80
Ser Leu Glu Lys Arg 85 Glu Ala Glu Ala Ser 90 Ser Ile Ile Leu Glu 95 Ser
Gly Asn Val Asn 100 Asp Tyr Glu Val Val 105 Tyr Pro Arg Lys Val 110 Thr Pro
Val Pro Arg 115 Gly Ala Val Gin Pro 120 Lys Tyr Glu Asp Ala 125 Met Gin Tyr
Glu Phe 130 Lys Val Asn Ser Glu 135 Pro Val Val Leu His 140 Leu Glu Lys Asn
Lys 145 Gly Leu Phe Ser Glu 150 Asp Tyr Ser Glu Thr 155 His Tyr Ser Pro Asp 160
Gly Arg Glu Ile Thr 165 Thr Tyr Pro Leu Gly 170 Glu Asp His Cys Tyr 175 Tyr
His Gly Arg Ile 180 Glu Asn Asp Ala Asp 185 Ser Thr Ala Ser • Ile 190 Ser Ala
Cys Asn Gly 195 Leu Lys Gly His Phe 200 Lys Leu Gin Gly Glu 205 Met Tyr Leu
Ile Glu 210 Pro Leu Glu Leu Ser 215 Asp Ser Glu Ala His 220 Ala Val Tyr Lys
Tyr 225 Glu Asn Val Glu Lys 230 Glu Asp Glu Ala Pro 235 Lys Met Cys Gly Val 240
Thr Gin Asn Trp Glu 245 Ser Tyr Glu Pro Ile 250 Lys Lys Ala Phe Gin 255 Leu
Asn Leu Thr Lys 260 Arg Ser Phe Pro Gin 265 Arg Tyr Val Gin Leu 270 Val Ile
Val Ala Asp 275 His Arg Met Asn Thr 280 Lys Tyr Asn Gly Asp 285 Ser Asp Lys
Ile Arg 290 Gin Trp Val His Gin 295 Ile val Asn Thr Ile 300 Asn Glu Ile Tyr
Arg 305 Pro Leu Asn Ile Gin 310 Phe Thr Leu Val Gly 315 Leu Glu Ile Trp Ser 320
Asn Gin Asp Leu Ile 325 Thr Val Thr Ser Val 330 Ser His Asp Thr Leu 335 Ala
Ser Phe Gly Asn 340 Trp Arg Glu Thr Asp 345 Leu Leu Arg Arg Gin 350 Arg His
Asp Asn Ala Gin Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val
355 360 365 ····
• · A ·· ·
Gly Leu 370 Ala Tyr Val Gly Gly 375 Met Cys Gin Leu Lys 380 His Ser Thr Gly
Val 385 Ile Gin Asp His Ser 390 Ala Ile Asn Leu Leu’ Val 395 Ala Leu Thr Met 400
Ala His Glu Leu Gly 405 His Asn Leu Gly Met 410 Asn His Asp Gly Asn 415 Gin
Cys His Cys Gly 420 Ala Asn Ser Cys Val 425 Met Ala Ala Met Leu 430 Ser Asp
Gin Pro Ser 435 Lys Leu Phe Ser Asp 440 Cys Ser Lys Lys Asp 445 Tyr Gin Thr
Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gin Cys Ile Leu Asn Lys Pro
450 455 460 <210> 4 <211> 1386 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> ρΟρί3 umělé sekvence: kóduje pro-NAT (analog fibrolázy) <400> 4 atgagatttc ccagtcaaca tactcagatt aacgggttat tctctcgaga gattacgaag aagtacgaag ttggaaaaaa ggtagagaaa gaaaacgatg aagttgcaag gctgtctaca acccaaaact agatctttcc aaatacaacg aacgaaatct aaccaagatt tggcgtgaaa atcgacttcg cattctactg gcacacgaac gcaaactcct tgctctaaga aaaccg cttcaatttt ctacaacaga tagaagggga tgtttataaa aaagagaggc ttgttcatcc atgccatgca acaaaggttt ttactactta ctgactccac gtgaaatgta agtacgaaaa gggaatcata cacaaagata gtgactctga acagaccact tgatcaccgt ccgacctgct acggtgatac gtgttatcca tgggtcataa gtgttatggc aagactacca tactgctgtt agatgaaacg tttcgatgtt tactactatt tgaagcttct aagaaaggtc atacgaattc gttctctgaa cccattgggt tgcttctatc cttgattgaa cgtcgaaaag tgaaccaatc cgtacagctg caaaatccgt gaacatccaa tacttctgta gcgtcgccaa tgttggtctg ggaccactcc cctgggtatg tgctatgctg gaccttcctg ttattcgcag gcacaaattc gctgttttgc gccagcattg tctattatct actccagttc aaggttaaca gattactctg gaagatcact tctgcttgta ccattggaat gaagatgaag aagaaggcct gttatcgttg caatgggtgc ttcactttgg tcccacgaca cgtcatgata gcttacgttg gctattaacc aaccacgatg tccgatcaac accgttaaca catcctccgc cggctgaagc cattttccaa ctgctaaaga
Cggaatctgg ctággggtgc gtgaaccagt .aaactcatta gttactacca acggtttgaa tgtccgactc ccccaaagat tccaattaaa ctgaccaccg accaaatcgt ttggtttgga ctctggcatc acgctcaact gtggcatgtg tgctggttgc gcaaccagtg catccaaact acccgcagtg attagctgct 60 tgtcatcggt 120 cagcacaaat 180 agaaggggta 240 taacgttaac 300 tgttcaacca 360 tgtcttgcac 420 ctccccagat 480 tggtagaatc 540 gggtcatttc 600 tgaagcccat 660 gtgtggtgtt 720 cttgactaag 780 tatgaacact 840 caacaccatt 900 aatctggtcc 960 cttcggtaac 1020 gctgaccgct 1080 tcaactgaaa 1140 tctgaccatg 1200 tcactgcggt 1260 gttctccgac 1320 tatcctgaac 1380
1386 • · « · · · <210> 5 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Nativní fibroláza z Agkistrodon contortrix <400> 5
Gin 1 Gin Arg Phe Pro 5 Gin Arg Tyr Val Gin Leu Val Ile Val Ala Asp
10 15
His Arg Met Asn Thr 20 Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp 25 Lys Ile Arg Gin 30
Trp Val His 35 Gin Ile Val Asn Thr Ile Asn Glu Ile 40 Tyr Arg Pro Leu 45
Asn Ile 50 Gin Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp 55 60 Ser Asn Gin Asp
Leu 65 Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu 70 75 Ala Ser Phe Gly 80
Asn Trp Arg Glu Thr 85 Asp Leu Leu Arg Arg Gin Arg 90 His Asp Asn Ala 95
Gin Leu Leu Thr Ala 100 Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr 105 Val Gly Leu Ala 110
Tyr Val Gly 115 Gly Met Cys Gin Leu Lys His Ser Thr 120 Gly Val Ile Gin 125
Asp His 130 Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr 135 140 Met Ala His Glu
Leu 145 Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn 150 155 Gin Cys His Cys 160
Gly Ala Asn Ser Cys 165 Val Met Ala Ala Met Leu Ser 170 Asp Gin Pro Ser 175
Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gin 180 185 Val Asn Asn Pro Gin Cys Ile Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 6 <211> 609 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> Thr Phe Leu Thr 190
<223> Kóduje nativní fibrolázu z Agkistrodon contortrix
• · · · · · • · . · · · · · · <400> 6 caacaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60 actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120 attaacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcacCt tggttggttt ggaaatctgg 180 tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240 aactggcgtg aaaccgácct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300 gctatcgact ccgacggtga tactgttggt ctggcttacg _ttggtggcat gtgtcaactg 360 aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420 atggcacacg aactgggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480 ggtgcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540 gactgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600 aacaaaccg 6Qq <210> 7 <211> 1392 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Kódující sekvence nativní pro-fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 7 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt aacgggttat tgtttataaa tactactatt tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc aagtacgaag atgccatgca atacgaattc ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc agacaacaaa gattcccaca aagatacgta aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa accattaacg aaatctacag accactgaac tggtccaacc aagatttgat caccgttact ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt accgctatcg, acttcgacgg tgatactgtt ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac accatggcac acgaactggg tcataacctg tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ctgaacaaac cg ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840 atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900 atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960 tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020 cgccaacgtc atgataacgc tcaactgčtg 1080 ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140 cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200 ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260 atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320 ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380
1392 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> umělá sekvence • · · · •« · • · · · <220>
<223> ρΟρϊ3 umělé sekvence: Oligonukleotid <400> 8 tactattgcc agcattgctg c <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> popis umělé sekvence: Oligonukleotid <400> 9 cctacagtct tacggtaaac g <210> 10 <211> 45 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Oligonukleotid <400> 10 tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtac <210> 11 <211> 44 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: Oligonukleotid <400> 11 ggttaatttg aactgattct ctagaaaggg tgtttctatg catg <210> 12 <211> 1620 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>
<221> misc_feature <222> Komplement ( (1) . . (1620)) β · 0·0 ·
9··· <223> KortlPlementární (sens) řetězec k antisensovému řetězci (viz SEQ ID NO:13) <220>
<223> Kódující sekvence nativní pro-fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 12 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgaťgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttacaaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gactacgaag ttgtttatcc aagaaaggcc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa jjgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840 aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtqcacca aatcgtcaac 900 accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960 tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020 ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080 accgctatcg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140 ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200 accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260 tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320 tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380 ctgaacaaac cgtaagcggc cgccagcttt ctagaacaaa aactcatctc agaagaggat 1440 ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcattgag tttgtagcct tagacatgac 1500 tgttcctcag ttcaagttgg gcacttacga gaagaccggt cttgctagat tctaatcaag 1560 aggatgtcag aatgccattt gcctgagaga tgcaggcttc atttttgata cttttttatt 1620 <210> 13 <211> 1620 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>
<221> misc_feature <222> Complement((1)..(1620)) <223> Komplementární (antisens) řetězec k sens řetězci (viz SEQ ID No:12) <220>
<223> Anti-kódující sekvence nativní pro-fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 13 aataaaaaag tatcaaaaat gaagcctgca tctctcaggc aaatggcatt ctgačatcct 60 cttgattaga atctagcaag accggtcttc tcgtaagtgc ccaacttgaa ctgaggaaca 120 gtcatgtcta aggctacaaa ctcaatgatg atgatgacga tggtcgacgg cgctattcag 180
99 9
9 9·· »··· « · » 9 · 9 • 9 99 atcctcttct gagatgagtt ctcgttctag aaagctggcg gccgcttacg gtttgttcag 240 gatacactgc gggttgttaa cggtcaggaa ggtctggtag tctttcttag agcagtcgga 300 gaacagtttg gatggttgat cggacagcat agcagccata acacaggagt ttgcaccgca 360 gtgacactgg ttgccatcgt ggttcatacc caggttatga cccagttcgt gtgccatggt 420 cagagcaacc agcaggttaa tagcggagtg gtcctggaca acaccagtag aatgtttcag 480 ttgacacatg ccaccaacgt aagccagacc aacagtatca ccgtcgaagt cgatagcggt 540 cagcagttga gcgttatcat gacgctggcg acgcagcagg tcggtttcac gccagttacc 600 gaaggatgcc agagtgtcgt gggatacaga agtaacggtg atcaaatctt ggttggacca 660 gatttccaaa ccaaccaaag tgaattggat gttcagtggt ctgtagatte cgttaatggt 720 gttgacgatt tggtgcaccc attgacggat tttgtcagag tcaccgttgt atttagtgtt 780 catacggtgg tcagcaacga taaccagctg tacgtatctt tgtgggaatc tttgttgtct 840 cttagtcaag tttaattgga aggccttctt gattggttca tatgattccc agttttgggt 900 aacaccacac atctttgggg cttcatcttc cttttcgacg ttttcgtact tgtagacagc 960 atgggcttca gagtcggaca attccaatgg ttcaatcaag tacatttcac cttgcaactt 1020 gaaatgaccc ttcaaaccgt tacaagcaga gatagaagca gtggagtcag catcgttttc 1080 gattctacca tggtagtaac agtgatcttc acccaatggg taagtagtaa tttctctacc 1140 atctggggag taatgagttt cagagtaatc ttcagagaac aaacctttgt ttttttccaa 1200 gtgcaagaca actggttcac tgttaacctt gaattcgtat tgcatggcat cttcgtactt 1260
Cggttgaaca gcacccctag gaactggagt gacctttct.t ggataaacaa cttcgtaatc 1320 gttaacgtta ccagattcca agataataga agaagcttca gcctctcttt tctcgagaga 1380 taccccttct tctttagcag eaatgctggc aatagtagta tttataaaca ataacccgtt 1440 atttgtgctg ttggaaaatg gcaaaacagc aacatcgaaa tccccttcta aatctgagta 1500 accgatgaca gcttcagccg gaatttgtgc cgtttcatct tctgttgtag tgttgactgg 1560 agcagctaat gcggaggatg ctgcgaataa aacagcagta aaaattgaag gaaatctcat 1620 <210> 14 <211> 540 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Xaa na pozicích 465, 493, 516 a 536 značí stop kodóny.
<220>
<223> Nativní pro-fibroláza z Agkistrodon contortrix <400> 14
Met 1 Arg Phe Pro Ser 5 Ile Phe Thr Ala Val 10 Leu Phe Ala Ala Ser 15 Ser
Ala Leu Ala Ala 20 Pro Val Asn Thr Thr 25 Thr Glu Asp Glu Thr 30 Ala Gin
Ile Pro Ala 35 Glu Ala Val Ile Gly 40 Tyr Ser Asp Leu Glu 45 Gly Asp Phe
Asp Val 50 Ala Val Leu Pro Phe 55 Ser Asn Ser Thr Asn 60 Asn Gly Leu Leu
Phe 65 Ile Asn Thr Thr Ile 70 Ala Ser Ile Ala Ala 75 Lys Glu Glu Gly Val 80
Ser Leu Glu Lys Arg 85 Glu Ala Glu Ala Ser 90 Ser Ile Ile Leu Glu 95 Ser
·♦··
Gly Asn Val Asn 100 Asp Tyr Glu Val Val 105 Tyr Pro Arg Lys Val 110 Thr Pro
Val Pro Arg 115 Gly Ala Val Gin Prc 120 Lys Tyr Glu Asp Ala 125 Met Gin Tyr
Glu Phe 130 Lys Val Asn Ser Glu 135 Pro Val Val Leu .His 140 Leu Glu Lys Asn
Lys 145 Gly Leu Phe Ser Glu 150 Asp Tyr Ser Glu Thr 155 His Tyr Ser Pro Asp 160
Gly Arg Glu Ile Thr 165 Thr Tyr Pro Leu Gly 170 Glu Asp His Cys Tyr 175 Tyr
His Gly Arg Ile 180 Glu Asn Asp Ala Asp 185 Ser Thr Ala Ser Ile 190 Ser Ala
Cys Asn Gly 195 Leu Lys Gly His Phe 200 Lys Leu Gin Gly Glu 205 Met Tyr Leu
Ile Glu 210 Pro Leu Glu Leu Ser 215 Asp Ser Glu Ala His 220 Ala Val Tyr Lys
Tyr 225 Glu Asn Val Glu Lys 230 Glu Asp Glu Ala Pro 235 Lys Met Cys Gly Val 240
Thr Gin Asn Trp Glu 245 Ser Tyr Glu Pro Ile 250 Lys Lys Ala Phe Gin 255 Leu
Asn Leu Thr Lys 260 Arg Gin Gin Arg Phe 265 Pro Gin Arg Tyr Val 270 Gin Leu
Val Ile Val 275 Ala Asp His Arg Met 280 Asn Thr Lys Tyr Asn 285 Gly Asp Ser
Asp Lys 290 Ile Arg Gin Trp Val 295 His Gin Ile Val Asn 300 Thr Ile Asn Glu
Ile 305 Tyr Arg Pro Leu Asn 310 Ile Gin Phe Thr Leu 315 Val Gly Leu Glu Ile 320
Tip Ser Asn Gin Asp 325 Leu Ile Thr Val Thr 330 Ser Val Ser His Asp 335 Thr
Leu Ala Ser Phe 340 Gly Asn Trp Arg Glu 345 Thr Asp Leu Leu Arg 350 Arg Gin
Arg His Asp 35S Asn Ala Gin Leu Leu 360 Thr Ala Ile Asp Phe 365 Asp Gly Asp
Thr Val 370 Gly Leu Ala Tyr Val 375 Gly Gly Met Cys Gin 380 Leu Lys His Šer
Thr 385 Gly Val Ile Gin Asp 390 His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu
395 400
Thr Met Ala His Glu Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly
405 410 415
Asn Gin Cys His Cys Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu
420 425 430
Ser Asp Gin Pro Ser Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr
435 440 445
Gin Thr Phe Leu Thr Val Asn Asn Pro Gin Cys Ile Leu Asn Lys Pro
450 455 460
Xaa Ala Ala Ala Ser Phe Leu Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp
465 470 475 480
Leu Asn Ser Ala Val Asp His His His His His His Xaa Val Cys Ser
485 490 495
Leu Arg His Asp Cys Ser Ser Val Gin Val Gly His Leu Arg Glu Asp
500 505 • 510
Arg Ser Cys Xaa Ile Leu Ile Lys Arg Met Ser Gly Cys His Leu Pro
515 520 525
Glu Arg Cys Arg Leu His Phe Xaa Tyr Phe Phe Ile
530 535 540
<210> 15 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Nativní fibroláza z Agkistrodon contortrix <220>
<223> xaa na pozici 1 zastupuje chemickou sloučeninu
-kyselinu pyroglutamovou. Táto chemická sloučenina je označovaná v seznamu písmenemE.
<400> 15 Gin Leu Val Ile Val Ala Asp
Xaa Gin 1 Arg Phe Pro 5 Gin Arg Tyr Val
10 15
His Arg Met Asn Thr 20 Lys Tyr Asn Gly 25 Asp Ser Asp Lys Ile Arg Gin 30
Trp Val His Gin Ile 35 Val Asn Thr 40 Ile Asn Glu Ile Tyr Arg Pro Leu 45
Φ· φφφφ φφ φφφφ
Asn Xle 50 Gin Phe Thr Leu Val 55 Gly Leu Glu Ile Trp 60 Ser Asn Gin Asp
Leu 65 Ile Thr Val Thr Ser 70 Val Ser His Asp Thr 75 Leu Ala Ser Phe Gly 80
Asn Trp Arg Glu Thr 85 Asp Leu Leu Arg Arg 90 Gin Arg His Asp Asn 95 Ala
Gin Leu Leu Thr 100 Ala Ile Asp Phe Asp 105 Gly Asp Thr Val Gly 110 Leu Ala
Tyr Val Gly 115 Gly Met Cys Gin Leu 120 Lys His Ser Thr Gly 125 Val Ile Gin
Asp His 130 Ser Ala Ile Asn Leu 135 Leu Val Ala Leu Thr 140 Met Ala His Glu
Leu 145 Gly His Asn Leu Gly 15£ Met Asn His Asp Gly 155 Asn Gin Cys His Cys 160
Gly Ala Asn Ser Cys 165 Val Met Ala Ala Met 170 Leu Ser Asp • Gin Pro 175 Ser
Lys Leu Phe Ser 180 ASP Cys Ser Lys Lys 185 Asp Tyr Gin Thr Phe 190 Leu Thr
Val Asn Asn 195 Pro Gin Cys Ile Leu 200 Asn Lys Pro
<210> 16 <211> 202 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Nativní fibroláza z Agkistrodon contortrix <220>
<223> xaa na pozici 1 zastupuje chemickou sloučeninu
-kyselinu pyroglutamovou. Tato chemická sloučenina
je označovaná v seznamu písmenemE.
<400> 16
Xaa 1 Arg Phe Pro Gin Arg 5 Tyr Val Gin Leu Val Ile Val Ala Asp His 10 15
Arg Met Asn Thr Lys Tyr 20 Asn Gly Asp 25 Ser Asp Lys Ile Arg Gin Trp 30
Val His Gin 35 Ile Val Asn Thr Ile Asn 40 Glu Ile Tyr Arg Pro Leu Asn 45
·*«·
999·
Ile Gin 50 Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu Ile Trp Ser Asn Gin Asp Leu
55 60
Ile Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn
65 70 75 80
Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gin Arg His Asp Asn Ala Gin
85 90 95
Leu Leu Thr Ala Ile Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr
100 105 110
Val Gly Gly Met Cys Gin Leu Lys His Ser Thr Gly Val Ile Gin Asp
115 120 125
His Ser Ala Ile Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu
130 135 140
Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gin Cys His Cys Gly
145 150 155 160
Ala Asn Ser Cys Val *% Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gin Pro Ser Lys
165 170 • 175
Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gin Thr Phe Leu Thr Val
180 185 • 190
Asn Asn Pro Gin Cys Ile Leu Asn Lys Pro
195 200
<210> 17 <211> 538 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>
<223> Popis umělé sekvence: analog nativní pro-fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 17
Met 1 Arg Phe Pro Ser 5 Ile Phe Thr Ala Val 10 Leu Phe Ala Ala Ser 15 Ser
Ala Leu Ala Ala 20 Pro Val Asn Thr Thr 25 Thr Glu Asp Glu Thr 30 Ala Gin
Ile Pro Ala 35 Glu Ala Val Ile Gly 40 Tyr Ser Asp Leu Glu 45 Gly Asp Phe
Asp Val 50 Ala Val Leu Pro Phe 55 Ser Asn Ser Thr Asn 60 Asn Gly Leu Leu
Phe 65 Ile Asn Thr Thr Ile 70 Ala Ser Ile Ala Ala 75 Lys Glu Glu Gly Val 80
·· 4444 > 4 4 «
44
Ser Leu Glu Lys Arg 85 Glu Ala Glu Ala Ser 90 Ser Ile Ile Leu Glu 95 Ser
Gly Asn Val Asn 100 Asp Tyr Glu Val Val 105 Tyr Pro Arg Lys Val 110 Thr Pro
Val Pro Arg 115 Gly Ala Val Gin Pro 120 Lys Tyr Glu Asp Ala 125 Met Gin Tyr
Glu Phe 130 Lys Val Asn Ser Glu 135 Pro Val Val Leu His 140 Leu Glu Lys Asn
Lys 145 Gly Leu Phe Ser Glu 150 Asp Tyr Ser Glu Thr 155 His Tyr Ser Pro Asp 160
Gly Arg Glu Ile Thr 165 Thr Tyr Pro Leu Gly 170 Glu Asp His Cys Tyr 175 Tyr
His Gly Arg Ile 180 Glu Asn Asp Ala Asp 185 Ser Thr Ala Ser Ile 190 Ser Ala
Cys Asn Gly 195, Leu Lys Gly His Phe 200 Lys Leu Gin Gly Glu 305 Met Tyr Leu
Ile Glu 210 Pro Leu Glu Leu Ser 215 Asp Ser Glu Ala His 22*0 Ala Val Tyr Lys
Tyr 225 Glu Asn Val Glu Lys 230 Glu Asp Glu Ala Pro 235 Lys Met Cys Gly Val 240
Thr Gin Asn Trp Glu 245 Ser Tyr Glu Pro Ile 250 Lys Lys Ala Phe Gin 255 Leu
Asn Leu Thr Lys 260 Arg Ser Phe Pro Gin 265 Arg Tyr Val Gin Leu 270 Val Ile
Val Ala Asp 275 His Arg Met Asn Thr 280 Lys Tyr Asn Gly Asp 285 Ser Asp Lys
Ile Arg 290 Gin Trp Val His Gin 295 Ile Val Asn Thr Ile 300 Asn Glu Ile Tyr
Arg 305 Pro Leu Asn Ile Gin 310 Phe Thr Leu Val Gly 315 Leu Glu Ile Trp Ser 320
Asn Gin Asp Leu Ile 325 Thr Val Thr Ser Val 330 Ser His Asp Thr Leu 335 Ala
Ser Phe Gly Asn 340 Trp Arg Glu Thr Asp 345 Leu Leu Arg Arg Gin 350 Arg His
Asp Asn Ala 355 Gin Leu Leu Thr Ala 360 Ile Asp Phe Asp Gly 365 Asp Thr Val
Gly Leu Ala Tyr Val Gly Gly Met Cys Gin Leu Lys His Ser Thr Gly
370 375 380 ·· ···· .· ··«·
Val 385 Ile Gin Asp His Ser 390 Ala Ile Asn Leu Leu 395 Val Ala Leu Thr Met 400
Ala His Glu Leu Gly 405 His Asn Leu Gly Met 410 Asn His Asp Gly Asn 415 Gin
Cys His Cys Gly 420 Ala Asn Ser Cys Val 425 Met Ala Ala Met Leu 430 Ser Asp
Gin Pro Ser 435 Lys Leu Phe Ser Asp 440 Cys Ser Lys Lys Asp 445 Tyr Gin Thr
Phe Leu 450 Thr Val Asn Asn Pro 455 Gin Cys Ile Leu Asn 460 Lys Pro Xaa Ala
Ala 465 Ala Ser Phe Leu Glu 470 Gin Lys Leu Ile Ser 475 Glu Glu Asp Leu Asn 480
Ser Ala Val Asp His 485 His His His His His 490 Xaa Val Cys Ser Leu 495 Arg
His Asp Cys Ser 500 Ser Val Gin Val Gly 505 His Leu Arg Glu • Asp 510 Arg Ser
Cys Xaa Ile 515 Leu Ile Lys Arg Met 520 Ser Glu Cys His Leu 525 Pro Glu Arg
Cys Arg 530 Leu His Phe Xaa Tyr 535 Phe Phe Ile
<210> 18 <211> 602 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Fragment fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 18 tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60 agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120 aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcaata 180 cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaaaaaaaca aaggtttgtt 240 ctctgaagat tactctgaaa ctcattactc cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300 attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc 360 ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420 gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480 cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540 accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatacgt 600 ac 602 <210> 19 <211> 816 ·· ··· · ·· ···· ·* 9
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9999 9999 999 9
9 9 9 9 9 · · · · ·
99 99 9 99 99 <212> DNA.
<213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Fragment fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 19 tccaattaaa cttgactaag agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg 60 ctgaccaccg tatgaacact aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc 120 accaaatcgt caacaccatt aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg 180 ttggtttgga aatctggtcc aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca 240 ctctggcatc cttcggtaac tggcgtgaaa ccgacctgct gcgtcgccaa cgtcatgata 300 acgctcaact gctgaccgct atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg 360 gtggcatgtg tcaactgaaa cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc 420 tgctggttgc tctgaccatg gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg 480 gcaaccagtg tcactgcggt gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac 540 catccaaact gttctccgac tgctctaaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca 600 acccgcagtg tatcctgaac aaaccgtaag cggccgccag ctttctagaa caaaaactca 660 tctcagaaga ggatctgaat agcgccgtcg accatcatca tcatcatcat tgagtttgta 720 gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct 780 agattctaat caagaggatg tcagaatgcc atttgc 816 <210> 20 <211> 1373 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220>
<223> Fragment fibrolázy z Agkistrodon contortrix <400> 20 tactattgcc agcattgctg ctaaagaaga aggggtatct ctcgagaaaa gagaggctga 60 agcttcttct attatcttgg aatctggtaa cgttaacgat tacgaagttg tttatccaag 120 aaaggtcact ccagttccta ggggtgctgt tcaaccaaag tacgaagatg ccatgcaata 180 cgaattcaag gttaacagtg aaccagttgt cttgcacttg gaaaaaaaca aaggtttgtt 240 ctctgaagat tactctgaaa ctcattactc cccagatggt agagaaatta ctacttaccc 300 attgggtgaa gatcactgtt actaccatgg tagaatcgaa aacgatgctg actccactgc 360 ttctatctct gcttgtaacg gtttgaaggg tcatttcaag ttgcaaggtg aaatgtactt 420 gattgaacca ttggaattgt ccgactctga agcccatgct gtctacaagt acgaaaacgt 480 cgaaaaggaa gatgaagccc caaagatgtg tggtgttacc caaaactggg aatcatatga 540 accaatcaag aaggccttcc aattaaactt gactaagaga tctttcccac aaagatacgt 600 acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaácactaaa tacaacggtg actctgacaa 660 aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac gaaatctaca gaccactgaa 720 catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac caagatttga tcaccgttac 780 ttctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg cgtgaaaccg acctgctgcg 840 tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc gacttcgacg gtgatactgt 900 tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat tctactggtg ttatccagga 960 ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca cacgaactgg gtcataacct 1020 gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca aactcctgtg ttatggctgc 1080 tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc tctaagaaag actaccagac 1140 cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa ccgtaagcgg ccgccagctt 1200 tctagaacaa aaactcatct cagaagagga tctgaatagc gccgtcgacc atcatcatca 1260 tcatcattga gtttgtagcc ttagacatga ctgttcctca gttcaagttg ggcacttacg 1320 agaagaccgg tcttgctaga ttctaatcaa gaggatgtca gaatgccatt tgc 1373
44 · ·♦ 4
4 4
4 4 4 »« 4 4 4 4 4
4 4 4 4
44 44
·4«4 - .
4 4 4 4 4
4 4 * 4 4
4 4 4 4 4 4
4 4 4 4 4

Claims (15)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Fibrinolyticky aktivní polypeptid má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1.
  2. 2. Polypeptid z nároku 1, který byl vyroben rekombinantní expresí v kvasinkách.
  3. 3. Molekula nukleové kyseliny kóduje polypeptid o sekvenci SEQ ID NO:1.
  4. 4. Molekula nukleové kyseliny z nároku 3 která má sekvenci SEQ ID NO :4.
  5. 5. Expresní vektor obsahuje expresní regulační prvky, které jsou účinně připojeny k molekule nukleové kyseliny podle nároku 3.
  6. 6. Expresní vektor podle nároku 5 ve kterém je molekula nukleové kyseliny má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:4.
  7. 7. Hostitelská buňka transformovaná nebo transfekovaná molekulou nukleové kyseliny podle nároku 3.
  8. 8. Transformovaná nebo transfekovaná hostitelská buňka podle nároku 7, která je prokaryotická nebo eukaryotická.
  9. 9. Transformovaná nebo transfekovaná prokaryotická buňka podle nároku 8, která je kvasinková buňka.
  10. 10. Transformovaná nebo transfekovaná kvasinková buňka podle národu 9, která je Pichia pastoris.
  11. 11. Metoda produkce NATu, zahrnující kultivaci hostitelských buněk obsahujících DNA molekulu kódující uvedenou metaloproteinázu , • ft ···· ·· * ··*· • · ···· · * * • · · « · · · · « « • ft · · ft · ···· « · ft · ···· · · · ···· • ft ·» ft · · · · · · účinně připojenou k regulačním prvkům které stimulují expresi za podmínek, že je DNA molekula exprimována a izolace exprimované metaloproteinázy z kultury hostitelských buněk.
    12. Metoda z nároku 11, 13. Metoda z nároku 11, kvasinky. 14 . Metoda z nároku 13, Pichia pastoris.
    kde DNA molekula je SEQ ID NO:4.
    ve které jsou hostitelské buňky ve kterém jsou kvasinkové buňky
  12. 15. Metoda produkce metalaloproteinázy-fybrinolytického agens vybraného ze skupiny sestávající se z fibrolázy NATu, obsahující kultivaci Pichia hostitelských buněk, které obsahují DNA molekulu kódující zmíněnou metaloproteinázu, účinně připojenou k regulačním prvkům pro stimulaci exprese za podmínek kdy je DNA molekula exprimována a izolace exprimované metaloproteinázy z kultury hostitelských buněk.
  13. 16. Metoda z nároku 15, kde Pichia hostitelská buňka je Pichia pastořis.
  14. 17. Metoda léčby trombózy u savců zahrnující podávání trombolyticky efektivního množství NATu savcům.
  15. 18. Protilátku proti polypeptidu z nároku 1.
    Protilátka z nároku 17 která je monoklonální protilátka.
CZ20021034A 1999-10-01 2000-09-29 Fibrinolyticky aktivní polypeptid a zpusob jeho produkce a použití, protilátka, molekula nukleové kyseliny, expresní vektor a hostitelská bunka CZ298502B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/411,329 US6261820B1 (en) 1999-10-01 1999-10-01 Fibronolytically active polypeptide

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20021034A3 true CZ20021034A3 (cs) 2003-06-18
CZ298502B6 CZ298502B6 (cs) 2007-10-24

Family

ID=23628486

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20021034A CZ298502B6 (cs) 1999-10-01 2000-09-29 Fibrinolyticky aktivní polypeptid a zpusob jeho produkce a použití, protilátka, molekula nukleové kyseliny, expresní vektor a hostitelská bunka

Country Status (29)

Country Link
US (4) US6261820B1 (cs)
EP (2) EP1605049A3 (cs)
JP (1) JP2003511034A (cs)
KR (2) KR100700753B1 (cs)
CN (2) CN101230340A (cs)
AT (1) ATE292180T1 (cs)
AU (1) AU767827B2 (cs)
BG (1) BG106577A (cs)
BR (1) BR0014414A (cs)
CA (1) CA2386185A1 (cs)
CZ (1) CZ298502B6 (cs)
DE (1) DE60019147T2 (cs)
DK (1) DK1224298T3 (cs)
EA (2) EA006487B1 (cs)
ES (1) ES2240167T3 (cs)
HK (1) HK1049351B (cs)
HU (1) HUP0202650A3 (cs)
IL (1) IL148787A0 (cs)
MX (1) MXPA02003126A (cs)
NO (1) NO20021501L (cs)
NZ (1) NZ517951A (cs)
PL (1) PL355017A1 (cs)
PT (1) PT1224298E (cs)
RS (1) RS20060033A (cs)
SG (1) SG127720A1 (cs)
SK (1) SK4232002A3 (cs)
WO (1) WO2001025445A1 (cs)
YU (2) YU59604A (cs)
ZA (1) ZA200202206B (cs)

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6440414B1 (en) 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
US6261820B1 (en) 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
US7033776B2 (en) * 1999-12-17 2006-04-25 Amgen Inc. Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases
US6455269B1 (en) * 1999-12-17 2002-09-24 Amgen, Inc. Method for localized administration of fibrinolytic metalloproteinases
US6523647B2 (en) * 2001-05-21 2003-02-25 Hydro Mobile Inc. Elevating platform assembly
EP1482882B1 (en) * 2002-02-11 2011-09-14 Gold-T Tech, Inc. Implantable device for preventing thrombus formation
US7016409B2 (en) * 2003-11-12 2006-03-21 Sony Corporation Apparatus and method for use in providing dynamic bit rate encoding
ES2239532B1 (es) * 2004-02-06 2006-11-01 Proyecto De Biomedicina Cima S.L. Metodo para evaluar el riesgo y la predisposicion a desarrollar una patologia relacionada con la presencia de autoanticuerpos frente a epcr.
US20070141625A1 (en) * 2005-02-03 2007-06-21 Santos Jose H Method for assessing risk of and predisposition to development of a pathology related to the presence of anti-epcr autoantibodies
EP1986568B1 (en) 2006-02-03 2017-04-05 Covidien LP Methods and devices for restoring blood flow within blocked vasculature
WO2010102307A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Lazarus Effect, Inc. Retrieval systems and methods for use thereof
US10207240B2 (en) 2009-11-03 2019-02-19 Gen9, Inc. Methods and microfluidic devices for the manipulation of droplets in high fidelity polynucleotide assembly
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
CN107873054B (zh) 2014-09-09 2022-07-12 博德研究所 用于复合单细胞核酸分析的基于微滴的方法和设备
US10456560B2 (en) 2015-02-11 2019-10-29 Covidien Lp Expandable tip medical devices and methods
US11873483B2 (en) 2015-03-11 2024-01-16 The Broad Institute, Inc. Proteomic analysis with nucleic acid identifiers
US11092607B2 (en) 2015-10-28 2021-08-17 The Board Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017075297A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute Inc. High-throughput dynamic reagent delivery system
US12071663B2 (en) 2016-01-15 2024-08-27 Massachusetts Institute Of Technology Semi-permeable arrays for analyzing biological systems and methods of using same
US11072816B2 (en) 2017-05-03 2021-07-27 The Broad Institute, Inc. Single-cell proteomic assay using aptamers
WO2022182799A1 (en) * 2021-02-23 2022-09-01 Clara Foods Co. Compositions for preparing animal-free egg-like products

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2310133A2 (fr) * 1975-05-05 1976-12-03 Fabre Sa Pierre Nouveau medicament comportant un activateur du plasminogene perfectionne
US4447236A (en) * 1982-02-05 1984-05-08 Cordis Corporation Infusion catheter system
DE3330699A1 (de) * 1983-08-25 1985-03-07 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur gleichzeitigen bestimmung von fibrinogen und fibrinogen-spaltprodukten im plasma
US4610879A (en) 1984-01-06 1986-09-09 University Of Southern California Fibrinolytic enzyme from snake vernom
CA1237482A (en) * 1984-03-09 1988-05-31 Frank B. Stiles Catheter for effecting removal of obstructions from a biological duct
US4755167A (en) * 1984-04-10 1988-07-05 Research Corporation In vivo method for distribution and stirring of therapeutic agents
US4885242A (en) * 1984-10-30 1989-12-05 Phillips Petroleum Company Genes from pichia histidine pathway and uses thereof
US4855231A (en) * 1984-10-30 1989-08-08 Phillips Petroleum Company Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4818700A (en) * 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4812405A (en) * 1986-02-18 1989-03-14 Phillips Petroleum Company Double auxotrophic mutants of Pichia pastoris and methods for preparation
US5000185A (en) * 1986-02-28 1991-03-19 Cardiovascular Imaging Systems, Inc. Method for intravascular two-dimensional ultrasonography and recanalization
ZA889415B (en) 1987-12-18 1989-09-27 Chiron Corp Compositions and method for recombinant production of crotalidus venum fibrolase
WO1990007352A1 (en) 1989-01-04 1990-07-12 Boston Scientific Corporation Angioplasty catheter
US5222941A (en) * 1990-01-12 1993-06-29 Don Michael T Anthony Method of dissolving an obstruction in a vessel
JPH05184352A (ja) * 1990-01-16 1993-07-27 Centro De Ing Genetica Y Biotecnol ピヒア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）酵母中での異種遺伝子の発現方法、発現ベクターおよび形質転換微生物
US5709676A (en) * 1990-02-14 1998-01-20 Alt; Eckhard Synergistic treatment of stenosed blood vessels using shock waves and dissolving medication
US5250034A (en) * 1990-09-17 1993-10-05 E-Z-Em, Inc. Pressure responsive valve catheter
US5167628A (en) * 1991-05-02 1992-12-01 Boyles Paul W Aortic balloon catheter assembly for indirect infusion of the coronary arteries
US5380273A (en) * 1992-05-19 1995-01-10 Dubrul; Will R. Vibrating catheter
EP0624642B1 (en) 1993-05-12 1999-01-20 Indian Council For Medical Research Novel thrombolytic agent, process for preparing same and its use for the preparation of a thrombi dissolving medicament
US5370653A (en) * 1993-07-22 1994-12-06 Micro Therapeutics, Inc. Thrombectomy method and apparatus
EP0689843B1 (en) 1993-12-17 2003-09-10 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Composition containing soluble thrombomodulins
US5626564A (en) * 1995-03-31 1997-05-06 Creighton University Adjustable sideholes catheter
US5830468A (en) * 1995-05-17 1998-11-03 The New York Blood Center, Inc. Fibrin(ogen) degradation by fibrinolytic matrix metalloproteinase
US6020181A (en) * 1995-05-17 2000-02-01 New York Blood, Inc. Inhibition of thrombus formation by medical related apparatus comprising treating with fibrinolytic matrix metalloproteinase
US5741779A (en) * 1996-05-10 1998-04-21 Xoma Corporation Antithrombotic materials and methods
DE69734060T2 (de) * 1996-05-24 2006-06-29 Angiotech Pharmaceuticals, Inc., Vancouver Zubereitungen und verfahren zur behandlung oder prävention von krankheiten der körperpassagewege
US5951981A (en) * 1996-12-02 1999-09-14 Diatide, Inc. Thrombolytic agents with antithrombotic activity
US6413760B1 (en) * 1997-04-15 2002-07-02 Genetics Institute, Inc. Highly purified mocarhagin cobra venom protease polynucleotides endcoding same and related proteases and therapeutic uses thereof
WO1999029838A1 (en) * 1997-12-09 1999-06-17 Bristol-Myers Squibb Company Fibrinogen-converting enzyme hybrids
US6261820B1 (en) 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
US6440414B1 (en) 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
US6455269B1 (en) * 1999-12-17 2002-09-24 Amgen, Inc. Method for localized administration of fibrinolytic metalloproteinases
WO2002012283A2 (en) 2000-08-03 2002-02-14 Zymogenetics, Inc. Disintegrin homologs, zsnk10, zsnk11, and zsnk12

Also Published As

Publication number Publication date
BR0014414A (pt) 2002-06-11
US20080058256A1 (en) 2008-03-06
KR100711312B1 (ko) 2007-04-27
DK1224298T3 (da) 2005-05-30
US7195903B2 (en) 2007-03-27
KR20020047208A (ko) 2002-06-21
AU767827B2 (en) 2003-11-27
NZ517951A (en) 2004-02-27
EA006487B1 (ru) 2005-12-29
US6261820B1 (en) 2001-07-17
DE60019147T2 (de) 2006-05-11
ATE292180T1 (de) 2005-04-15
CZ298502B6 (cs) 2007-10-24
EP1224298A1 (en) 2002-07-24
MXPA02003126A (es) 2002-09-30
SK4232002A3 (en) 2003-09-11
CN100357430C (zh) 2007-12-26
IL148787A0 (en) 2002-09-12
SG127720A1 (en) 2006-12-29
RS20060033A (sr) 2006-12-15
BG106577A (bg) 2003-04-30
EP1224298B1 (en) 2005-03-30
EA005944B1 (ru) 2005-08-25
YU22502A (sh) 2005-07-19
NO20021501D0 (no) 2002-03-26
KR20060114034A (ko) 2006-11-03
HK1049351B (en) 2005-07-29
PT1224298E (pt) 2005-06-30
EA200200410A1 (ru) 2002-10-31
NO20021501L (no) 2002-05-31
DE60019147D1 (en) 2005-05-04
JP2003511034A (ja) 2003-03-25
HUP0202650A3 (en) 2005-01-28
EP1605049A3 (en) 2006-12-13
EA200400290A1 (ru) 2005-02-24
WO2001025445A1 (en) 2001-04-12
KR100700753B1 (ko) 2007-03-28
CN101230340A (zh) 2008-07-30
CA2386185A1 (en) 2001-04-12
AU7625400A (en) 2001-05-10
HK1049351A1 (en) 2003-05-09
CN1402788A (zh) 2003-03-12
US6617145B2 (en) 2003-09-09
ZA200202206B (en) 2002-12-24
YU59604A (sh) 2005-11-28
ES2240167T3 (es) 2005-10-16
US20020058322A1 (en) 2002-05-16
EP1605049A2 (en) 2005-12-14
US20030186422A1 (en) 2003-10-02
HUP0202650A2 (hu) 2002-12-28
PL355017A1 (en) 2004-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20021034A3 (cs) Fibrinolyticky aktivní polypeptid
JP4722989B2 (ja) 新規な抗血管形成ペプチド、それをコードするポリヌクレオチド、および血管形成を阻害する方法
HU224827B1 (hu) Új antiangiogén peptidek, azokat kódoló polinukleotidok, és eljárások angiogenezis gátlására
TWI486168B (zh) 治療內皮功能不良之方法
AU2004200776B2 (en) Fibrinolytically active polypeptide
EP2370574A1 (en) Mutants of staphylokinase carrying amino and carboxy-terminal extensions for polyethylene glycol conjugation
HK1079242A (en) Fibrinolytically active polypeptide
NZ530114A (en) Fibrinolytically active polypeptide
US20030153064A1 (en) Disintegrin homologue, MAHBP
MXPA01005168A (en) Zace1:a human metalloenzyme

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20080929