CZ20021139A3 - Specifické promotory albumenu rostlinných zrn - Google Patents
Specifické promotory albumenu rostlinných zrn Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20021139A3 CZ20021139A3 CZ20021139A CZ20021139A CZ20021139A3 CZ 20021139 A3 CZ20021139 A3 CZ 20021139A3 CZ 20021139 A CZ20021139 A CZ 20021139A CZ 20021139 A CZ20021139 A CZ 20021139A CZ 20021139 A3 CZ20021139 A3 CZ 20021139A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plant
- gene
- promoter
- expression
- plasmid
- Prior art date
Links
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 73
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 33
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 claims abstract description 13
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 64
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 claims description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 18
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 13
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 13
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 12
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 12
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 8
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 8
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 4
- 108010050516 adenylate isopentenyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 claims description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 2
- 108091062157 Cis-regulatory element Proteins 0.000 claims 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 claims 1
- DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N barium atom Chemical compound [Ba] DSAJWYNOEDNPEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 claims 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000021759 endosperm development Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 64
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 43
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 101150007515 esr2 gene Proteins 0.000 description 20
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 19
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 19
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 16
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 16
- 101150064205 ESR1 gene Proteins 0.000 description 15
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 9
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 9
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 6
- 241000543381 Cliftonia monophylla Species 0.000 description 6
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 4
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 4
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 description 4
- 244000102209 Crateva religiosa Species 0.000 description 4
- 235000003494 Crateva religiosa Nutrition 0.000 description 4
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 4
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 4
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 4
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 4
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 4
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 101150012864 ipt gene Proteins 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 241000593992 Blicca bjoerkna Species 0.000 description 3
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000882584 Homo sapiens Estrogen receptor Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 2
- 229910002056 binary alloy Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 2
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 2
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHJFFLKPAYHPHU-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 DHJFFLKPAYHPHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589156 Agrobacterium rhizogenes Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011301 Brassica oleracea var capitata Nutrition 0.000 description 1
- 235000001169 Brassica oleracea var oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N Clavulanic acid Natural products OC(=O)C1C(=CCO)OC2CC(=O)N21 HZZVJAQRINQKSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008169 Co-Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010060434 Co-Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100038595 Estrogen receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101001010910 Homo sapiens Estrogen receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004713 Pisum sativum Species 0.000 description 1
- 235000010582 Pisum sativum Nutrition 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 101100018379 Shigella flexneri icsA gene Proteins 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 241000690606 Teratura Species 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 101100476911 Yersinia enterocolitica yscW gene Proteins 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 229940098164 augmentin Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000009144 enzymatic modification Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 108091008577 estrogen receptors gamma Proteins 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000018412 transposition, RNA-mediated Effects 0.000 description 1
- 230000009452 underexpressoin Effects 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 101150076562 virB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150033532 virG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Botany (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Description
Oblast, techniky • · · · · · v « l/1é>
Vynález se týká řízení exprese genů v průběhu vývoje albumenu. Obzvláště se týká nukleotidových promotorových sekvencí umožňujících specifickou expresi na rozhraní mezi klíčkem a albumenem a časnou během vývoje albumenu.
Dosavadní stav techniky
Albumen, charakteristický útvar zrna krytosemenných rostlin, je živnou tkání pro klíček. Je to komplexní tkáň svou strukturou a svým vývojem zejména u obilovin. Středová zóna albumenu sestává z velkých buněk s vakuolami, ve kterých jsou uloženy zásoby škrobu a proteinů, zatímco oblast, obklopující klíček, se vyznačuje buňkami spíše menšími obsazenými do velké míry cytoplasmou. Dosud není známa funkce těchto buněk nazývaných husté cytoplasmové buňky CSchel J.H.N. a kol., Can. J. Biol. 62, str. 2842 až 2856, 1984). V roce 1997 identikovali Opsahl a kol. COpsahl-Ferstad H.D. a kol., The Plant J. 12, str. 235 až 246, 1997) gen vyskytující se specificky v této oblasti kolem klíčku kukuřice, gen, který nazvali Esr <Embryo Surrounding Region).
Autoři vynálezu nyní izolovali promotorové nukleotidové sekvence umožňující expresi kódujících sekvencí, na které by mohly být vázány, což je specifické pro oblast albumenu obklopující klíček v zrnech krytosemenných rostlin a které zasahují zejména v raných stadiích vývoje albumenu. Tyto promotorové sekvence jsou obzvlášť užitečné pro zacílení nebo řízení exprese sledovaných genů.
V rámci zlepšování rostlin transgenesí, je možno vázat pracovní postup takové nukleotidové promotorové sekvence se • · ·· · · · · · · ·· · · ·«··*· · · · · · sekvencí kódující sledovaný gen.
Nukleotidové konstrukce, s výhodou v podobě vektoru, je možno použít k transformaci rostlinných buněk stabilním způsobem takového druhu, že takto transformované rostliny obsahují ve svém genomu sledovaný gen spojený s promotorovou sekvencí podle vynálezu.
Zrna, která se vyvíjejí oplodňováním z této rostliny, obsahují rovněž ve svém genomu tento transgen.
Vzhledem k souvislosti s promotorovou sekvencí podle vynálezu se sledovaný transgen exprimuje pouze v oblasti albumenu obklopující klíček, tedy ve shora uvedených hustých cytoplasmovýeh buňkách.
K expresi transgenu dochází v prvních dnech po opylení přesněji čtvrtého dne po opylení.
Promotorové sekvence podle vynálezu je možno volit ze souboru zahrnujícího sekvence SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 nebo všechny nukleotidové sekvence, které jsou jejich homology
| Sekvence | SEQ | ID | No | 1 | odpov í dá | promotoru | genu | ESR1 |
| Sekvence | SEQ | ID | No | 2 | odpovídá | promotoru | genu | ESR2 |
| Sekvence | SEQ | ID | No | 3 | odpovídá | promotoru | genu | ESR3 |
| Sekvence | SEQ | ID | No | 4 | odpovídá | promotoru | genu | ESR4 |
Sekvence SEQ ID No 5 odpovídá fragmentu 499 párů bází na SEQ ID No 2 (nukleotidům 1995-2493)
Sekvence SEQ ID No 6 odpovídá fragmentu 507 párů bází na SEQ • · «4 ·· ··· 4 44 ··
4 4 4 4 4 4 ··· • »44 4 4 · «·· · 4 • 4 4 4 · 4 4 · 4
4444 44 44 44 ·· 44··
ID No 3 (nukleotidům 1202-1708)
Sekvence SEQ ID No 7 je konzenzuální sekvencí 265 nukleotidů, získaná porovnáním mezi sekvencemi SEQ ID No 1, No 2 a No 3Označením homologová nukleotidová sekvence se rozumí všechny nukleotidové sekvence, které se liší od sekvence SEQ ID No 1, No 2, No 3, No 4, No 5, No 6 nebo No 7 substitucí, deleci a/nebo inzercí jednoho nebo několika nukleotidů v polohách, jakými homologové nukleotidové sekvence konzervují vlastnosti specifického promotoru sekvencí SEQ ID No 1 až No 7 S výhodou taková homologová nukleotidová sekvence obnáší alespoň 70 % sekvencí SEQ ID No 1 až No 7, s výhodou alespoň 80 % a ještě výhodněji alespoň 95 %.
Homologie je obecně určena použitím logiky analysy sekvencí (například Sequence Analysis Software Package Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, VI 53705}. Podobné nukleotidové sekvence jsou seřazeny k získání maximálního stupně homologie (identity). K tomu může být nutno zavést do sekvence umělý způsob prostorů (mezer“). Jakmile se uskuteční optimální seřazení, stanoví se stupeň homologie (například identity) zaznamenáním všech poloh, pro které jsou nukleotidy dvou porovnávaných sekvencí stejné, vzhledem k celkovému počtu poloh.
S výhodou taková homologová nukleotidová sekvence hybriduje specificky na komplementárních sekvencích sekvencí SEQ ID No 1 až No 7 za striktních podmínek. Parametry definující striktní podmínky závisejí na teplotě, při které se odděluje 50 % spárovaných větví (Tm).
U sekvencí obsahujících více než 30 bází, je teplota Tm definována vztahem:
• · titi · ti · · · · ·· · ti • · · ti · · · · · · • ti ti ti ti ti ti tititi 0 ti
Tm = 81,5 + 0,41 (%G-*-C)+16,6 Log(koncentrace kationtů)-0,63(% formamidu)-(600/počet bází) (Sambrook a kol., Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press str. 9-54 až 9.62, 1989).
U sekvencí s délkou menší než 30 bází je teplota Tm definována vztahem Tm = 4(G-*-C) + 2(A-»-T).
Za vhodných striktních podmínek, pří kterých se specifické sekvence nehybridují je teplota hybridizace přibližně 5 až 30 o o
C, s výhodou 5 až 10 C pod Tm, a použitými hybridizačními pufry jsou s výhodou roztoky se zvýšenou iontovou sílou jako je například roztok 6xSSC.
Různé nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být nebo nemusejí být umělého původu. Může jít o sekvence ADN získané probírkou banky sekvencí za použití sond zpracovaných na základě sekvencí SEQ ID No 1 až No 7. Takové banky mohou být připraveny klasickými technikami molekulární biologie, známými pracovníkům v oboru.
Nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být rovněž připraveny chemickou cestou nebo smíšenými způsoby zahrnujícími chemickou nebo enzymatickou modifikaci sekvencí získaných probírkou bank.
Promotorové nukleotidové sekvence podle vynálezu jsou s výhodou sekvence izolované z obilnin, obzvláště z kukuřice.
Promotorové nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být obzvláště izolovány způsoby inversní PCR nebo za použití genomů (Devic a kol., Plant Physiol. Biochem. 35= 35(4), str. 331 až 339, 1997).
Promotorové nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou • · ♦· ·· ···· ·· ·· » · · · · · · · · · · • ··· ♦ · · » · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ···· naopak obsahovat nebo mohou být spojené s regulačním motivem cis CTACACCA opakovaným s výhodou za sebou nebo s docela jiným motivem obsahujícím jednu nebo několik degenerovaných bází majících stejnou funkci.
Vynález se týká také nukleotidové konstrukce nazývané expresní kazeta, obsahující jednu promotorovou nukleotidovou sekvenci, jako je sekvence uvedená shora, operativně vázanou na alespoň jeden sledovaný gen.
Sledovaný gen může být spojen s jinými regulačními prvky, jako jsou aktivátory a sekvence terminace transkripce (terminátory) . Jako příklad je možno uvést jako terminátor použitelný v těchto konstrukcích zakončení 3 genu nopalinové syntházy Agrobacterium tumefaciens.
Sledovaný gen může například kódovat protein účastnící se na vývoji klíčku a/nebo albumenu, na buněčném růstu, na metabolismu cukrů (Invertázy) a mastných kyselin, toku živin (transportérech). Může rovněž kódovat toxický protein, nebo ještě aktivační nebo inhibiční protein ostatních genů, jako je protein inhibující transkripční faktor (například domény regrese typu engr&illed (Poole a kol. Cell 40, str. 3? až 43, 1989) nebo například korepresorů).
Podle výhodného způsobu kóduje sledovaný gen protein, jehož specifická exprese v zóně obklopující klíček by umožňovala ovlivňovat tvar klíčku a/nebo jeho vývoj. Například může takový gen kódovat barnázu nebo isopentenylovou transferázu.
Sledovaný gen může být umístěn ve směru nebo v proti směru.
Promotorové nukleotidová sekvence podle vynálezu může být také spojena s markerovým genem, například s genem umožňujícím selekci rostliny transformované od rostliny, která neobsahuje ·· «φ φφ φ··φ φ· φφ φφφφ φφ < · · · · > φ # # φ φ φ φφ* · · •φφφ ·· ·· ·· ·· ···· cizí transfektovanou ADH. Jako markerový gen je možno uvést zejména gen vykazující odolnost vůči antibiotiku (Herrera-Estrella a kol., EMBO J. 2, str. 987 až 995, 1983) nebo odolnost vůči herbicidu CEP 242246).
Vynález se týká také nukleotidového vektoru, jako je plasmidový vektor, vhodný k transformaci hostitelských buněk, obsahující shora uvedenou expresní kazetu- Konstrukci expresních vektoru pro transformaci volí pracovník v oboru ze standardních způsobů.
Vynález se týká také hostitelské buňky krytosemenné rostliny, jmenovitě obilniny transformované vektorem podle vynálezu .
Vynález se také týká transgenní rostliny nebo části transgenní rostliny, jmenovitě semen, plodů a pylů vytvořených z takové buňky.
Jako buňky, schopné transformace způsobem podle vynálezu, se příkladně uvádějí buňky rostlin ve velkých kulturách (například kukuřice, pšenice, řepka, slunečnice, hrách, sója a ječmen) nebo zelinářské rostliny a květiny. Přednostně je možno volit rostliny, o nichž je známo, že obsahují velké zásoby (proteinové, glycidové a lipidové), zejména obilniny nebo rostliny olejnaté.
Hybridní rostliny získané křížením rostlin podle vynálezu, patří také do rozsahu vynálezu.
Vynález se týká také způsobu získávání krytosemenné rostliny vykazující zlepšené agronomické nebo nutriční kvality, přičemž se při způsobu:
- transormuje alespoň jedna buňka krytosemenné rostliny shora uvedeným vektorem, ► · · · ·· ··
- kultivuje se takto transformovaná buňka způsobem k vytvoření rostliny obsahující ve svém genomu expresní kazetu podle vynálezu.
Transformace rostlinných buněk se může realizovat způsoby známými pracovníkům v oboru.
Uvádějí se jmenovitě způsoby přímého transferu genů jako je mikroinjektování do klíěekidní (klíčky vytvářející) rostliny (Neuhaus a kol., 1987), infiltrace ve vakuu (Bechtold a kol., 1993) nebo elektroporace (Chupeau a kol., 1989) nebo také přímé vysrážení za použití PEG (Schocher a kol. 1986) nebo bombardování znovu nabytými částicemi sledované plasmidické ADN (Fromm a kol., 1990).
Je také možno naočkovat rostlinu bakteriálním kmenem, jmenovitě Agrobakteriem- Podle jednoho provádění způsobu podle vynálezu se rostlinné buňky transformují vektorem podle vynálezu, přičemž buněčný hostitel je schopen infikovat uvedené rostlinné buňky umožněním integrace do jejich genomu sledované nukleotidové sekvence původně obsažené v genomu dále uvedeného vektoru. S výhodou je používaným buněčným hostitelem Agrobacterium tumefaciens obzvláště způsobem, který popsal An a kol. (1986) nebo také Agrobacterium rhizogenes způsobem, který popsal Guerche a kol. (Mol. Gen. Genet. str. 206 až 328, 1987).
Například se může transformace rostlinných buněk provádět transferem oblasti T cirkulárního plasmidu extrachromosomového indukt-oru tumorů Ti Agrobacter i um tumefaciens za použití binárního systému (Watson a kol. 1994). K tomu se sestrojí dva vektory. V jednom z nich se delecí vypustí oblast T s výjimkou levého a pravého okraje, přičemž se markerový gen začlení mezi ně k umožnění selekce v buňkách rostlin. Druhým partnerem binárního systému je pomocný plasmid Ti, což je modifikovaný plasmid, který už nemá oblast T, ale obsahuje vždy geny virové
44 ·· 4444 44 44 • 4 · 4 4 4 4 4444
444 444 ·· 4 ··· 444 4 4 4 4 ·
4 4444 ···
4444 44 44 44 44 4444 virulence potřebné k transformování rostlinné buňky.
Přednost se dává způsobu, který popsal Ishida a kol. (Nature Biotechnology 14, str. 745 až 750, 19961 k transformaci monoděložných rostlin.
Podle jiného protokolu se transformace provádí způsobem, který popsal Finer J. CPlant Cell Report. 11, str- 323 až 328, 19921 za použití bombardování částicemi wolframu nebo zlata.
Podstata vynálezu
Podstatou vynálezu je nukleotidová promotorová izolovaná sekvence umožňující expresi kódujících sekvencí, na kterých je vázána, přičemž exprese je il specifická pro oblast albumenu obklopující klíček v zrnech krytosemenných rostlin a iii působí obzvláště v časných stadiích vývoje albumenu.
Ve skutečností je možno časnou akci a specifickou pro vývoj kličkových tkání a albumenu nalézt: podle vzájemného tvaru jedné nebo druhé tkáně, bylo by možno získat zrna nebo plody obohacené škrobem (silný albumenl a/nebo olejem (silný klíčekl cestou použití příslušných stimulačních genů (například hormonu buněčného cyklul nebo inhibičních genů (například toxického proteinu nebo inhibitoru transkripce!. Albuminy bez klíčků by bylo možno získat také podle tohoto modelu, pro průmyslové aplikace ve škrobárnách a mlýnech.
Například použití genů kódujících hormony (cytokiny, auxinyl buněčného cyklu za řízení promotorů podle vynálezu by umožňovalo modifikovat proces vzniku buněk a korelačním způsobem vývoj albumenu, jak popsal R.J. Scott (19981.
Působení, zaměřené na akumulaci živin v klíčku a v albumenu, může být rovněž hledáno v použití například jako určitých toto ·· i · · · • to to •to ···· ·· ···· ·« • •to ·· · ·· ···· · • · · · · ·· • to ·· ·· ···· genů, genii kódujících trans portery živin (zejména cukrů) na rozhraní rostlina/albumen a albumen/klíček nebo geny kódující inhibitory těchto přenosů pro diferencovanou akumulaci živin v albumenu nebo v klíčku.
Vynález se týká také způsobu modifikace zemědělských a/nebo nutričních kvalit rostliny cíleným a časným působením na vývoj klíčku/albumenu použitím transformace rostlin vektorem podle vynálezu. Obzvlášť se vynález týká modifikace tvaru a/ nebo vývoje klíčků/albumenu. Poukazuje také na změny ve vývoji klíčku s cílem produkce zrn bez klíčků pro obiloviny zajímavé pro průmysl škrobáren a mlýnů.
Zvláště se vynález týká shora definované expresní kazety k získání krytozrnné rostliny vykazující zlepšené zemědělské nebo nutriční kvality. S výhodou může získaná tranšgenní rostlina produkovat zrna s upraveným obsahem škrobu nebo oleje v porovnání s rostlinhou netransformovanouVynález se týká také použití tranšgenních rostlin získaných podle vynálezu nebo částí těchto rostlin, zejména semen, zrn a plodů pro přípravu odvozených produktů zejména potravinových .
Do rozsahu vynálezu patří také získané produkty, jako jsou olejnatá semena obohacená olejem, mouky ze semen obohacených škrobem nebo olejem.
Vynález se týká také veškerých složek lidské nebo zvířecí potravy připravených ze získaných produktů.
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení pomocí připojených schémat..
toto ·« • ·· · ·· · • ··· • « ••toto ·· • to totototo ·· · to·* ·· ·· • ·· · ·· «to ·· ·· « · · · ·» » • · · • to · ·· totoito
Seznam obrázků na výkresech
Na obr. Na obr.
Na obr.
Na obr.
Na obr1.
Na obr.
Na obr.
Na obr.
Na obr.
Na obr. Na obr.
je schéma znázorňující etapy klonování promotoru ESR je restrikční obraz plasmidu L82/34 obsahujícího jmenovitě promotor pEsrl napojený na Bus.
je restrikční obraz plasmidu L124/19 obsahujícího jmenovitě promotor pEsr2 napojený na Gus.
je restrikční obraz plasmidu L127a5 obsahujícího jmenovitě promotor pEsr3 napojený na Gus.
je restrikční obraz plasmidu L78al obsahujícího jmenovitě promotor pEsrl napojený na Ipt.
je restrikční obraz plasmidu L125a2 obsahujícího jmenovitě promotor pEsr2 napojený na lpt.
je restrikční obraz plasmidu L77alOl obsahujícího jmenovitě promotor pEsrl napojený na Barnase.
je restrikční obraz plasmidu L126a3 obsahujícího jmenovitě promotor pEsrl napojený na Barnase.
je porovnání sekvencí promotorů genů Esrl, Esr2 a Esr3 (případně prEsrl, prEsr2 a prEsr3, nebo SEQ ID No 1, SEQ ID No 2 a SEQ ID No 3), přičemž konzervované části jsou seřazeny.
je restrikční obraz plasmidu pWP280.
je restrikční obraz plasmidu L129/46 obsahujícího zejména promotor pEsr2 napojený na sekvenci Esr2 v prot i směru.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Kvantitativní exprese Esrl,2,3
Opsahl-Ferstad a kol. (The Plant J. 12, str. 235 až 246, 1997) umožnil identifikovat “diferenčním displejem specifický amplikon albunenu Esral (číslo dostupnosti na bázi daných EMBL
0 • I · ·
Χ98495) a izolovat tříděním genomových a komplementárních bank na linii hybridu HGS^HD? (Barloy a kol., Maydica 34, str. 303 až 308, 1989) a linii A188 (Gerdes J.T. a Tracy W.F., Corp Sci. 33, str. 334 až 337, 1993) odpovídající klony. Z genomických sekvencí Esrlgl (číslo dostupnosti na EMBL=X98497) a Esr2gl (číslo dostupnosti na EMBL=X98499) a Esr3g2 (číslo dostupnosti na EMBL:X99970), bylo možno uvést ve známost zvláště tři geny Esrl, Esr2 a Esr3.
Autoři vynálezu vyhodnotili relativní příspěvky exprese každého z genů Esr díky zkušenostem RT-PCR, digesce enzymy restrikce a kvantifikace způsoby známými pracovníkům v oboru z materiálů JAP 7 a JAP 9 (dny po opylení Jour Apres Pollinisation).
Kvantifikace různých identických skupin na migračním gelu ukazuje relativní střední příspěvky 18 %, 53 % a 29 % pro transkripty Esrl, EsR2 a Esr3. Promotor Esr2 tedy umožňuje kvantitativní expresi nejsilnější z genu, který řídí.
Příklad 2
Izolování a klonování promotorových sekvencí
Jak je znázorněno na obr. 1, byly fragmenty obsahující fáze otevřeného čtení Esrl, Esr2 a Esr3 (Opsahl-Ferstad H.D. a kol., The Plant J. 12, str.235 až 246, 1997) i sekvence v protisměru a po směru subklonovány v plasmidu pBluescript SK+ (Stratagene) způsobem, který popsal Sambrook a kol. (Molecular Cloning - A laboratory manual. CoId Sprlg Harbor
Press, 1989). Část pocházející z plasmidu L23/7 fragment Sall o 2,1 kb lambdaEsrlgl, plasmid L33/1 obsahující fragment BamHI o 3,4 kb lambdaEsr2gl, plasmid L33/10 obsahující fragment BamHI o 1,9 kb lambdaEsr2gl a plasmid L102c24 obsahující fragment HinDIII o 4,5 kb lambdaEl-111. Místa Xbal,
Laboratory obsahuj íc í • 0 0 0 ·· ♦··* ·* ·* ···· ·· · · « · • · · * * · · * • ···«· · · · · · ’ <j « ···<* · · · • · · · · · · * · * ·· · · 1 situovaná hned v protisměru otevřeného čtení (TCTGATTCCATG) umožnila rozlišit domnělé promotory příslušných fází otevřeného čtení. Zejména fragment SallZXbal o 0,53 kb L23/7 byl označen jako domnělý promotor Esrl, fragment HindlII/BamHI o 2,35 kb L33/1 (část v proti směru promotoru) a fragment BamHI/ Xbal 0,14 o kb L33/10 (po směru promotoru), domnělého promotoru Esr2, fragment HindlII/Xbal 1,71 kb, domnělý promotor Esr3 a fragment Xbal/Xbal o 1,62 kb obsahující domnělý promotor Esr4. Funkční promotor Esr2 o 2,49 kb byl rekonstituován z fragmentu HindiII/BamHI o 2,35 kb L33/1 a fragmentu BamHI/ Xbal o 0,14 kb L33/10 ze základního plasmidu typu pBSSK+ (Stratagene). Orientace šipkami na obr. 1 znamená orientaci 5 3
Příklad 3
Struktura sekvencí v protisměru genů Esr
Porovnání mezi sekvencemi oblastí 5 ukázalo dva typy ho mologie: jednu sekvenci vysoce konzervovanou, která odpovídá sekvenci, která se blíží k 265 párům bází a retrotranspozní sekvence v distální části. Ačkoli retrotranspozní sekvence jsou ve všech třech promotorech v různých orientacích a polohách, nezdá se, že hrají významnou úlohu v expresi genů Esr. V důsledku toho 265 párů bází by obsahovalo celou informaci cis potřebnou k expresi genů specifických pro oblast obklopující klíček.
Dohodnutá sekvence (SEQ ID No 7) se získá po seřazení tří promotorových nukleotidových sekvencí a použitím logického Sequenceru 3.1 společnosti Genes Codes Corporation (Ann. Arbor, MI 48106).
Degenerované báze jsou popsány v publikaci Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry (1985): Nomenclature for incompletly specified nucleic acid sequences.
• 0
European Journal of Biochemistry 150=1-5. Zejména
| B=C, | G | nebo | T, | ale | nikoli | A |
| D=A, | G | nebo | T, | ale | n i ko1 i | C |
| H=A. | C | nebo | T, | ale | nikol i | G |
| K=G | nebo | T |
| M=A | nebo | C |
| N=G, | A.T | nebo C |
| R==G | nebo | A |
| S=C | nebo | G |
V=A,C,nebo G, ale nikoli T
| V=A | nebo | T |
| X—G | , A,T | nebo C a |
| Y=C | nebo | T. |
Patrná je také homologie mezi sousedícími oblastmi, které zasahují do přibližně 500 párů bází mezi promotorem Esr2 a Esr3, jak jsou definovány v SEQ ID No 5 a No 6.
Přítomnost prvků činných v cis se volí ze souboru zahrnujícího konzervované sekvence, z nichž nejvýraznějsi je CTACACCA v tandemu právě 50 bází protisměrně otevřené fáze čtení (obr. 9). Tato sekvence je dobrým kandidátem stát se elementem zodpovědným za genovou expresi specifickou pro tkáň. První z tohoto opakování je ostatně umístěna v kruhu nejvýznamnějšího inversního opakování nacházejícího se ve třech promotorech- 0pakované sekvence plus dvakrát jsou konzervovány pouze mezi promotory pEsr2 a pEsr3 v oblasti s chybějícím promotorem Esrl= například sekvence ATTCT a TTTTA, potenciální usnadňovači transkripce vzhledem ke slabší expresi Esrl (obr. 9) se opakují každá čtyřikrát.
K předvedení funkčnosti elementů cis se připraví konstrukty obsahující nukleotidové promotorové oddělené sekvence napojené na GUS.
4 4 · • *4 * « V · · • · 4 • 4 • ·4 • 444 ·4 • · · · · · 4 · ·
r. <* · • · · · • · 4 ·
44
• 444
Jako příklad k vytvoření delece promotoru Esr2 se použije dvou technik^
- extensivní deleci 5 až 3 na fragmentu HindlII-Xbal pomocí kitu Erase-a-base™ od Promega (konstrukce L140),
- zesílením PCR fragmentů promotoru (konstrukce L194).
Plasmidy L140 a L194 obsahují oddělené promotory Ers2 napojené na referenční Gus a terminátor technikou popsanou v následujícím příkladu.
Pro transformační etapu se fragmenty obsahující konstrukty oddělených promotorů Esr2-Gusa-ter transferují do jiného plasmidu obsahujícího konstrukt “promotoru ubiquitin-luciferase-ter“, který slouží jako interní standard pro kvalifikování aktivity Gus a ke korigování účinku polohy Inserce transgenu do genomu pod expresí, proměnlivé u různých rostlin.
V následující tabulce I jsou fragmenty promotoru Esr2 pocházejícího z těchto deleci.
Tabulka I
Technika zvolené delece Fragment zbylý z promotoru Esr2x
Digesční kit (L140)
Zesílení PCR (L194)
985-2493
1254-2493
1865-2493
1874-2493
1880-2493
2077-2493
2163-2493
2275-2493
2373-2493 x Očíslování promotoru Esr2 je založeno na sekvenci pEsr2 • « · · · 9 9 · · « 99999 9 «
9 9 ·*<
9999 99 ·· 9» uvedené v dodatku (SEQ ID No 2), která pochází z HindlII (AAGCTT nebo A=Poloha 1) na XbaKTCTAGA nebo A=poloha 2493).
K předvedení funkčnosti shora popsaných pomocných nukleotidových sekvencí je autoři klonovali v protisměru raportního genu GUS a získaných konstruktů použili k transformaci rostlin.
Výhodně se získají deletované promotory Esr2 podle následujících protokolů.
Předně se provedou delece 5 na 3 pomocí exonukleázy III. Plasmid L124/19 obsahující promotor genu Esr2 napojený na gen β-glukuronidázu popsanou v příkladu 4.1 se digeruje Hind III k vytvoření místa iniciace delece a pomocí Pstl k vytvoření ochranného místa proti působení exonukleázy III. Delece se provedou za použití kitu Erase-a-base™ (Promega).
Za druhé se promotory zesílí pomocí aiaorce ESRX (5'GGGGTCTAGACT6TGAAGCTATTTTCCA3' ) C SEQ ID restrikční místo (Xbal (podtržené) a ESRH1 (5'GGGGAAGCTTTACATTCTTGCCATAACATA3' (SEQ ID (5'GGGGAAGCTTTTCATCAATAATGCCTCATT3- (SEQ ID (5'GGGGAAGCTTTAATTTCTTACTTCCTATCT3' (SEQ ID cí restrikční místo Hind III (podtržené), digerované Xbal a HindlII nahradí celkový promotor Esr2 protisměrně genu β-glukuronidázy v plaswmidu L124/19.
Ho 8)) obsahující
No 9)), ESRH2 No 10)), ESRH3 No 11)) obsahujíProdukty zesílení
Spojené deletované promotory na genu β-glukuronidázy se pak klonují do plasmidu obsahujícího gen luciferázy pod kontrolou promotoru aktinu rýže. Ten se získá klonováním fragmentu Xhol/Ncol plasmidu pActl-F4 (Mc Elroy D. a kol-, Mol. Gen. Genet. 231, str. 150 až 160, 1991) odpovídajícího promotoru a prvnímu intronu aktinu rýže v plasmidu typu pGP214 obsahujícího gen luciferázy a terminátor nopalinové syntházy (Twell D. a • « toto to to «< · · » ·· · · · to · · • · · to ···· ·· to* ·♦ kol., Development. 109, str. 705 až 713, 1990) digerované Sall/ Ncol. Adaptor obsahující místa restrikce Sall a Notl, vytvořeného nukleotidy 5'GGCCAGTCGACAAAGCGGCCGCATGCA3* (SEQ ID No 12) a 5'TCAGCTGTTTCGCCGGCGT3' (SEQ ID No 13) se zavede do získaného plasmidů digerovaného Notl a Pstl (plasmidů L210). Fragmenty Sall/Notl obsahující deletované promotory spojené s genem (X-glukuronidázy se klonují do plasmidů L210 digerovaného Sall a Notl.
Příklad 4
Příprava chimerních konstrukt.fi
Všechny konstrukty se mohou realizovat zvláště způsoby, které popsal Sambrook a kol. (Molecular Cloning - A laboratory manual. Cold Sprig Harbor Laboratory Press, 1989). Adaptátory, kterých je možno použít jako příkladu pro klonování těchto fragmentů v protisměru různých ovlivňjících genů, jsou popsány v restrikčních plánech odpovídajících plasmidů.
4-1 Chimérní konstrukty GUS
Plasmid L23/7 (Esrl) se deletuje z fragmentu Sací obshujícího místa nežádoucí restrikce. Pak se zavede fragment Xbal/ EcoRI s 2164 páry bází plasmidů pBHOl (Jefferson a kol, Plant Nuclear Biology Reportér 5 (4), str. 387 až 405, 1987) obsahujícího gen Gus (kódující B-glukuronidázu avšak zbavený promotoru) a koncová sekvence nos. Takto vytvořený nový plasmid a tedy digerovaný Xhol a produkt digesce obsahující podpůrnou oblast napojenou na gen Gus a umístěnou proti jeho směru se subklonují do vektoru pBCKS-»- (Stratagene) tak, aby promotor byl v blízkosti hybridizační zóny iniciátoru T7 umožnujuící tak získat plasmid L82/34 (obr. 2, tabulka II).
Podle podobného protokolu a s indikovanými restrikčními • · • · «444
4 4 · · ·
4· 44 enzymy podle obrázků je možno získat plasmidy L124/19 (pEsr2-GUS, obr. 3, tabulka III) a L127a5 (pEsr3-GUS, obr. 4, tabulka IV).
Je rovněž možno použít jiných reportérových genů nahražen£m GUS například GFP (Green Fluorescent Protein, Siemering K. R. a kol., Current Biology 6, str.1653 až 1663, 1996) k potvrzení získaných výsledků s GUS.
Podle právě popsaného podobného protokolu se napojí fragment HindiII-Xbal promotoru pEsr2 na sekvenci kódující GFP.
Tabulka II
Charakteristiky plasmidu L82/34
| Fragment | Poloha | Odkaz |
| pEsrl Gus ter nos cat | 741-1272 1302-3107 3181-3434 5878-5223 | |
| pBCKS+ L23/7 (pEsrl) pBIlOl L23/7 (proti ssěru) pBSSK+ pBCKS+ | 1-740 741-1272 1273-3436 3437-3763 3764-3769 3770-6428 | Stratagene Opsáhl-Ferstad et al, 1997* a podle příkladu Jefferson et al, 1987 Opsáhl-Ferstad et al, 1997 a podle příkladu Stratagene Stratagene |
χ insert odpovídá fragmentu Esrlgl vyznačenému na obr. 4 podle Opsahl-Ferstada a kol. (The Plant J. 12, str. 235 až 246, 1997) φφ ··· · ·· ·· <· φ φ φφφφ φ φφφ· · •Φ φφ φφ φφφφ
Tabulka III
Charakteristiky plasmidu L124/Í9
| Fragment | Poloha | Odkaz |
| pEsr2 Gus ter nos bia | 689-3175 3205-5010 5084-5337 7441-6584 | |
| pBSSK+ | 1-674 | Stratagene |
| Linker JFB 34 | 675-688 | podle příkladu1y |
| L33/1 (pEsr2') | 689-3037 | podle príkladuxx |
| L33/10 (pEsr2) | 3038-3175 | Opsahl-Ferstad et al, 1997 a (podle příkladux |
| pBIlOl | 3176-5339 | Jefferson et al, 1987 |
| linker JFB56 | 5340-5346 | podle příkladu25 |
| pBSSK+ | 5347-7566 | Stratagene |
χχ inserty jsou uvedeny částečně jako fragment Esr2gl na obr. 4 podle Opsahl-Ferstada a kol. (The Plant J. 12, str. 235 až 246, 1997).
1) adaptor JFB34 : 5' TCGACTGCAGCCCA 3' (SEQ ID n° 14)
3' GACGTCGGGTTCGA 5’ (SEQ ID n° 15)
2) adaptor JFB56: 5- CTAGACCCGAATTCGC 3’ (SEQ ID n° 16)
3' TGGGGTTAAGCGCCGG 5' (SEQ ID n° 17)
Tabulka IV
Charakteristiky plasmidu L127a5
| Fragment | Poloha | Odkaz |
| pEsr3 Gus ter nos | 689-2390 2420-4225 4229-4552 | |
| bia | 6656-5799 | |
| Pbssk+ | 1-674- | Stratagene |
| Linker JFB 34 | 675-688 | podle příkladu |
| L102c24 (pEsr3) | 689-2390 | podle příkladu |
| pBIlOl | 2391-4554 | Jefferson et al, 1987 |
| linker JFB56 | 4555-4561 | podle příkladu |
| pBSSK+ | 4562-6781 | Stratagene |
·♦ ··
9 9 ·
9 9
9 9
9 9
9999 ·· ····
4-2 Chimérní konstrukty lpt
Gen kódu lpt pro isopentenyltransferázu, který je jedním z enzymů aplikovaných při syntese cytokininu, je fytohormon mající úlohu v buněčném růstu rostlin. Sekvenci genu stanovil Heidekamp F. a kol. (Nucl.Acids Res. 11, str. 611 až 6223, 1983). Další práce ukázaly, že tato sekvence za řízení jedním specifickým promotorem klíčku by umožnila zvýšit obsah v sušině rajčete (Martineau B. a kol., 1995).
Popsaným způsobem klonování a s fragmenty nukleových kyselin a restrikčních enzymů, vyznačených na odpovídajících obrázcích, mohly být připraveny konstrukty pEsrl-lpt (obr. 5, tabulka V) a pEsr2.1pt (obr. 6, tabulka VI). Rovněž je možno získat konstrukt pEsr3-lpt podle stejného protokolu. Pro přípravu těchto konstruktů bylo použito místo míst Xbal, míst Ncol (CCATGG) přečnívajících kodon ATG od začátku fáze otevřeného čtení.
Tabulka V
Charakteristiky plasmidu L78al
| Fragment | Poloha | Odkaz |
| pEsrl. ipt ter ipt bia | 310-844 846-1565 1566-1850 2963-3823 | |
| pUC118 | 1-231- | Boehringer |
| L23/7 (pEsrl) | 232-844 | Opsahl-Ferstad et al, 1997 et cet exemple |
| přesná mutace , | 845 | Zhang et al, 1996 |
| pRZl | 846-1883 | Zhang et al, 1995 |
| pUC118 | 1884-4763 | Boehringer |
4 4 «
» ·· • · 4 • · ·
Tabulka VI
Charakteristiky plasmidu L125a2
| Fragment | Poloha | Odkaz |
| pEsr2 ipt ter ipt bia | 689-3183 3185-3904 3905-4189 6309-5449 | |
| pBSSK+ | 1-674 | Stratagene |
| Linker JFB 34 | 675-688 | podle příkladu |
| L33/1 (pEsr2') | 689-3037 | podle příkladu |
| L33/10 (pEsr2) | 3038-3183 | Opsahl-Ferstad et al, 1997 a podle příkladu |
| přesná mutace | 3184 | Zhang et al, 1996 |
| pRZl | 3185-4198 | Zhang et al, 1995 |
| adaptateur JFB 56 | 4199-4214 | ipodle příkladu |
| pBSSK+ | 4215-6434 | Stratagene |
4-3 Chimerní konstrukty barnázy
Barnázový gen kóduje RNázu. Tento gen byl izolován pomocí Bacillus amylolíquefaciens (Hartley a kol., J. Mol. Biol. 202, str. 913 až 915, 1988). Jeho použití k vytvoření mužských sterilních rostlin je popsáno v evropském patentovém spise číslo EP 344 029 (Mariani a kol., 1990).
V rámci vynálezu byly získány plasmidy L77al01 (pEsrl-barnázy) a L126a3 (pEsr2-barnázy) popsané na obr. 7 (tabulka VII) a ba obr. 8 (tabulka VIII) z plasmidu promotoru A6-barnázy popsaného ve V0 92/11379 nahrazením pA6 promotory pEsrl a pEsr2 technikou zunámou pracovníkům v oboru.
Je také možno získat konstrukt pEsr3-Barnáza podle podobného protokolu.
• φ Φφφφ • Φ ·· φφφ* φφ φ φφφφ φφφ φφφ φφ · • φφφφφ φ φφφ φ φ φ φ φφφφ φφφ φφφφ φφ φφ φφ φφ φφφφ
Tabulka VII
Charakteristiky plasmidu L77al01
| Fragment | Poloha | Odkaz | du 1 |
| pEsrl Bamase ter CaMV bia | 80-605 613-945 1571-2257 4324-3467 | ||
| pA3 L23/7 (pEsrl) pA3 | 1-28 29-605 606-4473 | Scott et al, 1992 Opsahl-Ferstad et al, 1997 a podle příkla Scott et al, 1992 |
Tabulka VIII
Charakteristiky plasmidu L126a3
| Fragment | Poloha | Odkaz |
| pEsr2 Bamase ter CaMV bia | 43-2529 2537-2869 3495-4181 6248-5391 | |
| pA3 | 1-28 | Scott et al, 1992 |
| linker JFB34 | 29-42 | podle příkladu |
| L33/1 (pEsr2') | 43-2391 | ipodle příkladu |
| L33/10 (pEsr2) | 2392-2529 | Opsahl-Ferstad et al, 1997 a podle příkla |
| pA3 | 2530-6397 | Scott et al, 1992 |
4-4 Chimerní konstrukt antiEsr2
Rekonstituovaný funkční promotor Esr2 (2,49 kb), popsaný v příkladu 2 a volený přednostně se zřetelem k výsledkům kvantitativní exprese, popsaným v příkladu 1, se nafúzuje na sekvenci Esr2g2 (Opsahl-Ferstad H.D. a kol.,The Plant.J. 12, str. 235 až 246, 1997) vzatou v protisměru, jež je sama nafuzovaná na terminátor Nos.
Následujícím protokolem se s výhodou získá chimerní • · • »
4 4 4 « · • 44 ·
4 ·
konstrukt obsahující gen Esr2 v protisměru za řízení jeho čistým promotorem.
Do plasmidu odvozeného z pJIT3O obsahujícího promotor 35S se mezi místa BamHI a EcoRI začlení mnohočetné místo klonování a koncová sekvence viru mozaiky zelí (Guerineau F. a kol., Plant. Mol. Biol. 15, str. 127 až 136, 1990), adaptér obsahující místo Spěl a tvořený oligonukleotidy <5 'GATCCACTAGTCCCG (SEQ ID No 18) a (5'AATTCGGGACTAGTG CSEQ ID No 19). Fragment EcoRI/Spel plasmidu L42al4 (Opsahl-Ferstad H.D. a kol., The Plant. J. 12, str. 235 až 246, 1997)) se začlení do shora popsaného plasmidu. Takto získaná konstrukce obsahuje gen Esr2 v protisměrné orientaci za řízení promotorem 35S (plasmid L79b5).
Promotor 35S se zatlačí do plasmidu L79b5 restrikicí Sací a HindlII nahradí se adaptérem obsahujícím restriklční místa HindlII a Notl a tvořená oligonukleotidy C5'AAGCTTTTTGCGGCCGC (SEQ ID No 20) a (5'TC6AGCGGCCGCAAAAAGCTTAGCT (SEQ ID No 21)). Do tohoto adapteru se zavede promotor Esr2 ve formě fragmentu HindlII/Notl 2,44 kb. Takto získaná konstrukce obsahuje gen Esr2 v protisměrné orientaci za řízení jeho vlastním promotorem Cplasmid L129/46 (obr. 11).
Podobným protokolem je možno získat konstrukty obsahující promotor Esr2 navázaný na protisměrnou sekvenci Esrl a Esr3. Je také možno získat stejný t.yp chimerních konstruktů s jinými promotory Esr podle vynálezu. Získají se rovněž konstrukty obsahující konstitutivní promotor 35S, navázaný na protisměrnou shora popsanou sekvenci Esr.
Příklad 5
Získání transgenních rostlin (nutnost stabilní transformace kukuřice)
Zkušenosti s transitni expresí používající transformaci bombardováním rostlinných buněk chimerními konstrukty pEsr-GUS a konstrukčním promotorem Gus, nedávaly výsledky ukazující specifičnost exprese testovaných promotorů: nebyla pozorována žádná aktivita v zóně definované buňkami Esr. Malé rozměry této zóny a ostatních vlastních součástí mohly vysvětlovat skutečnost, že technika není přizpůsobena ve standardních podmínkách transitní expresi. Jako příklad jsou sledované konstitutivní testované promotory aktinu rýže (McElroy a kol., 1992), ubiquitinu kukuřice (Christensen a kol., Transgenic Res. 5, str. 213, 1996), Adh kukuřice (Denis a kol., Nucl. Ac. Res. 12, str. 3983 až 4000, 1984) a 35S (Oděli a kol., Nátuře 313, str. 810 až 812, 1985) zavádějící modré zabarvení do plného albumenu, což ukazovalo funkčnost transformačního systému, avšak nikoli v zóně obklopující klíček, což potvrzuje nepřizpůsobeni systému na tuto zónu.
K transformaci zaměřené na stabilní expresi bylo tedy nutno studovat specifičnost exprese promotorů podle vynálezu.
5-1 Bombardování částicemi
Způsob spočívá v použití bombardování částicemi stejnými jaké popsal J.Finer (Plant Cell Report 11, str. 323 až 328, 1992). Cílovými buňkami jsou buňky indiferentní k rychlému dělení mající zakonzervovanou schopnost regenerace celých rostlin. Tento typ buněk tvoří klíčkotvorný kalus kukuřice (nazývaný typ II). Kalusy se získají z nezralých klíčků genotypu Hill způsobem a v prostředí, které popsal Armstrong (Maize Handbook: nakladatelé M. Freeling, V.Walbot, str. 665 až 671, 1994). Tyto fragmenty kalusů o povrchu 10 až 20 mm2 se čtyři hodiny před bombardováním uloží v množství 16 fragmentů na misku do Petriho misek obsahujících kultivační prostředí identické s iniciačním prostředím s přísadou 0,2 M manitolu +0,2 M sorbitolu. Plasmidy, popsané v předchozích příkladech a ne24 toto toto • · to ·· tototo·
to · • · · •·· · · · • · ·
• to • · • · tto ···· soucť zaváděcí geny, se čistí na sloupci OiagenR podle instrukcí výrobce. Pak se vysrážejí na částicích wolframu (M10) podle Kleinova protokolu (Nátuře 327, str- 70 až 73, 1987). Takto obalené částice se vrhají na cílové buňky dělem podle protokolu, který popsal J. Finer (Finer J. Plant Cell Report. 11, str. 323 až 328, 1992). Misky s takto bombardovanými kalusy se pak zalijí prostředkem ScellofraisH, načež se kultivují ve tmě pří teplotě 27 C. K prvnímu prepichování dojde po 24 hodinách, pak vždy po 15 dnech během tří měsíců ve stejném výchozím prostředí s přísadou selektivního činidla. Po třech měsících nebo někdy dříve, se získají kalusy, jejichž růstu nebylo bráněno selektivním činidlem, obvykle a hlavně sestávajícím z buněk pocházejících z dělení buňky, do jejíhož genetického prostředí bylo integrováno několik kopií selekčního genu. Frekvence získávání takových kalusů je přibližně 0,8 kalusu na bombardovanou misku.
Kalusy se identifikují, rozjednotí, zesílí a pak se kultivují k regeneraci rostlin za modifikace hormonální a osmotické rovnováhy buněk způsobem který popsal Vain a kol. (Plant Cell Tissue and Organ Culture 18, str. 143 až 151, 1989). Tyto rostliny se aklimatizují ve skleníku nebo se mohou křížit k získání samosprašných hybridů.
5-2. Transformace agrobakteriem
Jinou technikou transformace, použitelnou v rámci vynálezu, je použití Agrobacter i um tumefaciens podle protokolu, který popsal Ishida a kol. (Nátuře Biotechnology 14, str. 745 až 750, 1996), zvláště na nezralých klíčcích deset dní po oplodnění. Všechna používaná prostředí jsou popsána v citované literatuře. Transformace začíná s fází společné kultury, kde jsou nezralé klíčky kukuřice uvedeny do styku na pět 5 minut s Agrobacteriem tumefaciens LBA 4404 obsahujícím superbinární vektory. Superbinární plasmid je výsledkem homologové rekombi25
nace mezi intermediárním vektorem nesoucím ADN-T obsahujícím sledovaný gen a/nebo selekční markér odvozený z plasmidů popsaných v předchozích příkladech a vektor pSBl japonského tabáku (evropský patentový spis číslo EP 672 752), který obsahuje: geny virB a virG plasmidu pTiBo542 obsažené v supervirulentní vrstvě A281 Agrobacterium tumefaciens (ATCC 37349) a homologickou oblast nacházející se v intermediárním vektoru umožňující tuto homologickou rekombinaci. Klíčky se pak uloží na tři dny do prostředí LSAs ve tmě při teplotě 25 C. K první selekci dojde na transformovaných kalusech: klíčkogenní kalusy se přenesou do prostředí LSD5 obsahujícího 5 rag/1 fosfinotricinu a cefotaximu 250 mg/l (vyloučení nebo omezení kontaminace Agrobacteriem tumefaciens). Tato etapa probíhá dva týdny za o
tmy při teplotě 25 C. Druhá etapa selekce se provádí přenesením klíčků, které se vyvinuly v prostředí LSD5 do prostředí LSD10 (fosfinotricin 10 mg/ml) v přítomnosti cefotaximu, během tří týdnů za stejných podmínek jako prve. Třetí etapa spočívá ve vyříznutí kalusů typu I (fragmenty 1 až 2 mm) a přeneo sení na tři týdny ve tmě při teplotě 25 C do prostředí LSD10 v přítomnosti cefotaximu.
Regenerace rostlinek se provede vyříznutím kalusů typu I, které proliferují a jejich přenesním do prostředí LSZ v přítomnosti 5 mg/l fosfinotricinu a cefotaximu na dva týdny při teplotě 22 C za tvalého osvětlení.
Regenerované rostlinky se přenesou do prostředí RM-+-G2 obsahujícího 100 mg/l Augmentinu na dva týdny při teplotě 22 C za trvalého osvětlení k vývojové etapě. Získané rostliny se pak přenesou do fytotronu k jejich aklimatizaci.
5-3 Způsob vhodný pro barnasové konstrukty: retransformace kalusů act-barstar
Chimerních barnasových konstruktů popsaných v příkladu 3
• ti titi • titi ti • · ti ti tititi ti ti • tititi titi • ti titititi • ti • ti • ti • ti ti se může využít ke klasické transformaci jedním nebo druhým shora popsaným způsobem.
Podle jednoho výhodného způsobu přizpůsobeného toxickému charakteru barnasy se používá k transformaci předběžně transformovaných kalusů obsahujících barst-arový gen, který kóduje specifický inhibitor Barnasy (Hartley a kol., J. Mol. Biol. 202, str. 913 až 915, 1988). Tento gen slouží jako ochrana'' během procesu regenerace těchto kalusů, který probíhá v podstatě z klíčekgeneze kukuřice.
Etapa a= získání linie exprimující barstar a plasmid obsahující gen resistentní k hygromycinu:
První etapa transformace probíhá podle popsaných protokolů s plasmidem pVP280 obsahujícím kazetu pActin-intron-Barstar-Nos póly A.
Tato kazeta se získá v těchto stupních: barnasový fragment se aplikuje pomocí PCR z plasmidu pTG2 (Horovitz a kol., J. Mol. Biol. 216, str. 1031 až 1044, 1990), pak se subklonuje až fragment Xbal/HindiII v plasmidu pBluescript KS+ (Stratagene) poskytujíce plasmid pWP118.
Barstarový gen se pak transfektuje na fragment Xbal/HincII v místě Xbal/Smal plasmidu pW90, odvozeného z plasmidu pJIT30 (Guerineau a kol.,Plant. Mol. Biol. 15, str. 127 až 136, 1990) (promotor 35SCaMV nahrazený dvojitým promotorem 35S a oblastí polyspojovník mezi místy Xbal a EcoRl nahraženými místy Spěl, BainHl, Smál a Pstl).
Oblast polyA CaMV získaného plasmidu se nahradí oblastí nos polyA pEI)23 (Dále a kol., Gene 91, str. 79 až 85, 1991) tvořící plasmid pWP266. Dvojitá promotorové oblast 35S CaMV se nakonec nahradí aktinovým promotorem rýže a intronem z pC0R113 (McElroy a kol., Mol. Gen. Genet.. 231, str. 150 až 160, 1991) φ · «·
φ φφφφ φ φ · φφφ φ φ φ φφφ φφ φφφφ
ΦΦ ΦΦ·· tvořícím plasmid pWP280 Cobr. 10).
Takto získané rostliny promotor aktin-barstar se analyzují způsobem Northern Blot k identifikování rostlin exprimujících korektně ARNm kódující Barstar. Rostliny tako vyrobené poskytují klíčky exprimující gen Barstar použitelné k produkci kalusů typu II známými způsoby: zavedením do kultury klíčků v indukčním prostředí kalogenese a přepichováním v selektivním prostředí obsahujícím hydromycin.
Etapa b; transformace těchto kalusů chimerním konstruktem barnasy:
Kalusy act-barstar získané v předchozí etapě se bombardují způsobem popsaným v odstavci 5-1 prve popsanými konstrukty promotor Esr-barnas plasmidem dodávajícím odolnost Basta CpDM302, McElroy a kol.,Mol. Gen. Genet. 231, str. 150 až 160, 1991). Pak se oba geny oddělí souproudně segregací k zísání samotného promotorového konstruktu Esr-barnase.
V porovnání s klasickým způsobem, který je zaměřen na přímé transformování kalusů konstruktem Esr-barnase se dosáhne výhodným způsobem nej lepších výsledků, zejména pokud jde o účinnost transformace a počet regenerovaných rostlin.
Příklad 6
Zavedení funkčnosti pomocných sekvencí Cpřípad konstruktů GUS)
Ke zjišťování aktivity β-glukuronidázy se sklidí kukuřičná zrna z rostlin transformovaných bombardováním částicemi v přesných stadiích vývoje a podélně se rozříznou. Inkubují se v přítomnosti 5-brom-4-chlor-3~ indoly 1-fJ-D-glukuronové kyseliny (X-GlcA, Duchefa) 24 hodin při teplotě 37 C CJefferson a kol., Plant Nuclear Biology Reportér 5 C4), str. 387 až 405, 1987).
···· • 4 • ·
•« ·· * 9 · • · · • ··· ···· ··
Zvláště v případě konstruktu Esr2-Gus je modré zabarvení omezeno na obrys embrya 4. a 5. dne po opylení, pak pouze na úrovni suspensoru 6. a 7. dne a nakonec na spodině suspensoru ve dnech 9, 12, 13 a 15.
Tyto výsledky exprese v transgenních rostlinách ukazují, že fragmenty 5 popsané ve vynálezu odpovídají funkčním promotorům, a že jsou postačující pro správnou prostoro-časovou expresi, v souhlasu s dosavadními výsledky COpsahal-Ferstad H.D. a kol. The Plant J. 12, str. 235 až 246, 1997).
Použití těchto pomocných nukleových sekvencí v molekulárních konstrukcích určených ke zlepšení kvality zemědělské, potravinové nebo průmyslové rostliny je obzvlášt zajímavé pro modifikování tvaru klíčku a nebo albumenu a jeho vývoje.
Průmyslová využitelnost
Modifikce potravinářských a průmyslových rostlin ke zvýšení jejich užitkovosti, zvláště obsahu škrobu nebo oleje.
/7
Česka republik fy. Vi • · · · • ·
99 9 · 9
L i teratura
Dále a kol
Dabis R.W. a kol., Can. J. Dennis, Nucl. Ac. Res. 12,
Devic a kol., Plant Physiol
Armstrong, Maize Handbook, nakladatelé Freeling M. Walbot V.
Eds-, str. 665 až 671, 1994.
Barloy D. a kol., Maydica 34, str. 303 až 308, 1989.
Becker H.A. a kol., Dopmains of gene expression in developlng endosperm str. 361 až 375, 1999.
Breton C.a kol., Plant Mol.Biol. 27, str. 105 až 113, 1995. Christensen a kol., Transgenic Res. 5, str. 213, 1996.
Clark J.K. a Sheridan W.F., J. Heredity77, str. 83 až 92, 1986. Gene 91, str. 79 až 85, 1990.
Biol. 68, str. 471 až 479, 1990. str. 3983 až 4000, 1984.
Biochem-35, str. 35(4)=331 až 339,
1997.
Finer J., Plant Cell Report. 11, str. 323 až 328, 1992. Gerdes J.T. a Tracy W.F., Crop Sci. 33, str. 334 až 337 Guerche a kol., Mol. Gen. Genet. str. 206 až 382, 1987.
1993.
Gueríneau a kol., Plant. Mol. Biol. 15, str. 127 až 136, 1990. Hartley a kol., J. Mod. Biol. 202, str. 913 až 915, 1988. Heidekamp F. a kol., Nucl. Acids Res. 11 stí'. 6211 až 6223, 1983.
Horovitz a kol., J. Mol. Biol. 216, str. 1031 až 1044, 1990.
Hu a kol., Molecular and General Genetics 248, str. 471 až 480, 1995.
Hueros Θ. a kol., Plant Cell. 7, str. 747 až 757, 1995.
Ishlda a kol., Nátuře Biotechnology 14, str. 745 až 750, 1996. Jefferson a kol-, Plant Nuclear Biology Reportér 5 (4), str.
387 až 405, 1987.
Klein, Nátuře 327, str- 70 až 73, 1987.
Kowles R.V. a Phillips R.L., Int. Rev Cytol. 112, str. 97 až 136, 1988.
Kýle D.J. a Styles E.D., Planta 137, str. 185 až 193, 1977. Liang P. a Pardee A.B., Science 257, str 967 až 971, 1*992.
Lopes M,A. a Larkins B.A., Plant Cell- 5, str. 1383 až 1399,
- a
0 «0
0» ««00
1993.
Maři an i a ko 1 . McElroy a kol. McElroy a kol. Oděli a kol., Opsahl-Ferstad , Nátuře 347, str. 737 až 741, 1990.
, Mol.Gen.Genet. 231, str. 150 až 160, , Plant Cell. 2, str. 163 až 171, 1990. Nátuře 313, str. 810 až 812, 1985.
H.D. a kol., The Plant J. 12, str. 235
1991.
až 246,
1997.
Poole a kol.. Cell 40, str. 37 až 43, 1985.
Sambrook a kol., Molecular Cloning- A laboratory manual- Cold Sprig Harbor Laboratory Press, 1989.
Schel J.H.N. a kol., Can. J. Bot. 62, str. 2842 až 2856, 1984. Scott a kol., světový patentový spis číslo W0 92/11379, 1992.
Siemering K.R. a kol., Current Biology 6, str. 1653 až 1663,
1996.
Twell D. a kol., Development 109, str. 705 až 713, C1990).
Vain a kol. Plant Cell Tissue and Organ Culture 18, str. 143 až 151, 1989.
Xu J. a kol., Plant Physiol. 108, str. 1293 až 1294, 1995. Zhang a kol., The effect of auxin on cytokinim levels and metabolism in transgenic tobacco tissue an ipt gene. Planta
196, str. 84 až 94, 1995.
Zhang a kol. Expression of the isopentyl transferase gene is regulated by auxin in transgenic tobacco tissues- Transgenic Res. 5, str. 57 až 65, 1996.
Vl
PATENTOVÉ • « • * * * ·»··
Claims (16)
- NÁROKYi.Nukleotidová promotorové izolovaná sekvence umožňující expresi kódujících sekvencí, na kterých je vázána, přičemž exprese je i) specifická pro oblast albumenu obklopující klíček v zrnech krytosemenných rostlin a ii) působí obzvláště v časných stadiích vývoje albumenu.
- 2. Nukleotidová promotorova izolovaná sekvence podle nároku 1, izolováná z obilovin, zvláště z kukuřice.
- 3. Nukleotidová promotorové izolovaná sekvence podle nároku 1 nebo 2 , obsahující sekvence SEQ ID No 1, No 2, No 3, No 4, No 5 No 6 nebo No 7 nebo všechny jejich homologové sekvence.
- 4. Nukleotidová promotorova izolovaná sekvence podle nároku 1 až 3, obsahující regulační element cis definovaný motivem CTACACCA opakovaným s výhodou za sebou.
- 5. Expresní kazeta vyznačující se tím, že obsahuje promotorovou nukleotidovou sekvenci podle nároku 1 až 4, vázanou operativně na alespoň jeden sledovaný gen.
- 6- Expresní kazeta podle nároku 5,vyznačuj ící se t í a, že sledovaný gen kóduje protein volený ze souboru proteinů účastnících se ve vývoji klíčku nebo albumenu, buněčného růstu, metabolismu cukrů nebo mastných kyselin, toxického proteinu a proteinu inhibujícího transkripci.
- 7. Expresní kazeta podle nároku 5 nebo 6, vyznačující se tím, že sledovaný gen kóduje protein volený mezi barnásou a isopentenyltransferázou.
- 8. Expresní vektor, vyznačující že obsahuje expresní kazetu podle nároku 5 až 7.tím, *00 0 · 0 0 0 · 0 00000 0 000 0 0
- 9. Hostitelská buňka krytosemenné rostliny, zejména obilniny transformovaná vektorem podle nároku 8.
- 10. Transgenní rostlina nebo část této rostliny, zejména ovoce, semen, zrn, pyly, vzniklé z buňky podle nároku 9.
- 11. Rostlina nebo část rostliny podle nároku 10 ze souboru zahrnujícího obilovinu nebo rostlinu olejnatou, volenou ze souboru zahrnujícího pšenici, řepku, slunečnici a především kukuřici.
- 12. Hybridní transgenní rostlina získaná křížením rostlin podle nároku 10 nebo 11.
- 13. Způsob získávánmí krytosemenné rostliny se zlepšenými zemědělskými nebo nutričními vlastnostmi , vyznačuj í c i se t í m, že se- transorrauje alespoň jedna buňka krytosemenné rostliny vektorem podle nároku 8,- kultivuje se takto transformovaná buňka způsobem k vytvoření rostliny obsahující ve svém genomu expresní kazetu podle nároku 5 až 7.
- 14- Použití expresní kazety podle 5 až 7 k získání transgenní krytosemenné rostliny se zlepšenými zemědělskými nebo nutričními vlastnostmi.
- 15. Použití podle nároku 14 k získání transgenní rostliny produkující zrna obsahující škrob nebo olej modifikovaná v porovnání s netransformovanou rostlinou.
- 16. Použití rostliny nebo části rostliny jmenovitě semene, zrna nebo plodu podle nároku 10 až 12 k přípravě odvozených produktů, zejména potravinářských.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9912305A FR2799203B1 (fr) | 1999-10-01 | 1999-10-01 | Promoteurs specifiques de l'albumen des graines de vegetaux |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20021139A3 true CZ20021139A3 (cs) | 2002-06-12 |
Family
ID=9550506
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20021139A CZ20021139A3 (cs) | 1999-10-01 | 2000-09-19 | Specifické promotory albumenu rostlinných zrn |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7071378B1 (cs) |
| EP (1) | EP1218510B1 (cs) |
| AU (1) | AU782957B2 (cs) |
| CA (1) | CA2385763C (cs) |
| CZ (1) | CZ20021139A3 (cs) |
| FR (1) | FR2799203B1 (cs) |
| HU (1) | HUP0203513A2 (cs) |
| PL (1) | PL354293A1 (cs) |
| WO (1) | WO2001025439A1 (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7534933B2 (en) * | 2000-08-18 | 2009-05-19 | University Of Connecticut | Transgenic plants overexpressing a plant vacuolar H + -ATPase |
| US20020178464A1 (en) * | 1999-11-10 | 2002-11-28 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Proton transporters and uses in plants |
| US8697950B2 (en) * | 1999-11-10 | 2014-04-15 | University Of Connecticut | Vacuolar pyrophosphatases and uses in plants |
| FR2828210B1 (fr) * | 2001-08-01 | 2004-08-06 | Agronomique Inst Nat Rech | Acide nucleique regulateur permettant l'expression d'un polynucleotide d'interet specifiquement dans l'endothelium d'une graine de plante, et ses applications |
| US7276596B2 (en) | 2003-02-25 | 2007-10-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Promoter from maize invertase inhibitor gene |
| GB0606033D0 (en) * | 2006-03-24 | 2006-05-03 | Univ Bath | Plant Promoters, Coding Sequence And Their Uses |
| AU2017249663B2 (en) | 2016-04-11 | 2023-04-20 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Seed-specific and endosperm-preferential promoters and uses thereof |
| EP3443098A1 (en) | 2016-04-11 | 2019-02-20 | Bayer CropScience NV | Seed-specific and endosperm-preferential promoters and uses thereof |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0412006B1 (en) * | 1989-08-04 | 2000-11-29 | Aventis CropScience N.V. | Plants with modified flowers, seeds or embryos |
| CA2071943C (en) * | 1989-12-22 | 2007-04-24 | Joan Tellefsen Odell | Site-specific recombination of dna in plant cells |
| EP0611395A1 (en) * | 1991-11-05 | 1994-08-24 | Novartis AG | Improved supersweet corn |
| US6326527B1 (en) * | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
| FR2744134B1 (fr) * | 1996-01-29 | 1998-04-03 | Biocem | Proteines de reserve de plantes enrichies en acides amines, notamment alpha-zeine de mais enrichie en lysine plantes exprimant ces proteines |
| WO1998008961A2 (en) * | 1996-08-30 | 1998-03-05 | Olsen Odd Arne | Endosperm and nucellus specific genes, promoters and uses thereof |
| WO1998010062A1 (en) * | 1996-09-03 | 1998-03-12 | Monsanto Company | Monocot seed gene expression system |
| US7053282B1 (en) * | 1998-02-09 | 2006-05-30 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Alteration of amino acid compositions in seeds |
-
1999
- 1999-10-01 FR FR9912305A patent/FR2799203B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-09-19 EP EP00964322.2A patent/EP1218510B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-19 AU AU75283/00A patent/AU782957B2/en not_active Expired
- 2000-09-19 WO PCT/FR2000/002596 patent/WO2001025439A1/fr not_active Ceased
- 2000-09-19 CA CA2385763A patent/CA2385763C/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-09-19 CZ CZ20021139A patent/CZ20021139A3/cs unknown
- 2000-09-19 HU HU0203513A patent/HUP0203513A2/hu unknown
- 2000-09-19 PL PL00354293A patent/PL354293A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-09-19 US US10/089,612 patent/US7071378B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1218510A1 (fr) | 2002-07-03 |
| CA2385763C (fr) | 2012-11-27 |
| AU782957B2 (en) | 2005-09-15 |
| FR2799203B1 (fr) | 2003-03-21 |
| US7071378B1 (en) | 2006-07-04 |
| AU7528300A (en) | 2001-05-10 |
| CA2385763A1 (fr) | 2001-04-12 |
| EP1218510B1 (fr) | 2015-11-11 |
| HUP0203513A2 (hu) | 2003-08-28 |
| FR2799203A1 (fr) | 2001-04-06 |
| PL354293A1 (en) | 2003-12-29 |
| WO2001025439A1 (fr) | 2001-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2332628C (en) | Seed-preferred promoters | |
| US6215051B1 (en) | Aarobacterium-mediated method for transforming rice | |
| CA2544272C (en) | Meg1 endosperm-specific promoters and genes | |
| US6403862B1 (en) | Seed-preferred promoter from maize | |
| US5460952A (en) | Gene expression system comprising the promoter region of the α-amylase genes | |
| EP1000164B1 (en) | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of streptavidin | |
| US20020148007A1 (en) | Seed-preferred promoter from barley | |
| AU2018220084A1 (en) | Method for plant improvement | |
| CN102575249B (zh) | 胚乳中有效的植物启动子及其用途 | |
| US8796507B2 (en) | MEG1 endosperm-specific promoters and genes | |
| EP2189532A1 (en) | Promoters from coffee | |
| US6921815B2 (en) | Cytokinin Oxidase Promoter from Maize | |
| CZ20021139A3 (cs) | Specifické promotory albumenu rostlinných zrn | |
| CN1423520B (zh) | 调节植物细胞分裂的组合物和方法 | |
| JP2004504031A (ja) | リポキシゲナーゼ遺伝子、プロモーター、シグナルペプチド、およびそのタンパク質 | |
| US7741534B2 (en) | Cytokinin oxidase promoter from maize | |
| US7112723B2 (en) | Globulin 2 regulatory region and method of using same | |
| HU227022B1 (en) | Plant reproduction proteins | |
| US20050086716A1 (en) | Nucleic acids coding for a ISUM2A polypeptide and use of said nucleic acids to obtain transformed plants producing seeds altered in germ development | |
| CN105018496A (zh) | 一种具有胚乳特异表达特性的DNA片段pENP5及其应用 | |
| WO2009030163A1 (fr) | Gène responsable de la synthèse d'acides gras dans le riz et son application | |
| JP2000157080A (ja) | アルファ―アミラ―ゼ遺伝子のプロモ―タ―領域を含んでなる遺伝子発現系 | |
| AU1468401A (en) | Seed-preferred promoter from barley |