CZ20021874A3 - Alergeny hmyzích jedů se sníľenou 1gE- reaktivitou a způsob jejich přípravy - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantních alergenů hmyzích jedů a způsobu jejich cílené výroby, přičemž se alergeny rozlišují podle provedení výrobního způsobu konformací neboli vinutím (folding”) identickým s přírodním nebo jiným než přírodním.

Použití pro formy vinutí, které odpovídají přírodním molekulám spočívá v diferenční diagnostice jednotlivých alergenů (in vitro nebo in vivo) od alergiků, zvláště alergiků na hmyzí j ed.

Umělé formy vinutí mohou být nasazeny jako léčiva s malými vedlejšími účinky ke speciální imunoterapii. Tím mohou tyto rekombinantní varianty vinutí ovlivňovat bezpečnější léčení než přírodní látka. Způsob je tak koncipován, že může být provedena biotechnologická výroba za podmínek nutných pro léčiva (GMP).

Dosavadní stav techniky

Alergie na hmyzí píchnutí jsou způsobovány hlavně vosami a včelami a mohou vést k těžkým systémickým příznakům, až ke smrtelně probíhající anafylaxi (Muller, U.R., Insect sting allergy, nak1adate1stbí Gustav Fischer 1990). U látek, vyvolávajících alergii typu 1, jde o proteiny, g1ykoproteiny nebo polypeptidy hmyzího jedu. Tyto alergeny reagují v případě senzibi 1 izovaných lidí po injekci s molekulami IgE vázanými na povrchu mastocytových buněk. Jestliže se takové Fc RI vázané molekuly alergenem navzájem zesítí, vyřadí se mediátory (například histamin, leukotrien) a cytokiny efektorovou buňkou a • · • · · · vyvjnou se odpovídající klinické symptomy.

Jako alergenové složky včelího jedu působí kromě peptidu melittin enzym hyaluroň idáza a fosfolipáza A2 (Habermann E., Science 177, str. 314 až 322, 1972). V případě vosy se vyskytují jako enzymaticky aktivní hlavní alergeny rovněž hyaluronidáza, která je podobná jako u včelího jedu (Hoffmann D.R., J. Aliergy Clin. Immunol. 78, str. 337 až 343, 1986) a fosfolipáza Al. Nejdůležitějším hlavním alergenem vosího jedu je antigen 5, pro který nebylo dosud možno prokázat žádnou enzymatickou aktivitu (King a kol., Biochemistry 17, str. 5165 až 5174, 1978). Všechny jmenované alergeny už byly charakterizovány z hlediska molekulární biologie a odpovídající molekuly cDNA klonovány (například Fang a kol., PNAS, str. 895 až 899, 1988; Soldátova a kol., FEBS str. 145 až 149, 1993; Kuchler a kol., Eur. J. Biochem., 184, str. 249 až 254, 1989). Pomocí sekvencí cDNA je možno připravovat rekombinantní alergeny, které by mohly nalézt uplatnění v diagnostice a terapii alergií (Scheiner a Kraft, Aliergy 50, str. 384 až 391, 1995).

Podle vynálezu má zvláštní význam jako hlavní alergen antigen 5, jelikož se vynález příkladně zabývá touto molekulou. Jde při tom o neglýkolyžovaný protein o velikosti přibližně 25 kDa. Primární sekvence obsahuje 8 cystě i nových zbytků, což poukazuje na čtyři disulfidové můstky (Hoffman D.R., J. Aliergy Clin. Immunol. 92, str. 707 až 716, 1993). Klasické nasazení k účinnému terapeutickému ošetřování alergií na hmyzí jed představuje imunoterapie nebo hyposenzibi láce (MÍiller U.R., Insect, sting aliergy, nakladatelství Gustav Fischer 1990). Pří tom se pacientovi injektují subkutánně alergenové extrakty ve vzrůstajících dávkách. Při tomto způsobu však nicméně přetrvává nebezpečí alergických reakcí až k anafylakt ickému šoku. Jelikož právě v případě hyposenzibilácí způsobených píchnutím hmyzem je nutno počítat se silnými reakcemi, provádí se dosud výhradně stacionárně.

Optimalisace terapie by byla možná s rekombinantně vyrobenými alergeny obzvláště v případech alergií na píchnutí hmyzem. Definované kokteily, případně přizpůsobené k individuálním senzibilačním vzorům pacientů, vysoce čistých alergenů vyrobených rekombinantně (Scheiner a Kraft, 1995) by mohly nahradit extrakty alergenů z přírodních zdrojů. Reálné perspektivy, které by mohly vést k bezpečné hyposenzibi 1aci těmito rekombinantnimi alergeny nabízejí cíleně mutované rekombinantní alergeny, při kterých se vyloučí specificky Ig-epitopy aniž se poškodí epitopy T-buněk nezbytné pro terapii (Schramm a kol., J. Immunol. 162, str. 2406 až 2414, 1999). 0 heterologové expresi v E-coli je známo, že většina eukaryontových proteinů nezaujímá přirozená uspořádání nebo jen je zaujímá v nepatrné míře. Důsledkem těchto chybných vinutí je často nerozpustnost těchto proteinů. To lze pozorovat zejména u proteinů obsahujících cystein (Kuchler a kol., Eur. J. Biochem. 184, str. 249 až 254, 1989). Obzvláště o antigenu 5 se uvádí, že exprese v bakteriích vede k nerozpustným agregátům, které nemají přírodní uspořádání. (Monsalve a kol., Protein Express Purif. 16(3), str. 410 až 416, 1999). Takové nerozpustné agregáty se nehodí ani k diagnostice, ani k terapii.

Často se proteiny nerozpustné v E.coli pro výzkumné účele připravují v eukaryotickém expresním systému, jako jsou například kvasnice nebo hmyzí buňky (Monsalve a kol., Protein Express Purif. 16(3), str. 410 až 416, 1999; Soldátova a kol.. J. Allergy Clin. Immunol. 101, str. 691 až 698, 1998). Nedostatky eukaryotických expresních systémů představují však především možné hyperg1ykosy1ace (Grobe a kol., Eur. J. Biochem. 263, str. 33 aš 40, 1999) proteocyk1 ické odbourávací procesy a porovnatelně žádné výtěžky produktu (Glover a Hames (vydvatelé) Expression Systems, IRL Press, Oxford-New York-Tokyo, 1995). Pro alergologické použití ve smyslu farmaceuticky-medičínské diagnostiky a terapie se proto takové proteiny většinou nehodí.

• · · · • · · · · · · • · · · · · · · • ·· ··· · · • · · · · · · • · ·· ·· · · · ·

Podstatou vynálezu je rekombinantní hmyzový alergen mající sníženou IgE-reakti v i tu, případně alergenitu.

Podstata vynálezu

Jde tedy o rekombinantní hmyzový alergen se 1gE-reakti vi tou, případně alergenitou. Podle vynálezu alergen i ta těchto proteinů snížena až o 95 % ve s př í rodri í m i a 1 ergeny.

sn í ženou je tato srovnán í

Produktů získaných způsobem podle vynálezu, které mají přírodní uspořádání, je možno s výhodou použít v diagnostice alergických onemocnění in vitro a in vivo, speciálně alergie na píchnutí hmyzem. Tato s přírodou identická forma vinutí je k disposici pro detekci protilátek IgE v zavedeném způsobu.

Na druhé straně se mohou používat varianty připravené podle vynálezu, které se vyznačují v podstatě nereaktívní nebo jen částečně 1gE-reaktivní konformací, jako hypoalergenové složky v prostředcích ke specifické imunoterapií. Výrazem hypoal ergen se podle vynálezu rozumí snížená o 5 až 95 %, obzvláště o 20 až 85 % nebo až chybějící alergie (oproti přírodním alergenům), která je podmíněna sníženou odezvou na IgE.

Vynález se týká způsobu, při kterém mohou být vytvářeny rekombinantní alergeny v bakteriích (E.coli). Vysokým obohacením nerozpustných proteinových agregátů dochází k prvnímu stupni čištění. Tyto agregáty se pak bez přidání redukčních prostředků denaturujί. V závísloasti na následujících dialysníeh podmínkách se získají různé formy vinutí. Rozhodující je, že se při tom jedná o monomerní a rozpustné molekuly. Jedna rozpustná varianta vinutí má reaktivitu IgE porovnatelnou s přírodními alergeny a může se jí podle toho používat k diagnostickým účelům. Takový produkt se získá dialyzou roztoku obsahuj í c í ho cystě i n.

Jiné alternativní rozpustné varianty vinutí se strukturou liší od přírodních alergenů a vyznačují se sníženou nebo chybějící 1gE-reakti v i tou. Z toho důvodu jsou vhodné takové varianty k umožnění zlepšené imunoterapie. Jeden takový hypoalergenový produkt se získá podle vynálezu dialyzou s kyselými pufry, výhodně při hodnotou pH 3,5 az 6,5, obzvláště 4,0 aš 5,5.

Obzvláště se vynález týká odpovídajícího rekombinantního vosího alergenu, zvláště z Vespula vulgaris a Vespula germanica.

Způsob získávání v podstatě čistého rekombinantního hmyzího alergenu spočívá podle vynálezu v tom, že se vyrábějí alergenové proteiny v buňkách bakterií v nerozpustné formě jako inkluzní tělíska, nerozpustné agregáty se denaturují a denaturované produkty se převádějí dialyzou na rozpustné monomerní alergeny různého uspořádání vinutí a izolují se. Denaturace se provádí s výhodou guanidiumchloridem bez přísady redukčních prostředků.

Vynález se týká obzvláště způsobu získávání rekombinantních alergenů hmyzího jedu se sníženou alergenitou, popřípadě s 1gE-reakti v i tou, při které se používá k dialyse kyselého pufru, s výhodou natriumacetátového pufru s hodnotou pH 4,5 aš 5, 0.

Vynález se týká také způsobu získávání rekombinantních alergeriů hmyzího jedu se normální alergenitou, popřípadě s lgEreaktivitou, přičemž se používá k dialyze roztoků obsahujících cystě i n.

Vynález se rovněž toho týká rekombinantních alergenů vosího jedu, který lze získat popsaným způsobem.

Vynález se dále týká farmaceutického prostředku, který obsahuje odpovídající rekombinantní alergen se sníženou, po6 případě se zeslabenou IgE-reaktivitou i odpovídající pomocné látky a nosiče.

Konečně se vynález týká také použití alergenů hmyzích jedů, získatelných popsaným způsobem, k diagnóze in vivo a in vitro alergie na hmy2.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení.

Příklady provedení vynálezu

Klonuje se například alergen vosího jedu antigen 5 Vespula vulgaris (Ves v 5) a antigen 5 Vespula germanica (Ves g 5) do expresního vektoru pSE420 a transformuje se ve kmeni bakterií K- 12 Ml 5 pREP4. Průběžné schéma je na obr. 1.

Obr. 1 Průběžné schéma ke způsobu rňg5 = rekombinantní antigen 5

···· · · ·· • ·

K vyrobení rekombinantních alergenů se použije předkultury kmene k naočkování expresní kultury. K expresi indukované

IPTG dochází v baňce s přepážkami při teplotě 37 C v LB-prostředí a s omezeným zásobováním kyslíkem (90 otáček za minulu) . Bakterie se sklidí po 5-hodinové expresi odstředěním

O (5000xg, 10 min, 20 C) . K rozrušení bakterií dochází po resuspendování buněk v pufru (50 mM Tris/HCl, 25 % sacharózy, hodnota pH 8) (hmotnost/objem) přidáním lysozymu (10 jjg/g hmotnost za mokra). Následuje přísda stejného objemu detergenčního roztoku (0,2 M chloridu sodného, 1 % (hmotnost/objem)

DOC, 1 % (hmotnost/objem) Nonidetu P40). Tento roztok se zpracuje ultrazvukem (3 min na ledu, 130 W, 0,5 s impuls). Jelikož se produkty exprese vyskytují primárně jako nerozpustné agregáty (včleněná tělíska, inkluzní tělíska), dají se vzhledem

- s k jejich vysoké hustotě od velké části ostatních složek (například fragmentů buněčných stěn, ribosomů) oddělit odstředěním při 3000xg. Dalčí čištění probíhá trojím následným promytím roztoky obsahujícími detergent (í% Triton X-100). Následně se vyčištěná uzavřená tělíska zpracují přísadou denaturačního pufru ( 6M guanidinchlorid, 20 mM Tris/HCl, pH 3,0) a 2 hodiny se vytřepávají při teplotě místnosti.

K získání 1gE-reaktivních forenm vinutí se denaturační vsázka naplní do dialyzní hadice (hranice 12 až 14 kDa) a dialyzuje se proti 100-násobnému objemu cysteinového roztoku (5mM cystein) 12 hodin za míchání při teplotě místnosti. Následuje dialysa proti destilované vodě k odstranění cysteinu.

K získání konformace se sníženou IgE-reaktivitou se provede první dialysa proti 20 mM natriumacetátovému pufru (hodnota pH 5,0). Také probíhá další dialyza proti destilované vodě. Po vyjmutí se ve vodě rozpustné alergeny odstraní od vysrážených agregátů odstředěním. Supernatant obsahuje žádané rozpustné rekombinantní alergeny. Místo natriumacetátového pufru je možno k pufrovárií použít i jiných kyselých pufrů s hodnotou pH 3,5 až 6,5, s výhodou 4,0 až 5,5 k pufrování. Příklady takových pufrových systémů jsou popsány v literatuře.

Vysrážené rekombinatnί, alergeny získané oběma způsoby, mohou býL znovu denaturovány a zpracovány podle stejného schéma. Tím se výtěžek významně zvýší.

Po dialyzových operacích mají produkty přibližně 95% čistotu. Další čisticí operace zásaditých alergenů hmyzího jedu jsou katexová chromatografie (pufr pH 7,2) například s produktem Source S (Pharmacia, Freiburg, Německo) a gelová filtrace. Gelová filtrace slouží vedle oddělení vysokomolekulárních a ηízkomolekulárních minimálních znečištění také k odsolení.

Posouzení jakosti produktů spočívá na následujících charak9 • · · ······ ·· ··· · · • · · · · ··· • ·· ·· ·· ····

LerisLických v 1dsLnuaLech, které jsou pro antigen 5 sestaveny v tabulce (riAntigen = přírodní antigen.

V1astnost	Vinutí s normální IgE-reakti v i tou	Vinutí se sníženou IgE-reakt i vi tou
App MW v SDS-PAGE ( neredukují c í podm i nky)	25 kDa	26-27 kDa
Koncentrace sol i k eIuc i v Source S	320 mM NaCl	400 mM NaCl
Rozštěpení prote- ázou V8	15 kDa fragment + pept i dy	peptidy > 10 kDa
Monoklonální protilátky specifické pro antigen 5	detekce 8E3, 1E11	detekce možná pouze s 8E3
Frekvenční lgE- reakt i v i ta se séry alergiků	> 95 %	< 10 %
Potence alergenu	podobná nAntigenu	5 >10x menší než nAg5

Způsob podle vynálezu je vhodný pro všechny druhy alergenů hmyzích jedů. Různé způsoby přípravy i rekombinantní klonování s technikami exprese jsou pracovníkům v oboru známy a dostupné a mohou být nahrazeny známými podobnými způsoby.

Průmyslová využitelnost alergeny pro výrobu farmaceuRekombínantní hmyzové zeslabené tických prostředků k ochraně vosami a včelami.

proti píchnutí hmyzem zvláště

Claims (13)

1. Rekombinantní hmyzový alergen mající sníženou

   1gE-reaktivitu, případně alergen i tu.
2. 2. Rekombinantní nou alergen i tou až o hmyzový alergen podle nároku 95 v porovnání s přírodními

   1 , se sn í še alergeny.
3. 3. Rekombinantní vosí alergen podle nároku 1 nebo 2.
4. 4. Rekombinantní hlavní alergen antigen 5 2 Vespula vulgar-is a Vespula germanica podle nároku 3.
5. 5. Způsob získávání v podstatě čistého rekombinantního hmyz í ho alergenu, vyznačuj ící se tím, še se vyrábějí alergenové proteiny v buňkách bakterií v nerozpustné formě jako inkluzní tělíska, nerozpustné agregáty se denaturují a děnaLurované produkty se převádějí dialysou na rozpustné monomerní alergeny různé konformace vinutí a izolují se.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že denaturace se provádí guanidiniumchloridem bez přísady redukčních prostředků.
7. 7. Způsob získávání rekombinantních alergenů hmyzího jedu se sníženou alergenitou, popřípadě 1gE-reakti v i tou podle nároku 5a 6, vyznačující se tím, še se k dialyze používá kyselého pufru.
8. 8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se používá natriumacetátový pufr s hodnotou pH 4,5 až 5,0.
9. 9. Způsob získávání rekombinantních alergenů s normální alergenitou, případně 1gE-reakti v i tou 5 nebo 6, v y s n a č u j í c í se tím, še hmyzího jedu podle nároku se k dialyse

   - 1 1 • * ·· ·· ·« • · · « b « · • ···· » » · ·· ·· · · · · · • · · · · · · • · «« ·« ···· používá roztoků obsahujících cystein.
10. 10. Způsob podle nároku 5 až 9, vyznačuj ící se tím, še se používá alergenů druhu Vespula spec., obzvláště Vespula vulgaris a Vespula germanica, Parevespula spec a ňpis mellifera.
11. 11. Rekombinantní alergeny vosího jedu získané způsobem podle nároku 7 nebo 8.
12. 12. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ící se t í m, še obsahuje rekombinantní alergen podle nároku 1 až 4 nebo 11 a odpovídající pomocné látky a nosiče.
13. 13. Použití alergenů hmyzího jedu získaných způsobem podle nároku 9 k diagnose in vitro alergií na hmyzí píchnutí.