CZ20021923A3 - Způsob pro přímou analýzu vzorku z procesu a kapilární elektroforetické zařízení pro jeho provádění - Google Patents

Description

Způsob pro přímou analýzu vzorku z procesu a kapilární elektroforetické zařízení pro jeho provádění

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu a zařízení pro odběr vzorku z technologického procesu a jeho přímou analýzu pomocí kapilárního elektroforetického zařízení.

Dosavadní stav techniky

Elektroforéza je elektrochemická metoda, pomocí které lze v elektrolytických roztocích oddělovat elektricky nabité částice, v určitých zvláštních metodách i částice nenabité. Velikost částic se může pohybovat od nejmenších iontů a molekul až po koloidní částice. Rychlost pohybu částice v elektrickém poli závisí na elektrickém náboji částice i dalších parametrech.

Při kapilární elektroforéze se základní roztok pohybuje tenkou trubicí - kapilárou, viskózní síly v kapalině brání konvekci. Vnitřní průměr kapiláry je obvykle mezi 0.02 a 1 mm. Elektroforéza tedy probíhá ve volném roztoku, čímž se eliminují interference s nosičem. Další výhodou je snadné odvádění tepla generovaného elektrickým proudem. Je proto možné použít silná elektrická pole, kterými se dále urychluje separace částic. Navíc lze kapilární elektroforézu snadno zautomatizovat.

Při kapilární elektroforéze se dvě nádoby, které obsahují stejný základní elektrolytický roztok, propojí kapilární trubicí, která obsahuje stejný roztok. Každá z nádob je osazena elektrodou. Vzorek, který se má analyzovat, se umístí do krátké zóny na vstupní straně kapiláry. Obecně, při zkoumání vzorku se kapilára vede z nádoby se základním roztokem do nádoby se vzorkem a zpět. Takové uspořádání způsobuje interference a zkreslení v základním roztoku v oblasti konce kapiláry i ve vzorkové oblasti, čímž se zmenšuje přesnost metody. Po dobu trvání přenosu vzorku z jedné nádoby do druhé je také nutné vypnout proud a za tuto dobu se mohou změnit podmínky testu. Ke stejným nevýhodám vede i výměna základního roztoku v průběhu testu.

Fí-76po

4 4 • · · φ ·44· • ·

2··· * · ’ · * Σ

4444 ·· ·

4 4 4 4 4 ·

4» 444 . «4 44 444·

Reakce, ke kterým dochází na elektrodách, mění složení roztoku v nádobách se základním roztokem. Tyto změny se mohou promítnout do kapiláry a tudíž zkreslit parametry testu.

Bylo vyvinuto několik zařízení, pomocí kterých lze výše popsané nevýhody z části odstranit. Virtanen, Acta Polytechnica Scandínavica, Chemistry Including Metallurgy Senes, č. 123 (1974), str. 1-67, použil již v 60. letech vstřikovací techniku, která umožňuje vstřikování vzorku při zapnutém proudu. Verheggen a kol., J. Chromatogr., 452 (1988), str. 615-622, a Záře a kol., US Patent 5,141,621 rovněž představili způsob vstřikování vzorku do kapilárního elektroforetického zařízení bez vypnutí proudu. Tyto metody a zařízení však neumožňují využít početné možnosti vyplývající z teoretické uniformity různých aplikací elektroforézy.

Finský patent FI 103438 popisuje kapilární elektroforetické zařízení, v němž se pro provádění určitých elektroforetických aplikací vyžaduje vybrat určité počáteční a koncové podmínky. Řízení koncových podmínek v kapilárním elektroforetickém systému znamená, že se musí regulovat složení základního roztoku v oblasti konců kapiláry. Podle zmíněného patentu se to provádí nepřetržitým čerpáním čerstvého roztoku okolo konců separační kapiláry. Zabrání se tím pronikání produktů, které vznikají na elektrodách, do kapiláry.

Aby se zabránilo nadměrné spotřebě základního roztoku, musí být objem kanálů minimální.

Návrh zařízení podle vynálezu vychází z popsaného principu. V zařízení podle vynálezu je možné volit podmínky testu bez omezení a lze je libovolně měnit v průběhu testu. V uspořádání podle dosavadního stavu techniky je však zavedení vzorku samostatnou operací a výsledek testu proto souvisí se zkoumaným procesem jen nepřímo.

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je přinést nový způsob a zařízení pro zavádění vzorku do kapilárního elektroforetického systému, čímž se odstraní výše uvedené nevýhody. Způsob a zařízení podle vynálezu umožní provádět různé způsoby kapilární elektroforézy na jediném zařízení. Význačné rysy vynálezu jsou uvedeny v patentových nárocích 1 a 9.

_ * 3···· »··· · · • · • · » · · • ··· · · · « · « · · · · » · · * · * , ·· ·· ····

Fi-76po

Způsob a zařízení podle vynálezu jsou vhodné pro přímé sledování různých procesů. Mezi oblasti, v nichž je možné vynález použít, patří například potravinářský průmysl, dřevozpracovatelský a papímický průmysl, čističky odpadních vod a mnoho dalších procesů, v nichž je potřeba sledovat stav prostředí. Dále lze způsob použít i při ošetřování a péči o zdraví nebo v laboratořích.

Hlavní výhodou vynálezu je rychlost a spolehlivost prováděných analýz. Ionty a sloučeniny se mohou v průběhu skladování a/nebo dopravy vzorku měnit, mohou podléhat oxidaci, redukci, hydrolýze, mohou precipitovat, slučovat se s jinými ionty nebo sloučeninami, slučovat se navzájem nebo se zcela rozkládat. Při přímém způsobu se takové problémy vůbec nemohou vyskytnout, získané výsledky jsou spolehlivější a poskytují pravdivější obraz skutečného stavu procesu.

Způsob a zařízení podle vynálezu jsou také jednoduché a levné, protože vystačí s malým 15 množstvím vzorku a jiných roztoků. Odborníkům je také okamžitě zřejmé, že k řízení zařízení lze použít počítač. V takovém případě může zařízení podle vynálezu pracovat jako spojitě pracující analyzátor procesu s periodickými odběry vzorků, například s frekvencí 20 sekund. Zařízení podle vynálezu lze vyrobit rozměrově malé, například v podobě mikroobvodu, takže jej lze použít i ve venkovních podmínkách, například pri analýze vodních vzorků.

Způsob a zařízení podle vynálezu mají následující další výhody:

- kapilární elektrofor etickou metodu (isoelektrické zaostřování, elektrochemická chromatografie micelií, zónová elektroforéza) lze měnit v průběhu separace částic;

- roztok lze snadno a rychle měnit;

- kapilára se může z částí naplnit materiálem pevné fáze;

- polaritu pole lze změnit v průběhu separace zkoumaných částic;

- v zařízení se může zapojit paralelně několik separačních kapilár, takže vzorek lze směrovat do několika separačních kapilár zároveň.

Přehled obrázků

Vynález je dále popsán podrobněji s odkazy na doprovodné výkresy, na nichž:

Fi-76po «· 9 • 9 9 • · • 9 « 9 9 • ♦ ·· · · • · ·

9

9·

9 9

999

Na obr. 1 je schéma kapilárního elektroforetického zařízení podle jednoho provedení vynálezu;

Na obr. 2 je schéma kapilárního elektroforetického zařízení podle dalšího provedení vynálezu;

Na obr. 3a a 3b je znázorněn způsob zaostřování kapiláry podle provedení vynálezu pro detekci;

Na obr. 4 je zařízení podle prvního provedení vynálezu;

Na obr. 5 je zařízení podle druhého provedení vynálezu;

Na obr. 6 je zařízení podle třetího provedení vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Na obr. 1 a 2 jsou ukázána kapilární elektroforetická zařízení podle provedení vynálezu. Konce separační kapiláry i se nachází v rozšířeních 5 a 6, která jsou pokračováními spodních konců úzkých kapilárních kanálů 2 a 3, kterými se přivádí různé roztoky. Průměr rozšíření je s výhodou 1 až 10 mm. Do rozšíření 5 a 6 ústí odpadní kanály WI a W2 k odpadním nádržím. Vnitřní průměr kapilárních kanálů 2 a 3 je s výhodou 0.02 až 1 mm, výhodněji 0.1 až 0.5 mm. Elektrolytický roztok, který se má použít jako základní roztok, pomalu přitéká z nezobrazeného zásobníku kapilárními kanály 2 a 3 přes konce separační kapiláry i směrem k elektrodám E, které se nachází v odpadních kanálech WI a W2 a které jsou připojeny ke zdroji napětí, a odpadními kanály pokračuje do odpadních nádrží 7 a 8 (viz obr. 2). Odpadní nádrže jsou dostatečně vzdáleny od konců separační kapiláry i a elektrody E leží s výhodou na výstupních koncích odpadních kanálů WI a W2, takže průnik produktů elektrolýzy vzniklých na elektrodách do separační kapiláry je do značné míry znemožněn, a to zejména díky dlouhým a prostorným odpadním kanálům. Průtok základního roztoku se nastaví tak, aby se dosáhlo stabilních poměrů v separační kapiláře a aby nedocházelo k pronikání produktů elektrolýzy na elektrodách do separační kapiláry.

Fi-76po

9 9 · · » «9··

5·*·* «·9·

Vstupní konec 9 separační kapiláry I se umístí do výšky Hl, která je vzdáleností od dna rozšíření 5 k průniku té stěny rozšíření 5, která je v podstatě rovnoběžná se separacní kapilárou i, s tou stěnou rozšíření 5, která je v podstatě nerovnoběžná se separacní kapilárou L Výstupní konec 10 separacní kapiláry 1. se umístí do výšky H2, která činí v provedení dle obr. 1 asi 20% a v provedení dle obr. 2 asi 70% výšky Hl vstupního konce kapiláry £.

Horní část rozšíření 5 může mít libovolný tvar, například kulově symetrický, kuželově symetrický nebo trychtýřovitě symetrický.

Základní roztok, který přitéká ze zásobníku, se může nahrazovat nezávisle pomocí čerpadel. Rovněž průtoky různých jiných roztoků lze regulovat nezávisle. Po dokončení elektroforetického testu se může systém propláchnout promývacími a neutralizačními roztoky, které se mohou zavést do libovolného ze zásobníků. Čerpadlo lze nainstalovat i do odpadního kanálu W2, přičemž pracuje na sacím principu. V takovém případě lze namísto Čerpadel použít ventily, tlakový spád v systému je zajištěn sacím čerpadlem. Počet čerpadel a ventilů je volitelný a závisí na použité aplikaci. Pokud se nevyžaduje velká přesnost regulace průtoku, lze průtok zajišťovat pouze hydrostatickým tlakem nebo přetlakem či podtlakem v některé z nádrží. Různá provedení vynálezu, která se liší způsobem přívodu různých roztoků, jsou zobrazena na obr. 4 až 6.

V podstatě v blízkosti výstupního konce separační kapiláry I je umístěn detektor 4, pomocí kterého se zjišťují částice oddělené v separační kapiláře. Detektor může pracovat například na principu zjišťování adsorbce vzorku. Činnost celého zařízení se může řídit mikroprocesorem.

Čerpadlo lze nainstalovat i do odpadního kanálu W2, přičemž pracuje na sacím principu. V takovém případě lze namísto výtlačných čerpadel použít ventily, tlakový spád v systému je zajištěn sacím čerpadlem. Počet čerpadel a ventilů je volitelný a závisí na použité aplikaci. Pokud se nevyžaduje velká přesnost regulace průtoku, lze průtok zajišťovat pouze hydrostatickým tlakem nebo přetlakem či podtlakem v některé z nádrží

Fi-76po » * · • φ · • ···· • ;

»♦·· · • · > · ··· > · · » · * · ··

W » » · • * · φ · · • φ φ φ· Φ·Φ·

Použitím vhodných čerpadel a ventilů se může kapilární elektroforéza provádět buď v uzavřeném nebo otevřeném okruhu s předem určeným průtokem kapilárou. V zařízení podle vynálezu je také možné dosáhnout požadovaných chemických gradientů a pulzů v libovolném z konců kapiláry v průběhu testu.

Pokud se zkoumaný roztok přivádí čerpáním při zapnutém elektrickém proudu, vstupuje do separační kapiláry 1 kontrolované množství vzorku. Množství vstřikovaného vzorku se reguluje dobou čerpání, elektrickým polem a elektro-osmotickým průtokem.

Elektro-osmotickému průtoku lze zcela zamezit uzavřením detekční strany systému.

Vzorek se do separační kapiláry 1 může tedy dostat pouze hydrodynamickým účinkem proudu z čerpadla, případně elektrokinetickým účinkem elektrického pole. Způsob vstřikování vzorku v zařízení podle vynálezu tak lze vybrat z několika způsobů a dále ovlivnit elektrickým polem a hydrodynamickým tokem.

Na obr. 3a a 3b je znázorněn způsob zaostřování kapiláry podle jednoho z provedení vynálezu pro detekci. Na obr. 3b je rez B-B dle obr. 3a. Separační kapilára I je upevněna ke standardním, navzájem spojeným dílům H. a 12. Separační kapilára 1 leží na detekční ploše 23, na které je přidržována zaostřovacím dílem 25. Zaostřovací díl 25 je pritlačován pružinou 26. Pomocí zaostřovacího dílu 25 se paprsek světla použitý pro detekci zaostří dobře známým způsobem na separační kapiláru E

Na obr. 4 je zařízení podle prvního provedení vynálezu. Zařízení zahrnuje kapilární elektroforetickou jednotku 13. Na vstupní straně jednotky 13 je přívodní systém a přepínací ventil 14. K přepínacímu ventilu 14 je připojena vzorková smyčka 15, kteráje vyrobena z vhodného, s výhodou izolačního materiálu. Vzorek z procesu se k přepínacímu ventilu 14 přivádí kanálem 16, mezi tímto kanálem a procesem se s výhodou nachází-jeden nebo více sběračů vzorků. Před přivedením do sběrače se vzorek může s výhodou upravit, například přefiltrovat nebo rozředit.

Sběrač se může vyrobit například z oceli, polyetereter-ketonu (PEEK), silikonu nebo jiného neaktivního materiálu. Konstrukčními prvky pro přepravu vzorku mohou být ;*Fi-76po

9 « «9 • 9 9 • 9999

9

9999 9

99 «9 • 9 999 • 9 9 9 9

9 · 9 ·· 99

9 9 například trubky nebo v materiálu obráběním vytvořené kanály. Materiálem může být sklo, silikon, polymer nebo kov,

K přepínacímu ventilu 14 se kanály 17,1,8 a 19 přivádí také elektrolyt a ostatní roztoky, například promývací a neutralizační roztok. Kanály 17,18 a 19 ústí do odpovídajících zásobníků. Přívod elektrolytu a roztoků zajišťuje čerpadlo 20. K přepínacímu ventilu 14 může vést i odpadní kanál 2J_. Kapaliny lze tedy dopravovat čerpadly, buď výtlačnými nebo sacími, s různými průtoky a tlaky podle požadavků testu.

Pomocí přepínacího ventilu 14 lze do kapilární elektroforetické jednotky 13 přivést konstantní objem vzorku nebo pomocí vzorkové smyčky 15 jiného roztoku. Alternativně lze roztoky do kapilární elektroforetické jednotky přivádět přímo, bez využití vzorkové smyčky. Vzorková smyčka má tu výhodu, že s ní je možné odměřit konstantní objem vzorku bez ohledu na jeho viskozitu. Vzorková smyčka rovněž izoluje vzorek od potenciálu země a ve fázi sběru vzorku i od kapilární elektroforetické jednotky 13. Je zřejmé, že smyčku lze alternativně snadno vyřadit.

Na výstupní straně kapilární elektroforetické jednotky 13 je zapojen systém úpravy kapalín, který zahrnuje čerpadlo 22 a připojení pro přívod elektrolytu a jiných kapalin přes kanály 17,18 a 19.

V popsaném prvním provedení zařízení podle vynálezu mohou být na obou stranách separační kapiláry stejné nebo jen málo rozdílné tlaky, které jsou nutné pro zavedení vzorku do kapiláry. Průtoky v systému přívodu vzorku a systému úpravy kapalin, množství a tlaky roztoků se mohou regulovat buď samostatně nebo společně.

Na obr. 5 je znázorněno zařízení podle druhého provedení vynálezu. Toto provedení má sedm paralelních vzorkových smyček 25, které se nachází mezi přepínacím ventilem a přívodním systémem pro elektrolyt a jiné roztoky. Kapalina, například vzorek, se z přepínacího ventilu 14 vede přímo do kapilární elektroforetické jednotky 13. Zbytek zařízení dle obr. 5 odpovídá výše popsanému zařízení dle obr. 4.

Fi-76po · · ···* k · ··* ! · · · » · · · ♦· ·· » » · ♦ · · » · · ·» ··♦·

Zařízení podle druhého provedení vynálezu umožňuje pomocí paralelních smyček sestavovat posloupnosti roztoků, které se mají zavést do separační kapiláry. Alternativně se mohou paralelní smyčky použít i na výstupní straně separační kapiláry.

Na obr. 3 je znázorněno zařízení podle třetího provedení vynálezu. Zařízení zahrnuje kapilární elektroforetickou jednotku 13, na vstupní straně systém přívodu vzorku, do kterého se vzorek přivádí z procesu kanálem 16. Mezi kanálem 16 a procesem je s výhodu jeden nebo více sériově řazených sběračů vzorku. Do systému přívodu vzorku lze přivádět také elektrolyt přes kanál 17. Ke vstupní straně jednotky 13 je připojen i systém úpravy kapalin podobný tomuto z obr. 4 a 5, pomocí kterého lze do jednotky přivádět například elektrolyt 17· Proudy kapaliny ze systému přívodu vzorku a systému úpravy kapalin se spojují s výhodou v těsné blízkosti přívodního konce separační kapiláry. Systém úpravy kapalin je s výhodou shodný se systémy dle obr. 4 a 5.

Způsob a zařízení podle vynálezu mohou nabývat různých podob. Podle aktuální potřeby lze vybrat některé z uspořádání a jeho parametry a za provozu lze uspořádání i parametry měnit.

V zařízení podle vynálezu je snadné vybrat a realizovat počáteční a koncové podmínky pro různé aplikace elektroforézy. Navíc je možné metody kombinovat a koncové podmínky měnit za provozu.

Výše byla popsána pouze některá možná provedení vynálezu. Vynález se však na tato příkladná provedení v žádném případě neomezuje a všechny změny a úpravy popsaných provedení by se měly posuzovat podle znění přiložených patentových nároků.

Claims (10)

1. PATENTOVÉ NÁROKY (UPRAVENÉ)

   1. Způsob pro přímou analýzu vzorku z procesu pomocí kapilárního elektroforetického zařízení, které zahrnuje kapilární elektroforetickou jednotku (13), která

   5 zahrnuje:

   - separační kápi láru (1);

   - proudové elektrody (E), které jsou připojené ke zdroji napětí; a

   - detektor (4), který se nachází v podstatě v blízkosti výstupního konce (10) separační kapiláry (1);

   10 kde konce separační kapiláry (1) se nachází v rozšířeních (5, 6), kterými pokračují spodní konce kapilárních kanálů (2, 3), rozšíření pokračují odpadními kanály (Wl, W2) do odpadních nádrží, které jsou vzdáleny od konců separační kapiláry (1), přičemž proudové elektrody (E) se nachází v odpadních kanálech (Wl, W2) s výhodou v blízkosti jejich výstupních konců, vyznačující se tím, že vzorek se pomocí čerpadla přivádí do kapilárních

   15 kanálů (2, 3) přímo z procesu stejným kanálem jako napájecí roztok, kde způsob dále zahrnuje čerpadla, pomocí kterých se vybere napájecí roztok a pomocí kterých se průtok napájecího roztoku nezávisle reguluje.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, Že vstupní konec (9) separační kapiláry 20 (1) se nachází v podstatě ve výšce Hl, kde výška Hl je vzdálenost od dna rozšíření (5) k průniku té steny rozšíření (5), která je v podstatě rovnoběžná se separační kapilárou (1), a té stěny rozšíření (5), která je v podstatě nerovnoběžná se separační kapilárou (1).
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že výstupní konec (10) separační 25 kapiláry (1) se nachází ve výšce H2, která je podstatně menší než výška Hl umístění vstupního konce (9) separační kapiláry (1).
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že výstupní konec (10) separační kapiláry (1) se nachází ve výšce H2, která je 10 až 85%, s výhodou 20 až 70%, výšky Hl

   30 umístění vstupního konce (9) separační kapiláry (1),
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že průměr rozšíření (5, 6) je s výhodou asi 1 až 10 mm.

   12'

   Fi-76po
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že vnitřní průměr kapilárních kanálů (2, 3) a separační kapiláry (1) je s výhodou 0.02 až 1 mm, výhodněji 0.1 až 0.5 mm.

   5
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že čerpadla se nahradí ventily a průtok kapilárními kanály (2, 3) se vyvolá účinkem gravitace nebo podtlaku či přetlaku.
8. 8. Kapilární elektroforetické zařízení pro odběr vzorku z procesu a jeho přímou analýzu v kapilární elektroforetické jednotce (13), která zahrnuje separační kapiláru (1);
9. 10 proudové elektrody (E), které jsou připojené ke zdroji napětí; a detektor (4), který se nachází v podstatě v blízkosti výstupního konce (10) separační kapiláry (1); kde konce separační kapiláry⁵ (1) se nachází v rozšířeních (5, 6), kterými pokračují spodní konce kapilárních kanálů (2, 3), rozšíření pokračují odpadními kanály (Wl, W2) do odpadních nádrží, které jsou vzdáleny od konců separační kapiláry (1) přičemž proudové elektrody
10. 15 (E) se nachází v odpadních kanálech (Wl, W2) s výhodou v blízkosti jejich výstupních konců, vyznačující se tím, že vzorek se pomocí čerpadla přivádí do kapilárních kanálů (2, 3) přímo z procesu stejným kanálem jako napájecí roztok, kde zařízení dále zahrnuje čerpadla, pomocí kterých se vybere napájecí roztok a pomocí kterých se průtok napájecího roztoku reguluje nezávisle.