CZ20021986A3

CZ20021986A3 - Embryogeneze a regenerace rostlin z mikrospor

Info

Publication number: CZ20021986A3
Application number: CZ20021986A
Authority: CZ
Inventors: Kenneth J. Kasha; Ecaterina Simion
Original assignee: University Of Guelph
Priority date: 1999-12-10
Filing date: 2000-12-07
Publication date: 2002-11-13
Also published as: EP1246522A2; PL356401A1; US6812028B1; CA2393701A1; ZA200204501B; US20040226059A1; AU2133301A; AR026769A1; WO2001041557A3; WO2001041557A2

Description

Umísténl kapek mikrospor na filtrační papír za použití vakua

Indukční kultura mikrospor Diferenciace embryi

Růst donorových rostlin

Sklizeň a čiSténl částí rostlin, které obsahuji mikrospory

PředindukČni příprava klasů nebo donorových rostlin v Petriho miskách izolace mikrospor (viz obr.· 4)

Promytl mikrospor studeným manitolem

Regenerace embryi a núst dvojitých haploidnlch rostlin

-/ • · • · · · · · * • ·· · 4 · • · · · · · · • · 9 · · · » ·· ·· ····

EMBRYOGENEZE A REGENERACE ROSTLIN Z MIKROSPOR

Oblast techniky

Vynález se zabývá způsoby produkce embryí a způsoby regenerace rostlin z kultivovaných mikrospor.

Dosavadní stav techniky

Zdvojené haploidní rostliny lze vytvářet z haploidních rostlin nebo buněk, ve kterých je počet chromozomů duplikací zdvojen na normální somatický počet (2n). Způsoby produkce haploidních a zdvojených haploidních rostlin mají využití při rostlinném šlechtění a při produkci transgenních rostlin.

Indukce dělení mikrospor vedoucí k embryogenezi má využití při produkci velkého množství haploidních a zdvojených haploidních rostlin. Jsou známy způsoby, pomocí kterých se indukuje tvorba struktur podobných embryu z mikrospor, kde mohou být genotypy jednotlivých druhů indukovány, aby produkovaly velké množství haploidů. Ukázalo se však, že regenerace zelených rostlin z takových embryí za dostupné metodologie je problematická. Genotypy některých jednoděložných druhů, jako jsou obilniny, produkují ze struktur podobných embryu albinózní rostliny. Konvenční techniky izolace kultury mikrospor doposud nevedly ke konzistentní regeneraci embrya a nevýhodně vznikala velká část albinózních rostlin.

U.S. Patent č. 4,840,906 (Hunter) popisuje způsob rostlinné regenerace zječmenných mikrospor inkubovaných při 25 °C po dobu 28 dní v mediu obsahujícím cukr po předchozí předúpravě po dobu 28 dní v chladu. Způsob popsal velmi rozdílné výsledky četnosti tvorby zelených rostlinek z mikrospor, přičemž tento počet byl v některých případech v rozmezí od asi 30 do asi 200 zelených rostlinek vytvořených ze 100 kultivovaných prašníků. Zjevně je zapotřebí nějakého lepšího způsobu, který konzistentně produkuje vysoké výtěžky zelených rostlinek z izolovaných mikrospor.

U.S. Patent 5,445,961 (Genovesi a kol.) popisuje způsob embryogeneze mikrospor za použití předúpravy cukerným alkoholem a chladem (asi 10 °C), kde je také zapotřebí kolchicinu, což je prostředek pro zdvojování chromozomů. Po této předúpravě následuje izolace mikrospor a růst na živném prostředí. Podle tohoto způsobu se vytvořilo od 2 do 115 embryoidů na každých 10⁴ inkubovaných mikrospor. Po působení prostředku způsobujícího zdvojení chromozomů, transformace mikrospor k homozygotním transformantům výrazně nevede, homozygotní transformanty spíše vznikají, pokud transformace proběhne před zdvojením chromozomů.

V tomto dokumentu ovšem není popsána žádná transgenní transformace mikrospor.

Haploidní jednobuněčná mikrospora je atraktivním cílem pro mutaci, selekci a transformaci. Pokud se transformace provádí ve fázi G1 jaderného cyklu, produkují se geneticky homozygotní rostliny, které obsahují transgeny zavedené před dělením. Yao a kol. (Genome 1997:40:570-581), za účelem transformace mikrospor, působili na vysoce indukovatelné mikrospory ječmene genotypu Igri mannitolem, s následným biolistickým bombardováním. Přesto tyto regenerované rostliny byly vzhledem ke vnesenému transgenu z velké části heterozygotní.

Jáhne a kol. (Theor. Appl. Genet. 1994;89:525-533) popisuje způsob použití mikrospor izolovaných z ječmene pro bombardování částicemi. Z klasů předupravených za chladu se rychle izolují mikrospory a před bombardováním transgenem se nechají při teplotě 24 °C po dobu 1 hodiny. Podle popsaného způsobu se vytvořilo v průměru 82 zelených rostlin na 10⁵ mikrospor a vyprodukovala se pouze jedna transgenní rostlina na každých 2,8.10⁶ mikrospor.

Mezi podmínky metodologie, které přispívají k úspěšné metodologii embryogeneze a regenerace rostlin, patří růst donorové rostliny, předúprava, komponenty živného prostředí jako je druh cukru, zdroj a rovnováha dusíku, hormony, hustota a osmolalita prostředí. Přesto doposud nebyl popsán způsob vedoucí k vysoké četnosti embryogeneze a vedoucí k úspěšné produkci velkého množství zelených rostlin. Je zapotřebí zavést metodologii, která využívá optimální a synergickou kombinaci výše zmíněných podmínek, které vedou k velké produktivitě zelených rostlin z mikrospor. Takovýto vylepšený způsob by šetřil práci a byl by účinnější, než konvenční metodologie, tím pádem by snižoval výrobní náklady.

Arabinogalaktanové proteiny (AGP) jsou rostlinné proteoglykany přítomné v různém počtu rostlinných tkání, které mohou mít regulační funkce na reprodukční procesy rostlinné buňky. Dřívější zprávy ilustrovaly pozitivní vlivy arabinogalaktanových proteinů na somatickou embryogenezi u Picea abies (smrk ztepilý) a u Daucus carota L. (viz např. Egertsdotter a kol., Physiol Plant 1995;93:334-45; a Kreuger a kol., Planta 1993;189:243-248). Kawaguchi a kol. (Plant Journal, 1996;9(6):777-785) popisuje tetrasacharid s podobnou strukturou jako je arabinogalaktanový protein,

4« · • · ·

který se v prasnicích rýže akumuluje stádium-specifickým způsobem. Účinky AGP na embryogenezi a regeneraci rostlin z mikrospor se nevyhodnocovaly.

Evropská zveřejněná patentová přihláška č. 0 455 597 A1 (Sandoz Ltd.) popisuje způsob stimulace růstu rostlinných buněk Daucus carota L. v kultuře in vitro. Tato publikace popisuje stimulaci růstu přídavkem AGP živného media v množství od 0,01 do 100 mg/l. AGP se však nepoužilo pro zlepšení účinnosti při indukci embryogeneze mikrospor, ani se u něj tato účinnost nezkoumala. Navíc zde nebyla uvedena žádná metodologie transformace nebo určování stadia buněk v kultuře.

Je zapotřebí způsobu embryogeneze, který vede k vysoké úspěšnosti produkce zelených rostlin.

Také je zapotřebí účinného způsobu transformace rostlin zembryogenní indukce mikrospor, který poskytuje účinnou předúpravu pro synchronizaci mikrospor a udržuje je před transformací v G1 fázi buněčného cyklu, čímž zvyšuje produkci homozygotních transformantů.

Cílem tohoto vynálezu je překonat nevýhody dosavadního stavu techniky. Tohoto cíle je dosaženo pomocí kombinace rysů hlavních patentových nároků, vedlejší nároky popisují další výhodné provedení vynálezu.

Podstata vynálezu

Vynález se zabývá způsoby produkce embryí a regenerace rostlin z kultivovaných mikrospor.

Podle vynálezu je poskytnut způsob produkce embrya, který sestává z kroků: (a) sběr rostlinného segmentu, který obsahuje mikrospory, z donorové rostliny; (b) inkubace segmentu za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu; (c) izolace mikrospor ze segmentu; a (d) inkubace izolovaných mikrospor v indukčním mediu, které obsahuje arabinogalaktan protein, za účelem indukce embryogeneze, a tedy produkce embryí.

Dále vynález poskytuje způsob regenerace rostlin z mikrospor, který sestává z kroků: (a) sběr rostlinného segmentu, který obsahuje mikrospory, z donorové rostliny; (b) inkubace segmentu za podmínek předúpravy, za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu; (c) izolace mikrospor ze segmentu; (d) inkubace izolovaných mikrospor v indukčním mediu, které obsahuje auxin, za účelem indukce produkce embryí; (e) inkubace embryí v diferenciačním ·· ··· · • ·

mediu, za účelem produkce diferenciovaných embryí; a (f) regenerace rostlin z diferenciovaných embryí.

Vynález je také zaměřen na produkci embrya, které je připraveno výše uvedeným způsobem, a na produkci rostliny vytvořené z tohoto embrya.

Vynález se také týká způsobu zavedení genu našeho zájmu do mikrospory, který sestává ze zavedení genetické struktury, která obsahuje gen našeho zájmu, do mikrospory, která dále projde kroky předúpravy a izolace. Mezi způsoby zavedení genetické struktury do mikrospory patří bombardování částicemi nebo transformace zprostředkovaná Agrobacteriem. Dále je vynález zaměřen na transgenní mikrosporu připravenou tímto způsobem, na transgenní embryo a transgenní rostlinu produkovanou jak z této transgenní mikrospory, tak i z transgenního embrya.

Výhodně je tento způsob efektivní a šetří práci, při porovnání s doposud známými postupy tvorby kultur mikrospor a kultur prašníků. Vyšší úspěšnost při produkci zelených rostlin podle nového způsobu vede ke snížení nákladů. Další výhodou této nové metodologie je snížení počtu produkovaných albinózních rostlin.

Výhodně je nový způsob efektivní u různých genotypů, což ukazuje, že zde není přítomen silný genotypický efekt. Synergická kombinace faktorů vede k všestrannému způsobu, který lze použít na mnoho druhů rostlin.

Odstranění prašníkové stěny během izolace mikrospor výhodně umožňuje vyšší nutriční dostupnost mikrospor během kroků indukce, diferenciace a regenerace. Použití podložky pro embrya během regenerace umožňuje pozorování embryí, které jsou na ní umístěny. Použití podložky také podporuje růst a usnadňuje přenos embryí do jiného media nebo aplikace.

Předúprava udržuje ve stejném stádiu velkou populaci haploidních mikrospor, které jsou vytvořeny podle způsobu vynálezu, ty poskytují lepší cíle pro mutaci, selekci a transformaci rostlin. Za použití nového způsobu mohou být transgenní rostliny vytvořeny s mikrospor, které jsou předupraveny a dále se postupuje kterýmkoliv konvenčním transformačním způsobem, jako je například bombardování transgenem.

Předúprava, která udržuje mikrospory ve stejném stádiu buněčného cyklu, umožňuje produkci velkého množství embryí a regenerovaných rostlin z izolovaných mikrospor. Kombinace chladu a cukerného alkoholu během předúpravy umožňuje mnohem kratší dobu působení, než při samotném působení chladu. Na toto působení kombinace chladu a cukerného alkoholu vykazují odezvu téměř všechny genotypy• · ··· · • ·

• ♦ · · * * ·

C ·♦····· «······· « · · · · · · ·· · ·· ··

Použití kombinace chladu a cukerného alkoholu během předúpravy indukuje nejen velké množství embryoidů, ale také má tendenci synchronizovat dělení buněk mikrospor, což vede k větší uniformitě populace mikrospor. Pravděpodobnost jaderného dělení během předúpravy se snižuje kombinací chladu a cukerného alkoholu při předúpravě. Toto může být hodnotné pro metodologie zabývající se transformací mikrospor, testováním exprese genových struktur, in vitro selekcí, nebo dalším využitím mikrospor.

Použití arabinogalaktan proteinu, nebo glykoproteinu bohatého na hydroxyprolin, který má boční uhlovodíkové řetězce bohaté na glukózu, vede během indukce embryogeneze ke zvýšenému výtěžku embryí mikrospor z předupravených rostlinných segmentů, čímž se zvyšuje účinnost tohoto způsobu při embryogenezi.

Tato podstata vynálezu nepopisuje všechny nezbytné znaky vynálezu, ale ukazuje, že může být proveden za použití různých kombinací popsaných rysů.

Vynález se zabývá způsobem embryogeneze a způsobem regenerace rostlin z kultury mikrospor. Tyto způsoby jsou níže popsány detailněji s odkazy na obr. 1 až 5. Detailněji jsou popsány příklady embryogeneze a regenerace rostlin obilnin, ovšem vynález se nevztahuje pouze na obilniny.

Následující popis vyjadřuje pomocí příkladu výhodné provedení a nemá za cíl omezovat kombinace charakteristických podmínek, které jsou nezbytné pro provedení vynálezu.

Termínem „rostlinný segment, který obsahuje mikrosporu“ je míněna jakákoliv část donorové rostliny, která může obsahovat mikrospory pro izolaci. Příklady takových segmentů zahrnují, ale nejsou omezeny na výhonky, klasy, prašníky, květy, vlákninu nebo laty.

Termínem „počáteční úprava“ rostlinných segmentů, které obsahují mikrospory, se míní postupy, které se provádí po odebrání segmentu, ale před předúpravou. Mezi procedury počáteční úpravy patří čištění alkoholem nebo bělidlem a promytí nebo inkubace ve vodě, jak je popsáno dále.

Termínem „předúprava“ se míní procedury, které se provádějí na rostlinných segmentech obsahujících mikrospory po počáteční úpravě a před umístěním na, nebo do embryogenního indukčního media. Mezi takové procedury patří inkubace za chladu ve vodě, v roztoku cukerného alkoholu s vysokým osmotickým tlakem, nebo jejich kombinace. Předúprava vytváří podmínky, které slouží k zastavení buněčného cyklu mikrospory na G1 fázi jednojaderného buněčného cyklu, udržuje podstatně ·· ···· všechny mikrospory na tomto jednojaderném stádiu vývoje a spouští následnou indukci embryogeneze. Předúprava připravuje jednojaderné mikrospory na embryogenní indukci udržováním synchronizované populace mikrospor, která má od asi 50 % do 100 % mikrospor, na konzistentní G1 fázi buněčného cyklu.

Existují tři stádia, které samostatně řídí produkci haploidních rostlin z mikrospor, a to indukce embryogeneze; regenerace struktur podobných embryu; a vývoj struktur podobných embryu na zelené rostliny. Pro dokončení efektivního produktu je potřeba optimalizovat podmínky každého jednotlivého stádia.

Pro efektivní produkci zelených homozygotních rostlin z kultury mikrospor je potřeba kontrolovat množství faktorů. Každý faktor ovlivňuje jedno z výše uvedených stádií při produkci haploidních rostlin z mikrospor. Pro zavedení úspěšné metody pěstování homozygotních rostlin z kultury mikrospor je potřeba optimalizovat různé faktory, jako jsou růstové podmínky donorové rostliny, sběr klasů, určování stadia mikrospor, předúprava, izolace mikrospor, podmínky indukce, podmínky diferenciace, vysazování embryí, a podmínky regenerace rostlin.

Podle vynálezu, a také jak je ilustrováno na schématu pracovního postupu na obr. 1, je poskytnut způsob produkce embrya, který sestává z kroků: (a) sběr rostlinného segmentu, který obsahuje mikrospory, z donorové rostliny; (b) inkubace segmentu za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu; (c) izolace mikrospor ze segmentu; a (d) inkubace zmíněných izolovaných mikrospor vinkubačním mediu, které obsahuje arabinogalaktan protein a aminokyseliny za účelem indukce embryogeneze, a tedy produkce embryí.

Dále se vynález zabývá způsobem regenerace rostliny z mikrospor, který sestává z kroků: (a) sběr rostlinného segmentu, který obsahuje mikrospory, z donorové rostliny; (b) inkubace segmentu za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu; (c) izolace mikrospor ze segmentu; (d) inkubace izolovaných mikrospor v indukčním mediu, které obsahuje auxin, vysoké hladiny glutaminu a aminokyseliny za účelem produkce embryí; (e) inkubace embryí v diferenciačním mediu za účelem produkce diferenciovaných embryí; a (f) regenerace rostlin z diferenciovaných embryí.

•· 9 99 9

9 · • · · • · · ·

9 9

9

9 9 8

9 9 ·

8 99

9 9 9

9 · 9

99

9 9 ·

9 8

9 9 9

9 9

9999

Růst rostliny

Podle vynálezu je žádoucí, aby se donorové rostliny pěstovaly v řízeném prostředí, které je výhodně bez škůdců, ale vynález není zaměřen pouze na rostliny pěstované za těchto podmínek. Následující růstové podmínky v řízeném prostředí jsou uvedeny jako příklad, v žádném případě nejsou míněny jako omezující.

Optimální relativní vlhkost se může pohybovat v rozmezí od asi 50 % do asi 90 %, výhodně od asi 60 % do asi 80 %. Osvětlení se pohybuje od asi 300 pEm²s do asi 450 pEm²s, výhodně od asi 350 pEm²s do asi 400 pEm²s na úrovni květináče. Je možno použít jakýkoliv vhodný zdroj světla, například bílá zářivka Gro-Lux™, žárovky, nebo jejich kombinace. Rostliny lze pěstovat v živných roztocích.

Více konzistentní výtěžky embryí a zelených rostlin vznikají z mikrospor produkovaných v rostlinách, které netrpěly suchem, stresem nebo napadením škůdci, nebo jejich kombinací. Rostliny vystavené stresu a produkované buď za nedostatečného nebo nadměrného zavlažování, nebo za napadení škůdci, často produkují mikrospory, které reagují nekonzistentně nebo jejich kultura může odumřít.

Následující teploty vedou k optimálnímu růstu rostlin. Pro ozimý ječmen jsou to teploty od asi 13 do asi 17 °C, výhodně od asi 15 °C na světle po dobu asi 15 do asi 18 hodin, výhodně od asi 16 do asi 17 hodin přes den. Během temnostního cyklu, který trvá od asi 6 do asi 9 hodin, výhodně od asi 7 do 8 hodin za den, jsou optimální teploty od asi 10 do asi 14 °C, výhodně asi 12 °C.

Pro jarní ječmen, který roste při světelném cyklu, který trvá 15-18 hodin, výhodně 16-17 hodin, se teploty mohou pohybovat od 16 až 20 °C, výhodně 18 °C.

Během temnostního cyklu, který trvá 6-9 hodin, výhodně 7-8 hodin za den, jsou optimální teploty pro jarní ječmen od asi 13 až 17 °C, výhodně 15 °C.

Pro ozimé nebo jarní hexaploidní pšenice, které rostou při světelném cyklu trvajícím 15-18 hodin, výhodně 16-17 hodin, mohou být teploty v rozmezí od 16 až 25 °C. Během temnostního cyklu o trvání 6-9 hodin, výhodně 7-8 hodin přes den, se optimální teploty pro hexaploidní pšenici pohybují od 13 až 18 °C, výhodně 15 až 16 °C.

Rostliny se mohou přihnojovat jednou týdně pro optimalizaci růstu. Postřikování pesticidy v období sběru se musíme vyvarovat, neboť by postřik mohl snížit reakci mikrospor. Rostliny však lze postřikovat v dřívějších stádiích za účelem minimalizace napadení škůdci nebo houbami.

• 4 44

9 4 ·

4 44

4 4 4

4 4 4 ·4 •4 4944

4 4 4

4 4

4444

Určování stadia mikrospor

Rostlinné segmenty obsahující mikrospory, jako jsou například výhonky, klasy, laty, prašníky, květy nebo vláknina, se sbírají z donorových rostlin, když jsou ty nejstarší mikrospory ve středním nebo pozdním jednojaderném stádiu.

Případně se může vzorek mikrospor z rostlinného segmentu obsahujícího mikrospory kontrolovat pro zajištění vhodného stádia vývoje. Popis středního až pozdního jednojaderného stádia lze najít v publikacích jako je Wheatly a kol. (Plant Cell Rep 1986;5;47-49), přičemž tento dokument je zde zahrnutý pomocí odkazu. Jedním z nejvýraznějších rysů tohoto stádia je umístění jádra vzhledem k průduchu (viz obr. 2). V počátečním jednojaderném stádiu je jádro blízko průduchu a v pozdním jednojaderném stádiu je naproti průduchu. Pro ilustrování tohoto jevu se může použít moření ječmenných mikrospor pomocí akteo-karmínu nebo DAPI. Alexandrovo mořidlo lze použít pro ilustraci tohoto jevu u mikrospor odvozených od pšenice a kukuřice.

V případě, kde rostlinný segment obsahující mikrospory je výhonek, odejmou se klasy od pochvy výhonků. Mikrospory získané z kvetu umístěného ve středové části klasů, lze pro určení stádia vývoje zkoumat pomocí určování stadia buněk. Poté lze vybrat rostlinné segmenty obsahující mikrospory, u kterých jsou mikrospory blízko střednímu až pozdnímu jednojadernému stádiu, na základě jejich vývojové podobnosti s těmi, které se zkoumaly pomocí moření.

Případně se mohou klasy po odstranění od pochvy vybrat na základě porovnání konzistentní délky a vzhledu květů se zkoumaným segmentem.

Počáteční úprava rostlinného segmentu obsahujícího mikrospory

Vybrané rostlinné segmenty obsahující mikrospory, které mají mikrospory ve středním nebo pozdním jednojaderném stádiu, se pro počáteční úpravy umístí do petriho misek (např. 15x100 mm), ještě před předúpravou, která je detailněji popsána níže.

Případně lze rostlinné segmenty obsahující mikrospory očistit čistícím roztokem. Vhodné čistící roztoky mohou obsahovat roztoky ethylalkoholu s obsahem od asi 50 % do 80 % ethanolu, výhodně asi 70 % ethanolu, nebo vodné roztoky obsahující asi 10 % až asi 15 % bělidla (asi 0,5 % do asi 1,0 % chloru).

·· ····

Například, což nemá v žádném případě být považováno za omezující, lze oddělené výhonky postřikovat vodným roztokem asi 70% ethanolu před odstraněním klasů. U ječmene se poté mohou osiny odlomit a klasy se podrobí předúpravě, jak je detailněji popsáno níže. U pšenice, pokud má osiny, mohou být osiny odstraněny, ale ne moc blízko, neboť vystavení vnitřku kvetu čisticímu roztoku by mohlo být škodlivé.

Dalším příkladem může být případ, který nemá v žádném případě být považován za omezující, kdy osiny nebo klasy vyrůstají z listové pochvy nebo pokud je problém s kontaminací, klasy lze sterilizovat tím, že se umístí do skleněné nádoby a přelijí se na 10-25 minut roztokem asi 10% bělidla. Izolované prašníky se neupravují bělidlem. Po čištění se květy a klasy dobře promyjí vodou a zbytková vlhkost se nechá odpařit ještě před inkubací v mannitolovém roztoku. Čištění lze provést ve Flow Bench pro zajištění dostatečně čistých roztoků.

Jako další možnost během počáteční úpravy lze vybrané rostlinné segmenty obsahující mikrospory podrobit posběrové inkubaci v ledové vodě při teplotě od asi 3 °C do asi 6 °C, výhodně od asi 4 °C po dobu až 4 týdnů, například od 3 až 4 dnů až po dobu 3 až 4 týdnů. Například klasy se mohou inkubovat ve sterilní vodě v petriho miskách (asi 0,5 ml vody na misku) při teplotě asi 4 °C po dobu asi 2-4 týdnů. Tato inkubace se může provádět pokud se například segment sbírá předtím, než jsou mikrospory ve vhodném stádiu vývoje. Proto posběrová inkubace může pokračovat, dokud segment nedosáhne vhodného stádia mikrospory, aby mohlo dojít k předúpravě, což lze určit mořením. Například výhonky lze inkubovat v ledové vodě, dokud se klasy neodstraní od pochvy. Posběrová inkubační perioda by měla být minimalizována, aby se předešlo progresi stádia u mikrospor během tohoto období.

Před úprava

Předůprava rostlinných segmentů obsahujících mikrospory se provádí proto, aby se mikrospory sjednotily na jednotné stádium vývoje při přípravě na embryogenickou indukci. Předůprava v sobě obsahuje použití chladu v kombinaci s inkubací rostlinných segmentů ve sterilní vodě nebo ve sterilním vodném roztoku cukerného alkoholu. U některých druhů může tato předůprava vyžadovat přídavek media s makrosolemi.

Předůprava může trvat od asi 3 dnů do asi 4 týdnů v závislosti na použitých podmínkách. Pokud se použije během inkubace za chladu voda, délka trvání

* 4

4«

4 4 · · · ·

W4 4 4 · * ·· » · 4444 4

4 4 4 4 4 4

4 44 ·· předúpravy může kolísat v rozmezí od 1 týdne do asi 4 týdnů v závislosti na druhu a genotypu. Pokud se použije roztok cukerného alkoholu, lze použít kratší inkubační dobu od asi 3 do asi 5 dnů, kde 3 dny jsou výhodné pro transformační procedury.

Pro předúpravu v cukerném roztoku může být koncentrace cukerného alkoholu v rozmezí od 0,1 mol/l do asi 1,0 mol/l. Výhodně je cukerný alkohol přítomen v množství od asi 0,2 mol/l do asi 0,5 mol/l a výhodněji se pohybuje v množství asi 0,3 mol/l pro ječmen, nebo 0,4 mol/l pro pšenici. Cukerný alkohol může být vybrán z jakéhokoliv alkoholu obsaženého ve skupině: mannitol, maltitol, sorbitol, xylitol, nebo se může použít jakákoliv jejich kombinace, a výhodně se použije mannitol. Působení na klasy, kde je výhodnou kombinací chlad (4 °C) s inkubací v mannitolu (0,3 mol/l) po dobu 3 dní, zvyšuje výnos zelených rostlin regenerovaných z mikrospor.

Cukerný alkohol se smící s rostlinnými segmenty v adekvátním množství pro částečné překrytí segmentů, které jsou uloženy v jedné vrstvě, například asi 15 ml v 15x100 mm petriho misce. Ph působení ledovou vodou na klasy, se do 15 x 100 mm misky přidá pouze 0,5 ml vody.

Petriho misky se poté neprodyšně uzavřou například filmem jako je Parafilm™ a umístí do temna při teplotě od asi 3 °C do asi 6 °C, výhodně při asi 4 °C. Inkubace v roztoku cukerného alkoholu pokračuje dalších přibližně 3 až 5 dní a při inkubaci v ledové vodě se nechají inkubovat od asi 10 dní do asi 4 týdnů, vše v závislosti na druhu.

Případně se mohou rostlinné segmenty inkubovat při teplotě místnosti podle způsobu od Roberts-Oehlschlger a Dunwell (1990) (asi 22 °C až asi 27 °C, výhodně při asi 25 °C) ve vodném roztoku, který obsahuje od asi 0,2 mol/l do asi 0,5 mol/l cukerného alkoholu, výhodně asi 0,3 mol/l cukerného alkoholu. Tato inkubace po dobu až 4 dní, výhodně po dobu 3-4 dní efektivně spouští indukci, ale neudržuje mikrospory na jednojaderné fázi.

Izolace mikrospor

Po předúpravě se mikrospory izolují z rostlinných segmentů. Pokud rostlinnými segmenty jsou prašníky, je možné je zpracovat ve vířivé komoře až po dobu 10 minut, výhodně asi 5 minut, kdy se většina mikrospor oddělí, tak jak je již dříve popsáno v Kasha a kol. (IAEA-SM-1995:340/9:23-37).

··· ··«« ··« ·· · ·· ·· ·« ♦···

Sklo a nářadí pro sběr rostlinných segmentů po předúpravě by se mělo použít sterilizované (v autoklávu) a ve Flow Bench. Segmenty klasů nebo vlákniny s květy se odstraní pro zmenšení velikosti segmentů na délku asi 2 cm až asi 3 cm. Nařezané segmenty se poté přelijí ledově studeným vodným roztokem cukerného alkoholu, který obsahuje od asi 0,2 mol/l do asi 0,5 mol/l cukerného alkoholu, výhodně od asi 0,3 mol/l mannitolu za účelem tvorby suspenze. Suspenze se míchá při rychlosti vhodné pro uvolnění mikrospor od zbytku rostlinného segmentu.

Při míchání suspenze se výhodně použije chlazená míchačka. K rostlinným segmentům se přidá adekvátní množství chlazeného roztoku cukerného alkoholu tak, aby zakryly segmenty klasů. Pro názornost lze uvést příklad: za účelem získání dostatečného množství mikrospor (500 000) na jednu misku, lze v míchačce přelít osm až deset ječmenných klasů ve dvou řadách, nebo šest řad ječmenných nebo pšeničných klasů asi 200-300 ml chlazeného roztoku cukerného alkoholu. Během míchání se rostlinné segmenty a roztok cukerného alkoholu promísí při nízké rychlosti po dobu až 15 sekund, výhodně od přibližně 5 do 10 sekund. Přesto se vhodná doba míchání a rychlost mění v závislosti na genotypu a předúpravě, a v konečném důsledku ovlivní životaschopnost.

Jako alternativu k míchání při omezené dostupnosti počtu klasů, lze na izolované prašníky použít izolační postup ve vířivé komoře. Tento postup zlepšuje životaschopnost mikrospor, neboť izolace ve vířivé komoře je ke zpracovávaným segmentům šetrnější, než míchání (viz např. Kasha a kol. IAEA-SM-1995:340/9:23-37).

Výsledná kaše obsahující mikrospory se rychle přefiltruje a promyje se roztokem cukerného alkoholu (viz obr. 3) například o koncentraci 0,2 mol/l do asi 0,5 mol/l, výhodně roztokem 0,3 mol/l mannitolu. Je potřeba dávat pozor, aby nedošlo k plazmolýze mikrospor, neboť z plazmolyzovaných mikrospor by se embrya nevyvinula. Pokud je životnost mikrospor pod 50 %, je možné mrtvé mikrospory odstranit tak, že umístíme resuspendovanou tabletku do gradientu hustoty, například do 20% gradientu hustoty maltózy s následnou centrifugací a zadrží se životaschopná frakce mikrospor.

Embryogenická indukce izolovaných mikrospor

Po předúpravě a izolaci se mikrospory indukují k vývoji v embrya. Po konečném promytí v kroku izolace mikrospor, se supernatant dekantuje a koláč • · *<·** Φ* »* ♦ ♦ ♦ · Φ · ♦ • « · · · ·· • · · · · ·· · • · · · · * « »ι · ·· «· ·« »#

Φ · 4. · s mikrosporami se resuspenduje v indukčním mediu. Indukční medium optimalizuje odezvu rostliny na indukci embryogeneze.

Indukční medium může obsahovat jakékoliv medium pro kultivaci rostlin s obsahem vhodných makro- a mikrosolí pro podporu životaschopných mikrospor, ke kterým se přidal auxin. Příklady takových medií pro použití jako indukčního media, což v žádném případě není v úmyslu být omezující, jsou uvedeny v tabulce 1. Tyto media jsou založeny na FHG mediu, jak popsal Hunter (1987) a MS mediu, jak popsal Murashige a Skoog (1962). Tyto základní media se modifikovala pro použití u ječmene (MFHG) a pšenice (MMS4).

Jeden možný auxin, který se může přidat do bazického media podle vynálezu je PAA (kyselina fenyloctová), která je účinná při zajištění indukční odezvy (Ziauddin a kol. 1990). V kompozici v tabulce 1, která je uvedena jako příklad a v žádném případě tato kompozice není míněna jako omezující, indukční medium obsahuje vysoké množství glutaminu, maltózyjako cukru a obsahuje PAA jako auxin.

• 0 » · · • · · ♦ · 0

0» * ♦ Μ • · · • * *4 · ·

0 · *0 »0 ·

· • · 0 « * *0

Φ »00

Tabulka 1: Složení živné půdy základní MFHG základní MMS4

Makrosoli	KNOj	1900	1900	1900	1400
	NH4NO3	165	165	1650	300
	KHjPO₄	170	170	170	170
	MgSO₄7H,O	370	370	370	370
	CaCl,-2H,0	440	440	440	440
	FeSO₄.7HjO	-	-	27.8	27.8
Mikrosoli j	FeNayEDTA	40	40	37.3	37.3
	MnSO₄-5HjO	22.3	22.3	22.3	22.3
	H₃BOj	6.2	6.2	6.3	6.3
	ZnSO₄-7H₂O	8.6	8.6	8.6	8.6
	CoCij-óHjO	0.025	0.025	0.025	0.025
	CuSO₄-5H₂O	0.025	0.025	0.025	0.025
	NaMoO₄-2H,O	0.25	0.25	0.25	0.25
	KI	♦	-	0.83	0.83
Další komponenty	glutamin	730	750	146	975
	inositol	100	100	100	300
	thiamin	0.4	0.4	0.4	0.4
	kyselina nikotinová	-	-	0.5	0.5
	pyroxidin	-	-	0.5	0.5
	sacharóza	-	-	30.0 gm	-
	maltóza	62 gm	62 gm	-	90 gm
	kyselina fenyloctová	-	10	-	4
	kyselina indoloctová	-	-	1.0	-
	BAP	1.0	1.0	-	-
	kinetin	-	-	1.0	0.5
	AGP	-	10	-	10
	agaróza	-	-	8.0gm	-
	fytagel	-	3.0gm	-	3.0gm

• · • · · · • · .··. . : i .* ··· · · · · ··· ·· · ·· ·· ······

Modifikované FHG medium (MFHG) lze použít pro indukci ječmenných izolovaných mikrospor, zatímco MMS4 lze použít pro pšenici. Jakmile embrya vykazují známky zelené barvy, ječmen i pšenice se obvykle regenerují v původním MS mediu, kromě případu kdy se sníží kinetin, například (ovšem bez omezení jen na tento případ) na asi 30 mg/l. Ve středním kroku diferenciace embryí před regenerací lze u ječmene a pšenice modifikovat vhodná indukční media snížením maltózy například (ovšem bez omezení jen na tento případ) na asi 30 mg/l, odstraněním auxinu, změnou koncentrace inozitolu například (ovšem bez omezení jen na tento případ) na asi 250 mg/l, přídavkem kaseinu například (ovšem bez omezení jen na tento případ) na koncentraci asi 1,0 mg/l a přídavkem prolinu například (ovšem bez omezení jen na tento případ) na koncentraci asi 690 mg/l.

Indukční media obsahují izotonickou kombinaci solí, amid, jako například (ovšem bez omezení jen na tento případ) glutamin v množství od asi 500 do asi 1000 mg/l, zdroj cukru, jako je maltóza, sacharóza, nebo melobióza, nebo další cukry (viz Hunter, 1988), v množství od asi 20 g/l do asi 100 g/l. Lze použít auxin v množství od asi 2 mg/l do asi 20 mg/l, výhodně od asi 2 mg/l do asi 10 mg/l. Jako auxin lze vybrat (ovšem bez omezení jen na tento případ) PAA (kyselina fenyloctová), NAA, pikloram (vysoce účinný herbicid), nebo 2,4-D. 2,4-D je silnější auxin a postačí použití nižšího množství. Příkladem takového množství PAA v indukčním mediu je od asi 4 mg/l do asi 5 mg/l. Pokud se použije 2,4-D, je optimální, pokud se po 1 až 4 hodinách odstraní a zamění za PAA za účelem získání vysoké četnosti tvorby embryí.

Mikrospory se na počátku inkubují v indukčním mediu takové v hustotě, která zajišťuje přiměřené dělení mikrospor. Jako příklad lze uvést, což v žádném případě není v úmyslu být omezující, inkubace koláče obsahujícího asi 500 000 ječmenných mikrospor, na sterilním a promytém filtračním papíře. Jako další příklad je 100 000 pšeničných mikrospor se směsnou kulturou se semeníky na sterilním a promytém filtračním papíře.

Pro vylepšení odezvy mikrospor v indukční medium, lze k indukčnímu mediu přidat arabinogalaktanový protein, zde uváděný jako AGP, nebo podobné glykoproteiny s bočními uhlovodíkovými řetězci s vysokým obsahem galaktózy, které jsou bohaté na hydroxyprolin (GaRGP), kde tento přídavek zlepší reakci mikrospor, například těch mikrospor, které jsou izolovány z obilnin, jako je pšenice nebo ječmen. Přítomnost AGP nebo GaRGP v indukčním mediu zlepšuje životaschopnost mikro• 4 spor v kultuře, jak za přítomnosti tak i nepřítomnosti semeníků ve směsné kultuře. AGP nebo GaRGP mohou být k indukčnímu mediu přidány v množství od asi 1 mg/l do asi 100 mg/l indukčního media a výhodně v rozmezí od asi 10 mg/l do asi 25 mg/l. V přítomnosti AGP nebo GaRGP je optimální inkubační perioda pro indukci od asi 10 do asi 14 dnů.

pH indukčního media se nastaví v rozmezí od asi 5,6 do 6,0, výhodně asi 5,8. Indukční medium lze případně ztužit přídavkem asi 3 g/l ztužovacího činidla, jako je Phytagel™ nebo Gelrite™, k základnímu kapalnému mediu. Pokud se použije Gelrite™, je zapotřebí vyšších hladin antibiotik nebo herbicidů pro dosažení efektivní selekce v porovnání s Phytagel™-em.

Například, což nemá v žádném případě být považováno za omezující, se umístí sterilizovaný filtrační papír Whatman #2 na vakuovanou plochu vakuové filtrační baňky. Výhodně se podložka přečistí kapalným mediem, jako je FHG medium, které může, ale také nemusí obsahovat auxin, vodný roztok cukerného alkoholu (asi 0,2 mol/l do asi 0,5 mol/l, výhodně asi 0,3 mol/l), nebo sterilní destilovanou vodu (asi od 10 do 20 ml). Při nízkém vakuu se na podložku pipetuje po kapkách asi 1 ml do asi 2 ml media s mikrosporami, které může, ale také nemusí obsahovat auxin.

Celkem se může na každou podložku dát asi od 500 000 do asi 600 000 embryí z ječmenných mikrospor. Pro pšeničné mikrospory je optimální nižší hustota embryí, a to od asi 50 000 do asi 200 000 mikrospor na podložku. Odborník může lehce určit optimální hustotu mikrospor pro danou odrůdu obilniny pro jednotlivou podložku. Podložka musí obsahovat vhodnou velikost pórů pro možnost průchodu kapaliny, přičemž embrya mikrospor zůstanou na povrchu podložky.

V tomto stádiu je u pšenice výhodné do indukčního media přidat směsnou kulturu semeníků. Pokud jsou semeníky umístěny mezi mikrosporami v indukčním mediu, vývoj embryí se zlepší. Semeníky se mohou izolovat z klasů, když jsou mikrospory v jednojaderném stadiu a pokud jsou uschovány v chladu na vlhkém filtračním papíře, dokud se nepoužijí ve směsné kultuře s izolovanými mikrosporami. Může se použít od asi 4 do asi 20 semeníků na misku. V přítomnosti AGP jsou 4 až 6 semeníků dostatečných pro dobrou odezvu mikrospor. Semeníky se umístí mezi mikrospory.

Podložka s mikrosporami, a případně se semeníky pšenice na povrchu, se přenese do misek, které obsahují ztužené regenerační medium, jako je modifikované medium FHG (MFHG) (pro ječmen) nebo medium MS (MMS4) (pro pšenici) popsané • · • 9

9 · · 9 9 · · 9 9 · ί ϊ . J i .**· · I ί ·* • · · · · · · · · · • 9 9 99 ·· 999999 v tabulce 1, ke kterému se přidaly komponenty regeneračního media. Misky se utěsní plynopropustnou folií, např. Parafilm™. Více než dvě vrstvy Parafilmu by mohly způsobit selhání odezvy kultury, pravděpodobně v důsledku nedostatečné výměny plynů. Eventuelně se může malá zavřená miska spolu s malou otevřenou miskou, která obsahuje kapky destilované vody, překrýt větší miskou. V tomto provedení se utěsní pouze velká vnější miska.

Pro indukci embryí se utěsněné misky umístí do temna při teplotách od asi 22 °C do asi 30 °C, výhodně asi 26 °C pro ječmen a asi 28 °C pro pšenici, na dobu asi 2 až asi 5 týdnů. Pokud vyschne podložka z filtračního papíru, je možné do misek přidat kapky kapalného indukčního media.

Mikrospory se umístí na ztužené indukční medium a embrya se nechají vyrůst na velikost od asi 1 do asi 2 mm což může trvat až čtyři týdny. Menší embryonální struktury mohou zůstat na misce s indukčním mediem a na misku se přidají jedna nebo dvě kapky čerstvě připraveného indukčního media. Tyto struktury lze poté, co dosáhnou vhodnou velikost, přemístit. Ječmenné mikrospory se mohou eventuelně kultivovat buď v kapalném nebo agarózou ztuženém FHG (MFGH) mediu nebo, u pšenice, v MS (MMS4) kapalném nebo ztuženém mediu.

Diferenciace

Jakmile embrya dosáhnou velikosti asi 1 mm až asi 2 mm, přenesou se z indukčního media do diferenciačního media na dobu jednoho nebo dvou týdnů, dokud se nevyvinou výhonky a kořínky. Diferenciační medium obsahuje izotonické soli a může obsahovat sacharózu v množství až 50 g/l. Jedno možné diferenciační medium je popsáno v tabulce 1 a sestává z MMS4 media, které navíc obsahuje asi 30 g maltózy, asi 250 mg inozitolu, asi 1000 mg kaseinu a asi 690 mg prolinu, vedle původního MS media, které obsahuje thiamin, pyridoxin, kyselinu nikotinovou a BAP. V diferenciačním mediu není přítomen auxin. Diferenciační medium se nastaví na pH od asi 5,6 do asi 6,0, výhodně asi 5,8. Medium se poté ztuží přídavkem ztužujícího činidla, jako je Phytagel™ nebo Gelrite™, v množstvích 3 g/l.

Ztužené FHG medium bez auxinu lze také použít jako diferenciační medium. Originální MS medium se v důsledku nízkého obsahu glutaminu nejvýhodněji použije v kultuře jako diferenciační medium při použití selekce s rezistencí na Basta herbicid, což je pro diferenciaci výhodné, neboť vysoké hladiny glutaminu snižují efektivnost selekce.

• · ··· · • · ·· ·· • 0 0 · • · · «00 9 0 · • · · ·

9 · · 0···

Regenerace

Diferenciované embrya se přemístí z diferenciačního media do regeneračního media za účelem regenerace zelených zdvojených haploidních rostlin.

Diferenciované embrya se umístí do Gelritem ztuženého diferenciačního media, jako je MS medium modifikované tak, jak je ukázané v tabulce 1.

Jakmile se objeví výhonky, embrya se případně přemístí do regeneračního media založeného na MS mediu, jak je ukázáno v tabulce 1. Embrya se nechají v temnu po dobu asi 3 až asi 4 dnů a poté se nechají při mírném světle po dobu asi 8 hodin/den při teplotě od asi 20 °C do asi 25 °C, výhodně asi 22 °C. Malé rostlinky (vysoké asi 3 cm až asi 4 cm) se přemístí do větších nádobek nebo kádinek s obsahem MS regeneračního media bez obsahu hormonů, aby rostlinky smohli růst. Jakmile má rostlinka asi 3 až 4 listy, umístí se na silné světlo a kondicionují se asi 2 až 5 dní. Po asi 2 až 5 dnech se malé rostlinky přemístí do půdy nebo do květináčů s růstovým mediem.

Transformace

Transformaci rostlin genem našeho zájmu lze dokončit za použití zde popsaného způsobu tak, že se do mikrospor po předúpravě zavede transgen. Protože předúprava posunuje mikrospory do stadia buněčného cyklu před jaderným dělením, přídavek transgenu v tomto stadiu umožní další duplikaci a dělení transgenu, takže vede ke zdvojeným haploidním rostlinám, které jsou vzhledem k transgenu homozygotní. Pro testování transformace je vhodný jakýkoliv detekovatelný markér připojený k transgenu, například gen s herbicidní rezistencí, jako je Bar (Jáhne a kol. 1994; Yao a kol. 1997) nebo lze použít gen s antibiotickou rezistencí. Eventuelně lze použít viditelný markér, jako je zelený fluorescenční protein (GFP) (Carlson 1998).

Transformace mikrospor lze provádět za použití zavedených způsobů, mezi které patří bombardování částicemi (e.g. Jáhne a kol., 1994; Yao a kol. 1997; Carlson 1998; Yao a Kasha 1998; přičemž jsou zde všechny uvedené odkazem) nebo transformace Agrobacteriem (např. WO 96/29419; nebo EP 0 737 738, které jsou zde uvedeny pomocí odkazu). Pro transformaci se výhodně používají předupravené, čerstvě izolované mikrospory. Za použití těchto popsaných způsobů se pozorovala zvýšená četnost transformace. Za použití zde popsaného procesu předúpravy, kdy se kombinoval chlad a cukerný alkohol, se mikrospory udržují na jednonukleární fázi G1, čímž je umožněno vytvářet homozygotní transgenní rostliny.

·· φφφφ ·· Φ· ·· ·φ • · · Φ Φ 0 · φ φ φ 0 .··· ·; : .·

ΦΦ0 ΦΦ00 Φ 0 0

ΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦΦΦΦΦ

Termínem „gen našeho zájmu“ se míní jakýkoliv gen, který se má přepsat do hostitelského organismu. Mezi takové geny našeho zájmu patří, ale nejsou omezeny na gen, jehož produkt má vliv na růst nebo plodnost rostliny, například regulátor rostlinného růstu, jako je auxin nebo cytokinin a jejich analogy, nebo genem našeho zájmu může být geny s herbicidní nebo pesticidní resistencí, které jsou v oboru dobře známy. Mezi geny našeho zájmu může také patřit gen, který kóduje farmaceuticky aktivní protein, například růstové faktory, růstové regulátory, protilátky, antigeny, jejich deriváty užitečné při imunizaci nebo vakcinaci a podobně. Příklady takových proteinů zahrnují, ale nejsou omezeny na interleukiny, insulin, G-CSF, GM-CSF, hPG-CSF, M-CSF nebo jejich kombinace, interferony, například interferon-α, interferon-β, interferon-τ, faktory srážení krve, například Faktor Vlil, Faktor IX, nebo tPA nebo jejich kombinace. Gen našeho zájmu může také kódovat průmyslově vyráběný enzym, proteinový doplněk stravy, výživnou látku, nebo doplňkový produkt do krmivá, potravin, nebo jak pro použití do krmivá i do potravin. Příklady takových proteinů zahrnují, ale nejsou omezeny na proteázy, oxidázy, fytázy, chitinázy, invertázy, lipázy, celulázy, xylanázy, enzymy zapojené do biosyntézy olejů atd.

Způsoby regenerace celých rostlin z embryí jsou v oboru také dobře známy. Obecně se transformované mikrospory kultivují ve vhodném mediu, jak je zde popsáno, které může obsahovat selektivní prostředky, jako jsou antibiotika, kde se použijí selektivní markéry pro ulehčení identifikace transformovaných mikrospor, které tvoří transgenní embrya. Z transgenních embryí poté vyrostou transgenní rostliny.

Výše uvedený popis nemá v žádném případě za cíl omezovat nárokovaný vynález, navíc zde probírané kombinace charakteristik vůbec nemusí být nezbytné pro vynálezecké řešení.

Přehled obrázků na výkresech

Tyto a další znaky vynálezu se lépe ozřejmí pomocí následujících popisů k přiloženým obrázkům, kde:

Obr. 1 je schéma pracovního postupu reprezentující způsob podle jednoho provedení vynálezu.

Obr. 2 ilustruje vývojové stádia jednojaderné mikrospory pro zjišťování stádia vývoje souboru rostlinných segmentů. Na spodních obrázcích jsou DAPI-mořené • to «· ·· ·· ·· · · · · · ♦ ♦ to · : ; .· .: : .··..; : ,* ··· · · · to ··· • to · ·· ·· ·· ···· mikrospory ve středně pokročilém nebo pozdním jednojaderném stádiu, kdy se materiál sbírá tak, jak je zde popsáno.

Obr. 3 ukazuje izolaci a výsev mikrospor. Obr. 3(a) ukazuje filtraci mikrospor přes plátěnko. Obr. 3(b) ukazuje peletu z mikrospor v kyvetě po centrifugaci.

Obr. 3(c) ukazuje umístění mikrospor na filtračním papíře po vakuové filtraci.

Obr. 4 ilustruje vývoj embryí ječmenných mikrospor c.v. Igri. na filtračním papíře za nepřítomnosti AGP. Obr. 4(a) ukazuje embrya při stáří 3 týdny po zavedení kultur na filtrační papír. Obr. 4(b) ukazuje embrya při stáří 5 týdnů po zavedení kultur na filtrační papír.

Obr. 5 ukazuje vývoj embryí pšenice a ječmene. Obr. 5(a) ukazuje vývoj embryí pšenice c.v. Bob White při stáří 4 týdny s (misky na levé straně) a bez (misky na pravé straně) směsné kultury se semeníky, a dále v přítomnosti (horní misky;

mg/l) a bez přítomnosti (spodní misky) AGP. Obr. 5(b) ukazuje vývoj embrya ječmene v přítomnosti 10 mg/l AGP (miska na levé straně) a za nepřítomnosti AGP (miska na pravé straně).

Obr. 6 ilustruje správný vývoj embrya pšenice po 4 týdnech v kultuře s AGP a směsnou kulturou se semeníky. Obr. 6(a) ukazuje vývoj embrya pšenice v kultuře.

Obr. 6(b) ukazuje izolované embrya.

Dále jsou uvedeny příklady, které popisují jednotlivá provedení vynálezu. Příklady nejsou sestaveny tak, aby vynález omezovaly, ale spíše jsou v příkladných provedeních uvedeny takové modifikace, se kterými se může odborník nejvíce dostat do styku.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Následující postup se použije pro izolaci mikrospor z kaše, kterou obdržíme mícháním nebo zpracováním rostlinných segmentů ve vířivé komoře. Kaše se filtruje přes plátýnko nebo přes hrubou nylonovou membránu (obr. 3A). Filtrát se shromažďuje a může se znovu přefiltrovat přes nylonovou síť, která má např. velikost 100 μιτι, do centrifugační kyvety. Centrifugační kyveta se poté centrifuguje při přiměřených podmínkách pro tvorbu koláče z mikrospor (obr. 3B), například, což nemá • · · · · · ·· ·· 44 44

4 4 4 4 4 4 4 4 4 9

4 4 4 4 44 4 4 ·

4 4 4 9 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 4 4 4 4 4 4 v žádném případě za cíl omezovat tento vynález, při 900 ot./min. po dobu 5 min. Asi 0,15 ml koláče může vyprodukovat přibližně 500 000 mikrospor ječmene. Koláč z mikrospor se resuspenduje ve studeném vodném roztoku mannitolu (asi 0,2 mol/l do asi 0,5 mol/l, výhodně 0,3 mol/l mannitolu) a promývá se, dokud nemá supernatant zelený odstín. Například je možné pro tento účel provést 2-3 promytí. Koláč se poté převede do suspenze do indukčního media a filtruje se po kapkách přes filtrační papír za použití vakuové filtrace (obr. 3C).

Příklad 2

Provedla se embryogeneze pro třicet různých genotypů ječmene podle postupu popsaném v tomto vynálezu. Obvykle se vyprodukovalo mezi 10 000 až 15 000 embryi na misku. Tabulka 2 ilustruje některé údaje o embryích v závislosti na zprůměrování ze tří replikací (misek). Nepočítaly se hodnoty u všech třiceti genotypů. Přesto se odezva každého genotypu posoudila na základě vzhledu misek po dvou týdnech a opět po 4 až 5 týdnech. Odebraly se náhodné vzorky 500 embryí ze zkoumaných misek a umístily se na regenerační medium, aby se zjistila schopnost regenerace embryí. Jak je vidět v tabulce 2, počet regenerátů se pohyboval od 36 do 97 %. Obr. 4 ilustruje vývoj ječmenného embrya c.v. Igri při stáří 3 týdny (obr. 4(a)) a 5 týdnů (obr. 4(b)) na filtračním papíře umístěném na ztuženém indukčním mediu.

• » ··«·

Tabulka 2: Indukce a regenerace embryí po předúpravě různých genotypů ječmene • · * ··«· » · · · • · · · · ·· · · · ··· · · · · ··· • · · · ♦ · · ······

Genotyp	Před úprava	Embroidy*	% regenerovaných embroidů
Igri	28d v chladnu,	13136	85%
	4 d 0.3M. man. 4’C	12380	97%
	4d 0.3Mman. 25‘C	13504	88%
GBC 782	3d 0.3M man. 4‘C	14496	n.a.
GBC 783	3d 0.3M man. 4‘C	11360	n.a.
Harrington	3d 0.3M man. 4’C	5533	36%
Lina	21d v chladnu,	15377	77%
	7d 0.3M man 4‘C	8921	81%
Oxbow	21 d 0.3M man. 4‘C	10810	58%
Manley	4d 0.3M man. 4‘C	11360	74%
GBC 777	4d 0.3M man. 4‘C	14133	89%
GBC 778	4d 0.3M man. 4’C	7667	84%

28d = 28 dní v chladnu; 0,3M man. 4 °C = 0,3 mol/I mannitol o teplotě 4 °C; n.a. = odrůda nebyla analyzována *Počet embryí se průměruje ze tří misek, zatímco % regenerace je založena na výhoncích vytvořených na 500 embryích na misku.

Ječmenné genotypy Igri, GBC777 a GBC778 jsou zimní habity, zatímco zbytek genotypů v tabulce 2 jsou jarní habity. Harrington, Manley a Oxbow jsou v dnešní době hlavní pěstované dvouřádkové sladovnické ječmeny v Kanadě. Igri a Lina jsou evropského původu. Linie GBC 777 a 778 jsou šestiřádkové ječmeny.

Porovnávaly se tři různé způsoby předúpravy na genotypu Igri a nepozorovaly se žádné zjevné rozdíly mezi indukcí a regenerací embryí (tabulka 2). Kultura mikrospor Lina obvykle reaguje dobře na předúpravu mannitoíem, ale kombinace chladu s mannitoíem po dobu 7 dnů vyvolala v této studii pouze slabou odezvu. Proto se tvorba embryí pro odrůdu Lina spočítala pro předúpravu při chladu po dobu 21 dnů, kdy reakce byla pro odrůdu Lina více typická (tabulka 2). Odezva na regeneraci u »9 ·**· «9 ·· 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 j í .· · j ί »**· ♦ í ; ♦*

9 9 9 9 9 9 9 9 9 * 99 <· ·· 9999 obou způsobů předúpravy byla u odrůdy Lina podobná. Četnost fertilních zdvojených haploidů v potomstvu odrůdy Lina po dvou předúpravách nebyla rozdílná, konkrétně 79% pro kombinovanou 7-mi denní předúpravu a 83% po předúpravě při 21 dnech v chladu.

Odezva u odrůdy Harrington byla také nízká jak u tvorby embryí, tak i u celkové procentuální regenerace, ale potom se zlepšila. Odezva odrůdy Oxbow ukázala, že při kratší době předúpravy vykazuje dobrou odezvu, ale z indukovaných struktur se převážně stal kalus. Přesto pokud se aplikuje delší předůprava, jak je ukázáno v tabulce 2, odezva je převážně embryogenní a dostáváme přijatelný poměr celkové regenerace. Tato odezva je pro Oxbow typická, je pravděpodobně způsobena vyšším obsahem endogenního auxinu.

U genotypu šestiřádkového zimního habitu GBC777 je neobvyklé, že by produkoval pouze asi 5 % zelených rostlin a zbytek byly albíny. I při tak nízké četnosti by bylo možné obdržet asi 500 zelených rostlin na misku, pokud by se všechny embrya regenerovaly. I když by tato procedura byla pracná, bylo by možné přenést všechna embrya do suspenze kultury v regeneračním mediu a za mírného osvětlení regenerovat zelené klíčící embrya.

Embryogeneze se vizuelně vyhodnocovala u ječmenných zimních genotypů:

OAC Elmira, GBC776, GBC779, GBC780 a GBC781, a u jarních genotypů, Trinity, Cooper, Golden Promise, Disa, Morex, Excel, Elrose, Bruče, Rodeo, H936 a Sabarilis. Účinné embryogeneze se dosáhlo předůpravou za chladu s mannitolem po dobu 3 až 4 dny v 0,3 mol/l mannitolu při 4 °C u těchto genotypů. Při těchto podmínkách se u responzivních genotypů naměřilo asi 2 000 rostlinek na 10⁵ mikrospor, nebo asi 200 rostlinek na klas.

Způsob embryogeneze mikrospor podle vynálezu, je pro ječmen efektivní v široké škále genotypů. U výše uvedených genotypů ječmene vedla produkce struktur embryí k vysokému procentu iniciace regenerace.

Příklad 3

V tomto příkladu se probírá účinek doby předúpravy na embryogenezi u ječmenného genotypu Igri pro klasy inkubované v 0,3 mol/l mannitolu při 4 °C. Tabulka 3 ilustruje, že již tak krátká doba jako jsou 4 dny předúpravy, drasticky ovlivňuje počet embryí vytvořených z mikrospor. Ačkoliv počet vytvořených embryí roste až do 28 dnů předúpravy, pro příznivé účinky postačí jen 4 dny předúpravy. Zjistilo se, že «·· ·

A« r* >* » · « β · A A 1 · · ·

A A · « · A * · · * • · A « · « · ♦·· · * • · · · * · · * · · • A c «»A * · 9991 doba předúpravy u Igri není pro dosáhnutí efektivní odezvy rozhodující. Avšak doba předúpravy ovlivňuje odrůdu Oxbow, jak již bylo dříve zmíněno a ilustrováno v tabulce 2.

Tabulka 3: Účinek doby předúpravy na tvorbu embryí z klasů při 4°C v 0,3 mol/l mannitolu

Doba předúpravy ve dnech	počet vytvořených embryí
0	0
4	9579
7	9693
14	8981
21	9692
28	10213

Příklad 4

Zkoumal se vliv použití podložky pro živné prostředí na vývoj embryí na regeneraci rostlin z pšeničných mikrospor genotypu Chris. Mikrospory se inkubovaly v indukčním mediu (MMS4 medium) buď na podložce (Watman #2 filtrační papír), nebo v kapalném mediu (kapkový způsob). Příprava a použití filtračního papíru byla popsána již výše. Kapkový způsob se přichystá stejným způsobem, jenom požadovaný počet mikrospor je obsažen v koncentrované kapce kapalného media, která se umístí přímo na povrch pevného media. Po 10 dnech až dvou týdnech se přidají jedna nebo dvě kapky čerstvého kapalného media jak na filtrační papír, tak i na kapkový systém, aby se lépe rozprostřely vyvíjející se mikrospory, a tak měli lepší podmínky pro vývoj. Tabulka 4 ilustruje výsledky získané ze tří replikací. Příklady vývoje jsou ukázány na obr. 4.

·· · · · · · · ··· · · · · · · · ·· · · · · ··· · · ··· ···· · · · ·· · ·· · · ·«····

Tabulka 4: Vliv podložky živného prostředí na vývoj embryí a regeneraci rostlin z mikrospor pšenice (genotypy Chris) indukované pomocí MMS4 (bez AGP).

Úprava	počet misek	počet embryí v kapkovém systému (ELS)	zelené rostliny	albinózní rostliny	celkem	% regenerátů	% zelených regenerátů
filtrační papír	1	650	350	4	354	54	54
	2	615	265	3	268	44	43
	3	658	390	5	395	60	59
	celkem	1923	1005	12	1017	53	52
kapkový způsob	1	300	130	2	132	44	43
	2	300	100		100	33	33
	3	300	110	3	113	38	37
	celkem	900	340	5	345	38,3	37,7

Indukovalo se dvakrát více embryí na misku za použití podložky během indukce, než při inkubaci v kapalném indukčním mediu. Počet získaných zelených rostlin se při použití podložky během indukce více než zdvojnásobil, což má dále za následek vyšší procentuální zastoupení regenerovaných rostlin z embryí. Lepší vývoj na filtračním papíře může být způsoben lepší aerací na povrchu filtračního papíru. Předúprava, izolace mikrospor a medium byly stejné jak pro indukci, tak i pro regeneraci.

Tyto výsledky demonstrují prospěšnost použití podložky během embryogenické indukce mikrospor. Příklady vývoje jsou ukázány na obr. 4.

Příklad 5

Porovnával se vliv složení regeneračního media pro pšeničné mikrospory, které se indukovaly v mediu za přítomnosti a nepřítomnosti AGP. Regenerační medium bylo založeno na MMS4 mediu, které obsahovalo buď 3 % sacharózy nebo 9 % maltózy jako zdroj cukru, nebo bylo založeno na MMS4 mediu s 9 % maltózy a obsahem AGP. Mikrospory se indukovaly buď na podložce, v tomto případě na Watman #2 filtračním papíře, nebo se umístily na pevné medium pomocí kapek.

• · · · • · • · ·· φ φφφφ φφφφ φφφ φ φ ·· φ φ · • · φ φφφφ φφφ • * « φ · ·· φφφφφφ

Tabulka 5: Vliv regeneračního media na vývoj rostlin z pšeničných mikrospor (c.v. Pavon 76) indukovaných na AGP mediu, buď na filtrech (A) nebo ve formě kapek na pevném mediu (B), provedla se 4 opakování (misky).

	Regenerační médium	# ELS (= počet embryí v kapkovém systému)	počet zelených rostlin	počet albinózních rostlin	% regenerátů	% zelených regenerátů
A	MMS₄(S*)	498	385	10	79,3	77,3
	MMS₄(M*)	498	235	22	51,6	47,2
	AGP(M)	498	148	17	33,1	29,7
	Celkem	1494	768	49	54,7	51,4
	May přenos**	600	291	17	51,3	48,5
	MMS₄(S*)	260	172	6	68,5	66,2
	MMS₄(M)	260	122	9	50,4	46,9
	AGP(M)	265	103	10	42,6	38,9
	Celkem	785	397	25	53,8	50,6
	May přenos**	610	296	9	50,3	48,5

*cukr je 3% sacharóza (S), oproti 9% maltóze (M) **pozdější přenos May byl pouze z MMS4 média, kdy zde bylo dalších 650 až 750 menších ELS, které nebyly přeneseny.

Jak je vidět z výsledků v tabulce 5, přítomnost podložky z filtračního papíru vede ke zvýšené embryogenezi a produkci zelených rostlin v porovnání s indukcí embryí v kapalném mediu kapaném na ztužené medium. Sacharóza v regeneračním mediu byla efektivní při produkci vysokého procenta zelených rostlin, u maltózy se zjistilo, že je také efektivní. Pokud se nebudeme svázáni teorií, můžeme usoudit, že to může být způsobeno rychlejším uvolňováním energie ze sacharózy, která je pro regeneraci potřebná. Přídavek AGP k regeneračnímu mediu snížil počet produkovaných zelených rostlin. Tento výsledek může ukazovat na to, že AGP je důležité v indukčním mediu pouze v iniciačním stadiu, ale ne při pozdějších stadiích.

Příklad 6

Zkoumal se účinek AGP na embryogenezi a rostlinnou regeneraci u pšeničných mikrospor, které se izolovaly z genotypu Pavon 79 podle způsobu vynálezu. Výsledky embryogeneze jsou prezentovány v tabulce 6 a hodnoty rostlinné regenerace jsou uvedeny v tabulce 7. Zkoumaly se koncentrace AGP 0, 1,5 a 10 mg/l.

·· ·· ··

8 · · · · · ·

9 9 9 9 99 9

Tabulka 6. Odezva kultur izolovaných pšeničných mikrospor na různé koncentrace AGP v MMS4 mediu, s a bez semeníků. Dvě opakování cv Pavon 79.

Úpravy	Celk. počet mikrospor po 10 dnech (D 10)	počet živých a dělících se po 10 dnech (d 10)	počet živých a nedělících se po 10 dnech(d 10)	počet mrtvých mikrospor po 10 dnech (d 10)	počet vícebuněčných po 10 dnech (d 10)	počet prasklých vícebu- něčných po 10 dnech (d 10)	počet embryí po 30 dnech
AGP ml/l	semeníky +/+ = přítom- nost semeníků nepřítom- nost semeníků
0	-	102805	6930	5775	83500	6600	0	0
	+	105925	16305	4950	68345	12850	1125	1650
1	-	89825	22125	5650	47558	13750	400	0
	+	92575	22605	2805	47175	18500	1072	2130
5	-	98015	26152	8275	34500	28345	742	0
	+	102280	18272	7600	30250	39078	7080	3393
10	-	110745	33275	6250	24650	41950	4620	50
	+	108305	8500	0	23550	68000	15452	4250

Celková množství v 10. den se zjišťovala sečtením ze čtvercové oblasti a vynásobením 1,65x10³. U každé misky se odečetly hodnoty z tří oblastí a zprůměrovaly se, poté se zprůměrovaly dvoje opakování. Pro zjištění počtu embryí při 30. dni se oddělila jedna čtvrtina misky a započetly se všechny velikosti embryí.

Pro zjištění hodnot regenerace (viz tabulka 7) se přeneslo 250 embryí z jedné misky do regeneračního media. Významné zlepšení embryogeneze, regenerace a % produkovaných zelených rostlin bylo výsledkem přídavku 10mg/l AGP, za použití genotypu Pavon 79. Pavon 79 vykazuje vyšší četnost albinózních rostlin, než ostatní genotypy. Navíc hodnoty ilustrují, že přítomnost semeníků ve směsné kultuře zlepšila embryogenezi a regeneraci rostlin. Za nepřítomnosti směsné kultury prašníků byla výrazná embryogeneze pozorována pouze při koncentraci AGP 10mg/l. Obrázek 5(a) ilustruje odezvu pšeničných mikrospor v přítomnosti nebo nepřítomnosti pšeničných semeníků a při koncentraci 0 nebo 10 mg/l AGP. Obrázek 6 ilustruje správnou strukturu embrya pšenice vyvinutého po 4 týdnech v mediu s obsahem semeníků a AGP.

• · ·· · · ·· • · · · · ···· • · «· · · · · ·· · · · · « • · · · · · ·

9· ·« »· ····

Tabulka 7: Regenerace rostlin z pšeničných mikrospor v přítomnosti AGP v indukčním mediu MMS4, cv Pavon 79.

Úpravy se semeníky a AGP	celkový počet mikrospor (x1000)	celkový počet embryí	počet embryí přenesených do regeneračního media	počet rostlin	% zelených rostlin	% regenerá- tů
mg/l AGP				zelené rostliny	albinózní rostliny	celkem
0	103	1650	250	37	78	115	32	46
1	90	2130	250	48	70	118	41	47
5	98	3393	250	50	70	120	42	48
10	111	4250	250	129	60	189	68	76

Příklad 7

Předběžné experimenty jak na filtračním papíře, tak i na kapalném mediu se semeníky, byly porovnány na odezvu embryí v indukčním mediu s obsahem 0,5 a 10mg/l AGP. Tabulka 8 ukazuje účinek AGP na izolovanou kulturu mikrospor Pavon 79 v kapalném mediu oproti kultuře pěstované na podložce z filtračního papíru. Výsledky jsou podobné jak pro kapalné medium, tak i pro filtrační papír při porovnání 3 koncentrací, přičemž 10 mg/l AGP vykazovalo nejlepší odezvu.

Tabulka 8: Účinek AGP na izolovanou kulturu mikrospor jarní pšenice Pavon 79 pěstovanou v kapalném mediu obsahujícím MMS4 medium oproti kultivaci na filtračním papíře na pevném mediu, obojí ve směsné kultuře se semeníky.

AGP konc. mg/l	počet kultivovaných mikrospor x 1 000	celkový počet embryí na misku
0 kapalina	106	1650
0 filtr	cca 100	1769
1 kapalina	93	2130
5 kapalina	102	3393
5 filtr	cca 100	3080
10 kapalina	108	4250
10 filtr	cca 100	4528

Příklad 8

Zkoumal se účinek AGP na embryogenezi mikrospor v přítomnosti směsné kultury semeníků za použití pšeničných genotypů Chris a Pavon 79. Porovnával se vliv media s obsahem 5 mg/l a 10 mg/l AGP oproti kontrolnímu medii na embryogenezi mikrospor v přítomnosti směsné kultury semeníků. Výsledky v tabulce 9 ukazují, že celková odezva pšenice Chris na AGP je vyšší, než odezva Pavon 79.

• · · · • 4 • · • 4 • · · « · · · 4 · · •4 « 4· ·· 4· 4444

Tabulka 9: Účinek AGP na vývoj embryí z mikrospor u jarních genotypů pšenice Chris a Pavon 79, při použití 0,8ml kapky na pevné MMS4 medium se 3-4 semeníky.

	Chris	Pavon 79
AGP konc. v mg/l	počet opakováni	průměrný počet embryí	počet opakování	průměrný počet embryí
0	3	4007	3	2778
5	5	5618	3	4155
10	5	9836	3	4681

Příklad 9

Na základě dat získaných z příkladu 8, tabulky 8 a 9, se zjistilo, že nejvyšší testovaná koncentrace AGP (10 mg/l) dávala nejlepší odezvu při embryogenezi, přičemž vyšší koncentrace nebyly testovány. V experimentu s Pavon 79 se použily koncentrace 0, 10, 25, 50, 100, 500 a 1 000 mg/l pro kulturu mikrospor se 4 semeníky kolem kapky kapalného media s mikrosporami na povrchu ztuženého media. Výsledky jsou zobrazeny v tabulce 10.

Tabulka 10: Vliv koncentrace AGP na kulturu mikrospor u jarní pšenice Pavon 79 v kapalném mediu MMS4 (data zprůměrované ze 4 opakování)

Konc. AGP mg/l	počet ph 12. dni	50.den
živé	mrtvé	dělící se	vícebu- něčné	ELS	celkový počet vyvíjejících se	počet embryí
0	64,3	62,7	12,4	23,5	2,1	38	2862
10	69,3	58,9	23,9	33,8	8,7	66,4	4493
25	66,6	69,3	13,6	38	10,3	61,9	3538
50	47,9	75	10,7	13,2	5	28,9	471
100	66,4	61	17,3	32,2	2,9	52,4	3709
500	57,3	61	19,4	27,7	4,5	51,6	3267
1000	69,3	56	14,8	28,5	7	50,3	1821

Ze získaných výsledků lze říct, že pro optimální embryogenezi jsou ideální koncentrace 10 nebo 25 mg/l AGP. Přesto lze použít také vyšší koncentrace. Životnost mikrospor při 12. dni nebyla výrazně odlišná od srovnávací hodnoty bez přítomnosti AGP, ale celkový počet vyvíjejících se struktur se v přítomnosti AGP zvýšil. Dále se vypozorovalo, že 10 až 14 dní v indukčním mediu sAGP může být maximální doba, neboť se zdá, že při delších periodách se v mediu s AGP regenerace snižuje.

• · · · · ·

Příklad 10

Zkoumal se vliv koncentrace AGP v kultuře během embryogenické indukce u ječmenných mikrospor. Na mikrosporách cv. Igri se zkoumalo široké rozmezí koncentrací, viz tabulka 11. Na pevné FHG medium se přidávalo kapalné medium FHG s 10⁵ mikrosporami a různými koncentracemi AGP. Za použití kapky s mikrosporami na ztuženém MFHG mediu se počítaly struktury pod invertovaným mikroskopem. Poměr živých a mrtvých mikrospor se na těchto miskách nepočítal, ale vyvíjejících se mikrospor bylo mnohem více v 0 mg srovnávacím vzorku v porovnání s pšenicí. Proto rozdíl v odezvě u ječmene na AGP při 10. dni není tak výrazný jako u pšenice. Avšak s pšenicí jsou podobné výsledky při 50. dni, kdy bylo zjevné pokračování vývoje a rapidnější vývoj mikrospor s AGP, jak je vidět na obrázku 5(b) po 4 týdnech v kultuře.

Tabulka 11: Vliv AGP na vývoj izolovaných ječmenných mikrospor cv Igri v kapalném mediu FHG po 10 dnech

AGP konc. v mg/l	dělení v rámci mikrospory	volné vícebuněčné	celkový počet vyvíjejících se mikrospor
0	33280	33310	65590
2	39600	33550	73150
5	43000	38230	81230
10	45280	35750	81030
25	39880	36030	75910
50	37120	39880	77000
100	42900	37730	80630
500	35890	37810	73700
1000	38500	41600	80100

Příklad 11

Vizuelně se zkoumala odezva izolovaných mikrospor na embryogenezi a regeneraci rostlin u jarních a ozimých pšeničných genotypů za použití způsobu podle vynálezu s obsahem AGP v indukčním mediu. Všechny genotypy vykazovaly odezvu na způsob produkce embryí a zelených rostlin z mikrospor. Tabulka 12 ukazuje relativní odezvu každého genotypu ve stupnici od 0 do 3, kde 0 reprezentuje nulovou odezvu, 1 reprezentuje slabou odezvu, 2 dobrou odezvu a 3 reprezentuje výbornou odezvu. Počítala se jak embryogeneze, tak i iniciace zelených rostlin. U zimních genotypů byly z produkčního reaktoru dostupné pouze 3 donorové rostliny, takže vzorek byl malý.

• · · 0 · 0 • 0

ničných genotypů (odezva hodnocená podle stupnice od 0 do 3)

Testované genotypy	odezva
embryogeneze	regenerace zelených rostlin
jarní pšenice
Chris	3	2-3
Pavon 70	3	2-3
Pavon 76	3	2-3
Bob White S	3	3
Quantum	3	1-2
Hartog	3	1-2
zimní pšenice
2540	3	2
OAC Montrose	3	3
Harus	3	2
Freedom	3	2
Hanover	3	2
Fundulea	2	neanalyzováno
AC Morley	3	2-3

Indukční odezva u pšenice je nezávislá na genotypu, stejně tak u ječmene, zatímco regenerační odezva je trochu rozdílnější. Výsledky se zimními liniemi pšenice jsou založeny jen na 3 donorových rostlinách, které jsme získali z produkčního reaktoru po jarovizaci. Regenerace odrůdy Fundulea se neprováděla. Jak Pavon, tak i Bob White jsou celkem rozdílné odrůdy a proto se kultivovala selekce. Bob White S je bezosinná selekce. I když indukce v mediu bez AGP je také dobrá, vývoj embryí není tak dobrý, jako s AGP, a proto je regenerace silně ovlivněna AGP.

Všechny zde citované publikace jsou zahrnuty pomocí odkazu. Je možné provést mnoho modifikací bez odklonění od vynálezu. Je samozřejmé, že vynález zde byl popsán ve spojení s určitými příklady a provedeními. Přesto se změny, modifikace nebo obdoby, které mohou odborníci provést, počítají za to, že jsou součástí vynálezu. Také popis vynálezu je sestaven jako příklad, ne jako omezení možností a proto změny v rozmezí principů vynálezu, jak je odborníkům zřejmé, jsou považovány za součást nároků.

·· ···· ·· 44 44 ·9

ODKAZY

Carlson, A. R. 1998, Visual selection of transgenic barley (Hordeum vulgare L.) structures and their regeneration into green plants. M.Sc. Thesis, Univ. of Guelph, 85 stran.

Egertsdotter a kol. Importance of arabinogalactan proteins for the development of somatic embryos of Norway Spruce Picea abies. Physiol Plant 1995;93:33445.

Hunter, C.P. 1988. Plant regeneration from microspores of barley (Hordeum vulgare L.) PhD Thesis, Wye College, Univ. of London.

Jáhne, A., D. Becker, R. Brettschneider and H. Lórz. 1994, Regeneration of transgenic, microspore-derived, fertile barley. Theor. Appl. Genet. 89:525-533.

Kasha, K.J., Q. Yao, E. Simion, T. Hu, a R. Oro. 1995. Production and Application of Doubled Haploids in Crops. In: Induced Mutations and Molecular Techniques for Crop Improvement. IAEA/FAO Symp., Vídeň.

IAEA-SM-340/9:23-37.

Kawaguchi a kol. A novel tetrasaccharide, with a structure similar to the terminál seqence of an arabinogalctan-protein, accumulates in rice anthers in a stagespecific manner. Plant Journal, 1996;9(6):777-785.

Kreuger a kol. Arabinogalactan proteins are essential in somatic embryogenesis of Daucus carota L. Planta 1993;189:243-248.

Murashige, T. a F. Skoog, 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:473-495.

Roberts-Oehlschlager, S.L. a J.M. Dunwell. 1990. Barley anther culture: Pretreatment on mannitol stimulates production of microspore-derived embryos. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 20:235-240.

• · ··· ·

Wheatly W.G., A.A. Marsolais a K.J. Kasha. 1986. Microspore growth and staging for barley anther cultures. Plant Cell Rep. 5:47-49.

Yao, Q.A., E. Simion, M. William, J. Krochko a K.J. Kasha. 1997. Biolistic transformation of haploid isolated microspores of barley (Hordeum vulgare L.) Genome 40:570-581.

Ziauddin, A., A. Marsollais, E. Simion, and K. J. Kasha. 1990. Improved plant regeneration from wheat anther and barley microspore culture using phenylacetic acid (PAA). Plant Cell rep. 11:489-498.

Claims

1. Způsob produkce embrya, vyznačující ment, který obsahuje mikrospory, z donorové rostliny: segment se inkubuje za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu: ze segmentu se izolují mikrospory: a izolované mikrospory se inkubují v indukčním mediu obsahujícím glykoprotein bohatý na hydroxyprolin s bočními uhlovodíkovými řetězci s vysokým obsahem galaktózy (GaRGP), čímž se indukuje embryogeneze a tím se produkují embrya.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že donorovou rostlinou je obilnina a indukční medium může obsahovat arabinogalaktanový protein nebo glykoprotein bohatý na hydroxyprolin.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že obilninou je pšenice nebo ječmen.

4. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že arabinogalaktanový protein nebo GaRGP je přítomen v indukčním mediu v koncentraci od 1 mg/l do 500 mg/l indukčního media.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že arabinogalaktanový protein nebo GaRGP je přítomen v indukčním mediu v koncentraci od 10 mg/l do 25 mg/l indukčního media.

6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že arabinogalaktanový protein nebo GaRGP je přítomen v indukčním mediu po dobu asi dvou týdnů.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že podstatná část mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu je zahrnuta v rozmezí od 50 % do 100 %.

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že podmínky předúpravy jsou tvořeny teplotou od 3 °C do 10 °C po dobu 3 až 10 dnů a inkubace při podmiň99 9999

9»

9 9

99 9 9 9·· ·99·

9 · 9 99 99 9 · ·

9 99 99 99 999 9 9 • 99 9··· 999 • 9 9 99 ·9 9· 9999 kách předúpravy probíhá ve vodném roztoku obsahujícím od 0,2 mol/l do 1,0 mol/l cukerného alkoholu.

9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že cukerný alkohol je vybrán ze skupiny sestávající z mannitolu, maltitolu, sorbitolu, xylitolu a z jakékoliv jejich kombinace.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že podmínky předúpravy zahrnují inkubaci ve vodě při teplotě od 3 °C do 10 °C po dobu 7 až 28 dní.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se rostlinný segment, který obsahuje mikrospory, vybere ze skupiny sestávající z výhonků, květů, klasů, prašníků, lat a vláknin.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se izolované mikrospory inkubují v indukčním mediu po dobu od 3 do 14 dnů.

13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že indukční medium obsahuje auxin.

14.Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že auxinem je kyselina fenyloctová.

15. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že indukční medium obsahuje glutamin v koncentraci od 500 do 1 000 mg/l.

16. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že indukční medium navíc obsahuje směsnou kulturu semeníků.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se mikrospora získá z pšenice.

·· ·»·· • ·· · · * · · · · · · • · · ···· · · « «· · ·· ·· 99 9999

18. Způsob regenerace rostlin z mikrospor vyznačující se tím, že se sebere rostlinný segment, který obsahuje mikrospory, z donorové rostliny; segment se inkubuje za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu; pak se ze segmentu izolují mikrospory; izolované mikrospory se inkubují v indukčním mediu, které obsahuje auxin a arabinogalaktanový protein v množství od 1 mg/l do 500 mg/l pro indukci produkce embryí; dále se embrya inkubují v diferenciačním mediu za účelem produkce diferenciovaných embryí; a z diferenciovaných embryí se pak regenerují rostliny.

19. Způsob regenerace rostlin podle nároku 18, vyznačující se tím, že embrya vzniklá po inkubaci mikrospor se umísťují na podložku.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že podložka obsahuje filtrační papír.

21. Způsob podle nároku 18, vyznačující se tím, že izolace mikrospor ze segmentu sestává z míchání nebo víření segmentu ve vodném roztoku 0,2 mol/l až 1,0 mol/l cukerného alkoholu.

22. Způsob tvorby kultury mikrospor obilniny, vyznačující se tím, že se inkubuje segment obilniny obsahující mikrospory v mediu, které obsahuje arabinogalaktanový protein v množství od 1 mg/l do 100 mg/l, pro tvorbu embryí; a z embryí se regeneruje obilnina.

23. Způsob zavedení určtého genu do mikrospory, vyznačující se tím, že se zavede genetický konstrukt obsahující určitý gen do mikrospory, která se získá předúpravou a izolací, jak je definováno v nároku 1.

24. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že zavedení sestává z bombardování částicemi.

♦ · φφφφ • Φ ·♦ φφ ·· • φ · · · φ « · * · · • φ · φ · φ* φ φ * • ·· · · φ · · φ φ φ φ • ΦΦ φφφφ ΦΦΦ φφ φ φφ ΦΦ φφ φφφφ

25. Způsob podle nároku 23, vyznačující se tím, že zavedení sestává z transformace zprostředkované Agrobacteriem.

26. Způsob produkce embrya vyznačující se tím, že se sebere rostlinný segment, který obsahuje mikrospory, z donorové obilniny: segment se inkubuje za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu; ze segmentu se izolují mikrospory; a izolované mikrospory se inkubují v indukčním mediu obsahujícím arabinogalaktanový protein, čímž se indukuje embryogeneze a tím se produkují embrya.

27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že obilninou je pšenice nebo ječmen.

28. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že arabinogalaktanový protein je přítomen v indukčním mediu v koncentraci od 1 mg/l do 500 mg/l indukčního media.

29.Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že arabinogalaktanový protein je přítomen v indukčním mediu v koncentraci od 10 mg/l do 25 mg/l indukčního media.

30. Způsob podle nároku 29, vyznačující se tím, že arabinogalaktanový protein je přítomen v indukčním mediu po dobu asi dvou týdnů.

31. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že podstatná část mikrospor v jednojaderné fázi G1 buněčného cyklu je při inkubaci zahrnuta v rozmezí od 50 % do 100%.

32.Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že podmínky předúpravy jsou tvořeny teplotou od 3 °C do 10 °C po dobu 3 až 10 dnů a inkubace při podmínkách předúpravy probíhá ve vodném roztoku obsahujícím od 0,2 mol/l do 1,0 mol/l cukerného alkoholu.

·» ·· toto ·· • · to · * to <► ·*«· ··· «··· toto * •e ···· • toto ···· »·♦ ·· · et to· · · ··· ·

33.Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že cukerný alkohol je vybrán ze skupiny sestávající z mannitolu, maltitolu, sorbitolu, xylitolu a z jakékoliv jejich kombinace.

34. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že podmínky předúpravy zahrnují inkubaci ve vodě při teplotě od 3 °C do 10 °C po dobu 7 až 28 dní.

35. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se rostlinný segment, který obsahuje mikrospory, vybere ze skupiny sestávající z výhonků, květů, klasů, prašníků, lat a vláknin.

36. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se izolované mikrospory inkubují v indukčním mediu po dobu od 3 do 14 dnů.

37. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že indukční medium obsahuje auxin.

38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že auxinem je kyselina fenyloctová.

39. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že indukční medium obsahuje glutamin v koncentraci od 500 do 1 000 mg/l.

40. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že indukční medium navíc obsahuje směsnou kulturu semeníků.

41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že se mikrospora sebere z pšenice.

42. Mikrospora získaná z indukčního media, jak je definováno v nároku 26, před embryogenezí.

43. Embryo produkované z mikrospory podle nároku 42.

·· «··· 9· ·9 ** ·♦ • 4 · 499· 9 9 · 9

38 ·*·· · ϊ i .*

499 9 9 9 * 999

49 9 4· 9« ·* 9994

44. Rostlina produkovaná z embrya podle nároku 43.

45. Semeno pocházející z rostliny podle nároku 44.

46. Způsob produkce kompozice mikrospor, vyznačující se tím, že se sebere rostlinný segment, obsahující mikrospory, z donorové rostliny; segment se ínkubuje za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi buněčného cyklu; ze segmentu se izolují mikrospory; izolované mikrospory se inkubují v indukčním mediu, které obsahuje arabinogalaktanový protein za účelem produkce kompozice mikrospor, která po 10 dnech inkubace obsahuje více než 25 % životaschopných mikrospor.

47. Kompozice mikrospor, vyznačující se tím, že po 10 dnech inkubace obsahuje více než 25 % životaschopných mikrospor.

48. Způsob produkce kompozice mikrospor, vyznačující se tím, že se sebere rostlinný segment, obsahující mikrospory, z donorové rostliny; segment se inkubuje za podmínek předúpravy za účelem udržení podstatné části mikrospor v jednojaderné fázi buněčného cyklu; ze segmentu se izolují mikrospory; izolované mikrospory se inkubují v indukčním mediu, které obsahuje arabinogalaktanový protein za účelem produkce kompozice mikrospor, která po 10 dnech inkubace obsahuje více než 15 % mnohobuněčných mikrospor.

49. Kompozice mikrospor, vyznačující se tím, že po 10 dnech inkubace obsahuje více než 15 % mnohobuněčných mikrospor.

50. Mikrospora získaná z indukčního media, jak je definováno v nároku 1, před embryogenezí.

51. Embryo produkované z mikrospory podle nároku 50.

52.Rostlina produkovaná z embrya podle nároku 51.