CZ20022510A3 - Způsob identifikace buněk, které produkují IgG, od buněk, které neprodukují IgG - Google Patents
Způsob identifikace buněk, které produkují IgG, od buněk, které neprodukují IgG Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20022510A3 CZ20022510A3 CZ20022510A CZ20022510A CZ20022510A3 CZ 20022510 A3 CZ20022510 A3 CZ 20022510A3 CZ 20022510 A CZ20022510 A CZ 20022510A CZ 20022510 A CZ20022510 A CZ 20022510A CZ 20022510 A3 CZ20022510 A3 CZ 20022510A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- igg
- cells
- protein
- produce
- produced
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims abstract description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 87
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 claims description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 claims description 5
- 241001529936 Murinae Species 0.000 claims description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 72
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 11
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 8
- 108091006004 biotinylated proteins Proteins 0.000 description 7
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 2
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- ZFMGGOYZSDMLSQ-UHFFFAOYSA-N 2-fluorochromen-4-one Chemical compound FC=1OC2=CC=CC=C2C(C1)=O ZFMGGOYZSDMLSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 argon ion Chemical class 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
Oblast techniky
Předložený vynález se týká nového způsobu identifikace buněk, které produkují IgG, od buněk, které neprodukují IgG, rozlišením zapouzdřených buněk, které produkují fluorescentně označený IgG, a buněk, které neprodukují IgG, a to použitím průtokové cytometrie.
Imunoglobulln G (IgG) je ve stále se zvyšující míře používán pro diagnostické a terapeutické účely v humánní medicíně (Scheinberg D. A. a Chapman P. B. v Birch J. R. a Lennox E. S., red., 1995, Wiley, 45 až 105).
Dosavadní stav techniky
Způsoby identifikace, které používají zapouzdřené buňky, aby se umožnilo rozlišení buněk, které produkují IgG, od buněk, které neprodukují IgG, jsou dobře známy (Gray F. a spol.: J Imm. Meth. 1995, 182, 155 až 163; Kenney J. S. a spol.: Bto/Tech 1995, 13, 787 až 790.) a jsou dobře komerčně dostupné např. od One Cell Systems lne. (Cambridge, Ma,, USA). Popsané způsoby však mají některé nevýhody v tom, že neposkytují dostatečné rozdělení pro identifikaci vysokoprodukčních buněčných linií.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je získat zlepšený způsob, který poskytuje větší rozdělení a který umožní identifikovat vysoké hladiny vysokoprodukčních buněčných linií.
Tohoto předmětu bylo dosaženo novým způsobem podle nároku 1.
Podle vynálezu se buňky, které produkují IgG, identifikují od buněk, které neprodukují IgG, přičemž
a) buňky, které produkují IgG, a buňky, které neprodukují IgG, jsou zapouzdřeny v matrici, která obsahuje činidlo zachycující produkovaný IgG, • to • to ·· ···· • toto toto
b) uvedená matrice se inkubuje pro takovou dobu, během níž se může produkovat IgG,
c) uvedený produkovaný IgG se fluorescentně označí a
d) buňky, které produkují fluorescentně označený zapouzdřený IgG, a buňky, které neprodukují IgG, se rozliší průtokovou cytometrií, přičemž zachycujícím činidlem je protein A a/nebo protein G.
Obrázek 1 ukazuje schematické zachycení produkovaného IgG zapouzdřenou buňkou.
Obrázek 2 ukazuje zachycení IgG použitím proteinu A při srovnání s protilátkou jako zachycujícím činidlem.
Obrázek 3 ukazuje pracovní koncentrace proteinu A.
Obrázek 4 ukazuje srovnání procenta neprodukujících GS-NSO v kultuře s procentem získaným průtokovou cytometrií.
Buňky
Podle účinnosti exprese a sekrece IgG jsou buňky používané v předloženém vynálezu definovány jako buňky, které produkují IgG, a buňky, které neprodukují IgG. Buňky, které neprodukují IgG, mohou exprimovat a sekretovat malá množství IgG až do asi 0,1 až 0,2 pg/ml nebo nemusí exprimovat a sekretovat vůbec žádný IgG. Buňky, které produkují IgG, mohou exprimovat a sekretovat IgG v množstvích nad 0,2 pg/ml. Výhodnými buňkami, které mohou být rozlišeny na buňky, které produkují IgG, a buňky, které neprodukují IgG, jsou savčí buňky.
Každá savčí buňka se může použít podle předloženého vynálezu. Příklady savčích buněk, které se mohou použít, jsou buňky plastocytomu, myeiomu, hybridomu, vaječniků čínského křečka (CHO) a fibrosarkomu nebo lymfoblastoidní • 4 * 4·4 4 • 44 • 44 • 4 4 e
4 4
4 4
4 4
4444 buňky myšího nebo lidského původu. Výhodnými savčími buňkami používanými v předloženém vynálezu jsou myší myelomové buňky. Příklady myších myelomových buněk jsou NSO a NSO transfektované gluthamin-synthetasou (GS-NSO). Zvláště užitečné jsou GS-NSO.
IgG
IgG, který se může produkovat buňkami použitými v předloženém vynálezu, může být lidský, prasečí, morčí, hovězí, kozí, ovčí, opičí, koňský, myší, krysí nebo křečkový IgG. Stejně tak může být produkován humanizovaný a chimerní IgG. S výhodou se produkuje lidský IgG. Dále pak buňky mohou produkovat také fragmenty IgG, jako jsou Fc-, Fab- a (Fab)2- fragmenty.
Zapouzdření (uzavření do tobolek)
Zapouzdření buněk, které produkují IgG, a buněk, které neprodukují IgG, se může provádět použitím např. standardních způsobů, jak je popsáno ve spisu WO 82/02561, nebo podle protokolů poskytnutých One Cell Systems lne.
Obvykle se buňky přidávají ke zkapalněnému gelu obsahujícímu zapouzdřující matrici, jako je zapouzdřující matrice CelBioGel™ obchodně vyráběná One Cell System lne. Zapouzdřující matrice obvykle sestává z agarosy. Matrice může být biotinylovaná. Zvláště výhodné jsou biotinylované agarosové matrice.
Výhodný počet buněk, který se bude přidávat ke zkapalněnému gelu, je mezi 105 a 108 buněk/ml, zvláště mezi 5.105 a 107 buněk/ml.
Buňky ve zkapalněné zapouzdřující matrici se mohou dále zpracovat tak, že se generují gelové mikrokuličky (GMD) obsahující alespoň jednu buňku na GMD použitím emulzní matrice, která obvykle sestává z oleje, s výhodou z minerálního oleje, jako je emulzní matrice CelMix™ a výrobního zařízení pro mikrokuličky, jako »· · ·· • » ·· ···· výrobní zařízení mikrokuliček CellSys 101™. Emulzní matrice CelMix™ a výrobní zařízení mikrokuliček CellSys 101™ jsou komerčně vyráběny One Cell Systems ínc,
Zachycující reakční činidlo protein A a/nebo protein B může být navázáno na matrici před nebo po generaci GMD. S výhodou se protein A a/nebo protein B naváže po tom, co se generují GMD. K navázání obvykle dochází nejdříve inkubací matrice s linkerem, po které následuje inkubace proteinem A a/nebo proteinem G. V případě, že matrice je biotinylovaná, výhodným linkerem je avidin, jako je streptavidin. Zvláště se používá streptavidin.
Protein A a/nebo protein G může být biotinylován, aby byl schopen navázat se na linker v tom případě, kdy linkerem je avidin. S výhodou se používá biotinylovaný protein A a/nebo protein G, zvláště se používá biotinylovaný protein A. Obvyklým množstvím proteinu A a/nebo proteinu G, které se přidává k matrici nebo ke GMD, je množství mezi 0,001 a 5 mg/ml, s výhodou mezi 0,01 a 0,1 mg/ml.
Inkubace pm produkci IgG
Inkubační doba, během které se může produkovat IgG, závisí na specifické IgG produktivitě buňky stejně jako na druhu použité buňky. V případě, že se používá myší myelomová buňka, je tato doba obvykle mezi 1 a 15 minutami, zvláště mezi 3 a 12 minutami.
Inkubační teplota rovněž závisí na specifické IgG produktivitě buňky stejně jako na druhu použité buňky. V případě, že se používá myší myelomová buňka, se inkubace provádí při teplotě mezi 2 °C a 15 °C, s výhodou mezi 2 °C a 8 °C. Obvykle se během inkubace přidává kontrolní IgG, aby se vyhodnotilo navázání vychytávajícího činidla.
tt ·
Označování a selekce průtokovou cytometrií
Jako fluorescenční značka se může použít cokoliv, co může rozpoznávat produkt IgG a co se konjuguje s fluorescenční sloučeninou. Obvykle se mohou použít protilátky, které se konjugují s fluorescenční sloučeninou a které jsou specifické pro produkt IgG, nebo antigeny, které jsou konjugovány s fluorescenční sloučeninou a které jsou specifické pro produkt IgG. S výhodou se používají protilátky, které jsou konjugovány s fluorescenční sloučeninou a které jsou specifické pro produkt IgG. Protilátkami specifickými pro produkt IgG mohou být imunoglobuliny vybrané z imunoglobulinových skupin A, D, E, G nebo M a měly by pocházet z takových hostitelských buněk, které nejsou příbuzné s buňkou, která exprimuje a sekretuje produkt IgG. Protilátka specifická pro produkovaný IgG s výhodou rovněž znamená IgG. V případě, že buňkou, která exprimuje a sekretuje produkt IgG, je myší buňka, značící protilátkou může být např. IgG pocházející z kozy.
Příklady fluorescenčních sloučenin jsou fýkoerythrin, fluoresceinisothiokyanát, texaská červeň, rhodamin nebo cyaninová barviva. Jako výhodná fluorescenční značka se používá IgG, který je konjugován s fykoerythrinem a který je specifický pro produkt IgG. IgG, které obsahují fluorescenční sloučeninu a které jsou specifické pro produkt IgG, jsou komerčně dostupné.
V případě, že se jako značka používá protilátka specifická pro produkt IgG, s výhodou se k zapouzdřeným buňkám před označením přidává blokátor, aby se se předešlo tomu, aby se další sekretovaný produkt navázal a stejně tak proto, aby se snížilo nespecifické navázáni. Jako výhodné sérum blokátorů se zvláště používá plodové telecí sérum nebo roztok sbíraného mléka (např. Maervel).
Obvyklé podmínky pro průtokovou cytometrií, aby se odlišily buňky, které produkují IgG, od buněk, které neprodukují IgG, se vyberou podle protokolu poskytnutého One Cell Systems Inc. Obvykle se detekují prázdné GMD a GMD, které obsahují alespoň jednu buňku, rozptylovými vlastnostmi na grafu lineárního předního • ·· · • · · ··· ·· ♦ · · ·· ··*· rozptylu (FSc) a logaritmického postranního rozptylu (SSc). Jako první se provede negativní kontrola (bez zachycujícího činidla) a FSc a SSc se upraví tak, aby se naplněná populace objevila přibližně ve středu grafu FSC/SSc. Prahový diskriminátor se upraví tak, aby se snížilo objevení prázdných GMD. Jediná naplněná sub-populace se ohraničí a analyzuje se na fluorescenci použitím logaritmického nastavení na detekci PMT (trubice fotonásobiče) příslušného pro fluorchromon. Fluorescenční detekce PMT se upraví tak, aby populace ležela v první logaritmické dekádě fluorescenčního histogramu. Provede se analýza positivních a testovacích vzorků, obvykle se provede 10 000 případů na vzorek. Rozlišení průtokovou cytometrií se může provést analyticky nebo preparativně. Popřípadě se GMD může před průtokovou cytometrií obarvit, aby se vybraly životaschopné buňky tak, že se tyto buňky vystaví působení vybarvovací sloučeniny, jako je je propidiumjodid.
Získané dosažené detekční limity pro buňky, které produkují IgG, v populaci buněk, které produkují IgG, a buněk, které neprodukují IgG, jsou obvykle mezi 95 a 99,99 %, s výhodou mezi 99 a 99,5 % z celkového počtu buněk.
Dalším předmětem předloženého vynálezu je biotinylované agarosová matrice obsahující biotinylovaný protein A a/nebo protein G jako zachycující činidlo pro IgG, přičemž biotinylovaný protein A a/nebo protein G je navázán avidinovým linkerem na matrici. Matrice s výhodou obsahuje jako zachycující činidlo pro IgG protein A a jako avidinový linker streptavidin.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava buněk a matrice ml emulzní matrice CelMix™ 200cs se ekvilibruje ve sterilní skleněné scintilační ampulce na 37 °C. Odstřeďováním při 200 x g po dobu 10 minut se získá • · ·» ····
10B životaschopných buněk GS-NSO. Buňky se resuspendují ve 100 μ| fosforečnanem pufrovaném solném roztoku (PBS). Ke 400 μΙ zkapalněného CelBioGel™ se přidá 25 μΙ kyseliny pluronové (sterilní, zfiltrovaná) a tento gel se ekvilibruje 3 minuty na 37 °C. K CelBioGel™ se přidají resuspendované buňky a směs se mírně míchá a inkubuje 3 minuty při 37 °C. Buněčná směs CelBioGel™ se přikape spirálním způsobem (ode dne k vršku) k zahřívanému oleji emulzní matrice v ampulce použitím špičky 1ml pipety, při čemž se zamezí přidávání bublinek vzduchu. Tato směs se emulguje zařízením pro výrobu mikrokapiček, které produkuje 25pm mikrokapičky odstředováním 1 minutu při 2100 otáčkách za minutu, 1 minutu při 2100 otáčkách za minutu v ledové lázni a 10 minut při 1100 otáčkách za minutu v ledové lázni. Zapouzdřující směs se rozdělí do 15ml konických zkumavek a emulze se pečlivě převrství 5 ml PBS. Tento roztok se odstřeďuje 10 minut při 600 x g tak, aby peleta GMD byla viditelná. Olejová fáze se odstraní pipetou, supernatant se odpipetuje a pelety ze dvou zkumavek se spojí a přidají se 2 ml PBS. 10 ml PBS se rozdělí na podíly do 15ml konických zkumavek a převrství se GMD. Tato směs se odstřecfuje 5 minut při 400 x g (tento stupeň se v případě potřeby zopakuje). Supernatant se odstraní a buňky se resuspendují v příslušném roztoku.
A. Streptavidinový můstek
GMD pelety se resuspendují ve 2,3 ml chladného DMEM media. 10μΙ podíl se vyhodnotí na % zaplnění. 0,3 ml se uchová pro neobarvenou negativní kontrolu. 80 μΙ 1 mg/ml streptavidinu se zředí 2 ml chladného kultivačního media s L15 buňkami (Biowhittaker) a přidá se ke 2 ml GMD. Směs se inkubuje v rotátoru 15 minut při teplotě místnosti. Tato směs se promyje 10 ml studeného PBS (dvakrát se odstřecfuje po dobu 5 minut pri 400 x g).
B. Biotinylové zachycení IgG navázání
GMD se resuspendují ve 2,3 ml L15 (0,3 ml se uschová jako negativní kontroly bez zachycujícího činidla). 80 μΙ 1,0 mg/ml biotinylovaného proteinu jako zachycu• · · ♦ * · • «· • « • · ··· ·* • · • a • v • ••a jícího reakčního činidla (Pierce) se zředí 2 ml studeného L15. Zředěné zachycující činidlo se přidá ke 2 ml GMD a tento roztok se inkubuje na rotátoru 15 minut za teploty místnosti, promyje se studeným PBS (dvakrát se odstřeďuje po dobu 5 minut při 400 x g) a resuspenduje se ve 3,3 ml studeného L15 (0,3 ml se uschová pro positivní kontroly).
C. Sekrece inkubace zapouzdřených buněk
GMD se přidají ke 25 ml studeného L15 a směs se ekvilibruje při 4 °C v T75 baňce a inkubuje se 10 minut při 4 °C. 6μΙ kontrolního IgG (lidský IgG Chromepure) se zředí v 0,8 ml L15. Ke každé kontrole se přidá 0,4 ml tohoto zředěného kontrolního IgG a tento roztok se inkubuje na rotátoru 15 až 30 minut při teplotě místnosti. Na konci těchto inkubací se všechny vzorky dvakrát promyjí studeným PBS/2% plodovým hovězím šerem (FBS) (Odstřetfují se 5 minut při 400 x g.). Sekrečni vzorek se resuspenduje ve 2 ml a kontroly v I ml, ve všech případech studeného L 15 + 5% FBS.
D. Vybarvování detekční protilátkou μΙ 0,5 mg/ml kozí protilidské detekční protilátky lgG-Anti-f(ab')2-R-Phytoerythrin (R-PE) se zředí ve 2 ml studeného L15 + 5% FBS na vzorek a 4 μΙ ve 2 ml pro kontroly. 40 μΙ přípravku se přidá ke GMD a 1 mí ze 4μ! přípravku se přidá ke každé z kontrol. Tato směs se otáčí 15 minut za teploty místnosti (ve tmě). Promyje se 2 x 10 ml studeného PBS/2% FBS. (Odstředuje se 5 minut při 400 x g) a každý vzorek se resuspenduje ve 2,0 ml PBS pro průtokovou cytometrii.
E. Průtoková cytometrie zapouzdřených buněk
Používaným zařízením je sortovač buněk Coulter EPICS ELITE se 488nm argonovým iontovým laserem s předřazenou průtokovou kontrolou fluoreskujících kuliček. Prázdné a naplněné GMD se detekují pomocí rozptylových vlastností na grafu lineárního předního rozptylu (FSc) a logaritmického postranního rozptylu (SSc).
Jako první se provede negativní kontrola {bez zachycujícího činidla) a FSc a SSc se upraví tak, aby se naplněná populace objevila přibližně ve středu grafu FSC/SSc. Prahový diskriminátor se upraví tak, aby se snížilo objevení prázdných GMD. Jednoduše okupovaná sub-populace se ohraničí a analyzuje se na fluorescenci použitím logaritmického nastavení na detekci PMT (trubice fotonásobiče) příslušného pro fluorochram. Fluorescenční detekce PMT se upraví tak, aby populace ležela v první logaritmické dekádě fluorescenčního histogramu. Provede se analýza positivních a testovaných vzorků, obvykle se provede 10 000 případů na vzorek.
Příklad 2
Srovnání zachycení produktu chimerního IgG použitím proteinu A, respektive protilátky jako zachycujícího činidla
Různá ředění produktu chimerního IgG byla vystaveny působení prázdných GMD buď se zachycujícím činidlem biotinylovaného proteinu A nebo zachycujícím činidlem biotinylovaného kozího protilidského IgG Fc gama fragmentu specifické protilátky, GMD inkorporující protein A vykazovaly mnohem vyšší fluorescenci při srovnání s protilátkou jako zachycujícím činidlem ve všech koncentracích produktu (viz obrázek 2).
Příklad 3
Stanovení pracovních koncentrací proteinu A
Jako zapouzdřené testované buňky, které produkují IgG produkt, byla použité buněčná linie GS-NSO. Jako negativní kontrola byly použity zapouzdřené buňky bez biotinylovaného proteinu A. Jako Fc positivní kontrola byly zapouzdřené buňky, které produkují IgG, napojeny s lidským IgG. Byl používán zásobní roztok 1 mg proteinu A na ml PBS (viz obrázek 3).
Claims (7)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob identifikace buněk, které produkují IgG, od buněk, které neprodukují IgG, přičemža) buňky, které produkují IgG, a buňky, které neprodukují IgG, jsou zapouzdřeny v matrici, která obsahuje činidlo zachycují produkovaný IgG,b) uvedená matrice se inkubuje pro takovou dobu, během níž se může produkovat IgG,c) uvedený produkovaný IgG se fluorescentně označí ad) buňky, které produkují fluorescentně označený zapouzdřený IgG, a buňky, které neprodukuji IgG, se rozliší průtokovou cytometrií, vyznačující se tím, že zachycujícím činidlem je protein A a/nebo protein G.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že buňky, které neprodukují IgG, a buňky, které produkují IgG, znamenají savčí buňky.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že savčí buňky znamenají myší myelomové buňky.
- 4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1až3, vyznačující se tím, že produkovaný IgG znamená lidský IgG.
- 5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se t i m, že protein A a/nebo protein G je biotinylovaný.
- 6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že doba, po kterou se může produkovat IgG, je mezi 1 a 15 minutami.
- 7. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že inkubace se provádí za teploty mezi 2 °C a 15 °C.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0002539.5A GB0002539D0 (en) | 2000-02-03 | 2000-02-03 | Process for the discrimination of immunoglobulin G-producing cells from non-immunoglobulin G-producing cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022510A3 true CZ20022510A3 (cs) | 2003-01-15 |
| CZ299627B6 CZ299627B6 (cs) | 2008-09-24 |
Family
ID=9884933
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022510A CZ299627B6 (cs) | 2000-02-03 | 2001-02-02 | Zpusob rozlišení bunek, které produkují IgG, od bunek, které neprodukují IgG a zarízení k provádenízpusobu |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20030013141A1 (cs) |
| EP (1) | EP1252521B1 (cs) |
| JP (1) | JP3577040B2 (cs) |
| KR (1) | KR100523198B1 (cs) |
| CN (1) | CN1181347C (cs) |
| AT (1) | ATE286254T1 (cs) |
| AU (1) | AU2001240576A1 (cs) |
| CA (1) | CA2396017C (cs) |
| CZ (1) | CZ299627B6 (cs) |
| DE (1) | DE60108074T2 (cs) |
| ES (1) | ES2234817T3 (cs) |
| GB (1) | GB0002539D0 (cs) |
| WO (1) | WO2001057527A2 (cs) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0118337D0 (en) * | 2001-07-27 | 2001-09-19 | Lonza Biologics Plc | Method for selecting antibody expressing cells |
| US10285901B2 (en) * | 2008-11-06 | 2019-05-14 | Health E Vibrations, Llc | Vibrating massage roller |
| WO2010125932A1 (ja) * | 2009-04-28 | 2010-11-04 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | 融合タンパク質含有集合体、その製造方法及び該集合体を用いたアッセイ法 |
| CN104508122A (zh) * | 2012-06-20 | 2015-04-08 | 赛璐拉有限公司 | 用于处理细胞群体的材料和方法 |
| JP6422075B2 (ja) * | 2014-09-24 | 2018-11-14 | 太陽誘電株式会社 | 組成物及び組成物を利用したモーター蛋白デバイス |
| CN105504042A (zh) * | 2016-02-04 | 2016-04-20 | 北京艺妙神州医疗科技有限公司 | 检测car-t细胞的捕获探针、该细胞含量的检测方法及应用 |
| EP3571509B1 (en) | 2017-01-18 | 2023-05-10 | Sartorius BioAnalytical Instruments, Inc. | Methods and reagents for determining immunoglobulin gamma (igg) antibody isotype concentration from biological samples |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2322552C2 (de) * | 1972-11-06 | 1986-08-28 | Pharmacia AB, Uppsala | Verfahren zum Abtrennen von Protein A aus Staphylococcus aureus aus einer Flüssigkeit |
| US4522918A (en) * | 1981-12-15 | 1985-06-11 | Jeffery Schlom | Process for producing monoclonal antibodies reactive with human breast cancer |
| AU3556789A (en) * | 1988-04-22 | 1989-11-24 | Massachusetts Institute Of Technology | Process for forming and using microdroplets |
| EP0520979B1 (en) * | 1988-10-17 | 1999-01-13 | Hemasure, Inc. | Process for the covalent surface modification of hydrophobic polymers and articles made therefrom |
| US5780029A (en) * | 1989-11-14 | 1998-07-14 | New York Medical College | Antidiotypic monoclonal antibodies for treatment of melanoma |
| US5217872A (en) * | 1990-02-27 | 1993-06-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Method for detection of borrelia burgdorferi antigens |
| US5328985A (en) * | 1991-07-12 | 1994-07-12 | The Regents Of The University Of California | Recombinant streptavidin-protein chimeras useful for conjugation of molecules in the immune system |
-
2000
- 2000-02-03 GB GBGB0002539.5A patent/GB0002539D0/en not_active Ceased
-
2001
- 2001-02-02 CN CNB018043046A patent/CN1181347C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-02 WO PCT/EP2001/001100 patent/WO2001057527A2/en not_active Ceased
- 2001-02-02 CZ CZ20022510A patent/CZ299627B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-02-02 DE DE60108074T patent/DE60108074T2/de not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-02 JP JP2001556324A patent/JP3577040B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-02 CA CA002396017A patent/CA2396017C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-02 AT AT01911576T patent/ATE286254T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-02-02 US US10/182,918 patent/US20030013141A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-02 ES ES01911576T patent/ES2234817T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-02 AU AU2001240576A patent/AU2001240576A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-02 EP EP01911576A patent/EP1252521B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-02 KR KR10-2002-7009002A patent/KR100523198B1/ko not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB0002539D0 (en) | 2000-03-29 |
| US20030013141A1 (en) | 2003-01-16 |
| KR20020086891A (ko) | 2002-11-20 |
| DE60108074T2 (de) | 2005-12-01 |
| JP3577040B2 (ja) | 2004-10-13 |
| CA2396017C (en) | 2006-04-11 |
| ES2234817T3 (es) | 2005-07-01 |
| JP2003524160A (ja) | 2003-08-12 |
| AU2001240576A1 (en) | 2001-08-14 |
| CN1401079A (zh) | 2003-03-05 |
| CA2396017A1 (en) | 2001-08-09 |
| ATE286254T1 (de) | 2005-01-15 |
| EP1252521B1 (en) | 2004-12-29 |
| KR100523198B1 (ko) | 2005-10-24 |
| EP1252521A2 (en) | 2002-10-30 |
| CN1181347C (zh) | 2004-12-22 |
| DE60108074D1 (de) | 2005-02-03 |
| WO2001057527A2 (en) | 2001-08-09 |
| CZ299627B6 (cs) | 2008-09-24 |
| WO2001057527A3 (en) | 2002-04-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1415158B1 (en) | Method for selecting antibody expressing cells | |
| Carroll et al. | The selection of high-producing cell lines using flow cytometry and cell sorting | |
| CA2146974C (en) | Direct selection of cells by secretion product | |
| EP0559738B1 (en) | Methods for detection and quantitation of cell subsets within subpopulations of a mixed cell population | |
| US20230341381A1 (en) | Methods and reagents for determining immunoglobulin gamma (IgG) antibody isotype concentration from biological samples | |
| CZ20022510A3 (cs) | Způsob identifikace buněk, které produkují IgG, od buněk, které neprodukují IgG | |
| Bohls et al. | The use of flow cytometry to discriminate avian lymphocytes from contaminating thrombocytes | |
| EP1511762A2 (en) | Detection of secreted polypeptides | |
| EP1766401B1 (de) | Verfahren zum einfachen und schnellen nachweis von zellen und biomolekülen mit hilfe paramagnetischer partikel | |
| EP1477808B1 (en) | Method for cell selection | |
| Takahashi et al. | Human leukocyte antigen antibody detection technologies in platelet transfusion refractoriness, with special emphasis on functional test | |
| EP2452196B1 (en) | Purification of monoclonal antibodies | |
| Sam-Yellowe | Exercise 18: Flow Cytometry |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20110202 |