CZ20022640A3 - Způsob stanovení koncentrace analytu a zařízení k jeho provádění - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká určování koncentrace analytu, zejména určování koncentrace krevního analytu, a zvláště potom určování koncentrace krevní glukózy.

Dosavadní stav techniky

V dnešní společnosti se zvyšuje zájem o stanovení koncentrace analytu ve fyziologických tekutinách, například v krvi nebo v produktech odvozených z krve, například plasmě. Tyto testy nacházejí uplatnění u celé řady různých aplikací a stanovení včetně klinických laboratorních testů, domácích testů atd., jejichž výsledky hrají významnou úlohu při stanovení diagnózy a léčení různých chorobných stavů. Sledované analyty zahrnují glukózu při léčbě cukrovky, cholesterol při monitorování kardiovaskulárních stavů apod. V odezvě na tento rostoucí zájem o stanovení koncentrace analytu byla vyvinuta celá řada různých protokolů a zařízení pro detekci analytu, a to jak pro klinické a laboratorní použití, tak pro domácí použití. Dva běžné protokoly, které byly vyvinuty, využívají kolorimetrické metody a elektrochemické metody.

Podstatou testů určujících koncentraci analytu, založených na kolorimetrickém postupu, je produkce peroxidu vodíku a jeho následná detekce. Analyty, jejichž koncentrace lze pomocí takového testu určit zahrnují: cholesterol, triglyceridy, glukózu, ethanol a kyselinu ui-zijo-uz-ue • · · · · · * · · « » · · · · · v • ····«· · · · · · · • * · ·· ··· · ·»· ···· *· ···· mléčnou. Glukóza se například pomocí takových testů kvantifikuje tak, že se nejprve oxiduje pomocí glukózooxidázy za vzniku kyseliny glukonové a peroxidu vodíku. Výsledný peroxid vodíku ve spojení s peroxidázou způsobuje konverzi jednoho nebo více organických substrátů, tj. indikátoru, na chromogenní produkt, který se následně detekuje, přičemž koncentrace tohoto produktu odpovídá koncentraci glukózy v počátečním vzorku.

Druhým obecným typem testů stanovujících koncentraci analytu jsou testy využívající elektrochemické metody. U těchto metod se vodný roztok kapaliny umístí do reakční zóny v elektrochemickém článku, který je tvořen alespoň dvěma elektrodami, tj. referenční a pracovní elektrodou, přičemž elektrody mají impedanci, která je činí vhodnými pro ampérometrické měření. Složka, která má být analyzována, se nechá reagovat přímo s elektrodou nebo přímo nebo nepřímo s redoxním reakčním činidlem za vzniku oxidovatelné (nebo redukovatelné) látky v množství, které odpovídá koncentraci složky, která má být analyzována, t j. analytu. Množství oxidovatelné (nebo redukovatelné) látky se následně určí elektrochemicky a odpovídá množství analytu, který byl přítomen v počátečním vzorku.

Bez ohledu na to, který typ systému pro určení koncentrace analytu se použije, se pro určení koncentrace analytu ve vzorku zpravidla použije automatizované zařízení, například elektrochemický měřící přístroj nebo optický měřící přístroj, přičemž volba konkrétního měřícího přístroje závisí na použitém typu testu. Mnoho měřících přístrojů výhodně umožňuje uložit koncentraci analytu, a obvykle množinu koncentrací analytu, do paměti přístroje. Toto opatření umožňuje uživateli sledovat úrovně koncentrace analytu v určitém časovém úseku, často jako • · · * · · • ····· ·

0 ··· ··

0· fl · fl průměr dříve získaných hodnot koncentrace analytu, přičemž výpočet průměru se provádí podle algoritmu souvisejícího s měřícím přístrojem. Nicméně aby se zajistila správná funkčnost měřícího přístroje, provede zpravidla uživatel před samotným testováním vzorku tekutiny kontrolní měření, při kterém do systému zavede kontrolní tekutinu, která obsahuje známou koncentraci sledovaného analytu. Hodnoty koncentrace analytu kontrolní tekutiny jsou ukládány do paměti měřícího přístroje společně s hodnotami koncentrace analytu v testované tekutině. Takže pokud uživatel hledá přehled průměru hladin analytu v testované tekutině z předchozích testů, potom jsou tyto výsledky posunuty, protože do průměru zahrnují i hodnotu koncentrace analytu v kontrolní tekutině.

Je tedy žádoucí, aby tato měřící zařízení byla schopna označit nebo identifikovat kontrolní a testované tekutiny jako takové. Označování tekutin buď jako kontrolní nebo jako testovací tekutinu lze provádět manuálně, nicméně je žádoucí, aby se tato činnost prováděla automaticky, a tím se minimalizovaly zásahy uživatele a usnadnilo se tak použití.

Jednou z technik, která byla vyvinuta je technika, která využívá kontrolního roztoku formulovaného tak, že jej zařízení rozpozná jako něco jiného než krev (viz patent US 5 723 284). Nicméně v tomto protokolu zařízení automaticky vylučuje výsledky ze své paměti, čímž brání ukládání výsledků získaných při testování kontrolních roztoků v případě, kdy je požadován. Tento protokol je navíc omezen pouze na metodu stanovení analytu elektrochemického typu a nutně vyžaduje příslušný typ kontrolní tekutiny, která obsahuje specifická reakční činidla, což zvyšuje složitost a cenu celého systému.

• ·«·» *

»•00

Stále tedy přetrvává zájem o vývoj nových metod a zařízení použitelných pro určení koncentrací analytu ve vzorku. Zvláštní zájem by měl být věnován vývoji takových metod a zařízení, které budou schopny automaticky označit vzorek jako kontrolní tekutinu nebo jako testovací tekutinu a na základě tohoto označení uložit nebo vyloučit měření. Zvláštní zájem by měl být navíc věnován vývoji takových metod, které bude možné použít jak u elektrochemických tak u kolorimetrických testů určujících koncentraci analytu.

Relevantní literatura

Zajímavými patentovými dokumenty jsou patenty US 4 224 125; US 4 545 382; US 5 834 224; US 5 942 102; US 5 972 199; a US 5 972 294.

Podstata vynálezu

Vynález tedy poskytuje způsoby a zařízení pro použití při určování analytu ve vzorku. U těchto metod se vzorek zavede do reagenčního testovacího proužku, kde je vzorkem testovaná tekutina nebo kontrolní tekutina, přičemž kontrolní tekutina je prostá složky zpomalující rozpouštění mediátoru a prostá oxidačního činidla, pokud se použije v testu stanovujícím koncentraci analytu elektrochemickou metodou. Určí se koncentrace analytu ve vzorku a vzorek se identifikuje jako kontrolní tekutina nebo jako testovací tekutina. Vynález rovněž poskytuje zařízení pro stanovení koncentrace analytu ve vzorku, přičemž zařízení obsahuje identifikační prvek pro identifikaci toho, zda je vzorek kontrolní nebo testovací tekutinou. Způsoby a zařízení • fl * fl flfl • · * · • ····· · flflfl • fl · fl • flfl flfl • flfl flflfl flfl flflflfl podle vynálezu nacházejí uplatnění v celé řadě různých aplikací, zejména při stanovení koncentrací krevní glukózy.

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje graf dat vygenerovaných během testu, který určuje koncentraci analytu elektrochemickou metodou a který byl použit pro stanoveni hodnot koncentrace analytu v kontrolní tekutině a v testované tekutině.

Obr. 2 znázorňuje graf dat vygenerovaných během testu, který určuje koncentraci analytu kolorimetrickou metodou a který byl použít pro stanovení hodnot koncentrace analytu v kontrolní tekutině a v testované tekutině.

Vynález tedy poskytuje způsoby a zařízení použitelná při určování koncentrace analytu ve vzorku. U těchto metod se vzorek zavede do reagenčního testovacího proužku, kde je vzorkem testovaná tekutina nebo kontrolní tekutina, přičemž kontrolní tekutina je prostá složky zpomalující rozpouštění mediátoru a prostá oxidačního činidla, pokud se použije v testu stanovujícím koncentraci analytu elektrochemickou metodou. Určí se koncentrace analytu ve vzorku a vzorek se identifikuje jako kontrolní tekutina nebo jako testovací tekutina. Vynález rovněž poskytuje zařízení pro stanovení koncentrace analytu ve vzorku, přičemž zařízení obsahuje identifikační prvek pro identifikaci toho, zda je vzorek kontrolní nebo testovací tekutinou. Způsoby a zařízení podle vynálezu nacházejí uplatnění v celé řadě různých aplikací, zejména při stanovení koncentrací krevní glukózy. V dalším popisu vynálezu budou nejprve popsány způsoby ♦ ♦ »

V X J. V £··· ···· · · · ···· · a a · · • a ·«*· · a · · · · a . a · a a · · · a řj »a a ··· aaaa aa aaaa podle vynálezu a následně bude zařazen přehled zařízení použitelných pro provádění těchto způsobů.

Před samotným popisem vynálezu je třeba upozornit, že konkrétně popsaná provedení neomezují rozsah vynálezu. Rovněž je třeba akceptovat, že terminologie, zde použitá pro účely popisu konkrétních provedení, má pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezuje rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

Pokud je v textu přihlášky vynálezu definován rozsah hodnot, potom je třeba chápat, že do rozsahu vynálezu spadá každá individuální hodnota spadající do tohoto rozsahu, vyjádřeno s přesností na desetinné místo hodnoty tvořící spodní mez, nevyplývá-li z kontextu jiné vymezení, nebo jakékoliv další uvedené rozmezí nebo hodnoty spadající do tohoto rozmezí.

Není-li definováno jinak, mají všechny zde použité technické a vědecké výrazy významy, které odborníci v oboru, do kterého předložený vynález náleží, běžně používají a se kterými jsou seznámeni. Přesto, že je pro realizaci nebo prověřování vynálezu výhodné použít níže popsané způsoby a materiály, je obecně možné pro tyto účely použít libovolné způsoby a materiály, které představují podobná nebo ekvivalentní řešení.

Dále je třeba poznamenat, že singulární formy použité v popisné části a v přiložených patentových nárocích je třeba, nevyplývá-li z kontextu opak, chápat tak, že zahrnují i plurální formy. Takže například výraz „testovací proužek” zahrnuje i množinu těchto testovacích proužků a

yi-íi j	7	fcfc · « ·· ” »· fcfcfc fcfcfcfc · · · fcfcfcfc « · * · · fc fc «·« · fcfc fcfc · fcfcfc fcfc fcfcfc fcfc fc fcfcfc «··· fcfc fcfcfcfc
výraz „procesor zahrnuje	jeden	nebo	více procesorů a
jejich v daném oboru známých	ekvivalentů	atd.

Zde diskutované publikace představují výhradně publikace zveřejněné před datem podání předložené přihlášky vynálezu a jejich cílem je definovat dosavadní stav techniky. Nic v textu přihlášky vynálezu by nemělo být vykládáno tak, že vynález není oprávněn antidatovat jakoukoliv zde uvedenou publikaci na základě dřívějšího vynálezu. Konečně je třeba upozornit, že zde uvedené údaje týkající se zmiňovaných publikací se mohou od aktuální údajů lišit.

Metody

Jak již bylo shrnuto výše, předmětem vynálezu jsou způsoby stanovení koncentrace analytu ve vzorku, přičemž výhodou těchto metod je schopnost určit, zdali je vzorek kontrolní nebo testovanou tekutinou. Způsoby podle vynálezu nacházejí využití při určování koncentrací celé řady různých analytů, přičemž za reprezentativní analyty jsou považovány glukóza, cholesterol, laktát, alkohol apod. U mnoha provedení jsou způsoby podle vynálezu použity ke stanovení koncentrace glukózy v testované tekutině, například ve fyziologickém vzorku.

I když v principu lze způsoby podle vynálezu použít ke stanovení koncentrace analytu v celé řadě různých fyziologických vzorků, například v moči, slzách, slinách apod., ukázalo se, že jsou zvláště vhodné pro stanovení koncentrace analytu v krvi nebo krevních frakcích, a zvláště potom v celé krvi.

«Φ · j »» »» ··· ·· · · * · · * · · · · · « · ··*· · · · · · * ·

9 9 9 9 9 9 9 ·· · *·· ·*·· ·· ♦··*

Stejně tak lze, v závislosti na typu použitého testovacího systému a v závislosti na sledovaném analytu při provádění způsobu podle vynálezu, použít celou řadu různých kontrolních tekutin. Nicméně zpravidla je kontrolní tekutinou vodný roztok, který obsahuje předem stanovené množství sledovaného analytu, přičemž množství tohoto analytu se bude nezbytně lišit. Zpravidla se množství analytu pohybuje přibližně od 200 mg/1 do 6000 mg/1, obvykle přibližně od 400 mg/1 do 4500 mg/1. Kromě toho může kontrolní tekutina obsahovat jednu nebo více následujících složek: pufr (například fosfát, citrát, citrakonát), povrchově aktivní činidlo (například FC 171, Triton X-100, Pluroníc 25R2 od společnost BASF Corp.), dispergační činidlo (například Aerosil 200 od společnosti Degussa Corp.), polymer (například methylcelulóza, karboxymethylcelulóza, dextran nebo polyvinylacetát), barvivo (například kyselina měďftalocyanin-3, 4' , 4' ' , 4 ' ' ' -tetrasulfonová, tetrasodná sůl; kyselina 1-[(6-methoxy-4-sulfo-m-tolyl)azo]-2-naftol-6-sulfonová, disodná sůl), činidla redukující pěnivost (například emulze Dow B od společnosti Dow Corning Corp.) a konzervační činilo (například benzoát sodný, methylparaben, EDTA, Germal II od společnosti Sutton Laboratories).

určitých provedení, například pokud se použijí elektrochemické metody pro určení koncentrace analytu, je kontrolní tekutinou zpravidla tekutina, která je prostá složek zpomalujících rozpouštění mediátoru, například ethylenglykolu, W-methylpyrrolídonu a N-propa-nolu, a která je prostá oxidačních činidel, například manganistanu draselného, perchromanu draselného, dichromanu draselného, trihydrogenhexakyanoželezitanu draselného, chloristanu sodného a jodistanu sodného. U mnoha provedení je kontrolní

• ··*· «« v • · · • · · · « · ··♦* · • · · ·· ·

• · ·· ···* tekutina v podstatě prostá libovolné redoxni složky, zejména pokud má být kontrolní tekutina použita u elektrochemických testů. U ještě dalších provedení může kontrolní tekutina obsahovat odrazivou složku, která je schopna generovat profil odrazivosti odlišný od profilu, který generuje krev. Do kontrolní tekutiny lze například zahrnout vhodné barvivo, jinými slovy barvivo, které je modifikátorem odrazivosti a absorbance, přičemž toto barvivo má maximální absorbanci viditelného světla jinde než hemoglobin, a to zejména pokud je kontrolní tekutina určena pro kolorimetrické testy. Příklady barviv, která jsou vhodná pro kontrolní tekutiny používané při kolorimetrických testech, zahrnují neomezujícím způsobem kyselinu měďftalocyanin-3,4 ¹ , 4 ' ' , 4 ¹ ' '-tetra-sulfonovou, tetrasodnou sůl; 3,7-bis(dimethylamino)fenothiazin-5-iumchlorid; ftalocyanin měďnatý; a kyselinu 1-[(6-methoxy-4-sulfo-m-tolyl)azo]-2-naftol-6-sulfonovou, disodnou sůl.

Při realizaci způsobů podle vynálezu je prvním krokem získání reakčního testovacího proužku majícího oblast pro příjem vzorku a zavedení vzorku do oblasti pro příjem vzorku, tj. reakční oblasti testovacího proužku. Vzorek lze zavést do reakční oblasti za použití libovolného běžného protokolu, podle kterého se vzorek do reakční oblasti vstřikuje, nechá se do reakční oblasti vzlínat apod. V rámci vynálezu lze použít různé reagenční testovací proužky, a to v závislosti na použitém typu testu, který určuje koncentraci analytu. Dvěma typy testů určujícími koncentraci analytu použitelnými v rámci vynálezu jsou elektrochemické systémy stanovující koncentraci analytu a kolorimetrické systémy stanovující koncentraci analytu, přičemž každý z těchto systémů bude v následující části popsán samostatně.

·· « ♦ · · · • · · · · • · · · * · · • · ♦ · 9 «···»·· ·· ··»·

Elektrochemické systémy určující koncentraci analytu a způsoby jejích použití

Prvním krokem způsobů podle vynálezu, které využívají elektrochemický testovací systém, je zavedení určitého množství sledovaného vzorku, například fyziologického vzorku, do elektrochemického článku, například zavedení vzorku do oblasti pro příjem vzorku elektrochemického testovacího proužku atd. Fyziologický vzorek se může měnit, ale u mnoha provedení je tímto vzorkem celá krev nebo její derivát nebo frakce, přičemž u mnoha provedení je sledovaným vzorkem zpravidla celá krev. Množství fyziologického vzorku, například krve, které se zavede do reakční oblasti testovacího proužku, může být různé, ale zpravidla se pohybuje přibližně od 0,1 μΐ do 10 μΐ a obvykle od 0,3 μΐ do 1,6 μΐ. Vzorek se zavede do reakční oblasti za použití libovolného běžného protokolu, podle kterého se může do reakční zóny vstřikovat, nechat vzlínat apod.

I když lze způsoby podle vynálezu v principu použít v souvislosti s libovolným typem elektrochemického článku, který obsahuje od sebe odsazenou pracovní a referenční elektrodu, využívají se v mnoha provedeních elektrochemické testovací proužky. Elektrochemické testovací proužky, používané u těchto provedení podle vynálezu, jsou tvořeny dvěma protilehlými kovovými elektrodami, které jsou od sebe odděleny tenkou dělící vrstvou s průřezem, který definuje reakční oblast neboli reakční zónu. U mnoha provedení se v reakční oblasti neboli zóně nachází redoxní reagenční systém.

U určitých provedení těchto elektrochemických testovacích proužků, jsou pracovní a referenční elektroda

V X.

v t.

T

0 • * « ♦ «000 0 0 0

W «« »» • 0 · · «00 * 0 0 0 0 0 »00* 0 0 0 4 0 « «00 ·»·· «0 ·0·0 zpravidla konfigurovány ve formě podlouhlých obdélníkových proužků. Délka elektrod se zpravidla pohybuje v rozmezí 1,9 cm až 4,5 cm, zpravidla od 2,0 cm do 2,8 cm. Šířka elektrod se pohybuje v rozmezí 0,07 cm až 0,76 cm, zpravidla od přibližně 0,24 cm do 0,60 cm. Pracovní a referenční elektroda mají zpravidla tloušťku 10 nm až 100 nm a zpravidla od přibližně 10 nm do 60 nm.

Pracovní a referenční elektrody jsou dále charakteristické tím, že alespoň povrch elektrod, který je orientován k reakční oblasti elektrochemického článku v proužku, je kovový, přičemž vhodnými kovy jsou palladium, zlato, platina, stříbro, iridium, uhlík (vodivá karbonová barva), legovaný oxid cínu, nerezavějící ocel apod. U mnoha provedení je kovem zlato nebo palladium. Přestože může být v podstatě celá elektroda vyrobena z kovu, je zpravidla každá z elektrod vyrobena z inertního nosného materiálu, na jehož povrchu je nanesena tenká vrstva kovové složky elektrody, U těchto běžnějších provedení se tloušťka inertního nosného materiálu zpravidla pohybuje od přibližně 25 pm do 500 pm, obvykle od 50 pm do 400 pm, například přibližně od 127 pm do 178 pm, zatímco tloušťka kovové vrstvy se zpravidla pohybuje od přibližně 10 nm do 100 nm a obvykle přibližně od 10 nm do 60 nm, například rozprášená kovová vrstva. Pro výrobu elektrod lze použít jakýkoliv běžný inertní nosný materiál, přičemž zpravidla je tímto materiálem pevný materiál, který je schopen poskytnout elektrodě strukturní oporu, a tak zpevnit celý elektrochemický testovací proužek. Vhodné materiály, které lze použít jako nosný podklad, zahrnuji plasty, například PET, PETG, polyimid, polykarbonát, polystyren, silikon, keramiku, sklo apod.

* · • « » • ···« * • · #

V -L z- x *fc ·

4 t

• ··*· * · ♦ • · · • * · · * · « #· ·*·♦

Jedním ze znaků elektrochemických testovacích proužků použitých u těchto provedení způsobů podle vynálezu je to, že, jak již bylo popsáno výše, pracovní a referenční elektroda jsou svým kovovým povrchem orientovány proti sobě a jsou odděleny pouze krátkou vzdáleností, takže vzdálenost mezi pracovní a referenční elektrodou v reakční zóně nebo oblasti elektrochemického testovacího proužku je extrémně malá. Toto minimální odsazení pracovní a referenční elektrody v testovacích proužcích je výsledkem přítomnosti tenké vmezeřené vrstvy umístěné mezi pracovní a referenční elektrodou. Tloušťka této vmezeřené vrstvy se může pohybovat od 50 pm do 750 pm, často je menší nebo maximálně rovna 500 pm, a zpravidla se pohybuje v rozmezí od přibližně 100 pm do 175 pm, například 102 pm až 153 pm. Vmezeřená vrstva je rozříznuta tak, že poskytuje reakční zónu nebo oblast alespoň se vstupním otvorem do reakční zóny a zpravidla rovněž s výstupním otvorem. Vmezeřená vrstva může mít vykrojenou kruhovou reakční oblast s bočním vstupním a výstupním otvorem nebo jiné konfigurace, například čtvercově, trojúhelníkově, obdélníkově tvarované reakční oblasti nebo oblasti, které mají nepravidelný tvar, atd. Vmezeřená vrstva může být vyrobena z libovolného běžného materiálu, přičemž příklady vhodných materiálů zahrnují PET, PETG, polyimid, polykarbonát apod., přičemž povrchy vmezeřené vrstvy mohou být ošetřeny tak, aby přilnuly k příslušné elektrodě a zachovaly tak strukturu elektrochemického testovacího proužku.

Elektrochemické testovací proužky použité u těchto provedení podle vynálezu zahrnují reakční zónu, oblast nebo prostor pro příjem vzorku, která je definována pomocí pracovní elektrody, referenční elektrody a vmezeřené vrstvy, přičemž tyto prvky jsou popsány výše. Přesněji • · · • ♦·** · · · · · »··

................

řečeno, pracovní a referenční elektroda definují horní a spodní stranu reakční oblasti, zatímco vmezeřená vrstva definuje stěny reakční oblasti. Objem reakční oblasti se zpravidla pohybuje od přibližně 0,1 μΐ do 10 μΐ, obvykle přibližně od 0,2 μΐ do 5,0 μΐ a obvykleji přibližně od 0,3 μΐ do 1,6 μΐ.

U mnoha provedení je v reakční oblasti přítomen reagenční systém nebo kompozice, přičemž tento reagenční systém reaguje se složkami vzorku tekutiny během provádění testu. Vhodné reagenční systémy zpravidla zahrnují redoxní pár.

Redoxní pár reagenční kompozice, pokud je přítomen, je vyroben z jednoho nebo několika členů redoxního páru. Široké spektrum různých členů redoxních párů je v daném oboru známo a zahrnuje: feríkyanid, fenazin ethosulfát, fenazin methosulfát, fenylenediamin, 1-methoxyfenazin methosulfát, 2,6-dimethyl-l,4-benzochinon, 2,5-dichlor-l,4-benzochinon, deriváty ferocenu, osmiumbipyridylové komplexy, komplexy ruthenia apod. U mnoha provedení jsou vhodnými členy redoxních párů feríkyanid apod.

Dalšími činidly, která mohou být přítomna v reakční oblasti, jsou pufrovací činidla, například citrakonát, citrát, jablečnan, maleinan, fosfát, „Good pufr apod. Ještě další činidla, která mohou být přítomna, zahrnují dvouvazné kationty, například chlorid vápenatý a chlorid hořečnatý; povrchově aktivní činidla, jako například Triton, Macol·, Tetronic, Silwet, Zonyl a Pluronic; a stabilizační činidla, jako například albumin, sacharóza, trehalóza, mannitol a laktóza.

0« » 0 ·» » • * 0 00 0 · *00

0000 0 000 0

0 0000 0 0 0 0 0 0 0

000 0* 000

0 000 0000 00 0000

Příklady takových reagenčních testovacích proužků použitelných v rámci vynálezu jsou například popsány v patentových přihláškách US 09/333 793; US 09/497 304; US 09/497 269; US 09/736 788; a US 09/746 116, jejíchž obsah je zde zahrnut formou odkazů.

V případě elektrochemických testů se elektrochemické měření zpravidla provádí za použití referenční a pracovní elektrody. Prováděná elektrochemická měření se mohou odlišovat v závislosti na konkrétní povaze testu a zařízení, se kterým elektrochemický testovací proužek pracuje, například v závislosti na tom, zdali je test koulometrický, amperometrický nebo potenciometrický. Obecně řečeno, elektrochemické měření bude měřit náboj (koulometrické), proud (ampérometrické) nebo potenciál (potenciometrícké), zpravidla po danou časovou periodu po té, co se vzorek zavede do reakční oblasti. Způsoby provádění výše popsaných elektrochemických měření jsou dále popsány v patentech US 4 224 125; US 4 545 382; a US 5 266 179; a stejně tak v patentových přihláškách WO 97/18465; a WO 99/49307; které jsou zde zahrnuty formou odkazů.

Následně, po detekci elektrochemického signálu generovaného v reakční zóně výše popsaným způsobem, se na základě vzájemného vztahu elektrochemického signálu a množství analytu ve vzorku stanoví množství analytu přítomného ve vzorku zavedeném do reakční oblasti. Příkladná měřící zařízení pro automatizované provádění těchto kroků jsou dále popsána v patentových přihláškách US 09/333 793; 09/497 304; 09/497 269; 09/736 788; a 09/746 116, jejichž obsah je zde zahrnut formou odkazů.

• · · · · · · ft • * ···· · · · · · · · „ · ♦ · ·· ftftft ·· · ·ι« ···· ·· »···

Systémy a způsoby jejich použiti při určování koncentrace analytu kolorimetrickou metodou

Podobně jako u elektrochemických systémů, které byly popsány výše, je prvním krokem způsobů využívajících kolorimetrický testovací systém zavedení určitého množství sledovaného vzorku, například fyziologického vzorku, do reagenčního testovacího proužku, a konkrétně do oblasti kolorimetrického testovacího proužku, která je určena pro příjem vzorku, přičemž zde použité výrazy kolorimetrický a fotometrický jsou zaměnitelné. Fyziologický vzorek se může lišit, ale u mnoha provedení se běžně používá celá krev nebo její derivát nebo frakce, přičemž zvláště zajímavá je u mnoha provedení celá krev.

Kolorimetrické reagenční testovací proužky použité u těchto provedení vynálezu jsou zpravidla tvořeny alespoň následujícími složkami: porézní matricí pro příjem vzorku a reagenční kompozicí, která zpravidla obsahuje jeden nebo několik členů systému produkujícího signál oxidace analytu.

Matricí, která se používá u těchto testovacích proužků, je inertní porézní matrice, která poskytuje oporu různým členům systému produkujícího signál, který bude popsán níže, a stejně tak světlo absorbujícímu neboli chromogennímu produktu, který je produkován systémem produkujícím signál, tj . poskytují oporu indikátoru. Inertní porézní matrice je uspořádána tak, že poskytuje místo pro aplikaci fyziologického vzorku, například krve, a místo pro detekci světlo absorbujícího produktu vyprodukovaného indikátorem systému produkujícího signál. Inertní porézní matricí je matrice, která umožňuje průchod proudu vodné tekutiny a poskytuje dostatek volného prostoru pro chemické reakce systému produkujícího signál. Byla vyvinuta

V A. í- J16

9· * »» • 9 9 * · Φ Φ > · Φ · 9 « 9 · Φ Φ « φ Φ φ φ >

999 999· 99 9999 celá řada různých porézních matric, které lze použít v různých testech detekujících analyt, přičemž tyto matrice se mohou lišit ve smyslu materiálů, velikostí pórů, rozměrů apod. a reprezentativní příklady těchto matric jsou popsány

v	patentech	US 4	734	360;	US 4	900	666;	US 4	935 346;
US	5 059 394;	US 5	304	4 68;	US 5	306	623;	US 5	418 142;
US	5 426 032;	US 5	515	170;	US 5	526	120;	US 5	563 042;
US	5 620 863;	US 5	753	429;	US 5	573	452;	US 5	780 304;
US	5 789 255;	US 5	843	691;	US 5 846 486; US	5 968 836; a

US 5 972 294; jejichž obsah je zde zahrnut formou odkazů. Povaha porézní matrice v podstatě není pro testovací proužky podle vynálezu nikterak podstatná a volba matrice se tedy provádí s přihlédnutím k ostatním faktorům, mezi kterými lze zmínit povahu přístroje, který se použije pro odečet testovacího proužku, pohodlí apod. Rozměry a poréznost testovacího proužku se může velkou měrou lišit, přičemž matrice může nebo nemusí mít gradient poréznosti, například větší póry v blízkosti nebo přímo v místě aplikace vzorku a menší póry v oblasti detekce. Materiály, ze kterých může být matrice vyrobena, mohou být různé a zahrnují polymery, například polysulfon, polyamidy, celulózu nebo absorpční papír apod., přičemž materiál může případně vykazovat schopnost navázat se kovalentní nebo nekovalentní vazbou na různé členy systému produkujícího signál.

Kromě porézní matrice testovací proužky dále zahrnují jeden nebo několik členů systému produkujícího signál, které produkují detekovatelný produkt v odezvě na přítomnost analytu, přičemž detekovatelný produkt lze použít k odvození množství analytu přítomného v testovaném vzorku. V testovacích proužcích je jeden nebo více členů systému produkujícího signál, které jsou spojeny například «« · · »· »a • » · ·· · * · · · ♦ ··· · · · * * φ · ···· t · · · · · · • a a a a aaa «a a •«•••aa ·· ♦·♦· kovalentním nebo nekovalentním navázáním s alespoň částí (tj. detekční oblastí} porézní matrice, a u mnoha provedení jsou spojeny s v podstatě celou porézní matricí.

Systémem produkujícím signál je systém produkující signál oxidace analytu, přičemž tímto se rozumí, že při generování detekovatelného signálu, ze kterého lze odvodit koncentraci analytu ve vzorku, se analyt oxiduje vhodným enzymem a poskytuje tak zoxidovanou formu analytu a odpovídající nebo proporcionální množství peroxidu vodíku. Peroxid vodíku se zase následně použije pro generování detekovatelného produktu z jednoho nebo několika indikátorů, přičemž množství detekovatelného produktu, tj . signálu, se následně použije pro odvození množství analytu v počátečním vzorku. Systémy produkující signál oxidace analytu v testovacích proužcích jsou rovněž správně charakterizovány jako systémy produkující signál na bázi peroxidu vodíku.

Jak již bylo naznačeno výše, systémy produkující signál na bázi peroxidu vodíku zahrnují enzym, který oxiduje analyt a produkuje odpovídající množství peroxidu vodíku, přičemž odpovídajícím množstvím se rozumí, že množství peroxidu vodíku, které se produkuje, je proporcionální k množství analytu přítomného ve vzorku. Specifická povaha tohoto prvního enzymu nezbytně závisí na povaze analytu, který je testován, ale zpravidla se jedná o oxidázu. Prvním enzymem může být: glukózooxidáza (pokud je analytem glukóza); cholesteroloxidáza (pokud je analytem cholesterol); alkoholoxidáza (pokud je analytem alkohol); laktátoxidáza (pokud je analytem laktát) apod. Další oxidační enzymy použitelné v kombinaci s těmito a dalšími sledovanými analyty jsou odborníkům v daném oboru známy a mohou být rovněž použity. U těch výhodných provedení, kde *· · « · · • · to · • to · to • to · « to to

je reagenční testovací proužek navržen pro detekci koncentrace glukózy, je prvním enzymem glukózooxidáza. Glukózooxidázu lze získat z libovolného běžného zdroje, například z přírodních zdrojů, jakými jsou Aspergillus niger nebo Penicillum, nebo lze glukózooxidázu připravit rekombinantními technikami.

Druhým enzymem systému produkujícího signál je enzym, který katalyzuje konverzi jednoho nebo několika indikátorů na detekovatelný produkt v přítomnosti hydrogenperoxidu v případě, že množství detekovatelného produktu, který je produkován touto reakcí, je proporcionální k množství peroxidu vodíku, který je přítomen. Tímto druhým enzymem je zpravidla peroxidáza, přičemž vhodné peroxidázy zahrnují křenovou peroxidázu (HRP), sójovou peroxidázu, rekombinantním způsobem připravenou peroxidázu a syntetické analogy mající peroxidační aktivitu apod., viz například Y. Ci, F. Wang; Analytica Chimíca Acta, 233 (1990), str. 299 až 302.

Indikátorem nebo indikátory, například substráty, jsou sloučeniny, které jsou buď tvořeny nebo rozkládány peroxidem vodíku v přítomnosti peroxidázy za vzniku indikačního barviva, které absorbuje světlo v předem stanoveném rozmezí vlnových délek. Výhodně má indikační barva silnou absorbanci, která je odlišná od vlnové délky, při které silně absorbuje vzorek nebo testovací reagenční činidlo. Zoxidovaná forma indikátoru může být barevná, lehce zabarvená nebo bezbarvá, a je tedy detekovatelná jako změna barvy na testovací straně membrány. Jinými slovy, testovací reagenční činidlo může indikovat přítomnost glukózy ve vzorku odbarvením barevné plochy nebo alternativně zabarvením bezbarvé plochy.

v £w· » »» » »

0 0 I» » » ♦ 0 0

0*00 0 000 B • 0 000« 0 0 0 » 0 > 0 000 00 000 ·· ... .··· ·» ·*·.

Indikátory, které lze použít v rámci vynálezu, zahrnují jak jednosložkové, tak dvousložkové chromogenní substráty. Jednosložkové systémy zahrnují aromatické aminy, aromatické alkoholy, aziny a benzidiny, například tetramethylbenzidin-HCl. Vhodné dvousložkové systémy zahrnují ty systémy, jejichž jednou složkou je MBTH, derivát MBTH (například ty, které jsou popsané v patentové přihlášce US 08/302 575, zde uvedené formou odkazu) nebo 4-aminoantipyrin a druhou složkou je aromatický amin, aromatický alkohol, konjugovaný amin, konjugovaný alkohol nebo aromatický nebo alifatický aldehyd. Příkladem dvousložkových systémů jsou 3-methyl-2-benzothiazolinon hydrazon hydrochlorid (MBTH) kombinovaný s kyselinou 3-dimethylaminobenzoovou (DMAB); MBTH kombinovaný s kyselinou 3,5-dichlor-2-hydroxybenzensulfonovou (DCHBS); a 3-methyl-2-benzothiazolinonhydrazon W-sulfonylbenzensulfonát monosodný (MBTHSB) kombinovaný s 8-anilino-l-naftalensulfonátem amonným (ANS). U určitých provedení se jako výhodný jeví pár barvív MBTHSB-ANS.

U ještě dalších provedení lze použít systémy produkující signál, které produkují fluorescenční detekovatelný produkt (nebo detekovatelnou nefluorescenční látku na fluorescenčním pozadí), které jsou například popsány v Kioshi Zaitsu, Yosuke Ohkura: New fluorogenic substrates for Horseradish Peroxidase: rapid and sensitive assay for hydrogen peroxide and the Peroxidase. Analytical Biochemistry (1980) 109, str. 109 až 113.

Obecně řečeno, při kolorimetrických testech se vzorek nechá reagovat se členy systému produkujícího signál za vzniku detekovatelného produktu, který je přítomen v množství úměrném počátečnímu množství analytu ve vzorku. Určí se hodnota detekovatelného produktu, tj. signálu • · • flfl • flflflfl • · • fl * •fl ·”· · · · ’ • · · fl fl • · · · · • · · · fl·· flflflfl flfl flflflfl produkovaného systémem produkujícím signál, a z této hodnoty se odvodí množství analytu v počátečním vzorku. Jak již bylo popsáno, u některých provedení provádí detekci, a s ní související kroky, automatizovaná měřící zařízení, tj. optická měřící zařízení. Výše popsaná reakce, detekce a s ní související kroky, a stejně tak přístroje pro jejich

realizaci	jsou	dále popsány	v	patentech	US	4	734	360;
US 4 900	666;	US 4 935 346;	US	5 059 394;	US	5	304	4 68;
US 5 306	623;	US 5 418 142;	US	5 426 032;	US	5	515	170;
US 5 526	120;	US 5 563 042;	US	5 620 863;	US	5	753	42 9;
US 5 573	452;	US 5 780 304;	US	5 789 255;	US	5	843	691;
US 5 846	486; US 5 968 836; a	US	5 972 294,	jej ichž	obsah

je zde zahrnut formou odkazů.

Příklady takových kolorimetrických nebo fotometrických reagenčních testovacích proužků, které lze použít v rámci vynálezu, jsou popsány v patentech US 5 563 042; US 5 753 452; a US 5 789 255, jejichž obsah je zde zahrnut formou odkazů.

Značení kontrolních a testovaných tekutin

Jak již bylo stručně uvedeno výše, znakem způsobů podle vynálezu je to, že se vzorek označí nebo určí buď jako kontrolní tekutina, nebo jako testovaná tekutina. Jinými slovy, pomocí měřícího přístroje se získá hodnota nebo signál generovaný systémem produkujícím signál kolorimetrického reagenčního testovacího proužku nebo hodnota nebo elektrochemický signál generovaný reakční zónou elektrochemického reagenčního testovacího proužku a kromě toho, že tento signál je použit pro stanovení koncentrace analytu, je rovněž použit pro identifikaci • · * · · 0

0 0«00 0 • 00

0 0 · >00 0 • · · 0

0«0

toho, zda je tekutina ve vzorku testovanou nebo kontrolní tekutinou.

Identifikaci tekutiny jako testovanou nebo kontrolní tekutinu lze provést před, po nebo dokonce v průběhu určování koncentrace analytu. Identifikaci lze tedy provádět buďto současně s určováním koncentrace analytu, nebo následně, po určení koncentrace analytu.

Bez ohledu na to, v jakém okamžiku identifikace probíhá, tj. bez ohledu na to, zda probíhá před, po nebo v průběhu určování koncentrace analytu, se identifikace vzorku zpravidla provádí během krátké časové periody. Krátkou časovou periodou se rozumí doba kratší než přibližně 20 s. U provedení, která používají elektrochemické metody, je identifikace vzorku zpravidla dokončena v době kratší než přibližně 1 s od okamžiku, kdy byl vzorek zaveden do testovacího proužku, a častěji je toto určování kratší než přibližně 0,25 s až 0,75 s. U provedení, která využívají kolorimetrické metody, bývá identifikace vzorku zpravidla dokončena během 10 s až 20 s od zavedení vzorku a obvykleji během 12 s až 18 s od zavedení vzorku. Určování koncentrace analytu může trvat kratší dobu, stejně dlouho nebo delší dobu než identifikace vzorku podle konkrétního použitého systému a sledovaného analytu. Určení koncentrace analytu může například trvat déle než 0,25 s až 1 s a dokonce déle než 1 s až 20 s.

Identifikace tekutiny nebo vzorku, tj. identifikace tekutiny jako kontrolní tekutiny nebo testované tekutiny, zpravidla zahrnuje získání signálu nebo naměřené hodnoty a jejich porovnání s referenční hodnotou, které vede k odvození nebo určení identity tekutiny. Referenční hodnotou se rozumí předem určený nebo standardní signál, hodnota » · · · · · · • · ··· * · · ·· · • · » • · » • · * • · t ·· ·««· koncentrace apod., které jsou známy, například hodnota standardního signálu je uživateli známa nebo je naprogramována do měřícího zařízení, a se kterými se vzorek, například signál produkovaný vzorkem, porovnává. Referenční hodnoty jsou zpravidla hodnoty, které lze pozorovat v době kratší než přibližně 20 s od okamžiku zavedení vzorku do měřícího zařízení. Referenční hodnotou může být například hodnota odrazu nebo proudová hodnota, přičemž proudová hodnota je zpravidla pozorována v době kratší než přibližně 1 s od zavedení vzorku do měřícího zařízení a zpravidla ji je možno zaznamenat přibližně po 0,25 s až 0,75 s od zavedení vzorku. Hodnotu odrazu lze zpravidla pozorovat přibližně do 10 s až 20 s od zavedení vzorku a zpravidla přibližně do 12 s až 18 s od zavedení vzorku do měřícího přístroje. Požadované signály nebo naměřené hodnoty, například hodnoty odrazu nebo elektrochemické hodnoty, lze získávat periodicky nebo v podstatě kontinuálně, případně zcela kontinuálně, během krátké časové periody.

Jak již bylo uvedeno výše, po získání signálu nebo naměřené hodnoty ze vzorku se provede identifikace vzorku na základě porovnání vztahů mezi signálem a referenční hodnotou, například porovnáním signálu se standardní nebo předem stanovenou hodnotou. Během krátké časové periody, při které se určuje identita vzorku, se signál, generovaný v důsledku aplikace vzorku do reagenčního testovacího proužku, porovná s předem stanovenou referenční hodnotou, například hodnotou proudu, hodnotou odrazu apod., které mohou být uloženy v měřícím zařízení a se kterými se signál vzorku porovnává. Identita vzorku se určuje rozlišením dvou signálů dvou tekutin v důsledku rozdílnosti signálů generovaných jednotlivými tekutinami a porovnáním tohoto signálu se známým signálem neboli referenční hodnotou. U \y· X

X -3 Vi.

* · • fcfc • fcfcfcfc • fc • fc ·· * · · · * • · · » ♦ · · · · · • « » · · ·· ···· ·· ··»· určitých provedení lze například identitu vzorku určit získáním a porovnáním signálu generovaného vzorkem se známým referenčním signálem, přičemž hodnota signálu se ukáže jako nižší než referenční hodnota a vzorek může být tedy označen a identifikován jako kontrolní tekutina. Alternativně se může zjistit, že hodnota signálu je shodná nebo výrazně vyšší než referenční hodnota a vzorek může být označen a identifikován jako testovaná tekutina nebo naopak. U určitých provedení používajících elektrochemické metody lze vzorek identifikovat jako kontrolní tekutinu, pokud je vyšší než referenční hodnota, například vyšší než referenční proudová hodnota, a může být identifikován jako testovaná tekutina, pokud je nižší než referenční hodnota. U určitých provedení, která využívají kolorimetrické metody, může být vzorek identifikován jako kontrolní tekutina, pokud má hodnotu nižší než je referenční hodnota, například nižší než referenční hodnota odrazu, jakou může být hodnota K/S, která bude podrobněji popsána níže, a jako testovaná tekutina může být vzorek identifikován, pokud poskytuje hodnotu vyšší než je zmíněná referenční hodnota.

Bez ohledu na to, jak se identita vzorku porovnává se známou hodnotou signálu se potom, co se provede identifikace koncentrace analytu ve vzorku a identifikace toho, zda je vzorek kontrolní nebo testovanou tekutinou, identifikovaný vzorek nebo hodnota koncentrace analytu ve vzorku může na základě získaných informací dále zpracovávat. Identifikovaný vzorek se může uložit do paměti měřícího zařízení nebo z paměti naopak odstranit a tyto činnosti mohou být prováděny ručně uživatelem nebo automaticky měřícím zařízením. U mnoha provedení lze signál nebo naměřenou hodnotu, například koncentraci analytu, identifikované ze vzorku kontrolní tekutiny odstranit z • · · • * · · • · ···· ♦ · · ·· · ·*’* *”· »” • * * * • · « t · • · * · • ···· ** ···· paměti měřícího zařízení, zatímco signál nebo koncentraci identifikované z testované tekutiny lze uložit. Alternativně lze signál nebo koncentraci, které byly označeny nebo identifikovány jako získané z kontrolní tekutiny v měřícím přístroji, například v paměti měřícího zařízení, uložit v případě, že je možné tento signál nebo koncentraci odlišit od uložených signálů nebo koncentrací označených jako získané z testovaných tekutin.

Rozlišení signálu na signály pocházející z kontrolních nebo testovaných vzorků lze provádět celou řadou různých metod. Signál kontrolní tekutiny lze například uložit v samostatné části paměti nebo společně s odečety testované tekutiny, pokud si zachovají odlišnost od již uložených odečetů testovaných tekutin, například pokud zůstane kontrolní a/nebo testovací tekutina „označkována, „označena nebo bude mít jinou schopnost rozlišení, jako kontrolní nebo testovaná tekutina. Bez ohledu na to, zda je odečet kontrolní tekutiny uložen v samostatné části paměti nebo nikoliv, mohou být koncentrace analytu v kontrolní nebo testované tekutině uložené v paměti měřícího přístroje prohlíženy a/nebo monitorovány samostatně, takže koncentrace analytu, a zejména průměr množiny koncentrací analytu, může být uživatelem prohlížen bez toho, že by došlo ke zkreslení v důsledku zahrnutí koncentrací analytu z odlišného zdroje. Množinu koncentrací analytu lze například ukládat do paměti měřícího zařízení tak, že lze zpětně prohlížet průměr množiny měření, například 7, 14 a 30 dnů koncentrací analytu v testovací tekutině bez toho, že by byly do této průměrné hodnoty zahrnuty koncentrace z kontrolní tekutiny, například koncentrace krevní glukózy lze ukládat a vypočíst průměr tak, aby mohl uživatel prohlížet a monitorovat průměrné hladiny glukózy získané z w· » • · · a a a a · a a♦··· a a a a aa a a a « » a a aaa a aaa aa aaaa testované tekutiny po určitou dobu bez toho, že by byly do těchto průměrů testované tekutiny zahrnuty hodnoty kontrolní tekutiny. Jak již bylo popsáno výše, měřící přístroj může provádět výše zmíněné operace ukládání odstraňování automaticky.

Systémy

Výše popsané metody nacházejí využití v systémech, které jsou tvořeny testovacími proužky a automatizovanými zařízeními, tj. měřícími přístroji pro odečet těchto testovacích proužků. Každý z těchto systémů bude nyní popsán podrobněji.

Zařízení

Vynález rovněž poskytuje měřící zařízení pro realizaci způsobů podle vynálezu, obecně elektrochemické a kolorimetrické, t j. optické nebo fotometrické, automatizované měřící přístroje. Přesto, že jsou tyto měřící přístroje vhodné pro určování širokého spektra analytů, jsou zvláště vhodné pro stanovení glukózy, a zejména glukózy ve vzorku celé krve. Automatizované měřící přístroje, které lze použít při provádění elektrochemických a kolorimetrických testů při. určování koncentrací analytů ve vzorcích, jsou v a jsou například popsány v patentu a související patentové přihlášce

US 09/333 793, jejichž obsah je zde zahrnut formou odkazů. Bez ohledu na to, jaký typ testovacího systému nebo měřícího zařízení se použije, je společným znakem měřících zařízení to, že zahrnují paměť nebo systém pro ukládání dat oboru známy US 5,059,3974 • ·

fe · · • fe · · • fe · · · • · · ♦ fe fev fe©·· • fefefefe a mikroprocesor nebo jiný naprogramovaný elektronický řídící a zobrazovací obvod, přizpůsobený pro provádění požadovaných operací a výpočtů a pro zobrazení výsledků. Mikroprocesory, které jsou součástí měřících zařízení pro určování koncentrací analytu, mohou zastávat řídící funkci, včetně načasování celého systému, a společně s programem a paměťovým systémem nebo prvkem zastávají další funkci, kterou je ukládání dat odpovídajících koncentracím analytu.

Měřící zařízení podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že má prvek pro identifikaci vzorku, který je schopen identifikovat, zdali je vzorek testovanou tekutinou nebo kontrolní tekutinou. V rámci vynálezu může být použita celá řada různých kontrolních tekutin, přičemž konkrétní tekutina bude zvolena v závislosti na typu použitého testovacího systému a v závislosti na sledovaném analytu. Nicméně obecně je kontrolní tekutinou vodný roztok, který obsahuje předem stanovené množství sledovaného analytu, přičemž množství analytu se bude v konkrétních případech samozřejmě lišit. Zpravidla se bude množství analytu pohybovat přibližně od 200 mg/1 do 6000 mg/1 a obvykle přibližně od 400 mg/1 do 4500 mg/1. Dalšími složkami kontrolní tekutiny může být jedna nebo více následujících složek: pufry, povrchově aktivní činidla, dispergační činidla, polymery, barviva, konzervační činidla a činidla snižující pěnivost.

Pokud jde o kontrolní tekutiny, používané při elektrochemických testech a metodách stanovení koncentrace analytu, může být touto kontrolní tekutinou obecně jakákoliv tekutina, která je prostá složek zpomalujících rozpouštění mediátoru, jakou je například ethylenglykol, N-methylpyrrolidon a W-propanol, a prostá oxidačních činidel, jakými jsou manganistan draselný, perchromát v ·

draselný, dichromát draselný, ferikyanid draselný, chloristan sodný a jodistan sodný. U mnoha provedení je kontrolní tekutina v podstatě prostá jakýchkoliv redoxních složek, a to zejména pokud se tato kontrolní tekutina použije v rámci elektrochemických testů. U ještě dalších provedení může kontrolní tekutina obsahovat odrazivou složku, která je schopna generovat profil odrazivosti odlišný od profilu generovaného krví. Například lze do kontrolní tekutiny zahrnout vhodné barvivo, jinými slovy barvivo, které je modifikátorem odrazivosti a absorbance, přičemž toto barvivo má maximální absorbanci viditelného světla v jiné části spektra než hemoglobin, a to zejména pokud je kontrolní tekutinou tekutina připravená pro kolorimetrické testy. Příklady barviv, která jsou vhodná pro použití v kontrolních tekutinách, používaných v rámci kalorimetrických testů a metod zahrnují neomezujícím způsobem kyselinu měďftalocyanin-3, 4',44’’’-tetrasulfonovou, tetrasodnou sůl; 3,7-bis(dimethylamino)fenothiazin-5-iumchlorid, ftalocyanin měďnatý a kyselinu l-(l-naftylazo)-2-naftol-3,6-disulfonovou, disodnou sůl.

Prvek pro identifikaci vzorku, tj . mikroprocesor, lze naprogramovat tak, aby automaticky identifikoval vzorek na základě hodnoty signálu, který produkuje, nebo podobným způsobem. Signálem se rozumí jeden nebo více datových bodů generovaných vzorkem, často soubor datových bodů, získaných v průběhu určité časové periody. Při získávání požadovaných signálů nebo naměřených hodnot ze vzorku, například signálů souvisejících s odrazivosti světla, které jsou generovány kolorimetrickou reakcí, nebo signálů souvisejících s proudem, které jsou generovány elektrochemickou reakcí, lze signály získávat periodicky nebo v podstatě kontinuálně,

VX · 0 · · ·

A 0 0 0 0 « 0 0 0 0 ·

0 0 0 0

000 00·« ·· «0·· • * * · · » · 00·· ·

OO · · · ·» · pokud ne zcela kontinuálně, v průběhu periody, zpravidla kratší než přibližně 20 s

Měřící přístroj tedy rovněž zahrnuje jednu nebo několik referenčních hodnot, se kterými se jeden nebo více signálů generovaných vzorkem porovnává, ve snaze identifikovat, zdali je vzorek kontrolní tekutinou nebo testovací tekutinou. Referenční hodnotou se rozumí jedna hodnota nebo série hodnot, které zpravidla odpovídají různým časovým okamžikům. Referenční hodnotou může být hodnota odrazivosti nebo hodnota proudu, v závislosti na tom, zdali se v konkrétním případu jedná o kolorimetrický nebo elektrochemický test, jak bude podrobněji popsáno níže.

krátké časové

Pokud je referenční hodnotou hodnota odrazivosti, tj. testem je kolorimetrický test, potom referenční hodnotou může být signál odrazivosti, který je libovolným vyjádřením nebo hodnotou související s množstvím světla, který odráží vzorek v průběhu určité časové periody v oblasti jedné nebo více vlnových délek. Referenční hodnota odrazivosti u kolorimetrického testu může například zahrnovat poměr odpovídající odrazivosti světla, přičemž takový poměr se může týkat barevné intenzity, světla odráženého vzorkem při jedné nebo několika vlnových délkách během určité časové periody, kterou lze zpravidla pozorovat přibližně do 10 s až 20 s od zavedení vzorku do měřícího přístroje a zpravidla přibližně do 12 s až 18 s od zavedení vzorku do měřícího přístroje. Lze použít libovolný vhodný poměr, například v daném oboru známý poměr K/S, kde K znamená koeficient světelné absorpce v pevné fázi a S znamená koeficient rozptylu světla (viz například patent US 5 049 487, jehož obsah je zde zabudován formou odkazů), zpravidla při vlnové délce přibližně 450 nm až 75 nm, «· ’ • · ftftft ftft··* · ft · •

• ft ft ft· * « · · • · · · · • · · · ··*« ·· ···· obvykle přibližně 650 nm až 720 nm a častěji přibližně 700 nm. Z výše uvedeného vyplývá, že měřici zařízení je schopno porovnávat jednu nebo více referenčních hodnot odrazivosti s jedním nebo více signály generovanými vzorkem v konkrétním časovém okamžiku nebo v průběhu určité Časové periody, přičemž tato časová perioda je kratší než přibližně 20 s a zpravidla trvá přibližně 12 s až 18 s, viz výše. Příkladné hodnocení ukazuje obr. 2, kde je znázorněn graf hodnot K/S v 15 s od okamžiku zavedení vzorku do měřícího přístroje získaný při vlnové délce 700 nm proti E koeficientní hodnotě měřícího přístroje pro kontrolní tekutinu a testovací tekutinu. Hodnotu K/S lze tedy nastavit jako referenční hodnotu tak, aby byl vzorek v případě, že hodnota K/S vzorku bude větší než referenční hodnota K/S, označen jako testovaná tekutina a v případě, že bude hodnota K/S vzorku menší než referenční hodnota K/S, označen jako kontrolní tekutina. Měřící zařízení tedy umožňuje porovnání hodnot K/S vzorku a předem stanovené reference, tj. známé hodnoty K/S, a identifikaci vzorku jako kontrolní nebo testovací tekutinu na základě jednoho nebo několika takových srovnání.

Pokud je referenční hodnotou proudová hodnota, tj. testem je elektrochemický test, potom může být referenční hodnotou hodnota související s maximální hodnotou signálu nebo rychlost změny jednoho nebo více signálů generovaných elektrochemickou reakcí, zpravidla pozorované v průběhu určité časové periody. Proudový signál je zpravidla možné zaznamenat v době kratší než přibližně 1 s od okamžiku zavedení vzorku do měřícího přístroje a zpravidla je zpozorována v době kratší než přibližně 0,25 s až 0,75 s od okamžiku zavedení vzorku. Referenční proudovou hodnotou může být numerická hodnota nebo podobná hodnota v případě, • 0 0 • 00··

000·

0 ·

0000 kdy tato hodnota souvisí s maximální hodnotou proudu v daný časový okamžik nebo v průběhu určité časové periody, tj. změna v hodnotě proudu v závislosti na čase. Zpravidla bude rychlost změny proudu produkovaná vzorkem v závislosti na čase vykazovat v podstatě konstantní klesající nebo stoupající tendenci, alespoň po krátkou časovou periodu, viz výše. Reprezentativní graf ukazující závislost proudových hodnot kontrolních tekutin a testovaných tekutin na čase je znázorněn na obr. 1. Hodnota, která souvisí s absolutní maximální proudovou hodnotou nebo sérií maximálních proudových hodnot, může být tedy nastavena jako referenční hodnota (hodnoty) tak, aby byla tekutina v případě, že je absolutní proudový signál generovaný vzorkem větší, než referenční proudová hodnota, označena jako testovaná tekutina, a v případě, že bude absolutní proudový signál generovaný vzorkem menší než referenční proudová hodnota, byla označena jako kontrolní tekutina. Alternativně lze jako referenční hodnotu použít hodnotu týkající se rychlosti změny proudu v závislostí na čase. Například pokud je rychlost změny hodnoty proudu v závislosti na čase, t j. sklon křivky změny náboje během časové periody kratší než přibližně 1 s nebo zpravidla kratší než přibližně 0,25 s až 0,‘75 s, generovaná vzorkem větší než referenční sklon křivky, potom je vzorek identifikován jako kontrolní tekutina a, pokud je rychlost změny proudu, tj. sklon, menší než referenční sklon, potom je vzorek identifikován jako testovaná tekutina.

Jak již bylo popsáno výše, měřící přístroj rovněž zahrnuje paměťový prvek, kterým může být digitální integrovaný obvod, který ukládá data, a mikroprocesorový operační program. U mnoha provedení ukládá paměťový prvek množinu koncentrací analytu. Paměťový prvek podle vynálezu *

·· ··· · • · *

* « * může být rovněž schopen ukládat množinu koncentrací analytu jak kontrolní tekutiny, tak testované tekutiny tak, aby zůstaly koncentrace kontrolní tekutiny v paměťovém prvku počítače odlišeny od koncentrací testované tekutiny. Výhodně může být měřící systém rovněž naprogramován k tomu, aby vyřazoval určité hodnoty koncentrací analytu ze své paměti a jiné naopak ukládal, přičemž toto vyřazování a ukládání lze provádět manuálně nebo automaticky, ale zpravidla se provádí automaticky. Měřící přístroj může být například schopen automaticky vyřazovat hodnoty koncentrací analytu kontrolní tekutiny a hodnoty koncentrace analytu testované tekutiny naopak ukládat.

U mnoha provedení může mít měřící přístroj rovněž výpočetní prvek, například algoritmus, který je schopen vypočíst průměr množiny koncentrací analytu uložených ve své paměti, zpravidla bez toho, že by do konečné hodnoty průměru zahrnul hodnoty koncentrace analytu získané z jiných typů vzorků, například vypočte průměr dat uložených pro testovanou tekutinu bez toho, že by zahrnul data uložená pro kontrolní tekutinu.

Kity

Vynález rovněž poskytuje kity použitelné pro provádění způsobů podle vynálezu. Tyto kity zahrnují alespoň jedno výše popsané zařízení podle vynálezu. Kity mohou dále zahrnovat nástroj pro získání fyziologického vzorku. Pokud je fyziologickým vzorkem krev, potom mohou sady podle vynálezu například zahrnovat prvek pro získání krevního vzorku, například lancetu pro propíchnutí prstu apod. Sady podle vynálezu mohou rovněž dále obsahovat výše popsanou • ··♦· · β·9· gi ukózovou kontrolní kontrolní tekutinu, například tekutinu. Určité sady mohou zahrnovat jeden nebo více testovacích proužků. Sady mohou konečně dále zahrnovat instrukce pro použití zařízení, které určují koncentraci analytu ve vzorku. Instrukce mohou být vytištěny na podkladu, který je papírový, plastový atd. Instrukce mohou být přítomny v křtech jako příbalový leták nebo mohou být součástí etikety na zásobníku kitu nebo jeho složek (tj. mohou být součástí obalu nebo obalů jednotlivých složek) atd. U jiných provedení jsou instrukce přítomny ve formě elektronického uloženého datového souboru, který je součástí vhodného datového nosiče a který je schopen počítač přečíst, např. na disketě nebo CD-ROMu atd.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými patentovými nároky.

I. Příklad elektrochemického stanovení koncentrace analytu

A. Příprava kontrolní tekutiny

Kontrolní tekutina se připravila za použití následujících složek a příslušných množství.

· • * * · · · • · ···· ·»· • ••0 0

Složka	Funkce	Množství
Kyselina citrakonová	Pufr	0,0833 g
Citrakonát didraselný	Pufr	1,931 g
Methylparaben	Konzervační činidlo	0,050 % hmotn./hmotn.
Germal II	Konzervační činidlo	0,400 % hmotn./hmotn.
Dextran T-500	Modifikátor viskozity	3,000 % hmotn./hmotn.
Pluronic 25R2	Rozvolňovadlo	0,050 % hmotn./hmotn.
Disodná sůl kyseliny l-[ (6-methoxy-4sulfo-m-tolyl)azo]-2-naftol-6-sulfonové	Barvivo	0,100 % hmotn./hmotn.
D-Glukóza	Analyt	50 mg, 120 mg nebo 400 mg
Deionizované voda	Rozpouštědlo	100 g

Nejprve se připravil citrakonový pufr pH 6,5 ± 0,1 rozpuštěním potřebného množství kyseliny a soli v deionizované vodě. Potom se přidal methylparaben a roztok se míchal do úplného rozpuštění konzervační látky. Potom se postupně přidal Dextran T-500, Germal II, Pluronic 25R2 a disodná sůl kyseliny 1-[(6-methoxy-4-sulfo-m-tolyl)azo]-2-naftol-6-sulfonové a všechny složky se nechaly zcela rozpustit. V tomto okamžiku se ověřila pH hodnota kontrolní tekutiny a následně se přidalo potřebné množství glukózy pro získání kontrolní tekutiny s nízkou, normální nebo vysokou koncentrací glukózy. Po úplném rozpuštění glukózy se nechala kontrolní tekutina odležet přes noc při pokojové teplotě. Na závěr se koncentrace glukózy ověřila za použití měřícího přístroje Model 2700 Select Biochemistry Analyzer od společnosti Yellow Springs Instrument Co., Inc.

·* · • · · a · ♦ · a · aaaa a aaa ·· · v x - Í. x~J -J V • * · a · · aa> · • * · «· a«aa

B. Měření

Elektrochemický proužek, zkonstruovaný výše popsaným způsobem, přístroje se zavedl do a na testovací elektrochemického měřícího proužek se nanesl vzorek (přibližně 2 μΐ nebo méně) testované tekutiny (například celé krve) nebo kontrolní tekutiny. Měřící přístroj následně měřil hodnoty proudu ve specifikovaných časových intervalech, viz výše, a získané hodnoty porovnal s hodnotami, které byly do měřícího přístroje předen naprogramovány a které jsou charakteristické pro příslušný typ vzorku. Na základě měření měřící přístroj vzorek označil.

C. Výsledky

Obr. 1 znázorňuje graf „proudové odezvy, na kterém je výstup, tj. elektrický proud naměřený měřícím přístrojem, vynesen jako funkce času kontrolních vzorků tekutiny identifikovaných jako CF, které mají předem stanovenou koncentraci glukózy 500 mg/1 a 4000 mg/1, a krevních vzorků, identifikovaných jako TF, které mají finální koncentraci glukózy 0 mg/1, 400 mg/1 a 6000 mg/1. V případě kontrolní tekutiny, bez ohledu na to, zda měla nízkou (500 mg/1) nebo vysokou (4000 mg/1) koncentraci glukózy, byla hodnota počátečního proudu velmi malá (záporný 1 μΑ až 2 μΑ) . Pokud se na testovací proužek aplikovala testovaná tekutina (tj. celá krev), potom měřící zařízení nejprve detekovalo hodnoty proudu, které byly významně vyšší než hodnoty generované kontrolní tekutinou. Na obr. 1 je kontrolní tekutina (CF) reprezentována křivkou sestrojenou na základě známých koncentrací • 9

Ui“ V 4.“

9999 ♦

9 •9 99·· glukózy (vzorek č. 1 až 2) a krev je označena jako TF (vzorky č. 3 až 8) a je reprezentována křivkami vynesenými na základě příslušných procentických koncentrací hematokritu a koncentrace glukózy, vyjádřeno v mg/l (například vzorek TF-70-34 označuje celou krev se 70 % hematokritu a 340 mg/l glukózy atd.). Výsledky demonstrují, že použití testovaných tekutin zahrnujících široké rozsahy koncentrací glukózy a široké rozmezí koncentrací červených krvinek lze dosáhnout diferenciace mezi kontrolními a testovanými tekutinami.

Obr, 1 tedy ukazuje, že celou první sekundu po zavedení vzorku do reagenčního testovacího proužku je proud, v případě kontrolních tekutin, výrazně nižší než proud získaný při zavedení testovaných neboli krevních tekutin. Z výše uvedeného vyplývá, že divergentní čtení kontrolních a testovaných tekutin umožňuje prvku pro identifikaci tekutin, který je součástí měřícího přístroje, označit nebo identifikovat vzorek buď jako kontrolní, nebo jako testovanou tekutinu a na základě této identifikace vzorek dále zpracovat.

II. Příklad kolorimetrického stanovení koncentrace analytů

A, Příprava kontrolní tekutiny

Kontrolní tekutina se připravila z následujících složek a odpovídajících koncentrací.

»· * • · · • · · · * ··»· · » · · *

• t ·”* t · t · ·

9

999 9999 • » · » » • · · • 9 · ·· ····

Složka	Fůnkce	Konečná koncentrace (% hmot./hmotn.)
Polyvinylaoetát	Polymer, modifikátor penetrace a odrazivosti vzorku	14,3
Tetrasodná sůl kyseliny měďftalocyanin-3,4', 4'', 4 '-tetrasulfonové	Barvivo, modifikátor odrazivosti	0,0075
Aerosil 200	Dispergační činidlo	0,1
Benzoát sodný	Konzervační činidlo	0,2
Disodný EDEA	Konzervační činidlo	0,1
Dow B emulze	Činidlo redukující pěnivost	0,02
D-Glukóza	Analyt	400 mg/l, 1000 mg/l, 3000 mg/l
Destilovaná voda	Rozpouštědlo	85,7

Kontrolní tekutina pro kolorimetrický test se připravila postupným přidáním složek, jejichž seznam reprezentuje výše uvedená tabulka, do destilované vody ve vhodné nádobě za nepřetržitého míchání obsahu nádoby. Jako poslední chemikálie se přidalo požadované množství glukózy a kontrolní tekutina se následně ohřála na 90 °C a při této teplotě se v uzavřené nádobě udržoval 2 h. Po 24h temperaci při pokojové teplotě se koncentrace glukózy stanovila pomocí měřícího přístroje Model 2700 Select Biochemistry Analyzer od společnosti Yellow Springs Instrument Co., Inc.

B. Měření

Fotometrický testovací proužek, zkonstruovaný výše popsaným způsobem, se zavedl· do optického měřícího ui-zijo-uz-ue • · · · ··· ···· ·· ···· přístroje a na testovací proužek se pomocí pipety naneslo 5 μΐ kontrolní tekutiny nebo celé krve. Při určení, zdali se jedná o kontrolní nebo testovanou tekutinu, měřící přístroj měřil 15 s po aplikaci vzorku odrazivost proužku při 700 nm. Barevná intenzita při specifikovaných světelných vlnových délkách může být definována poměrem K/S, kde K znamená koeficient absorpce světla v pevné fázi a S znamená koeficient rozptylu světla (viz patent US 5 049 487, který je zde uveden formou odkazů).

C. Výsledky

Získané výsledky ukazují významný rozdíl hodnot K/S 15 s, 700 nm mezi kontrolními a krevními tekutinami.

Obr. 2 znázorňuje graf „odrazivé odezvy pro prvních 15 s po zavedení vzorku do reagenčního testovacího vzorku. V grafu na obr. 2 je výstup, tj. odečet odrazivosti, vyjádřený jako K/S při 700 nm, vynesen jako funkce koeficientní hodnoty E kalibrované v měřícím přístroji pro vzorek kontrolní tekutiny mající předem stanovenou koncentraci glukózy 400 mg/1 (znázorněno jako čtverečky) a pro krevní vzorek mající koncentrace glukózy 330 mg/1 až 460 mg/1 a 18 % hematokritu (znázorněno jako křížky).

Obr. 2 demonstruje, že po celých počátečních 15 s po zavedení vzorku do reagenčního testovacího proužku kontrolní tekutina vykazovala výrazně nižší odrazivé signály než krevní vzorek v celém širokém rozmezí E koeficientní hodnoty. Konkrétně průměrný poměr K/S v případě kontrolní tekutiny dosahoval 0,0589 při standardní odchylce 0,0135, zatímco průměrný poměr K/S v případě krevního vzorku dosahoval 0,3651 při standardní odchylce *

*

• * • · · * · » ft · »

0,0323. 2 výše uvedeného vyplývá, že divergentní odečety kontrolní a testované tekutiny umožňují identifikačnímu prvku, který je součástí měřícího přístroje, označit nebo identifikovat vzorek buď jako kontrolní nebo testovanou tekutinu a na základě této informace vzorek dále zpracovat.

Z výše uvedených výsledků a diskusí je zřejmé, že výše popsaný vynález poskytuje jednoduchý a přesný způsob identifikace vzorku jako kontrolního nebo testovaného vzorku tekutiny při provádění testů určujících koncentraci analytu. Výše popsaný vynález poskytuje celou řadu výhod, včetně schopnosti ukládat a vyřazovat hodnoty koncentrace analytu z paměti měřícího přístroje, při použití jednoduchých kontrolních roztoků a jak elektrochemických, tak i kolorimetrických testů. Jako takový vynález reprezentuje významný přínos v dané oblasti.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Způsob stanovení koncentrace analytu ve vzorku, který zahrnuje:

   a) poskytnutí systému, který obsahuje:

   i) reagenční testovací proužek mající oblast pro příjem vzorku a ii) měřící přístroj pro stanovení koncentrace analytu ve vzorku zavedeném do oblasti pro příjem vzorku;

   b) zavedení vzorku do oblast-i pro příjem vzorku, přičemž vzorek se zvolí z množiny sestávající z kontrolní tekutiny a testovací tekutiny, jestliže je uvedená kontrolní tekutina prostá složky zpomalující rozpouštění mediátoru a oxidačního činidla, pokud se koncentrace analytu určuje za použití elektrochemických metod; a

   c) stanovení koncentrace analytu ve vzorku za použití měřícího přístroje, vyznačený tím, že dále zahrnuje určení toho, zdali je vzorek kontrolní tekutinou nebo testovanou tekutinou, které vede k získání identifikační informace o vzorku.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se identifikační informace o tom, zdali je vzorek kontrolní tekutinou nebo testovací tekutinou, získá v době kratší než přibližně 20 s od okamžiku zavedení vzorku.

   fc · • V • fc · fc • · • · fc · fcfcfc ···· • · fc fc fc fc * • fc
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že dále zahrnuje krok ukládání identifikační informace o vzorku do paměťového prvku měřícího přístroje.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že dále zahrnuje krok vyřazení identifikační informace o vzorku z paměťového prvku měřícího přístroje.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že měřící přístroj měří signál produkovaný kontrolní tekutinou a testovanou tekutinou, a naměřený signál produkovaný kontrolní tekutinou je slabší než naměřený signál produkovaný testovanou tekutinou.
6. 6. Měřící přistroj pro stanovení koncentrace analytu ve vzorku, vyznačený tím, že měřící přístroj obsahuje identifikační prvek pro identifikaci toho, zdali je vzorek testovanou nebo kontrolní tekutinou, přičemž identifikační prvek obsahuje alespoň jednu referenční hodnotu zvolenou z množiny sestávající z hodnoty odrazivosti a z hodnoty elektrického proudu, a hodnotou elektrického proudu je hodnota pozorovaná přibližně do 1 s od okamžiku zavedení vzorku do měřícího přístroj e.
7. 7. Měřící přístroj podle nároku 6, vyznačený tím, že měřící přístroj dále zahrnuje paměťový prvek, který je schopen ukládat množinu koncentrací analytu.

   • · • · · · t · tlM · ·· · ft* ·
8. 8. Měřící přístroj podle nároku 7, vyznačený tím, že paměťový prvek je schopen ukládat množinu koncentrací analytu kontrolní tekutiny a testované tekutiny odlišitelným způsobem.
9. 9. Měřící přístroj podle nároku 7, vyznačený tím, že měřící přístroj je schopen vypočíst průměr množiny uložených koncentrací analytu uložených v paměťovém prvku.
10. 10. Měřící přístroj podle nároku 7, vyznačený tím, že měřící přístroj je schopen vyřadit koncentraci analytu kontrolní tekutiny z paměťového prvku a ukládat koncentraci analytu testované tekutiny do paměťového prvku.
11. 11. Systém pro stanovení koncentrace analytu ve vzorku, vyznačený tím, že zahrnuje:

    (a) reagenční testovací proužek mající oblast pro příjem vzorku a (b) měřící přístroj podle nároku 6.