CZ2002402A3

CZ2002402A3 - Peptid, jeho použití tripeptidu, způsob určení tripeptidu

Info

Publication number: CZ2002402A3
Application number: CZ2002402A
Authority: CZ
Inventors: Anders Vahlne
Original assignee: Tripep Ab
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-06-29
Publication date: 2002-09-11
Also published as: US6258932B1; EP1206273A2; MXPA02001344A; WO2001010456A3; CA2378460A1; PL354090A1; NO20020571D0; IL147969A0; HUP0202502A2; IS6262A; JP2003506410A; NO20020571L; AU5700800A; KR20020025970A; CN1377275A; US20020091086A1; WO2001010456A2

Description

Peptid, jeho použití, použití tripeptidu, způsob určení tripeptidu.

OBLAST TECHNIKY

Předkládaný vynález se týká objevu peptidů, které inhibují virovou infekci, zahrnující infekci virem, způsobujícím AIDS (HIV). Konkrétněji jsou uveřejněny léky, obsahující různě malé peptidy pro použití při léčbě a prevenci virových infekcí, jako je HIV infekce.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Všechny viry jsou složeny z proteinového obalu, ležícího kolem jádra, obsahujícím nukleovou kyselinu. Proteinový obal, ležící přímo kolem virové nukleové kyseliny, se nazývá kapsida, zatímco úplný komplex protein-nukleová kyselina, který má jak kapsidu, tak nukleovou kyselinu, se nazývá nukleokapsida. Arenaviry, rotaviry, orbiviry, retroviry (zahrnující lentiviry), papillomaviry, adenoviry, herpesviry, paramyxovirus, myxovirus a hepadnaviry všechny ukazují tyto obecné strukturální znaky. (Virology, Fields ed., třetí vydání, vydavatelé Lippencott-Raven, str. 1513, 1645, 1778, 2047, 2113, 2221 a 2717 (1996)).

Kapsida je složena z mnoha podjednotek (kapsomer) a kapsomery jsou tvořeny z různých homo- nebo heteropolymerů proteinu. Nekovalentní vazby mezi kapsomery ve virovém agregátu jsou stejného druhu, jaké stabilizují složené proteinové domény. Meziprostor mezi dvěma podjednotkami může velmi vypadat jako samostatná doména s aminokyselinovými bočními řetězci těsně nahuštěnými jeden k druhému. Společný znak většiny analyzovaných virových struktur je způsob, jakým polypeptidový řetězec z jedné kapsomery může pokračovat pod nebo nad doménami sousedních kapsomer. Tyto dlouhé peptidové ramena se splétají s dalšími polypeptidovými rameny a pomáhají stabilizovat kapsidu vznikem hydrofobních interakcí, vodíkových můstků a solných můstků. Spojení mezi jednotlivými kapsomerami, a pro některé viry také spojení s proteiny jádra, určující celkovou kapsidovou strukturu a jestliže se spojí určitý počet stejných kapsomer, nastává opakované spojení a výsledná struktura je symetrická. (Virology. Fields ed., třetí vydání, vydavatelé Lippencott-Raven, str. 62 (1996)).

Některé jednoduché viry se tvoří spontánně z jejich disociovaných složek, zatímco jiné potřebují k průběhu skládání enzymově katalyzované úpravy kapsomer. Vlastní virové •fl flfl fl ·» • ··· ···· ··· ······· · · • flflfl flflfl ·· ·· · ····*· skládání je řízeno stabilitou interakcí mezi proteinovými jednotkami za podmínek, které zvýhodňují spojování. Více složité viry jsou často složeny ze subagregátů, které prošly vlastním procesy skládání. (Virology, Fields ed., třetí vydání, vydavatelé LippencottRaven, str. 62, 70, 1646 a 1888 (1996)). Ačkoliv kapsidy mnoha virů se liší v proteinovém složení, navržená obecná virová struktura byla odvozena tak, že se vyznačuje polymerizovanými kapsomerami, které jsou střídavě složeny z různých homo- nebo heteropolymerů proteinu.

HIV je jméno dané lentiviru, který infikuje lidi a který způsobuje syndrom získaného selhání imunity (AIDS). Lentivirus, izolovaný z lidí, patří do jednoho ze dvou typů (HIV-1 a HIV-2) na základě sérologických vlastností a sekvenční analýze molekulárně klonovaného virového genomu. Geneticky odlišné lentiviry byly získány z různých druhů primátu, zahrnujících makaky a kočkodany, mangabeje chocholaté, mandrily, šimpanze a Sykesovy opice. Souhrnně jsou lentiviry, izolované z primátů, nazývány SIV. Sekvenční analýza odhalila, že genomy některých SIV druhů a HIV 1 a HIV 2 ukazují vysoký stupeň homologie. Dále elektronová mikroskopie odhalila, že ultrastruktury HIV a SIV jsou podobné vtom, že oba mají viriony asi 110 nm v průměru s kuželovitou nukleokapsidou, obklopenou lipidovou dvojvrstevnou membránou, která obsahuje povlak glykoproteinových výběžků. (Virology, Fields ed., třetí vydání, vydavatelé Lippencott-Raven, str. 1882-1883 (1996)).

HIV je složitý retrovirus, obsahující alespoň sedm genů. Virové strukturální geny, označené gag, pol a env, kódují proteiny virového jádra, reverzní transkriptázu a virové glykoproteiny virového obalu. Zbývající HIV geny jsou pomocné geny, zahrnuté při virální replikaci. Gag a env geny kódují polyproteiny, tj. proteiny, syntetyzované ze všech těchto genů, jsou post-translačně rozděleny do několika menších proteinů.

Ačkoliv celkový prostor HIV a SIV virionů je kulovitý, nukleokapsida je asymetrická, mající nejdelší rozměr asi 100 nm, široký volný konec asi 40 až 60 nm a úzký konec asi 20 nm do šířky. Nukleokapsida při každém zrání virionu je složena ze dvou molekul virového jednovláknového RNA genomu, obaleného proteiny proteolyticky upravené z Gag prekurzorového polypeptidu. Odštěpení gag genového polyproteinu Pr55^gas virem kódovanou proteázou (PR) vyvolává zrání kapsidových proteinů. Tyto gag genové produkty jsou matrixový protein (pl7), o kterém se má za to, že je lokalizován mezi nukleokapsidou a virionovým obalem; hlavní kapsidový protein (p24), který tvoří kapsidový obal; a nukleokapsidový protein (p9), který se váže na virový RNA genom. Toto proteolytické zpracování v infikovaných buňkách je spojeno s virionovou

·· ·· • · morfogenezí. (Virology, Fields ed., třetí vydání, vydavatelé Lippencott-Raven, str. 1886-1887 (1996)).

Hlavní kapsidový protein p24 (také nazývaný CA) obsahuje asi 240 aminokyselin a má molekulární váhu 24 až 27 kD. Protein p24 se samostatně spojuje za tvorby dimerů a oligomerních komplexů stejně dlouhých jako dodekamery. Genetické studie s mutacemi v HIV-1 gag polyproteinu určili několik funkčních domén v p24 proteinu, zahrnující C koncovou polovinu molekuly a hlavní homologickou oblast (MHR) o rozsahu 20 aminokyselin, která je zachována v p24 proteinech různých retrovirů. Zdá se, že tyto mutace postihují prekurzory nukleokapsidového agreátu. (Virology, Fields ed., třetí vydání, vydavatelé Lippencott-Raven, str. 1888-1889 (1996)).

Od objevu HIV-1 jako etiologického činidla AIDS proběhl významný vývoj v porozumění mechanismům, kterými vir způsobuje onemocnění. Zatímco bylo vyvinuto mnoho diagnostických testů, vývoj v HIV očkovací léčbě byl do značné míry pomalý díky heterogennímu charakteru viru a nedostatku vhodných zvířecích modelů. (Viz. např. Martin, Nátuře, 345:572 až 573 (1990)).

Při pokusech o léčbu AIDS byla použita různá farmaceutická činidla. Hodně, ale ne všechna, z těchto léků nicméně vyvolává vážné vedlejší účinky, které velice omezují jejich vhodnost jako léčebných činidel. HIV reverzní transkriptáza je jeden cíl léků, protože má rozhodující roli při virové replikaci. Bylo zjištěno, že některé nukleosidové deriváty, které zahrnují azidothymidin (AZT, zidovidin) inhibují HIV reverzní transkriptázu. AZT způsobuje vážné vedlejší účinky, až takové, že mnoho pacientů nemůže snášet jeho podávání. Bylo zjištěno, že jiné nukleosidové analogy, které inhibují HIV reverzní transkriptázu, způsobují větší vedlejší účinky než AZT. Jiný cíl léků je HIV proteáza (PR), rozhodující při vývoji viru. PR je aspartátová proteáza a může být inhibována syntetickými látkami. (Richards, FEBS Lett., 253:214 až 216 (1989)). Proteázové inhibitory inhibují růst HIV účinněji než inhibitory reverzní transkriptázy, ale prodloužení léčby je spojeno s metabolickými chorobami, jako je lipodystrofie, hyperlipemie a inzulínová rezistence.

Dále HIV rychle získává rezistenci k nukleosid/nukleotidovým analogům inhibitorů reverzní transkriptázy a inhibitorům proteázy. Tato rezistence se také může šířit mezi pacienty. Studie například ukázaly, že jedna desetina jedinců nedávno infikovaných HIV má vždy získanou rezistenci k AZT, pravděpodobně protože byli infikováni osobou, která právě přenášela virus, který byl rezistentní k AZT.

* ·· · · · ·· ·· ··«· · · · * · · · • ··· ······· · · ··· ·* ·· 4 ·· 44*4

Pro léčbu a prevenci virových infekcí, zahrnující HIV a SIV, bylo by užitečné mít specifická a selektivní léčebná činidla, která způsobují malé, pokud nějaké, vedlejší účinky.

PODSTATA VYNÁLEZU

Předkládaný vynález se týká malých peptidů (dvě až deset aminokyselin dlouhých, které inhibují virovou nakažlivost. Neporušená kapsidová struktura je životně důležitá pro nakažlivost virionu. Cestou narušení skládání makromolekul kapsidových proteinů, které jsou pro nakažlivost závislé na di-, tri-, tetra- nebo polymerizaci, je vytvoření malých molekul, které způsobují takové protein-protein interakce. Bylo objeveno, že malé peptidy s karboxyl koncovou hydroxylovou skupinou nahrazenou amidoskupinou mají takový účinek na kapsida-proteinové interakce. Tak se aspekty předkládaného vynálezu vztahují k upraveným malým peptidům, které působí na skládání virové kapsidy.

V odpovídajících částech se krátké peptidy váží na protein, který je zahrnut v organizaci kapsomery a kapsidového agregátu HIV-1, HIV-2 a SIV a tím inhibují a/nebo předcházejí vlastnímu kapsidovému složení a tak virové infekci. Malé peptidy Gly-Pro-Gly-NH₂ (GPG-NH₂), Gly-Lys-Gly-NH₂ (GKG-NH₂), Cys-Gln-Gly-NH₂(GQG-NH₂), Arg-Gln-Gly-NH₂ (RQG-NH₂), Lys-Gln-Gly-NH₂ (KQG-NH₂), Ala-Leu-Gly-NH₂ (ALG-NH₂), Gly-Val-GIy-NH₂ (GVG-NH₂), Val-Gly-Gly-NH₂ (VGG-NH₂), Ala-Ser-Gly-NH₂ (ASG-NH₂), Ser-Leu-Gly-NH₂ (SLG-NH₂) a Ser-Pro-Thr-NH₂ (SPT-NH₂) jsou upřednostňované typy. Tyto malé peptidy a peptidomimetické látky, připomínající jejich strukturu (společně označované jako „peptidová činidla“) jsou použity v monomerické nebo multimerické formě. Peptidová činidla podle předkládaného vynálezu jsou vhodná pro léčebné a profylaktické použití u savců, zahrnujíce člověka, trpících virovou infekcí.

V jedné části má prostředek pro inhibici virové replikace v hostitelských buňkách, infikovaných virem, účinné množství peptidu v amidové formě, který má obecný vzorec XiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce X_b X₂ a X₃ jsou aminokyseliny a uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂ a kde uvedený prostředek inhibuje virovou replikaci přerušením skládání virové kapsidy. Vhodné je, jestliže sloučenina obecného vzorce X₃ je glycin. Dále prostředek, popsaný výše, může zahrnovat peptid v amidové formě, který je vybrán ze skupiny, obsahující peptidy, které mají vzorec Gly-Lys-Gly·· ·· ♦ · ·

-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂.

V jiné příbuzné části je prostředek, popsaný výše, peptid v amidové formě, která má obecný vzorec X4XsXiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce X4 a X5 jsou aminokyseliny a jedna nebo dvě aminokyseliny mohou chybět. Tato část může být tripeptid, který má obecný vzorec XjX₂X₃, kde tato sekvence je nalezena v aminokyselinové sekvenci kapsidového proteinu viru.

V jiných částech jsou prostředky, popsané výše, připojeny na nosič a v ještě jiných částech jsou prostředky, popsané výše, zabudovány do léku, který má léčebně vhodný nosič. Například může mít peptid v amidové formě vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂ a být připojený na nosič.

Dále může mít peptid v amidové formě vzorec jako Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂ nebo Ser-Leu-Gly-NH₂. Tyto peptidy můžou být také připojeny na nosič.

Způsoby inhibice HIV replikace v hostitelské buňce jsou také částmi vynálezu. Jeden přístup například zahrnuje podávání buňce účinné množství peptidu v amidové formě, která má obecný vzorec XiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce Xi, X₂ a X₃ jsou aminokyseliny a uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂. Výše uvedený peptid může tedy být vybrán ze skupiny, která se skládá z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. Způsob, popsaný výše, může dále zahrnovat krok podávání antivirového léku, vybraného ze skupiny, která se skládá z nukleosidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nukleotidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nenukleosidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy a inhibitorů proteázy. Peptid, použitý ve výše uvedeném způsobu, může být připojen na nosič nebo může být podáván léku, obsahujícím léčebně vhodný nosič.

V další části prostředek pro inhibici HIV replikace v hostitelských buňkách zahrnuje účinné množství peptidu v amidové formě, která má obecný vzorec XiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce Xi, X₂ a X₃ jsou aminokyseliny a uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂, a kde uvedený prostředek inhibuje HIV replikaci přerušením skládání kapsidy. Je vhodné, aby v peptidech této části sloučenina obecného vzorce X₃ byl glycin. Přednostně je peptid podle této části vybrán ze skupiny, která se skládá ·· • · · · · · • · · · · · « • · · · · · f, ······· v * · · · « • · · · · · · z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. Dále peptid v amidové formě, popsané výše, může mít obecný vzorec X₄X5XiX2X3-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce X₄ a X₅ jsou aminokyseliny a kde jedna nebo dvě aminokyseliny chybí. Tyto prostředky mohou mít například tripeptid obecného vzorce XiX₂X₃, který byl nalezen v aminokyselinové sekvenci kapsidového proteinu HIV. V některých částech jsou tyto peptidy připojeny na nosič a v jiných částech jsou tyto peptidy zabudovány do léku, obsahujícím farmaceuticky vhodný nosič.

V jiném způsobuje zajištěn přístup pro inhibování virové replikace v hostitelské buňce, který zahrnuje podávání uvedeným buňkám účinné množství peptidu v amidové formě, která má obecný vzorec XiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce X_b X₂ a X₃ jsou aminokyseliny a uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂. V tomto způsobu může být peptid vybrán ze skupiny, která se skládá z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. Tento způsob může také zahrnovat krok podání antivirového léku, vybraného ze skupiny, která se skládá z nukleosidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nukleotidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nenukleosidových inhibitorů reverzní transkriptázy a proteázových inhibitorů. Dále peptid, použitý v tomto způsobu, může být připojen na nosič nebo může být podán v léku, obsahujícím léčebně vhodný nosič.

V jiném způsobu je zajištěn přístup pro přerušení skládání virové kapsidy. Tento způsob zahrnuje kontakt buňky s účinným množstvím peptidu v amidové formě, která má vzorec obecný XiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce Xi, X₂ a X₃ jsou aminokyseliny a uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂. Je vhodné, aby peptid, použitý v tomto způsobu, byl vybrán ze skupiny, která se skládá z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. V některých částech je v peptidech podle tohoto způsobu sloučenina obecného vzorce X₃ glycin.

V jiných částech způsob používá peptid v amidové formě, která má obecný vzorec X₄X5XiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce X₄ a X5 jsou aminokyseliny a kde jedna nebo dvě aminokyseliny chybí. Ještě dále způsob může zahrnovat použití tripeptidu obecného vzorce XiX₂X₃, který byl nalezen v aminokyselinové sekvenci proteinu viru.

Často je peptid podle způsobu připojen na nosič nebo je zabudován do léku.

Jsou také zajištěny způsoby určení peptidových činidel. Podle jednoho způsobu je například peptidové činidlo pro zabudování do antivirového léku určeno kontaktem množství buněk, infikovaných virem, s účinným množstvím peptidového činidla, kde uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂, analýzou viru na tvorbu nekompletních kapsid a výběrem peptidového činidla, které vyvolává tvorbu nekompletních kapsid. Tento způsob může zahrnovat analýzu tvorby kapsid, které zahrnuje mikroskopování a vir může být vybrán ze skupiny, která se skládá zHIV-1, HIV-2 a SIV. Dále určené peptidové činidlo může být vybráno ze skupiny, která se skládá z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. V upřednostňované části má peptidové činidlo, použité ve výše uvedeném způsobu, aminokyselinovou sekvenci, která odpovídá aminokyselinové sekvenci p24.

V jiné části je zajištěn způsob pro určení peptidového činidla, které váže virový protein, který zahrnuje poskytnutí virového proteinu, kontaktem virového proteinu s účinným množstvím peptidového činidla, kde uvedené peptidové činidlo není Gly-Pro-Gly-NH₂ a detekcí tvorby komplexu, který obsahuje virový protein a peptidové činidlo. Jak je uvedeno výše, tento způsob může zahrnovat použití virového proteinu, který je z viru, vybraného ze skupiny, která se skládá zHIV-1, HIV-2 a SIV. Dále v některých aspektech je peptidové činidlo vybráno ze skupiny, která se skládá z tripeptidu, oligopeptidu a peptidomimetické látky. Je vhodné, aby ve výše uvedeném způsobu bylo peptidové činidlo vybráno ze skupiny, která se skládá z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. Dále je zajištěn způsob přípravy léku, ve kterém peptidové činidlo, určené výše uvedenými způsoby, je zabudováno do léku.

Je také zajištěn ještě jiný přístup k přípravě léku, který zahrnuje podávání buňce účinné množství peptidu v amidové formě, který má obecný vzorec XiX₂X3-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce Xj, X₂ a X3 jsou aminokyseliny a uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂, detekcí inhibice virové replikace v buňce a zabudování peptidu, který způsobuje inhibici virové replikace, do léku. Tento způsob může zahrnovat použití • · ·· ·

• · · • · · • · · • · ··· · peptidu, který je vybrán ze skupiny, která se skládá z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. Dále výše uvedený způsob může zahrnovat krok zabudování antivirové látky ze skupiny, která se skládá z nukleosidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nukleotidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nenukleosidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy a inhibitorů proteázy do léku. Dále výše uvedený způsob může zahrnovat krok zabudování nosiče do léku.

V jiné části prostředek pro inhibici virové replikace v hostitelské buňce, infikované virem, zahrnuje účinné množství peptidu, který má obecný vzorec XiX₂X₃-NH₂, kde sloučeniny obecného vzorce Xj, X₂ a X₃ jsou aminokyseliny a uvedený peptid není Gly-Pro-Gly-NH₂, kde sloučenina obecného vzorce R je modulační skupina, připojená na karboxylový konec uvedeného peptidu, a sloučenina obecného vzorce R obsahuje amidovou skupinu nebo jinou složku, která má podobný náboj a stérickou velikost a kde uvedený prostředek inhibuje virovou replikaci přerušením skládání virové kapsidy. Tento prostředek může být peptid, vybraný ze skupiny, která se skládá z peptidů, které mají vzorec Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂. Je vhodné, aby v těchto čátech byl X₃ glycin.

Dále výše uvedený prostředek může obsahovat peptid, který má obecný vzorec X4X5X6X7X8X9X10X1X2X3-R, kde sloučeniny obecného vzorce X₄, X₅, X₆, X₇, X₈, X₉ a X10 jsou aminokyseliny a kde jakákoliv jedna, dvě, tři, čtyři, pět, šest nebo sedm aminokyselin chybí, kde sloučenina obecného vzorce R je modulační skupina, připojená na karboxylový konec uvedeného peptidu, a sloučenina obecného vzorce R obsahuje amidovou skupiny nebo jinou složku, která má podobný náboj a stérickou velikost. Přednostně zahrnuje výše uvedený prostředek peptid XjX₂X₃, který byl nalezen v aminokyselinové sekvenci kapsidového proteinu viru.

Vynálezce objevil, že změněné malé peptidy, které mají sekvence, které odpovídají proteinům virové kapsidy a/nebo inhibují virovou infekci přerušením vlastního utváření nukleokapsidy. Takové peptidy jsou užitečné při léčbě virové nemoci, zvláště pacientů postižených HIV/AIDS, a jako preventivní činidla pro pacienty s nebezpečím virové infekce, zvláště HIV infekce, a pro použití v lékařských zařízeních, kde nebezpečí vystavení se viru je významné.

. * - · ·· ·· • · ··· ··** ·· ·»·· · . .

• · · · · ··«· · · · _a·· ··· ··« ·· ·· · ·» ····

V odhalení, uvedeném níže, vynálezce dokazuje, že malé peptidy v amidové formě, které mají sekvenci, která odpovídá virovým proteinům, jako jsou GPG-NH2, GKG-NH₂, cqg-nh₂, rqg-nh₂, kqg-nh₂, alg-nh₂, gvg-nh₂, VGG-NH2, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂, inhibují replikaci virů, jako jsou HIV-1, HIV-2 a SIV, jak bylo naměřeno testy virové nakažlivosti, které sledují množství kapsidového proteinu nebo aktivity reverzní transkriptázy, přítomné v supernatantu při kultivaci. Dále vynálezce předkládá důkaz, že tyto malé peptidy inhibují virovou nakažlivost mechanismem, nezávislým na V3 smyčce, ve fázi následující po DNA, RNA a proteinové syntéze. Obrázky z elektronového mikroskopu HIV částic po působení malých peptidů ukazují, že tato nová třída protivirových činidel přerušuje vlastní skládání kapsidy způsobem odlišným od proteázových inhibitorů. Dále testy vázání in vitro ukazují, že malé peptidy se váží na hlavní kapsidový protein (p24) HIV-1. Protože sekvence některých virových kapsidových proteinů jsou známy, jako členů rodin arenavirů, rotavirů, orbivirů, retrovirů, papillomavirů, adenovirů, herpesvirů, paramyxovirů, mykovirů a hepadnavirů, některé malé peptidy, které odpovídají těmto sekvencím, mohou být vybrány a rychle otestovány, který z nich účinně inhibuje a/nebo zabraňuje virové infekci, použitím testů virové nakažlivosti nebo technik elektronové mikroskopie nebo obou, popsaných zde, nebo pozměnění těchto testů, jak může být zřejmé odborníkům v oboru, udané v předkládaném zveřejnění.

Některé přístupy, připravující biotechnologické prostředky a farmaceutické prostředky, které obsahují malé peptidy a peptidomimetické látky (společně odkazované jako „peptidová činidla“), které odpovídají sekvencím virovým kapsidovým proteinům, jsou uvedeny níže. Ačkoliv upřednostňovaná peptidová činidla jsou tripeptidy, které mají amidovou skupinu na jejich karboxylovém konci,, jako jsou GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, rqg-nh₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂, vynálezce také poskytl prostředky a způsoby inhibice virové replikace v hostitelských buňkách, zahrnující replikaci HIV v hostitelských buňkách, které obsahují peptid v amidové formě, který má obecný vzorec X1X2X3-NH2 nebo obecný vzorec X4X5X1X2X3-NH2, kde sloučeniny obecného vzorce Xi, X₂, X3, X4 a X5 jsou jakákoliv aminokyselina, kde jedna nebo dvě aminokyseliny mohou chybět. Upřednostňované části mají glycinový zbytek jako sloučeninu obecného vzorce X3.

V některých částech jsou peptidová činidla poskytnuta v monomerické formě; v jiných jsou peptidová činidla poskytnuta v multimerní formě nebo v multimerizované formě.

V některých částech jsou použita také na nosič vázaná peptidová činidla. Farmaceutické • · · fcfcfc fcfc · · • ♦ · · · · • fcfc · fc · ······· · fc • · fcfcfc ·· · fcfc fcfcfcfc prostředky, obsahující peptidová činidla, jsou podávány jako léčebné nebo profýlaktické prostředky nebo obojí pro léčbu a/nebo prevenci virových nemocí, přednostně HIV infekce. V některých částech jsou podávány farmaceutické prostředky, které obsahují peptidová činidla ve spojení s další antivirovou léčbou, zahrnující nukleosídová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy, nukleotidová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy, nenukleosidová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy a proteázové inhibitory. Vynálezce dále poskytl důkaz, že malé peptidy jsou rezistentní ke kyselé hydrolýze, takže významné množství malého peptidu, jestliže je podáno testovanému jedinci, se dostane do krve, plasmy a tkání orgánů, a že podání velkých dávek malých peptidů testovanému jedinci je relativně netoxické.

Dále vynálezce zveřejnil několik způsobů určení peptidového činidla, které inhibuje nebo zabraňuje virové replikaci nebo přerušuje složení virové kapsidy. Podle jednoho přístupu účinné množství peptidového činidla je smícháno s buňkami infikovanými virem a buňky jsou analyzovány na přítomnost virové replikace nebo přítomnost virových produktů. Dále použitím elektronové mikroskopie může být snadno určena schopnost peptidového činidla přerušit skládání kapsidy. Dále jsou zveřejněny způsoby, které určují peptidového činidlo, které se váže na kapsidový protein (např. p24) a které tím přerušuje skládání kapsidy a tak virovou replikaci. Proto kapsidový protein (např. p24) je smíchán s peptidovým činidlem, například peptidem v amidové formě, který má obecný vzorec X_b X₂, X3, kde sloučeniny obecného vzorce Xj, X₂ a X3 jsou jakékoliv aminokyseliny, a je určen komplex, obsahující kapsidový protein (např. p24) vázaný na peptidové činidlo. V předkládaném zveřejnění je uvedena také reakční směs, která má virový protein (např. p24) a peptidové činidlo, a biomolekulární komplex, který má virový protein (např. p24) připojen na peptidové činidlo.

Byla testována amidická forma malých peptidů, uvedených níže v tabulce 1. Mnoho těchto malých peptidů bylo vybráno a syntetizováno, protože buď zcela nebo částečně odpovídají sekvencím virových proteinů HIV a/nebo SIV. Malé peptidy v tabulce 1 byly syntetizovány podle způsobu, uvedeném níže v příkladě 1, ale mohou být samozřejmě syntetizovány jakýmkoliv způsobem známým v oboru.

·· · tabulka 1 aminokyselinová sekvence testovaných peptidů

Leu-Lys-Ala (LKA)	Arg-Gln-Gly (RQG)
Iso-Leu-Lys (ILK)	Lys-Gln-Gly (KQG)
Gly-Pro-Gln (GPQ)	Ala-Leu-Gly (ALG)
Gly-His-Lys (GHK)	Gly-Val-Gly (GVG)
Gly-Lys-Gly (GKG)	Val-Gly-Gly (VGG)
Ala-Cys-Gln (ACQ)	Ala-Ser-Gly (ASG)
Cys-Gln-Gly (CQG)	Ser-Leu-Gly (SLG)
Ala-Arg-Val (ARV)	Ser Pro-Thr (SPT)
Lys-Ala-Arg (KAR)	Gly-Ala-Thr (GAT)
His-Lys-Ala (HKA)	Lys-Ala-Leu (KAL)
Gly-Pro-Gly (GPG)
použité zkratky:
Leu-leucin	Lys-lysin
Gln-glutamin	Ala-alanin
His-histidin	Ileu-isoleucin
Cys-cystein	Gly-glycin
Pro-prolin	Arg-arginin
Val-valin	Thr-threonin
Ser-serin

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obrázek 1 je graf, znázorňující výsledky ze studie nakažlivosti HIV, provedené na HUT78 buňkách.

Obrázek 2 je soubor elektronových mikrofotografií neošetřených HIV částic.

Obrázek 3 je soubor elektronových mikrofotografií HIV částic, které byly v kontaktu s proteázovým inhibitorem Ritonavir.

Obrázek 4 je soubor elektronových mikrofotografií neošetřených HIV částic, které byly v kontaktu s GPG-NH2.

Obrázek 5 znázorňuje uspořádání proteinové sekvence, odpovídající karboxylovému konci HIV 1 p24 proteinu (zbytky 146 až 231) a proteinové sekvenci HIV-2, SIV, viru ·· · «0 • 0 « 0 • « ·

0·>

0« •0 000· · · « 0 0

0 0 0 0 0 · «00

0« 0

Rousova sarkomu (RSV), lidských T buněk leukémického viru-typ 1 (HTLV-1), myšího prsního tumorového viru (MMTV), Mason-Pfizerova opičího viru (MPMV) a myšího leukémického Moloneyova viru (MMLV). Čára znázorňuje hlavní homologní oblast (MHR).

Obrázek 6 je graf p24 (pg/ml), detekovaný v supernatantu buněk, infikovaných HIV, které byly kultivovány v přítomnosti a nepřítomnosti GPG-NH2, Ritonaviru (Rito), AZT nebo kombinaci těchto činidel.

Obrázek 7 znázorňuje destičku pro tenkovrstvou chromatografii, na které jsou oddělené, ne na proteinech vázané radioaktivně značené látky ze vzorků králičí moči a králičí plazmy (rp) po orálním podání ¹⁴C-GPG-NH2, stejně jako lidské plasmy (Hp), inkubované s ¹⁴C-GPG-NH2; čas odebírání vzorků je připojen a sloučeniny obecného vzorce R1 až R13 slouží k určení pozice identifikovaných radioaktivních látek.

Obrázek 8 je destička pro tenkovrstvou chromatografii, která má na sobě oddělené ¹⁴C-GPG-NH2, která byla zpracována 0,1 A HCI a 50 mM KC1 a vzorky byly odebírány 24 hodin; čísla znázorňují čas působení kyseliny a sloučenina obecného vzorce R slouží k určení pozice identifikového ¹⁴C-GPG-NH2.

Obrázek 9 je graf segmentu ¹⁴C-GPG-NH₂ a jeho metabolitů v králičí krvi.

Obrázek 10 je graf odstranění radioaktivity z plasmové frakce králíků, která byla podána orálně jako ¹⁴C-GPG-NH₂.

Obrázek 11 ukazuje nestrávené a rozštěpené proteiny, které byly rozděleny 10% SDS/PAGE; 8-f3 se týká třetí frakce, odebrané ze vzorku po 8 hodinách po podání ¹⁴C-GPG-NH2, 8-f 1 se týká první frakce, odebrané ze vzorku po 8 hodinách po podání ¹⁴C-GPG-NH2, 4-fl 3 se týká třetí frakce, odebrané ze vzorku po 4 hodinách po podání ¹⁴C-GPG-NH2, 4-fl se týká první frakce, odebrané ze vzorku po 4 hodinách po podání ¹⁴C-GPG-NH2, 8 h, 4 h, 2 h a 1 h se týkají času, ve kterém vzorky byly odebrány po podání ¹⁴C-GPG-NH₂ a BI až B4 slouží k určení pozice identifikovaných proteinů.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1

V tomto příkladě jsou popsány přístupy, použité k získání malých peptidů, uvedených výše. Některé tripeptidy byly chemicky syntetizovány v automatickém peptidovém syntetizátoru (Syro, Multisyntech, Tubigen, Germany). Syntéza běžela za použití 9-fluorenylmethoxykarbonylem (fmoc) chráněných aminokyselin (Milligen, Bedford, • · · ·* * »» ·» • * * * 4 · • ♦ * * · 4 ·«»«··· · · • · * · « *· · »· ··«·

MA) podle standardního postupu. Všechny peptidy byly lyofilizovány a pak rozpuštěny ve vhodné koncentraci ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Peptidy byly analyzovány vysokotlakou kapalnou chromatografií s reverzní fází (RP-HPLC) s použitím PepS-15 Cl8 kolony (Pharmacia, Uppsala, Sweden).

V mnoha částech byly použity peptidy, které mají modulační skupinu, připojenou na karboxylový konec peptidu. („modifikované peptidy“). V některých případech byly modifikované peptidy vytvořeny substitucí amino skupiny na hydroxylový zbytek přirozeně přítomný v koncové karboxylové skupině peptidu. To znamená, že peptidy byly syntetizovány tak, aby namísto koncového COOH měly CO-NH₂. Například upřednostňované malé peptidy zahrnují glycyl-lysyl-glycinamid (GKG-NH₂), cystyl-glutaminyl-glycinamid (CQG-NH₂), glycyl-prolyl-glycinamid (GPG-NH₂), arginyl-glutaminyl-glycinamid (RQG-NH₂), lysyl-glutaminyl-glycinamid (KQG-NH₂), alanyl-leucyl-glycinamid (ALG-NH₂), glycyl-valyl-glycinamid (GVG-NH₂), valyl-glycyl-glycinamid (VGG-NH₂), alanyl-seryl-glycinamid (ASG-NH₂), seryl-leucyl-glycinamid (SLG-NH₂) a seryl-prolyl-threoninamid (SPT-NH₂). Kromě této syntézy bylo mnoho tripeptidů také koupeno od Bachem AG, Švýcarsko, což také zahrnuje GKG-NH₂, CQG-NH₂ a GPG-NH₂.

V toxikologických pokusech a pokusech, které hodnotí vlivy léčby malými peptidy ve spojení s obvyklými antivirovými terapiemi, byly peptidy získány následovně. Pro počáteční pokusy byla syntéza peptidů na pevné fázi provedena použitím Applied Biosystems 430A peptidového syntetizátoru (Applied Biosystems, Foster City, CA). Každá syntéza využívala p-methylbenzylhydrylaminovou pryskyřicovou pevnou fázi (Peptide International, Louisville, KY), poskytující amid pro karboxylový konec, když jsou peptidy odštěpeny z pevného nosiče kyselou hydrolýzou. Všechny aminokyseliny pro použití v syntéze obsahovaly t-butylkarbonylové skupiny, chránící cc-NH₂ skupinu a byly získány od Novabiochem AG, Švýcarsko. Chránící skupiny byly odstraněny ze syntetizovaných peptidů, které byly odštěpeny z pevného pryskyřicového nosiče reakcí s trifluoromethansulfonovou kyselinou, kterou se získávají peptidy s amino (-NH₂) modulační skupinou místo hydroxylové (-OH) skupiny na karboxylovém konci. Před použitím jsou peptidy purifikovány vysokotlakou kapalinovou chromatografií s reverzní fází a sekvenovány na Applied Biosystems 473A peptidovém sekvenátoru. Dále tripeptid GPG, který má buď amidový (CO-NH₂; GPG-NH₂) nebo karboxylový (COOH; GPG-OH) konec, byl zakoupen od Bachem AG, Švýcarsko.

• ·

Ve vysvětlení, uvedeném níže, jsou popsány některé testy, které byly použity pro určení malých peptidů, které inhibují HIV-1, HIV-2 a SIV infekce.

Testy nakažlivosti HIV a SIV - peptidy, připravené podle příkladu 1, byly použity při některých HIV-1, HIV-2 a SIV infekčních testech. Účinnost HIV-1, HIV-2 a SIV infekce byla sledována aktivitou reverzní transkriptázy, koncentrací proteinu p24 v buněčném supernatantu a mikroskopickým určením tvorby HIV-1 syncytia.

V počátečních pokusech byly některé tripeptidy vybrány pro schopnost inhibovat HIV-1, HIV-2 a SIV infekce v H9 buňkách. Jakmile byly tripeptidové inhibitory určeny, byly provedeny více specifické testy k určení vlivu různých koncentrací vybraných tripeptidů a kombinací vlivů (např. použití více než jednoho tripeptidu dohromady).

V příkladě, uvedeném níže, je uveden postup, který byl použit pro vybrání některých tripeptidů pro jejich schopnost inhibovat HIV-1, HIV-2 a SIV infekce.

Příklad 2

V tomto příkladě jsou uvedeny způsoby, které byly použity pro analyzování schopnosti různých tripeptidů inhibovat HIV-1, HIV-2 a SIV infekce. V pokusech 1 a 2 bylo přibližně 200 000 H9 buněk infikováno HIV-1, HIV-2 nebo SIV při 25 TCID50 ke zjištění inhibičního účinku následujících syntetizovaných tripeptidů LKA-NH2, ILK-NH₂, GPQ-NH₂, GHK-NH2, GKG-NH2, ACQ-NH₂, CQG-NH₂, ARV-NH₂, KAR-NH₂, HKA-NH2, GAT-NH₂, KAL-NH2 a GPG-NH₂. H9 buňky byly tedy resuspendovány s nebo bez různých peptidů (přibližně 100 μΜ) v 1 ml RPMI 1640 média s 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS), penicilínem (100 u/ml) a streptomycinem (100 u/ml), všechno dostupné od GIBCO, a Polybrenem ( g/ml), dostupným od Sigmy. Potom byly přidány viry při 25 TCID50 v objemu 20 až 30 μΐ. Buňky byly inkubovány s viry při 37 °C 1 hod, pak byly odstředěny při 170xg 7 minut. Buňky pak byly promyty třikrát RPMI médiem bez peptidů při pokojové teplotě a odstředěny při 170xg 7 minut, jak je uvedeno výše. Po konečném promytí byly buňky resusupendovány v RPMI médiu, obsahujícím peptidy, na 24 jamkové destičce (Costar Corporation) a umístěny do 37 °C s 5 % CO₂ s vlhkostí.

Kultivační supernatanty byly shromážděny a analyzovány, když médium bylo vyměněno 4, 7, 10 a 14 dní po infekci. Ke sledování replikace viru byla testována aktivita reverzní transkriptázy (RT) v supernatantu použitím komerčně dostupného Lenti-RT aktivity kitu (Cavidi Tech, Uppsala, Sweden). Množství RT bylo určeno s pomocí regresní křivky standardů. Výsledky jsou znázorněny jako hodnoty absorbance (OD) a vyšší absorbance ukazuje vyšší koncentraci proteinů a větší virovou infekci.

• «0 00 0 00 00 • 000 000 0 ♦ 0 0

Tvorba syncytia byla také sledována mikroskopickým sledováním. Tabulky 2 a 3 ukazují hodnoty absorbance buněčných kultivačních supernatantů pokusů 1 a 2.

V pokusu 3 (tabulka 4) bylo přibližně200 000 H9 buněk infikováno HIV-1, HIV-2 nebo SIV při 25 TCID50 ke zjištění inhibičního účinku různých koncentrací peptidů GPG-NH2, GKG-NH2 a CQG-NH2 a kombinace těchto peptidů (uvedená koncentrace odpovídala koncentraci každého tripeptidu). Jak je uvedeno výše, H9 buňky byly resuspendovány s nebo bez různých peptidů v různých koncentracích v 1 ml média RPMI 1640 s 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS), penicilínem (100 u/ml) a streptomycinem (100 u/ml) a Polybrenem ( g/ml). Potom byly přidány viry při 25 TCID50 v objemu 20 až 30 μΐ. Buňky byly inkubovány s uvedenými viry při 37 °C 1 hod, pak byly odstředěny při 170xg 7 minut. Buňky pak byly promyty třikrát RPMI médiem bez peptidů při pokojové teplotě a odstředěny při 170xg 7 minut, jak je uvedeno výše. Po konečném promytí byly buňky resustipendovány v RPMI médiu, obsahujícím peptidy, na 24 jamkové destičce (Costar Corporation) a umístěny do 37 °C s 5 % CO₂ s vlhkostí.

Kultivační supernatanty byly shromážděny a analyzovány, když médium bylo vyměněno 4, 7, 10 a 14 dní po infekci. Jak je uvedeno výše, replikace viru byla sledována detekcí aktivity reverzní transkriptázy (RT) v supernatantu použitím komerčně dostupného Lenti-RT aktivity kitu (Cavidi Tech). Množství RT bylo určeno s pomocí regresní křivky standardů. Výsledky jsou znázorněny jako hodnoty absorbance (OD) a vyšší absorbance ukazuje vyšší koncentraci proteinů a větší virovou infekci. Tabulka 4 ukazuje hodnoty absorbance buněčných kultivačních supernatantů pokusu 3.

V pokusu 4 (tabulka 5) bylo přibližně 200 000 H9 buněk infikováno HIV-1, HIV-2 nebo SIV při 25 TCID50 ke zjištění inhibičního účinku různých koncentrací peptidů GPG-NH2, GKG-NH2 a CQG-NH2 a kombinace těchto peptidů (uvedená koncentrace odpovídala celkové koncentraci tripeptidu). Jak je uvedeno výše, H9 buňky byly resuspendovány s nebo bez různých peptidů v různých koncentracích v 1 ml média RPMI 1640 s 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS), penicilínem (100 u/ml) a streptomycinem (100 u/ml) a Polybrenem ( g/ml). Potom byly přidány viry při 25 TCID50 v objemu 20 až 30 μΐ. Buňky byly inkubovány s uvedenými viry při 37 °C 1 hod, pak byly odstředěny při 170xg 7 minut. Buňky pak byly promyty třikrát RPMI médiem bez peptidů při pokojové teplotě a odstředěny při 170xg 7 minut, jak je uvedeno výše. Po konečném promytí byly buňky resusflpendovány v RPMI • ·· ·· · ·· ·· • · · · · · · · · · · médiu, obsahujícím peptidy, na 24 jamkové destičce (Costar Corporation) a umístěny do °C s 5 % CO2 s vlhkostí.

Kultivační supernatanty byly shromážděny, když médium bylo vyměněno 4, 7, 10 a 14 dní po infekci. Jak je uvedeno výše, replikace viru byla sledována detekcí aktivity reverzní transkriptázy (RT) v supernatantu použitím Lenti-RT aktivity kitu (Cavidi Tech). Množství RT bylo určeno s pomocí regresní křivky standardů. Výsledky jsou znázorněny jako hodnoty absorbance (OD) a vyšší absorbance ukazuje vyšší koncentraci proteinů a větší virovou infekci. Tabulka 5 ukazuje hodnoty absorbance buněčných kultivačních supernatantů pokusu 4. Supernatant, který byl analyzován 11. den, byl zředěn 5ti-násobně, takže detekce mohla být provedena přesněji.

V pokusu 5 (tabulka 6) bylo přibližně 200 000 H9 buněk infikováno HIV-1, HIV-2 nebo SIV při 25 TCID50 ke zjištění inhibičního účinku různých koncentrací peptidů GPG-NH2, GKG-NH2 a CQG-NH2 a kombinace těchto peptidů. Jak je uvedeno výše, H9 buňky byly resuspendovány s nebo bez různých peptidů v různých koncentracích v 1 ml média RPMI 1640 s 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS), penicilínem (100 u/ml) a streptomycinem (100 u/ml) a Polybrenem ( g/ml). Potom byly přidány viry při 25 TCID50 v objemu 20 až 30 μΐ. Buňky byly inkubovány s uvedenými viry při 37 °C 1 hod, pak byly odstředěny při 170xg 7 minut. Buňky pak byly promyty třikrát RPMI médiem bez peptidů při pokojové teplotě a odstředěny při 170xg 7 minut, jak je uvedeno výše. Po konečném promytí byly buňky resusupendovány v RPMI médiu, obsahujícím peptidy, na 24 jamkové destičce (Costar Corporation) a umístěny do 37 °C s 5 % CO₂ s vlhkostí.

Kultivační supernatanty byly shromážděny, když médium bylo vyměněno 4, 7, 10 a 14 dní po infekci. Replikace každého viru byla sledována detekcí přítomnosti p24 v supernatantu. HIV p24 antigen byl určen použitím komerčně dostupného HIV p24 antigen detekčním kitem (Abbott). Výsledky jsou znázorněny jako hodnoty absorbance (OD) a vyšší absorbance ukazuje vyšší koncentraci proteinů a větší virovou infekci.

V některých případech byla připravena řada ředění supernatantů, aby byla přesněji detekována koncentrace p24. Tabulka 6 ukazuje hodnoty absorbance buněčných kultivačních supernatantů pokusu 5. Jak je pojednáno podrobně níže, bylo objeveno, že tripeptidy GPG-NH2, GKG-NH2 a CQG-NH2 a kombinace těchto peptidů účinně inhibují HIV-1, HIV-2 a SIV infekci.

V pokusu 6 (tabulka 7 a tabulka 8) bylo přibližně 200 000 HUT78 buněk infikováno HIV-1 při 25 TCID50 ke zjištění inhibičního účinku GPG-NH2, RQC-NH₂, KQG-NH2,

ΦΦ φφ φ φφ φφ φ φ · · · · ♦ φ φφφ φφφφφφφ φ « φφφφφ φφ φ φφφφφ

ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂. HUT buňky byly resuspendovány v 1 ml média RPMI 1640 s 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS, GIBCO), penicilínem (100 u/ml) a streptomycinem (lOOu/ml) a Polybrenem (Sigma, 2 pg/ml) s nebo bez přítomnosti různých malých peptidů (100 μΜ), uvedených výše. Potom byly přidány viry HIV-1 při 25 TCID₅₀v objemu 20 μί. Buňky byly inkubovány s viry při 37 °C 1 hodinu a později byly odstředěny při 170xg sedm minut. Buňky pak byly promyty třikrát RPMI médiem bez peptidů při pokojové teplotě a odstředěny při 170xg sedm minut, jak je uvedeno výše. Po konečném promytí byly buňky resusupendovány v RPMI médiu, obsahujícím peptidy, na 24 jamkové destičce (Costar Corporation) a umístěny do 37 °C s 5 % CO₂s vlhkostí. Kultivační supernatanty byly shromážděny, když médium bylo vyměněno 4, 7, a 11 den po infekci a produkce virového p24 byla sledována HIV-1 p24 ELISA kitem (Abbott Laboratories, North Chicago, USA). Jak je pojednáno níže, bylo objeveno, že malé peptidy RQC-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH2 účinně inhibují HIV-1 infekci.

tabulka 2 pokus 1 - (peptidy připravené na místě) den 7 RT denlORT

tripeptid (100 M)	HIV-1	HIV-2	SIV	HIV-1	HIV-2	SIV	HIV-1 syncytium
LKA-NH2	0,568*	3,649	3,577	2,429	2,769	2,452	pos
ILK-NH2	0,365	3,467	3,180	2,033	2,791	2,255	pos
GPQ-NH₂	0,204	3,692	1,542	1,965	2,734	2,176	pos
GHK-NH₂	0,289	3,522	0,097	2,151	2,931	2,384	pos
GKG-NH₂	0,080	0,160	0,421	0,074	0,147	0,099	neg
ACQ-NHj	0,117	3,418	1,241	0,904	2,753	2,746	pos
CQG-NH₂	0,091	0,217	0,747	0,108	0,296	0,110	neg
ARV-NH₂	0,156	3,380	0,210	1,528	3,003	1,172	pos
KAR-NH2	0,380	3,419	0,266	2,779	2,640	1,722	pos
HKA-NHz	0,312	3,408	0,416	2,546	2,669	2,520	pos
GAT-NH2	0,116	3,461	0,892	1,565	2,835	2,343	pos
KAL-NH2	0,246	3,372	1,091	1,995	2,749	2,524	pos

« ·· ·· · ·· ·· • · · · * · · ♦··· ··· · · · · · » · »· ··· ······· · · » · · · · · · · · · 4 4 · 4 · · ······

gpg-nh₂	0,068	0,735	0,138	0,074	0,145	0,103	neg
kontrola bez peptidu	0,251	1,675	1,227	2,217	2,657	3,030	pos

hodnoty znázorňují optickou hustotu (OD) tabulka 3 pokus 2 - (peptidy připravené na místě) den 7 RT denlORT

tripeptid (100 M)	HIV-1	HIV-2	SIV	HIV-1	HIV-2	SIV	HIV-1 syncytium
lka-nh₂	0,894*	1,689	0,724	2,989	2,637	2,797	pos
ilk-nh₂	0,581	1,692	0,515	2,950	2,557	2,632	pos
gpq-nh₂	0,884	1,511	0,574	2,848	2,382	2,319	pos
ghk-nh₂	0,829	1,936	0,396	3,013	2,418	2,394	pos
gkg-nh₂	0,145	0,283	0,116	0,345	1,637	0,204	neg
acq-nh₂	0,606	1,661	0,612	2,831	2,505	2,606	pos
cqg-nh₂	0,143	1,241	0,120	1,546	2,501	1,761	neg
arv-nh₂	0,618	2,237	0,212	2,829	2,628	3,004	pos
kar-nh₂	0,753	1,904	1,034	2,928	2,742	2,672	pos
hka-nh₂	1,081	1,678	0,455	2,794	2,560	2,623	pos
gat-nh₂	0,776	1,707	0,572	2,800	2,565	2,776	pos
kal-nh₂	0,999	1,757	0,511	2,791	2,383	2,663	pos
gpg-nh₂	0,090	0,093	0,067	0,143	0,575	0,139	neg
kontrola bez peptidu	0,809	1,774	0,578	2,711	2,528	2,911	pos

hodnoty znázorňují optickou hustotu (OD)

tabulka 4 pokus 3 - (peptidy získané od Bachemu) den 7 RT denlORT

tripeptid	HIV-1	HIV-2	SIV	HIV-1	HIV-2	SIV
kontrola bez peptidu	1,558*	1,718	1,527	2,521	2,716	2,091
gpg-nh₂ 5 μΜ	1,527	1,735	0,753	2,398	2,329	2,201
gpg-nh₂ 20 μΜ	0,239	0,252	0,197	0,692	1,305	0,779
gkg-nh₂ 5 μΜ	1,587	1,769	0,271	1,683	2,510	1,709
gkg-nh₂ 20 μΜ	1,616	1,759	1,531	2,036	2,646	2,482
gkg-nh₂ 100 μΜ	0,823	0,828	1,005	1,520	1,947	1,382
cqg-nh₂ 5 μΜ	1,547	1,760	1,159	2,2028	2,466	2,821
cqg-nh₂ 20 μΜ	1,578	1,748	0,615	1,484	2,721	2,158
cqg-nh₂ 100 μΜ	1,520	1,715	0,795	2,014	2,815	2,286
GPG-NH₂ + gkg-nh₂ 5 μΜ	1,430	1,738	1,131	1,998	2,770	2,131
gpg-nh₂ + gkg-nh₂ 20 μΜ	0,129	0,244	0,123	0,164	1,110	0,309
GPG-NH₂ + cqg-nh₂ 5 μΜ	1,605	1,749	1,737	1,866	2,814	2,206
gpg-nh₂ + cqg-nh₂ 20 μΜ	0,212	0,194	0,523	0,397	1,172	0,910
GKG-NH₂ + cqg-nh₂ 5 μΜ	1,684	1,717	1,725	1,848	2,778	2,949
GKG-NH₂ + cqg-nh₂ 20 μΜ	1,490	1,792	1,670	1,891	2,799	2,889

• ·

gpg-nh₂ + gkg-nh₂ 5 μΜ	1,652	1,743	1,628	1,999	2,777	2,659
gpg-nh₂ + gkg-nh₂ 20 μΜ	0,165	0,119	0,317	0,307	0,447	0,389

iii ' ¹ hodnoty znázorňují optickou hustotu (OD) tabulka 5 pokus 4 - (peptidy získané od Bachemu) den 7 RT den 10 RT

tripeptid	HIV-1	HIV-1 (1:5)
kontrola bez peptidu	3,288*	1,681
GPG	5 μΜ	2,970	1,107
GPG	15 μΜ	0,894	0,095
GPG	45 μΜ	0,177	0,034
GPG	100 μΜ	0,150	0,033
GKG	5 μΜ	3,303	1,287
GKG	15 μΜ	3,551	1,530
GKG	45 μΜ	3,126	0,410
CQG	5 μΜ	2,991	1,459
CQG	15 μΜ	2,726	1,413
CQG	45 μΜ	3,124	1,364
gpg-nh₂ + gkg-nh₂ 5 μΜ	2,266	0,438
gpg-nh₂ + gkg-nh₂ 15 μΜ	0,216	0,044
gpg-nh₂ + cqg-nh₂ 5 μΜ	2,793	0,752
gpg-nh₂ + cqg-nh₂ 15 μΜ	0,934	0,110
GkG-NH₂ + CQG-NH₂ 5 μΜ	3,534	1,305

ckg-nh₂ + cqg-nh₂ 15 μΜ	3,355	2,013
gpg-nh₂ + gkg-nh₂+ cqg-nh₂ 5 μΜ	2,005	0,545
gpg-nh₂ + gkg-nh₂+ cqg-nh₂ 15 μΜ	0,851	0,110

hodnoty znázorňují optickou hustotu (OD) tabulka 6 pokus 5 - (peptidy připravené na místě) tripeptid (μΜ) p24 (OD) p24 (pg/ml) snížení (%)

den 7 HIV-1
kontrola bez peptidu	l,093xl0²	3,94xl0⁴	0
GPG-NH₂ (20)	1,159	4,21xl0²	99
GPG-NH₂ (100)	0,508	l,60xl0²	100
GPG-NH₂ (300)	0,557	l,80xl0²	100
GKG-NH₂ (100)	0,566x10’	l,83xl0³	95
GKG-NH₂ (300)	1,08	3,88xl0²	99
GKG-NH₂ (1000)	0,79	2,73xl0²	100
CQG-NH₂ (100)	1,51x10’	5,62xl0³	86
CQG-NH₂ (300)	0,59x10’	l,92xl0³	95
CQG-NH₂ (1000)	0,91	3,20xl0²	99
kombinovaný*	0,65	2,17xl0²	100
den 14 HIV-1
kontrola bez peptidu	0,46x10⁴	l,41xl0⁶	0
GPG-NH₂ (20)	1,12x10¹	4,06x10⁴	97
GPG-NH₂ (100)	1,76	6,63xl0²	100
GPG-NH₂ (300)	1,35	4,98xl0²	100
GKG-NH₂ (100)	l,48xl0³	5,51xl0⁵	61
GKG-NH₂ (300)	0,33x10’	8,70xl0²	100
GKG-NH₂ (1000)	0,11x10’	2,40x10²	100
CQG-NH₂ (100)	0,48x10⁴	l,47xl0⁶	0
CQG-NH₂ (300)	Ο,ΙΙχΙΟ²	2,40xl0³	100

CQG-NH₂ (1000)	Ο,ΠχΙΟ¹	2,80xl0²	100
kombinovaný*	1,01	3,61xl0²	100

*100 μΜ GPG-NH₂ + GKG-NH₂ + CQG-NH₂ *hodnoty znázorňují optickou hustotu (OD) tabulka 7 pokus 6 - (peptidy připravené na místě) tripeptid (100 μΜ) p24 (pg/ml) snížení (%)

den 7 HIV-1
kontrola bez peptidů	2,0x10⁴	0
gpg-nh₂	5,6xl0²	97
rqg-nh₂	l,13xl0²	99
kqg-nh₂	l,54xl0²	99
alg-nh₂	0,42xl0²	100
gvg-nh₂	l,5xl0⁴	25
vgg-nh₂	1,0x10⁴	50
asg-nh₂	l,5xl0⁴	25
slg-nh₂	l,14xl0²	99
spt-nh₂	l,5xl0⁴	25

Malé peptidy inhibují a/nebo zabraňují HIV-1, HIV-2 a SIV infekci - U malých peptidů, uvedených v tabulce 1, GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂, které inhibují a/nebo předcházejí HIV-1 infekci, a GKG-NH₂, CQG-NH₂ a GPG-NH₂ bylo také ukázáno, že inhibují nebo zabraňují HIV-2 a SIV infekci. Mělo by být zřejmé, že malé peptidy RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLGNH₂ a SPT-NH₂ nebyly analyzovány na schopnost zabraňovat nebo inhibovat HIV-2 nebo SIV infekci, ale, na základě skutečnosti, že HIV-2 a SIV mají významnou homologii v kapsidové proteinové struktuře v oblasti, které malé peptidy GPG-NH₂, cqg-nh₂, rqg-nh₂, kqg-nh₂, alg-nh₂, gvg-nh₂, vgg-nh₂, asg-nh₂, slg-NH₂ a SPT-NH₂ odpovídají, je inhibice nebo zabránění HIV-2 nebo SIV infekce očekáváno.

• φφ φφ φ φφ φφ • · · φ φφφ φφφφ φφφ φφφφ φφ φ φ φ φφφ φφφφφφφ φ φ φφφ φφ φ φφφ φφφ φφ φφ φ φφ φφφφ

Výsledky z pokusů 1 až 6 (ukázané v tabulkách 2 až 7 a obrázku 1) ukazují, že malé peptidy v amidové formě, které odpovídají virové kapsidové proteinové sekvenci, která má glycin jako karboxykoncovou aminokyselinu, , GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂ a SLG-NH₂, potlačují nebo zabraňují HIV infekci. Peptidy, které obsahují karboxykoncový alaninový zbytek, Leu-Lys-Ala (LKA) a His-Lys-Ala (HKA), nebo karboxykoncový glutaminový zbytek, Gly-Pro-Gln (GPQ) a Ala-Cys-Gln (ACQ) nezabraňují HIV infekci. Nicméně glycin na aminokonci nebyl inhibiční faktor, protože peptidy s aminokoncovým glycinovým zbytkem, Gly-Pro-Gln (GPQ), Gly-His-Lys (GHK) a Gly-Ala-Thr (GAT) nebyly úspěšné při zabránění infekce a tvorby HIV-1 syncytia. Dále peptidy s nenabitými polárními postraními řetězci, jako jsou Gly-Pro-Gln (GPQ), Ala-Cys-Gln (ACQ) a Gly-Ala-Thr (GAT), nebo nepolárními postraními řetězci na karboxylovém konci, jako jsou Ala-Arg-Val (ARV), His-Lys-Ala (HKA) a Lys-Ala-Leu (KAL) a Leu-Lys-Ala (LKA) nebyly úspěšné při zabránění infekce. Ačkoliv glycinový zbytek na karboxylovém konci se jeví být ve spojení s inhibici HIV a SIV infekce, jiné aminokyselinové zbytky nebo modifikované aminokyselinové zbytky na karboxylovém konci malého peptidu mohou také potlačovat HIV a SIV infekci. Například bylo ukázáno, že Ser-Pro-Thr (SPT) inhibuje nebo zabraňuje HIV-1 infekci.

V některých pokusech se zdá, že účinek malých peptidů na HIV-1, HIV-2 a SIV infekci byl závislý na koncentraci a čase. Tak nízké koncentrace GKG-NH₂, CQG-NH₂ a GPG-NH₂ a jejich kombinace jako 5 μΜ a 20 μΜ se ukázaly být účinné při redukci HIV-1, HIV-2 a SIV infekce. Nicméně při 100 μΜ nebo vyšší tripeptidy GKG-NH₂, CQG-NH₂a GPG-NH₂ a jejich kombinace účinněji inhibovaly HIV-1, HIV-2 a SIV infekci. Jak je ukázáno v tabulce 6, 300 μΜ GKG-NH₂ a CQG-NH₂ snižovalo HIV-1 nakažlivost téměř 100%, jak bylo detekováno přítomností p24 antigenu v buněčném supernatantu. Procentní snížení, uspořádané v tabulce 6, byla vypočítána dělením množství p24 antigenu, detekovaného v peptidem ošetřených vzorcích, množstvím p24 antigenu, detekovaného v kontrolních vzorcích, násobením tohoto podílu 100 pro získání procent a odečtením procentového podílu od 100 %. Například procenta snížení, vykázané GPG-NH₂, je:

5.6x10²x100 = 3 % a 2,0x10⁴

100 %-3 % = 97 % • ·· »♦ 0 ·9 00 • · · 0 · · · ···· • ··· ······· · · ·· 0 · 0 >·« • · · · · ·0··0

V prvních pěti pokusech (tabulky 2 až 6) bylo ukázáno, že tripeptidy GKG-NH₂, CQG-NH₂ a GPG-NH₂ a jejich kombinace inhibují HIV-1, HIV-2 a SIV infekci při koncentraci rovné nebo vyšší než 5μΜ.

V šestém pokusu (tabulka 7 a obrázek 1) bylo ukázáno, že malé peptidy RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂ účinně inhibují a/nebo zabraňují HIV-1 infekci při 100 μΜ. Jak je ukázáno v tabulce 7, snížení virů blízké 100 %, jak bylo měřeno množstvím kapsidového proteinu p24 v supernatantu, bylo dosaženo s malými peptidy RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂ a SLG-NH₂. Procentní snížení p24, ukázané v tabulce 7, bylo vypočítáno tak, jak je popsáno pro tabulku 6 výše. Ačkoliv GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂ a SPT-NH₂ byly při 100 μΜ méně účinné při inhibici nebo zabraňování HIV-1 infekce, věří se, že tripeptidy jsou účinnější při vyšších koncentracích. Data, získaná v pokusech 1 až 6, ukázaná v tabulkách 2 až 7 a obrázku 1, ukazují, že malé peptidy, které odpovídají sekvencím virového kapsidového proteinu, jsou účinná protivirová činidla v široké škále koncentrací.

Aby se lépe porozumělo malými peptidy zprostředkované virové inhibici, bylo provedeno několik studií DNA syntézy, RNA syntézy a proteinové exprese. Tyto pokusy jsou diskutovány níže.

Malé peptidy inhibují virovou nakažlivost ve stádiu, následující po DNA syntéze, RNA syntéze a proteinové expresi - Ke studiu provirové DNA a virové RNA syntézy, byly připraveny DNA a RNA z HIV-1 infikovaných H-9 buněk, kultivovaných v přítomnosti malého peptidů, v různých časových intervalech (0 až 48 hodin). Southern blotový test odhalil, že HIV-1 DNA byla syntetizována v přítomnosti GPG-NH₂ a množství provirové DNA bylo během prvních 24 h téměř stejné při různých koncentracích (0 až 2 00 μΜ) malého peptidů. Tyto výsledky dokazují, že malé peptidy, jako je GPG-NH₂, nemají inhibiční vliv na vstup HIV-1 a DNA syntézu a shodují se se zjištěním, že malé peptidy neinhibují aktivitu HIV-1 reverzní transkriptázy.

Nothern blotovou analýzou byly detekovány 24 až 48 h po infekci tři RNA bendy (9,2,

4,3, 2,0 kb). 9,2 kb RNA funguje jako genomická RNA a jako mRNA pro gag a pol geny. 4,3 kb jednou sestřižené RNA znázorňují alespoň env gen a vícenásobně sestřižená 2 kb RNA kóduje regulátorové geny. GPG-NH₂ při 20 μΜ nemá inhibiční účinek na expresi těchto RNA až do 48 h po infekci. Při 200 μΜ a 2 000 μΜ bylo snížení HIV-1 RNA zaznamenáno 48 h po infekci, což je pravděpodobně důsledek inhibice druhého replikačního cyklu. Tyto výsledky potvrdily, že malé peptidy

9 9

9 9 •9 999<

• 99

9» ·

9 9 • 9 9 9

99999

9 9 • 9 ·

9· neinhibují HIV-1 replikaci v transkripčním kroku, ani nemají vliv na sestřižení transkriptů.

V pokusech, navržených pro určení, zda je správně expresován HIV-1 protein v přítomnosti malých peptidů, nebyl pozorován významný vliv na proteinovou expresi.

V jednom pokusu nicméně byla pozorována odchylná migrace gpl60/gpl20 na polyakrylamidovém gelu. V přítomnosti GPG-NH2 (20 μΜ nebo víc) byl gpl60 a/nebo gpl20 pozorován při elektroforéze na pozici na polyakrylamidovém gelu, reprezentující molekulovou hmotnost mírně menší než 120 000 Da. Tento výsledek nebyl reprodukovatelný a změna migrace gag-proteinů pl7 nebo p24 nebyla pozorována. Studie analýzy glykosylace virového proteinu v přítomnosti GPG-NH₂ ukázaly, že nemá vliv na glykosylaci napojením buď přes N- nebo O. Také na glykosylaci rekombinantně (ve vakcíně viru) produkovaného gpl60 nebyl pozorován vliv GPG-NH₂. Dále nebyl nalezen vliv GPG-NH2 na aktivitu HIV-1 specifických proteáz.

V pokusech, popsaných výše, bylo ukázáno, že malé peptidy snižují HIV nakažlivost v pozdějším stádiu HIV replikačního cyklu. GPG-NH2 nebyl schopný přerušit DNA syntézu, RNA syntézu, proteinovou syntézu a proteinovou glykosylaci. V následující části zveřejnění více dokazuje, že malé peptidy, jako jsou GPG-NH₂, GKG-NH2, CQGH₂, RQG-NH₂, KQG-NH2, ALG-NH2, GVG-NH2, VGG-NH₂, ASG-NH2, SLG-NH₂ a SPT-NH₂, inhibují virovou infekci v pozdějším stádiu replikačního cyklu a, ve vyšším smyslu, jsou poskytnuty jiné techniky, které mohou být použity pro vybrání jiných malých peptidů a jejich derivátů pro schopnost inhibovat virovou infekci, jako jsou HIV a SIV infekce. Dále, níže je diskutováno více pokusů s elektronovým mikroskopem, ve kterých HIV-1 infikované buňky byly inkubovány v přítomnosti a nepřítomnosti malého peptidu.

Malé peptidy zasahují do skládání nukleokapsidy - Jakmile bylo objeveno, že malé peptidy GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NHz, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂, inhibují HIV infekci, byl použit k další analýze HIV infikovaných buněk, které byly inkubovány s malým peptidem, elektronový mikroskop, (viz. obrázky 2, 3 a 4). Jak ukazuje obrázek 4, analýza elektronovým mikroskopem odhalila, že kontakt s GPG-NH₂ přerušuje vlastní tvorbu virové nukleokapsidy.

V tomto setu pokusů byly HUT78 buňky infikovány HIV-1 SF-2 viry při 300TCIDso 1 hod při 37 °C. Následně byly infikované buňky promyty a odstředěny 3 krát, jak je popsáno v příkladu 2. Pak byly buňky resuspendovány v RPMI kultivačním médiu • ·· ·4 4 44 94 ···· · · · ··«· • * · Φ · Φ Φ ·· « • · · · · ······· · Φ • Φ · · · · ··· ··· ·Φ ·· φ 49 ΦΦΦ· s 10% FBS, antibiotiky (1000 u/ml) a polybrenem (3,2 pg/ml). GPG-NH₂ pak byl přidán do buněčných kultur 3, 5 nebo 7 dní po infekci při koncentraci 1 μΜ nebo 10 μΜ. Kontrolnímu vzorku byl podáván 0,5 μΜ Ritonavir (proteázový inhibitor).

Buňky byly kultivovány do 14 dne, kdy byly fixovány ve 2,5% glutaraldehydu obvyklým postupem. Fixované buňky pak byly postfixovány v 1% OsO₄ a byly dehydratovány, vloženy do epoxy pryskyřice a tyto bloky se nechaly zpolymerizovat. Epon řezy virem infikovaných buněk byly připraveny přibližně 60 až 80 nm tenké, aby se přizpůsobily šířce nukleokapsidy. Řezy byly připevněny na mřížku barvenou 1,0% uranylacetátem a byly analyzovány v Zeiss CEM 902 mikroskopu s urychlovacím napětím 80 kV. Mikroskop byl opatřen spektrometrem ke zlepšení kvality a tekutým dusíkem chlazený odlučovač byl použit pro snížení škodlivých paprsků. Mřížky, které mají řezy kontroly a buněk, inkubováných s GPG-NH₂, byly pozorovány v několika slepých pokusech.

Elektronová mikroskopie neošetřených HIV částic odhalila charakteristickou kuželovité tvarovanou nukleokapsidu a uzavřenou, stejnoměrně barvitelnou RNA, která sahá přes celou délku nukleokapsidy. (viz. obrázek 2). Na druhou stranu obrázek 3 znázorňuje dvě elektronové mikrofotky, ukazující některé HIV-1 částice, které byly produkovány v přítomnosti inhibitoru virové proteázy Ritonavir. Infikované buňky, které byly ošetřeny Ritonavirem, vykazovaly změněné struktury, ve kterých nebyly rozlišitelné nukleokapsidy, jak bylo očekáváno, (viz obrázek 3). Obrázek 4 znázorňuje elektronové mikrofotky, ukazující virové částice, které byly produkovány v přítomnosti GPG-NH₂. Buňky, které měli HIV-1 částice, které byly ošetřeny GPG-NH₂, ukazovaly HIV-1 částice s nerozlišitelnými kapsidovými strukturami, které jsou charakteristické pro částice, ošetřené Ritonavirem. Přesněji, v některých tripeptidem ošetřených virových částech se kuželovité tvarovaná kapsidová struktura jevila relativně neporušená, ale RNA byla nahromaděná v kuličce podobném uspořádání buď mimo kapsidu, nebo na vrcholu (širokém konci) kapsidy. Dále bylo pozorováno, že některé kapsidy mají znetvořené struktury s malou nebo žádnou morfologií normálních nukleokapsid a RNA byla pozorována buď mimo strukturu nebo uvnitř struktury na jednom konci. Z těchto studií bylo jasné, že malé peptidy zasahují do tvorby nukleokapsidy a že tato inhibice vývoje kapsidy se objevuje v kroku odlišném od působení proteázového inhibitoru Ritonaviru.

Větší důkaz, že tripeptidy v amidové formě, jako jsou GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPTη

0* 0* 0 04 00

0 * » 0 * · 0 0 ·

0 0 · » 0 · » 0 »

0 0 · · 0 0»·« 4 0 0 0

0 0 0 0 0 000

4»· 00 »4 · 00 0000

-ΝΗ₂, zasahují do skládání kapsid, byl získán, když byl proveden vazebný test s p24 jako cílovou biololekulou. Podrobnosti p24 vazebného testu jsou uvedeny níže.

Malé peptidy se váží na hlavní kapsidový protein (p24) - Pokusy byly provedeny pro přímé zjištění, zda malé peptidy mají schopnost interagovat se zralým kapsidovým proteinem (CA) nebo p24 a tím zasahovat do tvorby nukleokapsidy. V této sadě pokusů byl proveden p24 vazebný test, který stanovil schopnost radioznačeného GPG-NH₂vázat se na p24.

Vazebný test na základě dialýzy byl proveden použitím dialyzační membrány s velikostí pórů menší než 10 kD. (Slide-A-Lyzer, Pierce). Pět mikrolitrů 10 μΜ roztoku rekombinantních proteinů p24 a gpl20 (dary od AIDS program, NCIB) a BSA (Sigma) byly vloženy do jednotlivých dialyzační ch membrán a proteiny byly dialyzovány při 4 °C 2 dny proti 500 ml roztoku, složeného ze 150 mM NaCl a 50 mM Tris-HCl pufru, pH 7,4, a 27,5 M ¹⁴C-GPG-NH₂ (Amersham Ltd. UK). Následně byly odebrány deseti nebo pěti mikrolitrové alikvoty dialyzovaných p24, gpl20 a BSA a ve scintilační lahvičce smíchány se 3 ml ReadySafe (Beckman). C¹⁴ byl pak detekován scintilačním měřením.

V tabulce 8 jsou ukázány výsledky z reprezentativního dialyzačního pokusu. Především asociace p24 s GPG-NH₂ byla pozorována na dialyzační membráně. Množství radioaktivního GPG-NH₂, asociovaného s p24, bylo 7,5 krát vyšší než jeho přítomnost v pufru. Na druhou stranu nebylo znatelnější množství nad množství, přítomné v pufru, radioaktivního GPG-NH₂ asociováno s gpl20 nebo BSA. Tyto výsledky dokazují, že malé peptidy, jako je GPG-NH₂, se váží na p24 a touto interakcí přerušují vlastní tvorbu nukleoklapsid.

tabulka 8

vzorek:	dialyzační pufr	p24	gpl20	BSA
pCi/ml	1,816	13,712	1,745	1,674
krát pufr	1,000	7,551	0,961	0,922

V následujícím popisu je popsán další důkaz, že malé peptidy, jako jsou GPG-NH₂, GKG-NH₂, cqg-nh₂, rqg-nh₂, kqg-nh₂, ALG-NH₂, gvg-nh₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂, inhibují HIV a SIV infekci mechanismem, který je jiný než způsob, k terým AZT nebo Ritonavir inhibují tyto viry.

• ·Α ·θ • · · · · ·

Malé peptidy inhibují HIV-1 kmeny, které jsou rezistentní k AZT nebo Ritonaviru Schopnost malých peptidů inhibovat HIV-1 kmeny, které jsou rezistentní buď k nukleosidovému analogu AZT nebo proteázovému inhibitoru Ritonaviru. HIV-1 rezistentní izoláty byly kultivovány v monojaderných buňkách z periferní krve (PBMC) a supernatanty byly odebrány jako virové frakce. Titrace TCID50 (50% infekční dávka pro tkáňové kultury) byla provedena na PBMC a titry byly vypočítány podle Reed a Muenchova vzorce. 400 000 PBMC bylo infikováno při 25 TCID50 těchto virů (HIV-1 SF162 byl použit jako kontrola) adsorpci při 37 °C jednu hodinu, pak třikrát promyty. Buňky byly resuspendovány v kultivačním médiu, obsahujícím buď žádný lék, GPG-NH₂ (100 μΜ), AZT (5 μΜ) nebo Ritonavir (0,1 μΜ) a inkubovány při 37 °C, CO₂ a vlhkosti. Kultivační médium bylo měněno každé čtyři dny a HIV-1 p24 antigenový protein v supernatantech byl sledován ELISOU (tabulka 9).

Jak je ukázáno v tabulce 9, GPG-NH₂ má silný antivirový účinek na HIV kmeny rezistentní buď k AZT nebo k Ritonaviru. Výsledky v tomto pokuse dokazují data, uvedená výše, a dokazují, že malé peptidy inhibují HIV replikaci v jiném stádiu než AZT a Ritonavir. Dále ošetření „pouličních kmenů“ HIV bylo provedeno GPG-NH₂, jak je zveřejněno v US patentu č. 5 627 035 Vahlnem et al., zahrnutého zde v úplnosti odkazem. Dáno tím, že jsou také odvozeny od sekvence HIV virového proteinu, peptidy GKG-NH₂, cqg-nh₂, rqg-nh₂, kqg-nh₂, alg-nh₂, gvg-nh₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂ jsou také užitečné v léčbě HIV infekcí, rezistentních k AZT a Ritonaviru, stejně jako pouličních kmenů HIV.

tabulka 9

typ	číslo	kontrola (%)	GPG 100 μΜ (% snížení)	AZT 5 μΜ (% snížení)	Rito^b 0,1 μΜ (% snížení)
nízké AZT	p7261	130000* (0)	<500 (100%)	<500 (100 %)	nt
střední AZT	p7163	107000 (0)	<500 (100 %)	22200 (79 %)	nt
vysoké AZT	p7227	114000 (0)	<500 (100 %)	68000 (40 %)	nt
nízké Pl	p7300	146000 (0)	<500 (100 %)	nt^a	64000 (56 %)

• · · · ί · · · ·» ·· • * · ·

vysoké PI

p7141

114000 (0)

<500 (100 %)

nt

98000 (14 %)

*HIV-1 ρ24 hodnoty jsou ukázány v pg/ml a jsou průměry duplicitních pokusů, odebraných 14 dní po infekci.

^anetestováno ^bRitonavir nízké AZT: izolováno s nízkou rezistencí k AZT.

střední AZT: izolováno se střední rezistencí k AZT.

vysoké AZT: izolováno s vysokou rezistencí k AZT.

nízké PI: izolováno s nízkou rezistencí k proteázovému inhibitoru.

vysoké PI: izolováno s vysokou rezistencí k proteázovému inhibitoru.

Pro další potvrzení dat, předložených výše, byly provedeny některé pokusy HIV-1 nakažlivosti na HIV-1 mutantech, které postrádaly GPG-motiv v jejich V3 smyčce. Tyto pokusy, popsané podrobně níže, potvrdily, že GPG-NH₂ zprostředkovaná HIV-1 inhibice se objevuje ve způsobu nezávislém na V3 smyčce. V3 smyčka HIV-1 env glykoproteinu gpl20 obsahuje konzervativní GPG sekvenci na špičce smyčky, která může být zahrnuta při virové replikaci. K určení, zda GPG-NH₂ inhibuje HIV-1 infekci přerušením interakce V3 smyčky, byl připraven V3 smyčka HIV-1 mutantní pro virus. Tento mutantní provirus, nemající GPG doménu, byl testován na schopnost infikovat buňky v testech nakažlivosti a byl analyzován imunocytochemií a elektronovou mikroskopií. Příklad, uvedený níže, popisuje přípravy mutantního proviru, test HIV-1 nakažlivosti, určení struktury mutantních virových částic imunocytochemií a elektronovou mikroskopií a objev, že GPG-NH₂ inhibuje infekci mutantními virovými částicemi.

Příklad 3

Provirus s GPG deleci na základě infekčního klonu pBRu-2 byl připraven použitím technik obvyklých v molekulární biologii. Escherichia coli DH5a a NM522 mutS byly použity pro subklonování, mutagenezi a apmlifikaci plasmidové DNA. pucl8 plasmid byl použit jako vektor pro subklonování a HIV-1 provirální klon pBRu-2, který obsahuje celou délku, replikačně kompetentní klon HIV-I/Bru (také označený jako LAV, LAI), byl použit k přípravě mutantního viru.

• ···· *

2,7 kb Stf/I-to-Ba/wHI fragment z pBRu-2, který kóduje env gen, byl subklonován do Sáli a 2?a/wHI míst pucl8 vektoru. GPG delece byla dosažena cílenou lokální mutagenezí použitím U.S.E. mutagenezního kitu (Pharmacia). Byly získány dva oligonukleotidy. Mutagenní oligonukleotid byl 5'fosforylovaný CGT ATC CAG AGG AGA GCA TTT GTT ACA ATA GG-3' (získaný od Scandinavian Gene Synthesis AB, Stockholm, Švédsko). Selektivní oligonukleotid byl 5'fosforylovaný GTG CCA CCT GTC GAC TAA GAA ACC AT-3' a byl navržen pro odstranění specifického restrikčního místa AatlI vpucl8 vektoru. Divoký typ DNA byl tak selektivně eliminován ze smíšeného poolu divokého typu a mutantní DNA rozštěpením odpovídající endonukleázou AatII. Mutagenezní reakční produkty byly přeneseny do E. coli pro amplifikování plasmidové DNA. Mutace byla ověřena polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a sekvenováním DNA použitím automatického laserového fluorescentního ALF™ DNA sekvenátoru (Pharmacia). Sall-BamTAA fragment, deletovaný z oligonukleotidu, kódujícím GPG, byl pak klonován do pBRu-2 k přípravě provirálního plasmidu. Mutantní DNA z několika bakteriálních kolonií byly amplifikovány a čištěny QIAGEN plasmidovým kitem. Dvě z nich, mp8 a mplO DNA, byly transfekovány do buněk.

Divoký typ DNA a mutantní DNA, mp8 a mplO, byly transfekovány do Hela, HUT₇s nebo MT-2 buněk použitím DEAE dextranového způsobu. (Palker et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 1932 až 1936 (1988)). Ve stručnosti, 10⁶ buněk bylo připraveno 24 hodin před transfekci. Pak bylo médium odstraněno a buňky byly jednou promyty předehřátým fosfátem pufrováným fyziologickým roztokem (PBS) a jednou TBS-D (Trisem pufrovaný fyziologický roztok-0,1% dextróza). Přibližně 0,5 pg DNA bylo smícháno s TBS-D/DEAE-dextranem a bylo přidáno k buňkám, následovala 30 minutová inkubace při 37 °C. Pak byl roztok odstraněn a buňky byly promyty jednou TBS-D a jednou PBS. Buňky byly smíchány s 5 ml předehřátého média doplněného 10 % séra a 5 pg difosfátu chlorochinu a byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C, následovalo třikrát promytí médiem bez séra. Nakonec byly buňky udržovány v 10 ml kultivačního média a inkubovány při 37 °C 4 dny.

Viry obsahující supernatanty byly odebrány, filtrovány přes filtr o velikosti pórů 0,45 pg pro odstranění všech buněk, rozděleny na alikvoty a uchovány při -70 °C jako virové frakce. Titrace viru byla provedena infekčními MT-2 buňkami řadou ředění viru. Sto mikrolitrů každé pětinásobné řady ředění virových supernatantů bylo použito jako inokulum pro 200 000 MT 2 buněk. Po 16 hodinách adsorpce byly buňky pětkrát • ·

»· · promyty a resuspendovány v 1,5 ml kultivačního média na 24 jamkové destičce (Costar Corporation). Médium bylo měněno 4, 7 a 11 den po infekci a p24 produkce v supernatantu byla testována 14 den. Konečný bod pro 50% infekční dávku pro tkáňovou kulturu (TCID50) byl vypočítán podle Reed-Muenchova vzorce. (Reed and Muench, Am. J. Hygiene 27 493-497 (1938)).

CD4+ T buněčné linie MT-2, C91-PL, C8166, CEM, HUT₇₈, H9, Jurkat a Molt-3, monocytická buněčné linie U937 a THP-1 byly nakultivovány a udržovány v RPMI1640 médiu (GIBCO), doplněnému 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (GIBCO), penicilínem (100 u/ml) a streptomycinem (100 u/ml). Hela buňky rostly v médiu 199 s Hanko vou solí, doplněnou 2 % FBS, 0,8 % dextrózy a antibiotiky. Monojaderné buňky z periferní krve (PBMCs) byly čištěny Ficoll-Hypaque gradientovou centrifugací a stimulovány fytohemaglutininem (KEBO Lab) tři dny vRPMI1640 médiu, doplněnému tak, jak je popsáno výše před infikováním. Dendritické buňky byly připraveny z krevním monocytů, které byly čištěny z monojaderné frakce adhezí na plast, jak je popsáno Rormanem et al., J. Exp. Med. 180:83-93 (1994). Ve stručnosti byly krevní monojaderné buňky čištěny, jak je popsáno výše, a adheze byla prováděna v baňkách pro tkáňové kultury v RPMI médiu 2 hodiny, pak byly nenaadherované buňky odmyty PBS. Adherované buňky byly kultivovány sedm dní v médiu s GM-CSF (25 u/ml) a IL-4 (4,5 u/ml) a pak byly infikovány virem. Infekce byla provedena na buněčných liniích MT-2, C9 1-PL, C8166, CEM, HUT₇₈, H9, Jurkat a Molt-3, U937 ,THP-1, PBMCs a dendritických buňkách (DCs). Pro CD4+ T buněčné linie bylo 200 000 buněk inkubováno při 37 °C s viry divokého typu nebo mutantními při 100 TCID50 16 hodin, pak pětkrát promyty, resuspendovány v 1,5 ml čerstvého média, doplněnému 10 % FBS, antibiotiky a Polybrenem (Sigma, 2 pg/ml) a inkubovány na 24 jamkové destičce při 37 °C v 5 % CO₂ s vlhkostí. Pro PBMCs bylo použito 500 000 buněk a kultivováno v RPMI médiu, doplněném proleukinem (Eurcetus, 150 u/ml), hydrokortizonem (Sigma, 5 pg/ml) a polybrenem (Sigma, pg/ml). Pro DCs bylo 800 000 buněk vystaveno viru 1, 16 a 48 hodin, následovalo krát promytí v PBS a opatrným promytím 0,05% trypsinem při 37 °C 5 minut pro odstranění všech na povrch nenavázaných virů, jak je popsáno Grannelline-Pipernem et al, j. Exp. Med. 1884:2433-2438 (1996). Jako kontrola byly PBMCs vystaveny mp8 stejným způsobem. Buňky byly promyty, odebrány a lyžovány pro izolaci DNA fenol/chloroformovou extrakcí, pak byla provedena semikvantitativní PCR detekce LTR sekvence. Desetinásobná řada ředění byla připravena na DNA a byla provedena LTR

PCR ve 40 cyklech použitím tří primerů „vnořené“ konfigurace, jak je popsáno dříve. (Hwang et al., Science 253: 71-74 (1991)). Pro pokusy se DC-PBMC společnou kulturou a DC-MT-2 společnou kulturou bylo 250 000 DCs vystaveno viru na 16 hodin, následovalo pětkrát promytí až do žádné detekce p24 (méně než 5 pg/ml). Pak byly buňky opatrně ošetřeny 0,05% trypsinem, který porušil HIV-1 navázání epitopu na CD4 a odstranil viry, navázané na povrch. Po promytí byly buňky resuspendovány v RPMI kultivačním médiu, smíchaného s 200 000 PBMCs buňkami nebo 100 000 MT-2 buňkami.

Pro infekční pokusy bylo kultivační médium vyměněno 4, 7, 11 a 14 den po infekci a virový růst byl určen hladinou p24 použitím HIV-1 p24 ELISA kitu (Abbott Laboratories, Severní Chicago, USA). Kvantifikování p24 ELISA testem bylo použito pro kvantifikování hladiny p24 v každém virovém vzorku a tento test měl lineární závislost v rozmezí od 20 pg do 640 pg p24 na ml. Všechny virové vzorky byly testovány v mnohonásobných zředěních a množství p24 bylo určeno s pomocí regresní křivky. DNA byly izolovány z buněk, kultivovaných 17 dní po infekci a přímé sekvenovány na V3 oblast bylo provedeno na těchto DNA pro ověření mutace. Imunocytochemie byla také provedena na infikovaných a neinfikovaných MT-2 buňkách APAAP (imunokomplex alkalická fosfatáza antialkalická fosfatáza) sendvičovou technikou, jak bylo dříve popsáno v Kowalski et al., Science 237:1351-1355 (1987). Buňky byly dvakrát promyty v PBS a fixovány na sklíčko acetonem 15 minut. Pak byly buňky inkubovány postupně s primární protilátkou myší antiHIV-1 p24, sekundární protilátkou králičími antimyšími imunoglobulíny a myší APAAP monoklonální protilátkou (DAKO) 30 minut při 37 °C ve vlhké komoře, následovalo promytí PBS 5 minut. Po přidání chromogenního substrátu a inkubaci 20 minut při pokojové teplotě byly sklíčka umyty v H₂O, instalovány v glycerolů a prohlédnuty pod mikroskopem (zvětšení xlOO). Monoklonální protilátky (Mabs) myší antiHIV-1 p24 (DAKO, ředění 1:20), králičí antimyší imunoglobulíny (ředění 1:25) a myší imunokomplex Mab k telecí střevní alkalické fosfatáze a telecí střevní alkalická fosfatáza (APAAP, ředění 1:20) byly použity pro imunocytochemický test.

Dále byla provedena elektronová mikroskopie infikovaných buněk. Čerstvě infikované buňky byly fixovány na 7 dní 2,5% glutaraldehydem a postfixovány v 1% OSO4. Buňky byly dehydratovány, vloženy do epoxydových pryskyřic a barveny 1% uranylacetátem. Epon řezy virem infikovaných buněk byly připraveny 60 až 80 nm tenké. Vzorky byly analyzovány v Zeiss CEM 902 při urychlovacím napětím 80 kV, který byl opatřen ·· 9« 9 ·· • · · · · · · • 0 · · · 9 *· • 99* ·♦····· · spektrometrem ke zlepšení kvality obrázků. Tekutým dusíkem chlazený odlučovač byl použit pro snížení škodlivých paprsků.

V další řadě pokusů byl získán důležitější důkaz, že GPG-NH₂ inhibuje HIV-1 infekci jiným mechanismem než inhibici V3 smyčky. Byla tedy určena schopnost GPG-NH₂inhibovat nakažlivost divokého typu a delečních mutantů ve V3 smyčce (GPG doména) v MT-2 buňkách. V těchto pokusech bylo přibližně 200 000 MT-2 buněk infikováno HIV-1 Bru divokým typem a GPG delečními mutanty mp8 a mplO při 25 TCID50 k testování účinku GPG-NH₂. MT-2 buňky byly resuspendovány v 1 ml RPMT 1640 média, doplněného 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS, GIBCO), penicilínem (100 μ/ml), streptomycinem (100 μ/ml) a Polybrenem (Sigma, 2 μg/ml), s nebo bez přítomnosti GPG-NH₂ při koncentraci 20 μ M a 100 μΜ. Potom byly přidány viry při 25 TCID50 v objemu 20 až 30 μΐ. Buňky byly inkubovány s viry při 37 °C 16 hod, pak byly pomalu odstředěny při 170xg 7 minut. Buňky pak byly promyty třikrát RPMI médiem bez peptidů při pokojové teplotě a odstředěny při 170xg 7 minut, jak je uvedeno výše. Po konečném promytí byly buňky resusupendovány v RPMI médiu na 24 jamkové destičce (Costar Corporation), pak byly umístěny do 37 °C s 5 % CO₂ s vlhkostí. Kultivační supernatanty byly shromážděny, když médium bylo vyměněno 4, 7, 10 a 14 dní po infekci. Ke sledování replikace viru byl testován HIV-1 p24 antigenový protein v supernatantech ze 7 a 14 dne ELISA kitem (Abbott Laboratories), který má lineární odpověď na dávku v rozmezí od 20 pg do 640 pg p24 na ml a množství p24 bylo určeno pomocí regresní křivky.

Výsledky z pokusů, popsaných v tomto příkladě, diskutované velmi podrobně níže, prokazují, že GPG-NH₂ inhibuje HIV-1 infekci způsobem, nezávislým na V3 smyčce. Malé peptidy inhibují HIV-1 infekci způsobem, nezávislým na V3 smyčce - K určení, zda GPG delece ve V3 smyčce ovlivňuje produkci viru, byly provirové plasmidové DNA (divoký typ i mutant) transfekovány do CD4 negativní buněčné linie Hela, stejně jako do CD4 pozitivních buněčných linií MT-2 a HUT78. Kultivační supernatanty byly odebrány každý den a produkce viru byla sledována měřením hladiny p24. Podobný růstový model byl pozorován pro vir divokého typu (WT) a mutanty z Hela transfekce v 6 denním rámci, hladina p24 rostla do čtvrtého dne, pak zůstala na vrcholu. Z toho plyne, že mutant a divoký typ provirových DNA byly v těchto buňkách stejně dobře expresovány. Podobné výsledky byly získány z HUT78, transfektanty a syncytium byly pozorovány v těchto transfekovaných HUT78 buňkách. Nicméně charakter p24 produkce z MT-2 transfektů byly výrazně odlišné od těch, pozorovaných v Hela a HUT78

buňkách. Množství p24 produktu rostlo po čtvrtém dnu, ačkoliv p24 produkce buněk, transfekovaných mutantními virovými provirálními DNA, byla nižší než těch, transfekovaných divokým typem virové provirální DNA. 6 den po transfekci divoký typ produkoval 1,380 ng/ml p24, zatímco p24 produkce mp8 a mplO byly 15,8 ng/ml a

13,7 ng/ml. Tyto výsledky ukazují, že potomci GPG delečních mutantů virů byly produkovány a mohli infikovat netransfekované CD4+MT-2 buňky, ačkoliv podle všeho ne tak účinně jako potomci divokého typu. DNA z těchto transfekovaných buněk byly sekvenovány a GPG delece byla ověřena u potomků obou mp8 a mplO.

Za další, schopnost mutantních molekulárních klonů generovat virové částice, schopné způsobit infekci, byla dále analyzována. Hela buňky a MT-2 buňky byly transfekovány provirovými DNA a čtyři dny po transfekci byly kultivační supernatanty odebrány, filtrovány, testovány na množství p24 a alikvoty byly zamraženy při -70 °C jako virové frakce. Na Mt-2 buňkách byla provedena virová titrace (TCID50). V supernatantech z MT-2 transfektantů, upravených tak, aby obsahovaly stejné množství p24, poskytly viry divokého typu 83 300 TCIDso/ml, zatímco mutanty, mp8 a mplO, poskytly 16 700 a 25 000 TCIDso/ml, asi pětkrát méně, než co bylo získáno s viry divokého typu. V souladu s nižší p24 produkcí Hela transfektantových supernatantů poskytly také nižší titry, 70 a 10 TCIDso/ml pro WT a mutanty, respektive. Takže ačkoliv mutanti viru byly stále infekční, delece GPG motivu ve V3 může snížit virulenci v těchto buňkách. Tento způsob byl dále testován infekcí MT-2 buněk a sledována produkce potomků viru. Virové frakce z Hela i MT-2 transfektů byly pak použity k infekci MT-2 buněk (100 TCID50 divoký typ nebo mutantní vir z MT-2 transfektováných supernatantů nebo pět TCID50 zviru z Hela transfektovaných frakcí). Buňky byly inkubovány s viry 16 hodin a pak promyty. Pak byly buňky resuspendovány a inkubovány při 37 °C. Virová replikace byla sledována množstvím p24 a cytopatických účinků. S viry z MT-2 transfektantů všechny, divoký typ (WT) stejně jako mutantní viry (mp8 a mplO) ukázaly virovou replikaci produkcí p24. Divoký typ dosáhl vrcholu množství p24 2 150 ng/ml 11 den po infekci, zatímco mutantní viry vykázaly přibližně 4 den zpoždění s vrcholy p24 hodnot 1 580 ng/mL a 1 760 ng/mL pro mp8 a mplO 14 den po infekci. Infekce MT-2 buněk viry z Hela transfektantů (při 5 TCID50) také poskytla p24 produkci WT i mutantů s podobnými růstovými kinetikami, jaké se získaly s MT-2 buněčnými producenty virů. DNA byly izolovány ze všech infikovaných buněk a mutace byla ověřena sekvenováním V3, ukazující, že růst mutantních virů nebyl díky navrácení k nebo získání sekvence divokého typu.

• ·

Tvorba syncytia byla také pozorována v MT-2 buňkách, infikovaných WT i mutanty. Buněčné kultury byly fixovány 7 den po infekci a byly použity pro imunocytochemii s použitím APAAP sendvičové techniky. Infikované buňky byly imunologicky barveny a ukázaly červenou barvu. Syncytia byla pozorována n MT-2 buňkách, infikovaných WT i mutantním virem, ačkoliv WT vir indukoval syncytia dřív (4 dny po infekci) než mutanti (po 6 dnech). Elektronová mikroskopie (EM) dále odhalila, že mutantním virem infikované MT-2 buňky produkují HIV-1 částice. Byly pozorovány HIV-1 částice, které mají charakteristické, kuželovité tvarované core. Tyto data potvrdila, že GPG deleční mutantní viry zůstaly v MT-2 buňkách infekční.

Nezvratný důkaz, že GPG-NH2 inhibuje virovou infekci způsobem odlišným od interakce V3 smyčky, byl získán, když byly provedeny pokusy, které určily schopnost GPG-NH2 inhibovat nakažlivost divokého typu a V3 smyčka delečních mutantů (GPG doména) v MT-2 buňkách. 7 den i 14 den po infekci bylo pozorováno významné snížení virové infekce divokého typu a mutantů. Viz tabulka 10. Při 20 μΜ a 100 μΜ GPG-NEh účinně snižoval infekci divokého typu a infekci, zprostředkovanou GPG delečními konstrukty mp8 a mplO. Ve skutečnosti 7 den po infekci a 100 μΜ GPG-NH2 byla pozorována stejné úplné snížení virové nakažlivosti divokého typu, mp8 a mplO. Tyto výsledky potvrdily, že GPG-NH2 inhiboval HIV-1 infekci mechanismem nezávislým na interakci s GPG doménou V3 smyčky.

tabulka 10

7 den	p24 pg/ml
	kontrola	GPG 20 μΜ	snížení %	GPG 100 μΜ	snížení %
WT	33800	23900	29	3390	90
mp8	3170	2420	24	208	93
mplO	3120	1560	50	173	94
14 den
WT	357000	223000	38	181000	49
mp8	148000	69100	53	7410	95
mplO	470000	51500	89	47700	90

Data zde uvedená potvrzují, že malé peptidy, které mají modifikovaný karboxy konec, inhibují virovou infekci (např. HIV-1, HIV-2 a SIV infekci) vazbou na p24 a přerušují

Uv · · · · 4 ·

444 44 44 4 vlastní skládání kapsidy. Mnoho testů, podrobně popsané výše, může být použito pro určení schopnosti malého peptidů, modifikovaného malého peptidů, oligopeptidu nebo peptidomimetické látky zabránit nebo inhibovat HIV nebo SIV infekci. Podobné techniky mohou být také použity k určení schopnosti malého peptidů, modifikovaného malého peptidů, oligopeptidu nebo peptidomimetické látky zabránit nebo inhibovat ostatní virové infekce.

Protože jsou sekvence některých virových kapsidových proteinů známy, navržení, příprava a identifikace malých peptidů v amidové formě, která zabraňuje vlastnímu složení různých virových kapsid, je bez komplikací. Některé virové kapsidové proteiny například obsahují 20 aminokyselinovou homologní oblast, nazývanou hlavní homologní oblast (MHR), která je v karboxylkoncové doméně mnoha onko a lentivirů. (viz obrázek 5). Obrázek 5 ukazuje jiné viry, někteří z nich infikují ptáky, myši a opice. Především je nalezena vhodná homologie v sekvencích těchto virových kapsidových proteinů. Vědci také pozorovali, že karboxylkoncová doména je nezbytná pro kapsidovou dimerizaci a složení viru u HIV-1. (Gamble et al., Science 278: 849 (1997), zde v úplnosti zahrnutý odkazem). Zatímco malé peptidy, které ukazují antivirovou aktivitu při testech, popsaných v tomto sdělení, zcela nebo částečně odpovídají oblastem karboxylkoncové domény HIV-1, HIV-2 nebo SIV, oblasti N-koncové domény virů jsou důležité pro složení kapsid a navržení a syntéza malých peptidů, které buď zcela nebo částečně odpovídají aminokyselinové sekvenci N-koncové oblasti virových kapsidových proteinů, jsou vhodné části předkládaného vynálezu. Použití malých peptidů, které zcela nebo částečně odpovídají aminokyselinám v MHR oblasti a karboxylkoncové doméně virových kapsidových proteinů je nicméně hlavní částí předkládaného vynálezu.

Vynálezci ukázali některé nové malé peptidy v amidové formě, které zcela nebo částečně odpovídají kapsidové proteinové sekvenci tří různých virů, účině inhibující a/nebo zabraňující infekci těmito viry. Strategie zde popsané mohou být použity k přípravě dalších malých peptidů v amidové formě, které zcela nebo částečně odpovídají kapsidové proteinové sekvenci jiných virů. Například navržením a přípravou malých peptidů, oligopeptidů a/nebo peptidomimetických látek, které odpovídají oblastem sekvencí, zveřejněných na obrázku 5, mohou být nové molekuly, které inhibují HIV, SIV, RSV, HTLV-1, MMTV, MPMV a MMLV infekce, rychle určeny použitím vyhodnocovacích technik, diskutovaných výše, nebo modifikací těchto testů, jak může být zřejmé odborníkovy v oboru. Dále je známo mnoho sekvencí jiných

44 • 4 · ♦ • · · • « ·

4 4 • 4 4 4 4 4 virových kapsidových proteinů, jako členů rodin arenavirů, rotavirů, orbivirů, retrovirů, papillomavirů, adenavirů, herpesvirů, paramyxovirů a hepadnavirů. Některé malé peptidy, oligopeptidy a/nebo peptidomimetické látky, které zcela nebo částečně odpovídají těmto sekvencím, mohou být vybrány a rychle vyhodnoceny pro určení těch, které účinně inhibují a/nebo zabraňují virové infekci, použitím testů virové nakažlivosti a/nebo technik elektronové mikroskopie, zde popsaných, nebo modifikací těchto testů, jak může být zřejmé odborníkovy v oboru, podaných v tomto sdělení.

Vhodné části zahrnují malé peptidy (více než jednu aminokyselinu a méně než nebo rovno 10 aminokyselinám dlouhé), které mají modifikovaný karboxy konec, který se použije k přerušení skládání kapsidy a inhibici virové infekce. Přednostně jsou použity dipeptidy, tripeptidy a oligopeptidy a odpovídající peptidomimetické látky, které mají sekvenci, která se nachází v HIV nebo SIV kapsidě. Například oligopeptid podle předkládaného vynálezu může mít čtyři aminokyseliny, pět aminokyselin, šest aminokyselin, sedm aminokyselin, osm nebo devět nebo deset aminokyselin a peptidomimetické látky podle předkládaného vynálezu můžou mít strukturu, která se podobá čtyřem, pěti, šesti, sedmi, osmi, devíti nebo desíti aminokyselinám. Tyto oligopeptidy také vhodně zahrnují zcela nebo částečně sekvence, nalezené v tripeptidech GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NHz, SLG-NH₂ a SPT-NH₂. Peptidomimetické látky, které připomínají dipeptidy, tripeptidy a oligopeptidy, také, přednostně odpovídají sekvenci, která je nalezena v tripeptidech GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂. Je upřednostňováno, že malé peptidy mají modulační skupinu (např. amido skupinu) na jejich karboxy konci (CO-NH₂) raději než karboxylovou skupinu (COOH). Malé peptidy, které mají jiné modulační skupiny na karboxylovém konci, mohou být také použity, ale je vhodné, aby připojené modulační skupiny měli stejný náboj a stejné stérické chování jako amido skupina, (viz. US patent č. 5 627 035 Valhena et al., pro test ke srovnání peptidů, které mají různé substituenty na karboxylovém konci).

V některých částech je vhodný acetyl nebo methylová skupina také na konci malého peptidu, aby se zlepšila absorpce malého peptidu nebo se předešlo exoproteázovému rozštěpení nebo pro obojí.

V následujícím sdělení jsou popsány některé přístupy k přípravě biotechnologických nástrojů a farmaceutických prostředků, obsahující dipeptidy, tripeptidy, oligopeptidy menší nebo rovny 10 aminokyselinám, a peptidomimetické látky, které se podobají • · ·· ···· tripeptidům a oligopeptidům, menším nebo rovným 10 aminokyselinám (společně označované jako „peptidové činidlo(a)). Může být poznamenáno, že výraz „peptidová činidla“ zahrnuje dipeptidy, tripeptidy a oligopeptidy menší nebo rovny 10 aminokyselinám. „Peptidová činidla“ jsou například peptidy dvou, tří, čtyř, pěti, šesti, sedmi, osmi, devíti nebo desíti aminokyselin a peptidomimetické látky, které se podobají peptidům dvou, tří, čtyř, pěti, šesti, sedmi, osmi, devíti nebo desíti aminokyselin. Dále „peptidová činidla“ jsou peptidy dvou, tří, čtyř, pěti, šesti, sedmi, osmi, devíti nebo desíti aminokyselin nebo peptidomimetických látek, které se podobají peptidům dvou, tří, čtyř, pěti, šesti, sedmi, osmi, devíti nebo desíti aminokyselinám, které jsou zajištěna jako multimerní nebo multimerizované činidla, jak je popsáno níže. Jsou získány vhodné biotechnologické nástroje nebo složky pro profylaktická nebo léčebná činidla, zajišťující peptidové činidlo v takové formě nebo takovým způsobem, že má dostatečnou afinitu nebo inhibuje viry, jako je HIV-1, HIV-2 nebo SIV. Zatímco přirozené monomerní peptidové činidlo (např. vyskytující se jako nespojené jednotky peptidového činidla, každé nesoucí pouze jeden vázaný epitop) je dostatečné pro navázání kapsomerního proteinu, jako je p24, a/nebo zasahování do skládání kapsidy a/nebo zabránění virové infekce, jako je HIV-1, HIV-2 nebo SIV infekce, syntetické ligandy nebo multimerní ligandy (např. vyskytující se jako vícenásobné jednotky peptidového činidla s několika navázanými epitopy) mohou mít daleko vyšší schopnost vázat kapsomerní protein, jako je p24, a/nebo zasahovat do skládání kapsidy a/nebo zabraňovat virové infekci, jako je HIV-1, HIV-2 nebo SIV infekce. Může být poznamenáno, že výrazem „multimerní“ je míněno, že se vztahuje k přítomnosti více než jedné jednotky ligandu, například několika individuálních molekul tripeptidu, oligopeptidu nebo mimetické látky, čímž se liší od výrazu „multimerizovaný“, který se vztahuje na přítomnost více než jednoho ligandu, připojeného jako samostatná nespojená jednotka, například několika tripeptidů, oligopeptidů nebo peptidomimetických molekul, připojených jeden za druhým.

Příprava multimerního nosiče a multimerizovaných ligandů - Multimerní činidlo (syntetické nebo přirozené), které váže kapsomerní protein, jako je p24, a/nebo zasahuje do skládání kapsidy a/nebo zabraňovat virové infekci, jako je HIV-1, HIV-2 nebo SIV infekce, může být získáno vazbou tripeptidu, oligopeptidu nebo mimetické látky na makromolekulární podklad. Výraz „podklad“, jak je zde použit, zahrnuje nosič, pryskyřici nebo makromolekulární strukturu, použitou k navázání, imobilizování nebo stabilizování peptidového činidla. Pevné podklady zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, ·· *· 4 ·* ·· • · · w * · · · ♦ • · · · · · · · · φ ··· ······· · ·

9 9 4 · · · ♦

4 44 4 444444 stěny jamek reakční misky, zkumavek, polystyrénových kuliček, magnetických kuliček, nitrocelulózových proužků, membrán, mikročásteček, jako jsou latexové částice, ovčí (nebo jiného zvířete) červené krvinky, umělé buňky a další. Výraz podklad také zahrnuje nosiče, jestliže se výraz používá pro přípravu léků.

Makromolekulám! podklad může mít hydrofobní podklad, který interaguje s částí peptidového činidla hydrofobní nekovalentní interakcí. Hydrofobní povrch podkladu může také být polymer, jako je plast nebo jiný polymer, ve kterém jsou hydrofobní skupiny spojeny, jako je polystyren, polyethylen nebo póly vinyl. Volitelně může být peptidové činidlo navázáno na nosiče, zahrnující proteiny a oligo/polysacharidy (např. celulózu, škrob, glykogen, chitosan nebo aminovanou sefarózu). V těchto dalších částech může být reaktivní skupina na peptidovém činidle, jako je hydroxy nebo amino skupina, mohou být použity k připojení na reaktivní skupinu nosiče, aby vznikla kovalentní vazba. Podklad také může mít nabitý povrch, který interaguje s peptidovým Činidlem. Dále podklad může mít jiné reaktivní skupiny, které jsou chemicky aktivovány, aby navázaly peptidové činidlo. Například jsou v oboru známy chlorkyanem aktivované matrice, epoxidem aktivované matrice, thio a thiopropyl gely, nitrofenylchloromravečnanová a N-hydroxysukcinimidchlormravečnanová vazba a oxiranové akrylické podklady.

Podklad může také obsahovat anorganický nosič, jako látku z oxidu křemíku (např. silikagel, zeolit, křemelinu nebo aminované sklo), na které je peptidové činidlo kovalentně vázáno přes hydroxy, karboxy nebo amino skupinu a reaktivní skupinu nosiče. Dále v některých částech je zamýšlena jako podklad liposomální nebo lipidová dvoj vrstva (přirozená nebo syntetická) a peptidová činidla jsou připojena na povrch membrány nebo jsou zabudována do membrány technikami liposomálního inženýrství. Podle jednoho přístupu liposomální multimerické podklady obsahují peptidové činidlo, které je vystaveno na povrchu dvoj vrstvy, a druhou doménu, která ukotvuje peptidové činidlo k lipidové dvojvrstvě. Kotva může být složena z hydrofóbních aminokyselinových zbytků, připomínajících známé transmembránové domény, nebo může obsahovat ceramidy, které jsou připojeny na první doménu obvyklými technikami. Podklady nebo nosiče pro použití v těle (např. pro profylaktické nebo léčebné použití) jsou vhodně fyziologické, netoxické a přednostně bez imunologické odpovědi. Uvažované nosiče pro použití v těle zahrnují poly-L-lysin, poly-D, L-alanin, lipozómy a Chromosorb* (Johns-Manville Products, Denver Co.). Ligand, konjugovaný s Chromosorbem* (Synsorb-Pk) byl pro prevenci syndromu hemolytické uremie *· · ·» ·· • · * · • · * • · · • · · • · · · · · testován na lidech a byl označen jako nemající nepříznivé reakce. (Armstrong et al. J. Infectious Diseases, 171: 1042-1045 (1995)). Pro některé části předkládající vynálezce uvažuje podávání „samotného“ nosiče (např. chybí připojené peptidové činidlo), který má schopnost vázat peptidové činidlo v těle pacienta. Tímto přístupem je předvídána léčba „prolékového typu“, ve které je podáván samotný nosič odděleně od peptidového činidla a jestliže jsou oba v těle pacienta, tak se nosič a peptidové činidlo spojí do multimerního komplexu.

Vložení linkerů, jako jsou λ linkery, vhodné délky mezi peptidové činidlo a podklad může být také uvažováno, aby se dodala vyšší flexibilita peptidového činidla a tím se překonaly stérické překážky, které mohou být zapříčiněny podkladem. Určení vhodné délky linkeru, která dovoluje optimální vazbu na kapsomerní protein, jako je p24, a/nebo zasahování do skládání kapsidy a/nebo zabránění virové infekce, jako je HIV nebo SIV infekce, mohou být určeny vyhodnocením peptidových činidel s různými linkery v testech podrobně popsaných v předkládaném sdělení.

Složený podklad, obsahující více než jeden typ peptidového činidla, je také částí vynálezu. „Složený podklad“ může být nosič, pryskyřice nebo makromolekulární struktura, použitá k navázání nebo imobilizování dvou nebo více různých peptidových činidel, která se váží na kapsomerní protein, jako je p24, a/nebo zasahují do skládání kapsidy a/nebo zabraňují virové infekci, jako je HIV nebo SIV infekce. V některých částech je liposomová nebo lipidová dvoj vrstva (přírodní nebo syntetická) uvažována pro použití při konstrukci složeného podkladu a peptidových činidel, připojených k povrchu membrány nebo zabudovaných do membrány použitím technik liposomálního inženýrství.

Jak je uvedeno výše, vložení linkerů, jako jsou λ linkery, vhodné délky mezi peptidové činidlo a podklad, je také uvažováno, aby se dodala vyšší flexibilita molekule a tím se překonaly stérické překážky, které se mohou objevit. Určení vhodné délky linkeru, která dovoluje optimální vazbu na kapsomerní protein, jako je p24, a/nebo zasahování do skládání kapsidy a/nebo zabránění virové infekce, jako je HIV nebo SIV infekce, může být určena vyhodnocením ligandů s různými linkery v testech podrobně popsaných v předkládaném sdělení.

V jiné části předkládaného vynálezu mohou mít multimerní a složené podklady, diskutované výše, připojeny multimerizované ligandy, aby se vytvořil „multimerizovaný multimerní podklad“ a „multimerizovaný složený podklad“. Multimerizovaný ligand může být například získán spojením dvou nebo více ·· a· ·*·· • a

• · · · • · · a · · · • a · a· «♦ · • ♦ peptidových činidel za sebou použitím technik obvyklých v molekulární biologii. Multimerizovaná forma ligandu může být výhodná pro mnoho použití, protože je tím možno získat činidlo s lepší schopností vázat kapsomerní protein, jako je p24, a/nebo zasahovat do skládání kapsidy a/nebo zabránit virové infekci, jako je HIV nebo SIV infekce. Dále zahrnutí linkerů nebo spacerů, jako jsou flexibilní λ linkery, mezi jednotlivé domény, které tvoří multimerizované činidlo, je výhodnou částí vynálezu. Vložení λ linkerů vhodné délky například mezi proteinové vazebné domény může dodat vyšší flexibilitu molekule a může překonat stérické překážky. Podobně může inserce linkerů mezi multimerizovaný ligand a podklad dodat vyšší flexibilitu a omezuje stérické překážky, tvořené podkladem. Určení vhodné délky linkeru, která dovoluje optimální vazbu na p24 a/nebo zasahování do skládání kapsidy a/nebo zabránění HIV nebo SIV infekce, může být určena vyhodnocením ligandů s různými linkery v testech podrobně popsaných v předkládaném sdělení.

V upřednostňovaných částech byly vytvořeny různé typy podkladů, diskutovaných výše, použitím tripeptidů GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-NH₂, KQG-NH₂, ALG-NH₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH₂. Multimerické podklady, složené podklady, multimurizované multimerické podklady nebo multimerizované složené podklady, společně označované jako „podklady vázájící činidla“, jsou také přednostně připravovány použitím tripeptidů GPG-NH₂, GKG-NH₂, CQG-NH₂, RQG-nh₂, kqg-nh₂, alg-nh₂, gvg-nh₂, vgg-nh₂, asg-nh₂, slg-nh₂ a SPT-NH₂.

V diskusi, uvedené níže, jsou popsány některé části vynálezu, které mají léčebné a/nebo profylaktické použití.

Léčebné a profylaktické použití - Monomerní a multimerní peptidová činidla, zde popsaná, jsou vhodná pro léčbu pacientů buď jako preventivní krok k zabránění virových infekcí, jako je HIV nebo SIV infekce, nebo jako lék k léčbě pacientů již infikovaných viry, jako je HIV nebo SIV. Ačkoliv nikdo nemůže být léčen tripeptidy jako profylaktiky, většina vhodných pacientů jsou lidé s nebezpečím virové infekce. Takoví pacienti zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, homosexuály, prostitutky, lidí, požívající drogy nitrožilně, hemofiliky, děti narozené virem infikovaným matkám a těm v medicínských profesích, kteří jsou v kontaktu s pacienty nebo biologickými vzorky. Farmakologicky aktivní látky podle vynálezu mohou být zpracovány v souladu s obvyklými způsoby galenické farmacie k přípravě lékařských činidel pro podávání pacientům, např. savcům, zahrnujících lidi. Peptidová činidla mohou být zabudována do farmaceutického výrobku s nebo bez modifikace. Dále částí je příprava léčivých přípravků nebo léčebných činidel, která dodává několika způsoby peptidové činidlo nebo sekvenci nukleové kyseliny, kódující malý peptid. Pro příklad, a nějako omezení, jsou uvažovány DNA, RNA a virové vektory, které mají sekvence, kódující malý peptid, který potlačuje virovou replikaci přerušením kapsidového skládání. Nukleové kyseliny, kódující vhodné peptidové činidlo, mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s peptidovými činidly.

Látky zde popsané mohou být připraveny ve směsi s obvyklými masťovými základy, např. s farmaceuticky přijatelnými organickými nebo anorganickými nosičovými látkami, vhodnými pro parenterální, enterální (např. orální) nebo topikáiní aplikaci, které škodlivě nereagují s peptidovým činidlem.Vhodné, farmaceuticky přijatelné nosiče zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, vodu, roztoky solí, alkoholy, arabskou gumu, rostlinné oleje, benzylalkoholy, polyethylenglykoly, želatinu, uhlovodíky, jako je laktóza, amylóza nebo škrob, stearan hořečnatý, mastek, kyselina křemičitá, viskózní parafín, parfémovaný olej, monoglyceridy a diglyceridy mastných kyselin, estery pentaerythriolových mastných kyselin, hydroxymethylcelulóza, polyvinylpyrrolidon atd. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a, jestliže je to vhodné, smíchány s pomocnými činidly, např. mazivy, konzervačními prostředky, stabilizátory, smáčedly, umelsifikátory, solemi pro ovlivnění osmotického tlaku, pufry, zabarvujícími, aromatickými a/nebo vonnými látkami a podobnými, které škodlivě nereagují s aktivními látkami. Jestliže je to vhodné, mohou být také spojeny s jinými aktivními činidly, např. vitamíny.

V některých částech jsou terapeutická činidla, obsahující peptidová činidla, podávána v kombinaci s jinými terapeutickými činidly, které léčí virové infekce, jako je HIV infekce, aby se dosáhlo lepší virové reakce. V současné době jsou v klinické praxi používány v antivirové léčbě HIV-1 infekce u lidí čtyři různé třídy léků. Jsou to (i) nukleosidová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy (NRTI), jako je zidovidin, lamivudin, stavudin, didanosin, abacavir a zalcitabin; (ii) nukleotidová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy, jako jsou adetovir a pivaxir; (iii) nenukleosidová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy (NNRTI), jako je efavirenz, nevirapin a delavirdin; a (iv) proteázové inhibitory, jako je indinavir, nelfinavir, ritonavir, saquinavir a amprenavir. Současně použitím dvou, tří nebo čtyř různých tříd léků v kombinaci s podáváním peptidových činidel je méně pravděpodobné, že HIV získá rezistenci, protože je méně pravděpodobné, že se objeví u stejné virové částice vícenásobné mutace, které překonají různé třídy léků a peptidových činidel.

4· 44

9 9 » ·«* 99 Γ ·4 · 4 9 9 9 ·

4 · 9 « < 4 49 4 • · · 4 β · ·44· · 4 4 * • 44 ·· · · · · •44 »4 44 > ·· 4444

Το, že peptidové činidla jsou podávána v kombinaci s nukleosidovými analogy inhibitorů reverzní transkriptázy, nukleotidovými analogy inhibitorů reverzní transkriptázy, nenukleosidovými analogy inhibitorů reverzní transkriptázy a proteázovými inhibitory v dávkách a způsoby, známými odborníkům v oboru, je tak upřednostňovaná část předkládaného vynálezu. Léky, obsahující peptidová činidla a nukleosidové analoga inhibitorů reverzní transkriptázy, nukleotidová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy, nenukleosidová analoga inhibitorů reverzní transkriptázy a proteázové inhibitory, jsou také částmi předkládaného vynálezu.

Studie účinnosti léčby HIV infekce s kombinací GPG-NH2 a obvyklých antivirových činidel se nalézá v příkladu, uvedeném níže.

Příklad 4

V tomto příkladě jsou uvedeny pokusy, ve kterých byly testovány různé kombinace malého peptidů v amidové formě a AZT k určení, která ze dvou látek může doplnit jinou pro inhibici replikace HIV-1. (viz obrázek 6). 200 000 HUT78 buněk bylo tedy infikováno HIV-1 SF-2 virem při 25 TCID50 s nebo bez přítomnosti různých koncentrací GPG-NH2, AZT nebo Ritonaviru („Rito“) a kombinací těchto látek. Čísla na obrázku 6 znázorňují mikromolární koncentrace inhibujících látek. Buňky byly inkubovány s viry při 37°C 1 hod s různými inhibitory a pak byly třikrát promyty. Dále byly resuspendovány v RPMI 1640 médiu, obsahujícím antivirové činidlo a/nebo peptidy, doplněné 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS, GIBCO), penicilínem (100 υ/ml), streptomycinem (100 υ/ml) a Polybrenem (Sigma, 2 pg/ml) a kultivovány na 24 jamkové destičce (Costar Corporation) při 37 °C s 5 % CO2 s vlhkostí. Kultivační supernatanty byly shromažďovány a médium měněno každé čtyři dny až do 14 dne po infekci. Ke sledování replikace viru byl testován HIV-1 p24 antigenový protein v supernatantech použitím komerčně dostupného kitu (Abbott).

Bylo pozorováno, že GPG-NH2 zvyšuje inhibici replikace HIV-1 v přítomnosti AZT součinně, zatímco malý peptid pouze má pouze doplňkové účinky k těm, které má proteázový inhibitor Ritonavir. Nicméně tyto pokusy ověřily data, prezentovaná výše, že malé peptidy inhibují HIV-1 mechanismem mimo způsob, kterým nukleosidové analoga a proteázové inhibitory zasahují do virové replikace. Dále tyto pokusy ukázaly, že nový léčebný postup pro HIV-1 infekci, obsahující malé peptidy a AZT a/nebo Ritonavir, je účinný.

V následujícím sdělení jsou popsány dávky a způsoby podávání.

• € 0

Dávkování a způsoby podávání - Účinná dávka a způsob podání konkrétního přípravku peptidového činidla se může velmi lišit podle individuálního pacienta a stavu nemoci, stejně jako podle jiných faktorů, známým odborníkům v oboru. Léčebná účinnost a toxicita takových látek může být určena standardními farmaceutickými postupy v buněčných kulturách nebo na pokusných zvířatech, např. ED50 (dávka léčebně účinná na 50 % populace) a LD50 (dávka smrtelná pro 50 % populace). Dávkový poměr toxických k léčebným účinkům je léčebný index a může být vyjádřen jako LD50/ED50. Upřednostňovány jsou farmaceutické prostředky, které projevují vysoké léčebné indexy. Data, získaná z testů na buněčných kulturách a studiích na zvířatech, jsou použita při formulování rozmezí dávky pro použití u lidí. Dávka takových látek leží přednostně v rozmezí běžných koncentrací, které zahrnují ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Dávka, kolísající v tomto rozmezí, závisí na použité dávkové formě, citlivosti pacienta a způsobu podání.

Přesná dávka je zvolena konkrétním lékařem s ohledem na léčeného pacienta. Dávka a podání jsou upraveny tak, aby byla zajištěna vhodná hladina aktivní látky nebo pro udržení žádoucího účinku. Další faktory, které mohou být vzaty v úvahu, zahrnují závažnost stavu nemoci, věk, váhu a pohlaví pacienta; stravu, čas a frekvenci podávání, lékovou směs(i), reakci citlivosti a toleranci/odpověď na léčbu. Krátce působící léčebné směsi jsou podávány denně, zatímco dlouho působící léčebné směsi jsou podávány každý 2, 3 až 4 den, každý týden nebo každé dva týdny. V závislosti na poločasu a rychlosti odbourávání konkrétního přípravku jsou léčebné směsi podle vynálezu podávány jednou, dvakrát, třikrát, čtyřikrát, pětkrát, šestkrát, sedmkrát, osmkrát, devětkrát, desetkrát nebo vícekrát denně.

Obvyklé dávkové množství může kolísat od přibližně 1 do 100 000 mikrogramů, až do celkové dávky asi 10 gramů, v závislosti na způsobu podání. Vhodné dávky zahrnují 250 pg, 500 pg, 1 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, 450 mg, 500 mg, 550 mg, 600 mg, 650 mg, 700 mg, 750 mg, 800 mg, 850 mg, 900 mg, 1 g, 1,1 g, 1,2 g, 1,3 g, 1,4 g, 1,5 g, 1,6 g, 1,7 g, 1,8 g, 1,9 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 6 g, 7 g, 8 g, 9 g a 10 g. Dále koncentrace peptidových činidel mohou být mnohem vyšší v případech, kdy podání činidel je topikální. Molární koncentrace peptidových činidel mohou být v některých částech použita. Vhodné koncentrace pro topikální podání a/nebo pro lékařský potahovací přístroj leží v rozmezí od 100 pM do 800 mM. Upřednostňované koncentrace pro tyto případy leží v rozmezí od 500 pM do 500 mM. Například upřednostňované koncentrace pro použití při topikálních aplikací a/nebo pro

• 4 · lékařský potahovací přístroj zahrnují 500 μΜ, 550 μΜ, 600 μΜ, 650 μΜ, 700 μΜ, 750 μΜ, 800 μΜ, 850 μΜ, 900 μΜ, 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 425 mM, 450 mM, 475 mM a 500 mM. Směrnice pro konkrétní dávky a způsoby podání jsou uvedeny v literatuře (viz např. US pat. Č. 4 657 760; 5 206 444 nebo 5 225 212) a níže.

Konkrétněji dávka peptidových činidel, zde popsaných, je ta, které zajišťuje vhodné peptidové činidlo k dosažení žádoucího účinku, který zahrnuje vazbu kapsomerního proteinu, jako je p24, a/nebo ovlivnění kapsidového skládání a/nebo inhibici virové infekce, jako je HIV a SIV infekce. Dále dávka peptidového činidla přednostně vytváří v tkáních nebo v krvi nebo obojím koncentraci od přibližně 0,1 μΜ do 500 mM. Upřednostňované dávky vytváří v tkáních nebo v krvi nebo obojím koncentraci od asi 1 do 800 μΜ. Upřednostňované dávky je například množství malého peptidů, potřebné k dosažení koncentrace v tkáni nebo krvi nebo obojím 10 μΜ, 15 μΜ, 20 μΜ, 25 μΜ, 30 μΜ, 35 μΜ, 40 μΜ, 45 μΜ, 50 μΜ, 55 μΜ, 60 μΜ, 65 μΜ, 70 μΜ, 75 μΜ, 80 μΜ, 85 μΜ, 90 μΜ, 95 μΜ, 100 μΜ, 110 μΜ, 120 μΜ, 130 μΜ, 140 μΜ, 150 μΜ, 160 μΜ, 170 μΜ, 180 μΜ, 190 μΜ, 200 μΜ, 220 μΜ, 240 μΜ, 250 μΜ, 260 μΜ, 280 μΜ, 300 μΜ, 320 μΜ, 340 μΜ, 360 μΜ, 380 μΜ, 400 μΜ, 420 μΜ, 440 μΜ, 460 μΜ, 480 μΜ a 500 μΜ. Ačkoliv dávky, které vytváří v tkáni koncentraci vyšší než 800 μΜ nejsou upřednostňovány, mohou být použity v různých případech předkládaného vynálezu. Konstantní infúze peptidů může být také zajištěna, aby se udržela stála koncentrace v tkáních, jak se měří hladinami v krvi.

Vysoké tkáňové koncentrace mohou být udrženy bez poškození nízkou toxicitou peptidů. Pokusy o selektování kmenů HIV-1, rezistentních k malým peptidům (např. GPG-NH₂ rezistentní kmeny) byly až dosud neúspěšné. HIV-1 kmen HTLV-IIIB byl pasážován v přítomnosti řady ředění GPG-NH₂ (mezní ředění) po šest měsíců bez zjevných znaků vzniku rezistence in vitro.

Způsoby podání peptidových činidel zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, topikální, transdermální, parenterální, gastrointestinální, transbronchialní a transalveolární. Topikální podání se uskutečňuje přes topikálně aplikované krémy, gely, výplachy apod., obsahující peptid. Transdermální podání se uskutečňuje aplikací krémů, výplachů, gelů apod. schopných zajistit peptidovému činidlu penetrování kůží a vstoupit do krevního řečiště. Parenterální cesty podání zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, očkovací pero * 00 0 0 0 » * * · 0000 0 0 0 0 · 0 · nebo přímou injekci, jako je přímá injekce do centrálního cévního řečiště intravenózně, intramuskulárně, intraperitoneálně nebo podkožní injekcí. Gastrointestinální cesty podání zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, požití a rektální podání. Transbrochiální a transalveolární cesty podání zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, inhalaci, buď ústy nebo nosem.

Prostředky látek, obsahující peptidové činidlo, vhodných pro topikální aplikaci zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, fyziologicky vhodné implantáty, masti, krémy, výplachy a gely. Pro topikální použití podle předkládaného vynálezu je vhodná tekutá, gelová nebo pevná farmaceuticky vhodná báze, ve které jsou peptidy alespoň minimálně rozpustné. Prostředky pro topikální aplikaci jsou částečně užitečné v průběhu pohlavního styku k prevenci přenosu HIV. Vhodné prostředky pro takové použití zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, vaginální nebo anální čípky, krémy a výplachy. Prostředky peptidových činidel, vhodných pro transdermální podání, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, farmaceuticky vhodné suspenze, oleje, krémy a mastě, aplikované přímo na kůži nebo zabudované do ochranných nosičů, jako jsou transdermální přípravky („transdermální náplast“). Příklady vhodných krémů, mastí atp. jsou k nalezení například v Československém lékopise a jsou v oboru dobře známy. Příklady vhodných transdermálních přípravků jsou popsány například v US patentu č. 4 818 540, zveřejněném 4. dubna 1989 Chinenem et al., zde zahrnutým odkazem. Prostředky peptidových činidel, vhodných pro parenterální podání, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, farmaceuticky vhodné sterilní izotonické roztoky. Takové roztoky zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, fyziologický a fosfátem pufrovaný fyziologický roztok pro injekční podání do centrálního cévního řečiště intravenózně, intramuskulárně, intraperitoneálně nebo podkožní injekcí peptidových činidel.

Prostředky peptidových činidel, vhodných pro transbrochiální a transalveolární podání, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, různé typy aerosolů pro inhalace. Například pentamidin je podáván nosem pomocí aerosolu pacientům s AIDS k zabránění pneumonii, způsobené pneumocystis carínii. Zařízení, vhodná pro transbrochiální a transalveolární podání peptidů, jsou také částmi vynálezu. Taková zařízení zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, rozprašovače a odpařovače. Mnoho forem běžně dostupných rozprašovačů a odpařovačů může být snadno upraveno pro podání peptidových činidel. Prostředky peptidových činidel, vhodných pro gastrointestinální podání, zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, farmaceuticky vhodné prášky, tablety nebo tekutiny pro požití a čípky pro rektální podání. Díky nejvíce obvyklým cestám HIV infekce a snadnosti • «· · · · · · · · • · · » · « · · · · φ ··· · · · · · · · » · ··· ·····»· · A • · · ·· · · · · «·· ·· ·· 9 9· 999 9 použití je gastrointestinální podání, zejména orální, upřednostňovanou částí předkládaného vynálezu. Bylo připraveno pět set miligramových tablet, které mají tripeptid (GPG-NH₂) a byly stálé minimálně 12 měsíců, jestliže byly uchovávány při 4 °C. Jak bylo dříve ukázáno v jiných virus-hostitelských systémech, specifická antivirová aktivita malých peptidů může být po orálním podání detekována v séru. (Miller et al., Appl. Microbiol., 16:1489 (1968)). Vzhledem k tomu, že se malé peptidy podle všeho vyhnou degradaci pacientovým trávicím systémem, jsou ideální pro orální podání.

Peptidová činidla jsou také vhodná pro použití v situacích, kde je důležitá prevence HIV infekce. Například zdravotníci jsou stále vzstaveni pacientům, kteří mohou být HIV pozitivní a jejichž výměšky a tělesné tekutiny obsahují HIV virus. Dále peptidová činidla mohou být zabudovány do antivirových přípravků pro použití v průběhu pohlavního styku, aby se zabránilo přenosu HIV. Takové přípravky jsou známy v oboru a také jsou popsány v mezinárodní přihlášce, publikované v PCT publikaci číslo W090/04390 3. května 1990 Modakem et al., který je zde zahrnut celý odkazem.

Aspekty vynálezu také zahrnují ochranné vrstvy pro lékařské vybavení, jako jsou rukavice, povlaky a pracovní povrchy, které ochraňují proti přenosu HIV. Volitelně peptidová činidla mohou být napuštěny do polymerického lékařského vybavení. Zejména upřednostňovány jsou ochranné vrstvy pro lékařské rukavice a kondomy. Ochranné vrstvy, vhodné pro použití v lékařském vybavení, mohou být zajištěny práškem, který obsahuje peptidy nebo polymerickými ochrannými vrstvami, do kterých jsou peptidová činidla suspendována. Vhodné polymerické materiály pro ochranné vrstvy jsou ty, které jsou fyziologicky vhodné a přes které se může léčebně účinné množství peptidového činidla šířit. Vhodné polymery zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, polyuretan, polymetakrylát, polyester, polyethylen, polypropylen, polystyren, polytetrafluoroethylen, polyvinylchlorid, acetylcelulózu, silikonové elastomery, kolagen, hedvábí atp. Takové ochranné vrstvy jsou například popsány v US patentu č. 4 612 337, vydaného 16. září 1986 Foxem et al, který je zde zahrnut celým odkazem.

Ve sdělení, uvedeném níže, je popsáno několik toxikologických studií malých peptidů a jsou zveřejněny přístupy k testování toxicity jiných peptidových činidel.

Toxikologické studie malých peptidů - Některé toxikologické studie byly provedeny s GPG-NH₂ a tyto testy mohou být zopakovány s použitím mnohem více peptidů (např. GKG-NH₂, cqg-nh₂, rqg-nh₂, kqg-nh₂, alg-nh₂, GVG-NH₂, VGG-NH₂, ASG48 • » · * · · · · · • · · · · » · ·

-NH₂, SLG-NH₂ a SPT-NH2). (viz např. US patent č. 5 627 035 Vahlnea et al.). Vliv

GPG-NH₂ na kultivované lymfocyty je popsán v následujícím příkladě.

Příklad 5

V tomto příkladě jsou předloženy některé studie, které se zaměřují na účinek malých peptidů na kultivované lymfocyty. Obecně žádný z peptidů, použitých v testech inhibice viru HIV-1 při koncentracích až do 2 mM, nevykazoval žádný toxický účinek na použité buňky, jak bylo určeno z jejich morfologického vzhledu, barvením trypanovou modří a buněčným růstem. Toxicita GPG-NH2 byla dále testována v (i) testem snížení plaku a (ii) testem inhibice výtěžku HSV-1. GPG-NH2 nebyl úspěšný ve snížení HSV-1 replikace v koncentracích až do 1 mM, což nejenom potvrzuje jeho žádnou toxicitu, ale také ukazuje, že malý peptid selektivně inhibuje viry, příbuzné s HIV-1. Tento názor byl posílen pozorováním, že GPG-NH2 také není schopen inhibovat kteréhokoliv z virů chřipky nebo dětské obrny.

Dále toxicita byla měřena toxicita pro normální lidské lymfocytní buňky (PBMC). Při dávce vysoké 2 mM a expozici 4 dny nevykazoval GPG-NH2 znatelný účinek na životaschopnost kultivovaných monocytů a lymfocytů. Také byl testován účinek GPG-NH2 na in vitro proliferační odpověď lidských mononukleárních buněk. GPG-NH₂projevil při dávce 20 μΜ okrajově, pokud vůbec, přímo antiproliferační vlastnosti na T buňky a neměl vliv na funkci vedlejších buněk (např. monocytů a dendrických buněk).

In vitro 50% cytotoxická koncentrace (CC50) různých buněčných linií byla také stanovena. Proto bylo různými koncentracemi GPG-NH2, až do 40 mM, doplněno kultivační médium T-buněčných linií HUT78, H9, CEM-SS, MT-2 a (ne) indukovaných ACH-2, stejně jako makrofágové odvozené linie Jurkat-tat III, THP-1 a (ne) indukovaných U-l buněk. Po 3 dnech inkubace byl počítán počet buněk. Vyloučení barvy trypanové modře a počítání buněk HUT78, MT-2 a Jurkat-tat III ukázaly pro 3 dny kultivace v přítomnosti 40 mM GPG-NH2 asi 40% inhibici buněčného růstu. H9, CEM-SS a THP-1 ukázaly při této koncentraci GPG-NH₂ nižší než 20% pokles počtu buněk. Proto poměr CC50/IC50 in vitro je >10⁴. Toxikologické pokusy, předložené výše, prokazují, že malé peptidy jsou málo toxické pro lymfocyty i ve vysokých koncentracích.

Také byly analyzovány účinky velkých dávek malého peptidů na hlodavce a tyto pokusy jsou předloženy v dalším příkladě.

Příklad 6

V tomto příkladě jsou předloženy výsledky z několika in vivo toxikologických studií s malými peptidy, podávanými ve velkých dávkách hlodavcům. V prvním pokuse byla podána jedna velká dávka malého peptidů a byly analyzovány toxické účinky. Intravenózní injekční podáníGPG-NH₂ do periferní žíly dospělých myší v koncentracích až do 1 g na kilo tělesné hmotnosti nemělo na zvířata zřetelné toxické účinky. Ve druhém pokuse bylo více dávek různých množství malého peptidů podáno myším na téměř tři týdny. Skupiny myší (pět myší v každé skupině) byly dávány intraperitoneální injekce GPG-NH₂ (0,01, 0,1 a 1 g na kilo tělesné hmotnosti a den) od 6 dne věku. Denní injekce pokračovaly 18 dní. Ve srovnání s kontrolami nebyl významný vliv GPG-NH₂na myši. V podobném pokusu byla provedena čtyřtýdenní toxikologická studie GPG-NH₂ Scantoxem A/S v Dánsku. GPG-NH₂ byl podáván orálně králíkům až do 1 g na kilo tělesné hmotnosti denně dvacet osm dní. Žádný znak toxicity na zvířata nebyl pozorován. Tyto in vivo toxikologické pokusy dokazují, že malé peptidy, popsané zde, jsou málo toxické pro savce a mohou být bezpečně podány ve velkých dávkách.

V dalších studiích byla analyzována stabilita malých peptidů v lidské krvi a plazmě. Příklad, uvedený níže, popisuje tyto experimenty.

Příklad 7

Tento příklad popisuje několik studií, které byly provedeny ke zjištění stability malých peptidů v lidské krvi a plasmě. Proto byla lidská krev odebrána čerstvá a zpracována EDTA. Plasma byla oddělena centrifugací při 2 500 rpm 20 minut. GPG-NH₂ byl přidán do krve nebo plasmy při koncentraci 10 mM nebo 50 mM, následovala inkubace při 37 °C 1, 2 a 4 hodiny. Jako kontrola byl GPG-NH₂ přidán do RPMI 1640 média, doplněného 10 % (v/v) teplem inaktivovaným sérem z hovězího zárodku (FBS, GIBCO), penicilínem (100 u/ml), streptomycinem (100 u/ml) a Polybrenem (Sigma, 2 pg/ml) a inkubovány stejným způsobem. Po inkubaci při 37 °C byla krev, obsahující GPG-NH₂, odstředěna při 2 5000 rpm 20 minut pro izolaci plasmy. Některé vzorky plasmy byly zpracovány CaCl₂ při koncentraci 5 mM při 37 °C 10 minut, následovalo odstředění při 13 000 rpm 30 minut a supernatant byl označen jako CaCl₂ zpracovaná plasma. Pak všechny vzorky plasmy, obsahující GPG-NH₂, byly zředěny RPMI médiem do konečné koncentrace 20 μΜ nebo 100 μΜ GPG-NH₂ (500 násobné ředění) a byly pak použity pro testy HIV-1 replikace.

Testy replikace byly provedeny na HUT78 buňkách a byl použit HIV-1 SF-2 virový kmen. Ve stručnosti, přibližně 200 000 buněk bylo resuspendováno ve zředěném, GPG50

-amid obsahujícím médiu, plasmě nebo plasmě z krve. GPG-amid obsahující médium, plasma nebo plasma z krve byly inkubovány s buňkami buď 1 hod, 2 hod nebo 4 hod při 37 °C. Dodatečně byl přidán SF-2 virus při 25 TCID50. Po adsorpcí 1 hodinu byly buňky promyty třikrát v RPMI médiu, pak resuspendovány v čisté, GPG-amid obsahující plasmě a inkubovány při 37 °C v 5 % CO₂ s vlhkostí. Kultivační supernatanty byly odebrány každé čtyři dny a médium bylo měněno až do 14 dne po infekci. Ke sledování replikace viru byl testován HIV-1 p24 antigenový protein v supernatantech použitím komerčně dostupného kitu (Abbott). HIV-1 p24 test byl proveden se supernatanty ze 7 dne a 14 dne po infekci. Nebyla pozorována významnější odlišnost ve schopnosti inhibovat HIV-1 GPG-amid obsahujícím médiem, plasmou nebo plasmou z krve.

Stabilita GPG-NH₂ v lidské plasmě byla také stanovena chemicky chromatografii na tenké vrstvě (TLC). (viz obrázek 7). V tomto pokusu byl ^l4C GPG-NH₂ inkubován s lidskou plasmou při 37 °C 30 minut, dvě hodiny nebo osm hodin a pak byly proteiny rozděleny TLC a byly vizualizovány expozicí chromatografu na autoradiografický film. Jak je ukázáno na obrázku 7 (dráhy HpO, Hp0,5, Hp2 a Hp8), byla pozorována malá změna mobility malého peptidu. Ačkoliv mobilita malého peptidu vzrostla něco po 30 minutách inkubace v lidské plasmě při 37 °C, nebyla další změna mobility pozorována až do 8 hodin. Analýza hmotnostním spektrometrem (elektrosprejová analýza) TLC skvrn ukázala, že všechny skvrny, včetně skvrny se zvýšenou mobilitou, byly GPG-NH₂. Pokusy, uvedené výše, prokázaly, že malé peptidy zde popsané jsou stále v lidské krvi a plasmě; uchovávají si antivirové vlastnosti a nejsou degradovány plasmovými proteinázami.

Ve sdělení, uvedeném níže, jsou popsány některé studie adsorpce, distribuce a metabolismu malých peptidů.

Adsorpce, distribuce a metabolismus malých peptidů - Protože je vhodné orální podání léků, obsahujících malý peptid, byla určena kyselá stabilita malých peptidů inkubací ¹⁴C značeného GPG-NH₂ v roztoku 50 mM KC1 a 0,1 M HCI po různé časové periody. Po kyselé hydrolýze byly analyzovány radioaktivně značené tripeptidy chromatografii na tenké vrstvě (TLC) a HPTLC destička byla vyvolána 25 % methanol : 25 % isopropanol : 15 % butanol : 35 % (0,1 N HOAc a 0,1 N NaOAc). Jak můžeme vidět na obrázku 8, neměla inkubace tripeptidu až do 24 hodin žádný vliv na mobilitu a proto ani na molekulovou strukturu GPG-NH₂. Tento výsledek potvrdil, že malé peptidy přežívají kyselé podmínky podobné těm, které se nalézají v žaludku.

• · • ·

·· · * » ♦ * • · · 4 4 4·

4 944 ·♦···· si ··♦···

Dále byl studován v řadě pokusů in vitro příjem malých peptidů z kultivačního média do buněk. Proto HUT78, Jurkat-tat III a MT-2 buňky byly inkubovány se 165 nCi (ekvivalent 0,7 μΜ GPG-NH2) ¹⁴C značného GPG-NH2. Příjem malého peptidů byl pozorován a mezi 8 % (Jurkat-tat III buňky) a 20 % (HUT₇s buňky) GPG-NH₂ bylo zabudováno do buněk. Tyto výsledky prokázaly, že zabudování malých peptidů do více typů buněk bylo účinné.

Dále byl analyzován in vivo příjem malých peptidů v králících. Králíci byly krmeny ^l4C GPG-NH2 a po různých časových úsecích byla ze zvířat odebrána krev, moč a vzorky tkání. Vzorky králičí moče, odebrané osm hodin po nakrmení, a králičí plasmy, odebrané 30 minut, dvě hodiny a osm hodin po krmení, byly rozděleny na TLC destičce, jak je ukázáno na obrázku 7 (označené proto moč8, rp0,5, rp2 a rp8). Všechny tkáně byly po pitvě před provedením nějakého testu uchovávány v -20 °C. Deset až třicet mikrogramů vzorků tkání bylo odebráno ze tří různých míst každého orgánu, analyzováno a tkáň orgánu byla následně rozpuštěna ve 250 μΐ tkáňového solubilizéru (OptiSolv, LKB-Wallac) při 45 °C čtyři až šest hodin. Homogenizované roztoky tkání byly odbarveny přídavkem 50 μΐ 30% H2O2 a 100 μΐ isopropanolu před přidáním 3 ml 0,05 M HCI okyselujícího scintilačního koktejlu (Luma Gel, Lumac/3M). Radioaktivita byla určena beta scintilačním počítačem (LKB-Wallac 1218 Rack Beta). Volný/nenavázaný GPG-NH2 v plasmě byl shromážděn precipitací jednoho dílu plasmy a dvou dílů ethanolu, následovala inkubace při -70 °C jednu hodinu a odstředění při 20 OOOxg 15 minut při 4 °C. Vzorky krevních buněk byly ředěny PBS (v poměru 2 díly krevních buněk na 1 díl PBS) před odebráním a analyzováním 10 μΐ směsi jako tkáňových vzorků. Pět až 20 μΐ vzorků plasmy a moči byly před kvantifikací přímo smíchány se 3 ml Ready Safe (Beckman) kapaliny. Výsledky, udávající distribuci a základ pro výpočet maximálního příjmu, jsou ukázány v tabulkách 10 a 11. Hodnoty jsou vyjádřeny v nCi.

tabulka 11

číslo zvířete* nCi/ml nebo g tkáně	1	2	3	4	5	prům
mozek	48	34	31	30	33	35
ledviny	450	491	467	446	477	466
játra	599	413	454	507	503	495

• · • · 9

slezina	383	428	414	195	413	366
brzlík	366	288	290	338	372	331
krevní buňky	90	81	99	95	101	93
plasma	140	126	121	142	124	130
moč	5 846	5 068	6 841	4 557	5 986	5 660
celková moč	7 016	7 096	3 284	283	2 395	4 015

*zvířata byla usmrcena po 4 hodinách.

tabulka 12

číslo zvířete*	6	7	8	9	10	prům
mozek	43	27	28	25	29	30
ledviny	255	488	461	401	468	415
játra	537	419	478	458	578	494
slezina	307	281	257	336	285	293
brzlík	340	350	323	349	311	334
krevní buňky	51	72	87	71	108	78
plasma	138	123	135	129	148	135
moč	2 992	5 040	3 121	4 297	2 175	3 525
celková moč	6 463	6 653	11 173	10 227	7 613	8 426

* zvířata byla usmrcena po 8 hodinách.

Výpočet maximálního příjmu byl určen následovně. Celkové podání bylo 800 pCi/kg králičí tělesné váhy (160 pCi/kg celkem na zvíře). Za předpokladu, že GPG-NH₂ a jeho metabolity byly rovnoměrně distribuovány v těle, GPG-NH₂, přítomný v tkáních, mohl být průměrné impulzy/g z různých tkání z celkového množství studovaných zvířat, dělený celkovým počtem zvířat a násobený tělesnou váhou a faktorem 0,9. Tento faktor je odvozen vynecháním objemu krve, protože odhad objemu krve je zhruba 10 % průměrné tělesné váhy. Například (z dat zvířat 1 až 5) jestliže celková tělesná váha pěti králíků byla 207 g a radioaktivita, detekovaná z různých tkání, byla (35+466+495+366+331) nebo 1 693 nCi a radioaktivita, detekovaná v moči, byla 4 015 nCi, maximální příjem malého peptidu mohl být spočítán jako:

tkáň: (35+466+495+366+331)/5*207*0,9=63,240 nCi tekutiny: krev (93+130)*207*0,l=4,642 nCi moč: 4,015 nCi celkem: (63,24+4,642+4,015)/800*0,207=0,4342 nebo 43 % maximálního příjmu • ·* 9· · 9 9 9 9 • 999 · · · 9999 • 99 9 · 9 · 99 9 • 9 9«9 9999999 9 9 •9999 99 · 999999

Relativní rozdělení zadrženého/imobilizovaného GPG-NH₂ a jeho metabolitů ve vzorcích tkání bylo pozorováno nejvyšší v játrech, následovaly ledviny, následovala slezina, následoval brzlík, následoval mozek. Byla pozorováno, že radioaktivita moče se zdvojnásobila mezi 4 a 8 hodinou. Hmotnostní spektrometrická data (elektrosprejová hmotnostní spektrometrie) radioaktivní skvrny z moči z TLC destičky ukázala, že pouze malá část radioaktivity v moči byl neporušený GPG-NH₂. (viz obrázek 7). Výsledky ze studií in vivo, uvedených výše, prokázaly, že významné množství malých peptidů je účinně dodáno do krve, plasmy a některých odlišných tkání.

Dále, jak je ukázáno na obrázcích 9 a 10, významné množství malého peptidu zůstává v plasmové frakci po dlouhý časový úsek. Na obrázku 9 je ukázáno rozdělení radioaktivity mezi krevní buňky, vázající plasmové proteiny, stejně jako na proteiny nenavázaná (volná) plasmová radioaktivita. Odstranění radioaktivity z plasmové frakce je znázorněno na obrázku 10. Tripeptid GPG-NH₂ má poločas 86,5 minut. Proteiny vázaná radioaktivita byla testována po precipitací s dvěma díly 99,5 % ethanolu. Z dat příjmu a rozdělení a TLC dat, uvedených výše, byl vypočítán minimální příjem neporušeného GPG-NH₂, získaného z plasmy, a jednu hodinu po příjmu králíky mohlo být alespoň 1 % pozřeného GPG-NH₂ získáno jako GPG-NH₂ nenavázaný na proteiny v plasmě.

Pro hodnocení biologicky aktivního GPG-NH₂ v plasmě zvířat, krmených malým peptidem, byly připraveny vzorky plasmy z krve, získané z králíků při čtyřtýdenní toxikologické studii den po posledním krmení. Vzorky plasmy byly zředěny 1/5 v RPMI médiu a byly podány PBMC, infikovaných SF162 kmenem HIV-I, jak je uvedeno výše. Virová nakažlivost byla pak sledována sedmý, jedenáctý a čtrnáctý den po infekci detekcí množství p24 v supernatantu použitím komerčně dostupného testu. (Abbott). Jak je ukázáno v tabulce 12, séra, získaná z králíků, ošetřených malým peptidem, si udrželi schopnost inhibovat virovou nakažlivost. V některých případech podání tak málo jako 10 μΜ GPG-NH₂ zajistilo dostatečnou koncentraci malého peptidu v plasmě, umožňující inhibovat HIV-1 replikaci. Procenta snížení byla vypočítána jako v tabulce • φ

6. Výsledky z těchto pokusů potvrdila, že malé peptidy, zde popsané, mohou být udržovány v těle zvířat v koncentracích, která účinně inhibují HIV replikaci.

tabulka 13

zvíře #.	podávané GPG (mg/ml)	p24 (pg/ml)	% snížení
pok. 1 den 7
14	0	543,0	0
34	10	93,3	82,8
53	30	24,0	95,6
73	100	174,7	67,8
den
14
14	0	22678	0
34	10	1636	92,8
53	30	938	95,9
73	100	9211	59,4
pok. 2 den 7
16	0	321,8	0
36	10	219,2	31,9
56	30	194,3	39,6
76	100	173,5	46,1
den
14
16	0	4075,4	0
36	10	4760,8	0
56	30	3574,4	12,3
76	100	2203,7	45,9
pok. 3 den
18	0	183,9	0
38	10	255,6	0
58	30	107,3	41,7
78	100	96,9	47,3

den * 4 • 4 4

44444 4 ·· • 4 4 4

4 4 • 4 4

4 4 4 4 4

4 44 4444

18	0	7578,4	0
38	10	6700,6	11,6
58	30	6893,0	9,1
78	100	7578,4	0
pok. 4 den 11
13	0	242	0
33	10	170	29,8
52	30	487,4	0
71	100	51,7	78,6
pok. 5 den 7
15	0	304,8	0
35	10	79,6	73,9
55	30	439,3	0
75	100	60	80,3

Proteiny z celé plasmy byly také analyzovány kolonovou chromatografií a frakcionovány a surový protein byl oddělen elektroforézou s dodecylsulfátem sodným na polyakrylamidovém gelu (10%)) (SDS/PAGE). Vzorky králičí plasmy byly částečně vyčištěny gelovou (Sepharose G-50, Pharmacia) filtrací (0,4x6 cm) v pufru 10 mM Tris-HCl pH 8,3 a 50 mM KC1. Eluát byl pak rozdělen ionexovou chromatografií použitím postupně se zvyšujícího gradientu NaCI v pufru 10 mM Tris-HCl pH 8,3 (Sepharose CL-6B DEAE, 0,4x6 cm). Eluát byl sledován a rozdělen podle radioaktivity (Ready Safe, Beckman; LKB1218, Švédsko). Proteinové frakce se silným signálem byly rozděleny na 10% SDS-PAGE a byly později blotovány na PVDF (polyvinyldendifluorid, BioRad) membránu před tím, než s nimi byla provedena N-koncové aminokyselinové sekvenování (Applied Biosystems Procise Sequencer, USA). Jak je ukázáno na obrázku 11, po 60 minutách po krmení zvířat bylo pozorováno malé množství radioaktivity kovalentně spojené s proteiny. Proteiny, značené Bl až B4 byly sekvenovány a určeny jako alfa-1 antitrypsin (Bl), pentaxin (B-2), C-reaktivní protein (B-3) a B-4 nemohl být určen. Tyto proteiny jsou všechny syntetizovány v játrech. Jeden výklad je, že hydrolyzovaný GPG-NH₂ byl znovu využit v proteosyntéze v játrech. Tyto pokusy potvrdili, že malé peptidy jsou metabolizovány v těle a protože * ·« ·· 4 ·4 44

9 4 4 9 9 4 9 ·

4 4 4 9 9 9 9 4

4 9 4 9 4944444 · · <6 ·········

Μ 4 9 4 4 9 9 9 9 9 9 4 4 4 určené asociované proteiny (B-l, B-2 a B-3) jsou všechny syntetizovány v játrech, hydrolýza a znovu využití malých peptidů nastává v játrech.

Ačkoliv vynález byl popsán s odkazy na některé části a příklady, rozumí se, že mohou být provedeny různé změny bez odchýlení se od ducha vynálezu. Proto je vynález omezen pouze následujícími nároky.

-P

SEZNAM SEKVENCÍ <110> Anders Vahlne <120> peptidy, které blokují virovou nakažlivost, a způsoby jejich použití <130> TRIPEP.003VEP <160> 10 <170> FastSEQ pro Windows verze 3.0 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> oligonukleotid <400> 1 cgtatccaga ggagagcatt tgttacaata gg 32 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> oligonukleotid <400> 2 gtgccacctg tcgactaaga aaccat

<210> 3 <211> 86 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> uměle připravený peptid <400> 3

Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Lys Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe

10 15

Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu Arg Ala Glu Gin Ala 20 25 30

Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr Leu Leu Val Gin Asn 35 40 45

Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Lys Ala Leu Gly Pro Ala Ala 50 55 60

Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly 65 70 75 80

His Lys Ala Arg Val Leu <210> 4 <211> 86 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> uměle připravený peptid <400> 4

Í7

399999 9 9 • ··

9999

Asn Pro Thr Asn Ile Leu Asp Ile Lys Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe 15 10 15

Gin Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Arg Ala Glu Gin Thr 20 25 30

Asp Pro Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gin Thr Leu Leu Ile Gin Asn 35 40 45

Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly Met Asn Pro 50 55 60

Thr Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly 65 70 75 80

Gin Lys Ala Arg Leu Met <210> 5 <211> 86 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> uměle připravený peptid <400> 5

Asn Pro Val Asn Ile Leu Asp Ile Lys Gin Gly Pro Lys Glu Pro Phe 15 10 15

Gin Ser Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Ser Leu Arg Ala Glu Gin Ala 20 25 30

Asp Pro Ala Val Lys Asn Trp Met Thr Gin Thr Pro Leu Ile Gin Asn 35 40 45

Ala Asn Pro Asp Cys Lys Leu Val Leu Lys Gly Leu Gly Met Asn Pro 50 55 60

Thr Leu Glu Glu Met Leu Thr Ala Cys Gin Gly Val Gly Gly Pro Gly 65 70 75 80 fcfc • · <

(fiO

4• · • fcfcfc • fcfcfcfc · · • fc • · «

fc • fcfc*

Gin Lys Ala Arg Leu Met 85 <210> 6 <211> 85 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> uměle připravený peptid <400> 6

Asp Pro Ser Trp Ala Ser Ile Leu Gin Gly Leu Glu Glu Pro Tyr His 15 10 15

Ala Phe Val Glu Arg Leu Asn Ile Ala Leu Asp Asn Gly Leu Pro Glu 20 25 30

Gly Thr Pro Lys Asp Pro Ile Leu Arg Ser Leu Ala Tyr Ser Asn Ala 35 40 45

Asn Lys Glu Cys Gin Lys Leu Leu Gin Ala Arg Gly His Thr Asn Ser 50 55 60

Pro Leu Gly Asp Met Leu Arg Ala Cys Gin Thr Trp Thr Pro Lys Asp 65 70 75 80

Lys Thr Lys Val Leu <210> 7 <211> 87 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence <220>

•50 * 0 0

0··

0 0 0

0 0 0 0

0 0 0

0· 00 <223> uměle připravený peptid <400> 7

Asp Pro Gly Ala Ser Leu Thr Gly Val Lys Gin Gly Pro Asp Glu Pro 15 10 15

Phe Ala Asp Phe Val His Arg Leu Ile Thr Thr Ala Gly Arg Ile Phe 20 25 30

Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Tyr Val Lys Gin Leu Ala Tyr Glu 35 40 45

Asn Ala Asn Pro Ala Cys Gin Ala Ala Ile Arg Pro Tyr Arg Lys Lys 50 55 60

Thr Asp Leu Thr Gly Tyr Ile Leu Cys Ser Asp Ile Gly Pro Ser Tyr 65 70 75 80

Gin Gin Gly Leu Ala Met Ala <210> 8 <211> 82 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> uměle připravený peptid <400> 8

Leu Ala Gly Leu Lys Gin Gly Asn Glu Glu Ser Tyr Glu Thr Phe Ile 15 10 15

Ser Arg Leu Glu Glu Ala Val Tyr Arg Met Met Pro Arg Gly Glu Gly 20 25 30

Ser Asp Ile Leu Ile Lys Gin Leu Ala Trp Glu Asn Ala Asn Ser Leu 35 40 45

Cys Gin Asp Leu Ile Arg Pro Ile Arg Lys Thr Gly Thr Ile Gin Asp 50 55

ÚJ • φ* φφφ · φ φ « φ · · · φ · φ • φ · · · φφ * φ e » φ · · · • φφφφφ φφφ ·* φ • φ *· • φ φ φ φ φ * φφ· » φφφ • φ »···

Tyr Ile Arg Ala Cys Leu Asp Ala Ser Pro Ala Val Val Gin Gly Met 65 70 75 80

Ala Tyr <210> 9 <211> 87 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence <220>

<223> uměle připravený peptid <400> 9

Thr Asn Leu Ala Lys Val Lys Gly Ile Thr Gin Gly Pro Asn Glu Ser 1 5 10 15

Pro Ser Ala Phe Leu Glu Arg Leu Lys Glu Ala Tyr Arg Arg Tyr Thr 20 25 30

Pro Tyr Asp Pro Glu Asp Pro Gly Gin Glu Thr Asn Val Ser Met Ser 35 40 45

Phe Ile Trp Gin Ser Ala Pro Asp Ile Gly Arg Lys Leu Glu Arg Leu 50 55 60

Glu Asp Leu Arg Asn Lys Thr Leu Gly Asp Leu Val Arg Glu Ala Glu 65 70 75 80

Arg Ile Phe Asn Lys Arg Glu <210> 10 <211> 93 <212> PRT <213> uměle připravená sekvence

Τ' • ·· ·· » · • · · « Φ Φ • · · «·· ·

Φ· • · • · • · ♦ • Φ ··

ΦΦ • φ • φ • φ φ φ φ φ φ Φ·

Φ » ···*

ΦΦ-·' · <220>

<223> uměle připravený peptid <400> 10

Glu Pro Thr Asp Pro Trp Ala Asp lle Met Gin Gly Pro Ser Glu Ser 15 10 15

Phe Val Asp Phe Ala Asn Arg Leu lle Lys Ala Val Glu Gly Ser Asp 20 25 30

Leu Pro Pro Ser Ala Arg Ala Pro Val lle lle Asp Cys Phe Arg Gin 35 40 45

Lys Ser Gin Pro Asp lle Gin Gin Leu lle Arg Ala Ala Pro Ser Thr 50 55 60

Leu Thr Thr Pro Gly Glu lle lle Lys Tyr Val Leu Asp Arg Gin Lys 65 70 75 80

Thr Ala Pro Leu Thr Asp Gin Gly lle Ala Ala Ala Met

90

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10. 11. 12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

Peptid, vyznačující se tím, že je vybrán ze skupiny, která se skládá z Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂.

Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Gly-Lys-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Arg-Gln-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Cys-Gln-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Lys-Gln-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Ala-Leu-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Ser-Leu-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Gly-Val-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Val-Gly-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Ala-Ser-Gly-NH₂. Peptid podle nároku 1, vyznačující se tím, že peptid je Ser-Pro-Thr-NH₂.

Peptid podle jakéhokoliv nároku 1 až 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje farmaceuticky vhodný nosič.

Peptid podle jakéhokoliv nároku 1 až 11, vyznačující se tím, že dále obsahuje podklad.

Použití jakéhokoliv z peptidů podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že je v léku.

Použití jakéhokoliv z peptidů podle nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že je v léku za účelem léčby nebo prevence HIV infekce.

Použití tripeptidu v amidové formě v léku za účelem inhibování skládání kapsidy, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid se skládá ze vzorce X]X₂X₃-NH₂, kde Xi, X₂ a X3 je nějaká aminokyselina, uvedený tripeptid není Gly-Pro-Gly-NH₂ a uvedený tripeptid má sekvenci, která odpovídá sekvenci kapsidového proteinu uvedeného viru.

Použití podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený virus je retrovirus.

Použití podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený virus je lentivirus.

Použití podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený virus je HIV.

Podle nároku 16, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je vybrán ze skupiny, která se skládá z Gly-Lys-Gly-NH₂, Arg-Gln-Gly-NH₂, Cys-Gln99 ·9 » 9 9 4 • 99 9 9

9 9 9

-Gly-NH₂, Lys-Gln-Gly-NH₂, Ala-Leu-Gly-NH₂, Gly-Val-Gly-NH₂, Val-Gly-Gly-NH₂, Ala-Ser-Gly-NH₂, Ser-Leu-Gly-NH₂ a Ser-Pro-Thr-NH₂.

21. Způsob určení tripeptidu v amidové formě pro zabudování do antivirového léku, vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) vybrání tripeptidové sekvence, která odpovídá kapsidové sekvenci viru;

(b) připravení tripeptidu v amidové formě, který se skládá z uvedené tripeptidové sekvence;

(c) spojení množství buněk, infikovaných uvedeným virem, s účinným množstvím uvedeného tripeptidu; a (d) určení, zda uvedené spojení má za následek inhibici množení uvedeného viru.

22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený virus je retrovirus.

23. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený virus je lentivirus.

24. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedený virus je HIV.

25. Použití tripeptidu v amidové formě v léku za účelem inhibování množení HIV, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid se skládá ze vzorce XiX₂X₃-NH₂, kde Xj, X₂ a X₃ je nějaká aminokyselina, uvedený tripeptid není Gly-Pro-Gly-NH₂ a uvedený tripeptid má sekvenci, která odpovídá sekvenci p24.

26. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Gly-Lys-Gly-NH₂.

27. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Arg-Gln-Gly-NHi.

28. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Cys-Gln-Gly-NHz.

29. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Lys-Gln-Gly-NH₂.

30. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Ala-Leu-Gly-NH₂.

31. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Gly-Val-Gly-NH₂.

32. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Val-Gly-Gly-NH₂.

33. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Ala-Ser-Gly-NH₂.

• 4 ·· » · · *

4934. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Ser-Pro-Thr-NH₂.

35. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený tripeptid je Ser-Pro-Thr-NH₂.

36. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený lék dále obsahuje antivirový lék, vybraný ze skupiny, která se skládá z nukleosidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nukleotidových analogů inhibitorů reverzní transkriptázy, nenukleosidových inhibitorů reverzní transkriptázy a proteázových inhibitorů.

37. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený lék je připraven pro topikální podání.

38. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený lék je připraven pro transdermální podání.

39. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený lék je připraven pro parenterální podání.

40. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený lék je připraven pro gastrointestinální přípravek.

41. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený lék je připraven pro transbronchiální podání.

42. Použití podle nároku 25, vyznačující se tím, že uvedený lék je připraven pro transalveolární podání.