CZ20031154A3 - Činidla interagující s draslíkovým kanálem a jejich použití - Google Patents

Činidla interagující s draslíkovým kanálem a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ20031154A3
CZ20031154A3 CZ20031154A CZ20031154A CZ20031154A3 CZ 20031154 A3 CZ20031154 A3 CZ 20031154A3 CZ 20031154 A CZ20031154 A CZ 20031154A CZ 20031154 A CZ20031154 A CZ 20031154A CZ 20031154 A3 CZ20031154 A3 CZ 20031154A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
seq
nucleic acid
amino acid
disease
polypeptide
Prior art date
Application number
CZ20031154A
Other languages
English (en)
Inventor
Kenneth Rhodes
Maria Betty
Huai-Ping Ling
Wenqian An
Original Assignee
Millennium Pharmaceuticals, Inc.
Wyeth
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/670,756 external-priority patent/US7078481B1/en
Application filed by Millennium Pharmaceuticals, Inc., Wyeth filed Critical Millennium Pharmaceuticals, Inc.
Publication of CZ20031154A3 publication Critical patent/CZ20031154A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Membrány savčích buněk jsou významné pro strukturální integritu a aktivitu mnoha buněk a tkání. Zejména významné pro fyziologii membrán je studium transmembránových iontových kanálů, které přímo řídí různé farmakologické, fyziologické a buněčné procesy. Bylo identifikováno mnoho iontových kanálů, včetně vápníkových, sodíkových a draslíkových kanálů, které byly zkoumány pro určení jejich rolí v buňkách obratlovců a hmyzu.
Z důvodu účasti na udržování normální buněčné homeostázy se značná pozornost věnuje draslíkovým kanálům. Mnoho těchto draslíkových kanálů se otevírá v odpovědi na změny potenciálu • · buněčné membrány. Bylo identifikováno mnoho draslíkových kanálů závislých na napětí a byly charakterizovány jejich elektrofyziologické a farmakologické vlastnosti. Draslíkové proudy jsou různorodější než sodíkové a vápníkové proudy a podílejí se na odpovědi buněk na zevní stimuly. Diversita draslíkových kanálů a jejich významná fyziologická úloha naznačují jejich potenciál jako cílů pro vývoj terapeutických činidel pro léčbu různých onemocnění.
Jednou z nejlépe charakterizovaných tříd draslíkových kanálů jsou draslíkové kanály otevírané napětím. Prototypem této třídy je protein kódovaný Shaker genem v Drosophila melanogaster. Proteiny Shal nebo Kv4 rodiny jsou typem draslíkových kanálů otevíraných napětím, které jsou příčinou různých přirozených proudů typu A, které byly pozorovány u různých typů buněk. Kv4 kanály mají hlavní úlohu v repolarizaci srdečních akčních potenciálů. V neuronech mají Kv4 kanály a A proudy významnou úlohu při modulaci rychlosti aktivace, akčního potenciálu a při řízení dendritické odpovědi na synaptickou aktivaci.
Základní funkcí neuronů je příjem, vedení a přenos signálů. I přes různé účely signálů přenášených různými třídami neuronů je forma signálu v podstatě stejná a spočívá ve změně elektrického potenciálu podél plasmatické membrány neuronu. Plasmatická membrána neuronu obsahuje kationtové kanály otevírané napětím, které jsou odpovědné za šíření tohoto elektrického potenciálu (který se též označuje jako akční potenciál nebo nervový impuls) přes a podél plasmatické membrány.
Kv rodina kanálů zahrnuje, mimo jiné: (1) draslíkové kanály s oddálenou repolarizaci, které repolarizují membránu • · · 9 9 9
9 9 999 99 9 ··· · 9999 9 9 9
9999999 99 999 9 9 • 9 9999 9999
9999 9 99 99 99 99 po každém akčním potenciálu pro přípravu buňky k další aktivaci; a (2) draslíkové kanály s rychlou inaktivací (Atyp), které jsou aktivní především při podprahových napětích a které redukují rychlost, kterou excitovatelné buňky dosahují prahu aktivace. Kromě toho, že jsou zásadní pro vedení akčního potenciálu, řídí Kv kanály též reakci na depolarizační, např., synaptickou, aktivaci a mají vliv na uvolňování neurotransmiterů. V důsledku těchto aktivit jsou draslíkové kanály otevírané napětím klíčovými regulátory excitovatelnosti neuronů (Hille B., Ionic Channels of Excitable Membranes, Second Edition, Sunderland, MA: Sinauer, (1992)).
V nadrodině Kv draslíkových kanálů je významná strukturální a funkční diversita. Tato diversita je generována jednak existencí mnoha genů, a dále alternativním sestřihem RNA transkriptů stejného genu. Nicméně, aminokyselinové sekvence známých Kv draslíkových kanálů vykazují značnou podobnost. Všechny jsou složeny ze čtyř α-podjednotek tvořících pór a některé mají čtyři cytoplasmatické (βpodjednotkové) polypeptidy (Jan L.Y. et al. (1990) Trends Neurosci 13:415-419, a Pongs, O. et al. (1995) Sem Neuroscí. 7:137-146). Známý Kv kanál (α-podjednotky spadají do čtyř podrodin označených podle jejich homologie s kanály poprvé izolovanými od Drosophila: Kvl, nebo Shaker-příbuzná podrodina; Kv2, nebo Shah-příbuzná podrodina; Kv3, nebo Shawpříbuzná podrodina; a Kv4, nebo Shal-příbuzná podrodina.
Kv4.2 a Kv4.3 jsou příklady Kv kanálu (α-podjednotky Shal-příbuzné podrodiny). Kv4.3 má jedinečnou neuroanatomickou distribuci v tom, že jeho mRNA je vysoce exprimována v monoaminergních neuronech mozkového kmene a cholinergních neuronech předního mozku, kde se podílí na uvolňování neurotransmiterů dopaminu, norepinefřinu, serotoninu a • · · acetylcholinu.
Tento kanál je též vysoce exprimován v kortikálních pyramidových buňkách a v interneuronech. (Serdio P. et al. (1996) J. Neurophys 75:2174-2179). Zajímavé je, že Kv4.3 polypeptid je vysoce exprimován v neuronech, které exprimují příslušnou mRNA. Kv4.3 polypeptid je exprimován v somatodendritických membránách těchto buněk, kde se předpokládá, že přispívá k rychlé inaktivaci K+ vodivosti.
Kv4.2 mRNA je široce exprimována v mozku a zdá se, že příslušný polypeptid je také koncentrován v somatodendritických membránách, kde přispívá k rychlé inaktivaci K+ vodivosti (Sheng et al. (1992) Neuron 9:271-84). Tyto somatodendritické Kv kanály A-typu, stejně jako Kv4.2 a Kv4.3, se pravděpodobně podílejí na procesech, které jsou podkladem učení a paměti, jako je integrace podprahových synaptických reakcí a vedení zpětně se propagujících akčních potenciálů (Hoffman D.A. et al. (1997) Nátuře 387:869-875).
Tak jsou proteiny, které interagují s a modulují aktivitu proteinů draslíkových kanálů, např. draslíkových kanálů majících Kv4.2 nebo Kv4.3 podjednotku, novými molekulovými cíly pro modulování neuronální nebo kardiální excitabilitu, např. vedení akčního potenciálu, somatodendritické excitabilitu a uvolňování neurotransmiterů, v buňkách exprimujících tyto kanály. Dále, detekce genetických lézí v genu kódujícím tyto proteiny může být použita pro diagnostiku a léčbu onemocnění centrálního nervového systému, jako je epilepsie, spinocerebelární ataxie, úzkost, deprese, ztráta paměti související s věkem, migréna, obesita, Parkinsonova nemoc nebo Alzheimerova nemoc; nebo kardiovaskulárních onemocnění, jako je srdeční selhání, hypertense, fibrilace síní, dilatační kardiomyopatie, • 99 9 9 9 9 ······ • · · 9 · 9 ·· ·
9 · 9 9 · 999 999 •••••99 99 999 9 9 • 9 9999 9999 • 99 9 9 99 99 99 99 idiopatická kardiomyopatie nebo angína pectoris.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález je založen, alespoň částečně, na objevu nových molekul nukleové kyseliny, které kódují genové produkty, které interagují s proteiny draslíkového kanálu nebo které mají významnou homologii s genovými produkty podle předkládaného vynálezu, které interagují s proteiny draslíkového kanálu (paralogy). Proteiny draslíkového kanálu jsou, například, draslíkové kanály obsahující Kv4.2 nebo Kv4.3 podjednotku. Molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu a jejich genové produkty jsou zde označovány jako proteiny interagující s draslíkovým kanálem, PCIP, nebo KChlP nukleové kyseliny a proteiny. PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu interagují s, např. se váží na protein draslíkového kanálu, modulují aktivitu proteinu draslíkového kanálu, a/nebo modulují aktivitu draslíkového kanálu v buňkách, např. neuronech nebo kardiomyocytech. PCIP molekuly podle předkládaného vynálezu jsou použitelné jako modulační činidla pro regulaci různých buněčných procesů, např. procesů probíhajících v neuronech nebo srdečních buňkách. Proto v jednom aspektu vynález poskytuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny kódující PCIP proteiny nebo jejich biologicky aktivní části, stejně jako fragmenty nukleové kyseliny vhodné jako primery nebo hybridizační sondy pro detekci PCIP-kódující nukleové kyseliny.
V jednom provedení je PCIP molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu z alespoň 50%, 55%, 60%, 65%,
70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% nebo více identická s nukleotidovou sekvencí (např. s celou délkou nukleotidové
sekvence) uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ
ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID
0 0 0 0 » 0 0 0 0 0 » 0 0
NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23,
SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID
NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 46,
SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID
NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 71,
SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID
NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO: 88,
SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID
NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo s nukleotidovou sekvencí DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo s jeho komplementární sekvencí.
V jiném výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ
ID NO: 11, SEQ ID NOi 13, SEQ ID NOr 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27,
SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID
NO: 37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:4 6, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48,
SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID
NO: 58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:7 4, SEQ ID NO:75,
SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID
NO: 84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92,
SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo
SEQ ID NO:102, nebo sekvenci komplementární k této sekvenci.
V jiném výhodném provedení obsahuje molekula nukleové kyseliny fragment délky alespoň 300, 350, 400, 426, 471, nebo 583 nukleotidů nukleotidové sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ • · · 4 · ·
7 4 « 4 « 4 4« « » 4 4 4 4 4 4 444 4 14 4 4 4 4 4 4 4 4« «4 4 4 4 444 44 4444 4 4 4 • 4 · 4 4 4 4 4 4 · 4 · 44
4 4 4 · 44 * 4 · 4 4
ID NO:! 5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID
NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID
NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO:79,
SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID
NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO:96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo sekvence komplementární k uvedeným sekvencím.
V jiném provedení obsahuje PCIP molekula nukleové kyseliny nukleotidovou sekvenci kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci dostatečně identickou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID
NO: 24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID
NO: 49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID
NO: 78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID
NO: 97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO :103 i, nebo SEQ ID
NO:109, nebo s aminokyselinovou sekvencí kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994. Ve výhodném provedení obsahuje PCIP molekula nukleové kyseliny nukleotidovou sekvenci kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci alespoň z 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% nebo více identickou s
99 9 aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID
NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID
NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID
NO:7 8, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID
NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO :103, nebo SEQ ID
NO:109, nebo s aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994.
V jiném výhodném provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny kóduje aminokyselinovou sekvenci lv, 9q, pl9, W28559, KChIP4a, KChIP4b, 33b07, lp a krysího 7s proteinu. V ještě jiném výhodném provedení molekula nukleové kyseliny obsahuje nukleotidovou sekvenci kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID
NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID
NO:49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:7 6, SEQ ID
NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO:8 9, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID
NO:97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO :103 í, nebo SEQ ID
NO:109, nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, ·* ·y»·
98942, 98943, 98944, 98945, 98951, 98991, 98993 nebo ·· · 44 · ·
98937, 98938, 98939, 98940, 98941,
98946, 98947, 98948, 98949, 98950,
98994. V ještě jiném výhodném provedení má molekula nukleové kyseliny délku alespoň 426, 471, nebo 583 nukleotidů a kóduje protein s PCIP aktivitou (jak je zde popsána).
Jiné provedení předkládaného vynálezu se týká molekul nukleové kyseliny, výhodně PCIP molekul nukleové kyseliny, které specificky detekují PCIP molekuly nukleové kyseliny příbuzné s molekulami nukleové kyseliny kódující non-PCIP proteiny. Například, v jednom provedení jsou takové molekuly nukleové kyseliny alespoň 426, 400-450, 471, 450-500, 500-550, 583, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800 nebo více nukleotidů dlouhé a hybridizují za přísných podmínek na molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidové sekvence
uvedené v SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO: 5, SEQ ID ' NO: 7 r
SEQ ID NO:9, i SEQ ID ' NO:11, SEQ ID NO:13, : SEQ ID ' NO:15, SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 25,
SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:2 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:33, SEQ ID
NO:35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO:54, SEQ ID
NO:56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO: 74,
SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO:80, SEQ ID
NO:82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO: 90,
SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936,
98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo sekvence komplementární k uvedeným sekvencím. Ve výhodných provedeních jsou molekuly nukleové kyseliny alespoň 15 (např. sousedních) nukleotidů dlouhé a hybridizují za přísných podmínek na nukleotidy 93-126, 360-462, 732-825, • · • · • · · · · · · · · • · · · · · · · · · ·
W* ···· ·· · · ··· · · • · · · · · ···· ···· · ·· · · ·· ··
1028-1054 nebo 1517-1534 SEQ ID NO:7. V jiném výhodném provedení obsahují molekuly nukleové kyseliny nukleotidy 93126, 360-462, 732-825, 1028-1054, nebo 1517-1534 SEQ ID NO:7.
V dalších výhodných provedeních mají molekuly nukleové kyseliny délku alespoň 15 (např. sousedních) nukleotidů a hybridizují za přísných podmínek na nukleotidy 1-14, 49-116, 137-311, 345-410, 430-482, 503-518, 662-693, 1406-1421, 14411457, 1478-1494, nebo 1882-1959 SEQ ID NO:13. V jiném výhodném provedení obsahují molekuly nukleové kyseliny nukleotidy 1-14, 49-116, 137-311, 345-410, 430-482, 503-518, 662-693, 14061421, 1441-1457, 1478-1494, nebo 1882-1959 SEQ ID NO:13.
Ve výhodných provedeních mají molekuly nukleové kyseliny délku alespoň 15 (např. sousedních) nukleotidů a hybridizují za přísných podmínek na nukleotidy 932-1527, 1548-1765, 17861871, 1908-2091, 2259-2265, nebo 2630-2654 of SEQ ID NO:35. V jiném výhodném provedení obsahují molekuly nukleové kyseliny nukleotidy 932-1527, 1548-1765, 1786-1871, 1908-2091, 22592265, nebo 2630-2654 SEQ ID NO:35.
V jiném výhodném provedení kóduje molekula nukleové kyseliny přirozeně se vyskytující alelickou variantu polypeptidu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20,
SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID
NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38,
SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID
NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72,
SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID
NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93,
SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ
999 ·
ID NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, kde molekula nukleové kyseliny hybridizuje na molekulu nukleové kyseliny obsahující SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17,
SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID
NO: 27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO: 35,
SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID
NO: 48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO: 56,
SEQ ID NO:58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID
NO: 75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:8 0, SEQ ID NO: 82,
SEQ ID NO:8 4, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID
NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102 za přísných podmínek.
Jiné provedení předkládaného vynálezu poskytuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která je protismyslná k PCIP molekule nukleové kyseliny, např., kódujícímu řetězci PCIP molekuly nukleové kyseliny.
Jiný aspekt předkládaného vynálezu poskytuje vektor obsahující PCIP molekulu nukleové kyseliny. V některých provedeních je vektor rekombinantní expresní vektor. V jiném provedení vynález poskytuje hostitelskou buňku obsahující vektor podle předkládaného vynálezu. Vynález také poskytuje způsob pro produkci proteinu, výhodně PCIP proteinu, pomocí kultivace hostitelské buňky, např., savčí hostitelské buňky, jako je non-lidská savčí buňka, podle předkládaného vynálezu obsahující rekombinantní expresní vektor, ve vhodném mediu, za produkce takového proteinu.
• · • · • · · ··· ·· · ··· · · ··· · · · IQ ············· ·
14/ · · ········
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaných nebo rekombinantních PCIP proteinů a polypeptidů. V jednom provedení obsahuje izolovaný protein, výhodně PCIP protein, alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník. Ve výhodném provedení obsahuje protein, výhodně PCIP protein, alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník a má aminokyselinovou sekvenci alespoň z přibližně 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% nebo více procent identickou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID
NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:2 8, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID
NO:4 9, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID
NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID
NO:97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO : 103 :, nebo SEQ ID
NO:109, nebo s aminokyselinovou sekvencí kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994. V jiném výhodném provedení obsahuje protein, výhodně PCIP protein, alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník a moduluje aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem.
V ještě dalším výhodném provedení obsahuje protein, výhodně PCIP protein, alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník a je kódovaný molekulou nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek na molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID
• · • • • · * • · · · • · • · ··· · • · ·
13 • ···· · · • · · · • · · • · ·
• · · • · • · · · • · · ·
NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:2 3,
SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID
NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46,
SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID
NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71,
SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:7 9, SEQ ID
NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88,
SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID
NO:98, SEQ ID NO:100, nebo i SEQ ID NO:102.
V jiném provedení se vynález týká fragmentů proteinů majících aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID
NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22,
SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:4 0,
SEQ ID NO:4 9, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID
NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:76,
SEQ ID NO:7 8, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID
NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95,
SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 103 i, nebo
SEQ ID NO:109, kde fragment obsahuje alespoň 15 aminokyselin (např., sousedních aminokyselin) aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10,
SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID
NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28,
SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID
NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:4 9, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53,
SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID
NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO: 83,
SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID
NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID
NO:101, SEQ ID NQ:103, nebo SEQ ID NO:109, nebo • · · · aminokyselinové sekvence kódované DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938,
98939, 98948, 98940, 98949, 98941, 98950, 98942, 98951, 98943, 98991, 98944, 98993, 98945, 98946, 98947, nebo 98994. V jiném
provedení má protein, výhodně PCIP protein, aminokyselinovou
sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID
NO:18, SEQ ID NO-.20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26,
SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID
NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51,
SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID
NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81,
SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID
NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99,
SEQ ID NO:101 , SEQ ID NO:103 í, nebo SEQ ID NO:109.
V jiném provedení se vynález týká izolovaného proteinu, výhodně PCIP proteinu, který je kódovaný molekulou nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci alespoň z přibližně 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% nebo více procent identickou s nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19,
SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID
NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37,
SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID
NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO: 58,
SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID
NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO: 84,
SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID
NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID
NO:102, nebo sekvencí komplementární k uvedeným sekvencím.
• · · · • · · · • ······ »· · · ·
Proteiny podle předkládaného vynálezu nebo jejich biologicky aktivní části mohou být operativně navázané na nonPCIP polypeptid (např. heterologní aminokyselinovou sekvenci) za vzniku fúzních proteinů. Vynález se dále týká protilátek, jako jsou monoklonální nebo polyklonální protilátky, které se specificky váží na proteiny podle předkládaného vynálezu, výhodně PCIP proteiny. Dále, PCIP proteiny nebo jejich biologicky aktivní části mohou být inkorporovány do farmaceutických prostředků, které optimálně obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče.
V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro detekci přítomnosti PCIP molekuly nukleové kyseliny, proteinu nebo polypeptidu v biologickém vzorku tak, že se provede kontaktování biologického vzorku s činidlem schopným detekovat PCIP molekulu nukleové kyseliny, protein nebo polypeptid tak, že dojde k detekci přítomnosti PCIP molekuly nukleové kyseliny, proteinu nebo polypeptidu v biologickém vzorku.
V jiném aspektu předkládaný vynález poskytuje způsob pro detekování přítomnosti PCIP aktivity v biologickém vzorku pomocí kontaktování biologického vzorku s činidlem schopným detekovat indikátor PCIP aktivity tak, že je detekována přítomnost PCIP aktivity v biologickém vzorku.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro modulování PCIP aktivity zahrnující kontaktování buněk schopných exprese PCIP s činidlem, které moduluje aktivity PCIP tak, že dojde k modulování PCIP aktivity v buňkách. V jednom provedení činidlo inhibuje PCIP aktivity. V jiném provedení činidlo stimuluje PCIP aktivity. V jednom provedení je činidlem protilátka, která se specificky váže na PCIP protein. V jiném provedení činidlo moduluje expresi PCIP tím, že moduluje • φφ · · ······ • φφφ φ · · • · φφφφφ φ · · φφφφ φ φ φφ φφφ φ · • φ < φ φ φφφφ • φφ φφ φφ φφ transkripci PCIP genu nebo translaci PCIP mRNA. V ještě jiném provedeni je činidlem molekula nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci, která je protismyslná ke kódujícímu řetězci PCIP mRNA nebo PCIP genu.
V jednom provedení jsou způsoby podle předkládaného vynálezu použity pro léčbu jednice s onemocněním charakterizovaným aberantní expresí nebo aktivitou PCIP proteinu nebo nukleové kyseliny pomocí podání činidla, které je PCIP modulátorem, jedinci. V jednom provedení je PCIP modulátorem PCIP protein. V jiném provedení je PCIP modulátorem PCIP molekula nukleové kyseliny. V ještě dalším provedení je PCIP modulátorem peptid, peptidomimetikům nebo jiná malá molekula. V jiném výhodném provedení je onemocněním s aberantním PCIP proteinem nebo aberantní expresí nukleové kyseliny onemocnění CNS nebo kardiovaskulární onemocnění.
Předkládaný vynález také poskytuje diagnostický test pro identifikaci přítomnosti nebo absence genetické alterace charakterizované alespoň jednou z následujících vlastností:
(i) aberantní modifikací nebo mutací genu kódujícího PCIP?protein; (ii) chybnou regulací genu; a (iii) aberantní post-translační modifikací PCIP proteinu, kde přirozená forma genu kóduje protein s PCIP?aktivitou.
V jiném aspektu vynález poskytuje způsob pro identifikaci sloučenin, které se váží na nebo modulují aktivitu PCIP proteinu, kde uvedený způsob zahrnuje poskytnutí indikátorového prostředku obsahujícího PCIP protein s PCIP aktivitou, kontaktování indikátorového prostředku s testovanou sloučeninou, a určení efektu testované sloučeniny na PCIP aktivitu v indikátorovém prostředku za účelem identifikace sloučeniny, která moduluje aktivitu PCIP proteinu.
• ·· 9
• 9 · ·· ·· • · · · · 9 *·· 9 9999
Π 9 9999 9 9 · · • 9 9 · ·
9999 9 ·· ··
Další vlastnosti a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a připojených patentových nároků.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského lv. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1463 SEQ ID NO:1.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 216 SEQ ID N0:2.
Obr. 2 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího lv. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1856 SEQ ID NO:3. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 245 SEQ ID N0:4.
Obr. 3 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci myšího lv. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1907 SEQ ID NO:5. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 216 SEQ ID NO:6.
Obr. 4 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího lvi. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1534 SEQ ID NO:7.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 227 SEQ ID NO:8.
Obr. 5 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci myšího lvi. Nukleotidová sekvence
4 4 44 4
4 4* * 4 4 4 4 · 4 4 4
444444 4
4 4 4
4444 4 44
4 4 • 44 odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1540 SEQ ID NO:9.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 227 SEQ ID NO:10.
Obr. 6 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci částečného krysího lvn.
Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 955 SEQ ID NO:11. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 203 SEQ ID NO:12. (kompletní krysí lvn sekvence jsou zde uvedeny na Obr. 63, viz dále).
Obr. 7 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského 9ql. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2009 SEQ ID NO:13.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 270 SEQ ID NO:14.
Obr. 8 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 9ql. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1247 SEQ ID NO:15. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 257 SEQ ID NO:16.
Obr. 9 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci myšího 9ql. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2343 SEQ ID NO:17. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 270 SEQ ID NO:18.
Obr. 10 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského 9qm. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1955 SEQ ID NO:19.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 252 SEQ
·« ··· ·
ID NO:20.
Obr. 11 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 9qm. Nukleotidové sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2300 SEQ ID NO:21. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 252 SEQ ID NO:22.
Obr. 12 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského 9qs. Nukleotidové sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1859 SEQ ID NO:23.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 220 SEQ ID NO:24.
Obr. 13 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci opičího 9qs. Nukleotidové sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2191 SEQ ID NO:25. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 220 SEQ ID NO:26.
Obr. 14 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 9qc. Nukleotidové sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2057 SEQ ID NO:27.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 252 SEQ ID NO:28.
Obr. 15 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 8t. Nukleotidové sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1904 SEQ ID NO:29. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 225 SEQ ID NO:30.
Obr. 16 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou ·· · * · · • « .· · ··· ♦ aminokyselinovou sekvenci lidského pl9. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 619 SEQ ID NO:31. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 200 SEQ ID NO:32.
Obr. 17 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího pl9. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 442 SEQ ID NO:33.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 109 SEQ ID NO:34.
Obr. 18 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci myšího pl9. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2644 SEQ ID NO:35. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 256 SEQ ID NO:36.
Obr. 19 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského W28559. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 380 SEQ ID NO:37. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 126 SEQ ID NO:38.
Obr. 20 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského P193. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2176 SEQ ID NO:39.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 41 SEQ ID NO:40.
Obr. 21 je schematické znázornění krysího lv, krysího 9qm, a myšího P19 proteinu, které jsou seřazeny tak, aby byly patrné konzervované domény mezi těmito proteiny.
·· • · · « · · • · ··· · · · ······· · • · · · · · · * «· ·· ·· ·· ·· ··· · ·· « ·· ·« ·« • · · ··» ., · • * · · 4 « · 4 4 · · ni ········.·,., .
£ ί * · · · 4 4 4444 *··· 4 44 44 44 44
Obr. 22 znázorňuje genomovou DNA sekvenci lidského 9q.
Obr. 22A znázorňuje exon 1 a jeho sousední intronovou sekvenci (SEQ ID NO:46). Obr. 22B znázorňuje exony 2-11 a jejich sousední sekvence (SEQ ID NO: 47).
Obr. 23 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci opičího KChIP4a. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2413 SEQ ID NO:48. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 233 SEQ ID NO:49.
Obr. 24 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci opičího KChIP4b. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1591 SEQ ID NO:50. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 233 SEQ ID NO:51.
Obr. 25 znázorňuje uspořádání KChIP4a, KChIP4b, 9ql, lv, pl9, a příbuzného lidského paralogu (hsncspara) W28559. Aminokyseliny identické s konvenční sekvencí jsou černě zvýrazněny a konzervované aminokyseliny jsou zvýrazněny šedě.
Obr. 26 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 33b07. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2051 SEQ ID NO:52.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 407 SEQ ID NO:53.
Obr. 27 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského 33b07. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 4148 SEQ ID NO:54. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 414 SEQ ID NO:55.
• 9 <· > * « • · · • ···· »·*♦ a předpokládanou . Nukleotidová sekvence
Obr. 28 znázorňuje cDNA sekvenci aminokyselinovou sekvenci krysího lp odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2643 SEQ ID NO:56. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 267 SEQ ID NO:57.
Obr. 29 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 7s. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2929 SEQ ID NO:58. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 270 SEQ ID NO:59.
Obr. 30 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 29x. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1489 SEQ ID NO:60. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 351 SEQ ID NO:61.
Obr. 31 znázorňuje cDNA sekvenci krysího 25r.
Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1194 SEQ ID NO:62.
Obr. 32 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 5p. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 600 SEQ ID NO:63. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 95 SEQ ID NO:64.
Obr. 33 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 7q. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 639 SEQ ID NO:65. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 212 SEQ
4· ·· • t · • · ···
• « «· »··· ♦ · · • · ·
ID ΝΟ:66.
Obr. 34 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího 19r. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 816 SEQ ID NO:67.
Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 271 SEQ ID NO:68.
Obr. 35 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci of opičí KChIP4c. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2263 SEQ ID NO:69. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 229 SEQ ID NO:70.
Obr. 36 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci of opičí KChIP4d. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2259 SEQ ID N0:71. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 250 SEQ ID NO:72.
Obr. 37 znázorňuje vzájemné přiřazení KChIP4a, KChIP4b, KChIP4c a KChIP4d.
Obr. 38 je graf znázorňující záznamy proudu z CHO buněk, které exprimují Kv4.2 s nebo bez KChIP2 (9ql). Buňky se připojí k napětí -80 mV a napětí se postupně mění z -60 mV na +50 mV během 200 ms. Maximální amplitudy proudu při různých testovaných napětích jsou uvedené v pravém panelu. Obr. 38 dále znázorňuje tabulku ukazující amplitudu kinetických efektů KChIP2 (9ql) na Kv4.2. KChIP2 exprese alteruje maximální amplitudy proudu, konstantu inaktivací a doby zotavení z inaktivace, a aktivaci V1/2.
• ···
Obr. 39 je graf znázorňující záznamy proudu z CHO buněk, které exprimují Kv4.2 s nebo bez KchIP3 (pl9). Buňky se připojí na napětí -80 mV a napětí se postupně mění z -60 mV na +50 mV během 200 ms. Maximální amplitudy proudu při různých testovaných napětích jsou uvedené v pravém panelu. Obr. 39 dále znázorňuje tabulku ukazující amplitudu kinetických efektů KchIP3 (pl9) na Kv4.2. KchIP3 exprese alteruje maximální amplitudy proudu, konstantu inaktivaci a doby zotavení z inaktivace, a aktivaci V1/2.
Obr. 40 znázorňuje výsledky z elektrofyziologických pokusů demonstrujících, že současná exprese KChIPl dramaticky mění hustotu proudu a kinetiky Kv4.2 kanálů exprimovaných v CHO buňkách.
Obr. 4 0A znázorňuje proudy v Kv4 .2 transfektovaných CHO buňkách. Proudy byly evokovány sekvenční depolarizací buněk z udržovacího potenciálu -80 mV na testovací potenciály od -60 do 50 mV. Proudy jsou odečteny za použití p/5 protokolu. Osa s proudem je znázorněna ve stejném zvětšení jako na obr. (b) pro zdůraznění změn v amplitudách proudu. Vstupní-jednorázový proud při 50mV uvedený na rozšířené proudové ose ukazuje kinetiky aktivačního a inaktivačního proudu.
Obr. 40B znázorňuje záznamy proudu jako na obr. (a), ale z buněk transfektovaných stejným množstvím DNA pro Kv4.2 a KChIPl.
Obr. 40C znázorňuje vrcholovou amplitudu proudu při všech napětích v buňkách transfektovaných Kv4.2 samotným (n=ll) nebo současně transfektovaných KChIPl (n=9).
Obr. 40D a 40E ukazují zotavení z inaktivace za použití • · • ·· ·
dvoupulsového protokol. Kv4.2 samostatně (D) nebo současně exprimován s KChIPl (E) je převeden do inaktivovaného stavu za použití prvního pulsu na 50 mV a potom se aplikoval druhý puls na 50 mV, za různou dobu po prvním pulsu. Udržovací potenciál je -80 mV před a po všech pulsech.
Obr. 4OF znázorňuje součet procent zotavení maximálního proudu mezi pulsy pro Kv4.2 (n=8) a Kv4.2 plus KChIPl (n=5) transfektované buňky. Časová konstanta zotavení z inaktivace je upravena pro jeden exponenciál.
Obr. 41 znázorňuje srovnání členů rodiny lidského KChlP s blízce příbuznými členy recoverinové rodiny proteinů citlivých na Ca 2+. (HIP: lidský hippokalcin; NCS1: krysí neuronální kalciový sensor 1). Srovnání bylo provedeno za použití MegAlign programu pro Macintosh (verze 4.00 od DNASTAR) za použití Clustal metody s PAM250 tabulkou váhy zbytků chybových parametrů, a stínování je provedeno za použití BOXSHADES. Zbytky identické s konvenční sekvencí jsou zvýrazněny černě, konzervativní substituce jsou zvýrazněny šedě. X, Y, Z a -X, -Y, -Z označují pozice zbytků, které jsou odpovědné za vazbu vápníkového iontu v EF rameni.
Obr. 42 znázorňuje fyzikální mapu IOSCA regionu.
Obr. 43 znázorňuje vazebnou mapu ukazující lokalizaci h9q a známých markérů asociujících se s IOSCA a epilepsií.
Obr. 44 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského lvi (KChIPll).
Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1477 SEQ ID NO:79. Malá a velká písmena ukazují individuální exony. KChIPll (KChIPllong) specifický exon je druhý exon
v uvedené sekvenci. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 227 SEQ ID NO:109.
Obr. 45 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci varianta lidského KChIPlN s Nterminálním sestřihem. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1639 SEQ ID NO:80. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 232 SEQ ID NO:81.
Obr. 46 znázorňuje srovnání N-terminálních domén krysího a lidského KChIPlN, které ukazuje, že tato N-terminální doména je konzervována mezi těmito dvěma sekvencemi.
Obr. 47 znázorňuje genomovou DNA sekvenci lidského KChIP2 (včetně KChIP2 1, m, s, a N). Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 17803 SEQ ID NO:74. Velká písmena ukazují exony a malá písmena ukazují introny.
Obr. 48 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího KChIP2L. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1285 SEQ ID NO:75. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 270 SEQ ID NO:76.
Obr. 49 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského 8t (KChIP2N). Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2076 SEQ ID NO:77. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 225 SEQ ID NO:78.
Obr. 50 znázorňuje srovnání N-terminálních domén krysího a lidského KChIP2N (8t) proteinu, které ukazuje, že tyto proteiny mají 96,5% identitu.
« · · · • · « • · • · ·
Obr. 51 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci kompletního lidského KChIP3. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2835 SEQ ID NO:82. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 256 SEQ ID NO:83. Změny z velkých na malá písmena ukazují jednotlivé exony.
Obr. 52 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího KChIP3. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2414 SEQ ID NO:84. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 178 SEQ ID NO:85. Velká písmena ukazují kódující region a malá písmena ukazují 3' UTR.
Obr. 53 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci opičího KChIP4XC (KChIP4b). Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1005 SEQ ID NO:86. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 127 SEQ ID NO:87.
Obr. 54 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci myšího KChIP4N2 (KChIP4c). Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2181 SEQ ID NO:88. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 229 SEQ ID NO:89.
Obr. 55 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího KChIP4. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2022 SEQ ID NO:90. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 198 SEQ
ID NO:91.
·· 4
4
4
4 4 4 φ · ·444 444 • ••4 4 44 44 44 44
Obr. 56 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského KChIP4aS (KChIP4NlS) a kratší variantu s alternativním sestřihem KChIP4Nl.
Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2366 SEQ ID NO:92. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 188 SEQ ID NO:93.
Obr. 57 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského KChIP4a (KChIP4Nl). Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2431 SEQ ID NO:94. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 233 SEQ ID NO:95.
Obr. 58 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského KChIP4c (KChIPN2).
Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2261 SEQ ID NO:96. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 229 SEQ ID NO:97.
Obr. 59 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci lidského KChIP4d (KChIP4N3).
Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2299 SEQ ID NO:98. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 250 SEQ ID NO:99.
Obr. 60 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího KChIP4Nlx, varianty s alternativním sestřihem KChIP4Nl. Nukleotidová sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 2246 SEQ ID NO:100. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 272 SEQ ID NO:101.
Obr. 61 je sada grafů ukazujících kompetitivní modulaci • 9 • 9 • · • · · · • · · · · · • ···· · · · ······· · • ·· · · ·· · • · ·· ·· ·· časové konstanty inaktivace Kv4.3 prostřednictvím KChIP4N2 a KChIPl. Podané typy cRNA jsou uvedeny v části cRNA, kde 4.3 označuje Kv4.3, 1 označuje KChIPl, a 4 označuje KChIP4. Čísla v závorkách ukazují faktory ředění cRNA s lx=zásobní roztok. Trojúhelníčky nad sloupcovými grafy ilustrují kombinaci fixních dávek KChIP4N2 nebo KChIPl a stoupajících dávek KChIPl nebo KChIP4N2, v příslušném pořadí.
Obr. 62 znázorňuje srovnání proteinů ukazující, že Nterminální domény lidského KChIPlN a opičího KChIP4N2 jsou homologní a že N-terminální domény lidského/krysího KChIPl a opičího KChIP4N2 jsou divergentní.
Obr. 63 znázorňuje cDNA sekvenci a předpokládanou aminokyselinovou sekvenci krysího KChIPlN (lvn). Nukleotidové sekvence odpovídá nukleovým kyselinám 1 až 1856 SEQ ID NO:102. Aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinám 1 až 232 SEQ ID NO:103.
Obr. 64 je graf znázorňující koncentračně závislou modulaci Kv4.3 a Kv4.3/KChIPl proudů v Xenopus oocytech kyselinou arachidonovou. Depolarizační pulsy z udržovacího potenciálu -80 mV až +40 mV (trvání = 500 ms). Kyselina arachidonová v koncentraci 1-10 μΜ inhibovala vrcholové amplitudy (A) a snižovala konstanty doby inaktivace (Tinact) (B) v oocytech, kterým byla injikována Kv4.3 cRNA samotná (plná čára) a kterým byla současně injikována Kv4.3 a KChIPl cRNA (čárkovaná linie). n = 5 oocytů pro každý bod.
Obr. 65 je graf znázorňující to, že modulace Kv4.3 a Kv4.3/KChIPl proudů kyselinou arachidonovou je reversibilní.
Proudy v Xenopus oocytech byly evokovány každých 7 sekund depolarizačními pulsy na +40 mV (trvání = 500 ms) z • · • 9
• · · udržovacího potenciálu -80 mV. Efekty na vrcholovou amplitudu (A) a konstanty doby inaktívace (Tinact) (B) jsou uvedeny jako čárkované sloupce ukazující aplikaci 10 μΜ kyseliny arachidonové a prázdné sloupce ukazující vymytí ND96 mediem doplněným 0,5 mg/ml BSA (n = 5 pro každý bod).
Obr. 66 je graf znázorňující modulaci Kv4.3 a Kv4.3/KChIPl mastnými kyselinami. (A) Procentuální blokáda Kv4 (otevřené sloupce) a Kv4.3/KChIP (šrafované sloupce) vrcholových amplitud 10 μΜ kyseliny linoleové (n = 9, 8, Kv4.3,
Kv4.3/KChIPl, v příslušném pořadí), kyseliny γ-linolenové (n = 9, 8), ETI (n =4, 6), ETYA (n = 4, 6), a kyseliny arachidonové (n = 8, 9) v Xenopus oocytech. Všechny hodnoty kromě hodnot pro kyselinu Iinolelaidovou/Kv4.3 samotnou jsou statisticky signifikantní ve srovnání s kontrolami bez mastných kyselin. Rozdíly všech hodnot mezi Kv4.3 a
Kv4.3+KChIPl pro všechny mastné kyseliny byly statisticky nevýznamné. (B) Procentuální inhibice konstant doby inaktívace (Tinact) proudů v panelu A za stejných podmínek. Hodnoty jsou uvedeny jako průměr ± SEM. Všechny hodnoty pro Kv4.3 samostatně nebyly statisticky významné ve srovnání s kontrolami bez mastných kyselin. Všechny hodnoty pro
Kv4.3+KChIPl s výjimkou kyseliny linolelaidové byly statisticky významné ve srovnání s kontrolami bez mastných kyselin. Rozdíly hodnot mezi Kv4.3 a Kv4.3+KChIPl v každém ošetření mastnou kyselinou byly významné.
Obr. 67 je graf ukazující, že kyselina arachidonové neinterferuje s asociací mezi KChIPl a N-terminální doménou Kv4.3. (A) Překryté sensogramy ukazují, že ani asociační fáze, ani disociační fáze interakce mezi intracelulární Nterminální doménou Kv4.3 a KChIPl nebyla kvalitativně změněna 10 μΜ kyseliny arachidonové v Biosensor testu. (B) Růst ·· ··· · • · · • · · • · · · · • · • · · · · ♦ ··· • · 4 • · <
závislý na interakci N-terminální domény Kv4.3 a KChIPl v selektivním SC-WLH mediu nebyl pozměněn 10 μΜ ETYA. Neselektivní medium SC-WL, které umožňuje růst kmenů nezávislý na interakci mezi N-terminální doménou Kv4.3 a KChIPl bylo použito pro kontrolu nespecifických efektů ETYA na růst kmenů. Hodnoty jsou uvedené jako průměr ± SEM. n = 4 pro každý bod.
Obr. 68 je graf znázorňující výsledky z Taqman analýzy tkáňové exprese krysího KChIPlN.
Podrobný popis předkládaného vynálezu
Předkládaný vynález je založen, alespoň částečně, na objevu nových molekul nukleové kyseliny, které kódují genové produkty, které interagují s proteiny draslíkového kanálu nebo které mají významnou homologii s genovými produkty podle předkládaného vynálezu, které interagují s proteiny draslíkového kanálu (paralogy). Proteiny draslíkového kanálu jsou, například, draslíkové kanály obsahující Kv4.2 nebo Kv4.3 podjednotku. Molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu a jejich genové produkty jsou zde označovány jako proteiny interagující s draslíkovým kanálem, PCIP, nebo KChlP molekuly nukleové kyseliny a proteiny. Výhodně PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu interagují s, např. váží se na protein draslíkového kanálu, modulují aktivity proteinu draslíkového kanálu, a/nebo modulují aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem v buňce, např., a neuronu nebo srdeční buňce.
Termín PCIP rodina, jak je zde použit pro označení proteinů a molekul nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, označuje jeden nebo více proteinů nebo molekul nukleové kyseliny s PCIP aktivitou, jak je zde definována.
• 4 4 4 4 4
Takový členové PCIP rodiny mohou být přirozené nebo umělé a mohou být od stejného druhu nebo od různých druhů. Například může PCIP rodina obsahovat první protein lidského původu, stejně jako další, jiné proteiny lidského původu, nebo alternativně může obsahovat homology non-lidského původu.
Termíny PCIP aktivity, biologické aktivity PCIP nebo funkční aktivity PCIP, které jsou zaměnitelné, označují aktivity PCIP proteinu, polypeptidů nebo molekuly nukleové kyseliny na PCIP responsivních buňkách nebo na substrátu pro PCIP proteine, jak byly určeny in vivo nebo in vitro, za použití standardních technik. V jednom provedení je PCIP aktivitou přímá aktivita, jako je asociace s PCIP-cílovou molekulou. Termín cílová molekula nebo vazebný partner označuje molekulu, se kterou se PCIP protein váže nebo interaguje za normálních okolností, za dosažení PCIPzprostředkované funkce. Cílová molekula pro PCIP může být nonPCIP molekula nebo PCIP protein nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu. V příkladném provedení je cílová molekula pro PCIP ligand. Alternativně je PCIP aktivitou nepřímá aktivita, jako je buněčná signalizace zprostředkovaná interakcí PCIP proteinu s PCIP ligandem. Biologické aktivity PCIP jsou zde popsány.
Například mohou mít PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu jednu nebo více z následujících aktivit: (1) mohou interagovat s (např. vázat se na) proteinem draslíkového kanálu nebo jeho částí; (2) mohou regulovat fosforylační stav proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části; (3) mohou se asociovat s (např. vázat se na) vápník a mohou , například, účinkovat jako kalcium-dependentní kinasy, např. fosforylovat draslíkový kanál nebo receptor spřažený s G-proteinem způsobem závislým na vápníku; (4) mohou se asociovat s (např. vázat se ·· · • 9 9 9 9 ► 999·
9 9 9 9
999 999
9 · 9 · 9 9
9 9 9 9 9 9 • 9 9 · 99 99 na) vápník, a mohou - například - účinkovat způsobem závislým na vápníku v buněčných procesech, např. účinkovat jako transkripční faktory závislé na vápníku; (5) mohou modulovat aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem v buňkách (např., neuronech, jako jsou sensorické neurony nebo motorické neurony, nebo buňky srdce), například za účelem příznivého ovlivnění buněk; (6) mohou modulovat tvorbu chromatinu v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (7) mohou modulovat přesun vesikul a transport proteinů v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (8) mohou modulovat cytokinovou signalizaci v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (9) mohou regulovat asociaci proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části s buněčným cytoskeletem; (10) mohou modulovat buněčnou proliferaci; (11) mohou modulovat uvolňování neurotransmiterů; (12) mohou modulovat excitabilitu membrány; (13) mohou ovlivňovat klidový potenciál membrán; (14) mohou modulovat formy vln a frekvence akčních potenciálů; a (15) mohou modulovat prahy excitace.
Termín draslíkový kanál označuje protein nebo polypeptid, který se podílí na získání, vedení a přenášení signálů v excitovatelných buňkách. Draslíkové kanály jsou typicky exprimovány v elektricky excitovatelných buňkách, např. neuronech, buňkách srdce, skeletu a hladkého svalu, ledvin, endokrinního systému a vajíčkách, a mohou tvořit heteromultimerní struktury, např. složené s cytoplasmatické podjednotky a podjednotky vytvářející pór. Příklady draslíkových kanálů jsou: (1) napětím řízené draslíkové kanály, (2) ligandem řízené draslíkové kanály, a (3) mechanicky řízené draslíkové kanály. Pro podrobný popis draslíkových kanálů viz Kandel E.R. et al., Principles of Neural Science, 2.vydání, (Elsevier Science Publishing Co., Inc., N.Y. (1985)), kde tato publikace je zde uvedena jako • ·
9 9 9 9 1
9 9 9 9 999
999999 99
9 9 9 9
9999 9 99 99
9 9 99 ·
9 9
19
9 9
9 9 9
99 odkaz. Bylo dokázáno, že PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu interagují například s draslíkovými kanály obsahujícími Kv4.3 podjednotku nebo Kv4.2 podjednotku.
Termín aktivita zprostředkovaná draslíkovým kanálem označuje aktivity, které zahrnují účast draslíkového kanálu, např. a draslíkového kanálu v neuronech nebo buňkách srdce, asociované se získání, vedením a přenosem signálů v například nervovém systému či srdci. Mezi aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem patří uvolňování neurotransmiterů, např. dopaminu nebo norepinefřinu, z buněk, např. neuronů nebo buněk srdce; modulace klidového potenciálu membrán, formy vln a frekvencí akčních potenciálů, prahů excitace; modulace procesů, jako je integrace podprahových synaptických reakcí a vedení zpětně se propagujících akčních potenciálů v, například, neuronech nebo buňkách srdce.
Protože PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu modulují aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem, mohou být užitečné jako nová diagnostická a terapeutická činidla pro léčbu onemocnění asociovaných s draslíkovým kanálem a/nebo onemocnění nervového systému. Kromě toho PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu modulují Kv4 draslíkové kanály, např., draslíkové kanály s Kv4.2 nebo Kv4.3 podjednotkou, které jsou základem pro napětím řízený K+ proud známý jako It0 (dočasný outward proud) v srdci savců (Kaab S. et al. (1998) Circulation 98(14):1383-93; Dixon J.E. et al. (1996)
Circulation Research 79(4):659-68; Nerbonne JM (1998) Journal of Neurobiology 37(1):37-59,- Barry D.M. et al. (1998) Circulation Research 83(5):560-7,- Barry D.M. et al. (1996) Annual Review of Physiology 58:363-94). Tento proud je příčinou rychlé repolarizace kardiomyocytů během akčního potenciálu. Také se podílí na srdeční frekvenci tím, že řídí • 9 Μ·· ·· · ·· ·*
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 · * ··· · · ·
9999 9 9 9 9 9 9 9 · · · ···«*·· *.rychlost., kterou kardiomyocyty dosahují prahu pro vzplanutí dalšího akčního potenciálu.
Je také známo, že tento proud je inhibován u pacientů s hypertrofií srdce, což vede k prodloužení srdečního akčního potenciálu. U těchto pacientů se předpokládá, že prodloužení akčního potenciálu způsobuje změny a koncentraci a metabolismu vápníku v myokardu, což přispívá k progresi onemocnění srdce od hypertrofie k srdečnímu selhání (Wickenden et al. (1998)
Kardiovaskulární Research 37:312). Zajímavé je to, že několik PCIP podle předkládaného vynálezu (např., 9ql, 9qm, 9qs, uvedené v SEQ ID NO: 13, 15, 17, 19, 21, 23 a 25) se váže na a moduluje draslíkové kanály obsahující Kv4.2 nebo Kv4.3 podjednotku a tyto obsahují EF-domény vážící vápník.
V důsledku mutací v těchto PCIP genech mohou defekty v expresi těchto PCIP proteinů vážících vápník samotných, nebo defekty v interakci mezi těmito PCIP a Kv4.2 nebo Kv4.3 kanály, vést ke snížení KV4.3 nebo Kv4.3(Im) proudů v myokardu. Terapeutická činidla, která mění PCIP expresi nebo modulují interakci mezi těmito PCIP a Kv4.2 nebo Kv4.3, mohou být extrémně hodnotnými činidly pro zpomalení nebo zabránění progresi onemocnění srdce od hypertrofie k srdečnímu selhání.
Termín onemocnění asociované s draslíkovým kanálem označuje onemocnění, poruchu nebo stav, který je charakterizovaný chybnou regulací aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem. Porucha asociovaná s draslíkovým kanálem může škodlivě ovlivňovat vedení sensorických impulsů z periferie do mozku a/nebo vedení motorických impulsů z mozku do periferie; integraci reflexů; interpretaci sensorických impulsů; emocionální, intelektuální (např. učení a paměť) nebo motorické procesy. Onemocnění asociované s draslíkovým kanálem může dále škodlivě ovlivňovat elektrické impulsy, které ····
stimulují vlákna srdečního svalu ke kontrakcím. Příklady poruch asociovaných s draslíkovým kanálem zahrnují onemocnění nervového systému, stejně jako kardiovaskulární onemocnění.
Termín onemocnění nervového systému zahrnuje poruchu, onemocnění nebo stav, který ovlivňuje nervový systém.
Příklady poruch asociovaných s draslíkovým kanálem a onemocnění nervového systému jsou kognitivní poruchy, např. poruchy paměti a učení, jako je amnesie, apraxie, agnosie, amnestická dysnomie, amnestická prostorová dezorientace, Kluver-Bucyho syndrom, Alzheimerova ztráta paměti (Eglen R.M. (1996) Pharmacol. a Toxicol. 78(2):59-68; Perry E.K. (1995) Brain a Cognition 28(3):240-58) a neschopnost učení; poruchy ovlivňující vědomí, např., zrakové halucinace, poruchy vnímání, nebo delirium asociované s demencí spojenou s Lewyho tělísky; schizo-efektivní poruchy (Dean B. (1996) Mol. Psychiatry 1(1):54-8), schizofrenie se změna nálady (Bymaster F.P. (1997) J. Clin. Psychiatry 58 (suppl.10):28-36; Yeomans J.S. (1995) Neuropharmacol. 12(1):3-16; Reimann D. (1994) J. Psychiatrie Res. 28(3):195-210), depresivní onemocnění (primární nebo sekundární); afektivní poruchy (Janowsky D.S. (1994) Am. J. Med. Genetics 54 (4) :335-44); poruchy spánku (Kimura F. (1997) J. Neurophysiol. 77(2):709-16), např., abnormality REM spánku u pacientů s depresí (Ríemann D. (1994) J. Psychosomatic Res. 38 Suppl. 1:15-25; Bourgin P. (1995) Neuroreport 6(3): 532-6), abnormality paradoxního spánku (Sakař K. (1997) Eur. J. Neuroscience 9(3):415-23), nespavost, abnormality tělesné teploty nebo dechový útlum během spánku (Slidský S.L. (1995) Tím. J. Physiol. 269(2 Pt 2):R308-17; Mallick B.N. (1997) Brain Res. 750(1-2):311-7). Dalšími příklady onemocnění nervového systému jsou poruchy mechanismů generujících bolest, např. bolest při syndromu dráždivého tračníku (Mitch C.H. (1997) J. Med. Chem. 40(4):538-46;
4 4 · 4 • ··· 9 9 ·
4 4 4 4 4 9
9 · 9 4 9
99 99
9 • 4 4 • 94 4 44 · ♦ • 9
4 4 4 4 « 4 4 4··
Shannon H.E. (1997) J. Pharmac. a Exp. Therapeutics
281(2):884-94,- Bouaziz H. (1995) Anesthesia a Analgesia 80(6):1140-4,- nebo Guimaraes A.P. (1994) Brain Res. 647(2):220-30) nebo bolest na hrudi; poruchy hybnosti (Monassi C.R. (1997) Physiol. a Behav. 62(1):53-9), např. poruchy hybnosti při Parkinsonově nemoci (Finn M. (1997) Pharmacol. Biochem. & Behavior 57(1-2):243-9,- Mayorga A.J. (1997) Pharmacol. Biochem. & Behavior 56(2):273-9),- poruchy příjmu potravy, např. obesita související s hypersekrecí insulinu (Maccario M. (1997) J. Endocrinol. Invest. 20(1):8-12,Premawardhana L.D. (1994) Clin. Endocrinol. 40(5): 617-21); poruchy příjmu tekutin, např. diabetická polydipsie (Murzi E. (1997) Brain Res. 752(1-2):184-8,- Yang X. (1994) Pharmacol. Biochem. & Behavior 49(1):1-6),- neurodegenerativní onemocnění, např. Alzheimerova nemoc, demence spojené s Alzheimerovou nemocí (jako je Pickova nemoc), Parkinsonova nemoc a jiné nemoci spojené s Lewyho difusními tělísky, roztroušená sklerosa, amyotrofická laterální sklerosa, progresivní, výšenuclearní obrna, epilepsie, spinocerebellární ataxie, epileptické syndromy, Jakob-Creutzfieldtova nemoc; psychiatrická onemocnění, např., deprese, schizofrenní nemoci, Korsakoffova psychóza, mánie, úzkostné poruchy, bipolární afektivní poruchy nebo fobické poruchy; neurologické poruchy, např. migréna; poranění míchy; mrtvice a trauma hlavy.
Termín epilepsie, jak je zde použit, označuje neurologická onemocnění způsobená poruchami normálních elektrických funkcí mozku. V normálně fungujícím mozku probíhají miliony jemných elektrických impulsů z neuronů do celého těla. U pacientů s epilepsií je tento normální stav přerušován náhodnými a neobvyklými intenzivními impulsy elektrické energie, což může ovlivnit vědomí jedince, pohyblivost jedince nebo vnímání jedince. Tyto fyzikální změny
9 9 9 9 9
9 999 9 9 9
9
9999
9999 se označují jako epileptické záchvaty. Existují dvě kategorie záchvatů: parciální záchvaty, které probíhají v jedné oblasti mozku, a generalizované záchvaty, které ovlivňují nervové buňky v celém mozku. Epilepsie může být důsledkem poranění mozku před, během a po porodu; poranění hlavy; špatné výživy; některých infekčních onemocnění; mozkových nádorů; a některých jedů. Nicméně, v mnoha případech je příčina neznámá. Atakám epilepsie mohou předcházet neobvyklé pocity, které se označují jako aura, které ukazují na začátek záchvatu. Příznaky hrozícího epileptického záchvatu, které mohou být různé mezi pacienty, mohou zahrnovat vizuální fenomény, jako jsou záblesky světla. Nedávno byla genetická vazba pro epilepsii objevena na chromosomu lOq, blízko markéru D10S192: 10q22-q24 (Ottman et al. (1995) Nátuře Genetics 10:56-60). Mezi různé formy epilepsie patří: grand mal, Jacksonské záchvaty, myoklonní progresivní familiární epilepsie, petit mal, LennoxGastaut syndrom, febrilní záchvaty, psycho-motorická epilepsie a temporální epilepsie. Popsané objevy jsou zejména významné pro vývoj nových způsobů léčby pro parciální epilepsii.
Termín ataxie označuje běžné neurologické poruchy způsobené poruchami v normálních elektrických funkcích mozku. Spinocerebelárnír ataxie typu 1 (SCA1) je autosomálně dominantní onemocnění, které je geneticky vázáno na krátké raménko chromosomu 6 podle vazby na lidský hlavní histokompatibilní komplex (HLA). Viz například H. Yakura et al. (1974) N. Engl. J. Med., 291, 154-155; a J. F. Jackson et al. (1977) N. Engl. J. Med 296, 1138-1141. Bylo prokázáno, že SCA1 je těsně vázán na markér D6S89 na krátké raménko chromosomu 6, telomerně k HLA. Viz například L. P. W. Ranum et al. , Am. J. Huni. Genet., 49, 31-41 (1991); a Η. Y. Zoghbi et al., Am. J. Hum. Genet., 49, 23-30 (1991). Popsané objevy jsou zejména významné pro vývoj nových způsobů léčby pro ·* ···· ίο · t · · · ··· · · ·
9999 9 9 9 9 9 9 9 9 · • φ · · 9 · 9 9 9 9
9999 9 99 99 99 99 spinocerebelárnr ataxii s nástupem v dětském věku (IOSCA).
Termín kardiovaskulární onemocnění zahrnuje onemocnění postihující kardiovaskulární systém, např. srdce. Příklady kardiovaskulárních onemocnění jsou arteriosklerosa, ischemické reperfusní poškození, restenosa, arteriální zánět, remodelování cévní stěny, remodelování komor, Rychlý komorový rytmus, koronární mikroembolie, tachykardie, bradykardie, hypertense, aneurysma aorty, ligace koronární arterie, ischemická nemoc srdeční, fibrilace síní, syndrom dlouhého QT, městnavé srdeční selhání, dysfunkce sinusového uzlu, angína pectoris, srdeční selhání, hypertense, fibrilace síní, flutter síní, dilatační kardiomyopatie, idiopatická kardiomyopatie, infarkt myokardu, ischemická choroba srdeční, spasmus koronárních arterií nebo arytmie. Ve výhodném provedení je kardiovaskulární onemocnění asociované s abnormálním Ito proudem.
Někteří členové PCIP rodiny mohou mít společné strukturální charakteristiky, jako je společná strukturální doména nebo motiv nebo a dostatečné homologie aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence, jak je zde definována. Takoví členové PCIP rodiny mohou být přirození nebo umělí a mohou být od stejného nebo od různého druhu. Například může PCIP rodina obsahovat první protein lidského původu, stejně jako jiné, odlišné proteiny lidského původu, nebo alternativně může obsahovat homology non-lidského původu.
Například členové PCIP rodiny, kteří mají společné strukturální charakteristiky, mohou obsahovat alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník. Termín vazebná doména pro vápník označuje aminokyselinovou doménu, např., EF rameno (Baimbridge K.G. et al. (1992) TINS 15(8): 303-308), která se • 44 4
4444*4
4 4
4444 4
4 4 • 4 444
4 . 4 44 4
4 4 4
4 4 4
44 podílí na vazbě vápníku. Výhodně má vazebná doména pro vápník sekvenci, která je významně identická s konvenční sekvencí:
EO··00·‘ODKDGDGAO··’EF··ΟΟ. (SEQ ID NO:41) kde O může být I, L, V nebo M, a · ukazují pozice bez silně preferovaného zbytku. Každý uvedený zbytek je přítomen ve více než 25% sekvencí, a podtržené zbytky jsou přítomné ve více než 80% sekvencí. Aminokyselinové zbytky 126-154 a 174-202 lidského lv proteinu, aminokyselinové zbytky 126-154 a 174-202 krysího lv proteinu, aminokyselinové zbytky 137-165 a 185-213 krysího lvi protein, aminokyselinové zbytky 142-170 krysího lvn proteinu, aminokyselinové zbytky 126-154 a 174-202 myšího lv proteinu, aminokyselinové zbytky 137-165 a 185-213 myšího lvi proteinu, aminokyselinové zbytky 144-172, 180-208, a 228256 lidského 9ql proteinu, aminokyselinové zbytky 126-154, 162-190 a 210-238 lidského 9qm proteinu, aminokyselinové zbytky 94-122, 130-158 a 178-206 lidského 9qs proteinu, aminokyselinové zbytky 126-154, 162-190 a 210-238 krysího 9qm proteinu, aminokyselinové zbytky 131-159, 167-195, a 215-243 krysího 9ql proteinu, aminokyselinové zbytky 126-154, 162-190 a 210-238 krysího 9qc proteinu, aminokyselinové zbytky 99-127, 135-163 a 183-211 krysího 8t proteinu, aminokyselinové zbytky 144-172, 180-208 a 228-256 myšího 9ql proteinu, aminokyselinové zbytky 94-122, 130-158 a 178-206 opičího 9qs proteinu, aminokyselinové zbytky 94-122, 130-158 a 178-206 lidského pl9 proteinu, aminokyselinové zbytky 19-47 a 67-95 krysího pl9 proteinu, a aminokyselinové zbytky 130-158, 166194 a 214-242 myšího pl9 proteinu obsahují vazebné domény pro vápník (EF ramena) (viz Obr. 21). Aminokyselinové zbytky 116127 a 152-163 opičího KChIP4a a KChIP4b proteinu obsahují vazebné domény pro vápník.
• · ·
«· · • · · ···· · · • · a * *·♦ · • · · · · ·« ·*·· a a · a • a aa
V jiném provedení jsou izolované PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu identifikovány podle přítomnosti alespoň jedné konzervované karboxy-terminální domény, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci délky přibližně 100-200 aminokyselinových zbytků, výhodně 150-200 aminokyselinových zbytků, a ještě lépe 185 aminokyselinových zbytků, a která obsahuje tři EF ramena. PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu výhodně obsahují karboxy-terminální doménu, která je alespoň z 70%, 71%, 74%, 75%, 76%, 80%, nebo více procent identická s karboxy-terminálními 185 aminokyselinovými zbytky krysího lv, krysího 9q, nebo myšího pl9 (viz obr. 21, 25 a 41) .
Členové PCIP rodiny, kteří mají společné strukturální charakteristiky, jsou uvedeni v tabulce I. Jiní členové PCIP rodiny, např. členové PCIP rodiny, kteří nemají společné strukturální charakteristiky, jsou uvedeni v tabulce II a jsou popsáni dále. Předkládaný vynález poskytuje kompletní lidský a a parciální krysí 33b07 klon a proteiny kódované těmito cDNA. Předkládaný vynález dále poskytuje částečný krysí lp klon a protein kódovaný touto cDNA. Dále předkládaný vynález poskytuje částečný krysí 7s klon a protein kódovaný touto cDNA.
Předkládaný vynález dále poskytuje členy PCIP rodiny, které představují dříve identifikované cDNA (29x, 25r, 5p, 7q a 19r). Tyto dříve identifikované cDNA jsou zde identifikované jako členové PCIP rodiny, t.j. jako molekuly, které mají PCIP aktivity, jak jsou zde popsány. V souladu s tím předkládaný vynález poskytuje metody pro použití těchto dříve identifikovaných cDNA, např. způsoby pro použití těchto cDNA ve skríningových testech, diagnostických testech, prognostických testech a způsobech léčby podle předkládaného »·44
4 *4 ·· • 4« 444 44 · 4 »4 444 4 ·
444444 44 444 4
4 444444
4444 4 44 44 44 vynálezu.
PCIP molekuly podle předkládaného vynálezu byly nejprve identifikovány podle své schopnosti, která byla určena za použití kvasinkového dvou-hybridového testu (popsaného podrobně v příkladu 1), interagovat s amino-terminálními 180 aminokyselinami krysí Kv4.3 podjednotky. Další vazebné experimenty s jinými podjednotkami draslíkového kanálu byly provedeny pro demonstrování specificity PCIP pro Kv4.3 a Kv4.2. In šitu lokalizace, imunohistochemické metody, koimunoprecipitace a přilnavé svorky se potom použily pro jasné demonstrování toho, že PCIP podle předkládaného vynálezu interagují s a modulují aktivity draslíkových kanálů, zejména těch, které obsahují 4.3 nebo 4.2 podjednotku.
Bylo identifikováno několik nových lidských, myších, opičích a krysích členů PCIP rodiny a tyto jsou zde označovány jako lv, 9g, pl9, W28559, KChIP4, 33b07, lp a krysí 7s proteiny a molekuly nukleové kyseliny. Lidská, krysí a myší cDNA kódující lv polypeptid jsou uvedeny v SEQ ID NOs:l, 3 a 5, a jsou uvedené na obr. 1, 2 a 3, v příslušném pořadí.
V mozku je lv mRNA vysoce exprimována v neokortikálních a hippokampálních interneuronech, v thalamickém retikulárním nukleu a mediální habenule, v bazálním předním mozku a striatálních cholinergních neuronech, v colliculus superior a v mozečkových granulárních buňkách, lv polypeptide je vysoce exprimován v tělech, dendritech, axonech a axonálních zakončeních buněk, které exprimují lv mRNA. Varianty lv genu s alternativním sestřihem byly identifikovány u krys a myší a jsou uvedeny v SEQ ID NO: 7, 9 a 11 a na obr. 4, 5, a 6, v příslušném pořadí, lv polypeptide interaguje s draslíkovými kanály obsahujícími Kv4.3 nebo kv4.2 podjednotky, ale ne s Kvl.1 podjednotkami. Podle Northernové hybridizace jsou lv ·· ···· · « · » · · * · · ·<«· » »» ·« ·· «· transkripty (mRNA) exprimovány především v mozku.
8t cDNA (SEQ ID NO: 29) kóduje polypeptid s molekulovou hmotností přibližně 26 kD odpovídající SEQ ID NO:30 (viz obr.
15). 8t polypeptid interaguje s draslíkovým kanálem obsahujícím Kv4.3 nebo Kv4.2 podjednotky, ale ne s Kvl.1 podjednotkami. Podle Northernova přenosu a dat in sítu je 8t mRNA exprimována především v srdci a mozku. 8t cDNA je variantou 9q s alternativním sestřihem.
Lidská, krysí, opičí a myší 9q cDNA byla také izolována.
Mezi varianty s alternativním sestřihem patří lidský 9ql (SEQ ID N0:13; obr. 7), krysí 9ql (SEQ ID N0:15; obr. 8), myší 9ql (SEQ ID N0:17; obr. 9), lidský 9qm (SEQ ID N0:19; obr. 10), krysí 9qm (SEQ ID NO:21; obr. 11), lidský 9qs (SEQ ID NO:23; obr. 12), opičí 9qs (SEQ ID NO:25; obr. 13) a krysí 9qc (SEQ ID NO:27; obr. 14). Genomová DNA sekvence 9q byla také určena.
Exon 1 a jeho sousední intronové sekvence (SEQ ID NO:46) jsou uvedené na obr. 22A. Exony 2-11 a sousední intronové sekvence (SEQ ID NO:47) jsou uvedené na obr. 22B. 9q polypeptidy interagují s draslíkovými kanály obsahujícími Kv4.3 nebo Kv4.2 podjednotky, ale ne s Kvl.1 podjednotkami. Podle Northernova přenosu a in sítu testu jsou 9q proteiny exprimovány především v srdci a mozku. V mozku je 9q mRNA vysoce exprimována v neostriatu, hippokampu, neokortikálních pyramidových buňkách a interneuronech a v thalamu, colliculus superior a cerebellu.
Lidský, krysí a myší P19 cDNA byla také izolována. Lidská P19 je uvedená v SEQ ID NO:31 a na obr. 16; a v SEQ ID NO:39 a na obr. 20 (3' sekvence). Krysí P19 je uvedená v SEQ ID NO:33 a na obr. 17, a myší P19 je uvedená v SEQ ID NO:35 a na obr.
18. P19 polypeptidy interagují s draslíkovými kanály obsahujícími Kv4.3 nebo Kv4.2 podjednotky, ale ne s Kvl.1 • 4 4444
4 44 44 • 4 4 4 · · ·· ·
4 · 4 · ··· · · · · *♦··»« β· ·*· · · ' τ · · 4··· 4 4 6 4
44* 4 4» 4 4 4 4 4 4 podjednotkami. Podle Northernova přenosu jsou P19 transkripty (mRNA) exprimovány především v mozku.
Částečný lidský paralog PCIP molekul byl také identifikován. Tento paralog je zde označován jako W28559 a je uveden v SEQ ID NO:37 a na obr. 19.
Také byl identifikován opičí KChIP4a a jeho varianty s alternativním sestřihem KChIP4b, KChIP4c a KChIP4d. Opičí KChIP4a je uveden v SEQ ID NO:48 a na obr. 23. Opičí KChIP4b je uveden v SEQ ID NO:50 a na obr. 24. Opičí KChIP4c je uveden v SEQ ID NO:69 a na obr. 35. Opičí KChIP4d je uveden v SEQ ID NO:71 a na obr. 36.
Nukleotidová sekvence kompletní krysí 33b07 cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 33b07 polypeptidů jsou uvedené na obr. 26 a v SEQ ID NO:52 a 53, v příslušném pořadí. Krysí 33b07 cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnost přibližně 44,7 kD, který má délku 407 aminokyselinových zbytků. Krysí 33b07 se váže na rKv4.3N a rKv4.2N s mírnou preferencí pro rKv4.2N ve kvasinkovém 2hybridovém testu.
Nukleotidová sekvence kompletní lidské 33b07 cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence lidského 33b07 polypeptidů jsou uvedeny na obr. 27 a v SEQ ID NO:54 a 55, v příslušném pořadí.
Nukleotidová sekvence části krysí lp cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího lp polypeptidů jsou uvedené na obr. 28 a v SEQ ID NO:56 a 57, v příslušném pořadí. Krysí lp cDNA kóduje protein s molekulovou hmotností přibližně 28,6 kD a délkou 267 aminokyselinových zbytků. Krysí lp se váže na ·· ···· • · • · · ···· · • · ·· ··· • · • · • · • · ·· ··· • · · • · ·· ·· • · · • · · • · · • · · · • Φ ·· rKv4.3Ν a rKv4.2N s mírnou preferencí pro rKv4.3N ve kvasinkovém dvou-hybridovém testu.
Nukleotidové sekvence části krysí 7s cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 7s polypeptidů jsou uvedené na obr. 29 a v SEQ ID NO:58 a 59, v příslušném pořadí. Krysí 7s cDNA kóduje a protein s molekulovou hmotností přibližně 28,6 kD a délkou 270 aminokyselinových zbytků. Krysí 7s se váže na rKv4.3N a rKv4.2N s preferencí pro rKv4.3N v kvasinkovém 2-hybridovém testu.
Sekvence podle předkládaného vynálezu jsou shrnuty v následujících tabulkách I a II.
Tabulka I
Nové polynukleotidy a polypeptidy podle předkládaného vynálezu (kompletní, pokud není uvedeno jinak)
PCIP Forma molekuly nukleové kyseliny Zdroj SEQ ID NO: DNA SEQ ID NO: PROTEIN ATCC
lv nebo KChIPl lv člověk (225-875)* 1 2 98994
KChIPlN (lvN) Varianty s N- terminálním alternativním sestřihem člověk (353-461) 80 81
lv krysa (210-860) 3 4 98946
• 9 • ·
lv myš (477- 1127) 5 6 98945
lvi člověk 79 109
lvi krysa (31-714) 7 8 98942
lvi myš (77-760) 9 10 98943
lvn krysa (345-955) 11 (částečná) 12 (částečná) 98944
(339-1037) 102 (úplná) 103 (úplná)
9q nebo KChIP2 Genomová DNA sekvence člověk 74
Genomová DNA sekvence (Exon 1 a sousední intronové sekvence) člověk 46
Genomová DNA sekvence (Exony 2-11 a sousední intronové sekvence) člověk 47
9ql člověk (207-1019) 13 14 98993 98991
• · • · · · • · · · · · ·· · • · · · · · · · · · · ······· ·· · · · · · “ / · · ········
9ql krysa (2- 775) 15 (částečná) 16 (částečná) 98948
(1-813) 75 (úplná) 76 (úplná)
9ql myš (181 -993) 17 18 98937
9qm člověk (207-965) 19 20 98993 98991
9qm krysa (214-972) 21 22 98941
9qs člověk (207-869) 23 24 98951
9qs opice (133- 795) 25 26 98950
9qc krysa (208-966) 27 28 98947
8t člověk (1-678) 77 (částečná) 78 (částečná)
krysa (1- 678) 29 (částečná) 30 (částečná) 98939
pl9 or KChIP3 KChIP3 (kompletní) člověk (16-786) 82 83
pl9 člověk (1-771) 31 32 PTA- 316
pl9 krysa (1- 330) 33 (částečná) 34 (částečná) 98936
(1-579) 84 (částečná) 85 (částečná)
• · • · • · · · · · · · · ··· · · · · · · · · /10 · ···· ·· ·· ··· · · “O · · ···· ···· ···· · ·· · · ·· ··
pl9 myš (49-819) 35 36 98940
pl93 (částečný) člověk (2-127) 39 40 98949
W28559 W28559 (částečný) člověk (1-339) 37 38
KChIP4 KChIP4a (KCMP4N1) člověk (248-949) 94 95
KChIP4aS (KChIP4NlS) kratší varianty s alternativním sestřihem KChIP4Nl člověk (319-885) 92 93
KChIP4c (KCMP4N2) člověk (90-779) 96 97
KChIP4d (KChIP4N3) člověk (65-817) 98 99
KChIP4a (KCMP4N1) opice (265-966) 48 49
KChIP4b varianty s C- terminálním alternativním sestřihem opice (265-966) 50 (částečná) 51 (částečná)
KChIP4b (KChIP4XC) opice (1-385) 86 (částečná) 87 (částečná)
KChIP4c (KChIP4N2) varianty s alternativním sestřihem opice (122-811) 69 70
• · · · • ·
KChIP4d (KChIP4N3) varianty s alternativním sestřihem opice (64-816) 71 72
KChIP4c (KChIP4N2) myš (56-745) 88 89
KChIP4 krysa (1- 597) 90 (částečná) 91 (částečná)
KChIP4aX (KChIP4Nlx) varianty s alternativním sestřihem KChIP4Nl krysa (1- 821) 100 (částečná) 101 (částečná)
* Koordináty kódující sekvence jsou uvedené v závorkách. První sloupec ukazuje PCIP, které byly identifikovány a sloupec 2 ukazuje různé formy nukleové kyseliny identifikované pro každý PCIP.
Tabulka II
Polynukleotidy a polypeptidy podle předkládaného vynálezu (kompletní, pokud není uvedeno jinak)
PCIP Forma molekuly nukleové kyseliny Zdroj SEQ ID NO: DNA SEQ ID NO: PROTEIN ATCC
33b07 nový 33b07 člověk (88-1332) 52 53 PTA- 316
33b07 krysa (85-1308) 54 55
• · · • · • · · ··· · · · • · · · · · · · · · · ······· · · · · · · · • · · · ♦ · · · · ·
99·· 9 9 9 9 9 9 9 9 9
lp nový ip (částečný) krysa (1-804) 56 57
7s nový 7s (částečný) krysa (1-813) 58 59
29x 29x krysa (433-1071) 60 61
25r varianty s alternativním sestřihem 29x krysa (130-768) 62
5p 5p krysa (52-339) 63 64
7q 7q krysa (1-639) 65 66
19r 19r krysa (1-816) 67 68
★ Koordináty kódující sekvence jsou uvedené v závorkách. První sloupec ukazuje čtyři rodiny PCIP, které byly identifikovány, a sloupec 2 ukazuje různé formy nukleové kyseliny identifikované pro každou rodinu. Také jsou označeny nové molekuly.
Plasmidy obsahující nukleotidové sekvence kódující lidské, krysí a opičí PCIP byly uloženy v American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 17.11.1998, pod přírůstkovými čísly uvedenými výše. Tato uložení byla provedena podle Budapešťské smlouvy o ukládání mikroorganismů pro účely patentových řízení. Tato uložení byla provedena pouze pro potřeby pracovníků v oboru a není důvod, aby uložení bylo provedeno podle požadavků 35 U.S.C. §112.
Klony obsahující cDNA molekuly kódující lidský pl9 (klon EphPl9) a lidský 33b07 (klon Eph33b07) byly uloženy v American Type Culture Collection (Manassas, VA) 8.7.1998 pod přírůstkovým číslem PTA-316, jako součást kompozitního depozita představujícího směs dvou kmenů, který každý nese jeden rekombinantní plasmid s konkrétním cDNA klonem. (ATCC označení kmenu pro směs hP19 a h33b07 je EphP19h33b07mix).
Pro odlišení kmenů a izolaci kmenu nesoucího určitý cDNA klon může být podíl směsi kultivován za zisku jednotlivých kolonií na LB plotnách doplněných 100 pg/ml ampicilinu, jednotlivé kolonie mohou být kultivovány a potom může být plasmidová DNA extrahována za použití standardní minipreparační procedury. Potom může být vzorek tohoto přípravku DNA tráven Notl a získané produkty mohou být rozděleny na 0,8% agarosovém gelu za použití standardních elektroforetických podmínek pro DNA. Trávení vede k zisku následujících proužků: EphP19: 7 kb 9 (jediný proužek), Eph33b07: 5,8 kb (jediný proužek).
Různé aspekty předkládaného vynálezu jsou podrobněji popsány dále v následujících oddílech:
I. Izolované molekuly nukleové kyseliny
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaných molekul nukleové kyseliny, které kódují PCIP proteiny nebo jejich biologicky aktivní části, stejně jako fragmentů nukleové kyseliny dostačujících pro použití jako hybridizační sondy pro identifikaci PCIP-kódujících molekul nukleové kyseliny (např. PCIP mRNA) a fragmentů pro použití jako PCR primery pro amplifikaci nebo mutaci PCIP molekul nukleové kyseliny. Termín molekula nukleové kyseliny označuje DNA ·· · • · · ·· · • · · · · · · φ · • · · · · · φ φ · · · co · ···· ♦······· ·
-7Z. · · · · · · · · · Φ ·· · · · ·· ·· ·· · φ molekuly (např., cDNA nebo genomovou DNA) a RNA molekuly (např., mRNA) a analogy DNA nebo RNA generované za použití nukleotidových analogů. Molekula nukleové kyseliny může být jednořetězcová nebo dvouřetězcová, ale výhodně je to dvouřetězcová DNA.
Izolovaná molekula nukleové kyseliny je molekula, která je separována od jiných molekul nukleové kyseliny, které jsou přítomné v přirozeném zdroji nukleové kyseliny. Výhodně neobsahuje izolovaná nukleová kyselina sekvence, které v přirozeném stavu sousedí s nukleovou kyselinou (t.j., sekvence lokalizované na 5' a 3' koncích nukleové kyseliny) v genomové DNA organismu, ze kterého je nukleová kyselina získána. Například, v různých provedeních, může izolovaná PCIP molekula nukleové kyseliny obsahovat méně než přibližně 5 kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1 kb, 0,5 kb nebo 0,1 kb nukleotidové sekvence, která v přirozeném stavu sousedí s nukleovou kyselinou v genomové DNA organismu, ze kterého je nukleová kyselina získána. Dále, izolovaná molekula nukleové kyseliny, jako je cDNA molekula, může být významně prostá jiného buněčného materiálu nebo kultivačního media, když je produkována rekombinantními technikami, nebo může být významně prostá chemických prekursorů nebo jiných chemických činidel, když je syntetizována chemicky.
Molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, např. molekula nukleové kyseliny s nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:9, ; SEQ ID NO:11, ; SEQ ID 1 NO:13, ; SEQ ID NO:15, ; SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25,
SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID
NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47,
SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID
NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74,
• 4 4
444 444 *4 4 • 4 4 4 4 444 4 4 4
CO 4 4444 44 44 444 4 4
JJ 4 4 4444 4444
4444 4 44 44 44 44
SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID
NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90,
SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo s nukleotidovou sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944,
98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo jeho části, může být izolovaná za použití standardních technik molekulární biologie a informací o sekvenci, které jsou zde uvedeny. Za použití celé nebo části sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID
NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21,
SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID
NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39,
SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID
NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69,
SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID
NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86,
SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID
NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, nebo í SEQ ID NO:102, nebo
nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940,
98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, jako hybridizační sondy, může být PCIP molekula nukleové kyseliny izolovaná za použití standardních hybridizačních a klonovacích technik (jak jsou popsány např. v Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Dále, molekula nukleové kyseliny obsahující celou nebo • 0 0
0
0000
000000 00 000 0 0 ^7“ 0 0 00·· 000·
0000 0 00 00 00 00
Část SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7, SEQ ID
N0:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:17,
SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID
NO: 27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO: 35,
SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID
NO: 48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO: 56,
SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID
NO: 75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO: 82,
SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID
NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO: 100, nebo SEQ ID NO:102, nebo nukleotidovou sekvenci DNA
insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, může být izolovaná polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) za použití syntetických oligonukleotidových primerů navržených podle sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID
NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID
NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79,
SEQ ID NO:8 0, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID
NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, nebo I SEQ ID NO:102, nebo podle
nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 989.36, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994.
Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být ·· * ** · 9 « « 9 «9 t « · · · 9 9 99 9 __ 9 · ♦ 9 9 «9« 9 9 9
SS · 9999 99 99 999 9 9 + φ 9999 9999 • 999 9 99 99 99 99 amplifikována za použití cDNA, mRNA nebo alternativně, genomové DNA, jako templátu a vhodných oligonukleotidových primerů za použití standardních PCR amplifikačních technik. Takto amplifikovaná nukleová kyselina může být klonována do vhodného vektoru a může být charakterizována analýzou DNA sekvence. Dále, oligonukleotidy odpovídající PCIP nukleotidové sekvenci mohou být připraveny standardními technikami syntézy, např. za použití automatizovaného DNA syntezátoru.
Ve výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID N0:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID
NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23,
SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID
NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46,
SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID
NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71,
SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID
NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88,
SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID
NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo nukleotidovou
sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo část jakékoliv z těchto nukleotidových sekvencí.
V jiném výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu molekulu nukleové kyseliny, která je komplementární k nukleotidové sekvenci uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID ··· *r Μ ··»<*»*· • 1 · ·*· * · 4 • · · 4· ··« 4 · 9 • ···· 44 44 444 4 4
4 4444 444«
4444 4 44 44 44 44
NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23,
SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID
NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46,
SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID
NO:54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71,
SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID
NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:8 4, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88,
SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID
NO:98, SEQ ID NQ:100, nebo ; SEQ ID NO:102, nebo k nukleotidové
sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo k části jakékoliv z těchto nukleotidových sekvencí. Molekula nukleové kyseliny, která je komplementární k nukleotidové sekvenci uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9,
SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27,
SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID
NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:4 8,
SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID
NO: 58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75,
SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID
NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92,
SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, nebo
SEQ ID NO:102, nebo k nukleotidové sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936,
98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, je taková molekula, která je dostatečně komplementární k nukleotidové sekvenci uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3,
SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, nebo k nukleotidové sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC • · r-*7 · ···· ·· · · ··· · ·
O z · · ········ ···· · ·· ·· · · ·· pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940,
98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949,
98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, tak, že : může
hybridizovat na nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1,
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID
NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19,
SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID
NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37,
SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID
NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58,
SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID
NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84,
SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID
NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100 , nebo SEQ ID
NO:102, nebo na nukleotidovou sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, za tvorby stabilního duplexu.
V ještě jiném výhodném provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z přibližně 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% nebo více procent identická s celou nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ
ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID
NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27,
SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID
NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48,
SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID
NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75,
SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:7 9, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID
• · • · • · · · • · · • · · • ·
NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92,
SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:100, nebo
SEQ ID NO:102, nebo celou nukleotidovou sekvencí DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936,
98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo částí jakékoliv z těchto nukleotidových sekvencí.
Dále, molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může obsahovat pouze část sekvence nukleové kyseliny uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25,
SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID
NO: 35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID
NO: 56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74,
SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID
NO: 82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90,
SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO: 100, nebo i SEQ ID NO:102, nebo nukleotidové sekvence ] DNA
insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944,
98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, například fragment, který může být použit jako sonda nebo primer nebo fragment kódující biologicky aktivní část PCIP proteinu. Nukleotidové sekvence určená z klonování PCIP genu umožňuje generování sond a primerů určených pro použití v identifikování a/nebo klonování jiných členů PCIP rodiny, stejně jako PCIP homologů z jiných druhů.
Sonda/primer typicky obsahují významně přečištěné oligonukleotidy. Oligonukleotidy typicky obsahují region • · • · · · ···· · · · ······· ·· · · · · · • · · · · · ···· • · · · · · · ·· · · · · nukleotidové sekvence, který hybridizuje za přísných podmínek na alespoň přibližně 12 nebo 15, výhodně přibližně 20 nebo 25, ještě lépe přibližně 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, nebo 75 následujících nukleotidů kódující sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ
ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID
NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29,
SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID
NO:3 9, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50,
SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID
NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77,
SEQ ID NO:7 9, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID
NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94,
SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102,
nebo nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939,
98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, protismyslné sekvence k SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25,
SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID
NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47,
SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID
NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74,
SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID
NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90,
SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO:100, nebo i SEQ ID NO:102, nebo k nukleotidové ; sekvenci DNA
insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo přirozené alelické varianty nebo mutantu SEQ • · • · · · · · · • · · · · · ·· ·
ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:9,
SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID
NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27,
SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID
NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48,
SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID
NO: 58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75,
SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:7 9, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID
NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92,
SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo
SEQ ID NO:102, nebo nukleotidová sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994.
V příkladném provedení molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která má délku 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 949, 950-1000, nebo více nukleotidů a hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek na molekulu nukleové kyseliny SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ
ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID
NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29,
SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50,
SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID
NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:7 4, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77,
SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:8 0, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID
NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94,
SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102,
nebo na nukleotidovou sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, ·· · • · · · · · 9 9 · • · · · ···· · · · ······· ·· ·»· · · • · ···· ···· ···· · 99 ·· ·· ··
98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994.
Sondy navržené podle PCIP nukleotidové sekvence mohou být použity pro detekci transkriptů nebo genomové sekvence kódující stejné nebo homologní proteiny. Ve výhodném provedení sonda dále obsahuje na sebe navázanou značkovací skupinu, např. radioisotop, fluorescentní sloučeninu, enzym nebo kofaktor enzymu. Takové sondy mohou být použity jako součást diagnostického testovacího křtu pro identifikaci buněk nebo tkání, které chybně exprimují PCIP protein, například pomocí měření koncentrace PCIP-kódující nukleové kyseliny ve vzorku buněk od jedince, např. detekování koncentrací PCIP mRNA nebo určení toho, zda byl genomový PCIP gen mutován nebo deletován.
Fragment nukleové kyseliny kódující biologicky aktivní část PCIP proteinu může být připraven izolováním části nukleotidové sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5,
SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID
NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23,
SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID
NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46,
SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID
NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71,
SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID
NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88,
SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID
NO:98, SEQ ID NQ:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo nukleotidové
sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, která kóduje polypeptid s PCIP biologickou aktivitou (biologické aktivity PCIP proteinů jsou popsány dále), expresí kódované části PCIP proteinu • · (např. rekombinantní expresí in vitro) a hodnocením aktivity kódované části PCIP proteinu.
• · · · · • · · · · · · · ···· · · · ·
Vynález dále zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, které se liší od nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ
ID NO:: 13, SEQ ID NOh 15, SEQ ID NOh 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID
NO: 21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:2 9,
SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID
NO: 39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50,
SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID
NO: 69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77,
SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID
NO: 86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94,
SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102
nebo od nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým č. 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, v důsledku degenerace genetického kódu a kódují stejné PCIP proteiny jako jsou proteiny kódované nukleotidovou sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID
NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27,
SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID
NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48,
SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID
NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75,
SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID
NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92,
SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo
SEQ ID NO:102 nebo nukleotidovou sekvencí DNA insertu plasmidu
uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938 • · φφ φφ φφ φφφφ φφφ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φφ φφφ · · φ φφ φ φ φφ φ φφ φφ φφ φφ
98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994. V jiném provedení má izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu nukleotidovou sekvenci kódující protein mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2, SEQ
ID NO:4 , SEQ : ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID
NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30,
SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO:40, SEQ ID NO:4 9, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55,
SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:5 9, SEQ ID NO:7 0, SEQ ID NO:72, SEQ ID
NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85,
SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:8 9, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID
NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID
NO:103, nebo SEQ ID NO:109.
Kromě PCIP nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO:1,
SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID
NO: 11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19,
SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID
NO: 29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37,
SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID
NO: 50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58,
SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID
NO: 77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84,
SEQ ID NO:86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID
NO: 94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID
NO:102, nebo nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, bude odborníkům v oboru jasné, že v populaci (např. v lidské populaci) mohou existovat polymorfismy DNA sekvence, které • •4 4
4 4 ·· 4 4 · 4 •44 *44 44 · Λ 444 44444 444
Ad 4 4444 4 4 44 444 4 4
VT 4 4 4444 4444
4444 4 44 44 44 44 mohou vést ke změnám v aminokyselinové sekvenci PCIP proteinů. Takové genetické polymorfismy v PCIP genech mohou existovat mezi jedinci v populaci v důsledku přirozených alelických variací. Termíny gen a rekombinantní gen označují molekuly nukleové kyseliny, které obsahují otevřený čtecí rámec kódující PCIP protein, výhodně savčí PCIP protein, a mohou dále obsahovat nekódující regulační sekvence a introny.
Alelické varianty lidského PCIP zahrnují jak funkční, tak nefunkční PCIP proteiny. Funkční alelické jsou přirozené varianty aminokyselinové sekvence lidského PCIP proteinu, které si zachovávají schopnost vazby na PCIP ligand a/nebo modulují jakoukoliv ze zde PCIP aktivit popsaných. Funkční alelické varianty obvykle obsahují pouze konzervativní substituce jedné nebo více aminokyselin SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID
NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30,
SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55,
SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID
NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85,
SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:8 9, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID
NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID
NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo substituce, delece nebo inserce nekritických zbytků v nekritických regionech proteinu.
Nefunkční alelické varianty jsou přirozené varianty aminokyselinové sekvence, které si nezachovávají schopnost vazby na PCIP ligand a/nebo modulují jakoukoliv ze zde PCIP aktivit popsaných. Nefunkční alelické varianty obvykle obsahují nekonzervativní substituce, delece nebo inserce nebo předčasná zkrácení aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:2, SEQ φφ φ φ φφφφ
65 ΦΦ Φ • φ Φ φ φ Φ ΦΦ • • Φ · Φ ΦΦ ·· Φ φ Φ * • φ φ Φ · φ φ φ φ Φ φ φ φ Φ φφ Φ Φ φφφφ Φ ♦ • Φ φ Φ φ φ Φ Φ ··
Φ Φ φφφφ ΦΦΦΦ Φ Φ
ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ ID
NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:30,
SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO:55,
SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72, SEQ ID
NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:8 5,
SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID
NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101, , SEQ ID
ΝΟ:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo substituce, inserce nebo delece v kritických zbytkách nebo kritických regionech.
Předkládaný vynález dále poskytuje non-lidské ortology lidského PCIP proteinu. Ortology lidského PCIP proteinu jsou proteiny, které jsou izolované z non-lidského organismu a které mají stejnou vazbu na PCIP ligand a/nebo modulaci aktivit draslíkového kanálu jako lidský PCIP protein. Ortology lidského PCIP proteinu mohou být snadno identifikovány podle toho, že obsahují aminokyselinovou sekvenci, která je významně identická se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID
NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30,
SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO:4 0, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55,
SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID
NO:7 6, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85,
SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:8 9, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID
NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID
NO:103, nebo SEQ ID NO:109.
Dále, molekuly nukleové kyseliny kódující jiné členy PCIP rodiny a proto mající nukleotidovou sekvenci, která je odlišná • · od PCIP sekvence uvedené v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID
NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID
NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79,
SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID
NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo od
nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Například může být jiná PCIP cDNA identifikována podle nukleotidové sekvence lidského PCIP.
Dále, molekuly nukleové kyseliny kódující PCIP proteiny z různých druhů, které tedy mají nukleotidovou sekvenci, která je odlišná od PCIP sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID
NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID
NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79,
SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID
NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100, nebo ; SEQ ID NO:102, nebo od
nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, • · · * » ·
v/ · · « · · · • · · » · · · · ·
98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Například může být myší PCIP cDNA identifikována podle nukleotidová sekvence lidského PCIP.
Molekuly nukleové kyseliny odpovídající přirozeným alelickým variantám a homologům PCIP cDNA podle předkládaného vynálezu mohou být izolované podle své homologie s PCIP nukleovou kyselinou podle předkládaného vynálezu za použití zde popsané cDNA, nebo její části, jako hybridizační sondy za použití standardních hybridizačních technik a za přísných podmínek hybridizace.
V souladu s tím má v jiném provedení izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu délku alespoň 15, 20, 25, 30 nebo více nukleotidů a hybridizuje za přísných podmínek na molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ
ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:21, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:39, SEQ ID
NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO:69, SEQ ID
NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79,
SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO:86, SEQ ID
NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:100, nebo SEQ ID NO:102 nebo nukleotidovou sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994. V jiném provedení má nukleová kyselina délku alespoň 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 307, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, « « · t« <· «· <· • 9 9 » 9 a • 99 9 9
9
4 « « 9
99
9 9
9 999
9 » 9 9
9 9 9
99
9 9
9 9
9 9 9
9 9 « ♦ · ·
850, 900, 949, nebo 950 nukleotidů. Termín hybridizuje za přísných podmínek, jak je zde použit, označuje podmínky pro hybridizaci a promývání, za kterých nukleotidové sekvence alespoň z 60% identické zůstávají navázány na sebe. Výhodně jsou podmínky takové, že sekvence alespoň přibližně ze 70%, lépe alespoň z přibližně 80%, ještě lépe alespoň přibližně z 85% nebo 90% identické hybridizují jedna na druhou.
Takové přísné podmínky jsou známé odborníkům v oboru a jsou uvedeny v Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, lne. (1995), sekce 2, 4 a 6. Další přísné podmínky může jsou uvedeny v Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), kapitoly 7, 9 a 11. Výhodným příkladem přísných hybridizačních podmínek jsou hybridizace v 4X chloridu sodném/citrátu sodném (SSC), při přibližně 65-70 °C (nebo alternativně hybridizace v 4X SSC plus 50% formamid při přibližně 42-50 °C) , po které následuje jedno nebo více promytí v IX SSC, při přibližně 65-70 °C. Výhodným příkladem přísných hybridizačních podmínek jsou hybridizace v IX SSC, při přibližně 65-70 °C (nebo alternativně hybridizace v IX SSC plus 50% formamid při přibližně 42-50 °C) , po které následuje jedno nebo více promytí v 0,3 X SSC, při přibližně 65-70 °C. Výhodným příkladem hybridizačních podmínek s redukovanou přísností jsou hybridizace 4X SSC, při přibližně 50-60 °C (nebo alternativně hybridizace v 6X SSC plus 50% formamid při přibližně 40-45 °C) , po které následuje jedno nebo více promytí 2X SSC, pří přibližně 50-60 °C. Hodnoty v uvedených mezích např. 65-70 °C nebo při 42-50 °C také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. SSPE (lxSSPE je 0,15 M NaCl, 10 mM NaH2PO4, a 1,25 mM EDTA, pH 7,4) může být použit místo SSC (IX SSC je 0,15 M NaCl a 15 mM citrát sodný) v hybridizačních a promývacích pufrech; promytí se provádějí po dobu 15 minut po dokončení každé ·· • 6
» · · • · • · · ·· ··*· ·♦·· • · ··· • · · · • · « ·
4· ·<
hybrídizace. Hybridizační teplota pro hybridy s předpokládanou délkou méně než 50 párů baží by měla být o 5-10oC nižší než je teplota tání (Tm) hybridu, kde Tm se určí podle následující rovnice. Pro hybridy menší než 18 párů baží se Tm(°C) = 2(# A +
T baží) + 4 (# G + C baží). Pro hybridy délky 18 a 49 baží se Tm(°C) = 81,5 + 16, 6 (log10 [Na+] ) + 0,41(%G+C) - (600/N), kde N je počet baží v hybridu a [Na+] je koncentrace sodíkových iontů v hybridizačním pufru ( [Na+] pro IX SSC = 0,165 M). Odborníkům v oboru je také známo, že do hybridizačních a/nebo promývacích pufrů mohou být přidána další činidla, která snižují nespecificikou hybridizaci molekul nukleové kyseliny na membrány, například nitroceluíosové nebo nylonové membrány, včetně například blokovacích činidel (např. BSA nebo lososí nebo makrelí spermatická DNA), detergenty (např., SDS), chelatační činidla (např. EDTA), Ficoll, PVP a podobně. Při použití nylonových membrán je příkladem přísných hybridizačních podmínek hybrídizace v 0,25-0,5 M NaH2PO4, 7%
SDS při přibližně 65 °C, po které následuje jedno nebo více promytí s 0,02 M NaH2PO4, 1% SDS při 65oC (viz např. Church a Gilbert (1984) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:1991-1995), nebo alternativně 0,2X SSC, 1% SDS.
Výhodně izolované molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, které hybridizují za přísných podmínek na sekvenci SEQ ID NO:1, odpovídají přirozené molekule nukleové kyseliny. Termín přirozená molekula nukleové kyseliny označuje RNA nebo DNA molekulu mající nukleotidovou sekvenci, která se vyskytuje za přirozeného stavu (např. kóduje přirozený protein).
Kromě přirozené alelické varianty PCIP sekvence, která může existovat v populaci, bude odborníkům v oboru jasné, že do nukleotidové sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, • · · · · • · · · • · · · • · · · · · · • · ···· ···· •··» · ·· · · ·· ··
SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID
NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23,
SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID
NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46,
SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID
NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71,
SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:7 5, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID
NO:8 0, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88,
SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID
NO:98, SEQ ID NO:100, nebo 1 SEQ ID NO:102, nebo do nukleotidové
sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, mohou být mutací vloženy změny, které způsobí změny v aminokyselinové sekvenci kódovaných PCIP proteinů, bez narušení funkční schopnosti PCIP proteinů. Například mohou být v sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ
ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID
NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29,
SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:4 8, SEQ ID NO:50,
SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID
NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77,
SEQ ID NO:7 9, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID
NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94,
SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102,
nebo v nukleotidové sekvenci DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939,
98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, provedeny substituce nukleotidů vedoucí k aminokyselinovým substitucím v neesenciálních aminokyselinových zbytcích. Neesenciální ·· · • · ··· φ φ · • · · · · ··· φφφ ••••ΦΦΦ φ φ φφφ · · • · ···· ···· ···· · ·· ·· ·· φ · aminokyselinový zbytek je zbytek, který může být pozměněn v přirozené sekvenci PCIP (např. sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NQ:10, SEQ ID NO:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID
NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30,
SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55,
SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID
NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85,
SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID
NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID
NO:103, nebo SEQ ID NO:109) bez změny biologických aktivit, zatímco esenciální aminokyselinový zbytek je nutný pro biologickou aktivitu. Například, aminokyselinové zbytky, které jsou konzervovány mezi PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu, jsou zejména nevhodné pro alteraci. Dále, další aminokyselinové zbytky, které jsou konzervovány mezi PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu a dalšími členy PCIP rodiny proteinů, nejsou také vhodné k alteraci.
Proto se jiný aspekt předkládaného vynálezu týká molekul nukleové kyseliny kódujících PCIP proteiny, které obsahují změny v aminokyselinových zbytcích, které nejsou esenciální pro aktivitu. Takové PCIP proteiny se liší v aminokyselinové sekvenci od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16,
SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID
NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34,
SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID
NO:51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59,
SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID
NO:81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:89,
SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID
• * • · · · «· · · φ · • · φφφ · · • · · φ φφφφ φ · φ φφφφφφ · · · · · φ * · ΦΦ·· ···· •φφφ · φφ ·· ·· ··
ΝΟ:99, SEQ ID ΝΟ:101, SEQ ID ΝΟ:103, nebo SEQ ID ΝΟ:109, a stále si zachovávají biologickou aktivitu. V jednom provedení obsahuje izolovaná molekula nukleové kyseliny nukleotidovou sekvenci kódující protein, kde protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci alespoň z přibližně 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% nebo více procent identickou se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID
NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18,
SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID
NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36,
SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID
NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70,
SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID
NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91,
SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID
NO:101, SEQ ID NO :102 1, nebo SEQ ID NO:109.
Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující PCIP protein homologní s proteinem se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID
NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22,
SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID
NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40,
SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID
NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76,
SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID
NO:87, SEQ ID NO:8 9, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95,
SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO : 102 1, nebo
SEQ ID NO:109 může být vytvořena vložením jedné nebo více nukleotidových substitucí, adicí nebo delecí do nukleotidové sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25
73 ·· · • · · * · • · · • • · · · • • · · • • • · · · • · · • · · · · • · · · 1 • · · · • · · · • · • · • · • · · • · • · • · · · • • • • · • ·
SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID
NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47,
SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID
NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 74,
SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID
NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90,
SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo nukleotidové sekvence : DNA
insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, tak, že je jedna nebo více aminokyselinových substitucí, adicí nebo delecí vložena do kódovaného proteinu. Mutace mohou být vloženy do SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID
NO:46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID
NO:71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79,
SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID
NO:88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo : SEQ ID NO:102, nebo do
nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, za použití standardních technik, jako je místně cílená mutagenese a PCRzprostředkovaná mutagenese. Výhodně jsou konzervativní aminokyselinové substituce provedeny v jednom nebo více neesenciálních aminokyselinových zbytcích. Konzervativní aminokyselinová substituce je taková substituce, ve které je • · • · · ο« • · · · · · • · · · · · · · • ······ · · · • · · · · · ···· « ·· ·· aminokyselinový zbytek nahrazen aminokyselinovým zbytkem majícím podobný vedlejší řetězec. Rodiny aminokyselinových zbytků majících podobné vedlejší řetězce byly v oboru definovány. Těmito rodinami jsou aminokyseliny s bazickými vedlejšími řetězci (např. lysin, arginin, histidin), acidickými vedlejšími řetězci (např. kyselina asparagová, glutamová), polárními vedlejšími řetězci bez náboje (např. glycin, asparagin, glutamin, serin, threonin, tyrosin, cystein), nepolárními vedlejšími řetězci (např. alanin, valin, leucin, isoleucín, prolin, fenylalanin, methionin, tryptofan), beta-větvenými vedlejšími řetězci (např. threonin, valin, isoleucin) a aromatickými vedlejšími řetězci (např. tyrosin, fenylalanin, tryptofan, histidin). Tak je předpokládaný neesenciální aminokyselinový zbytek v PCIP proteinu výhodně nahrazen jiným aminokyselinovým zbytkem ze stejné skupiny vedlejších řetězců. Alternativně, v jiném provedení, mohou být mutace vkládány náhodně do celé nebo do části PCIP kódující sekvence, například saturační mutagenesí, a vzniklé mutanty mohou být testovány na PCIP biologickou aktivitu za účelem identifikace mutantů, které si zachovávají aktivitu. Po mutagenesi SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO: 17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25,
SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID
NO: 35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47,
SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID
NO: 56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74,
SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID
NO: 82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90,
SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem • 9
99 9 • · · · » ·
9 · · 99 9 9 9
9999 99 99 999 9
9 9 9 9 9 9 9 9
99 99 9 9 99
98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, může být kódovaný protein exprimován rekombinantně a může být určena aktivita proteinu.
Ve výhodném provedení může být mutantní PCIP protein testován na schopnost (1) interagovat s (např. vázat se na) a protein draslíkového kanálu nebo jeho část; (2) regulovat fosforylační stav proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části; (3) asociovat s (např. vázat se na) vápník a účinkovat jako kalcium-dependentní kinasy, např. fosforylovat draslíkový kanál způsobem závislým na vápníku; (4) asociovat s (např. vázat se na) vápník, a účinkovat jako transkripční faktory závislé na vápníku; (5) modulovat aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem v buňkách (např., neuronech nebo buňkách srdce), například za účelem příznivého ovlivnění buněk; (6) modulovat uvolňování neurotransmiterů; (7) modulovat excitabilitu membrány; (8) ovlivňovat klidový potenciál membrán; (9) modulovat formy vln a frekvence akčních potenciálů; a (10) modulovat prahy excitace.
Kromě molekul nukleové kyseliny kódující PCIP proteiny popsané výše se jiný aspekt předkládaného vynálezu týká izolovaných molekul nukleové kyseliny, které jsou protismyslné k těmto molekulám. Protismyslná nukleová kyselina obsahuje nukleotidovou sekvenci, která je komplementární ke kódující nukleové kyselině kódující protein, např. komplementární ke kódujícímu řetězci dvoj řetězcové cDNA molekuly nebo komplementární k mRNA sekvenci. Tak může být protismyslná nukleová kyselina navázána vodíkovou vazbou na kódující nukleovou kyselinu. Protismyslná nukleová kyselina může být komplementární k celému PCIP kódujícímu řetězci nebo pouze k jeho částí. V jednom provedení je protismyslná molekula • · · · • · ♦ «* ·· · · ··· · · · · · · • · · · · · · · 9 t « ·♦····♦ · · ··· · 9 / O 9 9 9 99 9 9 99 9
99 9 * ·· ·· · « « » nukleové kyseliny protismyslná je kódujícímu regionu kódujícího řetězce nukleotidové sekvence kódující PCIP. Termín kódující region označuje region nukleotidové sekvence obsahující kodony, které jsou translatovány do aminokyselinových zbytků. V jiném provedení je protismyslná molekula nukleové kyseliny protismyslná k nekódujícímu regionu kódujícího řetězce nukleotidové sekvence kódující PCIP. Termín nekódující region označuje 5’ a 3’ sekvence sousedící s kódujícím regionem, které nejsou translatovány do aminokyselin (t.j. sekvence též označované jako 5' a 3' netranslatované regiony).
Podle kódujícího řetězce sekvence kódující PCIP, která je zde popsaná, může být protismyslná nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu navržena podle pravidel Watsonova a Crickova párování baží. Protismyslná molekula nukleové kyseliny může být komplementární k celému kódujícímu regionu PCIP mRNA, ale lépe jde o oligonukleotid, který je protismyslný pouze k části kódujícího nebo nekódujícího regionu PCIP mRNA. Například může být protismyslný oligonukleotid komplementární k regionu sousedícímu se start místem pro translaci PCIP mRNA. Protismyslné oligonukleotidy mohou mít délku například přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 30,
35, 40, 45 nebo 50 nukleotidů. Protismyslná nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být připravena za použití chemické syntézy a enzymatických ligačních reakcí za použití postupů známých v oboru. Například může být protismyslná nukleová kyselina (např. protismyslný oligonukleotid) chemicky syntetizován za použití přirozených nukleotidů nebo různě modifikovaných nukleotidů navržených pro zvýšení biologické schopnosti molekul nebo pro zvýšení fyzikální schopnosti duplexu tvořeného mezi protismyslnou a kódující nukleovou kyselinou, např. za použití fosforothiodtových derivátů a • · · · ··· · » ·· · · ·*· ··· · 4 ·
4 4 · 4 4 4 4 4 · · »······ * · 4 4 4 · · • 4 · · · · · 4 · 4 • ♦·· 4 ·· 4 4 4 4 «» akridinem substituovaných nukleotidů. Příklady modifikovaných nukleotidů, které mohou být použity pro generování protismyslné nukleové kyseliny, jsou 5-fluoruracil, 5bromuracil, 5-chloruracil, 5-joduracil, hypoxanthin, xanthin, 4-acetylcytosin, 5-(karboxyhydroxylmethyl)uráčil, 5karboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5karboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-Dgalaktosylqueosin, inosin, N6-isopentenyladenin, 1methylguanin, 1-methylinosin, 2,2-dimethylguanin, 2methyladenin, 2-methylguanin, 3-methylcytosin, 5methylcytosin, N6-adenin, 7-methylguanin, 5methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosin, 5'-methoxykarboxymethyluracil, 5methoxyuracil, 2-methylthio-N6-isopentenyladenin, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), wybutoxosin, pseudouracil, queosin, 2thiocytosin, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 4thiouracil, 5-methyluracil, methylester kyseliny uracil-5oxyoctové, kyselina uracil-5-oxyoctová (v), 5-methyl-2thiouracil, 3-(3-amino-3-N-2-karboxypropyl)uráčil, (acp3)w a 2,6-diaminopurin. Alternativně může být protismyslná nukleová kyselina produkována biologicky za použití exprese vektoru, do kterého byla nukleová kyselina subklonována v protismyslné orientaci (t.j. RNA transkribovaná z vložené nukleové kyseliny buňce v protismyslné orientaci k cílové nukleové kyselině, jak je podrobněji popsáno v následujícím oddíle).
Protismyslné molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu jsou obvykle podány jedincům nebo jsou generovány in šitu tak, že hybridizují s nebo se váží na buněčnou mRNA a/nebo genomovou DNA kódující PCIP protein a tak inhibují expresí proteinu, např. inhibicí transkripce a/nebo translace. Hybridizaci může být běžná komplementarita nukleotidů vedoucí ke vzniku stabilního duplexu, nebo 78 • · · · · ······ • · · · · · · • · · · · · · · · · ······ · · ··· · · • · · · · ··«· • · · ·· *· · · například - v případě protismyslné molekuly nukleové kyseliny, která se váže na DNA duplexy, se může jednat o hybridizaci způsobenou specifickými interakcemi v hlavní drážce dvoušroubovice. Příkladem způsobu podání protismyslných molekul nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu je přímá injekce do tkáně. Alternativně může být protismyslná molekula nukleové kyseliny modifikována pro cílené podání do vybraných buněk a potom může být podána systémově. Například, pro systémové podání, může být protismyslná molekula modifikována tak, že se specificky naváže na receptory nebo antigeny exprimované na povrchu vybraných buněk, např. pomocí navázání protismyslných molekul nukleové kyseliny na peptidy nebo protilátky, které se váží na povrchové buněčné receptory nebo antigeny. Protismyslná molekula nukleové kyseliny může být také dopravena do buněk za použití zde popsaných vektorů. Pro dosažení dostatečných intracelulárních koncentrací protismyslných molekul jsou výhodné vektorové konstrukty, ve kterých je protismyslná molekula nukleové kyseliny umístěna pod kontrolu silného pol II nebo pol III promotoru.
V ještě jiné provedení je protismyslná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu α-anomerní molekula nukleové kyseliny. aanomerní molekula nukleové kyseliny tvoří specifické dvouřetězcové hybridy s komplementární RNA ve kterých, oproti obvyklým β-podjednotkám, jsou řetězce navzájem paralelní (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). Protismyslná molekula nukleové kyseliny může též obsahovat 2'-o-methylribonukleotid (Inoue et al. (1987)
Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) nebo chimérický RNA-DNA analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330).
V ještě jiném provedení je protismyslnou nukleovou kyselinou podle předkládaného vynálezu ribozym. Ribozymy jsou *· · ♦ · 9 · • ♦ · · · · ··« ♦ 9 9··
9999 9 9 99
9 9 9 9
9 9 · ·· « e katalytické RNA molekuly s ribonukleasovou aktivitou, které jsou schopné štěpit jednořetězcové nukleové kyseliny, jako je mRNA, ke kterým obsahují komplementární region. Tak mohou být ribozymy (např.. hammerhead ribozymy (popsané v Haselhoff and Gerlach (1988) Nátuře 334:585-591)) použity pro katalytické štěpení PCIP mRNA transkriptů a tím pro inhibici translace PCIP mRNA. Ribozym se specificitou pro PCIP-kódující nukleové kyseliny může být navržen podle nukleotidové sekvence PCIP cDNA, která je zde popsána (t.j., SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ
ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID
NO: 4 6, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID
NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79,
SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID
NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo podle nukleotidové sekvence DNA insertu plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994). Například může být připraven derivát Tetrahymena L-19 IVS RNA, ve kterém je nukleotidové sekvence aktivního místa komplementární k nukleotidové sekvenci, která má být štěpena v PCIP-kódující mRNA. Viz např. Cech et al. U.S. Patent č. 4,987,071; a Cech et al. U.S. Patent č. 5,116,742. Alternativně může být PCIP mRNA použita pro selekci katalytické RNA mající specifickou ribonukleasovou aktivitu ze skupiny RNA molekul. Viz např. Bartel, D. and Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
Alternativně může být exprese PCIP genu inhibována cíleným
9 9 9 · •99 9 9 · · · · • 9 9 9 9*99 99 9
9999 99 99 9 9 · * 9 • 9 9 9 · 9 99 9 9 • 999 « 99 99 ·· 9 9 ovlivněním nukleotidové sekvence komplementární k regulačnímu regionu PCIP (např. PCIP promotoru a/nebo zesilovače transkripce) za vzniku trojšroubovice, která brání transkripci PCIP genu v cílových buňkách. Viz Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N.Y.
Acad. Sci. 660:27-36; a Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15.
V ještě jiném provedení mohou být PCIP molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu modifikovány v bázi, sacharidové skupině nebo fosfátovém skeletu za zlepšení schopnost, hybridizace nebo rozpustnosti molekuly. Například, deoxyribosofosfátový skelet molekuly nukleové kyseliny může být modifikován za zisku peptidové nukleové kyseliny (viz Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic & Medicinal Chemistry 4 (1): 5-23). Termíny peptidové nukleové kyseliny nebo PNA označují sloučeniny napodobující nukleové kyseliny, např. DNA, ve kterých je deoxyribosofosfátový skelet nahrazen pseudopeptidovým skeletem a jsou zachovány pouze čtyři obvyklé nukleobaze. Bylo prokázáno, že neutrální skelet PNA umožňuje specifickou hybridizaci na DNA a RNA za podmínek s nízkou koncentrací iontů. Syntéza PNA oligomerů může být provedena za použití standardních protokolů syntézy peptidů na pevné fázi, jak jsou popsány v Hyrup B. et al. (1996) výše; PerryO'Keefe et al. Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 14670-675.
PNA PCIP molekul nukleové kyseliny mohou být použity v terapeutických a diagnostických aplikacích. Například, PNA mohou být použity jako protismyslná nebo antigenní činidla pro sekvenčně-specifickou modulaci genové exprese, například prostřednictvím indukci zástavy transkripce nebo translace nebo inhibici replikace. PNA PCIP molekul nukleové kyseliny mohou být také použity v analýze mutací jediného páru baží
*· · · • · · • ·· · ··· · « · ··· • · · · • · * · ·· 99
9 9
9 9 v genu (např. PNA-řízeným PCR clamping); jako 'artificiální restrikční enzymy', když jsou použity v kombinaci s jinými enzymy, (např., Sl nukleasami (Hyrup B. (1996), výše)); nebo jako sondy nebo primery pro DNA sekvenování nebo hybridizaci (Hyrup B. et al. (1996), výše; Perry-0'Keefe, výše).
V jiném provedení mohou být PNA PCIP modifikovány, (např. pro zvýšení jejich stability nebo vychytávání v buňkách), navázáním lipofilních nebo jiných pomocných skupin na PNA, tvorbou PNA-DNA chimér, nebo použitím liposomů nebo jiných technik pro přenos léků známých v oboru. Například mohou btý připraveny PNA-DNA chiméry PCIP molekul nukleové kyseliny, které mohou kombinovat výhodné vlastnosti PNA a DNA. Takové chiméry umožňují enzymům rozpoznávajícím DNA (např. RNAse H a DNA polymerasa) interagovat s částí, zatímco PNA část dodá vysokou vazebnou afinitu a specificitu. PNA-DNA chiméry mohou být navázány za použití spojovacích skupin vhodné délky vybraných podle velikosti baží, počtu vazeb mezi nukleobasemi a orientace (Hyrup B. (1996), výše). Syntéza PNA-DNA chimér může být provedena způsobem popsaným v Hyrup B. (1996), výše a Finn P.J. et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24 (17): 3357-63. Například může být DNA řetězec syntetizován na pevném nosiči za použití standardních fosforamiditových kondenzačních činidel a modifikovaných nukleosidových analogů, např., 5'-(4methoxytrityl)amino-5'-deoxy-thymidin- fosforamidit může být použit mezi PNA a 5' koncem DNA (Mag, M. et al. (1989) Nucleic
Acid Res. 17: 5973-88). PNA monomery se potom postupně na sebe navazují za zisku chimérické molekuly s 5' PNA segmentem a a 3' DNA segmentem (Finn P.J. et al. (1996), výše).
Alternativně, chimérické molekuly mohou být syntetizovány s 5' DNA segmentem a 3' PNA segmentem (Peterser, K.H. et al. (1975)
Bioorganic Med. Chem. Lett. 5: 1119-11124).
• 44
• 4 · ·· 4
4444 · 4 • ·
V jiném provedení může oligonukleotid obsahovat další navázané skupiny, jako jsou peptidy (např. pro zaměření receptoru hostitelské buňky in vivo), nebo činidla usnadňující transport přes buněčné membrány (viz, např., Letsinger et al. (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. US. 86:6553-6556; Lemaitre et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:648-652; PCT Přihláška č. W088/09810) nebo hematoencephalickou bariéru (viz, např., PCT Přihláška č. W089/10134). Dále mohou být oligonukleotidy modifikovány hybridizací aktivovanými štěpícími činidly (viz např. Krol et al. (1988) Bio-Technik 6:958-976) nebo interkalačními činidly. (Viz, např., Zon (1988) Pharm. Res. 5:539-549). Tak může být oligonukleotid konjugován na jinou molekulu, (např. peptid, hybridizací aktivované zesíťovací činidlo, transportní činidlo nebo hybridizací aktivované štěpící činidlo).
II. Izolované PCIP proteiny a anti-PCIP protilátky
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká izolovaných PCIP proteinů a jejich biologicky aktivních částí, stejně jako polypeptidových fragmentů vhodných pro použití jako imunogeny pro indukci anti-PCIP protilátek. V jednom provedení mohou být přirozené PCIP proteiny izolované z buněk nebo tkání vhodným přečišťovacím schématem za použití standardních technik pro přečištění proteinů. V jiném provedení jsou PCIP proteiny produkovány rekombinantní DNA technikou. Alternativně k rekombinantní expresi může být PCIP protein nebo polypeptid syntetizován chemicky za použití standardních technik peptidové syntézy.
Izolovaný nebo přečištěný protein nebo jeho biologicky aktivní část je významně prostý buněčného materiálu nebo • · · · ·· · ·· · · ·· • · · ··· · · Λ * · · · · ··· « · · ca * ···♦ »·····«· · v-j · · · · · · ···· *··· · ·· ·· «· ·β jiných kontaminujících proteinů z buněk nebo tkáně, ze kterých je PCIP protein získán, nebo významně prostý chemických prekursorů nebo jiných chemických činidel, když je syntetizován chemicky. Výraz významně prostý buněčného materiálu označuje přípravky PCIP proteinu, ve kterých je protein separován od buněčných složek, ze kterých je izolovaný nebo rekombinantně produkovaný. V jednom provedení, výraz významně prostý buněčného materiálu označuje přípravky PCIP proteinu obsahující méně než přibližně 30% (podle suché hmotnosti) non-PCIP proteinu (který je zde také označován jako kontaminující protein), lépe méně než přibližně 20% non-PCIP proteinu, ještě výhodněji méně než přibližně 10% non-PCIP proteinu, a nejvýhodněji méně než přibližně 5% non-PCIP proteinu. Když je PCIP protein nebo jeho biologicky aktivní část produkován rekombinantně, tak je také výhodně významně prostý kultivačního media, t.j., kultivační medium tvoří méně než přibližně 20%, lépe méně než přibližně 10%, a nejlépe méně než přibližně 5% objemu proteinového přípravku.
Výraz významně prostý chemických prekursorů nebo jiných chemických činidel označuje přípravky PCIP proteinu, ve kterých je protein separován od chemických prekursorů nebo jiných chemických činidel, které se používají v syntéze proteinu. V jednom provedení výraz významně prostý chemických prekursorů nebo jiných chemických činidel označuje přípravky PCIP proteinu obsahující méně než přibližně 30% (podle suché hmotnosti) chemických prekursorů nebo non-PCIP chemických činidel, výhodněji méně než přibližně 20% chemických prekursorů nebo non-PCIP chemických činidel, ještě výhodněji méně než přibližně 10% chemických prekursorů nebo non-PCIP chemických činidel, a nej výhodněji méně než přibližně 5% chemických prekursorů nebo non-PCIP chemických činidel.
♦ · · • · · • · · • ···· ·· ··· · ♦ ··· * • · · · · • ··· · · 9
9 9 9 9 9 9
9 9 · · · 9
99 99
Termín biologicky aktivní část PCIP proteinu označuje fragment PCIP proteinu, který se podílí na interakci mezi PCIP molekulou a non-PCIP molekulou. Biologicky aktivní části PCIP proteinu zahrnují peptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci dostatečně identickou s nebo odvozenou od aminokyselinové sekvence PCIP protein, např. aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO:10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:16, SEQ ID
NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26,
SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34, SEQ ID
NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 51,
SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59, SEQ ID
NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 81,
SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:89, SEQ ID
NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 99,
SEQ ID NO:101, SEQ ID NO :103, nebo SEQ ID NO:109, která
obsahuje méně aminokyselin, než kompletní PCIP proteiny, a vykazuje alespoň jednu aktivitu PCIP proteinu. Obvykle biologicky aktivní části obsahují doménu nebo motiv s alespoň jednou aktivitou PCIP proteinu, např. vazbou na podjednotku draslíkového kanálu. Biologicky aktivní část PCIP proteinu může být polypeptid, který má, například, délku 10, 25, 50, 100, 200 nebo více aminokyselin. Biologicky aktivní části PCIP proteinů mohou být použity jako cílové molekuly při vývoji činidel, které modulují aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem.
V jednom provedení obsahuje biologicky aktivní část PCIP proteinu alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník.
Je třeba si uvědomit, že výhodné biologicky aktivní části PCIP proteinu podle předkládaného vynálezu obsahují alespoň jednu výše uvedenou strukturální doménu. Výhodnější biologicky ·· ···· ·♦ ·· » · · · • · ··» « • · · · · · · • · · · · · « ·· ·· • · ···· • » • · • · • · · • · aktivní části PCIP proteinu obsahují alespoň dvě z výše uvedených strukturálních domén. Dále, jiné biologicky aktivní části, ve kterých jsou deletovány další regiony proteinu, mohou být připraveny rekombinantními technikami a mohou být testovány na jednu nebo více funkčních aktivit přirozeného PCIP proteinu.
Ve výhodném provedení má PCIP protein aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24,
SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID
NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49,
SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID
NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78,
SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID
NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97,
SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, nebo SEQ ID
NO:109. V jiných provedení je PCIP protein významně homologní
se SEQ ID NO:2, SEQ : ED NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID
NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18,
SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID
NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36,
SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID
NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70,
SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID
NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91,
SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID
NO:101, SEQ ID NO:103, nebo SEQ ID NO:109, a zachovává si
funkční aktivity proteinu se SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID N0:16, SEQ ID N0:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, ··· ·
SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID
NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID
NO:7 8, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID
NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO :103 i, nebo SEQ ID
NO:109, i když se liší v aminokyselinové sekvenci v důsledku přirozené alelické variace nebo mutagenese, jak bylo podrobně popsáno v oddíle I, výše. V souladu s tím je - v jiném provedení - PCIP protein - který obsahuje aminokyselinovou sekvenci alespoň z přibližně 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% nebo více identickou se SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20,
SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID
NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38,
SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID
NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72,
SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID
NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93,
SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ
ID NOŮ 103, nebo SEQ : ID NO:109.
Izolované proteiny podle předkládaného vynálezu, výhodně lv, 9q, pl9, W28559, KChIP4a, KChIP4b, 33b07, lp, nebo 7s proteiny, mají aminokyselinovou sekvenci dostatečně identickou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID
NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24,
SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID
NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49,
SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID
NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78,
• «· · ·· 4 ·» ·· ··· 9 9 9 9 9 9
9 9 · 9 99 9 9 9 9
9999 9 9 99 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
SEQ ID N0:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID
NO:89, SEQ ID N0:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97,
SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, nebo SEQ ID NO:109
nebo jsou kódované nukleotidovou sekvencí dostatečně identickou
se SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 , SEQ ID
NO: 9, SEQ ID 1 NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17,
SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID
NO: 27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35,
SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID
NO: 48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56,
SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID
NO: 75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82,
SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID
NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NQ:100,
nebo SEQ ID NO:102. Termín dostatečně identický, jak je zde použít, označuje první aminokyselinovou nebo nukleotidovou sekvenci, která obsahuje dostatek nebo minimální počet identických nebo ekvivalentních (např. aminokyselinových zbytků s podobnými vedlejšími řetězci) aminokyselinových zbytků nebo nukleotidů ve srovnání ke druhé aminokyselinové nebo nukleotidové sekvenci tak, že první a druhá aminokyselinová nebo nukleotidová sekvence sdílejí společné strukturální domény nebo motivy a/nebo stejné funkční aktivity. Například, aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence, které sdílejí společné strukturální domény, mají alespoň 30%, 40%, nebo 50% identitu, výhodně 60% identitu, výhodněji 70%-80%, a ještě výhodněji 90-95% identitu v aminokyselinové sekvenci domén a obsahují alespoň jednu a výhodně dvě strukturální domény nebo motivy, jsou zde považovány za dostatečně identické. Dále, aminokyselinové nebo nukleotidové sekvence, které mají alespoň 30%, 40%, nebo 50%, výhodně 60%, výhodněji 70-80%, nebo 90-95% identitu a mají společné funkční aktivity, jsou zde považovány za dostatečně identické.
»* · • · 9 9
9 9 9 ··«« « · • 9 9
9999 9 • * · · **
V » · · · · * 999 9 9 9
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
99 99
Výhodnými proteiny jsou PCIP proteiny mající alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník a výhodně PCIP aktivitu. Jiné výhodné proteiny jsou PCIP proteiny mající alespoň jednu vazebnou doménu pro vápník, a jsou výhodně kódované molekulou nukleové kyseliny mající nukleotidovou sekvenci, která hybridizuje za přísných hybridizačních podmínek na molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:3 SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:11,
SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID
NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29,
SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID
NO:39, SEQ ID NO: 4 6, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50,
SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID
NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77,
SEQ ID NO-.79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID
NO:86, SEQ ID NO:8 8, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94,
SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:100, nebo SEQ ID NO:102.
Pro stanovení procenta identity dvou aminokyselinových sekvencí nebo dvou sekvencí nukleové kyseliny jsou sekvence seřazeny pro účely optimálního srovnání (např. mohou být do jednoho nebo obou řetězců první a druhé aminokyselinové nebo nukleokyselinové sekvence vloženy mezery pro optimální seřazení a non-homologní sekvence mohou být eliminovány pro účely srovnání). Ve výhodném provedení je délka referenční sekvence přiřazené při srovnávání alespoň 30%, výhodně alespoň 40%, výhodněji alespoň 50%, ještě výhodněji alespoň 60%, a nejvýhodněji alespoň 70%, 80%, nebo 90% délky referenční sekvence (např., když srovnáváme druhou sekvenci s PCIP aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID ··««
89 • * 9 • · · t 9 9 · • · • 9 • · • · 99 ·« « ·«« • · • · • 9 • ··♦ • • · 9 9 9 9 ·
NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 32,
SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID
NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 57,
SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID
NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87,
SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID
NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 >, nebo SEQ ID
NO:109 mající 177 aminokyselinových zbytků, tak se přiřazuje alespoň 80, výhodně alespoň 100, výhodněji alespoň 120, ještě výhodněji alespoň 140, a nejvýhodněji alespoň 150, 160 nebo 170 aminokyselinových zbytků). Potom se srovnávají aminokyselinové zbytky nebo nukleotidy v odpovídajících aminokyselinových pozicích nebo nukleotidových pozicích. Když je pozice v první sekvenci obsazena stejným aminokyselinovým zbytkem nebo nukleotidem jako pozice v odpovídajícím místě druhé sekvence, tak jsou molekuly v této pozici identické (termín „identita aminokyseliny nebo nukleové kyseliny je ekvivalentní termínu homologie” aminokyselin nebo nukleových kyselin). Procento identity mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu identických pozic sdílených sekvencemi, když se bere v úvahu počet mezer a délka každé mezery, které jsou nutné pro optimální přiřazení dvou sekvencí.
Srovnání sekvencí a stanovení procenta identity mezi dvěma sekvencemi může být provedeno za použití matematického algoritmu. Ve výhodném provedení je procento identity mezi dvěma aminokyselinovými sekvencemi určeno za použití algoritmu dle Needlemana a Wunscha (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), který je použit v GAP programu v GCG softwaru (který je dostupný na http://www.gcg.com), za použití buď Blosum 62 matrice, nebo PAM250 matrice, a váhy mezery 16, 14, 12, 10, 8, 6, nebo 4, a váhy pro délku 1, 2, 3, 4, 5, nebo 6. V ještě jiném výhodném provedení je procento identity mezi dvěma ·· ·· ·· ··«· • · · · · · • · ··· · · · »······ · » · · · ···· ·· ·· ·· »» programu v GCG ·· · • · · • · · • ···· • · ···· · nukleotidovými sekvencemi určeno za použití GAP softwaru (který je dostupný na http://www.gcg.com), za použití NWSgapdna.CMP matrice a váhy mezery 40, 50, 60, 70, nebo 80 a a váhy pro délku 1, 2, 3, 4, 5, nebo 6. V jiném provedení, je procento identitiy mezi dvěma aminokyselinovými nebo nukleotidovými sekvencemi určeno za použití algoritmu dle E. Meyerse a W. Millera (CABIOS, 4:11-17 (1989)), který je použit v ALIGN programu (verze 2.0 nebo 2.0U), za použití a PAM120 tabulky váhy zbytků, penále za délku mezery 12 a penále za mezeru 4.
Sekvence nukleové kyseliny a proteinu podle předkládaného vynálezu mohou být dále použity jako požadavková sekvence pro provádění vyhledávání ve veřejných databázích, například za účelem identifikování jiných členů rodiny nebo příbuzných sekvencí. Takové vyhledávání může být provedeno za použití NBLAST a XBLAST programů (verze 2.0) podle Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. BLAST nukleotidové vyhledávání může být provedeno s NBLAST programem, skóre =
100, délka slova = 12, za zisku nukleotidové sekvence homologní k PCIP molekule nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu. BLAST proteinové vyhledávání může být provedeno s XBLAST programem, skóre = 50, délka slova = 3, za zisku aminokyselinové sekvence homologní k PCIP proteinovým molekulám podle předkládaného vynálezu. Pro získání přiřazení s mezerami pro optimální srovnání může být použito Gapped BLAST, jak je popsáno v Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Při použití BLAST a Gapped BLAST programů mohou být použity chybové parametry příslušných programů (např. XBLAST a NBLAST). Viz http://www.ncbi.nlm.nih. gov.
Vynález také poskytuje PCIP chimérické nebo fúzní ······· · · · · · · · • · · · · · ···· • · · · « · · ·· ·· ·· proteiny. Termín PCIP chimérický protein nebo fúzní protein označuje PCIP polypeptid operativně navázaný na nonPCIP polypeptid. PCIP polypeptid označuje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající PCIP, zatímco non-PCIP polypeptid označuje polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající proteinu, který není významně homologní s PCIP proteinem, např. proteinu, který je odlišný od PCIP proteinu a který je získán ze stejného či jiného organismu. V PCIP fúzním proteinu může PCIP polypeptid odpovídat celému nebo části PCIP proteinu. Ve výhodném provedení obsahuje PCIP fúzní protein alespoň jednu biologicky aktivní část PCIP proteinu. V jiném výhodném provedení obsahuje PCIP fúzní protein alespoň dvě biologicky aktivní části PCIP proteinu.
Ve fúzním proteinu termín operativně navázaný označuje to, že PCIP polypeptid a non-PCIP polypeptid jsou fúzované ve čtecím rámci na sebe navzájem. Non-PCIP polypeptid může být fúzovaný na N-konec nebo C-konec PCIP polypeptidu.
Například, v jednom provedení je fúzní protein GST-PCIP fúzní protein, ve kterém je PCIP sekvence fúzován na C-konec GST sekvence. Takové fúzní proteiny mohou usnadňovat přečištění rekombinantních PCIP.
V jiném provedení je fúzní protein PCIP protein obsahující heterologní signální sekvenci na svém N-konci. V některých hostitelských buňkách (např. savčích hostitelských buňkách), může být exprese a/nebo sekrece PCIP zvýšena pomocí použití heterologní signální sekvence.
PCIP fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být inkorporovány do farmaceutických prostředků a mohou být podány jedincům in vivo. PCIP fúzní proteiny mohou být použity pro ovlivnění biologické dostupnosti PCIP substrátu. Použití PCIP
fúzních proteinů může být výhodné terapeuticky pro léčbu poruch asociovaných s draslíkovým kanálem, jako jsou onemocnění CNS, např., neurodegenerativní onemocnění, jako je Alzheimerova nemoc, demence související s Alzheimerovou nemocí (jako je Pickova nemoc), Parkinsonova a jiné nemoci spojené s difusními Lewyho tělísky, roztroušená sklerosa, amyotrofická laterální sklerosa, progresivní supranukleární obrna, epilepsie, spinocerebellární ataxie a Jakob-Creutzfieldtova nemoc; psychiatrická onemocnění, např. deprese, schizofrenní poruchy, Korsakoffova psychosa, mánie, úzkostné poruchy nebo fóbie; poruchy učení nebo paměti, např. amnesie nebo ztráta paměti související s věkem; a neurologická onemocnění; např. migréna. Použití PCIP fúzních proteinů může být také vhodné pro terapii poruch asociovaných s draslíkovým kanálem, jako jsou kardiovaskulární onemocnění, např.. arteriosklerosa, ischemické reperfusní poškození, restenosa, arteriální zánět, remodelování cévní stěny, remodelování komor, rychlý komorový rytmus, koronární mikroembolie, tachykardie, bradykardie, hypertense, aneurysma aorty, ligace koronární arterie, ischemická nemoc srdeční, fibrilace síní a městnavé srdeční selhání.
Dále, PCIP-fúzní proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity jako imunogeny pro produkci anti-PCIP protilátek u jedince, pro přečištění PCIP ligandu a ve skríningových testech pro identifikaci molekul, které inhibují interakce PCIP s PCIP substrátem.
Výhodně je PCIP chimérický nebo fúzní protein podle předkládaného vynálezu produkován standardní rekombinantní DNA technikou. Například se ligují DNA fragmenty kódující různé polypeptidové sekvence dohromady ve čtecím rámci za použití běžných technik, například za použití lepivých nebo tupých • · · · · ····· ···
QT · ···· ·· ·· ··· · .
* · · ···· · · · · • · · · · ·· ·· · · ·· konců pro ligaci, provede se trávení restrikčními enzymy pro získání vhodných konců, doplnění se lepivé konce podle potřeby, provede se zpracování alkalickou fosfatasou pro zabránění nežádoucímu spojování a provede se enzymatická ligace. V jiném provedení může být fúzní gen syntetizován za použití běžných technik, včetně automatizované DNA syntézy. Alternativně může být provedena PCR amplifikace genových fragmentů za použití kotvících primerů, které způsobují vznik komplementárních přesahů mezi dvěma sousedními genovými fragmenty, které mohou být potom tepelně zpracovány a reamplifikovány za zisku chimérické genové sekvence (viz například Current Protocols in Molecular Biology, eds.
Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Dále, existuje mnoho komerčně dostupných expresních vektorů, které již kódují fúzní skupinu (např. GST polypeptid). PCIP-kódující nukleové kyseliny mohou být klonovány do takových expresních vektorů tak, že fúzní je navázána ve čtecím rámci na PCIP protein.
Předkládaný vynález se také týká variant PCIP proteinů, které účinkují jako PCIP agonisté (mimetika) nebo jako PCIP antagonisté. Varianty PCIP proteinů mohou být připraveny mutagenesí, např. diskrétní bodovou mutací nebo zkrácením PCIP proteinu. Agonisté PCIP proteinů si mohou zachovávat v podstatě stejnou - nebo část - biologických aktivit přirozené formy PCIP proteinu. Antagonista PCIP proteinu může inhibovat jednu nebo více aktivit přirozené formy PCIP proteinu, například prostřednictvím kompetitivní modulace aktivit zprostředkovaných draslíkovým kanálem PCIP proteinu. Tak může být pomocí podání varianty s omezenou funkcí dosaženo specifických biologických účinků. V jednom provedení má léčba jednice variantou s limitovanými biologickými aktivitami přirozeného proteinu méně nežádoucích účinků u jedince než léčba přirozenou formou PCIP proteinu.
• ··· • ·
V jednom provedení mohou být varianty PCIP proteinu, které účinkují jako PCIP agonisté (mimetika) nebo PCIP antagonisté, identifikovány skríningem kombinatoriálních knihoven mutantů, například zkrácených mutantů, PCIP proteinu na agonistickou nebo antagonistou aktivitu vzhledem k PCIP proteinu. V jednom provedení se generuje rozsáhlá knihovna PCIP variant pomocí kombinatoriální mutagenese na úrovni nukleové kyseliny a tato knihovna je kódovaná rozsáhlou genovou knihovnou. Rozsáhlá knihovna PCIP variant může být produkována například enzymatickou ligací směsi syntetických oligonukleotidů do genové sekvence tak, že degenerovaná sada potenciálních PCIP sekvencí je exprimovatelná ve formě jednotlivých polypeptidů, nebo alternativně, jako sada větších fúzních proteinů (např. pro fágové zobrazení) obsahující sadu PCIP sekvencí. Existují různé metody, které mohou být použity pro produkci knihoven potenciálních PCIP variant z degenerované oligonukleotidové sekvence. Chemická syntéza degenerované genové sekvence může být provedena na automatizovaném DNA syntezátoru, a syntetický gen může být potom ligován do vhodného expresního vektoru. Použití degenerované sady genů umožňuje získat v jedné směsi všechny sekvence kódující požadovanou sadu potenciálních PCIP sekvencí. Způsoby pro syntézu degenerovaných oligonukleotidů jsou známé v oboru (viz např. Narang, S.A. (1983)
Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al.
(1983) Nucleic Acid Res. 11:477.
Dále, knihovny fragmentů PCIP protein kódujících sekvencí mohou být použity pro přípravu různorodé populace PCIP fragmentů pro skríning a následnou selekci variant PCIP proteinu. V jednom provedení může být knihovna fragmentů kódující sekvence připravena reakcí dvou-řetězcového PCR • · ·♦· · • · · ·· · φ • · · · · · · · · · · ···
QS · ···· · · · · · · · · · · · • · · · · · · · · fragmentu PCIP kódující sekvence s nukleasou za podmínek, při kterých dojde k nicking pouze přibližně jednou na molekulu, denaturací dvouřetězcové DNA, renaturací DNA za vzniku dvouřetězcové DNA, která může obsahovat kódující/protismyslné páry z různých nicked produktů, odstranění jednořetězcové části z reformovaných duplexů reakcí s Sl nukleasou, a ligaci získaných fragmentů knihovny do expresního vektoru. Tímto způsobem může být získána expresní knihovna, která kóduje Nterminální, C-terminální a vnitřní fragmenty různé velikosti z PCIP proteinu.
V oboru je známo několik technik pro skríning genových produktů kombinatoriálních knihoven vyrobených bodovými mutacemi nebo zkráceními, a pro skríning cDNA knihoven na genové produkty s vybranou vlastností. Takové techniky lze upravit pro rychlý skríning genových knihoven generovaných kombinatoriální mutagenesí PCIP proteinů. Nejvíce používané techniky, které jsou vhodné pro vysoce účinnou analýzu, pro skríning velkých genových knihoven, typicky zahrnují klonování genové knihovny do replikovatelných expresních vektorů, transformování vhodných buněk získanou knihovnou vektorů, a exprimování kombinatoriálních genů za podmínek, při kterých detekce požadované aktivity usnadňuje izolaci vektoru kódujícího gen, jehož produkt byl detekován. Recrusive ensemble mutagenese (REM)z a nová technika, která zvyšuje frekvenci funkčních mutantů v knihovně, může být použita v • kombinaci se skríningovými testy pro identifikaci PCIP variant (Arkin a Yourvan (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:78117815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327331) .
V jednom provedení mohou být buněčné testy použity pro analýzu rozsáhlé PCIP knihovny. Například může být knihovna • 9 • 99 • ♦· ·· expresních vektorů transfektována do buněčné linie, která projevuje aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem. Efekt PCIP mutantu na aktivitu zprostředkovanou draslíkovým kanálem může být detekován, např., jakýmkoliv z enzymatických testů nebo detekováním uvolňování neurotransmiteru. Plasmidová DNA může být potom získána z buněk, které vykazují inhibici, nebo alternativně potenciaci, aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem, a jednotlivé klony mohou být dále charakterizovány.
Izolovaný PCIP protein, nebo jeho část nebo fragment, může být použit jako imunogen pro indukci protilátek, které se váží na PCIP, za použití standardních technik pro přípravu polyklonálních a monoklonálních protilátek. Může být použit kompletní PCIP protein, nebo alternativně vynález poskytuje antigenní peptidové fragmenty PCIP pro použití jako imunogeny. Antigenní peptid PCIP obsahuje alespoň 8 aminokyselinových zbytků aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID
NO: 22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30,
SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID
NO: 40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55,
SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID
NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85,
SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:8 9, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID
NO: 95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID
NO:103, nebo SEQ ID NO:109 a zahrnuje takový epitop PCIP, že protilátka namířená proti peptidu tvoří specifický imunitní komplex s PCIP. Výhodně antigenní peptid obsahuje alespoň 10 aminokyselinových zbytků, výhodněji alespoň 15 aminokyselinových zbytků, ještě výhodněji alespoň 20 aminokyselinových zbytků, a nejvýhodněji alespoň 30 aminokyselinových zbytků.
• · · * • · · ·
» 9 · · *· ····
Výhodnými epitopy obsaženými v antigenních peptidech jsou regiony PCIP, které jsou lokalizované na povrchu proteinu, např. hydrofilní regiony, stejně jako regiony s vysokou antigenicitou.
PCIP imunogen je typicky použit pro přípravu protilátky imunizací vhodného jedince (např. králíka, kozy, myši nebo jiného savce) imunogenem. Vhodný imunogenní přípravek může obsahovat, například, rekombinantně exprimovaný PCIP protein nebo chemicky syntetizovaný PCIP polypeptid. Přípravek může dále obsahovat adjuvans, jako je Freundovo kompletní nebo nekompletní adjuvans, nebo podobné imunostimulační činidlo. Imunizace vhodného jedince imunogenním PCIP přípravkem indukuje tvorbu polyklonálních anti-PCIP protilátek.
V souladu s tím se jiný aspekt předkládaného vynálezu týká anti-PCIP protilátek. Termám protilátka, jak je zde použit, označuje imunoglobulinovou molekulu a její imunologicky aktivní část, t.j. molekuly, které si zachovávají vazebné místo pro antigen, které se specificky váže na (imunoreaguje s) antigenem, jako je PCIP. Příklady imunologicky aktivních částí imunoglobulinových molekul jsou F(ab) a F(ab')2 fragmenty, které mohou být generovány zpracováním protilátky enzymem, jako je pepsin. Vynález poskytuje polyklonální a monoklonální protilátky, které se váží na PCIP. Termín monoklonální protilátka nebo přípravek monoklonální protilátky, jak je zde použit, označuje populaci protilátkových molekul, které obsahují pouze jeden druh vazebného místa pro antigen schopného imunoreagovat s určitým epitopem PCIP. Přípravek monoklonální protilátky tak typicky má jedinou vazebnou afinitu pro určitý PCIP protein, se kterým imunoreaguje.
• · • · • · · · ······· · · ··· * · • · ···· · · · · • · · · · ·· ·· · · ··
Polyklonální anti-PCIP protilátky mohou být připraveny způsobem popsaným výše imunizací vhodného jedince PCIP imunogenem. Titr ánti-PCIP protilátky u imunizovaného jedince může být sledován v čase za použití standardních technik, jako je enzymový imunosorbentní test (ELISA) za použití imobilizovaného PCIP. Pokud je to žádoucí, mohou být protilátkové molekuly namířené proti PCIP izolovány od savce (např. z krve) a mohou být dále přečištěny za použití dobře známých technik, jako je protein A chromatografie, za zisku IgG frakce. Za vhodnou dobu po imunizaci, např. tehdy, když jsou titry anti-PCIP protilátek nejvyšší, mohou být buňky produkující protilátky získány od jedince a mohou být použity pro přípravu monoklonální protilátky za použití standardních technik, jako je hybridomová technika původně popsaná v Kohler and Milstein (1975) Nátuře 256:495-497) (viz též, Brown et al. (1981) J. Imunol. 127:539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem .255:4980-83; Yeh et al. (1976) Proč. Nati. Acad. Sci.
USA 76:2927-31; a Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), novější lidská B lymfocytární hybridomová technika (Kozbor et al. (1983) Imunol. Today 4:72), EBV-hybrídomová technika (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., pp. 77-96) nebo triomová technika. Technologie pro produkci hybridomů pro monoklonální protilátky je dobře známá (obecně viz H. Kenneth, v Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenům Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet.
3:231-36). Stručně řečeno, imortalizovaná buněčná linie (obvykle myelomová) se fúzuje na lymfocyty (obvykle splenocyty) od savců imunizovaných PCIP imunogenem způsobem popsaným výše, a supernatanty získaných hybridomových buněk se testují za účelem identifikace hybridomů.
Jakýkoliv z mnoha známých protokolů používaných pro fúzování lymfocyců a imortalizovaných buněčných linií může být použit pro generování anti-PCIP monoklonální protilátky (viz, např., G. Galfre et al. (1977) Nátuře 256:55052; Gefter et al.
Somatic Cell Genet., citovaný výše; Lerner, Yale J. Biol.
Med., citovaný výše; Kenneth, Monoclonal ANtibodies, citováno výše). Kromě toho bude odborníkům v oboru jasné, že mohou být použity různé variace uvedených metod. Obvykle je imortalizovaná buněčná linie (např. myelomová buněčná linie) získána od stejného savčího druhu jako lymfocyty. Například, myší hybridomy mohou být připraveny fúzováním lymfocytů z myší imunizovaných imunogenním přípravkem podle předkládaného vynálezu s imortalizovanou myší buněčnou linií. Výhodnou imortalizovanou buněčnou linií je myší myelomová buněčná linie, která je sensitivní na kultivační medium obsahující hypoxanthin, aminopterin a thymidin (HAT medium).Jakákoliv z mnoha myelomových buněčných linií může být použita jako fúzní partner při použití standardních technik, např. P3-NSl/l-Ag41, P3-x63-Ag8.653 nebo Sp2/O-Agl4 myelomová linie. Tyto myelomové linie jsou dostupné v ATCC. Obvykle jsou HATsensitivní myší myelomové buňky fúzovány na myší splenocyty za použití polyethylenglykolu (PEG). Hybridomové buňky vzniklé fúzí se potom selektují za použití HAT media, které usmrcuje nefúzované a neproduktivně fúzované myelomové buňky (nefúzované splenocyty umírají po několika dnech, protože nejsou transformovány). Hybridomové buňky produkující monoklonální protilátku podle předkládaného vynálezu se detekují skríningem supernatantů hybridomové kultury na protilátky, které se váží na PCIP, např. za použití standardních ELISA testů.
Alternativně k přípravě hybridomů secernujicích • · • ·
100 • · · · · · · · · • · · · ···· · 9 9
9999 99 99 999 · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 « · · · · · · · · monoklonální protilátky mohou být monoklonální anti-PCIP protilátky identifikovány a izolovány skriningem rekombinantní kombinatoriální knihovny imunoglobulinů (např. protilátkové fágové zobrazovací knihovny) za použití PCIP pro izolování členů imunoglobulinové knihovny, které se váží na PCIP. Kity pro generování a skríning fágových zobrazovacích knihoven jsou komerčně dostupné (např. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, katalogové č. 27-9400-01; a Stratagene SurfZAP™ Phage Display Kit, katalogové č. 240612). Dále, příklady metod a činidel vhodných pro použití v generování a skríningu protilátkových zobrazovacích knihoven jsou uvedeny například v Ladner et al. U.S. Patent č. 5,223,409; Kang et al. PCT mezinárodní přihláška č. WO 92/18619; Dower et al. PCT mezinárodní přihláška č. WO 91/17271; Winter et al. PCT mezinárodní přihláška WO 92/20791; Markland et al. PCT mezinárodní přihláška č. WO 92/15679; Breitling et al. PCT mezinárodní přihláška WO 93/01288; McCafferty et al. PCT mezinárodní přihláška č. WO 92/01047; Garrard et al. PCT mezinárodní přihláška č. WO 92/09690; Ladner et al. PCT mezinárodní přihláška č. WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al.
(1992) J. Mol. Biol. 226:889-896; Clarkson et al. (1991)
Nátuře 352:624-628; Gram et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:13731377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; a McCafferty et al. Nátuře (1990) 348:552-554.
Dále, rekombinantní anti-PCIP protilátky, jako jsou chimérické a humanizované monoklonální protilátky, obsahující jak lidskou, tak non-lidskou část, které mohou být připraveny • · • ·
101 • · · · · · · · · · · ······· · · ··· · · • · · · · · ···· ··· · ·· ·· · · · · za použití standardních rekombinantní DNA technik, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Takové chimérické a humanizované monoklonální protilátky mohou být připraveny rekombinantními DNA technikami známými v oboru, například za použití způsobů popsaných v Robinson et al., mezinárodní přihláška č. PCT/US86/02269; Akira, et al., evropská patentová přihláška 184,187; Taniguchi, M., evropská patentová přihláška 171,496; Morrison et al., evropská patentová přihláška 173,494; Neuberger et al., PCT mezinárodní přihláška č. WO 86/01533; Cabilly et al. U.S. patent č. 4,816,567; Cabilly et al., evropská patentová přihláška 125,023; Better et al.
(1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Imunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005;
Wood et al. (1985) Nátuře 314:446-449; a Shaw et al. (1988) J.
Nati. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechnik 4:214; Winter, U.S. patent 5,225,539; Jones et al. (1986) Nátuře
321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; a Beidler et al. (1988) J. Imunol. 141:4053-4060.
Anti-PCIP protilátka (např. monoklonální protilátka) může být použita pro izolování PCIP pomocí standardních technik, jako je afinitní chromatografie nebo imunoprecipitace. AntiPCIP protilátka může usnadnit přečištění přirozených PCIP z buněk nebo rekombinantně produkovaných PCIP exprimovaných v hostitelských buňkách. Dále, anti-PCIP protilátka může být použita pro detekci PCIP proteinu (např. v buněčném lyzátu nebo buněčném supernatantu) pro hodnocení úrovně a charakteru exprese PCIP proteinu. Anti-PCIP protilátka může být použita diagnosticky pro sledování koncentrace proteinu ve tkáních při klinickém testování, např. pro stanovení účinnosti dané léčby.
• · · · · · · • · · ··· · · · • · · · ···· · · ·
1Π9 ··········«·· · · · ···· ···· • · · · · ·· · · · · ··
Detekce může být usnadněna navázáním (t.j. fyzikálním navázáním) protilátky na detekovatelnou substanci. Příklady detekovatelných substancí jsou různé enzymy, protetické skupiny, fluorescentní materiály, luminescentní materiály, bioluminescentní materiály a radioaktivní materiály. Příklady vhodných enzymů jsou křenová peroxidasa, alkalická fosfatasa, -galactosidasa nebo acetylcholinesterasa; příklady vhodných protetických skupin jsou komplexy streptavidin/biotin a avidin/biotin; příklady vhodných fluorescentních materiálů jsou umbelliferon, fluorescein, fluorescein isothiokyanatan, rhodamin, dichlortriazinylaminový fluorescein, dansylchlorid nebo fycoerythrin; příkladem luminescentního materiálu je luminol; příkladem bioluminescentní materiálu je luciferasa, luciferin a aequorin, a příkladem vhodného radioaktivního materiálu je 125I, 131I, 35S nebo 3H.
III. Rekombinantní expresní vektory a hostitelské buňky
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká vektorů, výhodně expresních vektorů, obsahujících nukleové kyseliny kódující PCIP protein (nebo jeho části). Termín vektor, jak je zde použit, označuje molekulu nukleové kyseliny schopnou transportovat jiné nukleové kyseliny, které jsou na ní navázané. Jedním typem vektoru je plasmid, což je cirkulární dvouřetězcová DNA smyčka, do které mohou být ligovány další DNA segmenty. Jiným typem vektoru je virový vektor, kde další DNA segmenty mohou být ligovány do virového genomu. Některé vektory jsou schopné autonomní replikace v hostitelské buňce, do které jsou vloženy (např. bakteriální vektory obsahující bakteriální sekvenci rozpoznávající počátek replikace a episomální savčí vektory). Jiné vektory (např. non-episomální savčí vektory) jsou integrovány do genomu hostitelské buňky po vložení do hostitelské buňky, a proto jsou replikovány • · · 4 4 4 4 ······ • · · 4 4 4 «« 4 •44 4 4444 4 4 4
1Λ0 4444444444444 4
J· Vw/ φ φ 4444 4444 • 444 4 44 «4 44 44 společně s genomem hostitelské buňky. Dále, některé vektory mohou řídit expresi genů, na které jsou operativně navázané. Takové vektory jsou zde označovány jako expresní vektory. Obecně, expresní vektory použitelné v technikách rekombinantní DNA jsou často ve formě plasmidů. V předkládaném vynálezu jsou termíny plasmid a vektor zaměnitelné, protože plasmid je nej častěji používanou formou vektoru. Nicméně, vynález zahrnuje i další formy expresních vektorů, jako jsou virové vektory (např., replikace defektní retroviry, adenoviry a adeno-asociované viry), které mají ekvivalentní funkce.
Rekombinantní expresní vektory podle předkládaného vynálezu obsahují nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu ve formě vhodné pro expresi nukleové kyseliny v hostitelské buňce, což znamená, že rekombinantní expresní vektory obsahují jednu nebo více regulačních sekvencí, vybraných podle hostitelské buňky použité pro expresi, které jsou operativně navázané na sekvenci nukleové kyseliny, která má být exprimována. V rekombinantním expresním vektoru termín operativně navázaný znamená, že daná nukleotidová sekvence je navázaná na regulační sekvenci způsobem, který umožňuje expresi nukleotidové sekvence (např. v in vitro transkripčním/translačním systému nebo v hostitelské buňce, když je vektor vložen do hostitelské buňky). Termín regulační sekvence označuje promotory, zesilovače transkripce a ji elementy řídící expresi (např., polyadenylační signály).
Takové regulační sekvence jsou popsány například v Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185,
Academie Press, San Diego, CA (1990). Mezi regulační sekvence patří ty sekvence, které řídí konstitutivní expresi nukleotidové sekvence v mnoha typech hostitelských buněk a ty sekvence, které řídí expresi nukleotidové sekvence pouze v některých typech hostitelských buněk (např. tkáňově specifické • ·
ΦΦΦ · φφφφ · · ·
ΦΦΦΦΦΦΦ Φ Φ · Φ Φ Φ · • φ ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ
ΦΦΦΦ Φ ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ • · φφφφ
104 regulační sekvence). Odborníkům v oboru bude jasné, že složení expresního vektoru může záviset na faktorech jako je volba hostitelské buňky, která má být transformována, požadovaná úroveň exprese proteinu, a podobně. Expresní vektory podle předkládaného vynálezu mohou být vloženy do hostitelské buňky pro produkci proteinů nebo peptidů, včetně fúzních proteinů nebo peptidů, kódovaných nukleovou kyselinou, jak je zde popsána (např. PCIP proteiny, mutantní formy PCIP proteinů, fúzní proteiny, a podobně).
Rekombinantní expresní vektory podle předkládaného vynálezu mohou být navrženy pro expresi PCIP proteinů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Například, PCIP proteiny mohou být exprimovány v bakteriálních buňkách, jako je E. coli, hmyzích buňkách (za použití baculovirových expresních vektorů), kvasinkách nebo savčích buňkách. Vhodné hostitelské buňky jsou podrobněji popsány v Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, CA (1990). Alternativně může být rekombinantní expresní vektor transkribován a translatován in vitro, například za použití T7 promotorové regulační sekvence a T7 polymerasy.
Exprese proteinů v prokaryotech je nej častěji provedena v E. coli za použití vektorů obsahujících konstitutivní nebo indukovatelné promotory řídící expresi fúzních nebo nonfúzních proteinů. Fúzní vektory přidávají určitý počet aminokyselin ke kódovanému proteinu, obvykle na amino konci rekombinantního proteinu. Takové fúzní vektory obvykle slouží pro tři účely: 1) zvýšení exprese rekombinantního proteinu; 2) zvýšení solubility rekombinantního proteinu; a 3) pro usnadnění přečištění rekombinantního proteinu tím, že působí jako ligand při afinitním přečištění. Často je ve fúzních
• φ · φ * • · · · · ♦ φ • · φ · · · φ φ · · φ φ φ φ « φ · · φφφ φ · • · φ « φ · φ · φ • «φ φφ φφ φφ expresních vektorech vloženo do místa spojení fúzní skupiny a rekombinantního proteinu proteolytické štěpící místo, které usnadňuje separaci rekombinantního proteinu od fúzní skupiny po přečištění fúzního proteinu. Mezi takové enzymy, a jejich příslušné rozpoznávací sekvence, patří faktor Xa, thrombin a enterokinasa. Typickými fúzními expresními vektory jsou pGEX (Pharmacia Biotech lne; Smith, D.B. a Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) a pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), které fúzují glutathion Stransferasu (GST), vazebný protein pro maltosu E nebo protein A, v příslušném pořadí, na cílový rekombinantní protein.
Přečištěné fúzní proteiny mohou být použity v testech na PCIP aktivitu (např., přímých testech nebo kompetitivních testech podrobněji popsaných dále), nebo pro generování protilátek specifických pro PCIP proteiny. Ve výhodném provedení je PCIP fúzní protein exprimovaný v retrovirovém expresním vektoru podle předkládaného vynálezu použit pro infikování buněk kostní dřeně, které se potom transplantují ozářeným příjemcům. Po dostatečně dlouhé době se potom vyšetřuje patologie u příjemce (například po šesti týdnech).
Příklady vhodných indukovatelných non-fúzních E. coli expresních vektorů jsou pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) a pET lid (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, California (1990) 60-89). Exprese cílového genu z pTrc vektoru závisí na transkripci RNA polymerasy v hostiteli z hybridního trp-lac fúzního promotoru. Exprese cílového genu z pET lid vektoru závisí na transkripci z T7 gnlO-lac fúzního promotoru zprostředkované koexprimovanou virovou RNA polymerasou (T7 gnl). Tato virová polymerasa je dodána hostitelským kmenem BL21(DE3) nebo HMS174(DE3) z rezidentního • · · • · · · • · · · • · · • ·
106 profágu nesoucího T7 gnl gen pod transkripční kontrolou lacUV promotoru.
Jednou strategií pro maximalizaci exprese rekombinantního proteinu v E. coli je exprimování proteinu v hostitelské bakterii s narušenou kapacitou pro proteolytické štěpení rekombinantního proteinu (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press, San Diego, California (1990) 119-128). Jinou strategií je pozměnění sekvence nukleové kyseliny, která má být insertována do expresního vektoru tak, aby jednotlivé kodony pro každou aminokyselinu byly ty kodony, které jsou přednostně používány v E. coli (Wada et al., (1992) Nukleové kyseliny Res. 20:21112118). Takové alterace sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být provedeny za použití standardních technik DNA syntézy.
V jiném provedení je PCIP expresní vektor kvasinkový expresní vektor. Příklady vektorů pro expresi v kvasince S. cerevisae jsou pYepSecl (Baldari, et al., (1987) Embo J.
6:229-234), pMFa (Kurjan a Herskowitz, (1982) Cell 30:933943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA), a picZ (InVitrogen Corp, San Diego, CA).
Alternativně mohou být PCIP proteiny exprimovány ve hmyzích buňkách za použití baculovirových expresních vektorů. Mezi baculovirové vektory vhodné pro expresi proteinů v kultivovaných hmyzích buňkách (např., Sf 9 buňkách) patří pAc série (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) a pVL série (Lucklow a Summers (1989) Virology 170:31-39).
V ještě jiném provedení jsou nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu exprimovány v savčích buňkách za • · · • ·
107 • · · · · · · · • · · · · ··· ·· · *··♦··· ·· · · · · « • · · · « · · · · · ·· · · · · » · * ·· «· použití savčích expresních vektorů. Příklady savčích expresních vektorů jsou pCDM8 (Seed, B. (1987) Nátuře 329:840) a pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Při použití v savčích buňkách jsou řídící funkce pro expresní vektor často dodány virovými regulačními elementy. Například, běžně používané promotory jsou odvozeny od polyomaviru, Adenoviru 2, cytomegaloviru a Simian Viru 40. Pro popis dalších vhodných expresních systémů pro prokaryotické a eukaryotické buňky viz kapitoly 16 a 17 v Sambrook, J.,
Fritsh, E. F., a Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
V jiném provedení je rekombinantní savčí expresní vektor schopen řídit expresi nukleové kyseliny přednostně v určitých typech buněk (např. jsou pro expresi nukleové kyseliny použity tkáňově specifické regulační elementy). Tkáňově specifické regulační elementy jsou v oboru známé. Příklady tkáňově specifických promotorů jsou albuminový promotor (specifický pro játra; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotory specifické pro lymfoidní tkáně (Calame a Eaton (1988) Adv. Imunol. 43:235-275), konkrétně promotory T lymfocytárních receptorů (Winoto a Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) a imunoglobulinů (Banerji et al. (1983) Cell
33:729-740; Queen a Baltimore (1983) Cell 33:741-748), neuronspecifické promotory (např., neurofilamentární promotor; Byrne a Ruddle (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotory specifické pro slinivku břišní (Edlund et al. (1985)
Science 230:912-916), a promotory specifické pro mléčnou žlázu (např. syrovátkový promotor; U.S. Patent č. 4,873,316 a
Evropská patentová přihláška č. 264,166). Vynález také zahrnuje použití vývojově regulovaných promotorů, například myších hox promotorů (Kessel a Gruss (1990) Science 249:374108 ·» · · « · « · · » * 9 999 9 9 9
9 9 9 · · 9 9 9 • · · 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9
379) a α-fetoproteinového promotoru (Campes a Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
Vynález dále poskytuje rekombinantní expresní vektor obsahující DNA molekulu podle předkládaného vynálezu klonovanou do expresního vektoru v protismyslné orientaci. To znamená, že DNA molekula je operativně navázaná na regulační sekvenci způsobem, který umožňuje expresi (transkripcí DNA molekuly) RNA molekuly, která je protismyslná k PCIP mRNA. Regulační sekvence operativně navázaná na nukleovou kyselinu klonovanou v protismyslné orientaci může být vybrána tak, aby řídila kontinuální expresi protismyslné RNA molekuly v různých typech buněk, jak je tomu například u virových promotorů a/nebo zesilovačů transkripce, nebo může být regulační sekvence vybrána tak, aby řídila konstitutivní, tkáňově specifickou nebo buněčně specifickou expresi protismyslné RNA. Protismyslný expresní vektor může být ve formě rekombinantního plasmidu, fágemidu nebo oslabeného viru, ve kterých je protismyslná nukleová kyselina produkována pod kontrolou vysoce účinného regulačního regionu, jehož aktivita může být určena typem buněk, do kterých je vektor vložen. Pro popis regulace genové exprese za použití protismyslných genů viz Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1)
1986.
Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká hostitelské buňky, do které je rekombinantní expresní vektor podle předkládaného vynálezu zaveden. Termíny hostitelské buňky a rekombinantní hostitelské buňky jsou zaměnitelné. Je třeba si uvědomit, že tyto termíny neoznačují pouze určité konkrétní buňky, ale také potomstvo nebo potenciální potomstvo těcHfc buněk. V důsledku modifikací, ke kterým může dojít v • · 4 44 4 4 • 4 · 444 4 4 ·
444 4 4444 4 4 4
44*4 44 44 4 4 4 4 4
4 4444 4444
4444 4 44 «4 44 «4
44 4
109 následných generacích v důsledku mutací nebo vlivů prostředí, nemusí být takové potomstvo identické s původními buňkami, ale spadá do rozsahu vynálezu.
Hostitelská buňka může být jakákoliv prokaryotická nebo eukaryotická buňka. Například může být PCIP protein exprimován v bakteriálních buňkách, jako je E. coli, hmyzích buňkách, kvasinkách nebo savčích buňkách (jako jsou ovariální buňky čínského křečka (CHO) nebo COS buňky). Další vhodné hostitelské buňky jsou známé odborníkům v oboru.
Vektorová DNA může být vložena do prokaryotické nebo eukaryotické buňky běžnou transformační nebo transfekční technikou. Termíny transformace a transfekce označují různé v oboru známé techniky prp vkládání cizorodé nukleové kyseliny (např. DNA) do hostitelské buňky, včetně koprecipitace fosforečnanem vápenatým nebo chloridem vápenatým, DEAE-dextranem-zprostředkované transfekce, lipofekce nebo elektroporace. Vhodné způsoby pro transformování nebo transfektování hostitelské buňky jsou uvedeny v Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), a v jiných laboratorních manuálech.
O stabilní transfekci savčích buněk je známo, že v závislosti na expresním vektoru a transfekční technice může pouze malá frakce buněk integrovat cizorodou DNA do svého genomu. Pro identifikaci a selekci těchto integrantů se obvykle gen kódující selektovatelný markér (např. gen pro resistenci na antibiotika) vkládá do hostitelské buňky společně s požadovaným genem. Mezi výhodné selektovatelné markéry patří geny udílející resistenci na léky, jako je G418, ·· ··· · ·· « ·« ·· • · · ··« · · · ··· · · · · · · · ·
I Λ ♦·♦·♦«···♦«·♦ · liU · · ·····♦·» «·· · · ·· ·· ·· ·· /
hygromycin a methotrexat. Nukleová kyselina kódující selektovatelný markér může být vložena do hostitelské buňky na stejném vektoru, jako je vektor kódující PCIP protein, nebo může být vložena na samostatném vektoru. Buňky stabilně transfektované vloženou nukleovou kyselinou mohou být identifikovány lékovou selekcí (např. buňky, které mají inkorporovaný selektovatelný markér, budou přežívat, zatímco jiné buňky nebudou).
Hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu, jako jsou prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky v kultuře, mohou být použity k produkci (t.j., expresi) PCIP proteinu. V souladu s tím vynález dále poskytuje způsoby pro produkci PCIP proteinu za použití hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu. V jednom provedení způsob zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu (do které byl vložen rekombinantní expresní vektor kódující PCIP protein) ve vhodném mediu tak, že je produkován PCIP protein. V jiném provedení způsob dále zahrnuje izolování PCIP proteinu z media nebo hostitelské buňky.
Hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro produkci non-lidských transgenních zvířat. Například, v jednom provedení je hostitelskou buňkou podle předkládaného vynálezu fertilizovaný oocyt nebo embryonální kmenová buňka, do které byla vložena PCIP-kódující sekvence. Takové hostitelské buňky mohou být potom použity pro vytvoření non-lidských transgenních zvířat, do jejichž genomu je vložena exogenní PCIP sekvence, nebo homologních rekombinantních zvířat, ve kterých byla endogenní PCIP sekvence pozměněna. Taková zvířata jsou užitečná pro studium funkce a/nebo aktivity PCIP a pro identifikaci a/nebo hodnocení modulátorů PCIP aktivity. Termín transgenní zvíře označuje non-lidského • · ·*· · ·· · ·* ··
9 9 9 9 · · · 9
999 99 999 9 9 9
111 9 9999 9 9 9 9 9 9 ♦ « ·
1 X 9 9 9 99 9 9 99 9
9 9 9 9 9 99 9 9 9 9 živočicha, výhodně savce, nejvýhodněji hlodavce, jako je krysa nebo myš, kde jedna nebo více buněk zvířete obsahuje transgen. Dalšími příklady transgenních zvířat jsou primáti, ovce, psi, krávy, kozy, kuřata, obojživelníci a podobně. Transgen je exogenní DNA, která je integrována do genomu buňky, ze které se vyvíjí transgenní zvíře a která zůstává v genomu dospělého zvířete, řídí expresi kódovaného genového produktu v jednom nebo více typech buněk nebo tkání transgenního zvířete. Termín homologní rekombinantní zvíře označuje non-lidského živočicha, výhodně savce, výhodněji myš, ve kterém byl endogenní PCIP gen pozměněn homologní rekombinaci mezi endogenním genem a exogenní DNA molekulou vloženou do buňky zvířete, například do embryonální buňky zvířete, před vývojem zvířete.
Transgenní zvíře podle předkládaného vynálezu může být vytvořeno vložením PCIP-kódující nukleové kyseliny do samčího pronukleu fertilizovaného oocytu, např. mikroinjekcí, retrovirovou infekcí, a vývojem oocytu v pseudogravidní samici. PCIP cDNA sekvence SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID
N0:5, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID
NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID
NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52,
SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO: 69, SEQ ID
NO: 71, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79,
SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID
NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96,
SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:100, nebo : SEQ ID NO:102 může být
vložena jako transgen do genomu non-lidského živočicha.
Alternativně může být jako transgen použit non-lidský homolog lidského PCIP genu, jako je myší nebo krysí PCIP gen.
Alternativně může být homolog PCIP genu, jako je jiný člen
PCIP rodiny, izolován pomocí hybridizace na PCIP cDNA sekvenci
SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID
N0:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17,
SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102 nebo DNA insert plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939,
98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948,
98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994 (jak je popsáno
v oddíle I, výše) a může být použit jako transgen. Intronové sekvence a polyadenylační signály mohou být také obsaženy v transgenu pro zvýšení účinnosti exprese transgenu. Tkáňově specifické regulační sekvence mohou být operativně navázané na PCIP transgen pro řízení exprese PCIP proteinu v určitých buňkách. Způsoby pro přípravu transgenních zvířat pomocí manipulace s embryi a mikroinjekce, zejména u zvířat jako jsou myši, jsou v oboru běžné a jsou popsány například v U.S. patentech č. 4736866 a 4870009, Leder et al., U.S. patentu č. 4873191, Wagner et al. a v Hogan, B., Manipulating Mouše Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Podobné způsoby se používají pro produkci jiných transgenních zvířat. Transgenní potomstvo může být identifikováno podle přítomnosti PCIP transgenu a jeho genomu a/nebo exprese PCIP mRNA ve tkáních nebo buňkách zvířete. Transgenní potomstvo může být potom použito pro křížení s dalšími zvířaty nesoucími transgen. Dále, transgenní zvířata
• 9
9 9 «9 9999
113 • 9 9 9 • 9 9 · 9 9 9 • ··
nesoucí transgen kódující PCIP protein mohou být dále křížena s jinými transgenními zvířaty nesoucími jiné transgeny.
Pro přípravu homologního rekombinantního zvířete je připraven vektor, který obsahuje alespoň část PCIP genu, do kterého byly vloženy delece, adice nebo substituce za účelem pozměnění, např. funkčního narušení, PCIP genu. PCIP genem může být lidský gen (např. cDNA SEQ ID NO:1), ale výhodněji je jím non-lidský homolog lidského PCIP genu (např., cDNA SEQ ID NO:3 nebo 5). Například myší PCIP gen může být použit pro konstrukci homologního rekombinantního vektoru vhodného pro pozměnění endogenního PCIP genu v myším genomu. Ve výhodném provedení je vektor navržen tak, aby při homologní rekombinací, byl endogenní PCIP gen funkčně narušen (t.j., nadále nekódoval funkční protein; což se také označuje jako knock out vektor). Alternativně může být vektor navržen tak, aby byl při homologní rekombinací endogenní PCIP gen mutován nebo jinak pozměněn, ale stále ještě aby kódoval funkční protein (např., předcházející regulační region může být pozměněn tak, že je pozměněna exprese endogenního PCIP proteinu). V homoíogním rekombinantním vektoru je pozměněná část PCIP genu obklopena 5' a 3' konci další nukleové kyseliny sekvence PCIP genu, čímž je umožněna homologní rekombinace mezi exogenním PCIP genem na vektoru a endogenním PCIP genem v embryonální kmenové buňce. Další sousední sekvence PCIP nukleové kyseliny je dostatečně dlouhá pro úspěšnou homologní rekombinací s endogenním genem. Typicky je několik kilobází sousední DNA (jak na 5', tak na 3' konci) obsaženo ve vektoru (viz např., Thomas, K.R. a Capecchi, M. R. (1987) Cell 51:503, kde je uveden popis vektorů pro homologní rekombinací). Vektor je vložen do embryonální kmenové buněčné linie (např.
elektroporací) a buňky, ve kterých vložený PCIP gen homologně rekombinoval s endogenním PCIP genem, se selektují (viz např.
* • · •a ····
114
4 4 • 4 4
Li, E. et al. (1992) Cell 69:915). Selektované buňky se potom injikují do blastocyst zvířete (např. myši) za zisku agregační chiméry (viz např., Bradley, A. v Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987) str. 113-152). Chimérické embryo může být potom implantováno do vhodné pseudogravidní samice a embryo může být donošeno. Potomstvo nesoucí homologně rekombinovanou DNA ve svých zárodečných buňkách může být použito pro křížení se zvířaty, jejichž všechny buňky obsahují homologně rekombinovanou DNA v důsledku zárodečného přenosu transgenu. Způsoby pro konstrukci homologně rekombinovaných zvířat jsou dále popsány v Bradley, A. (1991) Proud Opinion in Biotechnology 2:823-829 a v PCT mezinárodních přihláškách č.: WO 90/11354, Le Mouellec et al.; WO 91/01140, Smithies et al.; WO 92/0968, Zijlstra et al.; a WO 93/04169, Berns et al.
V jiném provedení mohou být produkována non-lidská transgenní zvířata, které obsahují systémy umožňující regulovanou expresi transgenu. Jedním příkladem takového systému je cre/loxP rekombinasový systém bakteriofágu Pl. Pro popis cre/loxP rekombinasového systému, viz např. Lakso et al. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:6232-6236. Jiným příkladem rekombinasového systému je FLP rekombinasový systém Saccharomyces cerevisiae (0'Gorman et al. (1991) Science
251:1351-1355. Když je cre/loxP rekombinasový systém použit pro regulaci exprese transgenu, tak jsou nutná zvířata obsahující transgeny kódující jak Cre rekombinasu, tak vybraný protein. Taková zvířata mohou být získána pomocí konstrukce dvojitě transgenních zvířat, např. spářením dvou transgenních zvířat, kde jedno obsahuje transgen kódující vybraný protein a druhé obsahuje transgen kódující rekombinasu.
115 • ·· 00 04 ·4·0 » 0 0 0 0 0 0 00 0 0 00« 000 00000« 00 000 0 0 0 0000 0000 0 00 00 00 00
Klony non-lidských transgenních zvířat podle předkládaného vynálezu mohou být také produkovány způsobem popsaným v Wilmut, I. et al. (1997) Nátuře 385:810-813 a PCT Mezinárodní přihlášce č. WO 97/07668 a WO 97/07669. Stručně, buňka, např., somatická buňka, ze transgenního zvířete, může být izolovaná a indukovaná k výstupu z růstové fáze a vstupu do Go fáze. Klidová buňka může být potom fúzována, např. pomocí elektrických pulsů, s enukleovaným oocytem od zvířete stejného druhu, jako je zvíře, od kterého byla izolovaná klidová buňka. Rekonstruovaný oocyt se potom kultivuje tak, že se vyvine morula nebo blastocysta a ta se potom přenese do vhodné pseudogravidní samice. Potomstvo této samice bude klonem zvířete, ze kterého byla buňka, např. somatická buňka, izolovaná.
IV. Farmaceutické prostředky
PCIP molekuly nukleové kyseliny, fragmenty PCIP proteinů, a anti-PCIP protilátky (též zde označované jako aktivní sloučeniny) podle předkládaného vynálezu mohou být inkorporovány do farmaceutických prostředky vhodných pro aplikaci. Takové prostředky obvykle obsahují molekulu nukleové kyseliny, proteinu, nebo protilátky, a farmaceuticky přijatelný nosič. Termín farmaceuticky přijatelný nosič označuje jakékoliv rozpouštědlo, disperzní medium, potah, antibakteriální či antimykotické činidlo, činidlo upravující isotonicitu nebo oddalující absorpci, a podobně, kompatibilní s farmaceutickým podáním. Použití takových medií a činidel pro farmaceuticky aktivní substance je dobře známé v oboru.
Pokud není nějaké běžné činidlo nebo medium inkompatibilní s aktivní sloučeninou, předpokládá se jeho možné použití v prostředkách. Prostředky mohou také obsahovat doplňkové aktivní sloučeniny.
• to ·*·· ·· · • to * • to · ii6 .· ··;
• ••to to • to ·* • · · to· · • · ··« · · · ·· · · to·· to · • to· · · ·· · ·· toto ·· ·*
Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu jsou připraveny tak, aby byly slučitelné s vybraným způsobem podání. Příklady způsobů podání jsou parenterální, např., intravenosní, intradermální, subkutánní, orální (např., inhalační), transdermální (lokální), transmukosální, a rektální podání. Roztoky nebo suspense použití pro parenterální, intradermální nebo subkutánní aplikaci mohou obsahovat následující složky: sterilní ředidla, jako je voda pro injekce, salinický roztok, netěkavé oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla; antibakteriální činidla, jako je benzylalkohol nebo methylparabeny; antioxidační činidla, jako je kyselina askorbová nebo kyselý siřičitan sodný; chelatační činidla, jako je kyselina ethylendiaminetetraoctová; pufry, jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty, a činidla úpravu tonicity, jako je chlorid sodný nebo dextrosa. pH může být upraveno kyselinami nebo bázemi, jako je kyselina chlorovodíková nebo hydroxid sodný. Parenterální přípravky mohou být obsaženy v ampulích, injekčních stříkačkách nebo lékovkách obsahujících více dávek vyrobených ze skla nebo plastu.
Farmaceutické prostředky vhodné pro injekční použití obsahují zahrnují sterilní vodné roztoky (pokud jsou rozpustné ve vodě) nebo disperse a sterilní prášky pro rychlou přípravu sterilních injekčních roztoků nebo dispersí. Pro intravenosní podání patří mezi vhodné nosiče fysiologický salinický roztok, bakteriostatická voda, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) nebo fosfátem pufrovaný salinický roztok. Ve všech případech musí být prostředek sterilní a měl by být dostatečně tekutý pro snadné injekční podání. Musí být stabilní za podmínek výroby a skladování a musí být chráněn před kontaminací
4
4 4 • 4 4
4444
4
4444 4
444«
117 ·· • · · o · · • 4 ··· · · 4 • 4 ·· 4 4 4 · · • · · · 4 · 4 4
44 44 44 mikroorganismy, jako jsou bakterie a houby. Nosičem může být rozpouštědlo nebo disperzní medium obsahující, například, vodu, ethanol, polyol (například, glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol, a podobně), a jejich vhodné směsi. Vhodná tekutost může být udržována, například, použitím potahů jako je lecitin, zachováváním vhodné velikosti částic v případě dispersí a použitím surfaktantů. Prevence působení mikroorganismů může být dosaženo použitím různých antibakteriálních a antimykotických činidel, například parabenů, chlorobutanolu, fenolu, kyseliny askorbové, thimerosalu a podobně. V mnoha případech je výhodné použít v prostředku isotonických činidel, například, sacharidů, polyalkoholů, jako je manitol, sorbitol, chloridu sodného. Prodloužené absorpce injekčních prostředků může být dosaženo použitím činidel oddalujících absorpci, například aluminiummonostearátu a želatiny.
Sterilní injekční roztoky mohou být připraveny inkorporováním aktivní sloučeniny (např. fragmentu PCIP proteinu nebo anti-PCIP protilátky) ve vhodném množství do vhodného rozpouštědla, spolu s jedním nebo více činidly uvedenými výše, a potom sterilizací filtrováním. Obecně se disperze připraví inkorporováním aktivní sloučeniny do sterilního vehikula, které obsahuje basické dispersní medium a požadované další složky uvedené výše. V případě sterilních prášků pro přípravu sterilních injekčních roztoků patří mezi výhodné způsoby přípravy sušení ve vakuu a lyofilizace, které vedou k zisku prášku tvořeného aktivní sloučeninou a dalšími přísadami získaného ze sterilně přefiltrovaného roztoku popsaného výše.
Orální prostředky obvykle obsahují inertní ředidlo a poživatelný nosič. Mohou být uzavřeny v želatinových kapslích • · • · · ·
118 • · · · nebo lisovány do tablet. Pro orální terapeutické podání může být aktivní sloučenina smísena s přísadami a použita ve formě tablet, pastilek nebo kapslí. Orální prostředky mohou být také připraveny za použití kapalného nosiče ve formě ústních vod, kde v takovém prostředku je sloučenina v kapalném nosiči aplikována orálně a vyplivnuta nebo vykašlána nebo polknuta. Farmaceuticky kompatibilní vazebná činidla, a/nebo adjuvantní materiály, mohou být také součástí prostředku. Tablety, pilulky, kapsle, pastilky a podobně mohou obsahovat jakoukoliv z následujících sloučenin nebo sloučeniny podobného charakteru: pojivá, jako je mikrokrystalická celulosa, tragant nebo želatinu; přísady, jako je škrob nebo laktosa, činidla podporující rozpadavost, jako je kyselina alginová, Primogel, nebo kukuřičný škrob; kluzná činidla, jako je magnesium stearát nebo Sterotes; maziva, jako je koloidní oxid křemičitý; sladidla, jako je sacharosa nebo sacharin; nebo chuťová korigens, jako je pepermint, methyl-salicylát, nebo pomerančová příchuť.
Pro inhalační podání jsou sloučeniny podány ve formě aerosolových sprayů z natlakovaného zásobníku, který obsahuje vhodný hnací plyn, např. oxid uhličitý, nebo nebulizátor.
Systémové podání může být transslizniční nebo transdermální. Pro tansslizniční nebo transdermální podání jsou v prostředcích použita činidla zlepšující průnik sliznicí nebo kůží. Taková činidla jsou obecně známá v oboru a patří mezi ně například pro transslizniční podání detergenty, žlučové soli a deriváty kyseliny fusidové. Transslizniční podání může být provedeno pomocí nasálních sprayů nebo čípků. Pro transdermální podání jsou aktivní sloučenipy formulovány ve formě mastí, obkladů, gelů nebo krémů, jak je v oboru známo.
··· ·
119
Sloučeniny mohou být také připraveny ve formě čípků (např.
za použití vhodných čípkových základů, jako je kakaové máslo a jiné glyceridy) nebo retenčních nálevů pro rektální podáni.
V jednom provedení jsou aktivní sloučeniny připraveny s nosiči, které chrání sloučeninu před rychlou eliminací z těla, za zisku prostředků s řízeným uvolňováním, např. implantáty a mikroenkapsulované systémy. Mohou být použity biodegradovatelné, biokompatibilní polymery, jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná. Způsoby přípravy takových prostředků jsou známé odborníkům v oboru. Takové materiály mohou být také zakoupeny od Alza Corporation a Nova Pharmaceuticals, lne. Liposomální suspense (včetně liposomů cílených na infikované buňky pomocí monoklonální protilátky k virovým antigenům) mohou být také použity jako farmaceuticky přijatelné nosiče. Tyto nosiče mohou být připraveny za použití způsobů známých v oboru, například, jak jsou popsány v U.S. Patentu č. 4522811.
Zejména výhodné je formulovat orální nebo parenterální prostředky ve formě dávkové jednotky se snadným podáním a uniformitou dávky. Dávková jednotka označuje fyzikálně diskrétní jednotku vhodnou pro podání jako jediná dávka léčenému jedinci, kde každá taková jednotka obsahuje předem určené množství aktivní sloučeniny vypočtené pro produkci požadovaného terapeutického efektu spolu s požadovaným farmaceutickým nosičem. Charakteristiky dávkové jednotky podle předkládaného vynálezu jsou určeny a jsou přímo závislé na jedinečných charakteristikách aktivní sloučeniny na požadovaném terapeutickém efektu, a na omezeních daných možnostmi zpracování takové aktivní sloučeniny na prostředek.
120
Toxicita a terapeutická účinnost takové sloučeniny může být určena za použití standardních farmaceutických procedur na buněčných kulturách nebo experimentálních zvířatech, např. pro určení LD50 (dávky letální pro 50% populace) a ED50 (dávky terapeuticky účinné v 50% populace). Poměr mezi toxickými a terapeutickými účinky se označuje jako terapeutický index a je vyjádřen jako poměr LD50/ED50. Sloučeniny, které vykazují vysoké terapeutické indexy, jsou výhodné. Sloučeniny s toxickými vedlejšími účinky mohou být také použity, ale je třeba navrhnout takový systém pro podání, který cílí takové sloučeniny do postižené tkáně, aby se minimalizovalo potenciální poškození neinfikovaných buněk a tak aby se redukovaly nežádoucí účinky.
Data získaná z testů na buněčných kulturách a na zvířatech mohou být použita pro určení dávek pro člověka. Dávky takových sloučenin jsou výhodně v rozmezí takových cirkulačních koncentrací, které zahrnují ED50 s malou nebo žádnou toxicitou. Dávky se v tomto rozmezí mohou lišit podle použité dávkové formy a způsobu podání. Pro jakoukoliv sloučeninu použitou ve způsobu podle předkládaného vynálezu může být terapeuticky účinná dávka nejprve odhadnuta z testech na buněčné kultuře. Na zvířecích modelech může být určena taková dávka, která je dostatečná k dosažení plasmatické koncentrace zahrnující IC50 (t.j., koncentrace testované sloučeniny, která je dostatečná pro dosažení poloviny maximální inhibice příznaků), jak je určena na buněčné kultuře. Takové informace mohou být použity pro přesnější určení dávky u člověka. Plasmatické koncentrace mohou být měřeny, například, vysoce účinnou kapalinovou chromatografií.
Jak je zde definováno, je terapeuticky účinné množství • ·
121 proteinu nebo polypeptidu (t.j. účinná dávka) v rozmezí přibližně 0,001 až 30 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodně přibližně 0,01 až 25 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodněji přibližně 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, a ještě výhodněji přibližně 1 až 10 mg/kg, 2 až 9 mg/kg, 3 až 8 mg/kg, 4 až 7 mg/kg, nebo 5 až 6 mg/kg tělesné hmotnosti. Odborníkům v oboru budou známy další faktory, které mohou ovlivňovat dávku nutnou pro účinnou léčbu jedince, včetně závažnosti nemoci nebo poruchy, předešlé léčby, celkového zdravotního stavu a/nebo věku jedince, a jiných současných onemocnění. Dále, léčba jedince terapeuticky účinným množstvím proteinu, polypeptidu, nebo protilátky, může být léčba jednou dávkou, ale lépe se jedná o léčbu sérií dávek.
Ve výhodném provedení je jedinec léčen protilátkou, proteinem nebo polypeptidem v dávce v rozmezí přibližně 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, jednou za týden po dobu přibližně 1 až 10 týdnů, výhodně 2 až 8 týdnů, výhodněji přibližně 3 až 7 týdnů, a ještě výhodněji přibližně 4, 5, nebo 6 týdnů. Je třeba si také uvědomit, že účinná dávky protilátky, proteinu, nebo polypeptidu použitá pro léčbu se může během léčby zvyšovat nebo snižovat. Změny dávkování se provádějí podle výsledků diagnostických testů, jak jsou zde popsány.
Předkládaný vynález zahrnuje činidla, která modulují expresi nebo aktivitu. Činidly mohou být například malé molekuly. Mezi malé molekuly patří například peptidy, peptidomimetika, aminokyseliny, aminokyselinové analogy, polynukleotidy, analogy polynukleotidů, nukleotidy, analogy nukleotidů, organické nebo anorganické sloučeniny (t.j. včetně heteroorganických a organometalických sloučenin) mající molekulovou hmotnost méně než přibližně 10000 gramů na mol, organické nebo anorganické sloučeniny mající molekulovou
122
hmotnost méně než přibližně 5000 gramů na mol, organické nebo anorganické sloučeniny mající molekulovou hmotnost méně než přibližně 1000 gramů na mol, organické nebo anorganické sloučeniny mající molekulovou hmotnost méně než přibližně 500 gramů na mol, a soli, estery a jiné farmaceuticky přijatelné formy takových sloučenin.
Je třeba si uvědomit, že vhodné dávky činidel s malou molekulou závisí na mnoha faktorech známých lékařům, veterinářům nebo výzkumníkům. Dávka malé molekuly se bude lišit například podle identity, velikosti a stavu jedince nebo vzorku, dále podle způsobu, kterým je kompozice aplikována, a podle efektu, který je požadován na nukleové kyselině nebo polypeptidů podle předkládaného vynálezu.
Příkladnými dávkami jsou mg nebo μg dávky malé molekuly na kilogram hmotnosti jedince nebo vzorku (např. přibližně 1 pg na kilogram až přibližně 500 mg na kilogram, přibližně 100 μς na kilogram až přibližně 5 mg na kilogram, nebo přibližně 1 μg na kilogram až přibližně 50 μρ na kilogram. Dále je třeba si uvědomit, že vhodné dávky malé molekuly závisí na účinnosti malé molekuly vzhledem k expresi nebo aktivitě, kterou má modulovat. Takové vhodné dávky mohou být určeny za použití testů popsaných výše. Když je jedna nebo více z těchto malých molekul podána jedinci (např. člověku) pro modulování exprese nebo aktivity polypeptidů nebo nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, pak může lékař, veterinář nebo výzkumník předepsat nejprve relativně nízkou dávku a potom tuto dávku zvyšovat, dokud není dosaženo uspokojivého efektu. Dále je třeba si uvědomit, že specifická dávka pro určitého jedince závisí na různých faktorech, včetně aktivity specifické použité sloučeniny, věku, tělesné hmotnosti, celkovém zdravotním stavu, pohlaví, dietních zvyklostech • · · ·
123
4 4 4 4444 4 4 4
4···44· 44 444 4 4
4 4444 4444
444 4 44 44 44 44 jedince, době podání, způsobu podání, rychlosti vylučování, jakékoliv kombinace léků, a stupně exprese nebo aktivity, která má být modulována.
Dále, protilátka (nebo její fragment) může být konjugována na terapeutickou skupinu, jako je cytotoxin, terapeutické činidlo nebo radioaktivní kov. Cytotoxin nebo cytotoxické činidlo je činidlo, které je škodlivé pro buňky. Příkladem je taxol, cytochalasin B, gramicidin D, ethidiumbromid, emetin, mitomycin, etoposid, tenoposid, vincristin, vinblastin, kolchicin, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracindion, mitoxantron, mithramycin, aktinomycin D, 1dehydrotestosteron, glukokortikoidy, prokain, tetrakain, lidokain, propranolol a puromycin a jejich analoga nebo homologa. Mezi terapeutická činidla patří například antimetabolity (např.· methotrexát, 6-merkaptopurin, 6thioguanin, cytarabin, 5-fluorouracil, dakarbazin), alkylační činidla (např., mechlorethamin, thioep, chlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) a lomustin (CCNU), cyklofosfamid, busulfan, dibromomanitol, streptozotocin, mitomycin C a cisdichlorodiamin-platina (II) (DDP) cisplatina), anthracykliny (např. daunorubicin (dříve daunomycin) a doxorubicin), antibiotika (např. daktinomycin (dříve aktinomycin), bleomycin, mithramycin a anthramycin (AMC)), a anti-mitotická činidla (např. vinkristin a vinblastin).
Konjugáty podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro modifikování dané biologické odpovědi a terapeutická skupina není limitována na klasická chemická terapeutická činidla. Například může být terapeutickou skupinou protein nebo polypeptid mající požadovanou biologickou aktivitu. Mezi takové proteiny patří, například, toxiny, jako je abrin, ricin A, pseudomonadový exotoxin nebo difterický toxin; proteiny, φφφ φφ φφ φφφ φφφ φφ φ φφφ φ φ φφφ φφφ φφφφφφφ φφ φφφ φ φ φ φ φφφφ φφφφ φφφφ φ φφ φφ φφ φφ ·· φφφφ
124 jako je faktor nekrosy nádorů, α-interferon, β-interferon, nervový růstový faktor, trombocytární růstový faktor, tkáňovýaktivátor plasminogenu; nebo činidlo modifikující biologickou reakci, jako jsou například lymfokiny, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), faktor stimulující kolonie granulocytů-makrofágů (GM-CSF), faktor stimulující kolonie granulocytů (G-CSF), nebo jiné růstové faktory.
Techniky pro konjugování takových terapeutických skupin na protilátky jsou dobře známé, viz např. Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Imunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), str. 243-56 (Alan R. Liss, lne. 1985);
Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, v Controlled Drug Delivery (2.vydání), Robinson et al. (eds.), str. 623-53 (Marcel Dekker, lne. 1987); Thorpe, Antibodies Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review, v Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), str. 475-506 (1985); Analysis, Results, And Future Prospective Of The Terapeutic Use Of Radiolabeled Antibodies In Cancer Therapy, v Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), str. 30316 (Academie Press 1985), a Thorpe et al., Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates,
Imunol. Rev., 62:119-58 (1982). Alternativně může být protilátka konjugována na druhou protilátku za zisku protilátkového heterokonjugátu, jak je popsáno v Segal, U.S. patent č. 4,676,980.
Molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být insertovány do vektorů a použity jako vektory pro genovou terapii. Vektory pro genovou terapii mohou být podány
125
0 0 0 0 · · 000000
0 0 004 ·0 0
004 0 0000 0 0 0
0000000 «0 000 0 0 • 0 0000 0000 0 4 0 0 0 ·· 00 00 00 jedinci například intravenosní injekcí, lokálním podáním (viz
U. S. Patent 5,328,470) nebo stereotaktickou injekcí (viz např.
Chen et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:3054-3057).
Farmaceutický přípravek vektoru pro genovou terapii může obsahovat vektor v přijatelném ředidlu, nebo může obsahovat matrici pro pomalé uvolňování, do které je vehikulum pro přenos genu inkorporováno. Alternativně, když může být produkován kompletní vektor pro přenos genu nezávislý na rekombinantních buňkách, např. retrovirový vektor, tak může farmaceutický prostředek obsahovat jednu nebo více buněk, které produkují tento systém pro aplikaci genu.
Farmaceutické prostředky mohou být obsaženy v zásobníku, balíčku nebo dávkovači spolu s návodem pro podání.
V. Použití a způsoby podle předkládaného vynálezu
Molekuly nukleové kyseliny, proteiny, proteinové homology a protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity v jedné nebo více z následujících metod: a) skríningových testech; b) prediktivní medicíně (např., diagnostických testech, prognostických testech, monitorování klinických studií a farmakogenetice); a c) způsobech léčby (např., terapeutických a profylaktických). PCIP proteiny podle předkládaného vynálezu mají jednu nebo více z následujících aktivit: (1) mohou interagovat s (např. vázat se na) proteinem draslíkového kanálu nebo jeho částí; (2) mohou regulovat fosforylační stav proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části; (3) mohou se asociovat s (např. vázat se na) vápník a mohou například účinkovat jako kalcium-dependentní kinasy, např. fosforylovat draslíkový kanál nebo receptor spřažený s G-proteinem způsobem závislým na vápníku; (4) mohou se asociovat s (např. vázat se na) vápník, a mohou - například 9 9
999«
126 • * · V · « • 4 4 ·« · 9 ·
9 9 9 ♦ · · 9 9
9 9 9 Λ · · · «· ·· ·* 9 9 účinkovat způsobem závislým na vápníku v buněčných procesech, např. účinkovat jako transkripčni faktory závislé na vápníku; (5) mohou modulovat aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem v buňkách (např. neuronech, jako jsou sensorické neurony nebo motorické neurony, nebo buňky srdce), například za účelem příznivého ovlivnění buněk; (6) mohou modulovat tvorbu chromatinu v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (7) mohou modulovat přesun vesikul a transport proteinů v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (8) mohou modulovat cytokinovou signalizaci v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (9) mohou regulovat asociaci proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části s buněčným cytoskeletem; (10) mohou modulovat buněčnou proliferaci; (11) mohou modulovat uvolňování neurotransmiterů; (12) mohou modulovat excitabilitu membrány; (13) mohou ovlivňovat klidový potenciál membrán; (14) mohou modulovat formy vln a frekvence akčních potenciálů; a (15) mohou modulovat prahy excitace; a proto mohou být použity k, například, (1) modulování aktivity proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části; (2) modulování fosforylačního stavu proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části; (3) modulování fosforylačního stavu draslíkového kanálu nebo receptoru spřaženého s G-proteinem způsobem závislým na vápníku; (4) asociování s (např. vazbu na) vápník, a mohou například - účinkovat způsobem závislým na vápníku; (5) mohou modulovat aktivity zprostředkované draslíkovým kanálem v buňkách (např. neuronech, jako jsou sensorické neurony nebo motorické neurony, nebo buňky srdce), například za účelem příznivého ovlivnění buněk; (6) mohou modulovat tvorbu chromatinu v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (7) mohou modulovat přesun vesikul a transport proteinů v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (8) mohou modulovat cytokinovou signalizaci v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce; (9) mohou regulovat asociaci proteinu
4 4 • 4 ·
127
4
4 4
• 44
4 4
4 · 4
4« *4 ···« * · 4
4 4 draslíkového kanálu nebo jeho části s buněčným cytoskeletem; (10) mohou modulovat buněčnou proliferaci; (11) mohou modulovat uvolňování neurotransmiterů; (12) mohou modulovat excitabilitu membrány; (13) mohou ovlivňovat klidový potenciál membrán; (14) mohou modulovat formy vln a frekvence akčních potenciálů; a (15) mohou modulovat prahy excitace;
Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu může být použita, například, pro expresi PCIP proteinu (např. za použití rekombinantního expresního vektoru v hostitelské buňce při genové terapii), pro detekci PCIP mRNA (např. v biologickém vzorku) nebo genetických alterací v PCIP genu, a pro modulování PCIP aktivity, jak je popsáno dále. PCIP proteiny mohou být použity pro léčbu onemocnění charakterizovaných nedostatečnou nebo nadměrnou produkcí PCIP substrátu nebo produkcí PCIP inhibitorů. Dále mohou být PCIP proteiny použity pro vyhledávání přirozených PCIP substrátů, pro vyhledávání léků nebo sloučenin, které modulují PCIP aktivitu, stejně jako pro léčbu onemocnění charakterizovaných nedostatečnou nebo nadměrnou produkcí PCIP proteinu nebo produkcí forem PCIP proteinu, které mají sníženou nebo aberantní aktivitu ve srovnání s přirozeným PCIP proteinem (např. onemocnění CNS, jako jsou neurodegenerativní onemocnění, např. Alzheimerova nemoc, demence související s Alzheimerovou nemocí (jako je Pickova nemoc), Parkinsonova nemoc a jiné demence související s Lewyho difusními tělísky, roztroušená sklerosa, amyotrofická laterální sklerosa, progresivní supranukleární obrna, epilepsie, spinocerebellární ataxie a Jakob-Creutzfieldtova nemoc; psychiatrická onemocnění, např. deprese, schizofrenní poruchy, Korsakoffova psychosa, mánie, úzkostné poruchy, bipolární afektivní poruchy nebo fobické poruchy; poruchy učení nebo paměti, např. amnesie nebo ztráta paměti související s věkem; neurologická • · · • · · · » ······
128 onemocnění, např. migréna; bolestivá onemocnění, např., hyperalgesie nebo bolest asociovaná s muskuloskeletálními poruchami; poranění míchy; mrtvice; trauma hlavy; nebo kardiovaskulární onemocnění, jako je dysfunkce sinového uzlu, angína, srdeční selhání, hypertense, fibrilace síní, flutter síní, dilatační kardiomyopatie, idiopatická kardiomyopatie, 1 infarkt myokardu, ischemická choroba srdeční, spasmus koronárních arterií nebo arytmie). Dále, anti-PCIP protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro detekci a izolování PCIP proteinů, regulování biologické dostupnosti PCIP proteinů, a modulování PCIP aktivity.
A. Skríningové testy:
Vynález poskytuje způsob (též zde označovaný jako skríningový test”) pro identifikaci modulátorů, t.j., kandidátních nebo testovaných sloučenin nebo činidel (např., peptidů, peptidomimetik, malých molekul nebo jiných léků), které se váží na PCIP proteiny, mají stimulační nebo inhibiční efekt na, například, expresi PCIP nebo aktivity PCIP, nebo mají stimulační nebo inhibiční efekt například na expresi nebo aktivitu PCIP substrátu.
V jednom provedení vynález poskytuje testy pro vyhledávání potenciálních sloučenin, které jsou substráty PCIP proteinu nebo polypeptidu nebo jeho biologicky aktivní části. V jiném provedení vynález poskytuje testy pro vyhledávání sloučenin, které se váží na nebo modulují aktivity PCIP proteinu nebo polypeptidu nebo jeho biologicky aktivní části. Testované sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být získány za použití jakéhokoliv z mnoha přístupů pro práci s kombinatoriálními knihovnami známého v oboru, včetně:
biologických knihoven; prostorově odlišitelných paralelních • · • · · ·
129 • · · · knihoven v pevné fázi nebo v roztoku; syntetických knihoven vyžadujících dekonvoluci; knihoven 'jeden korálek - jedna sloučenina'; a syntetické knihovny využívající selekce afinitní chromatografií. Způsob využívající biologické knihovny je omezen na peptidové knihovny, zatímco ostatní čtyři způsoby jsou použitelné pro peptidové, nepeptidové oligomerní knihovny nebo knihovny malých molekul (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).
Příklady způsobů pro syntézu molekulární knihovny jsou uvedeny například v: DeWitt et al. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. (1994). J. Med. Chem.
37:2678; Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al.
(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al.
(1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; a v Gallop et al
(1994) J. Med . Chem. 37:1233.
Knihovny sloučeniny mohou být přítomny v roztoku (např. Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), nebo na korálkách (Lam (1991) Nátuře 354:82-84), čipech (Fodor (1993) Nátuře 364:555-556), bakteriích (Ladner USP 5,223,409), sporách (Ladner USP '409), plasmidech (Culí et al. (1992) Proč Nati Acad Sci USA 89:1865-1869) nebo na fágu (Scott a Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner, výše.).
V jednom provedení je testem buněčný test, ve kterém je buňka, která exprimuje PCIP protein nebo jeho biologicky aktivní část, kontaktována s testovanou sloučenin a stanovuje se schopnost testované sloučeniny modulovat PCIP aktivitu, např. vazbu na draslíkový kanál nebo a jeho část. Stanovení • · · · · · · ······ • · · ··· ·· · • · · · · · · · · · 9
1ΟΛ ·······«·«*·· 9
ΙΟν · · ···· «··· • · · · · · · ·· · · ·· schopnosti testované sloučeniny modulovat PCIP aktivity může být provedeno například monitorováním uvolňování neurotransmiterů, např. dopaminu, z buněk, které exprimují PCIP, jako jsou neurony, např. neurony substantia nigra, nebo buňky srdce. Dále, stanovení schopnosti testované sloučeniny modulovat PCIP aktivitu může být provedeno například monitorováním Ito proudu nebo uvolňování neurotransmiterů z buněk, které exprimují PCIP, jako jsou buňky srdce. Proudy v buňce, např. Ito proud, mohou být měřeny za použití techniky kontaktních elektrod, jak je popsána v příkladech a v za použití technik popsaných například v Hamill et al. 1981. Pfluegers Arch. 391: 85-100). Buňka může být například savčí buňka. Stanovení schopnosti testované sloučeniny modulovat schopnost PCIP vázat se na substrát může být provedeno, například, navázáním PCIP substrátu na radioisotop nebo enzymatickou značkovací skupinu tak, že vazba PCIP substrátu na PCIP může být určena detekováním značeného PCIP substrátu v komplexu. Například mohou být sloučeniny (např. PCIP substráty) značeny 35g, 14gz nebo ^H, buď přímo, nebo nepřímo, a radioizotop může být detekován přímým odečtem radioemise nebo scintilačním odečtem. Alternativně mohou být sloučeniny značeny enzymaticky za použití například křenové peroxidasy, alkalické fosfatasy nebo luciferasy, a enzymatický markér může být detekován pomocí stanovení konverze vhodného substrátu na produkt.
Vynález také poskytuje způsob pro určení schopnosti sloučeniny (např., PCIP substrátu) interagovat s PCIP bez značení jakékoliv z interagujících složek. Například mikrofysiometr může být použit pro detekci interakce sloučeniny s PCIP bez značení sloučeniny nebo PCIP.
McConnell, Η. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912. Termín mikrofysiometr (např. Cytosensor) označuje analytický • · · · ··· · · · «· · • · · « · · · · · · ·
ΙΟΙ ··········♦·· «
131 · · «······· • ··· · ·· · · ·· *· přístroj, který měří rychlost, kterou buňky okyseluje své prostředí za použití světelného potenciometrického senzoru (LAPS). Změny v rychlosti okyselování mohou být použity jako indikátor interakcí mezi sloučeninami a PCIP.
V jiném provedení je testem buněčný test zahrnující kontaktování buněk exprimujících cílovou molekulu pro PCIP (např. draslíkový kanál nebo jeho fragment) s testovanou sloučeninou a stanovení schopnosti testované sloučeniny modulovat (např. stimulovat nebo inhibovat) aktivitu cílové molekuly pro PCIP. Stanovení schopnosti testované sloučeniny modulovat aktivity cílové molekuly pro PCIP může být provedeno například stanovením schopnosti PCIP proteinu vázat se nebo interagovat s cílovou molekulou pro PCIP, např. draslíkovým kanálem nebo jeho fragmentem.
Stanovení schopnosti PCIP proteinu nebo jeho biologicky aktivního fragmentu vázat se na nebo interagovat s cílovou molekulou pro PCIP může být provedeno jedním ze způsobů popsaných výše pro stanovení přímé vazby. Ve výhodném provedení může být stanovení schopnosti PCIP proteinu vázat se na nebo interagovat s cílovou molekulou pro PCIP provedeno stanovením aktivity cílové molekuly. Například aktivita cílové molekuly může být určena detekováním indukce druhého posla cílové molekuly v buňkách (t.j. intracelulárního Ca^4-, diacylglycerolu, IP3, a podobně), detekováním katalytické/enzymatické aktivity cílové molekuly na vhodném substrátu, detekováním indukce reporterového genu (obsahujícího na cílovou molekulu odpovídající regulační element operativně navázaný na nukleovou kyselinu kódující detekovatelný markér, např. luciferasu), nebo detekováním cílovou molekulou regulované buněčné reakce, jako je uvolňování neurotransmiteru.
132
V ještě jiném provedení je testem podle předkládaného vynálezu bezbuněčný test, ve kterém je PCIP protein nebo jeho biologicky aktivní část kontaktován s testovanou sloučeninou a určí se schopnost testované sloučeniny vázat se na PCIP protein nebo jeho biologicky aktivní část. Výhodnými biologicky aktivními částmi PCIP proteinů pro použití v testech podle předkládaného vynálezu jsou fragmenty, které se podílejí na interakcích s non-PCIP molekulami, např.
draslíkové kanály nebo jejich fragmenty, nebo fragmenty s vysokými skóre povrchové pravděpodobnosti. Vazba testované sloučeniny na PCIP protein může být určena buď přímo, nebo nepřímo, jak je popsáno výše. Ve výhodném provedení test zahrnuje kontaktování PCIP proteinu nebo jeho biologicky aktivní části se známou sloučeninou, která se váže na PCIP za vzniku testovací směsi, kontaktování testovací směsi s testovací sloučeninou, a stanovení schopnosti testované sloučeniny interagovat s PCIP proteinem, kde stanovení schopnosti testované sloučeniny interagovat s PCIP proteinem zahrnuje stanovení schopnosti testované sloučeniny přednostně se vázat na PCIP nebo jeho biologicky aktivní část ve srovnání se známou sloučeninou.
V jiném provedení je testem bezbuněčný test, ve kterém je PCIP protein nebo jeho biologicky aktivní část kontaktován s testovanou sloučeninou a určuje se schopnost testované sloučeniny modulovat (např. stimulovat nebo inhibovat) aktivitu PCIP proteinu nebo jeho biologicky aktivní části. Stanovení schopnosti testované sloučeniny modulovat aktivitu PCIP proteinu může být provedeno například stanovením schopnosti PCIP proteinu vázat se na cílovou molekulu pro PCIP jedním ze způsobů popsaných výše pro stanovení pro stanovení přímé vazby. Stanovení schopnosti PCIP proteinu vázat se na • ·· · « ·
133 cílovou molekulu pro PCIP může být také provedeno za použití technologií jako je analýza biomolekulárních interakcí v reálném čase (BIA). Sjolander, S. a Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 a Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Termín BIA označuje technologii pro studium biospecifických interakcí v reálném čase, bez značení jakéhokoliv z interagujících činidel (např. BIAcore). Změny v optickém jevu povrchové plasmonové resonance (SPR) mohou být použity jako indikátor reakcí v reálném čase mezi biologickými molekulami.
V alternativním provedení může být stanovení schopnosti testované sloučeniny modulovat aktivity PCIP proteinu provedeno stanovením schopnosti PCIP proteinu dále modulovat aktivity následných efektorů cílové molekuly pro PCIP. Například mohou být sledovány aktivity efektorové molekuly na vhodné cílové molekule nebo vazba efektorů na vhodný cíl, jak je popsáno výše.
V ještě jiném provedení bezbuněčný test zahrnuje kontaktování PCIP proteinu nebo jeho biologicky aktivní části se známou sloučeninou, která se váže na PCIP protein za vzniku testovací směsi, kontaktování testovací směsi s testovanou sloučeninou, a stanovení schopnosti testované sloučeniny interagovat s PCIP proteinem, kde stanovení schopnosti testované sloučeniny interagovat s PCIP proteinem zahrnuje stanovení schopnosti PCIP proteinu přednostně se vázat na nebo modulovat aktivity cílové molekuly pro PCIP.
Bezbuněčné testy podle předkládaného vynálezu jsou vhodné pro použití jak pro solubilní, tak pro na membránu vázané formy izolovaných proteinů. V případě bezbuněčných testů, ve kterých je použitá na membránu vázaná forma izolovaného ·· « • « • · · ·
134
99
9 9 9 9 9
9 99 9 9 9 ·
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 · · · 9 9 ·· ·· proteinu (např. draslíkový kanál) může být žádoucí použít solubilizační činidlo, aby byl izolovaný protein vázaný na membránu udržen v roztoku. Příklady takových solubilizačních činidel jsou neiontové detergenty, jako je n-oktylglukosid, ndodecylglukosid, n-dodecylmaltosid, oktanoyl-N-methylglukamid, dekanoyl-N-methylglukamid, Triton® X-100, Triton® X-114,
Thesit®, isotridecypoly(ethylenglykolether)nz 3—[(3— cholamidopropyl)dimethylamminio]-1-propansulfonát (CHAPS), 3[(3-cholamidopropyl)dimethylamminio]-2-hydroxy-lpropansulfonát (CHAPSO), nebo N-dodecyl=N,N-dimethyl-3ammonio-l-propansulfonát.
Ve vice než jednom provedení testovacích způsobů podle předkládaného vynálezu může být žádoucí imobilizovat buď PCIP nebo jeho cílovou molekulu pro usnadnění separace komplexovaných forem od nekomplexovaných forem jednoho nebo obou proteinů, stejně jako pro úpravu automatizace testu.
Vazba testované sloučeniny na PCIP protein, nebo interakce PCIP proteinu s cílovou molekulou za přítomnosti a absence testované sloučeniny, může být provedena v jakékoliv nádobě obsahující vhodná reakční činidla. Příklady takových nádob jsou mikrotitrační plotny, testovací zkumavky a mikrocentrifugační zkumavky. V jednom provedení může být poskytnut fúzní protein, který přidává doménu, která umožňuje vazbu jednoho nebo obou proteinů na matrici. Například glutathion-Stransferasa/ PCIP fúzní proteiny nebo glutathion-Stransferasa/cílové fúzní proteiny mohou být adsorbovány na glutathion-sepharosové korálky (Sigma Chemical, St. Louis, MO) nebo glutathionem derivatizované mikrotitrační plotny, které jsou potom kombinovány s testovanou sloučeninou nebo testovanou sloučeninou a neadsorbovaným cílovým proteinem nebo PCIP proteinem, a směs se inkubuje za podmínek vhodných pro tvorbu komplexů (např. za fyziologických podmínek z hlediska ·· to toto ·
135 toto· to to to ·· · • toto to · · · · · to · to······ toto to to to to to • · ···· · to · · ···· « 4»» ·· ·· to· solí a pH). Po inkubaci se korálky nebo jamky mikrotitrační plotny promyjí pro odstranění všech nenavázaných složek a komplexy se určí buď přímo nebo nepřímo, například způsobem popsaným výše. Alternativně mohou být komplexy disociované z matrice a hladina PCIP vazby nebo aktivity může být určena za použití standardních technik.
Jiná technika pro imobilizování proteinů na matricích může být také použita ve skríningových testech podle předkládaného vynálezu. Například PCIP protein nebo cílová molekula pro PCIP může být imobilizován za použití konjugace biotinu a streptavidinu. Biotinylovaný PCIP protein nebo cílové molekuly mohou být připraveny z biotin-NHS (N-hydroxysukcinimid) za použití technik známých v oboru (např.
biotinylačního kitu, Pierce Chemicals, Rockford, IL), a mohou být zmobilizovány na jamkách 96-jamkových ploten potažených streptavidinem (Pierce Chemical). Alternativně mohou být protilátky reaktivní s PCIP proteinem nebo cílovými molekulami, které však neinterferuji s vazbou PCIP proteinu na cílovou molekulu, derivatizovány do jamek plotny, a nenavázaná cílová skupina nebo PCIP protein mohou být zachyceny v jamkách konjugací s protilátkou. Způsoby pro detekování takových komplexů, kromě způsobů popsaných výše pro GST-imobilizované komplexy, zahrnují imunodetekci komplexů za použití protilátky reaktivní s PCIP proteinem nebo cílovou molekulou, stejně jako enzymové testy, které spočívají v detekci enzymatické aktivity asociované s PCIP proteinem nebo cílovou molekulou.
Ve výhodném provedení jsou potenciální nebo testované sloučeniny nebo činidla testovány na svou schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly modulovat přesun vesikul a transport proteinů v buňkách, např. neuronech nebo buňkách srdce, za použití testů popsaných například v Komada • ·· · • 4
4· 44 ·· • · 4 4« 4
4 4 4 4444 4 · 4 nr · 4444 44 44 4 · 4 · ·
130 « · 4444 4444
4444 4 44 44 44 44
M.s et al. (1999) Genes Dev.13(11):1475-85, a Roth M.G. et al. (1999) Chem. Phys. Lipids. 98(1-2):141-52, kde obsah těchto publikací je zde uveden jako odkaz.
V dalším výhodném provedení jsou potenciální nebo testované sloučeniny nebo činidla testovány na svou schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly regulovat fosforylační stav proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části, za použití například in vitro kinasového testu. Stručně řečeno, cílová molekula pro PCIP, např. imunoprecipitovaný draslíkový kanál z buněčné linie exprimující takovou molekulu, může být inkubována s PCIP proteinem a radioaktivní ATP, např. [γ-32Ρ] ATP, v pufru obsahujícím MgCl2 a MnCl2, např. 10 mM MgCl2 a 5 mM MnCl2. Po inkubaci se imunoprecipitovaná cílová molekula pro PCIP, např. draslíkový kanál, může separovat SDSpolyakrylamidovou gelovou elektroforesou za redukčních podmínek, může být přenesena na membránu, např. PVDF membránu, a může být vyhodnocena autoradiografií. Objevení se detekovatelných proužků na autoradiografu ukazuje na to, že PCIP substrát, např. draslíkový kanál, byl fosforylován. Také může být provedena fosfoaminokyselinová analýza fosforylovaného substrátu pro určení toho, které zbytky na PCIP substrátu jsou fosforylované. Stručně řečeno, radiofosforylovaný proteinový proužek může být excidován z SDS gelu a může být podroben částečné kyselé hydrolýze. Produkty mohou být potom separovány jednorozměrovou elektroforesou a mohou být analyzovány například na fosfoimagerum a mohou být srovnávány s ninhydrinem barvenými fosfoaminokyselinovými standardy. Mohou být použity také testy, jaké jsou popsány například v Tamaskovic R. et al. (1999) Biol. Chem.
380(5):569-78, který je zde uveden jako odkaz.
V jiném výhodném provedení jsou testované sloučeniny nebo «· · ·· ·· • 99 9 9 9 9 9 9
999 9 9999 9 9 9 <♦ ···· · · 9 9 999 9 9 »··9 9 ·· ·· ·· ·· činidla testována na jejich schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly asociovat se (např. vázat) s vápníkem, za použití například testů popsaných v Liu L.
(1999) Cell Signál. 11(5):317-24 a Kawai T. et al. (1999)
Oncogene 18(23):3471-80, kde obsah těchto publikací je zde uveden jako odkaz.
·· ····
V jiném výhodném provedení jsou kandidátské nebo testované sloučeniny nebo činidla testovány na jejich schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly modulovat tvorbu chromatinu v buňce, za použití například testů popsaných v Okuwaki M. et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(51):34511-8 a Miyaji-Yamaguchi M. (1999) J. Mol. Biol. 290(2): 547-557, kde obsah těchto publikací je zde uveden jako odkaz.
V ještě jiném výhodném provedení jsou kandidátské nebo testované sloučeniny nebo činidla testovány na jejich schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly modulovat proliferaci buněk, za použití například testů popsaných v Baker F.L. et al. (1995) Cell Prolif. 28(1):1-15, Cheviron N. et al. (1996) Cell Prolif. 29(8):437-46, Hu Z.W. et al. (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 290(1):28-37 a Elliott K. et al. (1999) Oncogene 18(24):3564-73, kde obsah těchto publikací je zde uveden jako odkaz.
Ve výhodném provedení jsou kandidátní nebo testované sloučeniny nebo činidla testovány na jejich schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly regulovat asociování proteinu draslíkového kanálu nebo jeho části s buněčným cytoskeletem, za použití například testů popsaných v Gonzalez C. et al. (1998) Cell Mol. Biol. 44(7):1117-27 a
Chia C.P. et al. (1998) Exp. Cell Res . 244(1) :34 0-8, kde obsah ·
♦ · · • 9 · ♦ »· ·· • · • · · · ·
138 • · · · · · 9 99 9 • 99 9 9 9
9 99 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 · · • ·· 9 9 9 · 9 * · · · · · ·· těchto publikací je zde uveden jako odkaz.
V jiném výhodném provedení jsou kandidátské nebo testované sloučeniny nebo činidla testovány na jejich schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly modulovat excitabilitu membrány, za použití například testů popsaných v Bar-Sagi D. et al. (1985) J. Biol. Chem. 260(8):4740-4 a
Barker J.L. et al. (1984) Neurosci. Lett. 47(3):313-8, kde obsah těchto publikací je zde uveden jako odkaz.
V jiném výhodném provedení kandidátské nebo testované sloučeniny nebo činidla testovány na jejich schopnost inhibovat nebo stimulovat schopnost PCIP molekuly modulovat cytokinovou signalizaci v buňce, např. neuronech nebo buňkách srdce, za použití testů popsaných v Nakashima Y. et al. (1999)
J. Bone Joint Surg. Am. 81(5):603-15, kde obsah těchto publikací je zde uveden jako odkaz.
V jiném provedení jsou modulátory PCIP exprese identifikovány způsobem, kde je buňka kontaktována s testovanou sloučeninou a stanovuje se exprese PCIP mRNA nebo proteinu v buňce. Úroveň exprese PCIP mRNA nebo proteinu v přítomnosti testované sloučeniny se srovnává s úrovní exprese PCIP mRNA nebo proteinu za nepřítomnosti testované sloučeniny. Testované sloučeniny mohou být potom identifikovány jako modulátory PCIP exprese na základě tohoto srovnání.
Například, když je exprese PCIP mRNA nebo proteinu vyšší (statisticky významně vyšší) za přítomnosti testované sloučeniny než za její nepřítomnosti, pak je testovaná sloučenina identifikována jako stimulátor PCIP mRNA nebo proteinové exprese. Alternativně, když je exprese PCIP mRNA nebo proteinu nižší (statisticky významně nižší) za přítomnosti testované sloučeniny než za její nepřítomnosti, • · · · · · · ♦ · · · · · ♦ · · • · ♦ · · ··· · · ·
Ι^Λ ♦ ···· '*··«··· * uy · · « · · · · ·b · • ·· · « «· «· ·· ·· tak je testovaná sloučenina identifikována jako inhibitor exprese PCIP mRNA nebo proteinu. Úroveň exprese PCIP mRNA nebo proteinu v buňkách může být určena způsoby zde popsanými pro detekování PCIP mRNA nebo proteinu.
V ještě jiném aspektu předkládaného vynálezu mohou být PCIP proteiny použity jako zachycovací proteiny ve 2hybridním testu nebo 3-hybridním testu (viz např. U.S. Patent č. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel et al.
(1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993)
Oncogene 8:1693-1696; a Brent W094/10300), pro identifikaci dalších proteinů, které se váží na nebo interagují s PCIP (PCIP-vazebné proteiny nebo PCIP-bp) a které se podílejí na PCIP aktivitě (jak je podrobněji popsáno v příkladech provedení vynálezu). Takové PCIP-vazebné proteiny se budou také pravděpodobně podílet na propagaci signálů od PCIP proteinů nebo PCIP cílových molekul, například cestou následujících prvků PCIP-signální dráhy. Alternativně je pravděpodobné že takové PCIP-vazebné proteiny budou PCIPinhibitory.
2-hybridový systém je založen na modulárním charakteru většiny transkripčních faktorů, které se skládají ze separovatelných domén pro vazbu na DNA a aktivačních domén. Stručně, test využívá dvou různých DNA konstruktů. V jednom konstruktu je gen, který kóduje PCIP protein, fúzován na gen kódující DNA vazebnou doménu známého transkripčního faktoru (např., GAL-4). V jiném konstruktu je DNA sekvence z knihovny DNA sekvencí, která kóduje neidentifikovaný protein (vzorek) fúzována na gen, který kóduje aktivační doménu známého transkripčního faktoru. Pokud jsou záchytný a zachycovaný proteiny schopny interagovat in vivo za tvorby PCIP·· ··· · ·* · • ·
999 ·
140 • 99 999 99 ·
999 99999 99 9
9999 9 9 99 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 99 9 9 dependentního komplexu, tak jsou DNA-vazebná a aktivační doména transkripčního faktoru v těsné blízkosti. Tato blízkost umožňuje transkripci reporterového genu (např. LacZ), který je operativně navázán na transkripční regulační místo reaktivní na transkripční faktor. Exprese reporterového genu může být detekována a buněčné kolonie obsahující funkční transkripční faktor mohou být izolovány a použity pro získání klonovaného genu, který kóduje protein, který interaguje s PCIP proteinem.
Předkládaný vynález se dále týká nových činidel identifikovaných výše uvedenými skríningovými testy. Proto předkládaný vynález dále zahrnuje použití činidel identifikovaných výše uvedenými způsoby na vhodném zvířecím modelu. Například činidlo identifikované výše uvedeným způsobem (např. PCIP modulační činidlo, protismyslná PCIP molekula nukleové kyseliny, PCIP-specifická protilátka, nebo PCIP-vazebný partner) může být použita na zvířecím modelu pro stanovení účinnosti, toxicity, nebo vedlejších účinků léčby takovým činidlem. Alternativně mohou být činidla identifikovaná výše uvedenými způsoby použita na zvířecím modelu pro určení mechanismu účinku takových činidel. Dále se předkládaný vynález týká použití nových činidel identifikovaných výše uvedenými skríningovými způsoby pro léčbu, například pro léčbu onemocnění CNS nebo kardiovaskulárních onemocnění, jak je zde popsána.
B. Detekční testy
Části nebo fragmenty cDNA sekvence identifikované v předkládaném vynálezu (a příslušné kompletní genové sekvence) mohou být použity v mnoha způsobech jako polynukleotidová činidla. Například mohou být tyto sekvence použity pro: (i)
141
9 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9
999 99 999 9 9 9
9999 99 99 999 9 9 • · » · 9 9 9 9 9 9
99 9 9 99 99 99 99 ··· · mapování příslušných genů na chromosom; a tím k lokalizování genových regionů asociovaných s genetickým onemocněním; (ií) identifikaci jednotlivců z malého biologického vzorku (tkáňové typizaci); a (iii) forensní identifikaci biologického vzorku.
Tyto aplikace jsou popsány v následujících oddílech.
1. Chromosomální mapování
Po izolování sekvence (nebo části sekvence) genu může být tato sekvence použita pro mapování genu na chromosom. Tento proces se označuje chromosomální mapování. Tak mohou být části nebo fragmenty PCIP nukleotidové sekvence, popsané v předkládaném vynálezu, použity pro lokalizaci PCIP genů na chromosomu. Mapování PCIP sekvence na chromosomy je významným prvním krokem při korelování těchto sekvencí s geny asociovanými s onemocněními.
Stručně řečeno, PCIP geny mohou být mapovány na chromosomy pomocí přípravy PCR primerů (výhodně délky 15-25 bp) z PCIP nukleotidové sekvence. Počítačová analýza PCIP sekvence může být použita pro návrh primerů, které nepřeklenují více než jeden exon v genomové DNA, což by komplikovalo proces amplifikace. Tyto primery mohou být potom použity pro PCR skríning hybridů somatických buněk obsahujících jednotlivé lidské chromosomy. Pouze ty hybridy, které obsahují lidský gen odpovídající PCIP sekvenci, povedou k zisku amplifikovaných fragmentů.
Hybridy somatických buněk se připraví fúzí somatických buněk od různých savců (např. lidských a myších buněk). Jak hybridy lidské a myší buňky rostou a dělí se, ztrácejí postupně náhodně lidské chromosomy, ale zachovávají si myší chromosomy. Při použití media, ve kterém myší buňky nemohou • ·· · ·· · ·· ·· ·· *·· ··♦ · · · » · · · * ·« · « · ·
JO ♦·♦·♦·♦······ « ΐ*τΖ. · · · · · · «·«· ···· « ·» ·· ♦· «· růst, protože nemají určitý enzym, ale lidské buňky mohou, dojde k zachování lidského chromosomu, který obsahuje gen kódující potřebný enzym. Při použití různých medií může být získán panel hybridních buněčných linií. Každá buněčná linie v panelu obsahuje buď jediný lidský chromosom, nebo malý počet lidských chromosomů, a kompletní sadu myších chromosomů, což umožňuje snadné mapování jednotlivých genů na specifické lidské chromosomy. (D'Eustachio P. et al. (1983) Science
220:919-924). Hybridy somatických buněk obsahující pouze fragmenty lidských chromosomů mohou být také připraveny za použití lidských chromosomů s translokacemi a delecemi.
PCR mapování hybridů somatických buněk je rychlým způsobem pro zařazení určité sekvence na určitý chromosom. Při použití jednoho termocyklovače je možné přiřadit tři nebo více sekvencí za den. Za použití PCIP nukleotidové sekvence pro přípravu oligonukleotidových primerů může být provedena sublokalizace pomocí panelů fragmentů ze specifických chromosomů. Mezi další mapovací strategie, které mohou být také použity pro mapování PCIP sekvence na chromosom, patří in šitu hybridizace (popsaná v Fan, Y. et al. (1990) Proč. Nati.
Acad. Sci. USA, 87:6223-27), pre-skríning se značenými tříděnými chromosomy, a pre-selekce hybridizací na chromosomálně specifickou cDNA knihovnu.
Fluorescenční in šitu hybridizace (FISH) DNA sekvence na nátěr chromosomů v metafázi může být dále použita pro získání přesného chromosomálního umístění v jednom kroku.
Chromosomální nátěr může být vyroben za použití buněk, jejichž dělení bylo zablokováno v metafázi chemickým činidlem, jako je kolcemid, který poškozuje mitotické vřeténko. Chromosomy mohou být zpracovány trypsinem a potom mohou být barveny podle
Giemsy. Vzorek ze světlých a tmavých proužků vznikne na každém ·· · * · · ♦ · · » · ··· ·
143 ♦ ··· ·♦ »· • · · • · ♦·· • · ·
na chromosomu a každý chromosom může být identifikován. FISH technika může být použita s DNA sekvenci již délky 500 nebo 600 baží. Nicméně, klony delší než 1000 baží mají vyšší pravděpodobnost vazby na jedinečné místo chromosomu s dostatečnou intenzitou signálu pro jednoduchou detekci.
Výhodně 1000 baží, a výhodněji 2000 baží, je dostatečný počet baží pro získání dobrých výsledků za rozumnou dobu. Pro p0ehled této techniky viz Verma et al., Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques (Pergamon Press, New York 1988).
Reakční činidla pro chromosomální mapování mohou být použita individuálně pro označení jediného chromosomu nebo jediného místa na tomto chromosomu, nebo může být použito panelů reakčních činidel pro označení více míst a/nebo více chromosomů. Reakční činidla odpovídající nekódujícím regionům genů jsou pro mapování výhodná. Kódující sekvence jsou s větší pravděpodobností konzervovány v genových rodinách, což zvyšuje šanci na zkříženou hybridizací během chromosomálního mapování.
Po přesné lokalizaci sekvence na chromosom může být fyzikální pozice sekvence korelována s genetickou mapou (taková data jsou uvedena v, například, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man, která je dostupná on-line přes Johns Hopkins University Welch Medical Library). Vztahy mezi genem a nemocí, mapovanými na stejný chromosomální region, mohou být identifikovány pomocí vazebné analýzy (současnému dědění fyzikálně sousedících genů), které je popsána například v Egeland, J. et al. (1987) Nátuře, 325:783-787.
Dále mohou být určeny rozdíly v DNA sekvenci mezi jednotlivci postiženými a nepostiženými onemocněním asociovaným s PCIP genem. Pokud je mutace pozorována u některých nebo u všech postižených jedinců, ale ne u žádného
9
9 9 · 9
9999
9
9999 9
144
9 9 9 • 9 9
9 99 9
9 9 9 9
9 9 ·
99 ·· **· ·
9 · • 9 9
9 9 ·
9 9 9
99 nepostiženého jedince, tak je mutace pravděpodobně kauzální příčinou onemocnění. Srovnávání postižených a nepostižených jedinců obvykle zahrnuje nejprve vyhledávání strukturálních alterací v chromosomech, jako jsou delece nebo translokace, které jsou viditelné na chromosorná1ním nátěru nebo detekovatelné za použití PCR podle této DNA sekvence. Nakonec může být pro potvrzení přítomnosti mutací a pro odlišení mutací od polymorfismů provedeno sekvenování genů od několika j edinců.
2. Tkáňová typizace
PCIP sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro identifikaci jedinců z malých biologických vzorků. Armáda Spojených států amerických například uvažuje o použití polymorfismů délky restrikčních fragmentů (RFLP) pro identifikaci svého personálu. V této technice se genomová DNA jedince tráví jedním nebo více restrikčními enzymy a sondování a Southern blot vedou k zisku jedinečných proužků použitelných pro identifikaci. Tato metoda nemá nevýhody Dog Tags, které mohou být ztraceny, přepnuty nebo odstraněny, což by činilo pozitivní identifikaci obtížnou. Sekvence podle předkládaného vynálezu jsou použitelné jako další DNA markéry pro RFLP (jak je popsáno v U.S. Patentu 5272057).
Dále, sekvence podle předkládaného vynálezu může být použita pro poskytnutí alternativní techniky, která určuje skutečnou DNA sekvenci vybraných částí genomu jedince. Tak mohou být PCIP nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu použity pro přípravu dvou PCR primerů z 5' a 3’ konců sekvence. Tyto primery mohou být potom použity pro amplifikaci DNA jedince a následné sekvenování.
145 • *
99
·♦ ·« • · ♦
9 999
9 9 9 • 9 9
9999
Panely příslušných DNA sekvencí od jedince, připravené tímto způsobem, mohou poskytnout jedinečnou identifikaci jedince, protože každý jedinec má jedinečnou sadu takové DNA v důsledku alelických variací. Sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro získání takové identifikační sekvence od jedinců a ze tkání. PCIP nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu reprezentují jedinečné části lidského genomu. Alelické variace se v určité míře vyskytují v kódujících regionech těchto sekvencí, a ve vyšší míře v nekódujících regionech. Předpokládá se, že alelické variace mezi jednotlivými lidmi se vyskytují s frekvencí přibližně jednou na každých 500 baží. Každá popsaná sekvence může být, v určitém rozsahu, použita jako standard, se kterým může být DNA od jedince srovnávána za účelem identifikace. Protože se větší počet polymorfismů vyskytuje v nekódujících regionech, je méně sekvence nutné pro odlišení jedinců. Nekódující sekvence mohou poskytnout pozitivní identifikaci jedince pomocí panelu přibližně 10 až 1000 primerů, které každý vedou k zisku nekódující amplifikované sekvence o 100 bazích. Když se použijí předpokládané kódující sekvence, tak je vhodnější počet primerů pro pozitivní identifikaci jedince 500-2000.
Pokud je panel reakčních činidel z PCIP nukleotidové sekvence použit pro přípravu identifikační databáze pro jednotlivce, tak mohou být stejná činidla potom použita pro identifikaci tkání od jedince. Za použití jedinečné identifikační databáze může být pozitivní identifikace jedince - živého či mrtvého - provedena z extrémně malého vzorku tkáně.
3. Použití částečných PCIP sekvencí ve forensní biologii
Identifikační techniky na bázi DNA mohou být použity také •9 99·«
146
9«· «
• · ve forensní biologii. Forensní biologie je vědecký obor využívající genetické typizace v biologických důkazech nacházených při kriminálních činech jako prostředek pro pozitivní identifikaci, například pachatele trestného činu.
Pro provedení takové identifikace může být PCR technologie použita pro amplifikaci DNA sekvence získané z velmi malých biologických vzorků, jako jsou tkáně, například vlasy nebo kůže, nebo tělní tekutiny, například krev, sliny, semenná tekutina, nalezených na místě činu. Amplifikovaná sekvence může být potom srovnávána se standardy, což umožní identifikaci původu biologického vzorku.
Sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro poskytnutí polynukleotidových reakčních činidel, např.,
PCR primerů, cílených na specifický lokus v lidském genomu, kde tato činidla mohou zvýšit spolehlivost forensní identifikace na bázi DNA tím, že - například - poskytnou jiný identifikační markér (t.j. jinou DNA sekvenci, která je jedinečná pro určitého jedince). Jak bylo uvedeno výše, skutečná sekvence baží může být použita pro identifikaci a je přesnou alternativou k analýze fragmentů generovaných restrikčními enzymy. Sekvence cílené na nekódující regiony jsou zejména vhodné pro toto použití, protože větší počet polymorfismů se vyskytuje v nekódujících regionech, což snáze umožňuje odlišení jedinců při použití této techniky. Příklady polynukleotidových reakčních činidel zahrnují PCIP nukleotidové sekvence nebo jejich části, které mají délku alespoň 20 baží, výhodně alespoň 30 baží.
PCIP nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu mohou být dále použity pro poskytnutí polynukleotidových reakčních činidel, např. značených nebo neznačených sond, které mohou být použity například v hybridizaci in sítu, pro identifikaci specifické tkáně, např. mozkové tkáně. Toto může být velmi užitečné v případech, kdy forensní patolog hodnotí tkáň neznámého původu. Panely takových PCIP sond mohou být použity pro identifikaci tkání podle druhu a/nebo typu orgánu.
147
9 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 999 9 9 9
9999 9 f 99 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 99 99 99 99 ·· ·»··
Podobným způsobem mohou být tato reakční činidla, např. PCIP primery nebo sondy, použity pro vyšetřování tkáňových kultur na kontaminaci (t.j. testování přítomnosti směsi různých typů buněk v kultuře).
C. Prediktivní medicína:
Předkládaný vynález se také oblasti prediktivní medicíny, ve které jsou diagnostické testy, prognostické testy a monitorování klinických studií používány pro prognostické (prediktivní) účely k určení toho, zda má být jedinec profylakticky léčen. V souladu s tím se jeden aspekt předkládaného vynálezu týká diagnostických testů pro určení exprese PCIP proteinu a/nebo nukleové kyseliny, stejně jako PCIP aktivity, v biologickém vzorku (např. krvi, séru, buňkách, tkáních) za účelem stanovení toho, zda je jedinec postižený onemocněním nebo poruchou, nebo zda je u něj riziko vzniku onemocnění asociovaného s aberantní PCIP expresí nebo aktivitou. Vynález také poskytuje prognostické (nebo prediktivní) testy pro určení toho, zda je jedinec rizikový z hlediska vzniku poruchy asociované s expresí PCIP proteinu, nukleové kyseliny nebo aktivitou PCIP. Například mohou být v biologickém vzorku testovány mutace v PCIP genu. Takové testy mohou být použity pro prognostické nebo prediktivní účely pro profylaktickou léčbu jedince před vznikem onemocnění charakterizovaného nebo asociovaného s PCIP proteinem, expresí nukleové kyseliny nebo aktivitou.
148 ·« · ·* ·· * · < · · · · · · «< « > · · ··« · · · ·*···· t «« · 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
999 9 9 9· »9 99 99
Jiný aspekt předkládaného vynálezu se týká monitorování vlivu činidla (např. léků, sloučenin) na expresi nebo aktivitu
PCIP v klinických studiích.
Tato a jiná činidla jsou podrobně popsána v následujících oddílech.
1. Diagnostické testy
Příkladný způsob pro detekování přítomnosti nebo absence PCIP proteinu nebo nukleové kyseliny v biologickém vzorku zahrnuje získání biologického vzorku od testovaného jedince a kontaktování biologického vzorku se sloučeninou nebo činidlem schopným detekovat PCIP protein nebo nukleovou kyselinu (např. mRNA, genomovou DNA), která kóduje PCIP protein tak, že je detekována přítomnosti PCIP proteinu nebo nukleové kyseliny v biologickém vzorku. Výhodným činidlem pro detekování PCIP mRNA nebo genomové DNA je značená nukleokyselinová sonda schopná hybridizace na PCIP mRNA nebo genomovou DNA. Nukleokyselinovou sondou může být například kompletní PCIP nukleová kyselina, jako je nukleová kyselina SEQ ID NO:1, SEQ ID N0:3 SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID N0:13, SEQ ID N0:15, SEQ ID NO:17,
SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID
NO: 27, SEQ ID NO:2 9, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35,
SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID
NO: 48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56,
SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID
NO: 75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82,
SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID
NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo DNA insert plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939,
149 * · · · · · «·4· ·♦·· ♦ ·· ·* ·· »·
98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948,
98949, 98950, 98951, 98991, 98993, nebo 98994, nebo její část, jako je oligonukleotid délky alespoň 15, 30, 50, 100,
250 nebo 500 nukleotidů dostačující pro specifickou hybridizaci za přísných podmínek na PCIP mRNA nebo genomovou DNA. Jiné vhodné sondy pro použití v diagnostických testech podle předkládaného vynálezu jsou zde popsány.
Výhodným činidlem pro detekování PCIP proteinu je protilátka schopná vazby na PCIP protein, výhodně protilátka s detekovatelným markérem. Protilátka může být polyklonální nebo - výhodněji - monoklonální. Může být použita intaktní protilátka, nebo její fragment (např. Fab nebo F(ab’)2).
Termín značená v souvislosti se sondou nebo protilátkou zahrnuje přímé značení sondy nebo protilátky navázáním (t.j., fyzikální vazbou) detekovatelné substance na sondu nebo protilátku, stejně jako nepřímé značení sondy nebo protilátky reaktivitou s jiným činidlem, které je přímo značené. Příklady nepřímého značení zahrnují detekci primární protilátky za použití fluorescentně značené sekundární protilátky a koncové značení DNA sondy biotinem, takže může být detekována fluorescentně značeným streptavidinem. Termín biologický vzorek označuje tkáně, buňky a biologické kapaliny izolované od jedince, stejně jako tkáně, buňky a kapaliny přítomné v jedinci. To znamená, že detekční metoda podle předkládaného vynálezu může být použita pro detekci PCIP mRNA, proteinu nebo genomové DNA v biologickém vzorku in vitro, stejně jako in vivo. Například, in vitro techniky pro detekci PCIP mRNA zahrnují Northernovu hybridizaci a in sítu hybridizaci. In vitro techniky pro detekci PCIP proteinu zahrnují enzymověvázané imunosorbentní testy (ELISAJ? Westernové hybridizace, imunoprecipitace a imunofluorescenční testy. In vitro techniky pro detekci PCIP genomové DNA zahrnují Southernovou
150 ·· „·· ·· ···· • · * · · · • · ··« · · · ······· « • ·· · · ·· · ·· ·· ·» ·· proteinu markérem.
• e · • · · • · · • ···· · • · ···· 4 hybridizaci. Dále, in vivo techniky pro detekci PCIP zahrnují podání značené anti-PCIP protilátky jedinci Například, protilátka může být značena radioaktivním jehož přítomnost a lokalizace v jedinci může být určena za použití standardních zobrazovacích technik.
V jednom provedení obsahuje biologický vzorek proteinové molekuly od testovaného jedince. Alternativně, biologický vzorek může obsahovat mRNA molekuly od testovaného jedince nebo genomové DNA molekuly od testovaného jedince. Výhodným biologickým vzorkem je vzorek séra nebo mozkomíšního moku izolovaný běžnými prostředky od jedince.
V jiném provedení způsoby dále zahrnují získán kontrolního biologického vzorku od kontrolního jedince, kontaktování kontrolního vzorku se sloučeninou nebo činidlem schopným detekovat PCIP protein, mRNA, nebo genomovou DNA tak, že dojde k detekci přítomnosti PCIP proteinu, mRNA nebo genomové DNA v biologickém vzorku, a srovnání přítomnosti PCIP proteinu, mRNA nebo genomové DNA v kontrolním vzorku s přítomností PCIP proteinu, mRNA nebo genomové DNA v testovaném vzorku.
Vynález také poskytuje kity pro detekování přítomnosti PCIP v biologickém vzorku. Například může kit obsahovat značenou sloučeninu nebo činidlo schopné detekovat PCIP protein nebo mRNA v biologickém vzorku; zařízení pro stanovení množství PCIP ve vzorku; a zařízení pro srovnání množství PCIP ve vzorku se standardem. Sloučenina nebo činidlo může být zabalena ve vhodném zásobníku. Kit může dále obsahovat návod k použití kitu pro detekci PCIP proteinu nebo nukleové kyseliny.
.
Prognostické testy
151 • · · · · · • · · · · · · · • ···· 9 9 99 999 9 9 · ···· ···· ·· 9 · » ·· · · ·· « ·
Popsané diagnostické způsoby mohou být dále použity pro identifikování jedinců s rizikem vzniku onemocnění nebo poruchy asociované s aberantní PCIP expresi nebo aktivitou. Například, popsané testy, jako jsou předchozí diagnostické testy nebo následující testy, mohou být použity pro identifikaci jedinců s rizikem vzniku poruchy asociované s chybnou regulací aktivity PCIP proteinu nebo exprese nukleové kyseliny, jako jsou neurodegenerativní poruchy, např. Alzheimerova nemoc, demence související s Alzheimerovou nemocí (jako je Pickova nemoc), Parkinsonova nemoc a jiné nemoci spojené s difusními Lewyho tělísky, roztroušená sklerosa, amyotrofická laterální sklerosa, progresivní supranukleární obrna, epilepsie, spinocerebellární ataxie, JakobCreutzfieldtova nemoc; psychiatrické poruchy, např. deprese, schizofrenní poruchy, Korsakoffova psychosa, mánie, úzkostné poruchy, bipolární afektivní poruchy nebo fóbie; a poruchy paměti nebo učení, např. amnesie nebo ztráta paměti související s věkem; a neurologická onemocnění, např. migréna; a bolestivá onemocnění, např. hyperalgesie nebo bolest asociovaná s mus^yloskeletálními nemocemi; poranění míchy; mrtvice; trauma hlavy; nebo kardiovaskulární onemocnění, např. dysfunkce sinusového uzlu, angína pectoris, srdeční selhání, hypertense, fibrilace síní, flutter síní, dilatační kardiomyopatie, idiopatická kardiomyopatie, infarkt myokardu, ischemická choroba srdeční, spasmus koronárních arterií nebo arytmie.
Alternativně mohou být prognostické testy použity pro identifikaci jedince majícího nebo rizikového z hlediska vzniku onemocnění asociovaného s chybnou regulací aktivity PCIP proteinu nebo exprese nukleové kyseliny, jako je onemocnění asociované s draslíkovým kanálem. Tak předkládaný vynález poskytuje způsob pro identifikaci onemocnění nebo • · · ·
152 poruchy asociované s aberantní expresí nebo aktivitou PCIP, ve kterém je testovaný vzorek získán od jedince a je detekován PCIP protein nebo nukleová kyselina (např. mRNA nebo genomová DNA), kde přítomnost PCIP proteinu nebo nukleové kyseliny je diagnostická pro existenci nebo riziko vzniku onemocnění nebo poruchy asociované s aberantní expresí nebo aktivitou PCIP u jedince. Termín testovaný vzorek označuje biologický vzorek získaný od vyšetřovaného jedince. Testovaným vzorkem může být například biologická kapalina (např. sérum), buněčný vzorek nebo tkáň.
Dále, popsané prognostické testy mohou být použity pro stanovení toho, zda může být jedinci podáno činidlo (např. agonista, antagonista, peptidomimetikum, protein, peptid, nukleová kyselin, malá molekula, nebo jiný potenciální lék) pro léčbu onemocnění nebo poruchy asociované s aberantní expresí nebo aktivitou PCIP. Například mohou být takové způsoby použity pro stanovení toho, zda může být jedinec účinně léčen činidlem pro onemocnění CNS nebo kardiovaskulárního systému. Předkládaný vynález tedy poskytuje způsob pro určení toho, zda může být jedinec účinně léčen činidlem pro poruchy asociované s aberantní expresí nebo aktivitou PCIP, ve kterém se získá testovaný vzorek a detekuje se exprese nebo aktivita PCIP proteinu nebo nukleové kyseliny (např. tehdy, když je nadměrná exprese nebo aktivita PCIP proteinu nebo nukleové kyseliny diagnostická jedince, tak může být jedinec léčen činidlem pro léčbu poruchy asociované s aberantní PCIP expresí nebo aktivitou).
Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být také použity pro detekci genetických alterací v PCIP genu, čímž se určí to, zda je jedinec s alterovaným genem rizikový z hlediska poruchy charakterizované chybnou regulací aktivity
153 • · • · · • · · · · ► · » · · · • · • ·« • ·
PCIP proteinu nebo exprese nukleové kyseliny, jako je onemocnění CNS nebo kardiovaskulární onemocnění. Ve výhodném provedení způsoby zahrnují detekování - ve vzorku buněk od jedince - přítomnosti nebo absence genetické alterace charakterizované alespoň jednou alteraci postihující integritu genu kódujícího PCIP-protein, nebo chybnou expresi PCIP geiMf. Například mohou být takové genetické alterace detekovány zjištěním existence 1) delece jednoho nebo více nukleotidů z PCIP genu; 2) adice jednoho nebo více nukleotidů k PCIP genu; 3) substituce jednoho nebo více nukleotidů PCIP genu, 4) chromosomálního přeskupení PCIP genu; 5) alterace na úrovni messengerového RNA transkriptu PCIP genu, 6) aberantní modifikace PCIP genu, jako je charakter methylace genomové DNA, 7) přítomnosti nepřirozeného sestřihu messengerového RNA transkriptu PCIP genu, 8) nepřirozenou úrovní transkripce PCIP-proteinu, 9) alelické ztráty PCIP genu, a 10) nevhodné post-translační modifikace PCIP-proteinu. V oboru existuje mnoho testů, které mohou být použity pro detekci alteraci v PCIP genu. Výhodným biologickým vzorkem je tkáň nebo sérum izolované od jedince běžným způsobem.
V některých provedeních zahrnuje detekce alterace použití sondy/primeru v polymerasové řetězové reakci (PCR) (viz např. U.S. Patenty č. 4683195 a 4683202), jako je kotvící PCR nebo RACE PCR, nebo, alternativně, v ligační řetězové reakci (LCR) (viz, např. Landegran et al. (1988) Science 241:10771080; a Nakazawa et al. (1994) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:360-364), kde druhá uvedená reakce je vhodná pro detekování bodových mutací v PCIP-genu (viz Abravaya et al. (1995)
Nucleic Acids Res .23:675-682). Tento způsob zahrnuje krok odběru vzorku buněk od jedince, izolování nukleové kyseliny (např., genomové, mRNA nebo obou) z buňky ve vzorku, kontaktování nukleové kyseliny s jedním nebo více primery,
154 • · ·
I · · · · · »· · · · · 4 » · · · 1 » ·· ·· které specificky hybridizují na PCIP gen za podmínek, při kterých probíhá hybridizace a amplifikace PCIP-genu (pokud je přítomen), a detekování přítomnosti nebo nepřítomnosti produktu amplifikace, nebo detekování velikosti amplifikačního produktu a srovnání jeho délky s kontrolním vzorkem.
Předpokládá se, že PCR a/nebo LCR mohou být použity jako první amplifikační krok společně s jakýmikoliv dalšími technikami používanými pro detekci mutací.
Mezi alternativní amplifikační způsoby patří: zpomalená replikace sekvence (Guatelli, J.C. et al., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), transkripční amplifikační systém (Kwoh, D.Y. et al., (1989) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:11731177), Q-Beta Replicase (Lizardi, P.M. et al. (1988) BioTechnology 6:1197), nebo jakákoliv jiná technika pro amplifikaci nukleové kyseliny, po které následuje detekce amplifikovaných molekul za použití technik dobře známých v oboru. Tato detekční schémata jsou zejména vhodná pro detekci molekul nukleové kyseliny, pokud jsou takové molekuly přítomny ve velmi malém počtu.
V alternativním provedení mohou být mutace v PCIP genu ze vzorku buněk identifikovány podle alterací v charakteru štěpení restrikčními enzymy. Například, vzorek kontrolní DNA se izoluje, amplifikuje se (volitelně), tráví se jednou nebo více restrikčními endonukleasami a délky fragmentů se určí gelovou elektroforesou a srovnávají se. Rozdíly v délce fragmentů mezi vzorkem a kontrolní DNA ukazují na mutace v testované DNA. Dále mohou být sekvenčně specifické ribozymy (viz. například U.S. Patent č. 5,498,531) použity pro testování přítomnosti specifických mutací podle toho, zda vzniklo nebo se ztratilo místo pro specifické štěpení ribozymem.
• · • · • ·
155
V jiném provedení mohou být genetické mutace v PCIP identifikovány hybridizaci testované a kontrolní nukleové kyseliny, např., DNA nebo RNA, na hustou sestavu obsahující stovky nebo tisíce oligonukleotidových sond (Cronin, M.T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M.J. et al.
(1996) Nátuře Medicine 2: 753-759). Genetické mutace v PCIP mohou být identifikovány na dvourozměrových čipech obsahujících světlem generované DNA sondy, jak jsou popsány v Cronin, M.T. et al., výše. Stručně řečeno, první hybridizační sestava sond může být použita pro prohledávání dlouhých řetězců DNA ve vzorku a kontrole pro identifikaci odlišnosti baží mezi sekvencemi za použití lineárních sestav sekvenčně se překrývajících sond. Tento krok umožňuje identifikaci bodových mutací. Po tomto kroku následuje použití druhé hybridizační sestavy, která umožňuje charakterizaci specifických mutací za použití menší, specializované sestavy sond komplementárních ke všem detekovaným variantám nebo mutacím. Každá sestava sond je složena z paralelní sady sond, kde jedna je komplementární k přirozenému genu a druhá k mutantnímu genu.
V ještě jiném provedení může být jakákoliv ze sekvenovacích reakcí použita pro přímé sekvencování PCIP genu a detekci mutací srovnáním sekvence testovaného PCIP genu s příslušnou normální (kontrolní) sekvencí. Příklady sekvenovacích technik jsou techniky vyvinuté Maxamem a Gilbertem ((1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74:560) nebo Sangerem ((1977) Proč. Nati. Acad. Sci. USA 74:5463). Také se předpokládá, že při provádění diagnostických testů je možno použít kteréhokoli z různých automatizovaných sekvenovacích postupů ((1995) Biotechniques 19:448), včetně sekvenování pomocí hmotové spektrometrie (viz např. PCT mezinárodní přihláška č. WO 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; a Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol.
• ·
156
38:147-159).
Jiné způsoby pro detekování mutací v PCIP genu jsou způsoby, ve kterých je chránění před štěpícími činidly použito pro detekování chybně spárovaných baží v RNA/RNA nebo RNA/DNA heteroduplexech (Myers et al. (1985) Science 230:1242).
Obecně, technika štěpení v chybných párech začíná získáním heteroduplexů tvořených hybridizací (značených) RNA nebo DNA obsahujících přirozenou PCIP sekvenci s potenciálně mutantní RNA nebo DNA získanou ze vzorku tkáně. Dvouřetězcové duplexy se zpracují činidlem, které štěpí jednořetězcové regiony duplexu, jako jsou regiony vznikající v důsledku chybného spárování baží mezi kontrolním a testovaným řetězcem. RNA/DNA duplexy mohou být zpracovány RNasou a DNA/DNA hybridy mohou být zpracovány Sl nukleasou pro enzymatické trávení chybně spárovaných regionů. V jiném provedení mohou být DNA/DNA nebo RNA/DNA duplexy zpracovány hydroxylaminem nebo tetroxidem osmičelým a piperidinem pro trávení chybně spárovaných regionů. Po trávení chybně spárovaných regionů se získaný materiál separuje podle velikosti na denaturačním polyakrylamidovém gelu pro určení místa mutace. Viz, například, Cotton et al. (1988) Proč. Nati Acad Sci USA
85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295.
Ve výhodném provedení může být kontrolní DNA nebo RNA značena pro detekci.
V ještě jiném provedení využívá reakce štěpení chybně spárovaných baží jeden nebo více proteinů, které rozpoznávají chybně spárované baze ve dvouřetězcové DNA (takzvané DNA mismatch repair enzymy) v definovaných systémech pro detekování a mapování bodových mutací v PCIP cDNA získané ze vzorku buněk. Například mutY enzym E. coli štěpí A v G/A chybných párech a thymidin-DNA glykosylasa HeLa buněk štěpí T • · • ·· ·
157 v G/T chybných párech (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis
15:1657-1662). V příkladném provedení je sonda na bázi PCIP sekvence, např.. přirozené PCIP sekvence, hybridizována na cDNA nebo jiný DNA produkt z testovaných buněk. Duplex se zpracuje DNA mismatch repair enzymem a produkt štěpení, pokud je nějaký, může být detekován pomocí elektroforesy nebo podobným způsobem. Viz například- U.S. Patent č. 5459039.
V jiném provedení se alterace v elektroforetické mobilitě použijí k identifikaci mutací v PCIP genech. Například polymorfismus konformace jednoho řetězce (SSCP) může být použit k detekci odlišností v elektroforetické mobilitě mezi mutantní a přirozenou nukleovou kyselinou (Orita et al. (1989) Proč Nati. Acad. Sci USA: 86:2766, viz též Cotton (1993)
Mutat. Res. 285:125-144; a Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79) . Jednořetězcové DNA fragmenty testované a kontrolní PCIP nukleové kyseliny se denaturují a nechají se renaturovat. Sekundární struktura jednořetězcové nukleové kyseliny závisí na sekvenci, což vede k alteracím v elektroforetické mobilitě, které umožňují detekci i jednotlivých změn baží. DNA fragmenty mohou být značené nebi mohou být detekovány značenými sondami. Sensitivita testu může být zvýšena použitím RNA (místo DNA), ve které je sekundární struktura citlivější na změny v sekvenci. Ve výhodném provedení využívá způsob podle předkládaného vynálezu analýzy heteroduplexu pro separování dvouřetězcových heteroduplexních molekul podle změn v elektroforetické mobilitě (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
V ještě jiném provedení je pohyb mutantních nebo přirozených fragmentů v polyakrylamidových gelech obsahujících gradient denaturačního činidla testován za použití gelové elektroforesy s denaturačním gradientem (DGGE) (Myers et al.
• · • ··· • · 1 • · · > ····
158 (1985) Nátuře 313:495). Když se DGGE použije jako způsob analýzy, tak je DNA modifikována pro zajištění toho, že nebude zcela denaturována, například přidáním GC „svorky délky přibližně 40 bp tvořené DNA bohatou na CG s vysokou teplotou tání pomocí PCR. V dalším provedení se teplotní gradient použije místo denaturačního gradientu pro identifikaci rozdílů v mobilitě kontrolní a testované DNA (Rosenbaum a Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).
Příklady dalších technik pro detekování bodových mutací jsou, například, selektivní oligonukleotidová hybridizace, selektivní amplifikace nebo selektivní primerová extense. Například mohou být připraveny oligonukleotidové primery, v jejichž centru je vložena známá mutace, a tyto potom hybridizují na cílovou DNA za podmínek, které umožňují hybridizací pouze tehdy, je-li přítomna perfektní shoda (Saiki et al. (1986) Nátuře 324:163); Saiki et al. (1989) Proč. Nati
Acad. Sci USA 86:6230). Takové oligonukleotidy specifické pro alely hybridizují na PCR amplifikovanou cílovou DNA nebo na množství různých mutací, když jsou oligonukleotidy navázány na hybridizační membránu a hybridizují se značenou cílovou DNA DNA.
Alternativně může být v předkládaném vynálezu použita alelicky specifická amplifikační technologie, která spočívá v selektivní PCR amplifikaci. Oligonukleotidy použité jako primery pro specifickou amplifikaci mohou nést požadované mutace v centru molekuly (takže amplifikace závisí na diferenciální hybridizací) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) nebo na 3' konci primeru, kde může chybné spárování, za vhodných podmínek, bránit nebo redukovat prodloužení polymerasou (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Dále může být žádoucí vložení nového restrikčního místa v regionu • ·· ·
159 ··· · · · · · • · · · · ··· · · · • ···· ········ · • · * · · · · · · · ···· · ·· ·· ·· ·· mutace za účelem možnosti detekce na bázi štěpení (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Předpokládá se, že v některých provedeních může být amplifikace také provedena za použití Taq ligasy pro amplifikaci (Barany (1991) Proč. Nati. Acad. Sci USA 88:189). V takových případech proběhne ligace pouze tehdy, když existuje perfektní shoda na 3' konci 5' sekvence, která umožňuje detekovat přítomnost známých mutací ve specifickém místě tak, že se vyhledává přítomnost nebo absence amplifikace.
Způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být provedeny, například, za použití předem připravených diagnostických kitů obsahující alespoň jednu nukleokyselinovou sondu nebo protilátku podle předkládaného vynálezu, kde tyto kity mohou být použity například v klinice pro diagnostiku u pacientů vykazujících příznaky nebo rodinou anamnesu onemocnění s podílem PCIP genu.
Dále, v prognostických testech podle předkládaného vynálezu může být použito jakéhokoliv typu buněk nebo tkání, ve kterých je PCIP exprimován.
3. Monitorování efektu během klinických pokusů
Monitorování vlivu činidla (např. léku) na expresi nebo aktivitu PCIP proteinu (např. modulací membránové excitability nebo klidového potenciálu) může být použito nejen při základním vyhledávání léků, ale též v klinických pokusech. Účinnost činidla objeveného ve skríningovém testu, jak je zde popsán, ve zvýšení exprese PCIP genu, koncentrace proteinu, nebo zvýšení aktivity PCIP, může být sledována v klinických pokusech u jedinců vykazujících sníženou expresi PCIP genu, koncentraci proteinu nebo sníženou aktivitu PCIP.
• 9
9 9 9 9
9 9
9
9
160 • 9 9 · • 9 9 • 9 9 9 9 • 9 9
9 9 • ·· ·
Alternativně, účinnost činidla objeveného ve skríningovém testu, jak je zde popsán, ve snížení exprese PCIP genu, koncentrace proteinu, nebo zvýšení aktivity PCIP, může být sledována v klinických pokusech u jedinců vykazujících zvýšenou expresi PCIP genu, koncentraci proteinu nebo zvýšenou aktivitu PCIP. V takových klinických pokusech může být exprese nebo aktivita PCIP genu, výhodně dalších genů, které se předpokládají u poruch asociovaných s draslíkovým kanálem, použita jako markér fenotypu určitých buněk.
Například mohou být identifikovány geny, včetně PCIP, které jsou modulovány v buňkách činidlem (např. sloučeninou, lékem nebo malou molekulou), které modulují PCIP aktivity (např. identifikované ve skríningových testech, jak jsou zde popsány výše). Tak může být pro studium efektu činidla na poruchy asociované s draslíkovým kanálem v klinických pokusech izolována buňka a z buňky připravena RNA, která může být analyzována na úroveň exprese PCIP a jiných genů, které se mohou podílet na onemocněních asociovaných s draslíkovým kanálem. Úroveň genové exprese (např. charakter genové exprese) může být kvantifikována northernovou hybridizaci nebo RT-PCR, jak je zde popsáno, nebo alternativně měřením množstvím produkovaného proteinu, za použití jedné z popsaných metod, nebo měřením aktivity PCIP nebo jiných genů. V tomto způsobu může charakter genové exprese sloužit jako markér, ukazující na fyziologickou odpověď buněk na činidlo. Tak může být tento reakční stav určen před a během léčby jedince činidlem.
Ve výhodném provedení předkládaný vynález poskytuje způsob pro sledování účinnosti léčby jedince činidlem (např.
agonistou, antagonistou, peptidomimetikem, proteinem, peptidem, nukleovou kyselinou, malou molekulou, nebo jiným • · * ·* ·
161 ·· · ·♦ ·· • · · · · · 9 9 9
9 9 9 9999 9 9 9
9999 99 99 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 9 99 99 99 99 potenciálním lékem identifikovaným skríningovým testem podle předkládaného vynálezu), který zahrnuje kroky (i) získání vzorku od jedince před podáním činidla; (ii) detekování úrovně exprese PCIP proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorku získaném před podáním; (iii) získání jednoho nebo více vzorků od jedince po podání činidla; (iv) detekování úrovně exprese nebo aktivity PCIP proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorcích získaných po podání; (v) srovnání úrovně exprese nebo aktivity PCIP proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorku před podáním s expresí nebo aktivitou PCIP proteinu, mRNA nebo genomové DNA ve vzorku po podání činidla; a (ví) podle toho změnění podávání činidla jedinci. Například, zvýšení aplikace činidla může být žádoucí pro zvýšení exprese nebo aktivity PCIP na vyšší hladiny, než jsou detekované hladiny, tj. pro zvýšení účinnosti činidla. Alternativně, snížení aplikace činidla může být žádoucí pro snížení exprese nebo aktivity PCIP na nižší hladiny, než jsou detekované hladiny, tj. pro snížení účinnosti činidla. V takovém provedení může být PCIP exprese nebo aktivita použita jako indikátor účinnosti činidla, i za nepřítomnosti pozorovatelné fenotypové reakce.
D. Způsoby léčby:
Předkládaný vynález poskytuje jak profylaktické, tak terapeutické způsoby léčby jedince rizikového (nebo citlivého na) poruchy nebo majícího onemocnění asociované s aberantní PCIP expresí nebo aktivitou. Profylaktické a terapeutické způsoby léčby mohou být specificky upraveny nebo modifikovány podle znalostí získaných v oboru farmakogenomiky. Termín farmakogenomika, jak je zde použit, označuje použití genomových technologií, jako je genové sekvenování, statistická genetika a analýza genové exprese, na klinicky vyvíjené a na prodávané léky. Přesněji tento termín označuje ·· ♦ • · ·
• ·· • · • '
162 • · · » • ··♦· · · výzkum toho, jak geny pacienta určuji jeho reakci na lék (např. fenotyp odpovědi pacienta na lék, nebo genotyp odpovědi pacienta na lék). Tak v dalším aspektu předkládaný vynález poskytuje způsoby pro individuální modifikaci profylaktické nebo terapeutické léčby PCIP molekulami podle předkládaného vynálezu nebo PCIP modulátory podle genotypu odpovědi pacienta na lék. Farmakogenomika umožňuje lékařům cíleně aplikovat profylaktické nebo terapeutické léčby pacientům, kteří budou mít největší prospěch z takové léčby a zabránit léčbě u pacientů, kteří by měly toxické nežádoucí účinky související s léčbou.
1. Profylaktické způsoby
V jednom aspektu vynález poskytuje způsob pro prevenci onemocnění nebo stavu asociovaného s aberantní PCIP expresí nebo aktivitou u jedince, ve kterém je jedinci podán PCIP nebo činidlo modulující PCIP expresi nebo alespoň jednu PCIP aktivitu. Jedinci rizikový z hlediska onemocnění, které je způsobeno nebo ovlivněno aberantní PCIP expresí nebo aktivitou, mohou být identifikování například jedním nebo kombinací diagnostických nebo prognostických testů podle předkládaného vynálezu. Podání profylaktického činidla může být provedeno před manifestací příznaků charakteristických pro poruchu v PCIP, takže je onemocnění zabráněno nebo alternativně - je zpomalena jeho progrese. Podle typu PCIP aberance může být pro léčbu jedince použito PCIP, PCIP agonisty nebo PCIP antagonisty. Vhodné činidlo může být vybráno za použití testů podle předkládaného vynálezu.
2. Terapeutické způsoby
Jiný aspekt podle předkládaného vynálezu se týká způsobů *· · ·« ·* *·· · » « · · · • · · · 9 9 9 •999*99 99 999 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 K 9 9
163 modulování PCIP exprese nebo aktivity pro terapeutické účely.
V souladu s tím v příkladném provedení modulační způsob podle předkládaného vynálezu zahrnuje kontaktování buňky s PCIP nebo činidlem, které moduluje jednu nebo více aktivit PCIP proteinu asociovanými s buňkami. Činidlem, které moduluje aktivity PCIP proteinu, může být zde popsané činidlo, jako je nukleová kyselina nebo protein, přirozená cílová molekula PCIP proteinu (např.· PCIP substrát), PCIP protilátka, PCIP agonista nebo antagonista, peptidomimetikum PCIP agonisty nebo antagonisty, nebo jiná malá molekula. V jednom provedení činidlo stimuluje jednu nebo více PCIP aktivit. Příklady takových stimulačních činidel jsou aktivní PCIP protein a molekula nukleové kyseliny kódující PCIP, která byla vložena do buňky. V jiném provedení činidlo inhibuje jednu nebo více PCIP aktivit. Příklady takových inhibičních činidel jsou protismyslné PCIP molekuly nukleové kyseliny, anti-PCIP protilátky a PCIP inhibitory.
Tyto modulační způsoby mohou být provedeny in vitro (např. kultivací buněk s činidlem) nebo alternativně in vivo (např. podáním činidla jedinci). Předkládaný vynález tak poskytuje způsoby léčby jedince postiženého onemocněním nebo poruchou charakterizovanou aberantní expresí nebo aktivitou PCIP proteinu nebo molekuly nukleové kyseliny. Příklady takových poruch jsou onemocnění CNS, jako jsou neurodegenerativní poruchy, např. Alzheimerova nemoc, demence související s Alzheimerovou nemocí (jako je Pickova nemoc), Parkinsonova nemoc a jiná onemocnění spojená s difušními Lewyho tělísky, roztroušená sklerosa, amyotrofická laterální sklerosa, progresivní supranukleární obrna, epilepsie, spinocerebellární ataxie a Jakob-Creutzfieldtova nemoc; psychiatrická onemocnění, např. deprese, schizofrenní poruchy, Korsakoffova psychosa, mánie, úzkostné poruchy nebo fóbie; poruchy učení nebo paměti, např., amnesie nebo ztráta paměti související s věkem; a neurologická onemocnění; např..
·♦ ·«··
164 ·· ·
Ί · · A • · · · • ···· # · • · ·
Α«Α· 4 ·♦ • · « · ♦ • ··♦ * · V • · · · · · · • · · · · A · •» A A · « migréna, bolestivá onemocnění, například hyperalgesie nebo bolest spojená s muskuloskeletálními nemocemi; poranění míchy; mrtvice; a trauma hlavy; nebo kardiovaskulární onemocnění, např., arteriosklerosa, ischemické reperfusní poškození, restenosa, arteriální zánět, remodelování cévní stěny, remodelování komor, rychlý komorový rytmus, koronární mikroembolie, tachykardie, bradykardie, hypertense, aneurysma aorty, ligace koronární arterie, ischemická nemoc srdeční, fibrilace síní, syndrom dlouhého QT, městnavé srdeční selhání, dysfunkce sinusového uzlu, angína pectoris, hypertense, flutter síní, dilatační kardiomyopatie, idiopatická kardiomyopatie, infarkt myokardu, spasmus koronárních arterií nebo arytmie. V jednom provedení způsob zahrnuje podání činidla (např. činidla identifikovaného skríningovým testem podle předkládaného vynálezu), nebo kombinace činidel, které modulují (např. zvyšují nebo snižují) PCIP expresi nebo aktivitu. V jiném provedení způsob zahrnuje podání PCIP proteinu nebo molekuly nukleové kyseliny za účelem kompenzování snížené nebo aberantní exprese nebo aktivity PCIP.
Výhodným provedením předkládaného vynálezu je způsob pro léčbu onemocnění nebo poruchy asociované s PCIP, který zahrnuje podání terapeuticky účinného množství PCIP protilátky jedinci. Jak je zde definováno, je terapeuticky účinné množství protilátky (t.j. účinná dávka) v rozmezí přibližně 0,001 až 30 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodně přibližně 0,01 až 25 mg/kg tělesné hmotnosti, výhodněji přibližně 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, a ještě výhodněji přibližně 1 až 10 mg/kg, 2 až 9 mg/kg, 3 až 8 mg/kg, 4 až 7 mg/kg, nebo 5 až 6 mg/kg tělesné hmotnosti. Odborníkům v oboru bude jasné, že některé faktory mohou ovlivňovat dávku nutnou pro účinnou léčbu jedince, například závažnost onemocnění nebo poruchy,
• · ·· · · ···· • · « · · · • ···· · · · ······· · • · · · · ·· * • · · · · · · · předešlá léčba, celkový zdravotní stav jedince a/nebo věk jedince, a přítomnost dalších onemocnění. Dále, léčba jedince terapeuticky účinným množstvím protilátky může zahrnovat jedinou dávku, nebo může označovat opakovanou aplikaci. Ve výhodném příkladu je jedinec léčen protilátkou v dávce přibližně 0,1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti, jednou za týden, po dobu přibližně 1 až 10 týdnů, výhodně 2 až 8 týdnů, výhodněji přibližně 3 až 7 týdnů, a ještě výhodněji přibližně 4, 5 nebo 6 týdnů. Je také třeba si uvědomit, že účinná dávka protilátky použitá pro léčbu se může zvyšovat či snižovat v průběhu jedné léčby. Změny dávkování mohou vyplynout z výsledků diagnostických testů, jak jsou zde popsány.
Stimulace PCIP aktivity je žádoucí v situacích, kdy je PCI abnormálně downregulován a/nebo když je pravděpodobné, že zvýšená aktivita PCIP bude mít pozitivní účinek. Například, stimulace PCIP aktivity je žádoucí v situacích, ve kterých je PCIP downregulován a/nebo když je pravděpodobné, že zvýšená aktivita PCIP bude mít pozitivní účinek. Obdobně, inhibice PCIP aktivity je žádoucí v situacích, kdy je PCI abnormálně upregulován a/nebo když je pravděpodobné, že snížení aktivity PCIP bude mít pozitivní účinek.
3. Farmakogenomika
PCIP molekuly podle předkládaného vynálezu, stejně jako činidla nebo modulátory, které mají stimulační nebo inhibiční účinek na PCIP aktivitu (např. expresi PCIP genu), identifikovaná skríningovými testy podle předkládaného vynálezu, mohou být podána jedincům pro léčbu (profylaktickou nebo terapeutickou) poruch asociovaných s draslíkovým kanálem asociovaných s aberantní PCIP aktivitou (jako jsou onemocnění
CNS, např. neurodegenerativní poruchy, např. Alzheimerova
166 nemoc, demence související s Alzheimerovou nemocí (jako je Pickova nemoc), Parkinsonova nemoc a jiná onemocnění spojená s difusními Lewyho tělísky, roztroušená sklerosa, amyotrofická laterální sklerosa, progresivní supranukleární obrna, epilepsie, spinocerebellární ataxie a Jakob-Creutzfieldtova nemoc; psychiatrická onemocnění, např. deprese, schizofrenní poruchy, Korsakoffova psychosa, mánie, úzkostné poruchy nebo fóbie; poruchy učení nebo paměti, např. amnesie nebo ztráta paměti související s věkem; a neurologická onemocnění; např., migréna, bolestivá onemocnění, například hyperalgesie nebo bolest spojená s muskuloskeletálními nemocemi; poranění míchy; mrtvice; a trauma hlavy; nebo kardiovaskulární onemocnění, např., arteriosklerosa, ischemické reperfusní poškození, restenosa, arteriální zánět, remodelování cévní stěny, remodelování komor, rychlý komorový rytmus, koronární mikroembolie, tachykardie, bradykardie, hypertense, aneurysma aorty, ligace koronární arterie, ischemická nemoc srdeční, fibrilace síní, syndrom dlouhého QT, městnavé srdeční selhání, dysfunkce sinusového uzlu, angína pectoris, hypertense, flutter síní, dilatační kardiomyopatie, idiopatická kardiomyopatie, infarkt myokardu, spasmus koronárních arterií nebo arytmie). Při takové léčbě může být použita farmakogenomika (t.j. výzkum vztahů mezi genotypem jedince a jeho reakcí na cizorodé sloučeniny nebo léky). Odlišnosti v metabolismu terapeutických činidel mohou vést k závažné toxicitě nebo terapeutickému selhání v důsledku změněných vztahů mezi dávkou a koncentrací farmakologicky aktivního léku v krvi. Tak může lékař použít znalostí získaných v relevantních farmakogemických studiích k určení toho, zda podat PCIP molekulu nebo PCIP modulátor, stejně jako pro úpravu dávky a/nebo terapeutického režimu PCIP molekuly nebo PCIP modulátoru.
167 •4 4 4* 44 • 44 444 44 ·
444 4 4444 4 4 4
4444444 44 444 4 4 • 4 4444 4444
4444 4 44 44 · 4 44
Farmakogemika se zabývá klinicky významnými hereditárními variacemi v reakci na lék způsobenými různými metabolismy léku a jeho abnormálními účinky u postižených osob. Viz například Eichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.
23(10-11) :983-985 a Linder, M.W. et al. (1997) Clin. Chem.
43(2):254-266. Obecné lze rozlišovat dva typy farmakogenomických stavů. Genetické dispozice ovlivňující působení léku na tělo (pozměněný účinek léku) nebo genetické dispozice ovlivňující působení těla na lék (pozměněný metabolismus léku). Tyto farmakogenomické dispozice se mohou vyskytovat buď v důsledku vzácných genetických defektů, nebo v důsledku přirozených polymorfismů. Například deficit glukosa-6-fosfát-dehydrogenasy (G6PD) je běžnou dědičnou enzymopatií, při které je hlavní klinickou komplikací hemolýza po požití oxidačních léků (antimalarik, sulfonamidu, analgetik, nitrofuranů) a po požití bobů.
Jeden farmakogenomický přístup pro identifikaci genů, které určují reakci na lék, známý jako přirozená asociace s genomem, spočívá primárně ve vysoce přesném mapování lidského genomu za použití známých markérů asociovaných s geny (např. bi-alelické genové markerové mapy, která se skládá z 60 000 až 100 000 polymorfních nebo variabilních míst na lidském genomu, kde každý z nich má dvě varianty). Taková genetická mapa s vysokým rozlišením může být srovnána s mapou genomu každého ze statisticky významného počtu pacientů zařazených do klinických studií fáze II/III za účelem identifikace markérů asociovaných s pozorovaným účinkem léku nebo vedlejším účinkem. Alternativně může být taková mapa s vysokým rozlišením připravena kombinováním nějakých 10 milionů známých polymorfismů jediného nukleotidu (SNP) v lidském genomu. SNP označuje běžné alterace, které se vyskytují v jediné nukleotidové bázi v řetězci DNA. Například se SNP může «* * ··» · ·· · 99 91
9 1 4 4* » · * 1ro ··· 9 9 999 «··
168 ····»·♦ 1 9 9 9 9 9 « • · 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 9 ·· 99 Λ 9 99 vyskytovat jednou na každých 1000 baží DNA. SNP se může podílet na onemocnění, většinou však nemusí s onemocněním souviset. Při znalosti genetické mapy na bázi výskytu takových SNP mohou být jedinci zařazeni do jednotlivých genetických kategorií podle konkrétního charakteru SNP v jejich genomu. Takovým způsobem mohou být léčebné režimy upraveny pro určité skupiny geneticky podobných jedinců, ve kterých se berou v úvahu rysy, které mohou být společné pro takové geneticky podobné jedince.
Alternativně může být pro identifikaci genů, které určují reakci na lék, použita metoda označovaná jako technika kandidátního genu. Pokud je v tomto způsobu gen kódující cíl pro lék znám (např. PCIP protein podle předkládaného vynálezu), mohou být snadno identifikovány všechny varianty tohoto genu v populaci a může být určeno, zda je jedna verze genu ve srovnání s jinou asociovaná s určitou reakcí na lék.
V ilustrativním provedení je aktivita enzymů metabolizujících lék hlavní determinantnou jak intenzity, tak trvání účinku léku. Objev genetického polymorfismu enzymů metabolizujících lék (např., N-acetyltransferasy 2 (NAT 2) a cytochrom P450 enzymů CYP2D6 a CYP2C19) poskytl vysvětlení toho, proč u některých pacientů nejsou patrné účinky léku a nebo jsou u nich excesivní účinky a závažná toxicita po podání standardních a bezpečných dávek léku. Tyto polymorfismy jsou v populaci vyjádřeny ve dvou fenotypech, rychlých metabolizátorech (EM) a pomalých metabolizátorech (PM). Prevalence PM je různá v různých populacích. Například gen kódující CYP2D6 je vysoce polymorfní a u PM bylo identifikováno několik mutací, které všechny vedou k absenci funkčního CYP2D6. Pomalí metabolizátoři CYP2D6 a CYP2C19 mají dosti často nadměrnou reakci na lék a vážné nežádoucí účinky
·· · • · ·
169 • · · · po podání standardních dávek. Pokud je metabolit aktivní terapeutickou skupinou, pak nevykazují PM žádnou terapeutickou odpověď, jak bylo prokázáno pro analgetickký efekt kodeinu zprostředkovaný CYP2D6-tvořeným metabolitem morfinem. Jiným extrémem jsou takzvaní ultra-rychlí metabolizátoři, kteří nereagují na standardní dávky. Nedávno byla identifikována molekulární příčina ultrarychlého metabolismu, kterou je amplifikace CYP2D6 genu.
Alternativně může být použit pro identifikaci genů, které určují odpověď na lék, způsob označovaný jako profilování genové exprese. Například genová exprese u zvířete, kterému byl podán lék (např. PCIP molekula nebo PCIP modulátor podle předkládaného vynálezu) může ukázat, které genové dráhy vedoucí k toxické reakci byly spuštěny.
Informace získané z jednoho nebo více uvedených farmakogemických postupů mohou být použity pro určení vhodné dávky terapeutického režimu pro profylaktickou nebo terapeutickou léčbu jedince. Tyto znalosti mohou při použití pro stanovení dávky nebo výběru léku, zabránit nežádoucím účinkům nebo terapeutickému selhání a tak mohou zvýšit terapeutickou nebo profylaktickou účinnost při léčbě jedince PCIP molekulou nebo PCIP modulátorem, jako je modulátor identifikovaný při použití jednoho ze skríningových testů podle předkládaného vynálezu.
4. Použití PCIP molekul jako doplňkových markérů
PCIP molekuly podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné jako markéry onemocnění nebo poruch, jako markéry předchorobí pro onemocnění, jako markéry pro predispozici k onemocnění, jako markéry pro aktivitu léku, nebo jako markéry
170
• · · • · · • · · · · · • · • · · · 0 farmakogenetického profilu jedince. Za použití způsobů podle předkládaného vynálezu může být detekována přítomnost, absence a/nebo kvantita PCIP molekul podle předkládaného vynálezu, a může být korelována s jedním nebo více biologickými stavy in vivo. Například PCIP molekuly podle předkládaného vynálezu mohou sloužit jako doplňkové markéry pro jednu nebo více poruch nebo onemocnění nebo pro podmínky vedoucí k onemocněním.
Termín doplňkový markér označuje objektivní biochemický markér, který koreluje s absencí nebo přítomností onemocnění nebo poruchy, nebo s progresí onemocnění nebo poruchy (např. s přítomností nebo absencí tumoru). Přítomnost nebo kvantita takových markérů je nezávislá na příčině onemocnění. Proto mohou tyto markéry sloužit k tomu, aby ukazovaly, zda je určitá léčba účinná z hlediska onemocnění nebo poruchy. Doplňkové markéry jsou používány zejména tehdy, když je rozsah nebo přítomnost onemocnění nebo poruchy obtížně hodnotitelná za použití standardních metod (např. u časných stadií nádorů), nebo když je hodnocení progrese onemocnění žádoucí před tím, než je dosaženo potenciálně nebezpečného klinického výsledku (např. hodnocení kardiovaskulárního onemocnění může být provedeno za použití koncentrace cholesterolu jako doprovodného markéru, a analýza HIV infekce může být provedena za použití koncentrací HIV RNA jako doprovodného markéru, dobře vypovídajícího o klinickém riziku infarktu myokardu nebo plně rozvinutého AIDS). Příklady použití doprovodných markérů jsou uvedeny v: Koomen et al. (2000) J. Mass. Spectrom. 35:258-264; a James (1994) AIDS Treatment News Archive 209.
PCIP molekuly podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné jako farmakodynamické markéry. Termín farmakodynamický markér, jak je zde použit, označuje
objektivní biochemický markér, který specificky koreluje s účinky léku. Přítomnost nebo kvantita farmakodynamického markéru nesouvisí s onemocněním nebo poruchou, pro kterou je lék aplikován; proto je přítomnost nebo kvantita markéru ukazatelem přítomnosti nebo aktivity léku u jedince.
Například, farmakodynamický markér může ukazovat na koncentraci léku v biologické tkáni v tom smyslu, že markér je buď exprimován nebo transkribován, nebo neexprimován nebo netranskribován v dané tkáni v závislosti na koncentraci léku. Tímto způsobem může být pomocí farmakodynamického markéru sledována distribuce nebo vychytávání léku. Obdobně, přítomnost nebo kvantita farmakodynamického markéru může být závislá na přítomnosti nebo kvantitě metabolického produktu léku, takže přítomnost nebo kvantita markéru ukazuje na relativní rychlost degradace léku in vivo. Farmakodynamické markéry jsou zejména vhodné pro použití ve zvýšení sensitivity detekce účinků léku, zejména tehdy, když je lék podáván v nízkých dávkách. Protože i malé množství léku může být dostatečné pro aktivaci opakovaných kol transkripce nebo exprese markéru (např. PCIP markéru), může být amplifikovaný markér přítomen v kvantitě, která je snáze detekovatelná než lék samotný. Markér může být také snáze detekovatelný v důsledku charakteru markéru samotného; například, za použití způsoby podle předkládaného vynálezu mohou být anti-PCIP protilátky použity v imunitním detekčním systému pro PCIP proteinový markér, nebo mohou být PCIP-specifické radioaktivně značené sondy použity pro detekci PCIP mRNA markéru. Dále, použití farmakodynamického markéru může poskytnout další predikci rizika léčby při použití vyšších dávek. Příklady použití farmakodynamických markérů jsou uvedeny v: Matsuda et al. US 6033862; Hattis et al. (1991) Env. Health Perspect.
90:229-238; Schentag (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm. 56
Suppl. 3:S21-S24; a Nicolau (1999) Am. J. Health-Syst. Pharm.
• ··« « · « ·♦ to
172
Suppl. 3:S16-S20.
PCIP molekuly podle předkládaného vynálezu jsou také použitelné jako farmakogenomové markéry. Termín farmakogenomový markér označuje objektivní biochemický markér, který koreluje se specifickou klinickou odpovědí na lék nebo s citlivostí jedince (viz, např., McLeod et al.
(1999) Eur. J. Cancer 35(12):1650-1652). Přítomnost nebo kvantita farmakogenomového markéru souvisí s předpokládanou reakcí jedince na specifický lék nebo třídu léků před podáním léku. Hodnocením přítomnosti nebo kvantity jednoho nebo více farmakogenomových markérů u jedince je možné určit lék, který je nejvhodnější pro terapii jedince, nebo lék, o kterém se předpokládá, že bude mít největší úspěšnost. Například, podle přítomnosti nebo kvantity RNA nebo proteinu (např., PCIP proteinu nebo RNA) pro specifické nádorové markéry u jedince může být vybrána optimální léčba jedince se specifickým nádorem, který je přítomen u jedince. Obdobně, přítomnost nebo absence specifické mutace v PCIP DNA může korelovat s reakcí na PCIP. Použití farmakogenomových markérů tedy umožňuje výběr nejvhodnější léčby pro jedince bez nutnosti aplikovat terapii.
Předkládaný vynález je dále ilustrován v následujících příkladech, které nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Obsah všech citací, patentů a publikovaných patentových přihlášek je zde uveden jako odkaz ve své úplnosti
Příklady provedení vynálezu
Následující materiály a způsoby byly použity v příkladech.
Kmeny, plasmidy, záchytná cDNA a obecné mikrobiologické
φ « • φφφ
173 φ φ • φ φφφφ · • ·«»« techniky
Základní kvasinkové kmeny (HF7c, Y187,), záchytné (pGBT9) a zychycované (pACT2) plasmidy použité v příkladech byly zakoupeny od Clontech (Palo Alto, CA). cDNA kódující krysí Kv4.3, Kv4.2, a Kvl.l, byly získány od Wyeth-Ayerst Research (865 Ridge Rd., Monmouth Junction, NJ 08852). Standardní kvasinkové medium, včetně syntetického kompletního media bez L-leucinu, L-tryptofanu, a L-histidinu, se připravilo známým způsobem genetické manipulace s kvasinkami byly provedeny známým způsobem (Sherman (1991) Meth. Enzymol. 194:3-21). Transformace kvasinek byly provedeny za použití standardních protokolů (Gietz et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:1425; Ito et al (1983) J. Bacteriol. 153:163-168). Plasmidové DNA se izolovaly z kvasinkových kmenů za použití standardních metod (Hoffman a Winston (1987) Gene 57:267-272).
Konstrukce záchytného a kvasirtového kmenu
Prvních 180 aminokyselin rKv4.3 (jak je popsán v Serdio P. et al. (1996) J. Neurophys 75:2174-2179) se amplifikovalo PCR a klonovaly se v rámci do pGBT9 za zisku plasmidů pFWA2, (dále záchytný plasmid). Tento záchytný plasmid se transformoval do 2-hybridního skríningového kmene HF7c a testoval se na expresi a samoaktivaci. Záchytný plasmid se ověřil pro expresi za použití Westernové hybridizace. rKv4.3 záchytný plasmid se sám neaktivoval za přítomnosti 10 mM 3-amino-l,2,3-triazolu (3-AT).
Konstrukce knihovny
Tkáň krysího středního mozku se získala od Wyeth-Ayerst
Research (Monmouth Junction, NJ). Celková buněčná RNA byla • 4 « • · • · 4 »» »4 • 4 4
·« ···<
174 • · ·« * • · · • · · ·· ·« extrahována ze tkání za použití standardních technik (Sambrook, J., Fritsh, E. F., a Maniatis, T. Molecular
Cloning: A Laboratory Manual. 2.vydání, Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)). mRNA se připravila za použití Poly-A Spin mRNA Isolation Kitu od New England Biolabs (Beverly, MA). cDNA z mRNA vzorku se syntetizovala za použití cDNA Synthesis Kitu od Stratagene (La Jolla, CA) a ligovala se do pACT2's EcoRI a Xhol míst, za zisku 2-hybridní knihovny.
2-hybridní skríning
2-hybridní skríning se provedl v podstatě způsobem popsaným v Bartel, P. et al. (1993) Using the Two-hybrid
System to Detect Polypeptide-Polypeptide Interactions v Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, Hartley, D.A. ed. Oxford University Press, Oxford, str. 153179, s párem záchytné činidlo - knihovna rkv4.3 záchytné činidlo-krysí knihovna středního mozku. Beta-galaktosidasový (beta-gal) test na filtračním disku se provedl v podstatě způsobem popsaným výše (Brill et al. (1994) Mol. Biol. Cell.
5:297-312). Klony, které byly pozitivní na aktivitu obou reportérových genů (His a beta-galaktosidasy) se skórovaly a vybrané plasmidy se izolovaly z kvasinek, transformovaly se do E. coli kmene KC8, DNA plasmidy se přečistily a získané plasmidy se sekvenovaly běžnými způsoby (Sanger F. et al.
(1977) PNAS, 74: 5463-67).
Test specificity
Pozitivně interagující klony se testovaly v testu specificity vazby, kde byly vystaveny působení panelu příbuzných a nepříbuzných záchytných činidel za použití dříve • ·· ·
175 • · · · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · · · · • ······ ·· ··· · • · · · · · ·· •·· · ·· · · ·· popsaného schématu párování (Finley R.L. Jr. et al. (1994)
PNAS, 91(26):12980-12984). Stručně, pozitivní rybí plasmidy se transformovaly do Y187 a panel záchytných činidel se transformoval do HF7c. Transformované rybí a záchytné buňky se natřely jako proužky na plotny se selektivním mediem, párovaly se na YPAD plotnách a testovaly se na aktivitu reporterového genu.
Analýza
PCIP nukleotidy se analyzovaly na odpovídající nukleotidy pomocí BLASTN 1.4.8MP programu (Altschul et al. (1990) Basic
Local Alignment Search Tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410).
PCIP proteiny se analyzovaly na odpovídající polypeptidy za použití BLASTP 1.4.9MP programu.
Elektrofyziologické způsoby
Savčí in vitro studie
HEK 293 a CHO buňky byly použity pro pokus 1-3 dny po přechodné transfekci. Proudy v celých buňkách se snímaly z buněk exprimujících GFP, identifikovaných podle zelené fluorescence. Elektrody vystrčené z vláknitého borosilikátového skla (Sutter Instrument Co, Novato, CA) měly počáteční odpor 3-5 MOhmů. Po Gigaseal a konfiguraci rupturovaných celých buněk byl odpor menší než 10 MOhms. Roztoky s celými buňkami se vyrobily z 10X Hankova vyváženého salinického roztoku (GibcoBRL) s následujícími koncentracemi (v mM) : 138 NaCl, 5,4 KCI, 1,3 MgCl2, 1,3 CaCl2, 5,5 Dglukosy a 10 HEPES, pH 7,4. Intracelulární elektrodový roztok se skládal z (v mM) 140 KCI, 10 HEPES, 10 EGTA, 0,5 MgCl2, pH 7,3. Všechna chemická činidla byla od Sigma (St. Louis, MO) • · ·
9 9 9
9999 9 9
176
999 9 nebo Fisher Scientific (Houston, TX). Membránové proudy byly zaznamenávány za použití EPC9 zesilovače s kontaktními svorkami (HEKÁ, Germany). Data byla analyzována za použití Matlab (Natick, Ma), a byla odečtena, pokud to bylo nutné. Všechny pokusy byly provedeny při teplotě místnosti.
Pokusy na Xenopus oocytech
Na žábách nebyly provedeny více než dva chirurgické zákroky a zákroky byly provedeny za použití běžných technik. Žáby byly uvedeny do anestesie ledem. Celková cRNA (1-10 ng) se injikovala do Xenopus oocytů stadia IV, které se odebraly předešlý den. Xenopus oocyty se inkubovaly v ND96 obsahujícím (v mM) 96 NaCl, 2 KC1, 1,8 CaCl2, 1 MgCl2, 5 HEPES, pH 7,6, plus (Gentamycin 50 pg/ml) při 18°C. Xenopus oocyty se studovaly 3-7 dnů po injekci. Záznamy napětí ze dvou elektrod se provedly v ND96 roztoku za použití TURBO TEC 03 Clamp Amplifier (ALA Scientific Instruments, Westbury, NY). Obě elektrody byly naplněny 3 M KC1 a měly odpory v rozmezí od 0,2-1 MOhm. Proudové signály se filtrovaly při 1000 Hz před tím, než se přenesly na PC (Gateway, CA) za použití PULSE softwaru (HEKÁ, Germany).
Příklad 1: Identifikace krysí PCIP cDNA
Kv4.3 genová kódující sekvence (kódující prvních 180 aminokyselin) se amplifikovala PCR a klonovala se do pGBT9 za vzniku GAL4 DNA-vazebná doména-Kv4.3(1-180) genové fúze (plasmid pFWA2). HF7c se transformovaly tímto konstruktem. Získaný kmen rostl na syntetickém kompletním mediu bez Ltryptofanu, ale ne na syntetickém kompletním mediu bez Ltryptofanu a L-histidinu za přítomnosti lOmM 3-AT, což • · • · • ·
177 ··· ··· · · · • · · 9 9 999 9 9 9 • 9999 9 9 99 999 9 « * · ···· ···· ···· · ·· ·· ·· 9 9 ukazuje, že {GAL4 DNA-vazebná doména}-{vKv4.3(1-180)} genová fúze nemá vnitřní aktivitu pro aktivaci transkripce vyšší než je práh umožněný 10 mM 3-AT.
V tomto příkladu se provedl kvasinkový 2-hybridový test, ve kterém byl plasmid obsahující {GAL4 DNA-vazebná doména}{rKv4.3(1-180)} fúzní gen vložen do kvasinkového 2-hybridního skríningového kmene HF7c, jak byl popsán výše. HF7c se potom transformoval krysí 2-hybridní knihovnou středního mozku.
Získalo se přibližně šest milionů transformantů, které se umístily na selekční medium. Kolonie, které rostly na selekčním medium a exprimovaly beta-galaktosidasový reporterový gen se dále charakterizovaly a podrobily se retransformaci a testu specificity. Retransformace a testy specificity vedly k zisku tří PCIP klonů (Krysí lv, 8t, a 9qm), které byly schopny vázat se na Kv4.3 polypeptid.
Kompletní sekvence pro krysí lv gen a částečné sekvence pro 8t a 9q geny se identifikovaly následujícím způsobem. Částečné krysí PCIP sekvence byly použity pro přípravu sond, které byly potom použity pro prohledávání například krysí cDNA knihovny středního mozku. Pozitivní klony se identifikovaly, amplifikovaly a sekvenovaly za použití standardních technik, za zisku kompletní sekvence. Dále, rychlá amplifikace existujících konců krysí PCIP cDNA (za použití, například, 5' RACE, Gibco, BRL) se použila k dokončení 5' konce transkriptů.
Příklad 2: Identifikace lidské lv cDNA
Pro získání lidské lv molekuly nukleové kyseliny se cDNA knihovna připravená z lidského hippocampu (Clontech, Palo
Alto, CA) vyšetřovala za málo přísných podmínek následujícím
178 • · · · · • · · · · · « · · • · · · · · · · · · · ······· ·· · · · · · • · ···· ···· ···· · ·· ·· ·· ·· způsobem: prehybridizace po dobu 4 hodin při 42°C v Clontech Express Hyb roztoku, potom hybridizace přes noc při 42°C.
Použitou sondou byl PCR-generovaný fragment, včetně nukleotidů 49-711 krysí sekvence, značený 32p dCTP. Filtry byly promyty 6-krát ve 2XSSC/0,l% SDS při 55°C. Stejné podmínky byly použity pro sekundární skríning pozitivních izolátů. Takto získané klony se sekvenovaly za použití ABI automatizovaného DNA sekvenovacího systému, a sekvence se srovnávaly s krysí sekvencí uvedenou v SEQ ID NO:3, stejně jako se známými sekvencemi z GenBank databáze. Největší klon z knihovny se potom subklonoval do pBS-KS+ (Stratagene, La Jolla, CA) pro ověření sekvence. Bylo určeno, že klon velikosti 515 párů baží reprezentuje lidský homolog lv genu, obsahující 211 páru baží z 5' UTR a 304 párů baží velký kódující region. Pro přípravu kompletní cDNA se použila 3' RACE podle návodu výrobce (Clontech Advantage PCR kit).
Příklad 3: Izolace a charakterizace variant lv s alternativním sestřihem
Myší lv sekvence uvedená v SEQ ID NO:5 a krysí lvi varianta s alternativním sestřihem uvedená v SEQ ID NO:7 se izolovaly za použití 2-hybridového testu, jak je popsáno v příkladu 1. Myší lvi varianta s alternativním sestřihem uvedená v SEQ ID NO: 7 se izolovala skríningem myší mozkové cDNA knihovny, a krysí lvn varianta s alternativním sestřihem uvedená v SEQ ID NO:11 se izolovala BLAST vyhledáváním.
Příklad 4: Izolace a identifikace 9Q a dalších PCIP
Krysí 9ql (SEQ ID NO: 15) se izolovala z databáze, krysí
9qm (SEQ ID NO: 21) se izolovala 2-hybridovým testem a krysí
9qc (SEQ ID NO:27) se identifikovala z databáze. Lidský 9ql
179 • 9 ·
9 9 9 (SEQ ID NO: 13) a lidský 9qs (SEQ ID NO: 23) se identifikovaly způsobem popsaným v příkladu 2. Myší 9ql (SEQ ID NO:17), opičí 9qs (SEQ ID NO:25), lidský pl93 (SEQ ID NO:39), krysí pl9 (SEQ ID NO:33) a myší pl9 (SEQ ID NO:35) se identifikovaly z databáze. Krysí 8t (SEQ ID NO:29) se identifikoval za použití 2-hybridového testu. Sekvence W28559 (SEQ ID NO:37) se identifikovala z databáze a sekvencováním identifikovaného EST s Genbank přírůstkovým číslem AI352454. Zjistilo se, že proteinová sekvence obsahuje 41 aminokyselinový region se silnou homologii s lv, 9ql a pl9 (viz seřazení na obr. 25). Nicméně, za tímto homoíogním regionem se sekvence odlišuje od sekvencí PCIP rodiny. Tato sekvence může reprezentovat gen, který má 41 aminokyselinovou doména s homologii k podobné doméně vyskytující se v členech PCIP rodiny.
Lidské genomové 9q sekvence (SEQ ID NO:46 a 47) se izolovaly skríningem BAC genomové DNA knihovny (Reasearch Genetics) za použití primerů, které byly navrženy podle sekvence lidské 9qm cDNA. Identifikovaly se a sekvencovaly se dva pozitivní klony (44802 a 721117).
Příklad 5: Exprese IV, 8T a 9Q mRNA v krysích tkáních
Krysí a myší Northernové membrány obsahující různé tkáně (Clontech) se sondovaly [32p]-značenou cDNA sondou namířenou na 5'-netranslatovaný a 5'- kódující region krysí lv sekvence (nukleotidy 35-124; SEQ ID N0:3) (tato sonda je specifická pro krysí lv a krysí lvi), 5' kódující region 8t sekvence (nukleotidy 1-88; SEQ ID NO:29) (tato sonda je specifická pro 8t), nebo 5' konec krysí 9qm sekvence (nukleotidy 1-195; SEQ ID NO:21) (tato sonda je specifická pro všechny 9q isoformy, kromě 8t). Membrány se hybridizovaly za použití standardních
180
• ·· · technik. Northernové membrány hybridizované krysí lv sondou ukázaly jediný proužek při 2,3 kb pouze v dráze obsahující mozkovou RNA, což naznačuje, že exprese lv je specifická pro mozek. Northernové membrány sondované krysí 8t sondou ukázaly hlavní proužek při 2,4 kb. Krysí 8t proužek byl nejintenzivnější ve dráze obsahující srdeční RNA a byl také přítomen slabší proužek ve dráze obsahující mozkovou RNA. Northernové membrány hybridizované 9q cDNA sondou ukázaly hlavní proužek při 2,5 kb a vedlejší proužek větší než 4 kb s predominantní expresí v mozku a srdci. Menší proužek může reprezentovat nekompletně sestřiženou nebo zpracovanou 9q mRNA. Výsledky z northernových hybridizaci dále ukazují, že pl9 je exprimován především v srdci.
Příklad 6: Exprese IV, 8T a 9Q v mozku
Exprese krysích lv a 8t/9q genů v mozku se vyšetřovala šitu hybridizační histochemií (ISHH) za použití [^^S]značených cRNA sond a hybridizačního postupu identická s postupem popsaným v Rhodes et al. (1996) J. Neurose!.,
16:4846-4860. Templáty pro přípravu cRNA sond se připravily standardními PCR způsoby. Stručně, oligonukleotidové primery se navrhly pro amplifikaci fragmentu 3'- nebo 5'netranslatovaného regionu cílové cDNA a dále pro přidání promotor-rozpoznávající sekvence pro T7 a T3 polymerasu. Tak jsme pro přípravu sondy velikosti 300 nukleotidů namířené na 3'-netranslatovaný region lv mRNA použily následujících primerů:
5-TAATACGACTCACTATAGGGACTGGCCATCCTGCTCTCAG-3 (T7, kódující; SEQ ID NO:42)
5-ATTAACCCTCACTAAAGGGACACTACTGTTTAAGCTCAAG-3 (T3, reverzní, protismyslný; SEQ ID NO:43). Podtržené baze odpovídají T7 a T3 promotorové sekvenci. Pro přípravu sondy namířené na 325 bp • · · ·
181 ··· · · · ·· · • · · · · · · · « · · ······· · · · · · · · • · · · · · · · · · ···» · ·· ·· · · · · region 3’-netranslatované sekvence společné 8t a 9q mRNA se použily následující primery:
5-TAATACGACTCACTATAGGGCACCTCCCCTCCGGCTGTTC-3 (T7, kódující;
SEQ ID NO:44)
5-ATTAACCCTCACT AAAGGGAGAGCAGCAGCATGGCAGGGT-3 (T3, reverzní, protismyslný; SEQ ID NO:45).
Autoradiogramy řezů tkáně krysího mozku zpracované pro ISHH lokalizaci lv nebo 8t/9q mRNA exprese ukázaly, že lv mRNA je exprimována silně v mozku s charakterem exprese souhlasícím se značením neuronů, na rozdíl od gliálních nebo endoteliálních buněk, lv mRNA je silně exprimována v kortikálních, hippokampálních a striatálních interneuronech, reticulálním nucleu thalamu, mediální habenule, a v granulárních buňkách mozečku, lv mRNA je exprimována středně silně v jádrech středního mozku, včetně substantia nigra a colliculus superior, v několika dalších jádrech thalamu a v mediálním septálním a diagonálním jádru bazálního předního mozku.
Protože sondy použité pro analyzování exprese 8t a 9q hybridizují na region 3-netranslatovaného regionu, který je identický v 8t a 9q mRNA, vytváří tato sonda kompozitní obraz ukazující, že 8t/9q mRNA je rozsáhle exprimována v mozku způsobem, který se částečně překrývá s expresí lv, jak byla popsána výše. Nicméni, 8t/9q mRNA je silni exprimována ve striatu, hippokampu, granulárních buňkách mozečku a neokortexu. 8t/9q mRNA je středně silně exprimována ve stoedním mozku, thalamu a mozkovém kmenu. V mnoha těchto oblastech se 8t./9q mRNA zdá být koncentrována v interneuronech kromě hlavních buněk a ve všech regionech se zdá být 8t/9q exprese koncentrována v neuronech místo gliálních buněk.
182 • · · · · ♦ · ······ • · · · · ♦ ·· · • · · · · · · · · · · ······· ·« ·«· · Λ • · » · · * · · · · • · · · · ·· · · ·· ··
Jednoduše a dvojitě značená imunohistochemická vyšetření ukázala, že PCIP a Kv4 polypeptidy jsou precisně kolokalizovány v mnoha typech buněk a mozkových regionech, kde jsou současně exprimovány PCIP a Kv4 mRNA. Například, 9qm se lokalizuje současně s Kv4.2 v tělech a dendritech hippokampálních granulárních a pyramidálních buněk, neuronech v mediálním habenulárním jádru a v mozečkových košíčkových buňkách, zatímco lv se lokalizuje současně s Kv4.3 v neuronech II vrstvy posteriorní cingulatní kůry, hippokampálních interneuronech a v podskupině mozečkových granulárních buněk. Imunoprecipitace ukázaly, že lv a 9qm jsou koasociované s Kv4 α-podjednotkami v krysích mozkových membránách.
Příklad 7: Koasociace PCIP a Kv4 kanálů v COS a CHO buňkách
COSI a CHO buňky se dočasně transfektovaly jednotlivými PCIP (KChIPl, KChIP2, KChIP3) samostatně nebo společně s Kv4.2 nebo Kv4.3, za použití lipofektamin-plus postupu, v podstatě jak je popsán výrobcem (Boehringer Mannheim). 48 hodin po transfekci se buňky promyly, fixovaly se a zpracovaly se pro imunofluorescentní vizualizaci, jak byla popsána dříve (Bekele-Arcuri et al. (1996) Neuropharmacology, 35:851-865).
Afinitně-přečištěné králičí polyklonální nebo myší monoklonální protilátky k Kv4 kanálu nebo PCIP proteinu byly použity pro imunofluorescenční detekci cílových proteinů.
Když byly exprimovány samostatně, tak byly PCIP difusně distribuovány v cytoplasmě COS-1 a CHO buněk, jak se očekávalo pro cytoplasmatické proteiny. Naopak, když byly exprimovány samostatně, byly Kv4.2 a Kv4.3 polypeptidy koncentrovány v perinukleárním ER a Golgiho kompartmentech, s určitou imunoreaktivitou koncetrovanou na zevních okrajích buněk.
183
• 4 4 4· « 4 · • · · • · ·· • 44 4
Když byly PCIP exprimovány současně s Kv4 α-podjednotkami, tak se charakteristická difusní distribuce PCIP dramaticky změnila tak, že se PCIP lokalizovaly současně s Kv4 α-podjednotkami.
K této redistribuci PCIP nedošlo, když byly pCIP exprimovány současně s Kvl.4 α-podjednotkami, což ukazuje, že změněná lokalizace PCIP není důsledkem nadměrné exprese a že se tyto PCIP asociují specificky s Kv4-rodinou α-podjednotek.
Pro ověření toho, že PCIP a Kv4 polypeptidy jsou těsně asociované a nejen pouze současně lokalizované s v kotransfektovaných buňkách se provedly reciproční imunoprecipitační analýzy za použití PCIP a protilátkami specifickými pro kanál popsanými výše. Všechny tři PCIP polypeptidy se asociovaly s Kv4 α-podjednotkami v současně transfektovaných buňkách, jak bylo dokázáno schopností antiKv4.2 a anti-Kv4.3 protilátek imunoprecipitovat KChIPl,
KChIP2, a KChIP3 proteiny z lyzátů připravených ze současně transfektovaných buněk, a schopností anti-PCIP protilátek imunoprecipitovat Kv4.2 a Kv4.3 α-podjednotky ze stejných lyzátů. Buňky se lyžovaly v pufru obsahujícím detergentní činidlo a inhibitory proteasy, a připravily se pro imunoprecipitační reakci způsobem popsaným dříve (Nakahira et al. (1996) J. Biol. Chem., 271:7084-7089). Imunoprecipitace byly provedeny způsobem popsaným v Nakahira et al. (1996) J. Biol. Chem., 271:7084-7089 a v Harlow E. a Lané, D., Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, cl988. Produkty získané z imunoprecipitace se frakcionovaly podle velikosti SDS-PAGE a přenesly se na nitroceluíosové filtry za použití standardních postupů.
Pro potvrzení toho, že cytoplasmatický N-konec Kv4 kanálu je dostačující pro interakci s PCIP, se KChIPl nebo KChIP2 současně exprimovaly s Kv4.3 mutantem (Kv4.3 C), kterému chybí • ·· ·
184 ·· · ·* • · · · · · • · · · · ··· • ······ ·· · • · · · · · ···· · ·· ·· celá 219 aminokyselinová cytoplasmatická C-terminální koncovka. V dočasně transfektovaných COS-1 buňkách byl
Kv4.3?C mutant výrazně vychytáván v perinukleárním ER a Golgiho aparátu: slabé nebo žádné barvení nebylo pozorováno na vnějších okrajích buněk. Nicméně, KChIPl a KChIP2 se lokalizovaly současně s Kv4.3?C v současně transfektovaných buňkách, a dále Kv4.3?C účinně imunoprecipitoval současně s PCIP protilátkou, což ukazuje, že interakce těchto PCIP s Kv4 α-podjednotkou nevyžaduje cytoplasmatický C-konec kanálu.
Příklad 8: Současná asociace PCIP a Kv4 kanálů v přirozených tkáních
Pro určení toho, zda se PCIP localizují současně s a zda se asociují s Kv4 podjednotkami v přirozených tkáních, se Kv4- a PCIP-specifické protilátky použily pro jednoduše a dvojitě značené imunohistochemické analýzy a pro reciproční koimunoprecipitační analýzu membrán z krysího mozku. Imunohistochemické barvení řezů z krysího mozku ukázalo, že KChIPl a KChIP2 se lokalizují současně s Kv4.2 a Kv4.3 způsobem specifickým pro region a typ buněk. Například, KChIPl se lokalizoval současně s Kv4.3 v hippokampálních interneuronech, mozečkových granulárních buňkách a mozečkových glomerulech, specializovaných synaptických uskupeních mezi dendrity mozečkových košíčkových a golgiho buněk a zakončeni mechových vláken. KChIP2 se lokalizuje současně s Kv4.3 a Kv4.2 v dendritech granulárních buněk v gyrus dentatus, v apikálních a bazálních dendritech hippokampálních a neokortikálních pyramidových buněk, a v několika subkortikálních strukturách, včetně striata a colliculus superior. Ko-imunoprecipitační analýzy provedené za použití synaptických membrán připravených z celého krysího mozku ukázaly, že PCIP (KChIPs 1, 2 a 3) jsou těsně asociované s
00 0 • · · • · ·
0000 • 0
185
0···
0 000
0 0 0 • 0 0 0
00
Kv4.2 a Kv4.3 v mozkových komplexech K+ kanálů. Anti-PCIP protilátky imunoprecipitovaly Kv4.2 a Kv4.3 z mozkových membrán, a anti-Kv4.2 a Kv4.3 protilátky imunoprecipitovaly PCIP. Žádný z PCIP polypeptidů neimunoprecipitoval s antiKv2.1 protilátkou, což ukazuje, že asociace těchto PCIP k mozkovými Kv kanály může být specifická pro Kv4 ot-podj ednotky. Dohromady tyto anatomické a biochemické analýzy ukázaly, že tyto PCIP jsou integrálními složkami přirozených komplexů Kv4 kanálu.
Příklad 9: PCIP jsou vazebné proteiny pro vápník
Pro určení toho, zda KChlP 1, 2 a 3 váží Ca2+, se připravily GST-fúzní proteiny pro každý PCIP a schopnost GSTPCIP proteinů, stejně jako rekombinantních PCIP polypeptidů 2+ enzymaticky odštěpených od GST, vázat Ca , se hodnotila za použití testu překrývání na filtru (jak je popsán, například, v Kobayashi et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun.
189(1):511-7). Všechny tři PCIP polypeptidy, ale ne nepříbuzný GST-fúzní protein, vykazovaly v tomto testu silnou vazbu na Ca2+. Dále, všechny tři PCIP polypeptidy vykazovaly Ca2+dependentní posun mobility na SDS-PAGE, což ukazuje, že jako jiní členové této rodiny jsou KChIPs 1, 2 a 3 ve skutečnosti Ca2+-vazebné proteiny (Kobuyashi et al. (1993), výše; Buxbaum et al. Nef (1996). Neuron-specific calcium sensors (the NCS-1 subfamily). V: Celio MR (ed) Guidebook to calcium-binding proteins. Oxford University Press, New York, str. 94-98; Buxbaum J.D., et al. (1998) Nátuře Med. 4(10):1177-81.
Příklad 10: Elektrofyziologická charakterizace PCIP
Protože se PCIP, např. KChIPl (lv), KChIP2 (9ql) a KChIP3 (pl9), lokalizují společně Kv4 α-podjednotkami v mozku, je • to • · · to to to ♦·· ·· ··· • ······ ·· · • · · · · · • •toto · ·· ·· • to ··· ·
186 • · to • · · • to· · • · · · ·· ·· jinou důležitou otázkou to, zda tyto PCIP mění vodivost Kv4 kanálů. Pro vyřešení této otázky byly Kv4.2 a Kv4.3 exprimovány samostatně a v kombinaci s jednotlivými PCIP.
CHO buňky se dočasně transfektovaly cDNA za použití DOTAP lipofekční metody, jak je doporučena výrobcem (Boehringer Mannheim, lne.). Transfektované buňky se identifikovaly podle současné transfekce GFP s požadovanými geny a potom se určilo, zda buňky obsahují GFP fluorescenci. Proudy v CHO buňkách se měřily za použití techniky kontaktních svorek (Hamill et al.
1981. Pfluegers Arch. 391: 85-100).
Přechodná transfekce krysí Kv4.2 α-podjednotky v CHO buňkách vedla k expresi typické K+ vodivosti A typu. Současná exprese Kv4.2 s KChIPl ukázala několik výrazných vlivů KChIPl na kanál (obr. 41 a tabulka 1). Za prvé, amplituda Kv4.2 proudu se zvýšila přibližně 7,5-násobně za přítomnosti KChIPl (amplituda Kv4.2 samotného = 0,60 + /- 0,096 nA/buňku; Kv4.2 + KChIPl = 4,5 +/- 0,55 nA/buňku). Při konverzi na hustotu proudu korekcí pro kapacitanci buněk, s měřením plochy povrchu buněk, se hustota Kv4.2 proudu zvýšila 12-krát při současné expresi KChIPl (Kv4.2 samostatně = 25,5 +/- 3,2 pA/pF; Kv4.2 + KChIPl = 306,9 + /- 57,9 pA/pF), což ukazuje, že KChlP podporuje a/nebo stabilizuje povrchovou expresi Kv4.2.
Společně s tímto zvýšením hustoty proudu se pozoroval dramatický posun prahu aktivace Kv4.2 proudu doleva v buňkách exprimujících Kv4.2 a KChIPl (aktivace Vl/2 pro Kv4.2 samostatně = 20,8 + /- 7,0mV, Kv4.2 + KChIPl = -12,1+/- 1,4 mV). Konečně, kinetiky Kv4.2 inaktivace se významně zpomalily, když byl Kv4.2 exprimován současně s KChIPl (inaktivační časová konstanta Kv4.2 samotného = 28,2 +/- 2,6 ms; Kv4.2 +
KChIPl = 104,1 +/- 10,4 ms), zatímco kanály se zotavily z inaktivace mnohem rychleji v buňkách exprimujících jak Kv4.2, tak KChIPl (zotavovací tau = 53,6 +/- 7,6 ms) oproti buňkám • · · • · « * ·«·« • ·
9999 ·
187 ·· ·· ·· ··· ·
9 9 · 9 · • · ··· · · · • · ·· 9 « · · 9
9 9 9 9 9 9 9
99 99 99 exprimujícím Kv4.2 samotný (zotavovací tau = 272,2 +/- 26,1 ms) .
KChlP 1, 2 a 3 mají odlišné N-konce, ale mají významnou aminokyselinovou identitu v C-terminální základní doméně.
I přes odlišné N-konce jsou vlivy KChIP2 a KChIP3 na Kv4.2 proudovou hustotu a kinetiky podobné jako KChIPl (Tabulka 1).
Tak byly pro potvrzení toho, že C-terminální základní doména, která obsahuje všechny tři EF-ramena, je dostatečná pro modulování Kv4 proudové hustoty a kinetiky, připraveny mutace KChIPl a KChIP2 s N-terminálním zkrácením. KChIPl?N2-31 a KChIP2?N2-67 mutanty jsou zkrácené vzhledem k KChIPl a KChIP2, v příslušném pořadí, na C-terminální 185 aminokyselinové základní sekvenci. Koexprese KChIPl?N2-31 nebo KChIP2?N2-67 s Kv4.2 v CHO buňkách produkovala změny v Kv4.2 proudové hustotě a kinetikách, které byly neodlišitelné od efektů produkovaných kompletními KChIPl nebo KChIP2 (Tabulka 1).
Pro výzkum toho, zda jsou modulační efekty tíchto KChlP specifické pro Kv4 kanály, byl KChIPl exprimován souěasni s Kvl.4 a Kv2.1 v Xenopus oocytech. Do Xenopus oocytu se injikovalo 1-3 ng cRNA/oocyt, kde cRNA se připravila za použití standardních in vitro transkripčních technik (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual, Cold Spring Harbor Press) . Proudy v Xenopus oocytech se měřily za použití 2-elektrodových napěťových svorek. KChIPl nejevil žádný vliv na Kvl.4 nebo Kv2.1 proudy (Tabulka 2), což ukazuje, že tyto funkční efekty mohou být specifické pro Kv4 kanály. Jako konečná kontrola KChlP efektů a pro ověření toho, že vlivy KChlP na Kv4 proudy jsou nezávislé na expresním systému, se výše uvedené analýzy kinetik opakovaly po exprimování Kv4.3 a KChlP mRNA v Xenopus oocytech. Efekty KChIPl na Kv4.3 v Xenopus oocytárním systému se silně podobaly • · • 4
44
444 4
188 ♦ » ·· ♦ · · «4 · * 4 444 · · · • · ·· 4 4 4 4 4 • 44 * 4 44 4
44 44 44 efektům na Kv4.2 v CHO buňkách (Tabulka 1).
2+ o
Protože se tyto KChlP váží na Ca , je dalším důležitým úkolem zjistit, zda efekty KChIPl na Kv4.2 proudy jsou Ca2+dependentní. Tato otázka byla zodpovězena nepřímo vložením bodových mutací do každého EF-ramena KChIPl: jeden mutant mil bodové mutace v prvních dvou EF ramenech (D199 na A, Gum na A, D135 na A, a G140 na A) a další měl bodové mutace ve všech třech EF ramenech (D199 na A, Gum na A, D135 na A, G140 na A, D183 na A, a Gi88 na A) . Tyto mutace substituovaly alanin za dvě nejvíce konzervované aminokyseliny v EF-ramenu (obr. 25; Linse, S. a Forsen, S. (1995) Determinants that govern high-affinity Calcium binding. Vn Means, S. (Ed.) Advances in second messenger and fosfoprotein research. New York, Ravens Press, . 30:89-150). Současná exprese tohoto KChIPl mutantu se třemi mutacemijv EF-ramenu s Kv4.2 nebo Kv4.3 v COS buňkách ukázala, že tentu mutant se lokalizuje současně s a je účinně imunoprecipitován s Kv4 α-podjednotkami v COS-1 buňkách. Nicméně, tyto bodové mutace v EF-ramenu zcela eliminovaly efekty KChIPl na kinetiky Kv4.2 (Tabulka 1). Dohromady tyto výsledky ukazují, že vazebná interakce mezi KChIPl a Kv4.2 je Ca2+ independentní, zatímco modulace kinetik Kv4.2 KChIPl je buď Ca2+-dependentní, nebo sensitivní na strukturální změny vložené bodovými mutacemi do EF-ramen.
189 • · ♦ ·» · · ······ ··· · · « · « · • · · · ···· « · · ······· ·· ··· · · • · » · · ♦ »··· ·♦·* » ·· ·· «» ··
Tabulka 1: Funkční efekty KChlP na Kv4 kanály
Parameter proudu rKv4.2 Η- vektor rKv4.2 + KChlP 1 rKv4.2 + KChIPl ÁN2-31 rKv4.2 + KChIP2 rKv4.2 + KChIP2 ÓN2-67 rKv4.2 + KChIP3 rKv4.3 rKv4.3 + KChIPl
Vrcholový proud 0.60* 4.5* 6.0* 3.3* 5.8* 3.5* 7.7μΑ 18.1μΑ*
(nA/buňku ±0.096 ±0.055 ±1-1 ±0.45 ±1-1 ±0.99 ±2.6 ±3.8
při 50 MV) Vrcholová hustota proudu 25.5 306.9* 407.2* 196.6* 202.6* 161.7* — —
(pA/pF při 50 mV) ±3.2 ±57.9 ±104.8 ±26.6 ±27.5 ±21.8
Inaktivačn 28.2 104.1 129.2 95.1* 109.5* 67.2* 56.3 135.0
í časová
konstanta
(ms, při 50 mV) ±2.6 ±10.4 ±14.2 ±8.3 ±9.6 ±14.1 ±6.6 ±15.1
časová 272.2 53.6* 98.1* 49.5* 36.1* 126.1* 327.0 34.5*
konstanta
zotavení z
inaktivace
I
* Významně odlišné od kontroly • · « • · ♦ · · • *··· · • · ·*·· *
190 »» · · » · « • · ··· • · · • · · ·· ·· ·· ···· « · · • · · • · · · * · · · ♦ · ··
Tabulka 2: Funkční efekty KChlP na jiné Kv kanály
Xenopus oocyty Xenopus oocyty
Parametry proudu HKvl.4 hKvl.4 ±lv HKv2.1 HKv2.1 ± lv
Vrcholový proud 8.3 6.5 3.7 2.9
(μΑ/buňku při 50 MV) ±2.0 ±0.64 ±0.48 ±0.37
Inaktivační časová konstanta 53.2 58.2 1.9 s 1.7 s
(ms, při 50 mV) ±2.8 ± 6.6 ±0.079 0.078
Konstanta doby zotavení z inaktivace (s, při -80 mV) 1.9 1.6 7.6 7.7
Aktivační V1/2 (mV) -21.0 -20.9 12.0 12.4
Rovnovážné inaktivační V1/2 (mV) -48.1 -47.5 -25.3 -23.9
Příklad 11: Efekty KChIPl na povrchovou expresi KV4-a podjednotek v COS-1 buňkách
Pro zhodnocení schopnosti KChIPl zvyšovat povrchovou expresi Kv4 kanálů se sledovala schopnost KChIPl podporovat tvorbu Kv4 kanály v sestavě s PSD-95 na povrchu buněk. PSD-95 se použil pro snazší vizualizaci komplexu.
Pro usnadnění interakce mezi Kv4.3 a PSD-95 se připravila ·* ·*· ·
191 ·· · ·· · « « ♦ ♦ * · ·« · • · · · · ··· · · · ··«·<·«· K « ·«· « 9 • · · » · ♦ ···· ···· « «· ·* ·* 99 chimérická Κν4.3 podjednotka (Kv4.3ch), ve které bylo Cterminálních 10 aminokyselin z rKvl.4 (SNAKAVETDV, SEQ ID
NO:73) připojeno na C-konec Kv4.3. C-terminálních 10 aminokyselin z rKvl.4 bylo použito proto, že se asociují s PSD-95 a způsobují schopnost asociovat PSD-95 s Kv4.3 proteinem, když jsou fúzovány na C-konec Kv4.3. Exprese Kv4.3ch v COS-1 buňkách ukázala, že Kv4.3ch polypeptid byl zachycován v perinukleární cytoplasmě, s minimální detekovatelnou Kv4.3ch imunoreaktivitou na zevních okrajích buněk. Když byl Kv4.3ch exprimován současně s PSD-95, tak se PSD-95 zachycoval v perinukleární cytoplasmě a lokalizoval se současně s Kv4.3ch. Nicméně, když byl KChIPl exprimován současně s Kv4.3ch a PSD-95, tak byly pozorovány velké plakům podobné seskupení Kv4.3ch, KChIPl a PSD-95. Trojitě značená imunofluorescence potvrdila, že tato povrchová uskupení obsahují všechny tři polypeptidy, a reciproční koimunoprecipitační analýzy ukázaly, že tyto tři polypeptidy jsou asociované v těchto povrchových uskupeních. Kontrolní pokusy ukázaly, že KChIPl neinteraguje s PSD-95 samostatně, a nelokalizuje se současně s Kvl.4 a PSD-95 v povrchových uskupeních. Dohromady tato data ukazují, že KChIPl může podporovat dočasný přesun Kv4.3 podjednotky na povrch buněk.
Příklad 12: Charakterizace PCIP proteinů
V tomto příkladu se aminokyselinová sekvence PCIP proteinů srovnávala s aminokyselinovými sekvencemi známých proteinů a identifikovaly se různé motivy.
lv polypeptid, jehož aminokyselinová sekvenci je uvedena v
SEQ ID NO:3, je nový polypeptid, který obsahuje 216 aminokyselinových zbytků. Domény, které se patrně podílejí na vazbě vápníku (Linse, S. a Forsen, S. (1995) Advances in
192 ·· · • 4 9 ·· 4· • 4 4
• · · · • · · · ·· 4« • 44 • 4 ···· • · 4 • 4 · ···· • · « • 4 4 · ·» 44
Second Messenger and Fosfoprotein Research 30, kapitola
3,str.89-151, ed. Means, AR., Raven Press, Ltd., New York), se identifikovaly pomocí srovnání sekvencí (viz obr. 21).
8t polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena v SEQ ID NO:30, je nový polypeptid, který obsahuje 225 aminokyselinových zbytků. Vazebné domény pro vápník, které se patrně podílejí na vazbě vápníku (Linse, S. a Forsen, S.
(1995) Advances in Second Messenger and Fosfoprotein Research 30, kapitola, str. 89-151, ed. Means, AR., Raven Press, Ltd., New York), se identifikovaly pomocí srovnání sekvencí (viz obr. 21).
9q polypeptid je nový polypeptid, který obsahuje vazebné domény pro vápník, které se patrně podílejí na vazbě vápníku (Linse, S. a Forsen, S. (1995) Advances in Second Messenger and Fosfoprotein Research 30, kapitola, str. 89-151, ed.
Means, AR., Raven Press, Ltd., New York).
pl9 polypeptid je nový polypeptid, který obsahuje vazebné domény pro vápník, které se patrně podílejí na vazbě vápníku (Linse, S. a Forsen, S. (1995) Advances in Second Messenger and Fosfoprotein Research 30, kapitola, str. 89-151, ed.
Means, AR., Raven Press, Ltd., New York)
BLASTN 2.0.7 prohledávání (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) nukleotidové sekvence krysího lvi ukázalo, že krysí lvi je podobný krysímu cDNA klonu RMUAH89 (přírůstkové číslo AA849706). Krysí lvi molekula nukleové kyseliny je z 98% identická s krysím cDNA klonem RMUAH89 (přírůstkové číslo AA849706) v nukleotidech 1063 až 1488.
BLASTN 2.0.7 prohledávání (Altschul et al. (1990) J. Mol.
193
Biol. 215:403) nukleotidové sekvence lidského 9ql ukázalo, že lidský 9ql je podobný jako lidský cDNA klon 1309405 (přírůstkové číslo AA757119). Lidský 9 ql molekula nukleové kyseliny je z 98% identická s lidským cDNA klonem 1309405 (přírůstkové číslo AA757119) v nukleotidech 937 až 1405.
BLASTN 2.0.7 prohledávání (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) nukleotidové sekvence myšího P19 ukázalo, že myší P19 je podobný jako Mus musculus cDNA klon MNCb-7005 (přírůstkové číslo AU035979). Myší P19 molekula nukleové kyseliny je z 98% identická s Mus musculus cDNA klonem MNCb7005 (přírůstkové číslo AU035979) v nukleotidech 1 až 583.
Příklad 13: Exprese rekombinantních PCIP proteinů v bakteriálních buňkách
V tomto příkladu byl PCIP exprimován jako rekombinantní glutathion-S-transferasový (GST) fúzní polypeptid v E. coli a fúzní polypeptid se izoloval a characterizoval. Přesněji, PCIP se fúzoval na GST a tento fúzní polypeptid se exprimoval v E.coli, např. kmeni BI21. Exprese GST-PCIP fúzního proteinu v BI21 se indukovala IPTG. Rekombinantní fúzní polypeptid se přečistil ze surových bakteriálních lyzátů indukovaného BI21 kmene afinitní chromatografií na glutathionových korálkách.
Za použití elektroforetické analýzy polypeptidu přečištěného z bakteriálních lyzátů na polyakrylamidovém gelu se určila molekulová hmotnost získaného fúzního polypeptidu.
Krysí lv a 9ql se klonovaly do pGEX-6p-2 (Pharmacia).
Získané rekombinantní fúzní proteiny se exprimovaly v E. coli buňkách a přečistily se za použití způsobů známých v oboru (jak je popsáno, například, v Current Protokols in Molecular
Biology, ed. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).
·· ·
194 • · · · · • · · · · ··· • ···· · · · · · • · · · · · • · · ·· ·· • · ·
Identity přečištěných proteinů se ověřily westernovou hybridizaci za použití protilátek namířených proti peptidovým epitopům krysího lv a 9ql.
Přílad 14: Exprese rekombinantních PCIP proteinů v COS buňkách
Pro expresi PCIP genu v COS buňkách se použil pcDNA/Amp vektor od Invitrogen Corporation (San Diego, CA). Tento vektor obsahuje SV40 sekvenci rozpoznávající počátek replikace, gen pro resistenci na ampicilin, E. coli sekvenci rozpoznávající počátek replikace a CMV promotor následovaný polylinkerovým regionem, a SV40 intron a polyadenylační místo. DNA fragment kódující celý PCIP protein a HA koncovku (Wilson et al. (1984)
Cell 37:767) nebo FLAG koncovku fúzovanou v rámci na 3' konec fragmentu, se klonoval do polylinkerového regionu vektoru, čímž se umístila exprese rekombinantního proteinu po kontrolu CMV promotoru.
Pro konstrukci plasmidu se PCIP DNA sekvence amplifikovala PCR za použití dvou primerů. 5' primer obsahoval vybrané restrikční místo následované přibližně dvaceti nukleotidy PCIP kódující sekvence od iniciačního kodonu; 3' konec sekvence obsahoval komplemenmtární sekvenci k dalšímu vybranému restrikčnímu místu, translační stop kodon, HA koncovku nebo FLAG koncovku a posledních 20 nukleotidů PCIP kódující sekvence. PCR amplifikovaný fragment pCDNA/Amp vektoru se trávil vhodnými restrikčními enzymy a vektor se defosforyloval za použití CIAP enzymu (New England Biolabs, Beverly, MA). Výhodně jsou dvě vybraná restrikční místa odlišná, takže je PCIP gen insertován ve správné orientaci. Ligační směs se transformovala do E. coli buněk (například mohou být použity kmeny HB101, DH5a, SURE, od Stratagene
195
Cloning Systems, La Jolla, CA), transformovaná kultura se umístila na plotny s ampicillinovým mediem a selektovaly se resistentní kolonie. Plasmidová DNA se izolovala z transformantů a vyšetřila se restrikční analýzou na přítomnost správného fragmentu.
COS buňky se potom transfektovaly PCIP-pcDNA/Amp plasmidovou DNA za použití techniky využívající srážení fosforečnanem vápenatým nebo chloridem vápenatým, DEAEdextranem-zprostředkované transfekce, lipofekce nebo elektroporace. Další vhodné způsoby pro transfektování hostitelské buňky jsou uvedeny v Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Exprese PCIP polypeptidů se detekovala pomocí radioaktivního značení (35g_ methionin nebo ^^S-cystein od NEN, Boston, MA) a imunoprecipitací (Harlow, E. a Lané, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988) za použití HA specifické monoklonální protilátky. Stručně, buňky se značily po dobu 8 hodin 35g_ methioninem (nebo 55g_CyS-j-ej_nem) . Kultivační medium se potom odebralo a buňky se lyžovaly za použití detergentů (RIPA pufr, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 50 mM Tris, pH 7,5). Buněčný lyzát a kultivačním medium se srážely HA specifickou monoklonální protilátkou. Vysrážené polypeptidy se potom analyzovaly pomocí SDS-PAGE.
Alternativně se DNA obsahující PCIP kódující sekvenci klonovala přímo do polylinkeru pCDNA/Amp vektoru za použití vhodných restrikčních míst. Získaný plasmid se transfektoval do COS buněk způsobem popsaným výše a exprese PCIP polypeptidů se detekovala radioaktivním značením a imunoprecipitací za
9
9 · 9
protilátky.
expresního vektoru pRBG4.
196 použití PCIP specifické monoklonální
Krysí lv byl klonován do savčího
Transfekce do COS buněk byla provedena za použití LipofectAmine Plus (Gibco BRL) podle návodu výrobce. Exprimovaný lv protein byl detekován imunocytochemickým vyšetřením a/nebo westernovou hybridizací za použití protilátek namířených proti lv u králíků nebo myší.
Příklad 15: Identifikace a charakterizace kompletního lidského P19
Kompletní sekvence lidského pl9 se identifikovala za použití RACE PCR. Sekvenci pl9 (též označovaného jako KChIP3) je uvedena na obr. 16. Aminokyselinová sekvence lidského pl9 je z 92% identická s myším pl9 genem (SEQ ID NO:35).
TBLASTN vyhledávání za použití proteinové sekvence lidského pl9 ukázalo, že lidský pl9 je homologní se dvěma sekvencemi, Calsenilinem (jak je popsán v (1998) Nátuře Medicine 4: 1177-1181) a DREAM, a Ca2+-dependentním regulátorem transkripce prodynorphinu a c-fos (jak je popsán v Carrion et al. (1999) Nátuře 398: 80-84). Lidský pl9 je ze 100% identický na nukleotidové úrovni s Calsenilinem (ale přesahuje 3' publikovanou sekvenci) a z 99% identický na nukleotidové úrovni s DREAM.
Schopnost pl9 (stejně jako jiných členů PCIP rodiny) lokalizovat se současně s presenilinem a účinkovat jako transkripční faktory se určila za použití technik známých v oboru, jako je northernova hybridizace, in šitu hybridizace, β-gal testy, testy mobility DNA (jak jsou popsány, například, v Carrion et al. (1999) Nátuře 398:80) a testy suerposunu • · ·· • · • · · · ·
197 • · · · · · • · · · · 4 ···· · ·· « » mobility DNA, za použití protilátek specifických pro KChIP.
Dalším testem vhodným pro hodnocení asociace členů PCIP rodiny s preseniliny je ko-imunoprecipitace (jak je popsána, například, v Buxbaum et al. (1998) Nátuře Medicine 4:1177).
Příklad 16: Identifikace a charakterizace opičího KChIP4
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genů kódujících opičí KChIP4a (jlkbd352e01tl) a alternativně sestřižené opičí KChIP4b (jlkbb231c04tl), KChIP4c (jlkxa053c02) a KChIP4d (jlkx015bl0). TBLASTN vyhledávání ve vhodné databázi se sekvencí známých členů PCIP rodiny vedlo k identifikaci čtyř klonů jlkbb231c04tl, jlkbd352e01tl, jlkxa053c02 a jlkx015bl0. Tyto čtyři opičí klony se získaly a sekvenovaly se.
Bylo zjištěno, že sekvence opičích klonů jlkbb231c04tl a jlkbd352e01tl odpovídají alternativně sestřiženým variantám dalšího člena PCIP rodiny, který je zde označen jako KChIP4. Klon jlkbb231c04t1 obsahuje 822bp deleci vzhledem k jlkbd352e01tl (pravděpodobně v důsledku vystřižení exonu), což vede ke ztrátě EF domény. V klonu jlkbd352e01tl je konečná EF doména zachována a C-konec je vysoce homologní k C-konci členů PCIP rodiny lv, 9ql a pl9. Celková identita v homologním Ckonci mezi KChIP4, lv, 9ql a pl9 je v rozmezí 71%-80% na aminokyselinové úrovni (seřazení byla provedena za použití CLUSTALW).
Opičí KChIP4c a KChIP4d byly objeveny BLASTN vyhledáváním za použití opičího KChIP4a jako požadavku pro vyhledávání ve vhodné databázi.
198
Nukleotidová sekvence opičí KChIP4a cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence KChIP4a polypeptidu jsou uvedeny na obr. 23 a v SEQ ID NO:48 a 49, v příslušném pořadí.
Nukleotidová sekvence opičí KChIP4b cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence KChIP4b polypeptidu jsou uvedené na obr. 24 a v SEQ ID NO:50 a 51, v příslušném pořadí.
Nukleotidová sekvence opičí KChIP4c cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence KChIP4c polypeptidu jsou uvedené na obr. 35 a v SEQ ID NO:69 a 70, v příslušném pořadí.
Nukleotidová sekvence opičí KChIP4d cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence KChIP4d polypeptidu jsou uvedené na obr. 36 a v SEQ ID NO:71 a 72, v příslušném pořadí.
Obr. 37 znázorňuje srovnání proteinové sekvence KChIP4a, KChIP4b, KChIP4c a KChIP4d.
Krysí KChIP4 je především exprimován v mozku a slabě v ledvinách, ale ne v srdci, mozku, slezině, plících, játrech, kosterním svalu nebo varlatech, ja ukázaly northernové hybridizace, ve kterých byly northernové membrány zakoupené od Clontech sondovány DNA fragmentem z 3'-netranslatovaného regionu krysího KChIP4.
Příklad 17: Identifikace a charakterizace lidského a krysího 33b07
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genů kódujících krysí a lidský 33b07. Částečná krysí 33b07 sekvence (klon 9o) se izoloval jako pozitivní klon z kvasinkového 2-hybridového testu popsaného výše, za použití • · • · • · rKv4.3N jako záchytného činidla. Kompletní krysí 33b07 klon se identifikoval z vhodné databáze.
199 • ··· • · 4 • · 4
Nukleotidová sekvence kompletní krysí 33b07 cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 33b07 polypeptidu jsou uvedeny na obr. 26 a v SEQ ID NOs:52 a 53, v příslušném pořadí. Krysí 33b07 cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotností přibližně 44,7 kD a délku 407 aminokyselin.
Krysí 33b07 se váže na rKv4.3N a rKv4.2N s mírnou prefrencí pro rKv4.2N v kvasinkovém 2-hybridovém testu. Naopak, krysí 33b07 se neváže na rKvl.lN, což ukazuje, že interakce krysí 33bO7-Kv4N je specifická.
Krysí 33b07 je exprimován především v mozku, jak bylo určeno northernovou hybridizaci.
Lidský 33b07 ortholog (klon 106d5) se také identifikoval pomocí průzkumu vhodné databáze. Nukleotidová sekvence kompletní lidské 33b07 cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence lidského 33b07 polypeptidu jsou uvedeny na obr. 27 a v SEQ ID NOs:54 a 55, v příslušném pořadí. Lidská 33b07 cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotností přibližně 45,1 kD a délku 414 aminokyselin.
Lidský 33b07 je z 99% identický s lidským KIAA0721 proteinem (GenBank přírůstkové číslo: AB018264) na aminokyselinové úrovni. Nicméně, GenBank přírůstkové číslo: AB018264 nemá funkční anotaci. Lidský 33b07 je také homologní s testes-specifickými (Y-kódovanými) proteiny (TSP(Y)s), SET, a proteiny související se sestavením nukleosomu (NAP). Lidský 33b07 je z 38% identický s lidským SET proteinem (GenBank • · • · · <
• * · ·
200 .· ··:
*·· · 9 přírůstkové číslo Q01105=U51924) v aminokyselinách 204 až 337 a ze 46% identický v aminokyselinách 334 až 387.
Lidský SET je také označován jako HLA-DR asociovaný protein II (PHAPII) (Hoppe-Seyler (1994) Biol. Chem. 375:113126) a v některých případech je asociovaný s akutní nediferencovanou leukémií (AUL) v důsledku translokace vedoucí ke vzniku SET-CAN fúzního genu (Von Lindern M. et al. (1992)
Mol. Cell. Biol. 12:3346-3355). Alternativně sestřižená forma SET se také označuje jako templatový aktivační faktor-I alfa (TAF). TAF je asociovaný s myeloidní leukemogenesí (Nagata K. et al. (1995) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92 (10), 42794283). Lidský SET je také účinný proteinový inhibitor fosfatasy 2A (Adachi Y. et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:22582262). NAP se mohou podílet na modulování tvorby chromatinu a přispívají k regulaci buněčné proliferace (Simon H.U. et al. (1994) Biochem. J. 297, 389-397).
Proto může, v důsledku své homologie s výše uvedenými proteiny, 33b07 účinkovat též jako proteinový inhibitor fosfatasy, onkogen a/nebo modulátor chromatinu. Homologie 33b07 se SET, proteinovým inhibitorem fosfatasy, má značný význam. Mnohé kanály, zejména Kv4 kanály (se kterými je 33b07 asociovaný), jsou regulovány fosforylaci PKC a PKA ((1998) J. Neuroscience 18(10): 3521-3528; Am J Physiol 273: H1775-86 (1997)). Tak může 33b07 také modulovat aktivity Kv4 tím, že reguluje fosforylační stav draslíkového kanálu.
Příklad 18: Identifikace a charakterizace krysího Ip
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genu kódujícího krysí Ip. Částečný krysí lp byl izolovaný jako pozitivní klon z kvasinkového 2-hybridového testu popsaného
• · · · · • · · *
201 ·· · » výše, za použití rKv4.3N jako zachycovacího činidla.
Nukleotidová sekvence částečné krysí lp cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího lp polypeptidu jsou uvedené na obr. 28 a v SEQ ID NO:56 a 57, v příslušném pořadí. Krysího lp cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnos přibližně 28,6 kD a délku 267 aminokyselin.
Krysí lp se váže na rKv4.3N a rKv4.2N s mírnou preferencí pro rKv4.3N v kvasinkovém 2-hybridovém testu. Naopak, lp se neváže na rKvl.lN, což ukazuje, že lp-Kv4N interakce je specifická.
Krysí lp je především exprimován v mozku, jak bylo určeno northernovou hybridizaci.
BLASTP 1.4 prohledávání, za použití skóre 100 a délky slova 3 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) aminokyselinová sekvence krysího lp ukázalo, že krysí lp je podobný lidskému Restinu (GenBank přírůstkové číslo P30622; též bývá označovaný jako cytoplasmatický spojovací protein-170 alfa-2 (CLIP-170), M97501)). Krysího lp protein je z 58% identický s lidským Restinem v aminokyselinách 105 až 182, z 55% identický s lidským Restinem v aminokyselinách 115 až 186, z 22% identický s lidským Restinem v aminokyselinách 173 až 246, z 22% identický s lidským Restinem v aminokyselinách 169 až 218, a z 58% identický s lidským Restinem v aminokyselinách 217 až 228.
Restin se také označuje jako protein asociovaný s ReedSternbergové středními filamenty. Reed-Sternberg buňky jsou nádorové buňky diagnostické pro Hodgkinovu nemoc. Předpokládá se, že nadměrná exprese restinu může přispívat k progresi
202
♦ ··· ·
9 9 9 9 •99 9
Hodgkinovi nemoci (Bilbe G. et al. (1992) EMBO J. 11: 2103-13) a zdá se, že restin je protein asocivaný se středními filamenty, který váže endocytické vesikuly na mikrotubuly (Pierre P, et al. (1992) Cell 70 (6), 887-900).
Cytoskelet reguluje aktivity draslíkových kanálů (viz, například, Honoře E, et al. (1992) EMBO J. 11:2465-2471 a
Levin G, et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:29321-29328), stejně jako aktivity dalších kanálů, např. Ca++ kanálů (Johnson B.D. et al. (1993) Neuron 10:797-804); nebo Na+ kanálů (Fukuda J. et al. (1981) Nátuře 294:82-85).
Proto, na základě své homologie s restinem, může být krysí lp protein asociovaný s cytoskeletem a může modulovat aktivity draslíkových kanálů, např. Kv4, prostřednictvím své asociace s cytoskeletem.
Příklad 19: Identifikace a charakterizace krysího 7s
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genu kódujícího krysí 7s. Čstečný krysí 7s se izoloval jako pozitivní klon z kvasinkového 2-hybridového testu popsaného výše, za použití rKv4.3N jako záchytného činidla. Krysí 7s je krysí ortholog lidské vakuolární H(+)-ATPasové katalytické podjednotky A (přírůstkové číslo P38606 a B46091), jak je popsáno, například, ve van Hille B. et al. (1993) J. Biol.
Chem. 268 (10), 7075-7080.
Nukleotidová sekvence částečné krysí 7s cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 7s polypeptidu jsou uvedené na obr. 29 a v SEQ ID NO:58 a 59, v příslušném pořadí. Krysího 7s cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnost přibližně 28,6 kD a délku 270 aminokyselin.
• •44 • •4
4444 ··
203
Krysí 7s se váže na rKv4.3N a rKv4.2N s preferencí pro rKv4.3N v kvasinkovém 2-hybridovém testu. Naopak, 7s se neváže na rKvl.lN, což ukazuje, že interakce 7s-Kv4N je specifická.
Krysí 7s je exprimován ve významně vyšších koncentracích v mozku a ledvinách než v plících, srdci, játrech, varlatech a kosterním svalu, jak bylo určeno northernovou analýzou.
Příklad 20: Identifikace a charakterizace krysího 29x a 25r
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genu kódujícího krysí 29x. Krysí 29x se izoloval jako pozitivní klon z kvasinkového 2-hybridového testu popsaného výše, za použití rKv4.3N jako záchytného činidla. Krysí 25r je variantou 29x s alternativním sestřihem. Liší se v 5' netranslatovaném regionu, ale je identický v kódujícím regionu a na aminokyselinové úrovni.
Nukleotidová sekvence krysí 29x cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 29x polypeptidů jsou uvedené na obr. 30 a v SEQ ID NO:60 a 61, v příslušném pořadí. Krysí 29x cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnost přibližně 40,4 kD a délku 351 aminokyselin.
Nukleotidová sekvence krysí 25r cDNA je uvedená na obr. 31 a v SEQ ID NO:62. Krysí 25r cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnost přibližně 40,4 kD a délku 351 aminokyselin.
Krysí 29x je exprimován ve slezině, plících, ledvinách, srdci, mozku, varlatech, kosterním svalu a játrech, s nejvyšší >· · • ·· · • to to » ···«
204 •· ·· ··
9 9 · · • · ·♦· « * ·· ·· 999 · • toto · to 9 9 9 • to ·· ·· toto expresí ve slezině a nejnižší v játrech.
Krysí 29x se váže na rKv4.3N a rKv4.2N s mírnou preferencí pro rKv4.3N v kvasinkovém 2-hybridovém testu. Naopak, 29x se neváže na rKvl.lN, což ukazuje, že interakce 29x-Kv4N je specifická.
Krysí 29x je identický na aminokyselinové úrovni s krysím SOCS-1 (Suppressor Of Cytokine Signaling), jak je popsán v Starr R. et al. (1997) Nátuře 387: 917-921; s JAB, jak je popsán v Endo T.A. et al. (1997) Nátuře 387: 921—924; a s SSI1 (STAT-indukovaný STÁT inhibitor-1), jak je popsán v Naka T. et al. (1997) Nátuře 387:924-928. Tyto proteiny jsou charakterizované tím, že mají SH2 doménu, váží se na a inhibují JAK kinasu, a tím regulují cytokinovou signalizaci.
Termín SH2 doména, též Src homologní 2 doména, označuje proteinovou doménu délky přibližně 100 aminokyselin, která se podílí na vazbě fosfotyrosinových zbytků, např.
fosfotyrosinových zbytků v jiných proteinech. Cílová místa se označují jako SH2-vazebná místa. SH2 doména má konzervovanou 3D strukturu skládající se ze dvou alfa šroubovic a šesti až sedmi beta-řetězců. Jádro SH2 domény je tvořeno kontinuálním beta-meandrem složeným ze dvou spojených beta-listů (Kuriyan J. et al. (1997) Curr. Opin. Struct. Biol. 3:828-837). SH2 domény účinkují jako regulační moduly intracelulární signalizační kaskády tím, že interaguji s vysokou afinitou s fosfotyrosin-obsahujícími cílovými peptidy způsobem specifickým pro sekvenci a závislým na fosforylaci (Pawson T.
(1995) Nátuře 373:573-580). Některé proteiny obsahují více SH2 domén, které zvyšují jejich afinitu vazby k různým fosfoproteinům nebo způsobují jejich schopnost vázat se na různé fosfoproteiny. Krysí 29x obsahuje SH2 doménu v ···· ·
205 ··· · • · • · ·
aminokyselinových zbytcích 219-308 SEQ ID NO:61.
Fosforylace tyrosinu reguluje aktivitu draslíkového kanálu (Prevarskaya N.B. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:2429224299). JAK kinasa fosforyluje proteiny na tyrosinech a předpokládá se je podíl na regulaci aktivity kanálu (Prevarskaya N.B. et al., výše). Tak mohou, v důsledku své homologie se SOCS-1, JAB a SSI-1, krysí 29x modulovat aktivity draslíkových kanálů, např. Kv4, jelikož modulují aktivitu JAK kinasy.
Příklad 21: Identifikace a charakterizace krysího 5p
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genu kódujícího krysí 5p. Krysí 5p se izoloval jako pozitivní klon z kvasinkového 2-hybridového testu popsaného výše, za použití rKv4.3N jako záchytného činidla.
Nukleotidové sekvence krysí 5pc DNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 5p polypeptidů jsou uvedené na obr. 32 a v SEQ ID NO:63 a 64, v příslušném pořadí. Krysí 5p cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnost přibližně 11,1 kD a délku 95 aminokyselin.
Krysí 5p se váže na rKv4.3N a rKv4.2N se stejnou silou ve kvasinkovém 2-hybridovém testu. Naopak, 5p se neváže na rKvl.lN, což ukazuje, že interakce 5p-Kv4N je specifická.
Krysí 5p je exprimován ve slezině, plících, kosterním svalu, srdci, ledvinách, játrech a varlatech, jak bylo určeno northernovou hybridizací.
Krysí 5p je identický s lehkým řetězcem krysího Calpactinu ··
99 9
206
9999 • ·· 99 • 9 9 19
1 ‘ - ----
• · · • · · • 9 9 · *· «·
I nebo P10 (přírůstkové číslo P05943). P10 se váže na a indukuje dimerizaci annexinu II (p36). P10 může účinkovat jako regulátor fosforylace proteinu v tom, že p36 monomer je výhodným cílem tyrosin-specifické kinasy (Masiakowski P. et al. (1998) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85 (4): 1277-1281).
Fosforylace tyrosinu reguluje aktivity draslíkových kanálů (Prevarskaya N.B. et al., výše). Tak může, díky své identitě s P10, krysí 5p modulovat aktivity draslíkových kanálů, např., Kv4, tím, že moduluje aktivitu tyrosin-specifické kinasy.
Příklad 22: Identifikace a charakterizace krysího 7q
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genu kódujícího krysí 7q. Krysí 7q se izoloval jako pozitivní klon z kvasinkového 2-hybridového testu popsaného výše, za použití rKv4.3N jako záchytného činidla. Kompletní krysí 7q se získal RACE PCR.
Nukleotidová sekvence krysí 7q cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 7q polypeptidu jsou uvedené na obr. 33 a v SEQ ID NO:65 a 66, v příslušném pořadí. Krysí 7q cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnost přibližně 23,5 kD a délku 212 aminokyselin.
Krysí 7q se váže na rKv4.3N a rKv4.2N se stejnou silou ve kvasinkovém 2-hybridovém testu. Naopak, 7q se neváže na rKvl.lN, což ukazuje, že interakce 7q-Kv4N je specifická.
Krysí 7q je exprimován v srdci, mozku, slezině, plících, játrech, kosterním svalu, ledvinách a varlatech, jak bylo určeno northernovou analýzou.
4 4 4 4
207 ·· 4 ·· 44
4 4 444 44 ·
444 · 4444 4 4 4
4444444 44 444 4 4 • 4 4 4 44 4 4 · 4 ··*· · 44 44 44 44
Krysí 7q je identická s RAB2 (krysím RAS-příbuzným proteinem, přírůstkové číslo P05712) na aminokyselinové úrovni. RAB2 se patrně podílí na transportu vesikul a proteinů (Touchot N. et al. (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 84 (23): 8210-8214). Proto se může, v důsledku své homologie s RAB2, krysí 7q podílet na transportu draslíkového kanálu, např. Kv4.
Příklad 23: Identifikace a charakterizace krysího 19r
V tomto příkladu je popsána identifikace a charakterizace genu kódujícího krysí 19r. Částečný krysí 19r se izoloval jako pozitivní klon z kvasinkového 2-hybridového testu popsaného výše, za použití rKv4.3N jako záchytného činidla. Kompletní krysí 19r se získal RACE PCR.
Nukleotidová sekvence krysí 19r cDNA a předpokládaná aminokyselinová sekvence krysího 19r polypeptidů jsou uvedené na obr. 34 a v SEQ ID NO:67 a 68, v příslušném pořadí. Krysí 19r cDNA kóduje protein mající molekulovou hmotnost přibližně 31,9 kD a délku 271 aminokyselin.
Krysí 19r je exprimován v srdci, mozku, slezině, plících, játrech, kosterním svalu, ledvinách a varlatech, jak bylo určeno northernovou analýzou.
Krysí 19r se váže na rKv4.3N a rKv4.2N s mírnou preferencí pro rKv4.3N v kvasinkovém 2-hybridovém testu. Naopak, 19r se neváže na rKvl.lN, což ukazuje, že interakce 19r-Kv4N je specifická.
Krysí 19r je identická s krysím fosfatidylinositol (PTDINS) transferovým proteinem alfa (PTDINSTP, přírůstkové • · · · ···· · · • « ·· · • ·
208 ·« ··· ·
číslo M25758 nebo P16446), jak je popsán v Dickeson S.K. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:16557-16564. Předpokládá se, že PTDINSTP se podílí na signalizaci fosfolipasy C-beta (PLCbeta), syntéze fosfatidylinositol-transferového proteinu (Ptdlns-TP), tvorbě sekrečních vesikul a zesílení aktivity fosfatidylinositol-3-kinasy (Ptdlns 3-kinasy) (Cunningham E. et al. (1995) Curr. Biol. 5 (7): 775-783; (1995) Nátuře 377 (6549): 544-547; a Panaretou C. et al. (1997) J. Biol. Chem.
272 (4) : 2477-2485) .
Proto, v důsledku své homologie s PTDINSTP, může krysí 19r modulovat aktivitu draslíkového kanálu, např. Kv4, cestou PLCbeta signální dráhy a/nebo Ptdlns 3-kinasové signální dráhy. Krysí pl9r se může také podílet na transportu draslíkového kanálu, např. Kv4.
Příklad 24: Chromosomální lokalizace lidského 9q
V tomto příkladu se lidský PCIP 9q chromosomálně mapuje za použití panelu radioaktivních hybridů (Panel GB4). h9q se lokalizuje do regionu chromosomu lOq, o kterém bylo dříve zjištěno, že obsahuje vazbu na epilepsii, konkrétně D10S192: 10q22-q24 (Ottman et al. (1995) Nátuře Genetics 10:56-60) (viz obr. 43). Podle tohoto pozorování předkládaný vynález jasně ukazuje, že 9q rodina proteinů může sloužit jako cílová rodina proteinů pro vývoj antiepileptik a cílů pro lékařskou intervenci při epilepsii.
Dále, h9q se lokalizoval do regionu chromosomu lOq, o kterém bylo dříve zjištěno, že obsahuje vazbu s IOSCA, konkrétně D10S192 a D10S1265: 10q24- Nikali (Genomics 39:185191 (1997)) (viz obr. 42 a 43). Podle tohoto pozorování předkládaný vynález jasně ukazuje, že 9q rodina proteinů může • 0« 0 • · 0
0000 0 0
0
0
0·
209
0000
sloužit jako cílová rodina proteinů pro vývoj léků proti spinocerebelární ataxii a že tato rodina může také sloužit jako cílová skupina pro medikamentosní intervenci při spinocerebellární ataxii.
Příklad 25: Kyselina arachidonová v modulaci KV4/KChIP kanálů
Modulace kinetiky Kv4 proudu kyselinou arachidonovou je KChlP depěndentní
Bylo prokázáno, že kyselina arachidonové (AA) inhibuje rekombinantní Kv4 proud exprimovaný v Xenopus oocytech (Villarroel, A. a Schwarz, T. L. (1996) J. Neuroscience 16:2522-32). Nicméně, modulace byly pozorovány pouze pro maximální amplitudy proudu, zatímco parametry kinetiky proudu nebyly ovlivněny přítomností AA. Naopak, záznamy z membránových kontaktů z hippokampálních neuronů ukázaly, že kromě snížení maximální amplitudy AA mění parametry kinetiky A-proudu v Kv4 kanálech (Keros, S. a McBain, C. J. (1997) J. Neuroscience 17: 3476-87). Důležité je, že inaktivační časová konstanta byla významně snížena (poznámka: inaktivační časová konstanta je nepřímo úměrná rychlosti inaktivace. Proto byla inaktivace zrychlena (Keros (1997), výše).
V tomto příkladu byla zkoumána hypotéza, že v KChlP chybí pomocné podjednotky, což odpovídá za výše uvedené rozdíly v kinetice, pomocí exprese Kv4 samostatně nebo společně s KChlP v CHO buňkách a Xenopus oocytech, a měřením jejich inaktivačních časových konstant (za použití technik známých v oboru, jak jsou popsány, například, v An et al. (2000) Nátuře
403:553-6; Keros, S. a McBain, C. J. (1997) J. Neuroscience
17: 3476-87; a Villarroel, A. a Schwarz, T. L. (1996) J.
Neuroscience 16:2522-32).
9 9
9 9
9 999
9 9 9 • · · · ·· 99
9
9 9
9 9
9999 9
9
999 9 9 ·« » *· ·
210
Modulace kinetiky Kv4 kyselinou arachidonovou byla KChlPdependentní (Tabulka 3). Když byl Kv4.2 exprimován samostatně v CHO buňkách, tak byla inaktivační časová konstanta výsledného proudu nezměněna za nepřítomnosti nebo přítomnosti 10 μΜ kyseliny arachidonové (32 ± 3 vs. 32 ± 2 ms ± průměrná standardní chyba (SEM)). Naopak, při současné expresi s KChIPl, byla inaktivační časová konstanta Kv4.2 proudu snížena z 88 ± 8 ms za nepřítomnosti kyseliny arachidonové na 37 ± 3 ms za přítomnosti 10 μΜ kyseliny arachidonové. Podobné výsledky byly získány s KChIPl (Tabulka 4) a KChIP2 v Xenopus oocytech. Tyto výsledky ukazují, že modulace kinetiky Kv4 proudu kyselinou arachidonovou je závislá na přítomnosti KChlP. Změna kinetiky Kv4/KChIPs za přítomnosti kyseliny arachidonové je v souladu se změnou popisovanou na neuronálních membránách [Keros (1997), výše], což podporuje předpoklad, že KChlP jsou endogenní podjednotky Kv4 proudu.
Je třeba poznamenat, že kyselina arachidonové také snižuje maximální amplitudu Kv4/KChlP proudu v CHO buňkách i Xenopus oocytech (Tabulky 3 a 4). Toto ukazuje, že modulace maximální amplitudy Kv4 proudu je nezávislá na KChlP.
Tabulka 3. Modulace Kv4 a Kv4/KChIPl proudů v CHO buňkách kyselinou arachidonovou.
Kv4.2 Kv4.2 KV4.2/KChIPl KV4.2/KChlPl
ΟμΜΑΑ ΙΟμΜΑΑ 0 μΜ AA 10 μΜ AA
Inaktivační časová konstanta (ms ± SEM) 32 ±3 32 ± 2 88 ±8 37 ±3
Maximální amplituda (pA ± SEM) 620 ± 80 336 ± 82 4539 ± 448 2827 ± 496
9* • · ·
• 9 **9 9
211
9 999 « 9 9
Vlivy kyseliny arachidonové na A-proud byly také zkoumány v neuronálním systému (kultivovaných primárních mozečkových neuronech), kde jsou přítomné jak Kv4, tak KChlP. TEA (10 mM) se aplikovala pro blokování slabé prodloužené vnější složky. Inaktivační časové konstanty A proudu za nepřítomnosti a přítomnosti 10 μΜ kyseliny arachidonové byly 44 ± 5 ms a 21 ± ms (průměr ± SEM), v příslušném pořadí. Příslušná maximální amplituda byla snížena z 2,0 ± 0,6 nA na 1,2 ± 0,4 nA. Tyto výsledky potvrzují, že kyselina arachidonové moduluje jak amplitudu Kv4 A-proudu, tak jeho kinetiku v přirozených buňkách.
Modulace Kv4/KChlP proudu kyselinou arachidonovou je závislá na koncentraci a reverzibilní
Vlivy různých koncentrací kyseliny arachidonové na Kv4/KChlP proud se studovaly na Xenopus oocytech. Protože jsou fyziologické koncentrace kyseliny arachidonové často 10 μΜ (Needleman, et al., 1986 Annu Rev Biochem 55:69-102; Anderson a Welsh, 1990, Proč Nati Acad Sci USA 87:7334-8; Meves,
1994, Prog Neurobiol 43:175-86), byla kyselina arachidonové testována v koncentracích 1-10 μΜ. Blokáda maximální amplitudy Kv4.3 proudu závislá na koncentraci byla nezávislá na přítomnosti KChIPl (viz obr. 64A). Dále, sklon snížení amplitudy v závislosti na zvýšení koncentrací byl velmi podobný za nebo bez přítomnosti KChlP. Blokáda maximálního proudu se nejevila být saturovaná nad 10 μΜ. Villarroel a Schwarz, (1996) J. Neurosci 16:2522-32 popsali, že IC50 kyseliny arachidonové pro Kv4 a podjednotky byla v oocytech přibližně 8 μΜ. Inaktivační časová konstanta za nepřítomnosti KChIPl byla nezměněna při všech testovaných koncentracích kyseliny arachidonové. Nicméně, za přítomnosti KChIPl se inaktivační časová konstanta snížila v závislosti na
212 ·· · • φ ··· · • · · · * * · φ • · * · · φφφ · · · • ΦΦΦΦ Φ φ 9 9 9 9 9 9 9
Φ 9 9 9 9 9 9 9 9
9999 « ·· «φ ·« 99 koncentraci (viz obr. 64Β).
Nástup KChIP-dependennít akcelerace inaktivace a KChlPindependentní blokády proudu Kv4.3 10 μΜ kyseliny arachidonová byl téměř okamžitý (obr. 65). Alespoň část mírné prodlevy (14 sekund) se přisuzuje transportu roztoku ze zásobníku do měřící komory. Blokáda amplitudy se postupně rozvíjela v závislosti na čase (obr. 65A) . Přítomnost KChIPl významně neměnila ani procento snížení, ani rychlost blokády proudu v čase, ani neměnila rychlost zotavení Kv4.3 proudové amplitudy v čase (obr. 65A). Oproti postupnému rozvoji blokády amplitudy se KChlPl-dependentní efekt na Kv4 kinetiky objevil mnohem rychleji po perfusi kyseliny arachidonové, a měl tendenci rychle dosáhnout plato (obr. 65B). Když byla kyselina arachidonová vymyta, tak se Kv4.3 proudová amplituda a inaktivační časové konstanty plni zotavily s podobnými rychlostmi za přítomnosti KChIPl (srovnej obr. 65A a 65B).
Dva malé poklesy v grafu pro Kv4.3 samostatně na panelu B byly artefakty způsobené změnami v pufru.
Modulace Kv4/KChIP proudu jinými mastnými kyselinami
Již dříve bylo prokázáno, že některé mastné kyseliny napodobují účinky kyseliny arachidonové na Kv4 proud v Xenopus oocytech, když je Kv4 a exprimován samostatně (Villarroel a Schwarz, J Neurosci 16:2522-32 (1996)). Proto byla zkoumána selektivita mastných kyselin pro Kv4 proud za přítomnosti KchIP. Kyselina arachidonová je 20-uhlíková mastná kyselina nesoucí ětyoi cis dvojné vazby, s první dvou vazbou na C5 (20:4 c5). Byly testovány následující analogy kyseliny arachidonové s odlišnými strukturálními vlastnostmi: kyselina γ-linolenová (18:3 c9), která má tři cis dvojné vazby místo čtyř dvojných vazeb, kyselina linolelaidová (18:2 t9) mající ·· · ·* ·· «·· ι *· « · · • · · · · ··· · · · • ···· ········ « • · ···· · » · · *»·· · ·· ·· ·· ·· ·· ····
213 dvě dvojné vazby místo čtyř cis dvojných vazeb, kyselina 5,8,11,14-eikosatetraynová (ETYA, 20:4 n5) mající čtyři trojné vazby místo dvojných vazeb v kyselině arachidonové (n ukazuje pozici první trojné vazby), a kyselina 5,8,11-eikosatriynoová (ETI, 20:3 n5) mající tři trojné vazby. Obr. 66A ukazuje, že maximální amplituda Kv4.3 proudu byla významně snížena ve srovnání s kontrolou bez mastné kyseliny 10 μΜ kyseliny γlinolenové, ETI, ETYA a kyseliny arachidonové, nezávisle na přítomnosti KChIPl. Procento inhibice amplitudy Kv4 samostatně a Kv4/KChIP nebylo pro tyto mastné kyseliny významně odlišné. Malý, statisticky významný blok Kv4 proudové amplitudy 10 μΜ kyseliny linolelaidová byl pozorován za přítomnosti KChIPl, ale ne za absence KChIPl, když byly hodnoty srovnávány s příslušnými kontrolami. Nicméně, nebyl pozorován významný rozdíl při srovnání Kv4.3 a Kv4.3/KChIP KChIPl.
Za absence KChIPl nevykazovala žádná z mastných kyselin statisticky významný efekt na Kv4.3 inaktivační časovou konstantu (obr. 66B). Pouze ty mastné kyseliny, které způsobovaly významnou blokádu proudu nezávisle na KChlP (kyselina γ-linolenová, ETI, ETYA a kyselina arachidonové) redukovaly Kv4.3 inaktivační časovou konstantu, když byly exprimovány současně s KChIPl. Kyselina linolelaidová, která vykazovala pouze stoední KChIP-dependentní blokádu Kv4.3 proudu, neovlivňovala Kv4.3 inaktivační časovou konstantu (obr. 66B). Tak mohou některé mastné kyseliny s dlouhým řetězcem imitovat kyselinu arachidonovou v modulaci kinetiky Kv4 proudu v závislosti na KChlP. Obecně, existuje souvislost mezi schopností dané mastné kyseliny blokovat maximální amplitudu a modifikovat kinetiky rekonstituovaného Kv4/KChIP proudu.
Kyselina arachidonové nenarušuje asociaci Kv4 a KChlP • · • ·
214 • · · · · · · · · • · · * · »»· · · · ······· ·· ··· · · • · ···· ···· ···· · ·· ·· ·· ··
V tomto příkladu byly použity následující testy.
Vazebný test in vitro
N-terminálni doména krysího Kv4.3 byla exprimována jako GST fúze (GST-Kv4.3N) a přečistila se z E.coli v podstatě podle protokolů dodaných Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, New Jersey). Rekombinantní krysí KChIPl protein byl nejprve exprimován a přečištěn jako GST-fúze, potom byla GST skupina odštěpena za použití PreScission proteasy (Amersham Pharmacia Biotech) za zisku volného KCHIP1 proteinu. Oba GST-Kv4.3N a KChlP proteiny měly >95% čistotu, jak bylo zjištěno barvením denaturačních gelů Coomassie barvivém. Vazebné testy in vitro byly provedeny za použití Biacore 3000 od Biacore AB v Uppsale, Švédsku. Experimenty byly provedeny ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS), pH 7,4, s 1 mM CaCl2 a 0,05% polysorbatem P-20. Anti-GST protilátka (Biacore AB) byla navázána na 3 průtokové kyvety CM-5 čipu (Biacore AB) v hladině 2000 resonančních jednotek (RU) za použití aminové vazby. Výsledná průtoková kyveta se aktivovala a blokovala ethanolaminem, který se použil jako referenční kontrolní povrch. GST-Kv4.3N terminální doména se zachytila na dvou anti-GST průtokových kyvetách a GST samostatně se navázal na třetí anti-GST průtokovou kyvetu v hladině 150 RU. Přečištěný KChIPl v koncentraci 1 μΜ v přítomnosti a absenci 10 μΜ kyseliny arachidonové se potom injikoval do všech čtyř průtokových kyvet. Také se injikovala kyselina arachidonová (10 μΜ) samostatně. Data jsou uvedena jako sensogramy s odečtem GST referenčních hodnot.
Kvasinkové 2-hybridové kmeny a růstové testy • · • ·
215 • · · · · • · · · • · · · • ······ ·· · • · · · · · • ··· » ·· ··
Diploidní kmeny obsahující zachycovací činidlo (Nterminální doménu Kv4.3 nebo prázdný vektor pGBT9) a rybí (KChIPl) plasmidy se získaly popsaným způsobem (An, et al., 2000). Pro synchronizaci se kmeny kultivovaly do saturace před tím, než byly naočkovány při stejné OD600 hodnotě do 5 ml synthetického kompletního-TrpLeuHis drop-out (SC-WLH) media, které selektuje interakce-dependentní růst, nebo do 5 ml SC-WL media, které je neselektivní za přítomnosti nebo absence 10 μΜ ETYA. Medium obsahoval 5 mM 3-AT (3-amino-l,2,4-triazolu) pro potlačení slabé samoaktivační aktivity od Kv4.3 N-terminální záchytné domény. Kultury se kultivovaly po dobu 17 hodin při 30°C a hodnoty OD600 se odečítaly spektrofotometrem.
Pro testování hypotézy, že kyselina arachidonová účinkuje prostřednictvím interference s vazbou mezi Kv4 a KChlP, se měření povrchové plasmonové rezonance (Biosensor) nejprve použilo pro měření asociační a disociační fáze Kv4-KChIP interakce za přítomnosti a absence kyseliny arachidonová. Intracelulární N-terminální doména Kv4.3 se exprimovala jako GST fúzní protein (GST-Kv4.3N) a imobilizovala se na povrchu Biosensor čipu. Rekombinantní KChIPl protein se nechal projít přes povrch čipu za přítomnosti a absence 10 μΜ kyseliny arachidonové. Jak je uvedeno na obr. 67A, byl KChIPl protein navázán na GST-Kv4.3N povrch, ale nebyly pozorovány kvalitativní rozdíly ani v on-fázi, ani v off-fázi asociace KChIPl a Kv4.3 N-terminální domény. Výsledky z testu na Biosensoru byly dále potvrzeny ve kvasinkovém 2-hybridovém systému, kde Kv4-KChIP interakce-dependentní růst na selektivním SC-WLH mediu nebyl postižen 10 μΜ ETYA (obr. 67B) . ETYA byla použita v těchto pokusech místo kyseliny arachidonové proto, že ačkoliv jak ETYA, tak kyselina arachidonová ovlivňuji Kv4 proud téměř identicky, je ETYA nemetabolizovatelná a proto je vhodnější pro tento pokus.
• · • · • · · · · ·
Dohromady tyto výsledky ukazují, že testované mastné kyseliny nenarušují asociaci mezi Kv4 a KChIP.
216
Kv4/KChIP je více sensitivní na modulaci kyselinou arachidonovou než Κνί.ΐ/Κνβΐ
Alfa podjednotky iontových kanálů tvořící póry, včetně podjednotek draslíkových kanálů, často nepracují samostatně. Asociují se s pomocnými podjednotkami a tyto pomocné podjednotky mohou výrazně měnit aktivitu kanálu. Tak je užitečnější studovat alfa podjednotky v kombinaci s jejich pomocnými podjednotkami, protože fyziologicky relevantní kanály jsou komplexy alfa- a pomocných podjednotek.
Bylo zjištěno, že když jsou rekombinantní Kv4 alfa podjednotky exprimovány samostatně, tak jsou citlivější na inhibici kyselinou arachidonovou než alfa podjednotky několika dalších draslíkových kanálů otevíraných napětím (např., Kvl.l) (Villarroel (1996), výše). Nicméně, tato práce vyšetřovala modulaci kyselinou arachidonovou pouze pro alfa podjednotky kanálů. Nebylo známo, zda je Kv4 proud citlivější na modulaci kyselinou arachidonovou než jiné proudy kanálu, když se kanály testují za přítomnosti příslušných pomocných podjednotek.
V tomto příkladu se toto testovalo pomocí měření dvou komplexů alfa- a pomocné podjednotky: Kv4.3/KChIPl a Κνί.ΐ/Κνβΐ. (Κνβΐ, která je jednou klasickou beta podjednotkou draslíkového kanálu, dramaticky mění kinetiky Kvl.l). Kv4.3/KChIPl a Κνί.ΐ/Κνβΐ byly exprimovány, v příslušném pořadí, v Xenopus oocytech a jejich získané proudy byly zaznamenávány za přítomnosti nebo absence 10 μΜ kyseliny arachidonové. Výsledky ukázaly, že maximální amplituda Κνί.ΐ/Κνβΐ proudu nebyla významně zvýšena za přítomnosti 10 μΜ • · • ·
217 • · · · · · · • · · 4··· · · · ······ · · ··· · · • · · · · ···· • · · · · · · · · kyseliny arachidonové (11 ± 4 na 14 ± 1 μΑ), zatímco maximální amplituda Kv4.3/KChIPl se výrazně snížila (44 ± 10 na 21 ± 4 μΑ, Tabulka 4). Kineticky byl KvKv4.3/KChIPl mnohem citlivější na modulaci kyselinou arachidonovou než Κνί.ΐ/Κνβΐ (Tabulka
4). Ačkoliv 10 μΜ kyseliny arachidonové nezpůsobuje statisticky významn snížení inaktivační časové konstanty Κνί.ΐ/Κνβΐ (11 ± 1 na 9 ± 1 ms), snižuje stejná koncentrace kyseliny arachidonové významně inaktivační časové konstanty Kv4.3/KChIPl z 104 ± 7 na 55 ± 4 ms). Tyto výsledky ukazují, že kyselina arachidonové snáze moduluje v normálních neuronech kinetiku a amplitudu Kv4/KChIPs draslíkového proudu než kinetiku a amplitudu Κνί.ΐ/Κνβΐ.
Tabulka 4. Kyselina arachidonové v modulaci Kv4, Kv4/KChIPl, Kvl.l, Κνί.ΐ/Κνβΐ proudů v Xenopus oocytech.
Kv4.3 Kv4.3 KV4.3/KChI PÍ KV4.3/KCM PÍ Kvl.l Kvl.l Kvl.l/Kv βΐ Kvl.l/Kv βΐ
0 μΜ AA 10 μΜ AA ΟμΜΑΑ ΙΟμΜΑΑ ΟμΜ AA 10 μΜ AA ΟμΜΑΑ 10 μΜ AA
Inaktivačn í časová konstanta (ms ± SEM) 75 ± 7 66 ± 6 104 ± 7 55 ± 4 N.A. N.A. 11± 1 9± 1
Maximální amplituda (μΑ± SEM) 30 ± 7 13 ±1 44 ± 10 21 ± 4 19 ± 2 21 ± 3 11 ± 4 14 ± 1
Příklad 26: Protein 2 interagující s K-kanálem (KChIP2), jeho varianty s alternativním sestřihem, chromosomální organizace a lokalizace • ·
218
V uvedené příkladu se identifikovaly varianty KChIP2 a jejich chromosomální organizace za použití standardních technik. KChIP2 geny jsou na aminokyselinové úrovni mezi člověkem, krysou a myší vysoce konzervovány. Různé lidské varianty s alternativním sestřihem se identifikovaly prohledáváním databází a vyšetřováním cDNA knihoven. Alternativním sestřihem vznikají N-terminální domény variabilní délky, ale základní C-terminální doména je dostatečná pro asociaci s a modulaci Kv4 . Lidský KChIP2 gen je v rozsahu přibližně 18 kb v q23 regionu lidského chromosomu 10 mezi WI-8488 a WI-6750. Tento region je syntenický s myším chromosomem 19 mezi D19Mit40 a D19Mitll. Krysí varianta objevená při prohledávání databáze má změněných posledních pět aminokyselin a zachovává si schopnost asociace a modulace Kv4. Proto se zdá, že tyto různé varianty KChIP2 účinkují v modulaci Kv4 podobně.
Příklad 27: Funkce a exprese KChIPIL
RT-PCR byla provedena pro hodnocení tkáňové exprese krysí KChIPll (KChIPl long) varianty s alternativním sestřihem.
PolyA+ RNA ze srdce, mozku, plic, sleziny, jater, kosterního svalu, ledvin a varlat byla zakoupena od Clontech. RT-PCR byla provedena za použití One-step RT-PCR kitu od Clontech s amplifikací 5' primeru GGTACCTTCTCGTCCCTGCAGACCAAACAAAG (SEQ ID NO:104) a 3' primer CGGTAAAGGACTTGCAGTTCTCTC (SEQ ID NO:105) s modifikacemi PCR podmínek: 50°C po dobu 1 hodiny;
94°C po dobu 3 minut; 50 cyklů 94°C po dobu 30 sekund, 65°C po dobu 30 sekund, a 68°C po dobu 2 minut. 5' primer je specifický pro KChIPl. Jak KChIPl, tak KChIPll může být amplifikován za použití stejné sady primerů, za zisku dvou různě velkých PCR produktů, které se separují při elektroforese do dvou proužků.
• · _ . Λ ··· ··♦·· ·· ·
71Q · ···· ········ · · · ···· ···· ···· « ·· ·· ·· ··
KChIPll-specifický proužek byl pozorován pouze v mozku, což ukazuje, že je specificky exprimován v mozku. Stejná reakce také ukázala silný KChIPl-specifický signál v mozku a slabě viditelný proužek v kosterním svalu. Žádné KChIPl nebo KChIPll signály nebyly pozorovány v jakékoliv jiné testované tkání Závěrem lze říci, že KChIPll exprese je specifická pro mozek, s velmi slabou expresí v kosterním svalu.
Funkce KChIPll Xenopus oocytech byla také testována.
Kv4.3 cRNA se injikovala do Xenopus oocytů s nebo bez KChIPll cRNA. Podobně jako KChIPl zvyšoval KChIPll maximální amplitudu Kv4.3 z 15 ± 4 ± na 55 ± 7 μΑ a zvyšoval inaktivační časovou konstantu z 56 ± 4 na 100 ± 8 ms (Tabulka 5). Tato data ukazují, že KchiPll, jako KChIPl, moduluje maximální amplitudu a kinetiky Kv4 proudu in vitro.
Za předpokladu, že společných C-terminálních 185 aminokyselin v KChIPl a KChIPll je odpovědných za vazbu na Kv4.3, je pravděpodobné, že KChIPll ko-asociuje s Kv4 v mozku. Inserce dalších aminokyselin do KChIPll proteinu může být významná pro neznámé funkce, a DNA sekvence kódující tyto aminokyseliny může být použita jako specifický genový markér pro detekování buněk a/nebo tkání se specifickou expresí této určité varianty s alternativním sestřihem.
DNA a proteinové sekvence specifické pro Kchlll varianty s alternativním sestřihem jsou identické mezi krysou a člověkem. Proto lze funkční data získaná pro KChIPll molekuly z jednoho druhu použitelná též pro druhý druh.
Tabulka 5. Modulace Kv4.3 prostřednictvím KChIPll a KChIPlN.
220
Kv4.3 ko-exprimován s ne KChIPll KChIPl KChIPlN
Inaktivační časová konstanta (ms ± SEM) 56 ± 4 100 ± 8 112± 3 1778 ± 136
Maximální amplituda (μΑ ± SEM) 15 ± 4 55 ± 7 59 ± 5 18± 3
Příklad 28: Funkce a exprese KChIPlN
Exprese krysího KChIPlN se hodnotila za použití Taqman techniky se sondou GGCAAAGAAGCGCGATTTT (SEQ ID NO:106), kódujícím primerem TCCCGGGTAGGCAAGCA (SEQ ID NO:107), a reverzním primerem CCTGCTCAAGCCCAGCACTGCA (SEQ ID NO:108). Sonda je specifická pro KChIPlN. Jak je uvedeno na obr. 68, KChIPlN je exprimován především v dorsálních kořenových gangliích (DRG), a slabě v míše mozku.
Také se hodnotila funkce KChIPlN v Xenopus oocytech.
Kv4.3 cRNA se injikovala do Xenopus oocytů s nebo bez KChIPlN cRNA. Oproti KChIPl a KChIPll, KChIPlN neovlivňoval maximální amplitudu Kv4.3 (15 ± 4 vs. 18 + 3 s nebo bez KChIPlN, tabulka 5). Překvapivě KChIPlN způsoboval mnohem větší zvýšení inaktivační časové konstanty Kv4.3 než KChIPl nebo KChIPll (32-násobné zvýšení při KChIPlN vs. ~2-násobné zvýšení pro KChIPl nebo KChIPll; tabulka 5).
Uvedená data ukazují, že KchiPlN modulují Kv4 proud in vitro způsobem odlišným od KChIPl nebo KChIPll. Za prvé, zvýšení inaktivační časové konstanty KChIPlN bylo významně vyšší ve srovnání se zvýšením způsobeným KChIPl nebo KChIPll.
V důsledku toho byl KChIPlN schopen rychleji měnit inaktivační • 4
221
Kv4.3 proud (téměř kompletně inaktivovaný během 200 ms) na téměř neinaktivační na 500 ms sekund +40 voltový puls. Za druhé, KChIPlN, při testované koncentraci, neovlivňoval maximální amplitudu Kv4. Protože KChIPl varianty s alternativním sestřihem mají společných C-terminálních 196 aminokyselin, ukazují tato data na důležitou a odlišnou funkci jedinečné 36-aminokyselinové N-terminální domény KChIPlN.
Příklad 29: Funkce KChIP2 varianty s alternativním sestřihem
V tomto příkladu se testovala funkce KChIP2 varianty s alternativním sestřihem, krysího KChIP21, lidského KChIP2s a krysího KChIP2C v Xenopus oocytech. Výsledky těchto pokusů jsou shrnuty v následující tabulce.
Tabulka 6. Modulace KV4 proudu KChIP2 variantou s alternativním sestřihem.
Kv4.3 ko-exprimovaný s KChIP21 KCMP2m KChIP2s KCWP2C none
Maximální amplituda (pA±SEM) 51 ± 4 40 ± 4 44± 3 44 ±5 14± 3
Inaktivační časová konstanta (ms ± SEM) 87 ± 4 70 ± 2 90 ± 3 74 ±4 55 ± 4
Data ukazují, že tyto KChIP2 varianty s alternativním sestřihem modulují Kv4 proud podobně jako KChIP2m (Tabulka 6). Protože mezi krysím a lidským KChIP2 existuje na aminokyselinové úrovni extrémně vysoká homologie (>95%), předpokládá se, že výsledky získané za použití KChIP2 molekul od jednoho druhu budou podobné jako výsledky pro KChIP2 molekuly od druhého druhu.
Příklad 30: Funkce a exprese KChIP4 •· 9*9 9
999 99 99
9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99 9 9 9 9
Μ 9 9999 9 9 9 9 9 9 9 9 9
LLL 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·«·· · ·· ·· ·· ··
Northernová hybridizace byla provedena pro určení tkáňové exprese KChIP4. Sonda, získaná z 3'UT regionu krysího KChIP4 (598-909) společného pro všechny N-terminální varianty s alternativním sestřihem KChIP4, se použila pro sondování krysích Clontech MTN Northernový membrán. Ze tkání přítomných na Northernových membránách (srdce, mozek, plíce, slezina, ledviny a varlata) byl predominantní proužek velikosti přibližně 2,4 kb pozorován pouze v mozku. Slabý proužek s o něco vyšší mobilitou byl přítomen též v ledvinách. Proto je zřejmé, že N-terminální varianty KChIP4 s alternativním sestřihem jsou exprimovány především v mozku a méně v ledvinách.
Schopnost KChIP4 asociovat s Kv4 byla také testována za použití kvasinkového 2-hybridového testu. H doména KChIP4 (Cterminálních 185 aminokyselin), která je společná pro všechny N-terminální varianty KChIP4 s alternativním sestřihem a homologní s dalšími KChIPs, byla exprimována jako ryby a Nterminální domény Kv4.3, Kv4.2 byly exprimovány jako návnady (Kv4.3N, Kv4.2N, v příslušném pořadí) za použití standardních technik. KChIP4H se asocioval s Kv4.3N a Kv4.2N, ale ne s Kvl.IN nebo jinými kontrolními „návnadami jak v růstovém testu, tak v β-galaktosidasovém testu. Tyto výsledky ukazují, že KChIP4s se specificky váže na Kv4 kanály.
Příklad 31: Funkční analýza KChIP4N2
KChIP4N2, oproti KChIPl, kCHIP2 a KChIP3, vykazuje vlivy na maximální amplitudu Kv4.3, které jsou závislé na dávce, když jsou současně injikovány do Xenopus oocytů (tabulka 7).
Při vysokých koncentracích (např. 5x ředění) snižuje KChIP4N2 amplitudu Kv4.3 proudu, zatímco nižší koncentrace KChIP4N2 ani <#
0 4 · » · • 0 0 04 0 0 0
0 »0 000 · 0
00 0 0 00 0
04 0 * 00 nezesilují, ani nemají žádný efekt na amplitudu Kv4 proudu (Tabulka 7).
223
KChIP4N2, oproti KChIPl, kCHIP2, a KChIP3, také vykazuje na dávce závislé ovlinění kinetiky inaktivace Kv4.3, když je injikován současně do Xenopus oocytů (Tabulka 7). Při vysokých koncentracích KChIP4 mění rychle inaktivující Kv4.3 proud na téměř neinaktivující proud (např. při 5x ředění se proudová křivka zpomaluje v čase příliš pomalu na to, aby byla získána inaktivační časová konstanta). Když se aplikuje více naředěná KChIP4N2 cRNA, tak se inaktivační časové konstanty postupně snižují k hodnotě získané za nepřítomnosti KChIP4N2.
Tabulka 7: Modulace maxiální amplitudy a kinetiky Kv4.3 proudu různými koncentracemi KChIP4N2 v Xenopus oocytech.
Kv4.3 koexprimován s KCHP4N2 naředěným faktorem (lx=zásobní roztok) lx 5x 30x 120x 500x nula
Inaktivační časová konstanta (ms ± SEM) 681 ± 28 193± 13 84 ± 5 56 ± 4
Maximální amplituda (μΑ ± SEM) 0± 0 4± 1 25 ± 2 16 ± 3 9± 4 15± 4
N-terminální doména KChIP4N2 je nutná pro pozorované účinky KChIP4N2. Delece N-terminální domény v podstatě ruší efekty normálního KChIP4N2 na maximální amplitudu a inaktivační časovou konstantu Kv4.3 (tabulka 8).
Účinek N-terminální domény KChIP4N2 se zdá být dominantní nad dalšími KChlP molekulami. Vyrobili jsme chimérickou molekulu, 4N-1H, kde byla N-terminální doména KChIP4N2
224
4 • · 4
4 4 »444 • 4 »44« *4 • 44 » 9 · r ··* · · · ··«««· · 4
4 · 4 4 «4 ·
44 44 44 fúzována na C-terminální 185 aminokyselinovou H doménu KChIPl (KChIPlH, která je homologní s dalšími KChlP). Když byla tato molekula exprmována současně s Kv4, tak KChIPlH moduluval Kv4 proud téměř stejně jako KChIPl, a produkoval modulační profil, který byl dosti odlišný od profilu KChIP4N2 (An F. et al. (2000) Nátuře 403:553-556). Nicméně, při současné expresi s Kv4.3 produkoval 4N-1H profil modulace téměř neodlišitelný od KChIP4N2 místo KChIPlH nebo KChIPl (tabulka 6). Toto ukazuje, že N-terminální doména KChIP4N2 může účinkovat jako modul, a jeho modulační účinek je dominantní nad modulačními účinky jiných KChlP.
Tabulka 8. N-terminální doména KChIP4N2 je nutná pro účinky KChIP4N2, a je dominantní nad KChIPl.
Kv4.3 ko-exprimován s KChIP4 (30xředěm) KChIP4H 4N-1H
Inaktivační časová konstanta (ms ± SEM) 681 ± 28 105 ± 4 680 ± 39
Maximální amplituda (μΑ ± SEM) 25 ± 2 19± 2 26 ± 3
Protože se KChIP4 a další KChlP asociují s Kv4 Nterminální doménou (Kv4N), je pravděpodobné, že se tyto KChlP váží na stejné místo na Kv4N. Pokud je toto pravda, měly by KChIP4N2 a KChIPl kompetovat o modulaci Kv4 proudu, když jsou oba současně exprimovány s Kv4. Tato hypotéza byla testována a jak je uvedeno na obr. 61, KChIP4N2 a KChIPl kompetují o modulaci Kv4 proudu. Protože koncentrace KChIP4 cRNA injikované do Xenopus oocytů byla konstantní, zatímco koncentrace KChIPl cRNA se postupně zvyšovala, měnil se Kv4.3 proudový profil z profilu KChIP4 na profil podobný KChIPl. Naopak, když byla koncentrace KChIPl cRNA konstantní, zatímco koncentrace KChIP4 cRNA se postupně zvyšovaly, měnil se proudový profil z profilu KChIPl na profil podobný KChIP4.
225
Tyto výsledky ukazují, že KChIPl a KChIP4 navzájem funkčně kompetují, pravděpodobně v důsledku kompetitivní vazby na stejné místo na Kv4.3N. Výsledky také ukazují, že různé kombinace KChIP4N2 a dalších KChlP vedou k dosaažení proudů s hybridními profily, které jsou kvantitativně a kvalitativně podobné nebo odlišné od původních profilů. Je pravděpodobné, že KChIP4N2 a další KChlP jsou současně exprimovány v některých typech buněk in vivo (např. v mozku). Proto může v závislosti na in vivo koncentracích a konkrétních typech buněk KChIP4N2 a další KChlP produkovat dosti odlišné proudy, i přesto, že pór-tvořící alfa podjednotky jsou Kv4 molekuly.
Důsledky uvedených zjištění pro KChIP4N2 jsou dalekosáhlé. Data ukazují, že N-terminální doména nese dominantní modulační funkci, která může být separována od funkcí H domény (vazby na Kv4 a modulování Kv4 proudové amplitudy a kinetik, jak je popsáno v An et al., výše, ale způsobem odlišným od KChIP4N2ř N-terminální domény). Proto je pravděpodobné, že N-terminální doména KChIP4N2 interaguje s částmi draslíkového kanálu, které jsou jiné než N-terminální doména Kv4. Tato další místa na Kv4 jsou pravděpodobně významná pro řízení pohybu draslíkových iontů kanálem, vzhledem k dramatickému efektu KChIP4N2 na kinetiky inaktivace. Potom je možné použít N-terminální doménu KChIP4N2 jako prostředek pro navrhování a provádění vyhledávání proteinů/peptidů/sloučenin, za použití této odlišné aktivity jako sledované hodnoty. Za použití těchto skríningových testů je možné získat proteiny/peptidy/ sloučeniny, které modulují Kv4 aktivity KChIP-dependentním nebo independentním způsobem.
Jak bylo uvedeno výše, KChIPlN a KChIP4N2 mají podobné charakteristiky modulace Kv4 proudu. Oba mohou konvertovat rychle inaktivující Kv4 proudy na téměř neinaktivující proudy.
226
Oba nemusí mít žádný vliv na maximální amplitudu Kv4. Toto je odlišné od účinků KChIPl, KChIP2 a KChIP3. Je zajímavé, že když byly srovnány N-terminální domény lidského KChIPlN a opičího KChIP4N2 (za použití Megalign, DNA Star), vykazovaly významnou homologii (obr. 62), což ukazuje na existenci proteinového motivu, který způsobuje odlišnou modulaci KChIPlN a KChIP4N2. Naopak, N-terminální domény lidského/krysího KChIPl a opičího KChIP4N2 byly dosti odlišné (obr. 62).
Příklad 32: Funkční analýza KChIP4Nl a KChIP4N3
KChIP4Nl a KChIP4N3 byly současně injikovány s Kv4.3 cRNA do Xenopus oocytů. Mmodulační účinky těchto proteinů na Kv4.3 jsou shrnuty v tabulce 9. Oba zvyšovaly inaktivační časovou konstantu Kv4.3. KChIP4N3 zvyšoval maximální amplitudu Kv4.3, zatímco KChIP4Nl neměl žádné statisticky významné (ns) účinky na amplitudu Kv4.3.
Tabulka 9. Modulace Kv4 proudu KChIP4Nl a KChIP4N3 v Xenopus oocytech.
Kv4.3 ko-exprimován s KChIP4Nl KChIP4N3 ničím
Maximální amplituda (μΑ ± SEM) 6± 1 (ns) 43 ± 4 15± 4
Inaktivační časová konstanta (ms ± SEM) 112± 7 85 ± 4 56 ± 4
Ekvivalenty: Odborníkům v oboru budou známé - nebo budou schopni zjistit za použití běžných pokusů - různé ekvivalenty specifických provedení předkládaného vynálezu. Takové ekvivalenty spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Claims (53)

1. Izolovaná molekula nukleové kyseliny vybraná ze skupiny zahrnující:
a) molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z 60% identická s nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:7 9, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102,
DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, nebo sekvencí komplementární k uvedeným sekvencím;
b) molekulu nukleové kyseliny obsahující fragment délky alespoň 583 nukleotidů nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID
NO: 15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:8 8, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO: 92,
Φ Φ φφφφ
228 φφ φφφ φφ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φ φφφφ φ φ» φ φ φφφ φ φ φ φφφφ φφφφ φφ φ φφ φφ φφ φφ
SEQ ID ΝΟ:94, SEQ ID ΝΟ:96, SEQ ID ΝΟ:98, SEQ ID Ν0:100, nebo SEQ ID NO:102, DNA insert plasmidů uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, nebo sekvence komplementární k uvedeným sekvencím;
c) molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci alespoň přibližně z 60% identickou s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID
NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo aminokyselinovou sekvencí kódovanou DNA insertem plasmidů uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316;
d) molekulu nukleové kyseliny, která kóduje fragment polypeptidu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 2 6, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93,
*4
1 · 1 * 9 9119
229
9 9 9 9 9 9 9 9
999 99 991 999
9 9999 1 9 99 9 9 9 9 9
1 1 9 9 9 9 9 9 19
99 9 « ·· · 9 9 9 9 9
SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, kde fragment obsahuje alespoň 15 sousedních aminokyselinových zbytků aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:8 9, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO :103, nebo SEQ ID
NO:109 nebo aminokyselinové sekvence kódované DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936,
98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316; a
e) molekulu nukleové kyseliny, která kóduje přirozenou alelickou variantu polypeptidů obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:7 6, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 99,
230 ** « *» *« « ♦ · < » ♦ · · • · · · · *♦ · « * · • ···· * · * · · · · « « • · ···· · » · » ···· 4 ·· ·· ·· ·*
SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, kde molekula nukleové kyseliny hybridizuje na molekulu nukleové kyseliny obsahující SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13,
SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, nebo : SEQ ID NO:102, nebo na DNA insert plasmidu
uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, za přísných podmínek.
2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, která je vybrána ze skupiny zahrnující:
a) molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO: 8 0, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID
• · · ·
231 ·· 999 99 9 <99 9 9999 9 9 9
9999999 99 999 9 9
9 9 9999 9999
NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94 SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID N0:100, nebo SEQ ID NO:102 nebo DNA insert plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991 98993, 98994, nebo PTA-316, nebo sekvenci komplementární k
uvedeným sekvencím; a
b) molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID
NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:4 0, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO :102 l, nebo
SEQ ID NO:109 nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insert plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316.
3. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 dále obsahující vektorové sekvence nukleové kyseliny.
4. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 dále obsahující sekvence nukleové kyseliny kódující heterologní polypeptid.
5. Hostitelská buňka vyznačující se tím, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1.
232 • · · · · · · • · · · · · • · · · ···· • ······ · · · • · · · · · ···· · ·· ··
6. Hostitelská buňka podle nároku 5vyznačuj ící se t i m, že se jedná o savčí hostitelskou buňku.
7. Non-lidská savčí hostitelská buňka vyznačuj ící se t i m, že obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1.
8. Izolovaný polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující:
a) fragment polypeptidu obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101 , SEQ ID NO :103, nebo SEQ ID NO: 109 nebo
aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, kde fragment obsahuje alespoň 15 sousedních aminokyselin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10,
SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID
_ · 9 · 9 9 999 9 9 9 · ···· ....... · ♦
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9
NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo aminokyselinové sekvence kódované DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316;
b) přirozené alelické varianty polypeptidů obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO :103, nebo SEQ ID
NO:109 nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936,
98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, kde polypeptid je kódovaný molekulou nukleové kyseliny, která hybridizuje na molekulu nukleové kyseliny obsahující SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, nebo SEQ ID NO:102,
• · • ·
- . ··· · · · · · · · ·
734 · ···· ·· ·· ··· · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 nebo DNA insert plasmidů uloženého v ATCC pod přírůstkovým
číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, za přísných podmínek; a
c) polypeptid, který je kódovaný molekulou nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která je alespoň z 60% identická s nukleovou kyselinou obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7,
SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID
NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:7 9, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, nebo SEQ ID NO:102,
nebo DNA insert plasmidů uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316;
d) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z 60% identická s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID
NO: 10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:4 0, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO:103 !, nebo SEQ ID NO:109 nebo s
• · • · · · aminokyselinovou sekvencí kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938,
98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947,
98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316.
235 • · · · · · · · ·
9 9 9 99 999 999
9999999 99 999 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9 ·
9999 · 99 99 99 99
9. Izolovaný polypeptid podle nároku 8 obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14,
SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO : 102 i, nebo SEQ ID
NO:109 nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936,
98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316.
10. Polypeptid podle nároku 8 dále obsahující heterologní aminokyselinové sekvence.
11. Protilátka vyznačující se tím, že se selektivně váže na polypeptid podle nároku 8.
12. Způsob přípravy polypeptidů vybraného ze skupiny zahrnuj ící:
a) polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ
ID N0:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10,
SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID • ·
236 « · • · • • • • · · · • · · • · • · · • · · · · · • · • · · • · • · • · · · • · • · • · • • • · · • · • · · · • • • • · • · ♦ • · • • • • • NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo
aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316;
b) fragment polypeptidů obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8,
SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:4 9, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:5 9, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:103 l, nebo SEQ ID NO:109 nebo
aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, kde fragment obsahuje alespoň 15 sousedních aminokyselin SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10,
SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:3 6, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:4 0, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO: 53,
• · · ·
• · • · • • • · • • · • « • • • · · · · • · 237 • • • · · · • • « • • · * < • · 4 t · · r ·> • · • « » • « · · • · • · • « · · SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 70, SEQ ID ŇO: 72, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO:103 ;, nebo SEQ ID NO: 109, nebo
aminokyselinové sekvence kódované DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316;
a
c) přirozenou alelickou variantu polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12,
SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO:57, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:101, SEQ ID
NO:103, nebo SEQ ID NO:109 nebo aminokyselinovou sekvenci kódovanou DNA insertem plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316, kde polypeptid je kódovaný molekulou nukleové kyseliny, která hybridizuje na molekulu nukleové kyseliny obsahující SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID
NO: 13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID
• · ~00 · · · 9 9 999 9 9 9
ZJo · ···· ········ » • · · · · · · · 9 · ···· · · · · « · · · ·
NO:56, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:69, SEQ ID N0:71, SEQ ID NO:74,
SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID
NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90,
SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID
NO:100, nebo SEQ ID NO:102, nebo DNA insert plasmidu uloženého v ATCC pod přírůstkovým číslem 98936, 98937, 98938, 98939, 98940, 98941, 98942, 98943, 98944, 98945, 98946, 98947, 98948, 98949, 98950, 98951, 98991, 98993, 98994, nebo PTA-316 za přísných podmínek;
vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 5 za podmínek, při kterých je molekula nukleové kyseliny exprimována.
13. Způsob detekce přítomnosti polypeptidů podle nároku 8 ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) kontaktování vzorku se sloučeninou, která se selektivně váže na polypeptid; a
b) určení toho, zda se sloučenina váže na polypeptid ve vzorku, a tím detekování přítomnosti polypeptidů podle nároku 8 ve vzorku.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že sloučeninou, která se váže na polypeptid, je protilátka.
15. Kit, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu, která se selektivně váže na polypeptid podle nároku 8, a návod k použití.
16. Způsob detekce přítomnosti molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1 ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) kontaktování vzorku s nukleokyselinovou sondou nebo
444 444 44 4
444 94 444 944
4 4444 44 44 444 · 4
9 4 4944 99··
4449 · 4· 49 49 44
239 primerem, který selektivně hybridizuje na molekulu nukleové kyseliny; a
b) určení toho, zda se nukleokyselinová sonda nebo primer váže na molekulu nukleové kyseliny ve vzorku a tím detekování přítomnosti molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1 ve vzorku.
17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že vzorek obsahuje molekuly mRNA a je kontaktován s nukleokyselinovou sondou.
18. Kit, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu, která selektivně hybridizuje na molekulu nukleové kyseliny podle nároku 1, a návod k použití.
19. Způsob identifikace sloučeniny, která se váže na polypeptid podle nároku 8, vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) kontaktování polypeptidu, nebo buňky exprimující polypeptid, s testovanou sloučeninou; a
b) určení toho, zda se polypeptid váže na testovanou sloučeninu.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že vazba testované sloučeniny na polypeptid je detekována způsobem vybraným ze skupiny zahrnující:
a) detekci vazby přímou detekcí vazby testované sloučeniny a polypeptidu;
b) detekci vazby za použití testu kompetitivní vazby; a
c) detekci vazby za použití testu na PCIP aktivitu.
21. Způsob modulování aktivity polypeptidu podle nároku 8 v y značující se tím, že zahrnuje kontaktování ·· ··· ·
24U ······· · · ··· « 9 • · » · · · · · · « ··«· * ·· ·· ·* ·· polypeptidu nebo buňky exprimující polypeptid se sloučeninou, která se váže na polypeptid v koncentraci dostatečné pro modulování aktivity polypeptidu.
22. Způsob identifikace sloučeniny modulující aktivitu polypeptidu podle nároku 8,vyznačující se tím, že zahrnuje:
a) kontaktování polypeptidu podle nároku 8 s testovanou sloučeninou; a
b) stanovení efektu testované sloučeniny na aktivitu polypeptidu a tím identifikování sloučeniny modulující aktivitu polypeptidu.
23. Způsob identifikace sloučeniny schopné léčit onemocnění charakterizované aberantní expresí PCIP nukleové kyseliny nebo aktivitou PCIP proteinu, vyznačuj ící se t í m, že zahrnuje testování schopnosti sloučeniny nebo činidla modulovat expresi PCIP molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1 nebo aktivity PCIP polypeptidu podle nároku 8, čímž se dosáhne identifikace sloučeniny schopné léčby onemocnění charakterizovaného aberantní expresí PCIP nukleové kyseliny nebo aktivitou PCIP proteinu.
24. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící že onemocněním je onemocnění CNS.
se tím,
25. Způsob podle nároku 24, vyznačuj že onemocněním je epilepsie.
27. Způsob podle nároku 24, vyznačuj že onemocněním je spinocerebelární ataxie.
ící se tím, ící se tím,
28. Způsob podle nároku 23, vyznačuj ící se tím,
241 • · · ♦» ·· • · · · · * · · • · · « · · · · · * · • ···· · · ·· ··« · 9
9 9 9 9 9 9 9 9*9
9 9 9 ♦ 9 9 9 9 9 9 9 9 že onemocněním je kardiovaskulární onemocnění.
29. Způsob podle nároku 28,vyznačující se tím, že kardiovaskulární onemocnění je asociované s abnormálním It0 proudem.
30. Způsob stanovení, zda je jedinec rizikový pro onemocnění charakterizované aberantní nebo abnormální expresí PCIP nukleové kyseliny a/nebo aktivitou PCIP proteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti genetické léze ve vzorku buněk od jedince, kde genetická léze je charakterizována alterací postihující integritu genu kódujícího PCIP polypeptid podle nároku 8 nebo chybnou expresí PCIP molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1.
31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tí m, že onemocněním je onemocnění CNS.
32. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že onemocněním je epilepsie.
33. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že onemocněním je spinocerebelární ataxie.
34. Způsob podle nároku 30, vyznačuj ící že onemocněním je kardiovaskulární onemocnění.
se tím,
35. Způsob podle nároku 34, vyznačující se tím, že kardiovaskulární onemocnění je asociováno s abnormálním Ito proudem.
36. Způsob identifikace jedince trpícího onemocněním • 44 4
242
44 4 4» 4 · ·· • 44 44« 44
444 44 4·· 4 4
4 ·♦·· «4 44 4 · 4 4
4 4 4444 · 4 ♦ • 444 · 44 44 44 4 · charakterizovaným aberantní nebo abnormální expresí PCIP nukleové kyseliny a/nebo aktivitou PCIP proteinu vyznačující se tím, že zahrnuje získání biologického vzorku od jedince a detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti genetické léze ve vzorku, kde genetická léze je charakterizována alterací postihující integritu genu kódujícího PCIP polypeptid podle nároku 8 nebo chybnou expresí PCIP molekuly nukleové kyseliny podle nároku 1, čímž se dosáhne identifikace jedince trpícího onemocněním charakterizovaným aberantní nebo abnormální expresí PCIP nukleové kyseliny a/nebo aktivitou PCIP proteinu.
37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se ti m, že onemocněním je onemocnění CNS.
38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že onemocněním je epilepsie.
39. Způsob podle nároku 37,vyznačující se tím, že onemocněním je spinocerebelární ataxie.
40. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že onemocněním je kardiovaskulární onemocnění.
41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že kardiovaskulární onemocnění je asociované s abnormálním Ito proudem.
Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že onemocněním je onemocnění CNS.
38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že onemocněním je epilepsie.
0· 00 00
0 0 0 0 0 0
0 0000 0 0 ·
0 00 000 0 0
0 ♦· 0 0 0· 0
00 00 00 00
0 0
0«00 0
243
39. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že onemocněním je spinocerebelární ataxie.
40. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že onemocněním je kardiovaskulární onemocnění.
41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že kardiovaskulární onemocnění je asociováno s abnormálním Ito proudem.
42. Způsob léčby jedince s onemocněním asociovaným s draslíkovým kanálem, vyznačující se tím, že zahrnuje podání PCIP polypeptidu podle nároku 8 nebo jeho části jedinci tak, že dojde k léčbě.
43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že onemocněním je onemocnění CNS.
44. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že onemocněním je epilepsie.
45. Způsob podle nároku 43, vyznačující se tím, že onemocněním je spinocerebelární ataxie.
46. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že onemocněním je kardiovaskulární onemocnění.
47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že kardiovaskulární onemocnění je asociováno s abnormálním It0 proudem.
48. Způsob léčby jedince s onemocněním asociovaným s
244 •· ·· ·· ···♦ • · ♦ 9 9 · • · 999 · · · « · 9 9 9 9 9 · *
9 9 9 · 9 9 9 9
99 9 9 99 9 9 draslíkovým kanálem, vyznačující se tím, že zahrnuje podání nukleové kyseliny kódující PCIP polypeptid podle nároku 8 nebo jeho část jedinci tak, že dojde k léčbě.
49. Způsob podle nároku 48, vyznačující se tí m, že onemocněním je onemocnění CNS.
50. Způsob podle nároku 49, vyznačuj že onemocněním je epilepsie.
ící se tím,
51. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, že onemocněním je spinocerebelární ataxie.
52. Způsob podle nároku 48,vyznačující se tím, že onemocněním je kardiovaskulární onemocnění.
53. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že kardiovaskulární onemocnění je asociováno s abnormálním Ito proudem.
54. Použití sloučeniny identifikované způsobem podle nároku 23 pro léčbu onemocnění asociovaného s draslíkovým kanálem.
CZ20031154A 2000-09-27 2001-09-27 Činidla interagující s draslíkovým kanálem a jejich použití CZ20031154A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US09/670,756 US7078481B1 (en) 1998-11-20 2000-09-27 Potassium channel interactors and uses therefor
US09/703,094 US7556938B1 (en) 1998-11-20 2000-10-31 Nucleic acids encoding potassium channel interactors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20031154A3 true CZ20031154A3 (cs) 2003-09-17

Family

ID=27100393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031154A CZ20031154A3 (cs) 2000-09-27 2001-09-27 Činidla interagující s draslíkovým kanálem a jejich použití

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP1322759A2 (cs)
JP (1) JP2004525610A (cs)
KR (1) KR20030074604A (cs)
CN (1) CN1498271A (cs)
AU (1) AU2001296393A1 (cs)
BR (1) BR0114383A (cs)
CA (1) CA2420960A1 (cs)
CZ (1) CZ20031154A3 (cs)
EA (1) EA200300420A1 (cs)
IL (1) IL154962A0 (cs)
MX (1) MXPA03002557A (cs)
NO (1) NO20031369L (cs)
WO (1) WO2002026984A2 (cs)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7067312B1 (en) 2001-09-19 2006-06-27 Myriad Genetics, Inc. PN7718 nucleic acids and use thereof
CA2501523A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Inga Reynisdottir Human type ii diabetes gene-kv channel-interacting protein (kchip1) located on chromosome 5
CA2740701A1 (en) * 2008-11-06 2010-05-14 Basf Se A screening assay for insecticides
CN105483276B (zh) * 2016-02-01 2019-06-11 成都望路医药技术有限公司 Kcnip4基因及其表达产物在直肠腺癌诊疗中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4758997A (en) * 1996-10-17 1998-05-11 Nps Pharmaceuticals, Inc. Potassium channel blocking compounds and their use
US6117989A (en) * 1998-03-26 2000-09-12 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Human calcium-binding proteins
IL143148A0 (en) * 1998-11-20 2002-04-21 Millennium Pharm Inc Potassium channel interactors and uses therefor
AU5151100A (en) * 1999-05-19 2000-12-05 Incyte Genomics, Inc. Extracellular signaling molecules
CA2402563A1 (en) * 1999-12-23 2001-07-26 Hyseq, Inc. Novel nucleic acids and polypeptides

Also Published As

Publication number Publication date
CA2420960A1 (en) 2002-04-04
WO2002026984A3 (en) 2003-03-13
WO2002026984A2 (en) 2002-04-04
JP2004525610A (ja) 2004-08-26
CN1498271A (zh) 2004-05-19
NO20031369L (no) 2003-05-22
BR0114383A (pt) 2005-04-12
EP1322759A2 (en) 2003-07-02
IL154962A0 (en) 2003-10-31
AU2001296393A1 (en) 2002-04-08
EA200300420A1 (ru) 2004-04-29
MXPA03002557A (es) 2004-09-10
KR20030074604A (ko) 2003-09-19
NO20031369D0 (no) 2003-03-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20020142377A1 (en) 18607, a novel human calcium channel
US5882893A (en) Nucleic acids encoding muscarinic receptors and uses therefor
US7091006B2 (en) PGC-1β, a novel PGC-1 homologue and uses therefor
US6780987B1 (en) β-cap73 control of normal and abnormal cell migration
US6518398B1 (en) ERG potassium channel
EP1108027A1 (en) Hypertension associated transcription factor-1 (hatf-1) and and hatf related protein 1 (hrp-1)
WO2003006619A2 (en) Calcineurin modulators
AU775713B2 (en) Potassium channel interactors and uses therefor
CZ20031154A3 (cs) Činidla interagující s draslíkovým kanálem a jejich použití
US6361971B1 (en) Nucleic acid molecules encoding potassium channel interactors and uses therefor
US6326481B1 (en) Molecules of the AIP-related protein family and uses thereof
US6689581B1 (en) Potassium channel interactors and uses therefor
US7556938B1 (en) Nucleic acids encoding potassium channel interactors
US20020081658A1 (en) 18610, a novel human transient receptor and uses thereof
WO2003045970A1 (en) Novel molecules of the card related protein family and uses thereof
US7439029B2 (en) Human 9q polypeptides method
US20020081651A1 (en) 26649, a novel human GTPase activating molecule and uses therefor
WO2001030813A9 (en) Novel molecules of the card-related protein family and uses thereof
ZA200103995B (en) Potassium channel interactors and uses therefor.
KR20010086407A (ko) 칼륨 채널 상호작용물질 및 이의 용도
US20020086357A1 (en) 32591, a novel human GTPase activating molecule and uses therefor
WO2002026983A2 (en) 56115, a novel human twik potassium channel and uses therefor
US20030049727A1 (en) 25658, a novel human calcium channel subunit and uses thereof
WO2001081416A2 (en) Human ion channel and uses thereof
WO2003005958A2 (en) Hypertension associated transcription factors and uses therefor