CZ20031378A3 - Způsob exprese genu v bakteriální buňce, způsob vyvolání imunitní odezvy u hostitele a systém pro exprimování proteinu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Níže uvedené odhalení se vztahuje k použití proteinového exportního systému. Odhalený systém poskytuje účinné způsoby a prostředky, které je možno použít pro produkci rekombinantních proteinů.

Dosavadní stav techniky

Při pokusech zvýšit výtěžky rekombinantních proteinů, které jsou předmětem zájmu, používaly proteinové expresní systémy expresní vektory nebo expresní plasmidy poskytující vysoký počet kopií. Expresní plasmidy poskytující vysoký počet kopií a sledované proteiny, které kódují, mohou mít na hostitele, který expresní plasmid obsahuje, negativní účinek. Značná zátěž pro prokaryotické hostitelské buňky nesoucí plasmidy poskytující vysoký počet kopií je kumulativním výsledkem metabolické kaskády, která je spouštěna dvěma procesy; 1) replikací a zachováním expresních plasmidů a 2) transkripcí a translací různých plasmidem kódovaných funkcí včetně sledovaného genu. Tyto mechanismy by také mohly vysvětlovat zjištění, že bakterie nesoucí plasmid roste pomaleji než bakterie bez plasmidu. Tato zátěž může také vysvětlovat zjištění, že růstová rychlost se zvyšujícím se počtem kopií klesá.

Když je sledovaný gen exprimován, klesá rychlost růstu rekombinantní hostitelské buňky. Snížení růstové rychlosti může vyvolat indukci různých buněčných proteas, které mohou štěpit rekombinantně produkovaný protein přítomný v cytoplasmě hostitelské buňky. Snížená růstová rychlost je tedy nevyhnutelným důsledkem metabolické zátěže, která je kumulativním výsledkem řady fyziologických poruch. Protože toto snížení růstové rychlosti vytváří selektivní tlak na ztrátu přítomných plasmidů v nepřítomnosti selekce, může po transformaci hostitelské • · · · · · • · · · · ·

9999 9 9 · · · · ........

4/ · 9 ········ •··· · 99 9 9 99 99 buňky dojít k podstatnému úbytku expresních plasmidů z hostitelské buňky nesoucí expresní vektor.

Hostitelské buňky se sníženými růstovými rychlostmi mohou ztrácet expresní plasmid spontánně, a to proto, aby z hostitelské buňky odstranily nadbytečnou metabolickou zátěž a umožnily tak hostitelským buňkám bez plasmidů rychle přerůst populaci hostitelských buněk nesoucích plasmid. Lze očekávat, že tento posun v expresi proteinů u populace hostitelských buněk sníží produkci proteinů.

Bylo by proto žádoucí připravit takový proteinový expresní systém, který by optimalizoval expresi proteinů z expresního vektoru a současně by minimalizoval metabolickou zátěž hostitelské buňky vytvořenou expresním vektorem.

Podstata vynálezu

Odhalené téma se vztahuje k použití exportního proteinu k usnadnění exportu fúzního proteinu ven z hostitelské buňky. Jedno odhalené provedení poskytuje takový způsob exprimování genu v bakteriální buňce, který se skládá z poskytnutí expresního vektoru populaci netransformovaných hostitelských bakteriálních buněk, přičemž expresní vektor zahrnuje expresní kazetu obsahující sekvenci kódující exportní protein geneticky fúzovanou se sekvencí kódující sledovaný protein, z exprimování expresní kazety tak, že je produkován fúzní protein exportní protein::sledovaný protein, který je exportován nebo transportován do kultivačního média.

Jiné odhalené provedení se vztahuje ke způsobu vyvolání imunitní odezvy u zvířete, který se skládá z poskytnutí populace bakteriálních hostitelských buněk transformovaných expresním vektorem, který obsahuje expresní kazetu obsahující sekvenci, která kóduje exportní protein geneticky fúzovanou se sekvencí, která kóduje sledovaný protein, zvířeti, z exprimování expresní kazety tak, že je produkován fúzní protein exportní protein: :sledovaný protein a je exportován nebo transportován do zvířete a z vyvolání imunitní odezvy proti fúznímu proteinu u zvířete.

Jiné odhalené provedení se vztahuje k systému exprimování sledovaného proteinu, který zahrnuje: expresní vektor obsahující expresní kazetu, přičemž expresní kazeta obsahuje sekvenci kódující exportní protein geneticky fúzovanou se sekvencí kódující sledovaný protein, hostitelskou buňku transformovanou expresním vektorem a kultivační prostředí pro transformovanou hostitelskou buňku. Expresní kazeta exprimuje fúzní protein exportní protein: .sledovaný protein, který je exportován ven z transformované hostitelské buňky.

• · • ·· · • ·

• · · · · · • · · · · · • · · · · · ·· «· ··'

Níže uvedené odhalení poskytuje proteinový exportní systém pro účinně produkovaný rekombinantní protein z bakteriálního hostitele. Ve výhodnějším provedení využívá proteinový exportní systém endogenní proteinový exportní systém hostitelské bakterie, do níž je vektor proteinového exportního systému začleněn.

Proteinový exportní systém má řadu užitečných aplikací. Systém může být použit pro účinné produkování rekombinantní ch proteinů, které jsou předmětem zájmu, uvnitř bakteriální hostitelské buňky a pro export daného rekombinantního proteinu z bakteriální hostitelské buňky. Odhalený systém může být použit také například k účinnému produkování rekombinantních proteinů, které jsou předmětem zájmu, v bioreaktoru.

Proteinový exportní systém může být také použit za účelem poskytnutí antigenního materiálu zvířeti, proti němuž si může zvíře vytvořit imunitní odezvu. V jenom provedení je například oslabená bakterie, jako je Salmonella, transformována složkami proteinového exportního systému. Rekombinantní Salmonella může být potom použita jako živý vektorový imunogenní prostředek, který je schopen napomáhat tvorbě imunitní odezvy u zvířete. Proteinový exportní systém může být použit pro různé sledované antigeny. Specifická provedení zahrnují imunogenní prostředky zaměřené proti břišnímu tyfu a dalším onemocněním. Rovněž jsou odhaleny imunogenní prostředky exprimující antigeny, které jsou z rekombinantní bakterie exportovány za současné minimální bakteriální lýze.

A. Proteinový exportní systém rodiny HlyE

Níže uvedené odhalení se vztahuje k použití členů rodiny HlyE v proteinovém exportním systému za účelem usnadnit expresi proteinů. Členové rodiny HlyE mohou být použity pro usnadnění exportu rekombinantně produkovaných proteinů ze svých bakteriálních hostitelů. U expresních systémů, které exportují rekombinantně produkované proteiny, se předpokládá, že usnadňují zvýšenou produkci proteinů. Odhalený proteinový exportní systém může být použit také pro přípravu imunogenních prostředků, jimiž jsou očkována zvířata.

U růstových rychlostí rekombinantních organismů, které obsahují expresní vektory, bylo pozorováno, že se se zvyšující se hladinou exprese sledovaného genu snižují. Pokles růstu může vyvolat indukci různých buněčných proteas, které mohou štěpit exprimovaný rekombinantní protein. Snížená růstová rychlost je tedy nevyhnutelným důsledkem metabolické záteže, která je kumulativním výsledkem řady fyziologických poruch. Fyziologické poruchy jsou výsledkem například exprese a akumulace sledovaného proteinu uvnitř hostitelské bakterie. Tato akumulace ·· ···· • · · · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · • · ·· · · · · může být pro životaschopnost hostitelské bakterie škodlivá a tudíž může být negativním selekčním tlakem.

Protože metabolické zátěže, jako např. ty, které jsou diskutovány výše, vytvářejí selektivní tlak na ztrátu přítomných expresních vektorů v nepřítomnosti selekce, může dojít k významnému úbytku expresního vektoru z hostitelské bakterie a to poté, když byla hostitelská bakterie transformována expresním vektorem, který obsahuje sledovaný gen. Spontánní ztráta plasmidu odstraňuje metabolickou zátěž z hostitelské bakterie a umožňuje bakterii bez plasmidu rychle přerůst populaci bakterie nesoucí plasmid. Tento rychlejší růst bakteriálních buněk, které neobsahují expresní vektor a tudíž neexprimují sledovaný protein, snižuje celkové hladiny produkce proteinu. Proto tedy hostitelská bakterie, která není geneticky přinucena udržovat expresní vektory řídící syntézu vysokých hladin daného sledovaného proteinu, může produkovat podstatně méně proteinu.

Výhodné provedení vztahující se k exportování rekombinantně exprimováného proteinu, který je předmětem zájmu, zahrnuje využití endogenního exportního systému v hostitelské bakterii obsahující expresní vektor. Využití endogenního exportního systému je výhodné, protože se předchází potřebě velkých množství heterologní DNA kódující exotické proteiny pro zásobování exogenního exportního systému. Přesto však jsou předmětným vynálezem zahrnuty rovněž takové proteinové exportní systémy, které využívají exogenních exportních systémů.

Atraktivním kandidátem na endogenní exportní systém je kódovaný hemolysin kódovaný cytolysinem A (clyA) na chromozomu Salmonella enterica serovar Typhi (dále jen S. Typhi), člen rodiny proteinů HlyE. Rodina HlyE se skládá z jednoho proteinu, HlyE, a jeho blízkých homologů z E. coli, Shigella flexneri a S. Typhi a jiných bakterií. Protein z E. coli je funkčně velmi dobře charakterizovný, póry tvořící, chromozomálně kódovaný hemolysin také nazývaný ClyA, HlyE a tichý hemolysin A (SheA). Skládá se z 303 aminokyselinových zbytků (34 kDa). Jeho transkripce je pozitivně kontrolovaná SlyA, regulátorem nacházejícím se v různých střevních bakteriích. HlyE tvoří v lipidové dvojvrstvě stabilní, středně kationselektivní transmembránové póry o průměru 2,5 až 3,0 nm. Protein váže cholesterol a tvorba pórů v membráně je stimulována tehdy, když membrána obsahuje cholesterol. Krystalická struktura HlyE z E. coli byla zjištěna do rozlišení 2,0 Á a pomocí elektronové mikroskopie při nízkém rozlišení byla provedena visulizace formy toxinu spojené s lipidy. Struktura vykazuje komplikovaný spirálovitý svazek nějakých 100 Á dlouhý. V přítomnosti lipidu oligomerizuje za vzniku transmembránových pórů.

• · · · · 9 · · • ·99 •99 999 •••99 9 • · 9 9 9 9 • · 9 9 9 9

B. Proteinový exportní systém Cytolysin A (ClyA)

Výhodné provedení předmětného vynálezu se vztahuje k použití proteinu ClyA, člena rodiny HlyE, v proteinovém exportním systému. Gen clyA o velikosti přibližně 1 kb byl klonován z S. Typhi CVD 9Q%-htrA s cílem použít ho v proteinovém exportním systému. ClyA protein je exportován jak z E. coli tak i S. Typhi a je schopen exportovat spolucestující proteiny, které byly geneticky fúzovány na 3'-konec otevřeného čtecího rámce clyA. Spolupřenášený protein, na něž je zde proveden odkaz, je dále označován jako sledovaný protein nebo protein, který je předmětem zájmu. Je ukázáno, že správné sbalení těchto fuzních proteinů probíhá tak, že zůstává zachována vlastní biologická aktivita domén.

Cytolysin A (ClyA) z S. Typhi poprvé popsal Wallace a kol., který rovněž oznámil krystalickou strukturu homologního hemolysinu z E. coli (Wallace, A. J., T. J. Stillman, A. Atkins, S. J. Jamieson, P. A. Bullough, J. Green a P. J. Artymiuk. 2000. E. coli hemolysin E (HlyE, ClyA, SheA): X-ray crystal structure of the toxin and observation of membrane pores by electron microscopy. Cell 100: 265 až 276). Tento hemolysin byl popsán již dříve a byl označován jako ClyA, HlyE nebo SheA. Aby se předešlo zmatku, je zde hemolysin E. coli označován jako HlyE a je kódován hlyE. Rovněž z důvodu jasnosti je zde hemolysin z S. Typhi označována j ako ClyA, který je kódován clyA.

Pro ilustraci je proteinová struktura členů rodiny HlyE diskutována s odvoláním na protein HlyE z E. coli. HlyE je molekula tvaru zlomené tyče s hydrofobní transmembránovou oblastí tvořenou 27 zbytky. Tato oblast zahrnuje jeden konec sbalené molekuly a předpokládá se, že tvoří pór v cílové membráně. Tvorba póru vede v zásadě k lýzi cílové buňky. Ve studiích využívajících elektronové mikroskopie Wallace a kol. ukázali, že HlyE se inzertuje do lipidových dutin za vzniku pórů složených z 8 monomerů HlyE.

Ačkoliv tvorba pórů zprostředkovaná HlyE byla již objasněna, mechanismus, kterým jsou HlyE a homology HlyE exportovány ven z bakterie zůstává nejasný. Kromě toho, způsob, jakým se hemolysin začleňuje do cílových membrán za účelem včlenit se do pórů rovněž není zcela znám. Del Castillo a kol. popsali sekreci hemolytické aktivity závisející na růstové fázi. Sekrece vrcholí během střední logaritmické fáze a vymizí při nástupu fáze stacionární (del Castillo, F. J., S. C. Leal, F. Mořeno a I. del Castillo. 1997. The Escherichia coli K-12 sheA gene encodes a 34-kDa secreted haemolysin. Mol. Microbiol. 25: 107 až 115). Ludwig a jeho kolegové oznámili, že vylučování tohoto kódovaného hemolysinu je doprovázeno ztrátou periplasmaticky ohraničených proteinů, ale není doprovázeno ztrátou cytoplasmatických proteinů, což hovoří proti úplné buněčné lýzi za účelem uvolnění HlyE. (Ludwig, A., S. Bauer, R. Benz, • ·· ·

B. Bergmann a W. Goebel. 1999. Analysis of the SlyA-controlled expression, subcellular localization and pore-forming activity of 34 kDa haemolysin (ClyA) from Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 31: 557 až 567.)

Kromě toho sekvenování N-konce vylučovaného HlyE a porovnání se sekvencí kódovanou hlyE, odhalilo, že HlyE není v průběhu transportu N-koncově zpracováván. Oscarsson a kol. oznámili, že HlyE se váže na cholesterol a že přítomnost cholesterolu v cílových membránách stimuluje tvorbu pórů a lýzi. (Oscarsson, J., Y. Mizunoe, L. Li, X. Lai, A. Wieslander a Β. E. Uhlin. 1999. Molecular analysis of the cytolytic protein ClyA (SheA) from Escherichia coli. Mol. Microbiol. 32: 1226 až 1238.) Je odhadováno, že přibližně 10³ molekul HlyE je potřeba pro lýzi cílového erytrocytu, což naznačuje významné hromadění HlyE před tím, než je zaznamenána buněčná lýze. HlyE je nápadně stabilní v rozmezí hodnot pH 3,0 až 9,0 a je rezistentní vůči štěpení proteasami včetně trypsinu a pepsinu. (Atkins, A., N. R. Wybom, A. J. Wallace, T. J. Stillman, L. K. Black, A. B. Fielding, M. Hisakado, P. J. Artymiuk a J. Green. 2000. Structure-function relationships of a novel bacterial toxin, haemolysin E. The role of ocg·

J. Biol. Chem. 275: 41 150 až 41 155.

Aminokyselinová sekvence proteinu ClyA použitá v odhalené práci je poskytnuta jako SEQ ID č:2. Ostatní členové rodiny HlyE jsou rovněž dostupné a jsou odborníkům v dané oblasti techniky známé. Například další gen cly A pro cytolysin A ze S. Typhi je dostupný pod přístupovým číslem GENBANK AJ313034; sekvence genu clyA pro cytolysin A ze Salmonella paratyphi je dostupná pod přístupovým číslem GENBANK AJ313033; kompletní kódující sekvence genu zkráceného HlyE (hlyE) Shigella flexneri je dostupná pod přístupovým číslem GENBANK AF200955; a sekvence genu clyA Escherichia coli je dostupná pod přístupovým číslem GENBANK AJ001829.

Typické pro proteiny rodiny HlyE je to, že způsobují v cílových buňkách hemolýzu. Podle uvedených postupů mohou být použity hemolyticky aktivní nebo inaktivní členové rodiny HlyE. Například je známo, že mutace genu clyA může snižovat nebo zcela eliminovat hemolytickou aktivitu. Ztráta hemolytické aktivity byla například oznámena tehdy, když byl clyA mutován tak, že se aminokyselinové substituce vyskytovaly v pozicích 180, 185, 187 a 193. Konkrétně v případě G180V, V185S, A187S a 1193S je výsledkem ztráta hemolytické aktivity u proteinu ClyA exprimováného z mutovaného genu clyA.

Předmětné odhalení využívá exportních charakteristik proteinů rodiny HlyE k vytvoření proteinového exportního systému. Jsou odhaleny například fúzní proteiny zahrnující libovolný člen rodiny HlyA a sledovaný protein. Ještě konkrétněji jsou odhaleny fúzní proteiny obsahující

ClyA a sledovaný protein. Jak je diskutováno níže, jsou fuzní proteiny obsahující ClyA ·· ·«·· • ·

• · • · · · exportovány ven z bakteriální hostitelské buňky do okolního média. Tento charakteristický znak expresního systému zahrnuje takovou složku fuzního proteinu exportní protein::sledovaný protein, která usnadňuje produkci sledovaného proteinu a exportování fuzního proteinu exportní protein::sledovaný protein.

Expresní vektory pro exportní proteiny

Zde popsaný proteinový exportní systém může být použit pro expresi a export mnoha různých fúzních proteinů obsahujících exportní protein a sledovaný protein. Exportní protein je vybrán z proteinů rodiny HlyE. V jednom provedení je sledovaný protein kódován sledovaným genem. Sledovaný gen může být pro bakterii obsahující proteinový exportní systém cizí nebo to může být gen, který je pro bakterii endogenní. Konstrukt fúzního proteinu exportní protein::sledovaný protein je přítomen v expresní kazetě, která je přítomna v expresním vektoru. Každá z těchto jednotek je diskutována níže.

Expresní vektory

Proteinový exportní systém využívá expresního vektoru pro usnadnění rekombinantní produkce sledovaného proteinu. Typický expresní vektor bude obsahovat počátek replikace a další strukturní znaky, které kontrolují a regulují udržování expresního vektoru v hostitelské buňce. Termín expresní vektor se vztahuje k plasmidů, viru nebo jinému prostředku, který je známý v dané oblasti techniky, který byl manipulován tak, že byla inzertována nebo začleněna expresní kazeta obsahující expresní kazetu fúzního proteinu exportní protein::sledovaný protein. Příkladem expresního vektorového systému je systém, který uvádí expresní vektory, které udělují stabilitu plasmidů na dvou nezávislých úrovních, což je popsáno v Galen a kol., Immun. 67:6 424 až 6 433 (1999) a v US patentových přihláškách č. 09/204 117 podané 2. prosince 1998 a 09/453 313, podané 2. prosince 1999, které jsou zde celé zahrnuty jako odkaz.

Expresní kazety exportní protein-fúzní protein

Zde popsaný proteinový exportní systém může být použit k expresi a exportu mnoha různých fúzních proteinů obsahujících exportní protein a sledovaný protein. Sledovaný protein je kódován sekvencí kódující sledovaný protein, která je zároveň sledovaným genem. Sledovaný gen může být pro bakterii obsahující proteinový exportní systém cizí nebo to může být gen, který

9990 je pro bakterii endogenní. Velikost sledovaného proteinu se může pohybovat v rozmezí od jediné aminokyseliny až po proteiny několikrát větší než je exportní proteinová molekula. Výhodněji se může velikost sledovaného proteinu pohybovat v rozmezí od 10 aminokyselin do dvojnásobné velikosti exportního proteinu. Je výhodnější, aby velikost sledovaného proteinu byla taková, aby neinterferovala se schopností exportního proteinu být zcela exportován mimo bakterii. Mezi příklady sledovaných proteinů patří proteiny o hmotnosti 0 kDa až alespoň 50 kDa. Vyšší hmotnosti a tudíž delší proteiny mohou být jako sledované proteiny také použity. Sledované proteiny mohou mít hmotnost například 55 kDa, 60 kDa, 65 kDa, 70 kDa, 75 kDa, 80 kDa, 85 kDa, 90 kDa, 95 kDa, 100 kDa nebo větší.

Sledovaný protein se může také skládat z 1 až 1000 aminokyselin nebo více aminokyselin. Sledovaný protein může mít například 10,20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90,100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 aminokyselin nebo více.

Sledovaný gen, který má být exprimován, je většinou přítomen v expresní kazetě. Typická expresní kazeta bude obsahovat vhodné strukturní znaky jako je promotor, terminátor atd. a to proto, aby mohla proběhnout transkripce sledovaného genu.

Polynukleotidové sekvence kódující fuzní protein exportní protein::sledovaný protein (také známé jako sekvence kódující fuzní protein exportní protein::sledovaný protein) mohou být za vzniku expresní kazety operativně připojeny na kontrolní sekvence exprese. Termín operativně připojeny se vztahuje k pozicím vedle sebe, kdy komponenty takto popsané jsou ve vztahu, který jim umožňuje pracovat svým obvyklým způsobem. Expresní kontrolní sekvence operativně připojená ke kódující sekvenci je ligována tak, že proběhne exprese kódující sekvence za podmínek, které jsou srovnatelné s expresními kontrolními sekvencemi. Termín expresní kontrolní sekvence, který je zde používán, se vztahuje k sekvencím nukleové kyseliny, které regulují expresi sekvence nukleové kyseliny, na níž je operativně připojena. Expresní kontrolní sekvence jsou operativně připojeny k sekvenci nukleové kyseliny tehdy, když expresní kontrolní sekvence kontrolují a regulují transkripci a v případě potřeby translaci sekvence nukleové kyseliny. Expresní kontrolní sekvence tedy mohou zahrnovat příslušné promotory, terminátory transkripce, optimalizované ribosomové vazebné sekvence, startovní kodón (tzn. ATG) před genem kódujícím protein, správný čtecí rámec tohoto genu, aby mohla proběhnout translace mRNA a stop kodóny. Termín kontrolní sekvence zahrnuje minimálně ty komponenty, jejichž přítomnost může ovlivnit expresi, ale může také zahrnovat další komponenty, jejichž přítomnost je výhodná, například vedoucí sekvence. Expresní kontrolní sekvence mohou zahrnovat promotor.

·· ···* .. ,. ..

• · ··«» · · a • · ♦ · ··♦ · · a

Ο - * - · ·······» ζ ···· · «· ,, φφ φφ

Promotor je minimální sekvence dostatečná pro řízení transkripce. Ve vynálezu jsou zahrnuty také ty promotorové prvky, které jsou dostačující pro uskutečnění promotor-dependentní exprese genu kontrolovatelné pokud jde o specifickou pro buňku, tkáňově specifickou nebo indukovatelnou externími signály nebo činidly; tyto prvky mohou být umístěny v 5' nebo 3' oblastech kódující sekvence fuzního proteinu exportní protein::sledovaný protein. V odhalených způsobech jsou použitelné jak konstitutivní tak i indukovatelné promotory. Exprese kódujících sekvencí fúzního proteinu exportní protein::sledovaný protein může být řízena řadou promotorů. Ačkoliv endogenní promotor exportního proteinu může být využit pro regulaci transkripce expresní kazety, výhodněji je promotorem cizí regulační sekvence. Příkladem indukovatelného endogenního promotoru je promotor ompC, který může být použit pro řízení transkripce expresní kazety.

Promotory užitečné ve vynálezu zahrnují jak konstitutivní tak i indukovatelné přirozené promotory, ale i promotory vytvořené. Výhodnější indukovatelný promotor by měl 1) poskytnout nízkou expresi v nepřítomnosti induktoru; 2) poskytnout vysokou expresi v přítomnosti induktoru; 3) použít takové indukční schéma, které neinterferuje s normální fyziologií hostitelské buňky; a 4) mít malý nebo nemít žádný vliv na expresi jiných genů. Mezi příklady indukovatelných promotorů patří takové promotory, které jsou indukovány chemickým způsobem. Odborníci v dané oblasti budou tyto jak konstitutivní tak indukovatelné promotory znát.

Konkrétní vybraný promotor by měl být schopen způsobit dostatečnou expresi, jejíž výsledkem by měla být produkce účinného množství fúzního proteinu exportní protein: :sledovaný protein. Účinné množství fuzního proteinu exportní protein::sledovaný protein se může lišit v závislosti na cíli exprese. Promotory použité ve vektorových konstruktech předmětného vynálezu mohou být v případě potřeby modifikovány s cílem ovlivnit jejich kontrolní charakteristiky.

Fúzní protein exportní protein::sledovaný protein, který obsahuje exportní protein a sledovaný protein, může dále obsahovat purifikační konce, zapracované do expresní kazety tak, aby byly exprimovány jako součást fuzního proteinu exportní protein::sledovaný protein. Konec je vybrán proto, aby usnadnil purifikaci fuzního proteinu exportní protein::sledovaný protein a/nebo sledovaného proteinu produkovaného popsanými způsoby. Například, aby byla usnadněna purifikace proteinu může být do C-koncové části nebo N-koncové části sledovaného proteinu zapracováno určité množství histidinových zbytků. Je výhodné, že začlenění konce minimalizuje nesprávné sbalení sledovaného proteinu.

*0 **« · · •00 «

0

00 0 0 0 ·00 0

0000

0·

Kromě polyhistidinového konce, existuje ještě řada jiných proteinových konců, které mohou být pro usnadnění purifikace proteinu použity. V popsaném systému mohou být použity například antigenní konce jako je protein vážící maltosu, c-myc epitopový konec, zelený fluorescenční protein, luciferasa, beta-galaktosidasa, polyhistidinový konec nebo jakkýkoliv jiný vhodný proteinový expresní konec.

Fúzní protein exportní protein::sledovaný protein, který obsahuje exportní protein a sledovaný protein, může dále obsahovat další znaky, jejichž úkolem je usnadnit použití exprimováného a exportovaného proteinu. Například, aby došlo k separaci komponent fuzního proteinu exportní protein::sledovaný protein, mohou být mezi dvěma různými složkami fúzního proteinu exportní protein::sledovaný protein v případě potřeby včetně výše popsaných značek, vytvořena místa pro rozpoznání proteasami. Místo pro rozpoznám proteasami může být v expresní kazetě začleněno například mezi dvě sekvence exportního proteinu a sledovaného proteinu. Místo pro rozpoznání proteasami může být v expresní kazetě také začleněno mezi sekvence značky a sledovaného proteinu. Tato místa pro rozpoznání proteasami usnadňují separaci exportního proteinu od sledovaného proteinu.

S expresní kazetou může být někdy spojena selekční značka. Termín značka, který je zde používán, se vztahuje ke genu, který kóduje charakteristický znak nebo fenotyp a umožňuje selekci nebo testování a výběr hostitelské buňky obsahující danou značku. Značkovým genem může být rezistence vůči antibiotiku, čímž může být odpovídající antibiotikum použito pro rozlišení transformovaných hostitelských buněk a buněk, které transformovány nejsou. Značkovým genem může být i některý další gen rezistence vůči léku. Mezi příklady vhodných selekčních značek patří adenosindeaminasa, dihydrofolátreduktasa, hygromycin-β-fosfotransferasa, thymidinkinasa, xanthin-guaninfosforibosyltransferasa, glykofosfátová a glufosinatová rezistence a amino-glykosid-3 '-O-fosfotransferasa II (rezistence vůči kanamycinu, neomycinu a G418). Odborníci v dané oblasti budou další vhodné značky, které mohou být použity, znát.

Příklad expresního vektoru je uveden na obr. 1. Na obr. 1A je uveden expresní vektor pSEC84. Nukleotidovou sekvenci vektoru pSEC84 je možno nalézt v SEQ ID č:l. Aminokyselinová sekvence ClyA kódovaná genem clyA je uvedena v SEQ ID č:2.

Každý vektor uvedený na obr. 1A až D obsahuje promotor (P_ompc - modifikovaný osmoticky regulovaný promotor ompC z E. coli), exportní protein (clyA), počátek replikace, terminátor transkripce (TI), pasivní dělící funkci (par), rezistenci vůči kanamycinu (aph), posegregační zabíjecí systém (hok-sok) a aktivní dělící systém (parA). Je třeba uvést, že tyto vektorové komponenty jsou pouze ukázkové pro toto jedno provedení odhaleného systému.

Obrázek 1B zobrazuje expresní vektor pSECS4ó/«. Tento expresní vektor obsahuje stejné znaky jako vektor pSEC84 a dále obsahuje konstrukt fuzního proteinu exportní protein: :sledovaný protein. Konkrétně gen bia kódující β-laktamasu byl klonován do vektoru pSEC84 v místě Nhe I v pozici 1426 výchozího vektoru. Jiné fúzní konstrukty jsou uvedeny na obr. 1C (pSEC84s<zc2?) a obr. ID (pSEC84g#?wv).

• 0 0000

Sledované geny

Zde odhalený proteinový exportní systém může být použit u řady sledovaných genů. V jednom provedení kóduje sledovaný gen požadovaný protein. V odhaleném exportním systému může být použit libovolný protein, který je přístupný rekombinantní bakteriální expresi. Sledovaný gen může kódovat jakýkoliv polypeptid, jako je například savčí polypeptid jako enzym, inhibitor enzymu, hormon, lymfokin, plasminogenový aktivátor nebo jakýkoliv jiný protein, který je předmětem zájmu. Sledovaný gen může kódovat eukaryotický gen, prokaryotický gen, rostlinný gen nebo virový gen.

Výhodou odhaleného systému je to, že poskytuje způsob, kterým proteiny, které byly pro hostitelskou bakterii toxické, mohou být nyní exprimovány. Rekombinantní exprese určitých proteinů je složitá nebo ji nelze vůbec uskutečnit například tehdy, není-li exprimovaný protein exportován ven z hostitelské bakteriální buňky. Pomocí postupů, které jsou zde odhaleny, může odborník v dané oblasti exprimovat dříve neexprimovatelný nebo nedostatečně exprimovaný protein a produkovat tak žádoucí protein v použitelných množstvích.

V jiném provedení je sledovaným genem gen kódující imunogenní antigen a sledovaným proteinem je antigen, což může být protein nebo jeho antigenní fragment z libovolného patogenů jako jsou virové patogeny, bakteriální patogeny a parazitové patogeny. Sledovaným genem může být někdy také syntetický gen konstruovaný pomocí rekombinantních DNA způsobů, který kóduje antigeny nebo jejich části z virových, bakteriálních, parazitových patogenů nebo jiný sledovaný antigen. Tyto patogeny mohou být pro hostitele, a to lidi, domácí zvířata nebo divoká zvířata, infekční.

Mezi příklady konkrétních virových patogenů, z nichž jsou odvozeny virové antigeny, patří, avšak nejsou tím nijak limitovány, ortomyxoviry jako je virus chřipky; retroviry jako je respiračně syncytiální virus (RSV) a virus opičí immunodeficience (SIV), herpesviry jako je virus Epstein Barrové (EBV); cytomegalovirus (CMV) nebo virus herpes simplex; lentiviry jako je virus lidské imunodeficience; rhabdoviry jako je vzteklina; pikomaviry jako je poliovirus; poxviry jako jsou neštovice; rotavirus; a parvoviry.

*· ··*· ·· ··· ·

Mezi příklady imunogenních antigenů z virových patogenů patří antigeny viru lidské imunodeficience Nef, p24, gpl20, gp41, Tat, Rev a Pol. Dalšími příklady antigenů jsou epitopy T buněk a B buněk gpl20, povrchový antigen hepatitidy B, rotavirové antigeny jako je VP4, VP6 a VP7, antigeny viru chřipky jako je hemaglutinin nebo nukleoprotein a thymidinkinasa viru herpes simplex. Sekvence nukleové kyseliny a aminokyselinové sekvence každého z těchto virových antigenů jsou odborníkům v dané oblasti dobře známé a jsou snadno dostupné.

Bakteriální patogeny, z nichž mohou být odvozeny bakteriální antigeny, zahrnují, aniž by tím však byly limitovány, Mycobacterium spp., Helicobacter pylori, Salmonella spp., Shigella spp., E. coli, Rickettsia spp., Listeria spp., Legionella pneumoniae, Pseudomonas spp., Vibrio spp., &Borellia burgdorferi.

Mezi příklady imunogenních antigenů z bakteriálních patogenů patří, aniž by tím však byly jakkoliv limitovány, antigen Shigella sonnei forma 1, O-antigen V. cholerae Inaba kmen 569B, imunogenní antigeny enterotoxigenní E. coli jako je CFA/I fimbriální antigen a netoxická B-podjednotka tepelně labilního toxinu, pertaktin z Bordetella pertussis·, adenylátcyklasa-hemolysin z B. pertussis a fragment C tetanového toxinu Clostridium tetani.

Mezi příklady imunogenních antigenů parazitových patogenů, z nichž mohou být parazitově antigeny odvozeny, patří, aniž by tím však byly jakkoliv limitovány, Plasmodium spp., Trypanosome spp., Giardia spp., Boophilus spp., Babesia spp., Entamoeba spp., Eimeria spp., Leishmania spp., Schistozome spp., Brugia spp., Fascida spp., Dirofilaria spp., Wuchereria spp. a Onchocerea spp.

Mezi příklady imunogenních antigenů z parazitových patogenů patří, aniž by tím však byly jakkoliv limitovány, cirkumsporozoitální antigeny z Plasmodium spp., jako je cirkumsporozoitální antigen P. bergerii nebo cirkumsporozoitální antigen P. falciparum; merozoitální povrchový antigen z Plasmodium spp.; lektin specifický pro galaktosu z Entamoeba histolytica; gp63 z Leishmania spp., paramyosin z Brugia malayi; triosafosfátisomerasa z Schistosoma mansoni; vylučovaný protein podobný globinu z Trichostrongylus colubriformis; glutathion-S-transferasa z Frasciola hepatica; Schistosoma bovis a S. japonicum·, a KLH z Schistosoma bovis a S. japonicum.

N jiném provedení může sledovaný gen kódovat terapeutické činidlo jako jsou činidla nádorově specifická, transplantátová nebo autoimunitní nebo jejich části. Někdy může sledovaný gen kódovat syntetické geny, které kódují nádorově specifická, transplantátová nebo autoimunitní činidla nebo jejich části.

Mezi příklady nádorově specifických činidel patří antigen specifický pro prostatu,

TAG-72 a CEA, MAGE-1 a tyrosinasa. Nedávno bylo ukázáno u myši, že imunizace • · • 1

9111 1 • · · » • · 111 1 • « * · · · »

1111 9 ο· ·· ·*·* » 1

1

1 • 1 1 » « nemaligními buňkami exprimujícími nádorový antigen poskytuje efekt podobný vakcíně a rovněž zvířeti pomáhá rozpoutat imunitní odezvu za účelem zbavit se maligních nádorových buněk zobrazujících stejný antigen.

Mezi příklady transplantních antigenů patří CD3 receptor na T buňkách. U působení protilátky na CD3 receptor bylo ukázáno, že rychle čistí cirkulující T buňky a zabraňuje nej odmítavějším případům.

Mezi příklady autoimunitních antigenů patří IAS β řetězec. U očkování myši 18 aminokyselinovým peptidem z IAS β řetězce bylo ukázáno, že chrání a léčí myši s experimentální autoimunní encephalomyelitidou.

Sledovaný gen může také kódovat imunoregulační molekuly. Tyto imunoregulační molekuly zahrnují, avšak nejsou tím jakkoliv limitovány, růstové faktory, jako je M-CSF, GM-CSF; a cytokiny jako je IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 nebo IFN-gamma. Nedávno bylo u lokalizovaného dopravení cytokinů do nádorové tkáně ukázáno, že stimuluje silnou systemickou imunitu a zvyšuje prezentaci nádorového antigenů, aniž by byla produkována systemická cytokinová toxicita.

Stabilizované expresní systémy na bázi plasmidů

Navrhované bakteriální expresní systémy většinou využívají expresní vektory k tomu, aby využily systém syntézy proteinů bakteriální hostitelské buňky s cílem produkovat sledovaný protein. Hladiny exprese proteinů mohou být často zvýšeny použitím plasmidů poskytujících vysoký počet kopií nebo expresních vektorů poskytujících vysoký počet kopií a hostitelských buněk. Jak je diskutováno výše zavedení expresního vektoru poskytujícího vysoký počet kopií do bakteriální hostitelské buňky však klade na hostitelskou buňku určitou metabolickou zátěž, která může způsobit, že hostitelská buňka expresní vektor vypuzuje a tudíž snižuje hladiny exprese proteinu.

Při úpravě expresního vektoru je často přehlížen efekt, že expresní vektory poskytující vysoký počet kopií často ovlivňují stav hostitelské buňky, do níž je expresní vektor začleněn. Zátěž kladená na hostitelské bakteriální buňky nesoucí tyto plasmidy je kumulativním výsledkem metabolické kaskády. Kaskáda je spouštěna replikací expresních vektorů a snahou udržet je (viz Bailey, J.E., Host-vector interactions in Escherichia coli, str. 29 až 77. V A. Fiechter (vyd.) Advances in Biochemical Engineering. Biotechnology. Springer-Verlag, Berlin (1993), Glick, B.R., Biotechnol. Adv. 13:247 až 261 (1995), a Smith & Bidochka. Can. J. Microbiol. 44:351 až 355 (1998)). Kaskáda je také spouštěna transkripcí a translací různých

♦* «··· expresním vektorem kódovaných funkcí včetně sledovaného proteinu. Mechanismy, jako jsou ty popsané výše, vysvětlují fakt, že bakterie nesoucí plasmid roste pomaleji než bakterie bez plasmidu. Tyto mechanismy mohou také vysvětlit zjištění, že růstová rychlost klesá se zvyšujícím se počtem kopií.

U růstových rychlostí rekombinantních organismů obsahujících expresní vektory bylo pozorováno, že se se zvyšující se expresí sledovaného genu snižují. Pokles růstu může vyvolat indukci různých buněčných proteas, které mohou štěpit sledovaný exprimovaný rekombinantní protein. Snížená růstová rychlost je tedy nevyhnutelným důsledkem metabolické zátěže, která je kumulativním výsledkem řady fyziologických poruch. Fyziologické poruchy jsou například výsledkem exprese a hromadění sledovaného proteinu uvnitř hostitelské bakterie. Toto hromadění může být škodlivé pro životaschopnost hostitelského organismu a tudíž vytváří negativní selekční tlak.

Protože metabolické zátěže, které jsou diskutovány výše, způsobují selektivní tlak na ztrátu přítomných expresních vektorů v nepřítomnosti selekce, může dojít poté, co byla hostitelská buňka transformována expresním vektorem obsahujícím sledovaný gen, k podstatnému úbytku expresních vektorů z hostitelské buňky. Spontánní ztráta plasmidu odstraňuje z hostitelské buňky jakoukoliv metabolickou zátěž a umožňuje hostitelské buňce bez plasmidu rychle přerůst populaci hostitelské buňky nesoucí plasmid. Tento rychlejší růst hostitelských buněk, které neobsahují a tudíž ani neexprimují sledovaný protein, snižuje celkové hladiny produkce proteinu. Proto hostitelské buňky, které nejsou geneticky přinuceny k tomu, aby udržovaly expresní vektory řídící syntézu vysokých hladin daného proteinu, mohou produkovat podstatně méně proteinu.

Existuje řada způsobů jak tento metabolický stres snížit. Kontrolovaná exprese sledovaného proteinu z expresních vektorů poskytujících vysoký počet kopií představuje jedno řešení jak syntetizovat vysoké hladiny sledovaného proteinu v hostitelských buňkách. Toto řešení je jedním provedením, jímž jsou realizovány odhalené způsoby. Využití indukovatelných promotorů je například jedním způsobem, jímž může být regulována exprese z expresního vektoru. Tyto induktivní promotory jsou diskutovány v kapitole týkající se expresní kazety.

Jiné provedení postupů, které jsou zde odhaleny, se vztahuje k expresnímu systému na bázi plasmidu upraveného tak, aby umožnil stabilní expresi vysokých hladin jednoho nebo více proteinů prostřednictvím rostoucí populace buněk. Stabilním expresním vektorem je výhodněji takový vektor, který zvěčňuje expresní vektor tím, že se hostitelská buňka replikuje. Expresní vektory, které udílí stabilitu plasmidu na dvou nezávislých úrovních, byly nedávno popsány v Galen a kol., Immun. 67:6 424 až 6 433 (1999) a v US patentových přihláškách číslo 09/204 117, • · • · • · • · · · podané 2. prosince 1998 a 09/453 313 podané 2. prosince 1999. Obě jsou zde zahrnuty jako odkaz.

V tomto provedení mohou být jednotlivé funkce začleněny do expresního vektoru za účelem zvýšit dědičnost plasmidu, protože daná bakterie nebo hostitelská buňka roste a následně se dělí. Ve vzácných případech, kdy dceřinná buňka nedědí alespoň jednu kopii expresního vektoru, je aktivován posegregační zabijecí systém a tím dochází k odstranění této bakterie nebo hostitelské buňky z rostoucí populace prostřednictvím lýze.

C. Bakteriální hostitelské buňky

Pro použití, které je zde uváděno, je vhodná řada druhů bakterií. Vhodné bakteriální druhy budou výhodněji schopny transportovat protein tak, že sledovaný gen může být vhodně přepisován a že sledovaný protein podléhá translaci a je exportován ven z bakterií. V jednom provedení vynálezu je bakterie podávána zvířeti a sledovaný protein tudíž musí být exportován ven z bakterie do zvířete. Může být použita invazivní a neinvazivní bakterie. Mezi invazivní bakterie patří například Shigella spp., Listeria spp., Rickettsia spp. a enteroinvazivní Escherichia coli. Výhodnější provedení využívá druhy Salmonella.

Konkrétní kmen Salmonella použitý v tomto odhalení není nebezpečný. Mezi příklady kmenů Salmonella, které mohou být použity v předmětném vynálezu patří S. Typhi (ATCC č. 7251) a S. Typhimurium (ATCC č. 13311). V předmětném vynálezu jsou výhodněji použity oslabené kmeny Salmonella kam patří S. Typhi aroAaroD (Hone a kol., Vacc., 9:810 až 816 (1991)) a S. Typhimurium mutant aroA (Mastroeni a kol., Micro. Pathol., 13:477 až 491 (1992))). Někdy mohou být zkonstruovány nové oslabené kmeny Salmonella a to tak, že jsou začleněny jedna nebo více oslabujících mutací jako je popsáno výše pro Salmonella spp.

D. Bioreaktory

Zde popsaný proteinový exportní systém je vytvořen tak, aby mohl být použit v bioreaktorech a podobných zařízeních, která usnadňují růst bakterií a zisk nebo použití žádoucího produktu nebo sledovaného proteinu. Existuje 5 fází, během nichž jsou z bioreaktorů získány biomolekuly: prvotní ošetření, separace v systému pevná látka/kapalina, zahuštění, přečištění (purifikace) a formulace. V rámci těchto fází je možno použít řadu postupů. Pro každou danou fázi jsou postupy následující: prvotní ošetření: rozrušení buněk, stabilizace, sterilizace, pasterizace a flokulace; separace pevná látka/kapalina: filtrace, sedimentace a * · • · • · · · · · ········ ····· ·· ·· ·· ·· centrifugace; Zahuštění: membrány, srážení, odpaření, extrakce a mrazová koncentrace; Přečištění: srážení, extrakce, diafíltrace, adsorpce a chromatografie; a formulace: sušení, potahování, granulace a výroba tablet.

V bioreaktorech, kdy bakterie neexportují požadovaný produkt ven z bakterie, může být bakterie namnožena, indukována tak, aby produkovala žádoucí produkt a poté lyžována za účelem uvolnit obsah. Toto rozrušení je většinou prováděno ve stejném médiu, v němž byla bakterie kultivována. K mechanickému porušení bakterie může být použit homogenizátor nebo kuličkový mlýnek. Při jiném než mechanickém porušování může být použit tepelný šok (který může zničit proteiny), mohou být použity detergenty, rozpouštědla, oddělovadla a enzymy. (Krijgsman, Releases of Intracellular Components, str. 22 až 42, v Product Recovery in Bioprocess Technology, vyd. Butteworth-Heinemann Ltd, Oxford, Velká Británie, 1992).

Poté, co je bakterie porušena, jsou separovány pevné částice od kapalných (separace pevná látka/kapalina). Požadovaný produkt je většinou obsažen v kapalině, která pak musí být zahuštěna. Poté je požadovaný produkt extrahován ze zahuštěné kapaliny.

Faktory, které negativně ovlivňují separaci žádoucího produktu od nežádoucích pevných látek nebo kapalin, jsou velikost, difuzivita, iontový náboj, rozpustnost a hustota. Při separaci na základě velikosti je možno použít mikrofíltry, textilní nebo vláknité filtry, ultrafíltraci, síta/filtry a gelovou chromatografii. Pro separaci na bázi různé difúze je možno použít reverzní osmózu a dialýzu. Ionexová chromatografie je používána pro separaci podle iontového náboje. Pro separaci požadovaného produktu na základě jeho rozpustnosti je možno použít extrakci rozpouštědlem. Pro separaci podle hustoty je možno použít ultracentrifugy, centrifugy a gravitační sedimentaci (Krijgsman, Downstream Processing in Biotechnology, str. 2 až 12, v Product Recovery in Bioprocess Technology, vyd. Butteworth-Heinemann Ltd, Oxford, Velká Británie, 1992).

Jednou z výhod použití odhalených systémů je to, že populace rekombinantních bakteriálních hostitelských buněk může být transformována expresním vektorem obsahujícím odhalený proteinový exportní systém a že tato populace bakteriálních hostitelských buněk může být udržována v kultuře a použita pro produkci proteinu, aniž by bylo třeba bakteriální hostitelské buňky sklízet a lyžovat. Kultivace bakteriálních hostitelských buněk a sklízení kultivačního média obsahujícího rekombinantně exprimovaný sledovaný protein mohou být uskutečněny v jakémkoliv typu bioreaktoru.

Existují různé typy bioreaktorů, avšak tato zařízení je možno rozdělit do dvou hlavních kategorií: bioreaktory s volně plovoucím obsahem a bioreaktory s vrstvou. V bioreaktorech s volně plovoucím obsahem bakterie volně plavou v médiu. Příklady bioreaktorů s volně • · · · • · plovoucím obsahem jsou běžné míchané tankové bioreaktory, probublávané kolony, čerpadlové, víceúčelové věžové bioreaktory, kapalné nepoháněné smyčkové bioreaktory a věžové bioreaktory s pumpou. Příkladem bioreaktoru s vrstvou je zhuštěný vrstvový bioreaktor. V bioreaktoru s vrstvou je bakterie zachycena na kuličky, membránu nebo jiný pevný nosič. Hybridní typ bioreaktoru může být vytvořen pomocí fluidizačního vrstvového bioreaktoru, kde je bakterie sice zachycena na kuličky nebo jiný nosič, ale může plavat v médiu. (Mijnbeek, The Conventional Stirrer Tank Reactor, str. 39 až 74; Mijnbeek, Bubble Column, Airlift Reactors, and Other Reactor Designs, str. 75 až 114; Geraats, An Introduction to Immobilized Systems str. 115 až 124; vše v Operational Modes of Bioreactors, vyd. Butteworth-Heinemann Ltd, Oxford, Velká Británie, 1992).

Použití proteinového exportního systému, který je zde popsán, a bioreaktoru s vrstvou umožňuje vynechat prvotní ošetření a separaci pevná látka/kapalina, protože požadovaný sledovaný protein je exportován ven z bakterie do média. Před tím než se začne s izolací požadovaného produktu je pouze potřeba oddělit médium od vrstvy. Pro bioreaktory s volně plovoucím obsahem je možno směs kapalina/bakterie odstředit, čímž je získána peleta bakterií. Poté se od pelety bakterií oddělí kapalina obsahující požadovaný protein. Dále je požadovaný sledovaný protein izolován z média. Dalším přínosem odhaleného systému je to, že média budou obsahovat méně nežádoucích proteinů než je přítomno v médiích, v nichž byly bakterie porušeny; všechny intracelulámí složky porušených bakterií se podle předmětného vynálezu v médiu nevyskytují. Proto je přečištění požadovaného sledovaného proteinu snažší. Kromě toho izolaci a purifikaci sledovaného proteinu také usnadňují konce a místa pro štěpení proteasami přítomné v sledovaném fúzním proteinu exportní protein:'.sledovaný protein.

Příkladem bioreaktoru je aparatura uvedená v US patentové přihlášce č. 5 635 368, Bioreactor with immobilized lactid acid bacteria and the use thereof, Lommi a kol., 3. červen, 1997, která je zde zahrnuta jako odkaz. Aparatura podle Lommiho se vztahuje k bioreaktoru s mobilizovanými bakteriemi, který je charakterizován tím, že bakterie jsou fixovány na povrch téměř nestlačitelného nosiče. Jiný příklad bioreaktoru je možno najít v US patentu č. 4 910 139, Method for continuously producing citric acid by duál hollow fibre membrane bioreactor, Chang a kol., 20. březen 1990, který je zde zahrnut jako odkaz. Tento vynález se vztahuje k rostoucím mobilizovaným bakteriím s cílem kontinuálně produkovat kyselinu citrónovou.

Další bioreaktor je odhalen v US patentu č. 5 585 266, Immobilized cell bioreactor,

Plitt a kol., 17. prosinec, 1996, který je zde zahrnut jako odkaz. Odhalené zařízení podle Plitta se vztahuje k bioreaktoru s imobilizovánými buňkami, kde se buňky nacházejí v nebo na imobilizační matrici zahrnující podpůrné pláty složené z běžné textilní tkaniny. US patenty • ·· · • · • ·

č. 4 665 027 a 5 512 480, které jsou zde oba zahrnuty jako odkaz, odhalují další provedení bioreaktoru.

E. Vakcíny

Zde popsaný proteinový exportní systém nachází využití při přípravě vakcín. Přípravu např. podjednotkových vakcín je možno provést pomocí proteinového exportního systému, protože systém usnadňuje zisk rekombinantního proteinu a snižuje přítomnost kontaminujících proteinů v růstovém médiu, v němž jsou rekombinantní hostitelské buňky množeny. Rekombinantní hostitelské buňky mohou být také použity pro výrobu imunogenních prostředků, v nichž je rekombinantní hostitelská buňka poskytována jedinci a jeho imunitní systém vytváří imunitní odezvu na proteiny exportované z rekombinantní hostitelské buňky.

Proteinový exportní systém, který je zde popsán, může být použit s libovolným antigenem s cílem připravit z něj vakcínu, přičemž antigenem je výše popsaný sledovaný protein. Příprava vakcíny je obecně popsána v New Trends and Developments in Vaccines, vydáno Voliér a kol., University Park Press, Baltimore, Md. USA, 1978. Enkapsulaci do lipozómů popsal například Fullerton, US patent č. 4 235 877. Spojení proteinů a makromolekul odhalili například Likhite, US patent ě. 4 372 945 a Armor a kol., US patent č. 4 474 757.

Množství antigenů v každé dávce vakcíny je určeno jako takové množství, které indukuje obrannou imunitní odezvu bez významných nežádoucích vedlejších účinků. Toto množství se bude lišit v závislosti na tom, které specifické antigeny jsou použity a na použitém způsobu dopravení (například, purifikované proteiny nebo živé bakterie). Obecně se očekává, že dávky obsahující purifikované proteiny budou obsahovat 1 až 1000 pg celkového antigenů, výhodněji 2 až 200 pg. Obecně se předpokládá, že dávky obsahující živé bakterie dopravující sledované proteiny budou obsahovat 1 až 1000 ng celkového sledovaného antigenů. Optimální množství pro konkrétní vakcínu může být zjištěno pomocí standardních studií, které zahrnují sledování titrů protilátek a jiných odezev u subjektů. Po úvodním očkování mohou subjekty (zvířata nebo lidé) obdržet jednu nebo více posilovačích dávek, například po 1 a 6 měsících.

Proteinový exportní systém může být použit také u živých bakteriálních vektorových vakcín za účelem zvýšit účinnost preparátu. Například US patent č. 5 387 744 od Curtis a kol., nazvaný Avirulent microbes and uses thereof: Salmonella typhi, který je zde zahrnut jako odkaz, poskytuje živou bakteriální vektorovou vakcínu proti S. Typhi. Ještě konkrétněji Curtissův patent poskytuje imunogenní prostředky pro imunizaci obratlovců nebo bezobratlích obsahující avirulentní derivát S. Typhi. Deriváty mají mutaci genů cya a/nebo crp a/nebo cdt.

• · · · · · · · · · • · · · · · • · ··· · · ·

Avirulentní deriváty uvedené Curtisem a kol. mohou být transformovány zde popsaným proteinovým exportním systémem, aby umožnily vzniklému rekombinantnímu organismu fungovat jako imunogenní prostředek proti S. Typhi a stejně tak i jinému antigenů nebo antigenům, které jsou spojeny s proteinovým exportním proteinem popsaného systému.

F. Další využití

Kromě terapeutických proteinů a antigenů, které jsou užitečné pro farmaceutický průmysl, může sledovaný gen kódovat enzymy, polypeptidy, proteiny nebo aminokyseliny, které mohou být užitečné např. v potravinářském průmyslu, průmyslu pro doplňky výživy, průmyslu aditiv do krmiv, biozprostředkujícím průmyslu, průmyslu na odstraňování odpadu a v průmyslu čištění odpadních vod. Pro účely těchto průmyslů nemusí být sledovaný protein kódovaný sledovaným genem proto, aby splnil svou funkci, izolován z média z bioreaktoru. Sledovaný protein může být katalyzátorem žádoucí reakce nebo může působit jako prekurzorová složka požadované reakce.

Následující příklady jsou poskytovány pouze za účelem ilustrace a nelze je považovat v žádném směru za jakkoliv limitující rozsah předmětného vynálezu.

Přehled obrázků ve výkresech

Obrázek 1 poskytuje příklady expresního vektoru tohoto vynálezu. Obrázek IA zobrazuje expresní vektor pSEC84. Obrázek 1B zobrazuje expresní vektor pSEC84ů/n. Obrázek 1C zobrazuje pSEC84saci? (SEQ ID č:18). Obrázek ID zobrazuje pSEC84g/puv.

Obrázek 2 zobrazuje exportování proteinové fuze ClyA-SacB, která vede k metabolizování sacharosy v pevném růstovém médiu. Kmeny byly kultivovány v médiu obsahujícím buď 8% sacharosu (2A a 2B), 16% sacharosu (2C a 2D) nebo 8% sacharosu + 8% L-arabinosu (2E a 2F). Obrázky 2A, 2C a 2E ukazují růst CVD 908-htrA exprimujícího ClyA. Obrázky 2B, 2D a 2F ukazují růst CVD 908-htrA exprimujícího ClyA-SacB.

Obrázek 3 zobrazuje růst CVD 908-htrA exprimujícího buď ClyA (pSEC84) nebo ClyA-SacB (pSEC84óac5), růst probíhal v médiu 2XLB50 obohaceném DHB a buď 10% sacharosou nebo 10% glukosou.

Obrázek 4 zobrazuje analýzu Western imunoblotem frakcí bakteriálních buněk z CVD

908-htrA (dráhy 1 až 3) nebo z CVD 908-/zřrri(pSEC84g^«v) (dráhy 4 až 8). Buněčné frakce jsou naneseny následovně: supematanty, dráhy 1 a 4; cytoplasmatické, dráhy 2 a 6;

· · 4

4 periplasmatická, dráha 5; nerozpustná, dráha 7; celá buňka, dráhy 3 a 8; a 50 ng GFPuv, dráha 9. Membrány s identickými vzorky byly testovány s protilátkami specifickými pro GFPuv (panel A) nebo E. coli GroEL (panel B).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 Klonování a mutace clyA S. Typhi

Identifikace clyA byla provedena pomocí analýzy BLASTN dosud kompletované sekvence genomu S. Typhi, která je dostupná v Sanger Centre (Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge, CB10 ISA, VB) (http://www.sanger.ac.uk/Proiects/Styphi/blastserver.shtml), pomocí DNA sekvence hlyE z E. coli (GenBank přístupové číslo U57430).

Otevřený čtecí rámec clyA byl identifikován jako sekvence o velikosti 912 bp, u níž se předpokládá, že kóduje protein o 304 zbytcích, jehož molekulová hmotnost je 33,8 kDa a který je z 89,4 % identický s HlyE E. coli. Ačkoliv clyA je z 85,3 % identický s otevřeným čtecím rámcem hlyE z E. coli o velikosti 915 bp, je upstream (po směru transkripce) transkripční kontrolní oblast vzdáleně spojená pouze s 33,6 % identických bází v rámci 250 bp oblasti.

Na základě této analýzy byly navrženy primery pro amplifikaci pomocí PCR genetické kazety bez promotoru kódující ClyA, v níž bylo vytvořeno optimalizované místo pro vazbu na ribozom jako 5 '-proximální ke startovnímu kodónu ATG. Sekvence primerů jsou uvedeny v Tab. 1.

Tabulka 1 Primery použité při konstrukci a sekvenční analýze plasmidových kazet

číslo primeru	sekvence3	vytvořená kazeta	templát (vzor)
1	5 GGATCC A AA ΑΤΑΛ GGA GGA A A A A A A A ATG ACTAGT ATTT TTGCAGAACAAACTGTAGAGGTAGTTAAAAGCGCGATCGA AACCGCAGATGGGGCATTAGATC-3'(SEQ ID č:3)	clyA-tetA	CVD 903-htrA
2	5'CCTAGGTTATCAGCTAGCGACGTCAGGAACCTCGAAAAG CGTCTTCTTACCATGACGTTGTTGGTATTCATTACAGGTGTT AATCATTTTCTTTGCAGCTC-3'(SEQ ID č:4)	11	II
3	5'CACGGTAAGAAGACGCTTTTCGAGGTTCCTGACGTCGCTA GCTGATAACCTAGGTCATGTTAGACAGCTTATCATCGATAA GCTTTAATGCGGTAGT-3'(SEQ ID č:5)	11	pBR322
4	5'AGATCTACTAGTGTCGACGCTAGCTATCAGGTCGAGGTG GCCCGGCTCCATGCACCGCGACGCAACGCG-3'(SEQ ID č:6)	II	II
5	5'ACTAGTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCT GAAGATCAGTTGGGTGCACGA-3'(SEQ ID č:7)	bla-tetA	pGEM-T
6	5'CATTAAAGGTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGCTA GCCTAGGTCATTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATC TCAGCGATCTGTCTATTTCG-3'(SEQ ID č:8)	11	II
7	5'CGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTA AGCATTGGTAATGACCTAGGCTAGCTCATGTTTGACAGCTT ATCATCGATAACCTTTAATG-3'(SEQ ID č:9)	II	pBR322
8	5'GCGCACTAGTAAAGAAACGAACCAAAAGCCATATAAGGA AACATACGGCATTTCCCATATTACACGCCATG-3 '(SEQ ID č:10)	sacB-tetA	pIB279
9	5'TAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTGTCAA ACATGACCCGGGTCACTATTTGTTAACTGTTAATTGTCCTT GTTCAAGGATGCTGTCTTTGAC-3 '(SEQ ID č: 11)	II	II
10	5'TCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGT AGTTTA-3 '(SEQ ID č: 12)	II	pBR322
11	5 'GCGC AGATCTTA ATCATCCAC4 GGA GGCGCTA GCA TG AGP AAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTG3'(SEQ ID.č:13)	gfpuv-tetA	pGEN84
12	5'GTGATAAACTACCGCATTAAAGCTTATCGATGATAAGCTG TCAAACATGAGCGCTCTAGAACTAGTTCATTATTTGTAGAG CTCATCCATGCCATGTGTAATCCCAGCAG-3'(SEQ ID č:14)	II	II

^a Příslušná restrikční místa jsou vyznačena silnějším písmem a jsou podtržena; ribosomová vazebná místa a startovní kodóny jsou vyznačeny kurzívou.

• 9 ««··

99 9

Pro lepší návratnost byly použity PCR s překrývajícími se úseky, jejichž cílem bylo vytvořit genetickou kazetu bez promotoru o velikosti 2252 bp clyA-tetA syntetizovanou PCR jak bylo již popsáno. Použity byly primer 1,2 a chromozomální templátová DNA z CVD 908-htrA a primery 3, 4 a templát pocházející z pBR322, získané v pGEM-T (Promega, Madison, WI) transformovaným do E. coli DH5a.

Rekombinantní klony byly testovány a vybírány na pevném agarovém médiu obsahujícím ovčí červené krevní buňky. Konkrétněji bylo testování hemolytické aktivity provedeno na čerstvě připraveném 1XLB agarovém médiu obsahujícím odpovídající antibiotickou selekci a 5% ovčí krev. Misky byly inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 24 h s cílem detekovat zóny odpovídající hemolýze červených krevních buněk (RBC). Některé kolonie, které vytvářely zřetelné kruhy hemolýzy, byly bezprostředně identifikovány. Toto pozorování naznačilo, že jestliže cly A vyžaduje pro přemístění ven z bakterie doplňkové proteiny, jsou tyto proteiny podle všeho společné pro S. Typhi a E. coli. Pro další použití byl vybrán pozitivní izolát, označený jako pGEM-Tc/y4.

Byly testovány funkční úlohy různých oblastí ClyA a to proto, aby byly získány informace pro vlastní úpravu rekombinantní ch fuzních proteinů kódujících antigen fúzovaný s ClyA. Konkrétněji byla testována úloha aminokonce, karboxylového konce nebo obou v exportu hemolysinu ven z bakterie.

Aby bylo toto zjištěno, byl clyA náhodně mutován pomocí transpozonu TnpAort. phoA z AnphoA kóduje alkalickou fosfatasu (viz Manoil & Bechwith, PNAS Sv. 82, str. 8 129 až 8 133, 1985). Přemístění TnphoA umožňuje náhodnou tvorbu fúzí N-konce PhoA do daného cílového proteinu. Mutace Tn/?áa4 byla provedena po elektroporaci pGEM-Tc/y4, exprimujícího funkční ClyA hemolysin z S. Typhi, do DH5a za vzniku DH5a (pGEM-Tc/yrt). Poté bylo mezi DH5a (pGEM-Tc/y.4) a TnphoA donorovým kmenem SM10(pRT733) provedeno křížení a transkonjuganty byly selektovány na 2XLB50 médiu obohaceném tetracyklinem, karbenicilinem a kanamycinem v koncentracích 10 pg/ml, 50 pg/ml a 10 pg/ml (2XLB50 + T10C50K10). Bakterie byly poté shromážděny dohromady a byly kultivovány v bujónových kulturách, aby mohly být plasmidy purifikovány. Purifikované plasmidy byly znovu transformovány do mutantu phoÁ)20 E. coli kmen CC118, aby mohly být selektovány Pho⁺ transformanty na 2XLB50 + T10C50K10 médiu obohaceném substrátem pro alkalickou fosfatasu 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fosfátem (BCIP; Sigma, St. Louis, MO) v koncentraci 200 pg/ml. Konečné proteinové fúze, které jsou N-koncově vylučovány do periplasmy, povrchově vystaveny nebo exportovány vně bakterie, mohou být snadno testovány pomocí chromogenního substrátu BCIP ·· ···♦ • · ··· · za účelem detekovat temně modré kruhy odpovídající hydrolýze; proteiny, které jsou C-koncově vylučovány nebudou touto metodou detekovány.

Pomocí mutace ΊχφΗοΑ bylo u 4 ze 621 PhoA⁺ kolonií zjištěno, že nevykazují hemolytickou aktivitu. Sekvenování jednoho izolátu potvrdilo inzerci PhoA za zbytek 179 (Ala) ClyA. Tato inzerce zkrátila ClyA v plánované hydrofobní transmembránové oblasti a odstraňuje zbývajících 125 C-koncových zbytků. Byl tedy učiněn závěr, že C-konec ClyA S. Typhi není pro transport cytoplasmy E. coli (a pravděpodobně také S. Typhi) nutný a že genetická fúze heterologních genů, které možná kódují exportované proteinové fúze, musí být provedena na 3'-konci clyA.

Příklad 2 Konstrukce C-koncových fúzí testovaných antigenů a ClyA

Pro pokusy, během nichž byla testována schopnost exportovat spolupřenášené proteiny fúzované na C-konec ClyA, byl zvolen gen bia, který kóduje RTEM-1 β-laktamasový protein, který nese rezistenci k ampicilinu a karbenicilinu.

Tato proteinová fúze byla upravena jako genetická fuze kazety Spěl inzertované do místa Nhel, které sousedí s tandemovými stop kodóny v 3'-konci clyA pSEC84. Nejdříve byl z derivátu pBR322 pomocí PCR syntetizován fragment Spél-Nhél o velikosti 807 bp kódující zralou β-laktamasu o velikosti 268 aminokyselin bez signální 23 zbytkové sekvence. Přečištěný fragment byl poté inzertován do připraveného C-koncového Nhél místa clyA s cílem vytvořit genetickou fúzi clyA-bla o velikosti 1742 bp kódující předpovězený fuzní protein o velikosti

62,9 kDa. Požadovaný plasmidový konstrukt byl snadno získán v izolovaných koloniích z kultur, které byly kultivovány v přítomnosti 5 pg/ml karbenicilinu. Plasmidy získané po selekci s 50 pg/ml karbenicilinu se však ukázaly jako nestabilní a geneticky pozměněné.

Fúze bla-tetA

Z důvodu problému se stabilitou plasmidu a genetickým pozměněním konstruktu clyA-bla, což bylo popsáno výše, byla syntetizována fúze bla-tetA a to jako Spěl kazeta o velikosti 2 111 bp. K tomu byla použita PCR s překrývajícími se úseky s použitím primerů 5 a 6 a templátu pGEM-T a primerů 7 a 4 a templátu pocházejícího z pBR322; výsledkem inzerce této kazety do pSEC84 naštěpeného Nhél byl pSEC846Zóz (viz obr. 1B).

U kolonií byla po začlenění do CVD 908-htrA testována schopnost zachovat si hemolytickou aktivitu a poté u nich byla sledována aktivita β-laktamasy pomocí chromogenního

0 0000

0000 •0 0000 0«

0 0000S 0 0 _ . «000000000 · · 00000· ** · 0···· · * φ t ι φ substrátu nitrocefín v koncentraci 100 pg/ml v 2XLA50+DHB+T10; misky byly inkubovány při teplotě 30 °C alespoň 16 h a poté byla sledována přítomnost červených kruhů okolo kolonií, které naznačovaly štěpení nitrocefínu. Červené kruhy byly pozorovány okolo CVD 908-AZr/í(pSEC84ů/«), což naznačuje štěpení nitrocefínu a tudíž potvrzuje přítomnost enzymově aktivní β-laktamasy. Byl učiněn závěr, že přibližně zdvojnásobení molekulové hmotnosti ClyA z 34 na 63 kDa vedlo k 2 doménovému fuznímu proteinu, v němž byly obě domény zřetelně správně sbaleny, aby byla zachována očekávaná biologická aktivita každé domény.

Fúze sacB-tetA

Aby mohla být zjištěna přizpůsobivost ClyA jakožto partnera fuze při exportu heterologních antigenů ven ze S. Typhi, byla testována schopnost ClyA exportovat potenciálně letální levansacharasu kódovanou sacB z Bacillus subtilis. Exprese genu sacB je letální tehdy, je-li exprimován v cytoplasmě střevních bakterií včetně S. Typhi, rostoucích v přítomnosti sacharosy. Byl učiněn pokus o konstrukci proteinové fuze ClyA-SacB s předpovězenou molekulovou hmotností 83,9 kDa a začlenění do CVD 908-htrA. Tato fuze byla zpracována jako sacB-tetA Spěl kazeta kódující zralou levansacharasu skládající se z 445 zbytků a mající molekulovou hmotnost 50,0 kDa bez 29 aminokyselinové signální sekvence. Poté byla inzertována do vytvořeného C-koncového Nhel místa ClyA v pSEC84. CVD 908-htrA nesoucí požadovaný konstrukt byl vybrán pomocí tetracyklinu a byla testována jeho schopnost přežít v přítomnosti sacharosy. Jestliže by ClyA-SacB nebyl exportován ven z cytoplasmy, nebyly by získány žádné izoláty, ale pro fúze buď povrchově exprimované nebo zcela exportované ven z bakterie do okolního média, by se u enzymově aktivního SacB zbytku očekávalo, že budě štěpit sacharosu za vzniku glukosy, která by mohla být ihned transportována do bakterie a metabolizována.

SacB-tetA kazeta byla syntetizována pomocí primerů 8 a 9 a templátu pIB279 a primerů 10 a 4 s cílem vytvořit Spěl kazetu o velikosti 2 653 bp inzertovanou do pSEC84 za vzniku clyA::sacB fúze pSEC84sflc5 (viz obr. IC). Po začlenění do CVD 908-htrA byla u kolonií znovu testována schopnost zachovat si hemolytickou aktivitu a poté byla sledována aktivita levansacharasy a to tak, že byly umístěny na MacConkey agarové základní médium (Difco) obohacené DHB a buď sacharosou (8% nebo 16% hmotn./obj.) nebo 8% sacharosou + 8% arabinosou, jakožto základním zdrojem uhlíku. Misky byly kultivovány při teplotě 30 °C po dobu 16 až 24 hodin, aby byly získány izolované cfu a aby byla stanovena fermentace sacharidu;

·« ···· ·» ···· » · · · · φ • · «·· · · · • ·· · · · · * • · · · * ♦· · ·· ·· ·♦ ·» další inkubace při laboratorní teplotě po několik následujících dní byla vyžadována proto, aby byla zjištěna tvorba klenby podobné polysacharidu přes kolonie.

Jak je ukázáno na obr. 2B a 2D, byl růst CVD 9Q8-htrA(pSEC84sacB), probíhal-li na indikačním médiu obsahujícím buď 8% sacharosu nebo 16% sacharosu jakožto základní sacharidový zdroj (růst na MacConkey agarovém základním médiu), excelentní. Byla pozorována polysacharidu podobná klenba, která se vytvořila přes izolované kolonie CVD 908-/zZrri(pSEC84ó'(3c5), která však nebyla zjištěna u CVD 908-/zZrri (obr. 2A a 2C) a jejíž intenzita se s rostoucí koncentrací sacharosy zvyšovala. Za předpokladu, že tímto polysacharidu podobným materiálem byl levan, tvořený polymerizací, která je katalýzo vána levansacharasou, fruktosy uvolněné při hydrolýze sacharosy, jsme se pokusili tuto polymerizací blokovat tím, že jsme začlenily 8% L-arabinosu, o níž je známé, že levansacharasu inhibuje. Jak je ukázáno na obr. 2F, nebyly již klenby pozorovány a kolonie CVD 908-htrA a CVD 908-AZrri(pSEC84.racB) nyní vypadaly velmi podobně.

Jestliže jsou fúze proteinů ClyA-SacB skutečně exportovány ven z CVD 908-AZr4(pSEC845'ucB), pak by štěpení sacharosy SacB doménou za vzniku volné glukosy mělo v případě, že tyto kmeny budou kultivovány jako bujónové kultury v přítomnosti sacharosy, poskytnout metabolickou výhodu ve srovnání s CVD 908-htrA. Pro ověření této hypotézy byly do 1 1 baněk obsahujících 2XLB50+DHB+K10 plus 10% sacharosu umístěno 100 ml kultury buď CVD 908-/zZrri(pSEC84) nebo CVD 908-htrA(pSEC84sacB). Růst byl porovnáván s kulturami CVD 908-A/rri(pSEC84), které byly jako pozitivní kontrola kultivovány v přítomnosti 10% glukosy. Jak je ukázáno na obr. 3 byl u CVD 908-AZrX(pSEC845ucR) pozorován rychlejší růst v přítomnosti sacharosy než u CVD 908-Aír4(pSEC84) rostoucí v přítomnosti glukosy nebo sacharosy. Zjištění byla potvrzena počítáním buněk. Jestliže toto dáme dohromady s výsledky, které byly pozorovány pro ClyA-Bla výše, data jasně naznačují, že ClyA je univerzálním fúzním partnerem pro export správně sbalených fúzních proteinů v nichž je zachována biologická aktivita fúzovaných domén ven z bakterie.

Fúze clyA::gfpuv

Aby byly definovány exportní vlastnosti ClyA a aby byla specificky ověřena přítomnost fúzních produktů ClyA v supematantu exponeciálně rostoucího CVD 908-/zZrri, byla konstruována genetická fúze clyA, kde clyA byl fúzován s fluorescenčním zeleným proteinem (GFPuv) vytvářejícím kazetu clyA;:gfpuv pSEC84gfpuv (viz obr. ID) a izogenní pro pSEC84b/u i pSEC84sacB. CVD 908-A/r/í(pSEC84g^uv) opět zůstal hemolytický, ale se sníženou ··»· ·· ««·· fluorescencí oproti cytoplasmaticky exprímovanému GFPuv. Pomocí GFP polyklonální protilátky (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) byl pomocí Western imunoblotové analýzy testován export ClyA-GFPuv do supematantu kultury, což je ukázáno na obr. 4. Obr. 4 zobrazuje sadu Western imunoblotů analyzujících bakteriální buněčné frakce z CVD 908-Λ/γ4 (dráhy 1 až 3) nebo CVD 908-/z/r/í(pSEC84g/pwv) (dráhy 4 až 8). Buněčné frakce byly naneseny následovně: supematanty, dráhy 1 a 4; cytoplasmatické, dráhy 2 a 6; periplasmatická, dráha 5; nerozpustná, dráha 7; celé buňky, dráhy 3 a 8; a 50 ng GFPuv, dráha 9. Membrány s identickými vzorky byly podrobeny reakci s protilátkami specifickými pro GFPuv (panel A) nebo E. coli GroEL (panel B). Jak je patrné z tohoto obrázku, bylo významné množství očekávaného fúzního proteinu o velikosti 61 kDa detekováno v 0,5 ml supematantu z CVD 9Q8-htrA(pSEC84gfpuv) sráženého TCA (dráha 4); nevýznamné křížové reakce odpovídající velikosti asi 45 kDa byla rovněž detekována v cytoplasmě CVD 908-AírX (dráha 2) a v cytoplasmatických, nerozpustných a celobuněčných frakcích CVD 908-/tfr4(pSEC84_<g/pwv); zajímavé je, že dráha 5 ukazuje, že z periplasmatického prostoru je získáno velmi málo ClyA-GFPuv.

Závěr

Výsledky této práce jasně podporují závěr, že kódovaný hemolysin ClyA ze S. Typhi může být použit k usnadnění exportu heterologních antigenních domén ven z oslabeného očkovacího kmene CVD 908-htrA do okolního média. Tato práce dále ukazuje, že ClyA je možno použít k usnadnění exportu fúzního proteinu ven z bakterie do okolního média. Jak je zobrazeno výše, byla schopnost exportovat správně sbalené proteiny, které jsou předmětem zájmu, fúzované na C-konec ClyA, ukázána prostřednictvím genu bia, který kóduje RTEM-1 β-laktamasový protein, který nese rezistenci k ampicilinu a karbenicilinu. Gen bia v pBR322 je 861 bp dlouhý a kóduje protein o velikosti 31,5 kDa se signální 23 aminokyselinovou sekvencí, která řídí N-koncové vylučování β-laktamasy do periplasmatického prostoru. Tato práce naznačuje úspěšné vytvoření genové fúze kódující funkční fúzi proteinů ClyA^-laktamasa, která si uchovává hemolytickou aktivitu i schopnost štěpit chromogenní substrát β-laktamasy nitrocefin, čímž dochází k produkci červených kruhů na žlutém pozadí neštěpeného nitrocefinu.

Zajímavé je, že pokusy selektovat tyto expresní vektory, když tranformanty rostly v bohatém médiu obohaceném 50 pg/ml karbenicilinu nebo ampicilinu, byly neúspěšné, a byly získány pouze značně přeskupené plasmidy, což bylo potvrzeno pomocí restrikčních map. Na závěr bylo ukázáno, že exprimovaná cytoplasmatická β-laktamasa nese rezistenci k přibližně 5 pg/ml ampicilinu, zatímco příslušně exprimovaná periplasmatická β-laktamasa udílí rezistenci »»·♦ ·♦ ···”» • · ·»·♦ 9 4 φ * · ·«··· »1 4 * · 44 44 444 4 4 . * · · · · * 4 9 · ·

Z-/ ·«<·· 4 49 44 44 44 vůči více než 4 000 pg/ml ampicilinu. U povrchového zobrazení β-laktamasových proteinových fúzí však bylo ukázáno, že udílí rezistenci vůči asi 100 pg/ml ampicilinu. Chervaux a kol. skutečně oznámili, že sekrece β-laktamasových fúzí z E. coli zprostředkovaná HlyA znovu udílí malou rezistenci vůči asi 5 pg/ml ampicilinu. Ukázali, že i přesto, že specifická aktivita neporušené β-laktamasové domény povrchové fúze zůstala podobná aktivitě nemodifikované β-laktamasy, rezistence vůči vysokým hladinám ampicilinu zjištěna nebyla. Učinili tedy závěr, že bakteriální rezistence vůči β-laktamovým antibiotikům vyžaduje významné koncentrace β-laktamasy v periplasmatickém prostoru blízko zabíjeným cílům. Na základě těchto pozorování byl učiněn závěr, že v CVD 908-Zúr4(pSEC84h/a) byly syntetizovány správně sbalené ClyA-beta-laktamasové proteinové fuze a byly exportovány tak, aby udělily hemolytický fenotyp i β-laktamasou zprostředkovanou hydrolýzu chromogenního cefalosporinového nitrocefínu, aniž by však byla udělena resistence k ampicilinu nebo karbenicilinu.

Pro jasnější definování povahy exportu zprostředkovaného Cly A heterologních antigenových domén ven z CVD 908-htrA a možná také vyloučení toho, aby byly zahrnuty periplasmatické intermediáty, byly studovány fúze sacB kódující potenciálně letální levansacharasu z B. subtilis. Levansacharasa je 50 kDa exoenzym s jedním polypeptidovým řetězcem, který katalyzuje hydrolýzu sacharosy za vzniku volné glukosy a fruktosy a střídavě katalyzuje polymerizaci fruktosy do dlouhých polymerů nazvaných levan. Výsledkem uvolňování levansacharasy z B. subtilis, který roste na médiu obsahujícím sacharosu, je růst izolovaných kolonií, které jsou po prodloužené inkubaci při laboratorní teplotě potaženy působivou klenbou viskózního levanu.

Bylo potvrzeno, že cytoplasmatická a periplasmatická exprese levansacharasy kódované sacB je pro řadu bakterií rostoucích v přítomnosti sacharosy letální. Nedávno bylo pomocí mutací signálního peptidu ukázáno, že levansacharasa se stává v cytoplasmě B. subtilis, který je kultivovaný v přítomnosti sacharosy, letální a že inaktivace aktivity fruktosapolymerázy byla pro odstranění sacharosou indukované letality nezbytná. Na základě tohoto bylo uvedeno, že výsledkem selhání fúzí ClyA-SacB z pohledu jejich exportu ven z cytoplasmatického a periplasmatického prostoru CVD 908-htrA by měla být výrazná intracelulámí akumulace fuzního proteinu, jejíž výsledkem je letalita pro CVD 90&-htrA(pSEC84sacB), který je kultivován v přítomnosti sacharosy.

Jak je ukázáno na obr. 2B nebylo však u CVD 908-/2/r4(pSEC84suc£) pozorováno pouze to, že roste v přítomnosti 8% sacharosy, ale že také fermentuje cukr, tzn. fenotyp, který nebyl pozorován u CVD 908-A/r4(pSEC84), který byl kultivován za stejných podmínek. Když byla koncentrace sacharosy zvýšena z 8% na 16%, zvýšila se rovněž fermentace sacharosy a *· 0000

0000 ♦ » 0 • 0 0 0 0 0

0000 · • 0 00 • 0 0

0 000

0 «0 0

0 0 0 *0 00 • 0 0 0 0 0 •00 S

0 0 0 00 00 docházelo k akumulaci jedinečných kleneb tvořených látkou podobnou levanu, které v přítomnosti inhibitoru levansacharasy arabinosy vymizely. Podobná pozorování aktivity levansacharasy oznámil Jung a kol. pro povrchově exprimovanou levansacharasovou doménu fúzovanou na C-konec ice nucleation proteinu z Pseudomonas syringae a exprimovanou v E. coli. Ve světle těchto výsledků byl učiněn závěr, že vytvořený CVD 908-A/r?l(pSEC84.sac/?) měl schopnost zpracovávat sacharosu jako zdroj uhlíku v takových experimentech, v nichž bylo u CVD 908-/ůrA(pSEC84sacB) pozorováno, že roste rychleji než CVD 908-ůtM(pSEC84), který byl kultivován v přítomnosti buď sacharosy nebo čisté glukosy. Byl opět učiněn závěr, že stejně jako u proteinových fúzí ClyA-beta-laktamasa popsaných výše, byly v CVD 908-á/rÁ syntetizovány správně sbalené proteinové fúze ClyA-SacB a byly exportovány tak, že udílely jak očekávaný hemolytický fenotyp tak i levansacharasovou aktivitu umožňující, aby nebyl extracelulámí katabolismus náhradního zdroje sacharidu využíván hostitelským kmenem bez plasmidu.

Příklad 3 Exprese proteinové fúze ClyA-SacB v bioreaktoru

Bioreaktor je připraven podle návodů v US patentu č. 5 635 368, který je zde zahrnut jako odkaz. Stručně, granulámí derivatizovaná celulosa je vyrobena podle US patentu č. 4 355 117 následujícím způsobem: 25 dílů vláknité celulosyje smícháno s 25 díly oxidu titaničitého a směs je smíchána s 50 díly polystyrenu. Extrudát je ochlazen ve vodě a vytříděn na velikost částic 0,35 až 0,85 mm. Vytříděné granulámí shluklé částice celulosy jsou derivatizovány s cílem vytvořit DEAE celulosu, což je popsáno v US patentu výše. Poté je 10 g granulámí DEAE celulosy suspendováno v destilované vodě a suspenze je ponechána po dobu alespoň 5 h za občasného míchání. Hydratovaný nosič je poté přelit destilovanou vodou a je převeden do skleněné kolony s vnitřním průměrem 15 mm, kde vytvoří vrstvu o výšce 145 mm.

Bakterie transformovaná pSEC84sflcR (viz příklad 2) je kultivována 48 h při teplotě 30 °C. 50 ml buněčné suspenze je pomocí čerpadla čerpáno přes vrstvu nosiče při průtokové rychlosti 25 ml/h. Poté jsou přes vrstvu nosiče čerpána další množství média s kulturou. Roztok vytékající z kolony je shromažďován a je z něj izolován a purifikován rekombinantně exprimovaný fúzní protein ClyA-SacB (kódovaný SEQ ID č:19). Štěpení SacB by mělo poskytnout taková komerční množství levansacharasy, která jsou dostatečná pro tvorbu levanu.

φφφφ

Příklad 4 Purifikace proteinu pomocí His konce za denaturujících podmínek

Bakteriální kultura je transformována expresním vektorem, který obsahuje expresní kazetu obsahující kódující sekvenci pro oslabený ClyA protein fúzovanou s genem sacB, který je fúzován s kódující sekvencí, která kóduje proteasové rozpoznávací místo, která je fúzována s sekvencí kódující polyhistidinový konec. Bakteriální kultura je dána do bioreaktorů, který je popsaný např. v příkladu 3.

Kultura je umístěna do podmínek, které podporují expresi rekombinantního fuzního proteinu, který je exportován do kultivačního média. Médium s kulturou je shromážděno a aplikováno na Ni kolonu (HISTRAP; Pharmacia) ekvilibrovanou pufrem s močovinou v koncentraci, která je dostatečně vysoká, aby denaturovala protein. Kolona je poté promyta a eluována. Eluát je analyzován gelovou elektroforézou s cílem stanovit přítomnost purifikovaného proteinu.

Frakce obsahující purifikovaný protein jsou dialyzovány proti pufru na štěpení enzymu. Dialyzované vzorky jsou poté shromážděny dohromady a podrobeny proteolýze, která je katalýzo vána příslušným enzymem. Proteolyzovaný vzorek je purifikován s cílem odstranit vyštěpený polyhistidinový konec za vzniku izolovaného přečištěného proteinu.

Příklad 5 Konstrukce oslabeného CVD 9O8-Afr/Í, který exprimuje Frag C a vyvolává na něj imunitní odezvu

Fúzní protein ClyA-Frag C je vytvořen v CVD 908-AfrA podle kroků, které jsou uvedeny v příkladu 1. Naším cílem je exprimovat kodónem optimalizovaný otevřený čtecí rámec toxC, který kóduje fragment C toxinu tetanu inzertovaný do ClyA, který je exprimován ze zde odhaleného expresního vektoru. Export fragmentu C je realizován prostřednictvím genetické fúze toxC na 3'-konec clyA a pokračující na oriEl replikonu pSEC84 jakožto 1426 bp velká Pompc-clyA EcoRl-Nhel kazeta. toxC kódující fragment C je přepracován z dřívějších konstruktů za pomoci protisměrného (forward) primerů 5 '-GCGCACTAGTAAAAACCTTGATTG TTGGGTCGACAACGAAGAAGACATCGATGTTATCCTGAAAAAGTCTACCATTCTGAC TTGGACATCAAC-3' (SEQ ID č:15) a protisměrného primerů 5AACTACCGCATTAA AGCTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGCTAGCCTAGGTCATTAGTCGTTGGTC CAACCTTCATCGGTCGGAACGAAGTA-3' (SEQ ID č:16) tak, aby vytvářel žádoucí PCR produkt (1424 bp). toxC kazeta je poté subklonována do pSEC84 naštěpeného Nhel za vzniku pSEC84toxC. DNA sekvence požadovaného spojení clyA-toxC je potvrzena pomocí • · · · • · • · · · sekvenačního primeru 5 '-CGATGCGGCAAAATTGAAATTAGCCACTGA-3' (SEQ ID č:17), který hybridizuje 172 bází po směru transkripce vytvořeného Nhel místa na 3'-konci clyA. U konstruktů je testována schopnost zachovat si hemolytickou aktivitu a pomocí Western imunoblotové analýzy je potvrzen export ClyA-Frag C do supematantu.

Skupiny 6 týdnů starých myší Balb/c jsou imunizovány intranasálně množstvím 1,0 χ 1O¹⁰ cfu kmene CVD 908-AZrd, který exprimuje fúzní protein ClyA-Frag C. Myším je odebrána krev před a 30 dní po imunizaci a sérum je až do použití skladováno při teplotě -20 °C. Protilátky přítomné v séru proti antigenům ClyA a Frag C jsou stanoveny pomocí ELISA. Výsledky naznačují, že imunizace kmenem CVD 908-A/rri, který exprimuje fúzní protein ClyA-Frag C, vyvolává tvorbu hladin protilátek proti antigenu Frag C, které jsou podstatně vyšší než jsou hladiny získané u kmene 9Q%-htrA, který fúzní protein ClyA-Frag C neexprimuje. Výsledky ukazují, že exprese antigenu Frag C jakožto fúzního proteinu s ClyA zvyšuje imunitní odezvu proti tomuto antigenu. Obranná imunita proti tetanovému toxinu je potvrzena vypořádáním se imunizované myši s jinak letálními dávkami přirozeného tetanového toxinu.

Ačkoliv výše uvedené odhalení popisuje vynález podrobněji a s odkazem na specifická provedení, bude odborníkům v dané oblasti techniky jistě zřejmé, že mohou být provedeny různé změny a modifikace, aniž by tím došlo k odchýlení se od smyslu a rozsahu vynálezu.

• · · ·

Literatura:

Atkins, A., N. R. Wyborn, A. J. Walace, T. J. Stillman, L. K. Black., A. B. Fielding, M. Hisakado, P. J. Artymiuk a J. Green. 2000. Structure-function relationships of a novel bacterial toxin, hemolysin E. The role of ct6. J. Biol. Chem. 275: 41 150 až 41 155.

Bailey, J. E., Host-vector interactions in Escherichia coli, str. 29 až ΊΊ. V A. Fiechter (vyd.), Advances in Biochemical Engineering. Biotechnology, Springer-Verlag, Berlin (1993).

Balbas, Ρ., X. Soberon, E. Merino, M. Zurita, H. Lomeli, F. Valle, N. Flores a F. Bolivar.

1986. Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives - a review. Gene 50: 3 až 40.

Blomfield, I. C., V. Vaughn, R. F. Rest a Β. I. Eisenstein. 1991. Allelic exchange in Escherichia coli using the Bacillus subtilis sacB gene and a temperature-sensitive pSCIOl replicon. Mol. Microbiol. 5: 1 447 až 1 457.

Boe, L., K. Gerdes a S. Molin. 1987. Effects of genes exerting growth inhibition and plasmid stability on plasmid maintenance. J. Bacteriol. 169: 4 646 až 4 650.

Borchert, Τ. V. a V. Nagarajan. 1991. Effect of signál sequenee alterations on the export of levansucrase in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 173: 276 až 282.

Bramucci, M. G. a V. Nagarajan. 1996. Direct selection of cloned DNA in Bacillus subtilis based on sucrose-induced lethality. Appl. Environ. Microbiol. 62: 3 948 až 3 953.

Chervaux, C., N. Sauvonnet, A. Le Clainche, B. Kenny, A. L. Hunt, J. K. Broome-Smith a I. B. Holland. 1995. Secretion of active β-lactamase to the medium mediated by the Escherichia coli haemolysin transport pathway. Mol. Gen. Genet. 249: 237 až 245.

Corchero, J. L. a A. Villaverde. 1998. Plasmid maintenance in Escherichia coli recombinant cultures is dramatically, steadily, and specifícally influenced by features of the eneoded proteins. Biotechnol. Bioeng. 58: 625 až 632.

• ·

4·· • 4

4

444 4 «· 444« · « * • 4 44444 44 4

Cserjan-Puschmann, M., W. Kramer, E. Duerrschmid, G. Streidner a K. Bayer. 1999. Metabolic approaches for the optimisation of recombinant fermentation processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53: 43 až 50.

Datta, N. a P. Kontomichalou. 1965. Penicillinase synthesis controlled by infectious R factors in Enterobacteriaceae. Nátuře 208: 239 až 241.

Dedonder, R. 1966. Levansucrase from Bacillus subtilis, str. 500 až 505. V E. F. Neufeld and V. Ginsburg (vyd.), Methods in Enzymology. Academie Press, New York.

del Castillo, F. J., S. C. Leal, F. Mořeno a I del Castillo. 1997. The Escherichia coli K-12 sheA gene encodes a 34-kDa secreted haemolysin. Mol. Microbiol. 25: 107 až 115.

Fouet, A., M. Arnaud, A. Klier a G. Rapoport. 1984. Characterization of the precursor form of the exocellular levansucrase from Bacillus subtilis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 119: 795 až 800.

Galen, J. E., O. G. Gomez-Duarte, G. Losonsky, J. L. Halpern, C. S. Lauderbaugh, S. Kaintuck, Μ. K. Reymann a Μ. M. Levine. 1997. A murine model of intranasal immunization to assess the immunogenicity of attenuated Salmonella typhi live vector vaccines in stimulating sérum antibody responses to expressed foreign antigens. Vaccine 15: 700 až 708.

Galen., J. E. a Μ. M. Levine. 2001. Can a flawless live vector vaccine strain be engineered? Trends in Microbiology 9: 372 až 376.

Galen, J. E., J. Nair, J. Y. Wang, S. S. Wasserman, Μ. K. Tanner, M. Sztein a Μ. M. Levine. 1999. Optimization of plasmid maintenace in the attenuated live vector vaccine strain Salmonella typhi CVD 908-ArM. Infect. Immun. 67: 6 424 až 6 433.

Gay, P., D. Le Coq., M. Steinmetz, T. Berkelman a C. I. Kado. 1985. Positive selection proceduře for entrapment of insertion sequence elements in Gram-negative bacteria. J. Bacteriol. 164: 918 až 921.

Gay, P., D. Le Coq, M. Steinmetz, E. Ferrari a J. A. Hoch. 1983. Cloning structural gene sacB, which codes for exoenzyme levansucrase od Bacillus subtilis'. expression of the gene in Escherichia coli. J. Bacteriol. 153: 1 424 až 1 431.

Glick, B. R., Biotechnol. Adv. 13: 247 až 261 (1995).

Han, Y. W., 1990. Microbiol. levan. Advances in Applied Microbiology 35: 171 až 194.

Harcum and Bentley. 1993. Biotechnol. Bioeng. 42: 675 až 685.

Hone, D.M., A. M. Harris, S. Chatfield, G. Dougan a Μ. M. Levine. 1991. Construction of genetically defined double aro mutants of Salmonella typhi. Vaccine 9: 810 až 816.

Jung, H., J. Lebeault a J. Pan. 1998. Surface display of Zymomonas mobilis levansucrase by using the ice-nucleation protein of Pseudomonas syringae. Nat. Bitechnol. 16: 576 až 580.

Lattemann, C. T., J. Maurer, E. Gerland a T. F. Meyer. 2000. Autodisplay: functional display of active β-lactamase on the surface of Escherichia coli by the AIDA-I autotransporter. J. Bacteriol. 182: 3 726 až 3 733.

Le Coq, D., P. Ratet, M. Steinmetz a P. Gay. 1984. A genetic approach to levansucrase secretion in Bacillus subtilis, str. 141 až 152. V A. T. Ganesan a J. A. Hoch (vyd.), Genetics and biotechnology of bacilli. Academie Press, New York.

LeBrun, E. a R. van Rapenbusch. 1980. The structure of Bacillus subtilis levansucrase at 3.8 A resolution. J. Biol. Chem. 255:12 034 až 12 036.

Ludwig, A., S. Bauer., R. Benz., B. Bergmann a W. Goebel. 1999. Analysis of the SlyAcontrolled expression, subcellular localization and pore-forming activity of a 34 kDa haemolysin (ClyA) from Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 31: 557 až 567.

Matthew, M. a R. W. Hedges. 1976. Analytical isoelectric focusing of R factor-determined βlactamase: correlation with plasmid compatibility. J. Bacteriol. 125: 713 až 718.

• · · · • · · · · · • · · * • · ♦ · · · • · · · · · · · • ·· ··· φ β • · · · · · · · ·· ·· ·· ··

McDermott, Ρ. J., Ρ. Gowland a P. C. Gowland. 1993. Adaptation of Escherichia coli growth rates to the presence of pBR322. Lett. Appl. Microbiol. 17: 139 až 143.

Orr, N., J. E. Galen a Μ, M. Levine. 1999. Expression and immunogenicity of a mutant diphtheria toxin molecule, CRM197, and its fragments in Salmonella typhi vaccine strain CVD 908-/ζ/ζΆ Infect. Immun. 67: 4 290 až 4 294.

Oscarsson, J., Y. Mizunoe, L. Li, X. Lai, A. Wieslander a Β. E. Uhlin. 1999. Molecular analysis of the cytolytic protein ClyA (SheA) from Escherichia coli. Mol. Microbiol. 32: 1 226 až 1 238.

Oscarsson, J., Y. Mizunoe, Β. E. Uhlin a D. J. Haydon. 1996. Induction of haemolytic activity in Escherichia coli by the slyA gene product. Mol. Microbiol. 20: 191 až 199.

Pecota, D. C., C. S. Kim, K. Wu, K. Gerdes a T. K. Wood. 1997. Combining the hok/sok, parDE, and pnd postsegregational killer loci to enhance plasmid stability. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1 917 až 1 924.

Pluckthun, A. a J. R. Knowles. 1987. The consequences of stepwise deletions from the signalprocessing site of β-lactamase. J. Biol. Chem. 262: 3 951 až 3 957.

Ried, J. a A. Collmer. 1987. An npI-sacB-sacR cartridge for constructing directed, unmarked mutations in Gram-negative bacteria by markér exchange-eviction mutagenesis. Gene 57: 239 až 246.

Sambrook, J., E. F. Fritsch a T. Maniatis. 1989. Anonymous Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

Sambrook, J. a D. W. Russell. 2001. Expression of cloned genes in Escherichia coli, 1535 Anonymous Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor.

• ·

O C · · 99999999

OJ 9 9 9 9 9 9* · « « « «

Shaw, K. J., P. N. Rather, R. S. Hare a G. H. Miller. 1993. Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol. Rev. 57: 138 až 163.

Smith & Bidochka. Can. J. Microbiol. 44: 351 až 355 (1998).

Steinmetz, M., D. Le Coq, Η. B. Djemia a P. Gay. 1983. Genetic analysis of sacB, the structural gene of a secreted enzyme, levansucrase of Bacillus subtilis Marburg. Mol. Gen. Genet. 191: 138 až 144.

Summers, D. K. 1998. Timing, self-control and sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability.Mol. Microbiol. 29: 1 137 až 1 145.

Sutcliffe, J. G. 1978. Nucleotide sequence of the ampicillin resistance gene of Escherichia coli plasmid pBR322. Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3 737 až 3 741.

Tacket, C. O., Mí. Sztein, G. Losonsky, S. S. Wasserman, J. P. Nataro, R. Edelman, D. Pickard, G. Dougan, S. Chatfíeld a Μ. M. Levine. 1997. Safety of live oral Salmonella typhi vaccine strains with deletions in htrA and aroC aroD and immune responses in humans. Infect. Immun. 65: 452 až 456.

Wallace, A. J., T. J. Stillman, A. Atkins, S. J. Jamieson, P. A. Bullough, J. Green a P. J. Artymiuk. 2000. E. coli hemolysin E (HlyE, ClyA, SheA): X-ray crystal structure of the toxin and observation of membrane pores by electron microscopy. Cell 100: 265 až 276.

Wang, J. Y., F. Noriega, J. E. Galen, E. M. Barry a Μ. M. Levine. 2000. Constitutive expression of the Vi polysaccharide capsular antigen in attenuated Salmonella enterica serovar Typhi oral vaccine strain CVD 909. Infect. Immun. 68: 4 647 až 4 652.

Wang, J. Y., M. F. Pasetti, F. Noriega, R. J. Anderson, S. S. Wasserman, J. E. Galen, M. Sztein a Μ. M. Levine. 2001. Construction, genotypic and phenotypic characterization, and immunogenicity of attenuated DguaBA Salmonella enterica serovar Typhi strain CVD 915. Infect. Immun. 69: 4 734 až 4 741.

• · · ·

Wu, K. a Τ. K. Wood. 1994. Evaluation of the hok/sok killer locus for enhanced plasmid stability. Biotechnol. Bioeng. 44: 912 až 921.

• · • ·· · • · • ··« • · · ·

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob exprese genu v bakteriální buňce, vyznačující se tím, že se skládá z:

   poskytnutí expresního vektoru populaci netransfromovaných bakteriálních buněk, kde expresní vektor zahrnuje expresní kazetu, která obsahuje sekvenci kódující exportní protein geneticky fúzovanou se sekvencí kódující sledovaný protein;

   exprimování expresní kazety tak, že je produkován fúzní protein exportní protein:: sledovaný protein a je exportován do kultivačního média;
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že zmíněnou bakteriální buňkou je buňka S. Typhi.
3. 3. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že zmíněnou bakteriální buňkou je buňka Escherichia coli.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein je vybrána ze skupiny, kterou tvoří gen clyA ze S. Typhi, gen clyA ze S. paratyphi nebo gen hlyE z Escherichia coli.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č:2.
6. 6. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein kóduje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č:2 s jednou nebo více mutacemi, jejichž výsledkem jsou aminokyselinové substituce vybrané ze skupiny, kterou tvoří aminokyselinové substituce v pozici 180, 185, 187 a 193, které oslabují hemolytickou aktivitu exportního proteinu.
7. 7. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že sledovaným proteinem je antigen.
8. 8. Způsob vyvolání imunitní odezvy u hostitele, vyznačující se tím, že se skládá z:

   poskytnutí populace bakteriálních buněk transformovaných expresním vektorem, který zahrnuje expresní kazetu obsahující sekvenci kódující exportní protein geneticky fúzovanou na sekvenci kódující sledovaný protein, zmíněnému hostiteli;

   • · ··* · ·· ···· • · .:λ :

   exprimování expresní kazety tak, že je produkován fuzní protein exportní protein:: sledovaný protein a je exportován do hostitele; a vyvolání imunitní odezvy proti fuznímu proteinu u subjektu.
9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že zmíněnou bakteriální buňkou je buňka S. Typhi.
10. 10. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že zmíněnou bakteriální buňkou je buňka Escherichia coli.
11. 11. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein je vybrána ze skupiny, kterou tvoří gen clyA ze S. Typhi, gen clyA ze S. paratyphi nebo gen hlyE z Eschericha coli.
12. 12. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein kóduje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID č: 2.
13. 13. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein kóduje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID č:2 s jednou nebo více mutacemi, jejichž výsledkem jsou aminokyselinové substituce vybrané ze skupiny, kterou tvoří aminokyselinové substituce v pozici 180, 185, 187 a 193, které oslabují hemolytickou aktivitu exportního proteinu.
14. 14. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že sledovaným proteinem je antigen.
15. 15. Systém pro exprimování sledovaného proteinu, vyznačující se tím, že obsahuje:

    expresní vektor obsahující expresní kazetu, přičemž expresní kazeta obsahuje sekvenci kódující exportní protein geneticky fúzovanou na sekvenci kódující sledovaný protein;

    hostitelskou buňku transformovanou expresním vektorem; a kultivační prostředí pro transformovanou hostitelskou buňku, přičemž expresní kazeta exprimuje fúzní protein exportní protein::sledovaný protein, který je exportován ven z transformované hostitelské buňky.

    • · • ··« ·· ··♦· ·· ··· · ·· · · · t í m, že zmíněnou hostitelskou buňkou
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se je buňka 5. Typhi.
17. 17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se je buňka Escherichia coli.
18. 18. Způsob podle nároku 15, v y z n a č u j í c í se t í m, že sekvence kódující exportní protein je vybrána ze skupiny, kterou tvoří gen clyA ze S. Typhi, gen clyA ze S. paratyphi nebo gen hlyE z Eschericha coli.
19. 19. Způsob podle nároku 15,vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein kóduje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID č:2.
20. 20. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že sekvence kódující exportní protein kóduje aminokyselinovou sekvenci podle SEQ ID č:2 s jednou nebo více mutacemi, jejichž výsledkem jsou aminokyselinové substituce vybrané ze skupiny, kterou tvoří aminokyselinové substituce v pozici 180, 185, 187 a 193, které oslabují hemolytickou aktivitu exportního proteinu.

    t í m, že zmíněnou hostitelskou buňkou ··♦· «· ·· • · · Μ « • · ··* · · • · · · · · « • · · · · · ·· ·· ·· ·· ···· ·· «44« «· ·· > · · » · * ·· » · · 4 ·· »··· ·· ·\ “Κ,,.

    .„JZ ·—^-⁹ -.Λ·*-»’*.

    Ό · \ ^ř'sj_ ř> ,*>

    * ’ ,Ο/χώ-χ>^; 'ΖΖ#'' »·«·”*»’. -Κ ,- ..·£* ;*».

    <** x-t·;·· J· - X» ,· -