CZ20031409A3 - Mikroorganismy a způsob výroby amidů - Google Patents

Mikroorganismy a způsob výroby amidů Download PDF

Info

Publication number
CZ20031409A3
CZ20031409A3 CZ20031409A CZ20031409A CZ20031409A3 CZ 20031409 A3 CZ20031409 A3 CZ 20031409A3 CZ 20031409 A CZ20031409 A CZ 20031409A CZ 20031409 A CZ20031409 A CZ 20031409A CZ 20031409 A3 CZ20031409 A3 CZ 20031409A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
rhodococcus
nitrile hydratase
activity
acetonitrile
cyanopyridine
Prior art date
Application number
CZ20031409A
Other languages
English (en)
Inventor
Karen Tracey Robins
Toru Nagasawa
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of CZ20031409A3 publication Critical patent/CZ20031409A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01084—Nitrile hydratase (4.2.1.84)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Mikroorganismy a způsob výroby amidů
Oblast techniky
Vynález se týká mikroorganismů, které jsou schopné tolerovat acetonitril v koncentraci alespoň 3M, enzymu s aktivitou nitrilhydratasy, způsobu výroby amidů za použití těchto mikroorganismů, popřídě enzymu a rovněž použití těchto mikroorganismů k odstranění acetonilrilovýeh odpadů.
Dosavadní stav techniky
Pro výrobu amidů jako například amidu kyseliny nikotinové, pro zvířata a člověka esenciálního vitaminu komplexu vitaminu B, je známo několik biotechnologických způsobů.
Například ΕΡ-Λ 0 307 926 popisuje přeměnu 3-kyanpyridinu na amid kyseliny nikotinové pomocí Rhodococcus rhodochrous Ji. Nevýhodou tohoto způsobu je červené zbarvení Rhodococcus rhodochrous Ji, čímž dochází ke zbarvení produktu. Navíc má tento mikroorganismus vysokou hodnotu I<M s ohledem na substrát 3-kyanpyridin, má nízkou tepelnou toleranci a malou toleranci vůči 3-kyanpyridinu.
WO 99/05306 popisuje například způsob výroby amidu kyseliny nikotinové z odpovídajícího nilrilu pomocí mikroorganismů rodu Rhodococcus, Amycolatopsis a Acdnomadura. Nevýhodou tohoto způsobu je to, že použité mikroorganismy rodu Amycolatopsis se při vyšších teplotách inaktivují. Navíc mají tyto mikroorganismy malou toleranci vůči 3kyanpyridinu a amidu kyseliny nikotinové. Popsané mikroorganismy rodu Rhodococcus mají vysokou hodnotu 1<m s ohledem na substrát 3-kyanpyridin a nízkou tepelnou stabilitu. Z těchto důvodů není tento způsob hospodárný pro velkovýrobu.
Úkolem předloženého vynálezu bylo poskytnout mikroorganismy, které jsou stabilnější, mají nižší hodnotu Km například pro substrát 3-kyanpyridin a tím jsou použitelné pro hospodárný způsob výroby amidů. Přičemž odpovídající amid může být izolován ve velmi dobrém výtěžku a čistotě. Tento úkol se řeší pomocí mikroorganismů podle nároku 1, enzymem podle nároku 5 nebo 7 a způsobem podle nároku 8.
• · · · • · tm · ·
Podstata vynálezu
Mikroorganismy podle vynálezu se získají vhodnou selekcí například ze vzorků půdy, kalu nebo odpadních vod za pomocí obvyklých mikrobiologických technik. Účelně se mikroorganismy podrobí selekci pěstováním s pyridinaldoximem obecného vzorce I
CHNOH (I) nebo s nitrily jako zdrojem uhlíku v přítomnosti iontů kobaltu a například extraktem kvasnic a/nebo amonných solí. Ze získaných kultur se pak selektují takové mikroorganismy, které jsou schopné tolerovat acetonitril v koncentraci alespoň 3M a které jsou schopné přeměňovat nitrily, jako například 3-kyanpyridin a acetonitril, na odpovídající amid.
Jako pyridinaldoximy se mohou použít pyridin-2-, pyridin-3- nebo pyridin-4-aldoxim.
Nitrily vhodné pro selekci jsou zejména takové, které se mají použít jako substrát při pozdější biotransformaci, například acetonitril (nitril kyseliny octové), propionitril, butyronitril, nitril kyseliny krotonové a nitril kyseliny malonové.
Jako zdroj pro kobaltové ionty se výhodně používají tzv. sloučeniny kobaltu generující kobaltové ionty, například soli Co21 nebo Co3’1’ jako chloridy, sulfáty a acetáty kobaltu. Výhodně se jako sloučenina kobaltu použije sůl Co21 jako například C0CI2. Pěstování se však může provádět také spolu s kovovým kobaltem nebo s jinými sloučeninami kobaltu. Obvykle se kobalt nebo sloučeniny kobaltu používají v množství od 1 do 30 mg/1, výhodně od 1 do 20 mg/1 v kultivačním mediu.
Jako amonné soli se mohou použít například amonné fosfáty jako (NH|)2HPO4 nebo (N114)1I2PO4.
Mikroorganismy se před vlastní biotransformaci pěstují ve vhodných mediích. Vhodná kultivační media jsou například media popsaná v tabulkách 3 nebo 5.
• · · · · · • AAA • A AAAAA · · · • · · · A AAAA A n AAAAA AAAAA
J AAAA AA AA AAA AA ··
Pěstování se obvykle provádí při teplotě od 20 do 40 °C a při hodnotě pH mezi 5 a 8, výhodně při teplotě od 25 do 35 °C a při hodnotě plí mezi 6 a 7,5.
Během pěstování se účelně indukují účinné enzymy, nitrilhydratasy, přidáním induktoru enzymu.
Jako induktory enzymu se mohou použít nasycené nebo nenasycené alifatické nitrily nebo odpovídající amidy. Jako alifatické nitrily se mohou použít všechny C2-7-alkannitrily, jako například butyronitril, isobutyronitril, nitril kyseliny valerové nebo nitril kyseliny isovalerové, nebo C3-7.alkennitrily, jako například methakrylnitril nebo nitril kyseliny krotonové. Jako alifatické amidy se mohou použít všechny C2-7-alkanamidy, jako například butyramid, isobutyramid, amid kyseliny valerové nebo amid kyseliny propionové, nebo C3-7alkenamidy, jako například methakrylamid nebo amid kyseliny krotonové. Výhodné induktory enzymu jsou methakrylamid, butyramid, isobutyramid, amid kyseliny valerové, methakrylnitril, amid kyseliny krotonové, butyronitril nebo isobutyronitril. Obzvláště výhodný induktor enzymu je methakrylnitril.
Mikroorganismy podle vynálezu jsou schopné tolerovat koncentraci acetonitrilu ve výši alespoň 3M. Tím je třeba rozumět to, zeje aktivita enzymu stabilní po 1 hodinové inkubaci s 3 M aeetonitrilem v 0,1 M kaliumfosfátovém pufru při pH 7,0 a 20 °C, to znamená že je ztráta na aktivitě maximálně 10 %. Výhodné mikroorganismy tolerují koncentraci acetonitrilu ve výši alespoň 6M po dobu 1 hodiny za shora uvedených podmínek při ztrátě aktivity maximálně 50 %. Obzvláště výhodné mikroorganismy tolerují koncentraci acetonitrilu ve výši alespoň 9M po dobu 1 hodiny za shora uvedených podmínek při ztrátě aktivity maximálně 70 %. U zcela nej výhodnějších mikroorganismů je samotná aktivita enzymu po několika minutové inkubaci s 15 M a 19 M aeetonitrilem (to odpovídá čistému acetonitrilu) stabilní. Ztráta aktivity enzymu je tak při inkubaci s 15 M aeetonitrilem po 10 min. méně než 10%.
Mikroorganismy podle vynálezu vykazují velkou termickou stabilitu, tzn. mají vyšší stabilitu při vysokých teplotách než doposud známé mikroorganismy. Výhodně činí ztráta aktivity enzymu mikroorganismů podle vynálezu po 1 hodinové inkubaci v 0,1 M kaliumfosfátovém pufru, pil 7,0 při 60 °C maximálně 10 % a ztráta aktivity enzymu po 2 hodinové inkubaci za uvedených podmínek činí maximálně 40 %.
• · ·
9 9
Pod pojmem aktivita enzymu se zde rozumí aktivita nitrilhydratasy, zejména aktivita nitrilhydratasy vůči 3-kyanpyridinu jako substrátu.
Dalšími vlastnosti mikroorganismů podle vynálezu jsou vysoká tolerance vůči výhodně používanému substrátu 3-kyanpyridinu a vůči produktu z toho vytvořeného amidu kyseliny nikotinové a nízká hodnota Km vzhledem k 3-kyanpyridinu. Vynikající vlastnost je také to, že mohou akumulovat acetamid ve vyšší koncentraci než odpovídá koncentraci roztoku acetamidu nasycenému při 30 °C (ca. 220-230 g acetamidu v 100 ml vody).
Výhodné mikroorganismy patří k rodu Rhodococcus. Obzvláště výhodné mikroorganismy jsou kmen Rhodococcus sp. FZ4 a jeho funkčně ekvivalentní varianty a mutanty. Pod pojmem funkčně ekvivalentní varianty a mutanty se rozumějí takové varianty a mutanty, které tolerují acetonitril v koncentracích nejméně 3M. Zcela nejvýhodnější jsou pigmentově-negativní kmeny Rhodococcus, tzn. kmeny, které nejsou červené, která může způsobit zabarvení požadovaného produktu. Takové kmeny se dají popřípadě lehce vytvořit z mikroorganismů tvořících pigment mutagenezí pomocí UV záření nebo mutagenními chemikáliemi.
Kmen Rhodococcus sp. FZ4 byl uložen 11. července 2000 u Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ), Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig podle Budapešťské úmluvy pod depozitním číslem DSM 13597. Tento mikroorganismus se nemohl na základě jeho identifikačních dat přiřadit k žádnému dosud známému druhu Rhodococcus a byl tedy přiřazen novému druhu.
Funkčně ekvivalentní varianty a mutanty kmenu Rhodococcus sp. FZ4 se mohou vytvořit buď spontánní mutací nebo například pomocí UV záření nebo mutagenními chemikáliemi. Výhodné varianty a mutanty kmenu Rhodococcus sp. FZ4 jsou pigmentově negativní, tzn. nemají červenou barvu, která může způsobit zabarvení požadovaného produktu.
Enzymový extrakt lze získat například otevřením mikroorganismů, například pomocí ultrazvuku, tlakovým zařízením podle Frenche nebo pomocí lysozymové metody.
0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 · · 00 0 · · · 0 0000 00 00 000 00 00
Enzymy podle vynálezu s aktivitou nitrilhydratasy se získají ze shora popsaných mikroorganismu. Výhodně se získají z mikroorganismů rodu Rhodococcus, zejména z mikroorganismů Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597).
Tyto enzymy vykazují zejména následující vlastnosti:
a) hodnotu Km pro substrát acetonitril 2,84±1,00 mM a pro substrát 3-kyanopyridin 80,5±15,0 mM, pokaždé v 0,05 M kaliumfosfátovém pufru, pH 7,0 při 20 °C,
b) pll-optimum při pi l 6,5±1,0 při 20 °C v 0,05 M kaliumfosfátovém pufru, zejména mají enzymy
c) nativní molekulovou hmotnost 465±50 kDa, stanoveno pomocí HPLC.
Vlastní biotransformace se může provádět se shora popsanými mikroorganismy, enzymovým extraktem z těchto mikroorganismů nebo s izolovaným enzymem. Výhodně se biotransformace provádí s mikroorganismy Rhodococcus sp. FZ4.
Jako substráty pro biotransformaci se mohou použít nitrily obecného vzorce II R1 — CN (II).
V obecném vzorci II substituent R1 znamená C|.6-alkylovou skupinu, C2-6-alkenylovou skupinu, nebo skupinu obecného vzorce IV
X (IV).
V obecném vzorci I V znamená X atom dusíku nebo -CH= a substituenty R2 a R3 znamenají nezávisle na sobě atom vodíku, atom halogenu, Ci.6-alkylovou skupinu nebo C2-6-alkenylovou skupinu.
Jako Ci.6-alkylová skupina se může použít methyl, ethyl, propyl, isopropyi, butyl, terc.-butyl, isobutyl, pentyl a jeho isomery, rovněž hexyl a jeho isomery. Jako C2-6-alkenylová skupina se může použít například vinyl, allyl, 1-propen-l-yl nebo l-propen-2-yl.
4444 44 4444 44 444 4
4444 4« *
6· 4 44444 44 4 • 4444 4 4 4 4 4 • 44 44 4 4444
4444 4 4 44 444 44 4 4
Jako halogen se může použít F, Cl, Br nebo J.
Výhodnými zástupci nitrilů obecného vzorce II jsou acetonitril, butyronitril, akrylnitril, propionitril, nitril kyseliny krotonové, 2-kyanpyridin, 3-kyanpyridin, 4-kyanpyridin, benzonitril, lluorbenzonitril, chlorbenzonitril a brombenzonitril. Nejvýhodnějšími substráty jsou acetonitril a 3-kyanpyridin.
Výhodně se bio transformace provádí při jednorázovém nebo kontinuálním přidání substrátu. Jak je odborníkovi známo, je použitelná koncentrace substrátu závislá na rozpustnosti substrátu, který se použije.
Výhodně se způsob provádí s buňkami v klidu (s nerostoucími buňkami).
Jako media pro biotransformaci se mohou použít v oboru obvyklá media, například nízkomolární fosfátové pufry, pufr IIEPES, citrátový pufr a borátový pufr. Mezi nízkoinolárními fosfátovými pufry je výhodný 0,01 až 0,5 M fosfátový pufr, obzvláště je výhodný 0,05 až 0,25 M fosfátový pufr.
Výhodně se biotransformace provádí při teplotě od 5 do 50 °C, obzvláště výhodně při teplotě od 20 do 40 °C. Výhodná hodnota pH je mezi 5 a 10, obzvláště výhodná je mezi 6 a 7,5.
l’o přeměně nilrilu obecného vzorce II se pak mohou izolovat odpovídající amidy obecného vzorce III
R — CONIE (III) kde R1 má již uvedený význam, popřípadě po oddělení buněk, pomocí obvyklých metod zpracování, jako například krystalizaci nebo sušením roztřikenr.
Další předmět vynálezu je použití shora popsaných mikroorganismů, zejména rodu Rhodococcus, pro odstranění odpadů acetonitrilu.
Acetonitril je rozpouštědlo, které se například používá při HPLC a nakonec se musí odstranit jako odpad. Při odstranění acetonitrilových odpadů podle vynálezu může být acetonitril ···· • · ···· • · ···· « · · · · · · · · · · * *7 · · · · · · · · · · / · · · · · ♦···· ···· ·· ·· ··· ·· ·· přítomen v koncentraci až maximálně 19 M, což odpovídá čistému acetonitrilu. Výhodně se používá 0,25 až 15,0 M, výhodně 1 až 10 M roztok, popřípadě suspenze acetonitrilu.
Výhodně se mikroorganismy používají k odstranění acetonitrilových odpadů při teplotě od 5 do 50 C, výhodně při teplotě od 20 do 40 °C. Hodnota pH je výhodně mezi 5 a 10, výhodně mezi 6 a 8. Doba přeměny acetonitrilu na acetamid pro odstranění odpadů závisí na koncentraci acetonitrilu. Například je tato doba ca. 2 hodiny při výrobě 9,5 M roztoku/suspenze acelamidu., při hodnotě pH 7,0 a teplotě ca. 20 °C.
Identifikace kmenu FZ4 (DSM 13597):
A) chemolaxonomické znaky:
1. Diagnostická aminokyselina peptidoglykanu: kyselina meso-diaminopimelová
2. Kyseliny mykolové: jsou přítomné kyseliny mykolové s délkou řetězce od C4o do C48
3. Vzorek mastných kyselin: jsou přítomné lineární, nasycené a nenasycené mastné kyseliny jakož i vysoký podíl kyseliny tuberkulostearové. Na základě vzorku mastných kyselin byl kmen FZ4 i ndeti Ukován jako náležející k rodu Rhodococcus.
B) konvenční znaky:
Makroskopický vzhled a morfologie buněk kmenu FZ4 se podobaly Rhodococcus rhodochrous. Kolonie kmenu FZ4 jsou lososově červené (RAL 3022) a mladé kultury vyvíjely rozvětvené čárky (hyfy), které se vyvinuly do tvaru tyčinek a koků.
Na základě chemotaxonomických a konvenčních znaků byl kmen FZ4 indentifikován jako přináležející k druhu Rhodococcus rhodochrous, avšak s malým korelačním faktorem.
C) analýza prvních 500 baží 16s rDNA
Sekvence prvních 500 baží 16S rDNA ukazuje podobnost jen 97,7 % k sekvenci typického zástupce kmenu pro druh Rhodococcus rhodochrous, Rhodococcus rhodochrous DSM 43241, a 99,1 % k jinému referenčnímu kmeni Rhodococcus rhodochrous. Protože byla podobnost sekvence prvních 500 baží 16S rDNA kmene FZ4 k sekvenci kmene Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 pod 99,5 %, nemůže být kmen FZ4 identifikován jako náležející k druhu Rhodococcus rhodochrous.
Kmen FZ4 byl proto identifikován jako nový druh uvnitř rodu Rhodococcus.
·· ···· ·· «· · 4 > · · ► · · · · ·· · ·· ·
Výkresy:
Obr. 1: Zobrazena je biotransformace acetonitrilu na acetamid s buňkami v klidu Rhodococcus ,sp. VZA.
Obr. 2: Zobrazeno je teplotní optimum aktivity nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodocuccus sp. FZ4.
Obr. 3: Zobrazena je termická stabilita aktivity nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. I7Z4.
Obr. 4: Zobrazeno je pH-optimum aktivity nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. ΓΖΑ.
Obr. 5: Zobrazena je pll-stabilita aktivity nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 6: Zobrazen je 3-kyanpyridinová tolerance aktivity nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 7: Zobrazen je nikotinamidová-tolerance aktivity nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 8: Zobrazen je vliv koncentrace acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. FZ4 při biotransformaci acetonitrilu na acetamid.
Obr. 9: Zobrazen je vliv koncentrace acetonitrilu na aktivitu nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. ΐΖΑ
Obr. 10: Zobrazena je aktivita nitrilhydratasy v buňkách v klidu Rhodococcus sp. FZ4 v závislosti na koncentraci 3-kyanpyridinu.
Obr. 11: Zobrazeno je logaritmické vynesení molekulových hmotností nitrilhydratasy a referenčních proteinů proti příslušné HPLC reteční době.
Obr. 12: Zobrazeno je logaritmické vynesení molekulových hmotností podjednotek nitrilhydratasy a referenčních proteinů proti příslušné hodnotě SDS Page RF.
Obr. 13: Zobrazena je aktivita čištěné nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4 v závislosti na koncentraci 3-kyanpyridinu.
Obr. 14: Zobrazena je aktivita čištěné nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4 v závislosti na koncentraci acetonitrilu.
Obr. 15: Zobrazena je termická stabilita čištěné nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 16: Zobrazeno je pll-optimum čištěné nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4.
Obr. 17: Zobrazena je pl l-stabilita čištěné nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4.
• · · · • · · · · · • · · · · • · · · • ·· ···
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Stanovení aktivity nitrilliydratasy
Ke stanovení aktivity nitrilhydratasy se inkubovala reakční směs sestávající z 3-kyanpyridinu (1,0 M; 1,0 ml), kal i um fosfátového pufru (0,1 M, pil 7,0; 0,5 ml) a buněčné suspenze (0,5 ml) za míchání při 20 °C po dobu 5 min. Reakce se ukončila přidáním HCl (5 M; 0,1 ml). Po filtrování (0,2 pm filtr) reakční směsi se množství vytvořeného amidu kyseliny nikotinové stanovilo pomocí HPLC (Waters Spherisorb 5 μ ODS2 (4,6 x 150 mm); KH2PO4/H3PO4 (10 mM; pil 2,8)/acelonitril = 9:1 (obj/obj); Iml/min; 230 nm). Celková aktivita se vyjadřuje jako pmol vytvořeného amidu kyseliny nikotinové/(min x ml) a specifická aktivita se vyjadřuje jako pmol vytvořeného amidu kyseliny nikotinové/(min x ml x ODóionm)·
Příklad 2
Isolace kmenu Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597)
V Arch. Microbiol. 1998, 170, 85-90 se popisuje, že kmen Rhodococcus sp. YH3-3 (TPU 3453) melabolizuje 3-pyridinaloxim přes 3-kyanpyridin a amid kyseliny nikotinové na kyselinu nikotinovou. V tomto případě se aktivita aldoximdehydratasy stejně jako aktivita nitrilhydratasy a amidasy kmenu Rhodococcus sp. YII3-3 (TPU 3453) indukovala, jak různými aldoximy, tak také nilrily.
Do obohacovacího media podle tabulky 1 se inokulovaly různé vzorky půd a inkubovaly se 7 až 10 dnů při 37 °C. Takto získané kultury se přeočkovaly do stejného media a ještě jednou se kultivovaly 7 až 10 dnů při 37 °C. Tato procedura se třikrát opakovala. Nakonec se kultury zředily a rozložily na destičky. Po 5 dnech inkubace desek při 37 °C se získaly jednotlivé kolonie. Jednotlivé kolonie se testovaly na přítomnost aktivity nitrilhydratasy podle příkladu 1. Tímto způsobem se isoloval kmen Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597). Místo 3pyridinaldoximu se mohou použít i nitrily acetonitril, propionitril, butyronitril, nitril kyseliny krotonové, nitril kyseliny adipové a nitril kyseliny malonové jako zdroj uhlíku.
·· ···· ···· ··
Tabulka 1: obohacovací medium
Složky Koncentrace íg/U
3-pyridinaldoxim 3,0 nebo 1,0
(NI I4)? I IP( >., 2,0
KII2PO4 2,0
NaCl 1,0
MgSO4x7H2O 0,2
CoC12x6JI2O 0,01
extrakt kvasnic 0,2
vodou doplněno na 1 1 (pil 7,0)
Příklad 3
Vliv kofaktorů během pěstování na aktivitu nitrilliydratasy Rhodococcus sp. FZ4
Kmen Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597) se inokuloval do předkultury podle tabulky 2 a za třepání se inkuboval 1 až 2 dny při teplotě 28 °C. Předkultura se přeočkovaia do základního media podle tabulky 3, které obsahovalo buď C0CI2 nebo FeSO4 a 2 až 3 dny se kultivovala za třepání pří teplotě 28 °C. Aktivita nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1. Výsledky jsou sestaveny v tabulce 4. Aktivita nitrilhydratasy se vyskytovala pouze tehdy, když se Rhodococcus sp. FZ4 kultivoval v přítomnosti kobaltu.
Tabulka 2: předkultivační medium
Složky Koncentrace Lg/iJ
pepton 5,0
masový extrakt 5,0
NaCl 2,0
extrakt kvasnic 0,5
vodou doplněno na 1 1 (pí I 7,0) ·· ···· ·· ··· · • · • ··· • ·♦ ·
Tabulka 3: základní medium
Složky Koncentrace [g/il
extrakt kvasnic 2,0
pepton 0,2
L-glutamát, sodná sůl 15,0
MgSO4 x 7 ÍI2O 0,5
CoC12x6I12O (neboFeSO4x7íl2O) 0,004
amid kyseliny krotonové 5,0
vodou doplněno na 1 1 (pi l 6,8)
Tabulka 4: vliv kofaktorů během pěstování na aktivitu nitrilhydratasy
Kolaktor Růst ΙθΙ^όΙΟιιιιι 1 Celková aktivita ]pmol/(min x ml)] Specifická aktivita [pmol/(min x ml x ODruonm)]
FeSO4 2,86 0,989 0,346
CoCl2 2,79 38,1 13,1
Příklad 4
Vliv induktorů během pěstování na aktivitu nitrilhydratasy Rhodococcus sp. FZ4 Kmen Rhodococcus sp. FZ4 (DSM 13597) se inokuloval do předkultury podle tabulky 2 a za třepání se inkuboval 1 až 2 dny při teplotě 28 °C. Předkultura se přeočkovala do kultivačního media podle tabulky 5, které obsahovalo různé induktory a 3 dny se kultivovala za třepání při teplotě 28 °C. Aktivita nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1. Výsledky jsou sestaveny v tabulce 6. Nitrilhydralasa z Rhodococcus sp. \<'ZA se exprimovala během pěstování jen v přítomnosti induktoru.
• 4 4444 ♦· · ♦ • 4 4 • · 4 4 •·44
4* ··*· • · • 444
Tabulka 5; Kultivační mediu
Složky Koncentrace [g/ij
extrakt kvasnic 1,0
natři umci trat 10,0
kukuřičný extrakt 15,0
induktor 0,2%(hmot/obj)
KIÍ2PO4 2,0
MgSO4x7II2O 0,5
CoCI2x6II2O 0,015
vodou doplněno na 1 1 (pil 7,0) ·· ·**·
Tabulka 6: Vliv induktorů na aktivitu nitrilhydratasy ······ ·····» ♦ · · · · · · 4 t • · ····· ·· · • · · · · ···« « • · · ·· « ···· *··· ·· ·· ··· ·< ··
Iiiduktor Růst JODfi, Celková aktivita [pmol/(min x ml)] Specifická aktivita [pmol/fminxmlxODcifla)]
melhakrylamid 4,55 569 125
isobutyramid 3,55 387 109
butyramid 4,7 344 73,2
methakrylnitril 4,61 330 71,5
krotonamid 9,32 558 59,9
butyronilril 5,26 307 58,4
amid kys. valerové 5,61 322 57,5
isobulyronitril 5,24 273 52,1
nitril kys. krolonové 8,24 407 49,4
amid kys. propionové 5,17 149 28,7
valcro ni trii 3,70 120 32,4
nitril kys.isokapronové 4,72 134 28,5
isovalcronitril 3,22 74,7 23,2
nitril kys. kapronové 4,54 104 23,0
propi oni trii 4,72 95,8 20,3
akrylamíd 5,17 60,5 11,7
3-pentcnnilril 4,62 62 13,4
ε-kaprolaklam 4,44 40,3 9,08
benzonitril 5,62 40,3 7,17
amid kys. pikolinové 3,80 26,1 6,87
4,2 27,7 6,59
kyanaeelamid 4,75 30,9 6,50
acetamid 4,37 21,6 4,98
acetonitril 4,46 18,4 4,13
3-kyanpyridin 5,54 12,3 2,21
amid kys.isonikotinové 5,03 10,9 2,17
benzamid 3,88 8,24 2,12
akrylonitril 3,27 5,91 1,81
amid kys. nikotinové 3,55 4,94 1,39
močovina 6,16 5,66 0,918
1111
1111 · « » « * ·
- . · · · · ·
-, Λ · · 1 1 111 119 .*-!*·· 1111 « ···♦ ·« *·♦*···* *·*·*·**
Příklad 5
Pěstování Rhodococcus sp. FZ4
Kmen Rhodococcus sp. FZ4 se inokuloval do předkuítury podle tabulky 2 a za třepání se inkuboval 1 až 2 dny při teplotě 28 °C. Předkultura se přeočkovala do kultivačního media podle tabulky 5, které obsahovalo 6 g/1 methakrylamidu jako induktor a 3 dny se kultivovala za třepání při teplotě 28 °C. Po 48 hod. se dodatečně přikrmilo metahkrylamidem (0,2 % (obj/obj)).
V příkladech 6 až 13 se použily buňky v klidu Rhodococcus sp. FZ4
Příklad 6
Substrátová spceiíita aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4
Aktivita nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4 vzhledem k různým substrátům se stanovila podle příkladu 1 s tím, že místo 3-kyanpyridinu se použil odpovídající substrát a podmínky HPLC se pozměnily v závislosti na použitém substrátu. Substrátová specifita aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. V7A ve srovnání se substrátovou specifitou aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus rhodochrous JI je sestavena v tabulce 7.
0 0 00 «
0 0
0 0
0 0 0
0 0 0
00
0000 ♦ > 0
0 • 0 0
0 0 »000 00 »» 0000 0 0 0
0 0 0«
0 0
0 0
00·
Tabulka 7: srovnání substrátových spccifít aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4 a Rhodococcus rhodochrous J1
Rhodococcus sp. FZ4 Rhodococcus rhodochrous J1
Substrát Relativní aktivita [%] Relativní aktivita l%]
acetonitril 646 0 (nitrilhydratasa A) 115 (nitrilhydratasa B)
akrylonitril 498 478
bulyroni trii 466 26
propionitril 412 435
3-kyanpyridin 100 100
4-kyanpyridin 98,4 70
nitril kys. krotonové 92,1 78
benzonitril 41,7 27
2-kyanpyridin 39,3 45
m-chlorbenzonitril 39,3 43
p-clilorbenzonitril 8,25 13
methakrylnitril 3,64 87
o-chlorbenzonitril 0 2,8
Příklad 7
Teplotní optimum a termická stabilita aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4
Aktivita nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1 při různých teplotách v rozsahu od 20 do 70 C. Teplotní optimum pro aktivitu nitrilhydratasy bylo při 60 °C (Obr. 2).
Pro zjištění termické stability aktivity nitrilhydratasy se buněčná suspenze inkubovala 15 min. při různých teplotách v rozmezí od 40 do 70 °C. Pak se stanovila aktivita nitrilhydratasy podle příkladu 1 při 20 °C. Aktivita nitrilhydratasy po 15 minutové inkubaci při teplotách v rozmezí od 40 do 60 °C odpovídala původní aktivitě nitrilhydratasy (Obr. 3) ·· • 9 « 9 9
9999 • 9 9494 « « · • « · ··« » 3 t · 9 • 9 9 «
99 999
9994 « * · • > 9 r 9
4 9 9
44
Příklad 8 pli-optiinum a p 11-stabilita aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4
Aktivita nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1 při různých hodnotách pH v rozsahu od 3 do 12 při použití různých pufrů (0,1 M). pl l-optimum pro aktivitu nitrilhydratasy bylo mezi 6 a 7 (Obr. 4).
Pro zjištění plI-stability aktivity nitrilhydratasy se buněčná suspenze inkubovala při různých hodnotách pil v rozmezí od 4 do 10 po dobu 24 hod. při 20 °C. Pak se buněčná suspenze odstředila. Oddělené buňky se promyly a rcsuspendovaly v pufru fosforečnanu draselného (0,1 M, pi l 7,0). Aktivita nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1. Aktivita nitrilhydratasy po 24 hodinové inkubaci při pil v rozmezí od 5 do 10 odpovídala přibližně původní aktivitě nitrilhydratasy (Obr. 5).
Příklad 9
Vliv koncentrace 3-kyanpyridinu na aktivitu nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4
Buněčná suspenze se inkubovala při různých koncentracích 3-kyanpyridinu v rozmezí od 0 do 10 % (hmotn./obj.) po dobu 60 min. při 20 °C. Buňky se oddělily, promyly a resuspcndovaly v pufru fosforečnanu draselného (0,1 M, pH 7,0). Aktivita nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1. Aktivita nitrilhydratasy po 60 minutové inkubaci při koncentracích 3-kyanpyridinu v rozmezí od 0 do 20 % (hmotn./obj.) odpovídala přibližně původní aktivitě nitrilhydratasy (Obr. 6).
Příklad 10
Vliv koncentrace amidu kyseliny nikotinové na aktivitu nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4
Buněčná suspenze se inkubovala při různých koncentracích amidu kyseliny nikotinové v rozmezí od 0 do 20 % (hmotn./obj.) po dobu 24 hod. při 20 °C. Buňky se oddělily, promyly a rcsuspendovaly v 0,1 M pufru fosforečnanu draselného (0,1 M, pH 7,0). Aktivita nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1. Aktivita nitrilhydratasy po 24 hodinové inkubaci při koncentracích amidu kyseliny nikotinové v rozmezí od 0 do 20 % (hmotn./obj.) odpovídala přibližně původní aktivitě nitrilhydratasy (Obr. 7).
• · · · ·· ···· · · · • · · · · · · · · · • · · · · · · · · · ···· ·· ·· «·· ·· ··
Příklad 11
Stanovení hodnoty Km pro 3-kyaiipyridiii u nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4 Reakční směs složená z 3-kyanpyridinu (0,1-1,0 M; 1,0-1,8 ml), vodného roztoku NaCl (0,85 % (lunoln./obj.); 0,7 až 0,1 ml), pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,3 ml) a buněčné suspenze (0,01 ml) se za třepání inkubovala po dobu 10 min. při 30 °C. Celkový objem reakční směsi byl podle koncentrace 3-kyanpyridinu mezi 2,0 až 2,2 ml. Reakce se zastavila přidáním HCÍ (2 M; 0,1 ml). Po odstředění (12 000 Upm(otáčekZmin); 5 min) reakční směsi se množství vytvořeného amidu kyseliny nikotinové stanovilo pomocí I-IPLC podle příkladu 1. Hodnota Km byla 160 mM (Obr. 10).
Příklad 12
Srovnání aktivit u nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4 s aktivitami nitrilhydratasy známých mikroorganismů Atnycolatopsis sp. NA40, Rhodococcus sp. GF 270 a Rhodococcus rhodochrous J I
Hodnoty Km pro substrát 3-kyanpyridin pro aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GP 270 (DSM 12211; WO 99/05306), Amycolatopsis sp. NA40 (DSM 11617; WO 99/05306) a Rhodococcus rhodochrous JI se stanovily podle příkladu 11 za použití jednotlivých mikroorganismů. Hodnoty KM kmenů Amycolatopsis sp. NA40 a Rhodococcus sp. PZ4 jsou nižší než ostatních mikroorganismů (tabulka 8).
Tabulka 8: Srovnání hodnot Km pro substrát 3-kyanpyridin
Km [mM]
Rhodococcus Rhodococcus Amycolatopsis Rhodococcus
sp. FZ4 sp. GF270 sp. NA40 rhodochrous J1
160 >200 41,7 200
Termická stabilita aktivit nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF 270, Amycolatopsis sp. NA40 a Rhodococcus rhodochrous JI se stanovila podle příkladu 7 za použití určitého mikroorganismu a za inkubačních podmínek daných v tabulce 9. Aktivita nitrilhydratasy kmenu Rhodococcus sp. YZA vykazovala ve srovnání s aktivitou nitrilhydratasy ostatních mikroorganismů největší termickou stabilitu.
· 4 · · · · · « · · · · · · · · 4
9 9 9 9 4 4 4 4
9 4 4 9 4 4 4 44 ť 4 44
Tabulka 9: Srovnání termická stability aktivit nitrilhydratasy
Relativní aktivita [%J
Inkubaění podmínky Rhodococcus sp. FZ4 Rhodococcus sp. GF270 Amycolatopsis sp. NA40 Rhodococcus rhodochrous JI
15 min. při
50 °C 100 100 nba 100
60 C 93 95 nba 80
70 °C 2 5 nba 0
60 min. při
20 °C 100 100 100 nba
30 °C 100 100 95 nba
40 °C 100 100 80 nba
50 llC 100 100 32 nba
60 °C 100 89 0 nba
70 °C 6 0 0 nba
60 °C po
0 min. 100 100 nba nba
30 min. 100 67-80 nba nba
60 min. 92-100 52-68 nba nba
120 min. 72-87 29-47 nba nba
a nestanoveno
Vliv koncentrace 3-kyanpyridinu na aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF 270 , Amycolatopsis sp. NA40 a Rhodococcus rhodochrous JI se stanovil podle příkladu 9 za použití jednotlivých mikroorganismů a koncentrací 3kyanpyridinu uvedených v tabulce 10. Aktivity nitrilhydratasy kmenů Rhodococcus sp. FZ4 a Rhodococcus sp. GF 270 měly největší toleranci vůči 3-kyanpyridinu.
• · · · · · · · · • · ····· · · · • · · · · · · · · · • · · · · 4» · · · · ···· ·> ·» ·«· ·· «·
Tabulka 10: Srovnání vlivu koncentrace 3-kyanpyridinu na aktivitu nitrilhydratasy
Relativní aktivita [%]
3-kyanpyridin Rhodococcus ; Rhodococcus Amycolatopsis Rhodococcus
[% (hmot/obj)] sp. FZ4 sp. GF270 sp. NA40 rhdochrous J1
0 100 100 O O ϊθθΒ
2,5 100 100 74b nbc
5,0 100 100 56 b
7,5 100 100 4P nbe
10,0 100 100 16b 6p
inkubace 60 min. 'inkubace 15 min. Cncstanoveno.
Vliv koncentrace amidu kyseliny nikotinové na aktivity nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4, Rhodococcus sp. GF 270 , Amycolalopsis sp. NA40 a Rhodococcus rhodochrous JI se stanovily podle příkladu 9 za použití jednotlivých mikroorganismů a koncentrací amidu kyseliny nikotinové uvedených v tabulce 11. Aktivity nitrilhydratasy kmenů Rhodococcus sp. FZ4 a Rhodococcus sp. GF 270 měly největší toleranci vůči amidu kyseliny nikotinové (tabulka 11).
Tabulka 11: Srovnání vlivu koncentrace amidu kyseliny nikotinové na aktivity nitrilhydratasy
Relativní aktivita [%]
Nikotinamid Rhodococcus Rhodococcus Amycolalopsis Rhodococcus
|% (lunot/obj)] sp. FZ4 sp. GF270 sp. NA40 rhdochrous J1
0 100 100 100 nb
10 100 100 55 nb
20 100 100 0 nb
30 100 100 0 nb
nestanoveno.
Příklad 13
Biotransformacc 3-kyanpyridinu na nikotinamid s Rhodococcus sp. FZ4
K. předloze sestávající z buněčné suspenze (13,7 mg suché buněčné hmotnosti , 4 ml) a pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pil 6,0; 16 ml) se přidal roztok 3-kyanpyridinu ve 42 • 4 4 4444
4 4 4 · »
4444 44 44 444 dávkách (42 x 0,52 g = 21,8 g; 0,21 mol). Další dávka 3-kyanpyridinu se přidala k reakční směsi, když se v reakční směsi 3-kyanpyridin kvantitativně přeměnil na nikotinamid. Reakční směs během reakce ztuhla. Celkově se vytvořilo 25,7 g nikotinamidu (kvantitativní výtěžek).
Příklad 14
Biotransforniacc acetonitrilu na acctainid s Rhodococcus sp. FZ4
Acetonitril (5 ml; 95 mmol) se během 80 min. přikapal do reakční směsi složené z pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pil 7,0; 4,5 ml) a buněčné suspenze (4,88 mg suché buněčné hmotnosti , 0,5 ml) při 20 C. Následná reakce se uskutečnila při 20 °C za třepání. Tvorba acetamidu během reakce se sledovala pomocí IíPLC ( Waters Spherisorp 5 μ ODS2 (4,6 x 150 mm); KII2PO4 (10 mM; pH 2,5/acetonitril = 99/1 (obj/obj); 10 ml/min; 210 nm). Během 120 min. se vytvořilo 6,14 g acetamidu (kvantitativní výtěžek), který se akumuloval v reakčním mediu (Obr. 1).
Příklad 15
Vliv koncentrace acetonitrilu na aktivitu nítrilhydratasy Rhodococcus sp. FZ4 při biotranslbrniaci acetonitrilu na acetamid
Reakční směs sestávající z acetonitrilu (0,2-19,0 M; 1,0-1,6 ml), vodného roztoku NaCl (0,85 % (lunol/obj); 0,6-0,0 ml), pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,3 ml) a buněčné suspenze (0,1 ml) se inkubovala 10 min. při 20 °C za třepání. Celkový reakční objem byl 2,0 ml. Reakce se zastavila přidáním MeOH. Reakční směs se odstředila (12 000 Upm (otáček/min), 5 min) a množství vytvořeného acetamidu se stanovilo pomocí HPLC podle příkladu 14.
Aktivita nítrilhydratasy byla v rozmezí od 0,1 do 15 M acetonitrilu přibližně konstantní (Obr. 8).
Příklad 16
Vliv koncentrace acetonitrilu na aktivitu nítrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4 Buňky se inkubovaly s acetonitrilem (0,0-15,0 M) v ) v pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pi l 7,0) 1 hodinu při 20 °C. Buněčná suspenze se odstředila (12 000 Upm (otáček/min), 5 min) a buňky se resuspendovaly ve vodném roztoku NaCl (0,85 % (hmot/obj)). Reakční směs sestávající z této buněčné suspenze (0,1 ml), 3-kyanpyridinu (0,5 M; 1,0 ml), vodného roztoku NaCl (0,85 % (hmot/obj); 0,6 ml) a pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 3 • · ···· · · · • · ····· ·· · • · · · · · · · · · • ·· · · · · · · · ··»· ·· ·» ··· ·· ·· ml) se za třepání 5 min. ínkubovala při 30 °C. Reakce se zastavila přidáním MeOlI. Reakční směs se odstředila (12 000 Upm (otáček/min), 5 min) a množství vytvořeného acetamidu se stanovilo pomocí HPLC podle příkladu 14.
Aktivita nilrilhydratasy byla po 1 hodinové inkubaci s acetonitrilem o koncentraci v rozmezí od 0 do 3 M přibližně konstantní. Po 1 hodinové inkubaci s 6 M acetonitrilem bylo ještě 60 % původní aktivity nilrilhydratasy. Po 1 hodinové inkubaci s 9 M acetonitrilem bylo ještě ca 35 % původní aktivity nilrilhydratasy (Obr. 9).
Příklad 17
Výroba pigmentově negativních mutantů Rhodococcus sp. FZ4
Kmen Rhodococcus sp. FZ4 se inkuboval v živném mediu (50 ml) a při 28 °C za třepání se inkuboval až se dosáhlo hodnoty OlVionm 6,29. Předkultura (10 ml) se pak přeočkovala do živného media (25 ml)) a ínkubovala se při 28 °C za třepání až se dosáhlo hodnoty ODóionm 1,90. Takto získaná kultura (10 ml) se odstředila (8 000 Upni (otáček/min), 5 min.). Supernatant se odstranil a buněčná sraženina se suspendovala do roztoku chloridu sodného pilířovaného fosfátem. Buněčná suspenze se odstředila (8 000 Upm (otáček/min), 5 min.). Supernatant se odstranil a buněčná sraženina se suspendovala do roztoku chloridu sodného pilířovaného fosfátem (5 ml). Buněčná suspenze se přenesla do skleněné Petriho misky (průměr 90 mm). Buňky se ozařovaly UV lampou (15 W, 254 nm) ze vzdálenosti 25 cm po dobu 17 min. Polom se buňky inkubovaly ve dvojnásobně koncentrovaném živném mediu při 28 °C po dobu 4 dnů za třepání. Takto získaná kultura se lOOnásobně zředila a 100 pl alikvotní části z toho se rozprostřely na plate eount agar a inkubovaly při 28 °C. Téměř 150 jednotlivých kolonií vyrostlo na jednotlivé destičce. Destičky se vystavily dennímu světlu, aby se indukovala tvorba červených pigmentů. Kolonie pigmentově-negativních mutantů se daly jednoduše rozlišit od zbarvených mutantů a od červeného divokého typu.
Příklad 18
Čištění nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4
Rhodococcus sp. PZ4 se pěstoval v 21 fermentoru podle příkladu 3. Kultura se odstředila a buněčná sraženina se resuspendovala do vodného roztoku NaCl (85 % hmot/obj). Buněčná suspenze se převedla do pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0) obsahujícího kyselinu máselnou (44 mM) a ošetřila se ultrazvukem. Buněčné zbytky se odstranily odstředěním. Supernatant se použil pro čištění nitrilhydratasy podle tabulky 12. Aktivita
444· ·· 4444 44 · • 4 44444 44 4 • 4 4 4 4 4444 4 • 44 44 4 4444 •#4· 44 44 444 44 4* nitrilhydratasy se stanovila podle příkladu 1, místo buněčné suspenze se však použily jednotlivé extrakty.
Tabulka 12: Čištění nitrilhydratasy z Rhodococcus sp. FZ4
Stupeň čištění Obsah proteinů [mg] Celková aktivita [pmol/min] Specifická aktivita | pmol/min x mg]
bezbuněčný extrakt 335 5881 17,6
sraženina (NIl4)2SO4 198 6087 28,4
DLAL-Sephaeel 73,0 3553 48,7
butyl-Toyopearl 66,2 2035 30,7
fenyl-Sepharose 26,2 890 34,0
Příklad 19:
Stanovení molekulové hmotnosti čištěné nitrilhydratasy
Molekulová hmotnost se zjišťovala pomocí HPLC (TSK gel G 300 SW (0,75 x 60 cm); pufr fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,5) a chlorid draselný (0,2 M); 0,7 ml/min; 280 nm). Molekulová hmotnost nitrilhydratasy byla 465 kDa (Obr. 11).
Nitrilhydratasa se skládá z α-pojednotky s molekulovou hmotností 27,7 kDa a β-pojednotky s molekulovou hmotností 31,2 kDa (Obr. 12).
Přiklad 20
Tepelná stabilita čištěné nitrilhydratasy
Roztok sestávající z roztoku nitrilhydratasy (0,697 pmol/min; 0,025 ml) a pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pi l 7,0; 0,475 ml) se inkuboval 60 min při různých teplotách v rozsahu od 20 do 70 °C. Pak se roztok ochladil ledovou lázní na 20 °C a přidal se 3-kyanpyridin (0,5 M; 0,500 ml). Reakční směs se inkubovala 10 min. při 20 °C. Reakce se zastavila přidáním MeOH. Množství vytvořeného nikotinamid se stanovila pomoci HPLC podle příkladu 1. Aktivita nitrilhydratasy se výrazně snížila po 60 minutové inkubaci při teplotách nad 40 °C, po 60 minutové inkubaci při 50 ”C byla aktivita nitrilhydratasy jen 25 % původní aktivity (Obr. 15).
• · · »
Příklad 2 ί pH-optimum čištěné nitrilhydratasy
Reakční směs sestávající z 3-kyanpyridinu (0,5 M; 0,500 ml), roztoku nitrilhydratasy (0,697 pmol/min; 0,025 ml) a různých pufrů v rozsahu pH od 4 do 11 (0,1 M; 0,0475 ml) se inkubovala 10 min při 20 °C. Reakce se zastavila přidáním MeOH. Množství vytvořeného nikotinamid se stanovila pomocí HPLC podle příkladu 1. pH-optimum nitrilhydratasy bylo v rozmezí od 6,0 do 6,5 (Obr. 16).
Příklad 22 pH-stabilta čištěné nitrilhydratasy
Roztok sestávající z roztoku nitrilhydratasy (8,36 pmol/min; 0,47 ml), různých pufrů v rozsahu pi l od 4,0 do 11 (0,3 M; 0,10 ml) a destilované vody (0,03 ml) se inkuboval 30 min při 20 °C. Reakční směs sestávající z aíikvotní části inkubovaného roztoku nitrilhydratasy (0,05 ml), 3-kyanpyridinu (0,5 M; 0,5 ml) a jednotlivých pufrů (0,1 M; 0,45 ml) se inkubovala 10 min při 20 °C. Reakce se zastavila přidáním MeOH. Množství vytvořeného nikolinamidu se stanovilo pomocí HPLC podle příkladu 1. Aktivita nitrilhydratasy odpovídala po 60 minutové inkubaci při pil v rozmezí od 6 do 8 přibližně původní aktivitě nitrilhydratasy (Obr. 17).
Příklad 23
Substrátová spccifita čištěné nitrilhydratasy
Reakční směs sestávající z roztoku nitrilhydratasy (0,695 pmol/min; 0,025 ml), různých substrátů ( 0,5 ml) a pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml) se inkubovala 5 až 10 min při 20 °C. Koncentrace použitých substrátů byly v rozmezí od 0,015 až 0,250 M, Reakce se zastavila přidáním MeOH. Množství vytvořeného amidu se stanovilo pomocí HPLC. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 13. Nitrilhydratasa má nejvyšší aktivitu mezi testovanými substráty k substrátu acetonitrilu.
Tabulka 13: Substrátová specifíta čištěné nitrilhydratasy • · · · · · • · «··« · · · Λ ··········
4 · ·*·······
Substrát Koncentrace [Mj Relativní aktivita [%]
aeetontril 0,2 1008
akrylonitril 0,2 774
propionilril 0,2 693
butyronitril 0,2 578
nitril kys. krotonové 0,2 114
3-kyanpyridin 0,25 100a
4-kyanpyridin 0,125 92,8
benzonitril 0,015 75,6
m-ehlorbenzonitril 0,015 66,5
2-kyanpyridin 0,125 36,7
p-chlorbenzonilril 0,015 8,31
methakrylamid 0,2 1,39
o-chlorbenzonitril 0,015 0
“celková aktivita: 4164 pmol/(min x ml).
Příklad 24
Vliv potencionálních inhibitorů na čištěnou nitrilhydratasu
Roztok sestávající z roztoku nitrilhydratasy (0,695 pmol/min; 0,025 ml), pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pil 7,0; 0,475 ml), destilované vody (0,150 ml) a různých potencionálních inhibitoru (0,100 ml) se inkuboval 5 min při 20 °C. Pak se přidal 3-kyanpyridin (1,0 M; 0,250 ml). Koncentrace inhibitorů v reakční směsi byia 1,0 mM. Reakční směs se inkubovala 10 min. při 20 C. Reakce se zastavila přidáním MeOH. Množství vytvořeného nikotinamidu se stanovilo pomocí HPLC podle příkladu 1. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 14. Mezi testovanými potencionálními inhibitory měly nejsilnější inhibiční účinek hydroxyíamin a kyanid draselný.
Tabulka 14: Vliv potencionálních inhibitorů na čištěnou nitrilhydratasu
Potencionální inhibitor Relativní aktivita 1%J
kys. p-chlormerkuribcnzoováa 187
tiron 114
fenylmethansuUbnylíluorid 110
1,10-íenanthrolin 106
močovina 106
dilhiothreitol 103
EDTA1’ 100
100c
cysteamin 99,1
8-hydroxychinolin 97,8
2,2'-bipyridyl 97,8
jodacetat 96,7
N-elhyhnaleinimid 95,3
azid sodný 93,5
5,5'-dithiobis(2-kyseIina nitrobenzoová)3 93,4
dielhyldithiokarbamat 93,3
D-cykloserin 86,3
íěnylhydrazin 84,6
2-merkaploelhanol 76,3
hydroxylamin 1,34
kyanid draselný 0
a0,1 mM Bkys. ethylendiamintetraoctová Ccelková aktivita: 3776 pmol/(min x ml).
Příklad 25
Vliv iontů kovu na aktivitu čištěné nitrilhydratasy
Vliv iontů kovu na aktivitu čištěné nitrilhydratasy se prováděl podle příkladu 24, avšak za přidání iontů kovu místo potencionálních inhibitorů. Koncentrace iontů kovu v reakční směsi byla 1,0 mM. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 15. Mezi testovanými ionty kovů měly inhibiční vliv jen kationty stříbra a dvojmocné kationty rtuti.
Tabulka 15: Vliv iontů kovu na aktivitu čištěné nilrilhydratasy • · ♦ · · · • · 9 9 9 9 ·9 9 • 9 9 9 9 9· 99 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 99 99 9 9 9 9 9 99
Ionty kovu Relativní aktivita [%]
CuSO4 177
MnCl2 123
NiCl2 123
ZnSO4 121
FeSO4 113
CaCl2 113
CoCl2 110
FeCb 105
- 100
AgNO3 0
HgCiT 0
celková aktivita: 3375 pmol/(min x ml) mM.
Příklad 26
Stanovení hodnoty Km pro 3-kyanpyridin u čištěné nitrilhydratasy
K roztoku sestávajícího z roztoku nitrilhydratasy (0,697 pmol/min; 0,025 ml) a pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml) se přidal 3-kyanpyridin v různých koncentracích (3,1-800 mM; 0,500 ml). Reakční směs se inkubovala 10 min. při 20 °C. Reakce se zastavila přidáním MeOH. Množství vytvořeného nikotinamidu se stanovilo pomocí HPLC podle příkladu 1. Hodnota KMpro 3-kyanpyridin byla 80,5 mM (Obr. 13).
Příklad 27
Stanovení hodnoty KM pro acetonitril u čištěné nitrilhydratasy
K roztoku sestávajícího z roztoku nitrilhydratasy (0,697 pmol/min; 0,025 ml) a pufru fosforečnanu draselného (0,1 M; pH 7,0; 0,475 ml) se přidal acetonitril v různých koncentracích (2,5-80 mM; 0,500 ml). Reakční směs se inkubovala 10 min. při 20 °C. Reakce se zastavila přidáním MeOH. Množství vytvořeného acelamidu se stanovilo pomocí PIPLC podle příkladu 14. Hodnota KMpro acetonitril byla 2,84 mM (Obr. 14).

Claims (10)

  1. Ρ Α ϊ Ε Ν Τ Ο V É NÁROKY
    1. Mikroorganismy, v y z n a č u j í c í se ti m, že jsou schopné tolerovat koncentraci acetonitrilu alespoň 3 M.
  2. 2. Mikroorganismy podle nároku 1 rodu Rhodococcus.
  3. 3. Mikroorganismus podle nároku 2 s označením kmenu Rhodococcus sp. FZ4, uložený pod číslem DSM 13597.
  4. 4. Enzymové extrakty získané z mikrorganismů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
  5. 5. Nitrilhydratasa získaná z mikrorganismů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
  6. 6. Nitrilhydratasa podle nároku 5, v y z n a č uj í c í se
    a) hodnotou I<m pro substrát acetonitril 2,84±l,00 mM a pro substrát 3-kyanpyridin 80,5±15,0mM;
    b) píl-optitnem při pH 6,5±l,0.
  7. 7. Nitrilhydratasa v y z n a č uj í c í se
    a) hodnotou KM pro substrát acetonitril 2,84±l,00 mM apro substrát 3-kyanpyridin 80,5±15,0mM;
    b) pll-optimum při pH 6,5±1,0.
    Způsob výroby amidů obecného vzorce III
    R1—-CONH2 (ΙΠ) kde R1 znamená C|.6-alkylový zbytek, C2.6-alkenylovou skupinu nebo skupinu obecného vzorce IV (IV) φ φ φφφφ φφ φφφφ φφ φφφφ φφ φ « φ φφφφφ φφ φ φ φφφφ φφφφ φ kde X znamená atom dusíku nebo -CII= a R a R nezávisle na sobě znamenají atom vodíku, atom halogenu, Cj.©-alkylovou skupinu nebo C2-6-alkenylovou skupinu, v y z n a č u j í c í se l i tn, že se nitril obecného vzorce II
    R1—CN (III) kde R1 má uvedený význam, přeměňuje pomocí mikroorganismu podle kteréhokoliv nároku 1 až. 3, enzymového extraktu podle nároku 4 nebo pomocí enzymu podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7.
  8. 9. Způsob podle nároku 8,,vyznačující se t í m, že se jako nitril použije 3kyanpyridin nebo acetonitril.
  9. 10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 nebo 9 , v y z n a č u j í c í se t í m, že se reakce provádí při teplotě od 5 do 50 °C a při pil od 5 do 10.
  10. 11. Použití mikroorganismů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 k odstranění odpadů acetonitrilu.
CZ20031409A 2001-01-09 2002-01-08 Mikroorganismy a způsob výroby amidů CZ20031409A3 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01100493 2001-01-09
US34237301P 2001-12-27 2001-12-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20031409A3 true CZ20031409A3 (cs) 2003-11-12

Family

ID=26076438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031409A CZ20031409A3 (cs) 2001-01-09 2002-01-08 Mikroorganismy a způsob výroby amidů

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20040142447A1 (cs)
EP (1) EP1352050B1 (cs)
JP (1) JP4307837B2 (cs)
KR (2) KR100903756B1 (cs)
CN (1) CN1316010C (cs)
AT (1) ATE417919T1 (cs)
AU (1) AU2002228036A1 (cs)
CA (1) CA2432060C (cs)
CZ (1) CZ20031409A3 (cs)
DE (1) DE50213120D1 (cs)
DK (1) DK1352050T3 (cs)
EA (1) EA008600B1 (cs)
ES (1) ES2319875T3 (cs)
HU (1) HU229283B1 (cs)
IL (2) IL155996A0 (cs)
MX (1) MX268424B (cs)
NO (1) NO329719B1 (cs)
PL (1) PL208060B1 (cs)
PT (1) PT1352050E (cs)
SK (1) SK288061B6 (cs)
WO (1) WO2002055670A1 (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102004013824A1 (de) 2004-03-20 2005-10-13 Degussa Ag Nitrilhydratasen aus Rhodococcus opacus
IT1400395B1 (it) 2010-06-08 2013-05-31 Procos Spa Processo one-pot per la sintesi di dalfampridine.
CN102212566A (zh) * 2011-04-11 2011-10-12 江苏大学 一种高纯度异丁酰胺生产方法
ITUA20163572A1 (it) * 2016-05-18 2017-11-18 Columbia S R L Metodo biotecnologico per la produzione di acrilammide e relativo nuovo ceppo batterico
CN111757940B (zh) * 2017-11-14 2023-11-07 哥伦比亚有限公司 用于制备酰胺的微生物学方法
CN114686538B (zh) * 2020-12-30 2023-09-29 杭州唯铂莱生物科技有限公司 一种烟酰胺制备中烟酸含量的控制方法
CN115572746A (zh) * 2022-06-28 2023-01-06 杭州师范大学 一种双相体系下化学酶法级联催化酰胺类化合物的一锅法合成工艺
AU2024239889A1 (en) * 2023-03-17 2025-09-18 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing amide compound

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4255344A (en) * 1978-11-08 1981-03-10 Mitsubishi Chemical Industries, Limited 9-α-Hydroxy steroids
CA1133840A (en) * 1980-09-08 1982-10-19 James E. Zajic De-emulsification agents of microbiological origin
DE3248167A1 (de) * 1982-12-27 1984-06-28 Wintershall Ag, 3100 Celle Trehaloselipidtetraester
US5179014A (en) * 1985-01-08 1993-01-12 Nitto Chemical Industry Co., Ltd. Process for the preparation of amides using microorganisms
MX169933B (es) * 1987-09-18 1993-08-02 Hideaki Yamada Procedimiento para la produccion biologica de amidas
GB8910958D0 (en) * 1989-05-12 1989-06-28 Bruce Neil C Assay
AU627648B2 (en) * 1990-02-28 1992-08-27 Teruhiko Beppu Dna fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
US5753472A (en) * 1991-05-02 1998-05-19 Nitto Chemical Industry Co. Ltd. DNA fragment encoding a polypeptide having nitrile hydratase activity, a transformant containing the gene and a process for the production of amides using the transformant
DE4313649C1 (de) * 1993-04-21 1995-01-26 Fzb Biotechnik Gmbh Mikroorganismus und Verfahren zur mikrobiellen Herstellung eines Nitrilhydratase-/Amidase-Enzymkomplexes
RU2053300C1 (ru) * 1993-12-17 1996-01-27 Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Штамм бактерий rhodococcus rhodochrous - продуцент нитрилгидратазы
HU226274B1 (en) 1997-07-22 2008-07-28 Lonza Ag Process for preparing amides
JP4185607B2 (ja) * 1998-12-15 2008-11-26 ダイセル化学工業株式会社 新規な微生物及びアミド化合物の製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1316010C (zh) 2007-05-16
NO20033116D0 (no) 2003-07-08
KR100880143B1 (ko) 2009-01-23
US20070148743A1 (en) 2007-06-28
ES2319875T3 (es) 2009-05-14
CN1486363A (zh) 2004-03-31
HUP0401111A2 (hu) 2004-08-30
NO329719B1 (no) 2010-12-06
HU229283B1 (en) 2013-10-28
WO2002055670A1 (de) 2002-07-18
MXPA03006149A (es) 2004-05-04
MX268424B (es) 2009-07-17
IL155996A0 (en) 2003-12-23
SK6242003A3 (en) 2003-10-07
DK1352050T3 (da) 2009-04-06
CA2432060C (en) 2013-04-23
AU2002228036A1 (en) 2002-07-24
US7838271B2 (en) 2010-11-23
KR100903756B1 (ko) 2009-06-18
DE50213120D1 (de) 2009-01-29
JP4307837B2 (ja) 2009-08-05
IL155996A (en) 2010-04-29
CA2432060A1 (en) 2002-07-18
HUP0401111A3 (en) 2004-10-28
ATE417919T1 (de) 2009-01-15
KR20080099348A (ko) 2008-11-12
EA200300749A1 (ru) 2003-12-25
EA008600B1 (ru) 2007-06-29
PT1352050E (pt) 2009-03-24
NO20033116L (no) 2003-07-08
US20040142447A1 (en) 2004-07-22
SK288061B6 (sk) 2013-04-03
KR20040012707A (ko) 2004-02-11
EP1352050B1 (de) 2008-12-17
PL208060B1 (pl) 2011-03-31
PL365921A1 (en) 2005-01-10
EP1352050A1 (de) 2003-10-15
JP2004516849A (ja) 2004-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5334519A (en) Process for biological production of amides with R. rhodochrous J-1
US7838271B2 (en) Microbiological method for producing amides
US20080050798A1 (en) Enzymes for the preparation of amides
KR20010040960A (ko) 신규한 미생물 및 아미드 화합물의 제조 방법
US20020037559A1 (en) Process for producing n-protected d-proline derivatives
MXPA00000440A (es) Procedimiento para la preparacion de amidas
KR102021097B1 (ko) γ-PGA 생산능이 향상된 신규한 바실러스 서브틸리스 HB-31 균주 및 γ-PGA 생산용 배지
CN1886501A (zh) 制备不饱和酰胺和羧酸的方法
JP2006158323A (ja) 微生物によるアミド化合物の製造方法およびそれに使用する微生物、菌体処理物および酵素