CZ2003146A3 - Způsob identifikace regulačního místa kontrolujícího úroveň genových přepisů a produktů založená na mapování - Google Patents
Způsob identifikace regulačního místa kontrolujícího úroveň genových přepisů a produktů založená na mapování Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2003146A3 CZ2003146A3 CZ2003146A CZ2003146A CZ2003146A3 CZ 2003146 A3 CZ2003146 A3 CZ 2003146A3 CZ 2003146 A CZ2003146 A CZ 2003146A CZ 2003146 A CZ2003146 A CZ 2003146A CZ 2003146 A3 CZ2003146 A3 CZ 2003146A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- interest
- genes
- gene
- regulatory
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 259
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 136
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 title claims description 54
- 238000013507 mapping Methods 0.000 title claims description 34
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 title claims description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 title description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 title description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 170
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims abstract description 41
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 32
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 claims description 113
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 33
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 19
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 13
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 10
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 claims description 10
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 claims description 7
- 238000011835 investigation Methods 0.000 claims description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 7
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 claims description 3
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 3
- 230000002060 circadian Effects 0.000 claims description 3
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 claims description 3
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 claims description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 3
- 230000005305 organ development Effects 0.000 claims description 3
- 230000000243 photosynthetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims description 3
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims description 3
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 claims description 2
- 230000032683 aging Effects 0.000 claims description 2
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 claims description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 claims description 2
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 claims description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 claims 1
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 51
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 14
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 12
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 11
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 11
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 240000004658 Medicago sativa Species 0.000 description 8
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 8
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 7
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 7
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 7
- 102100028509 Transcription factor IIIA Human genes 0.000 description 6
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 6
- 102000037983 regulatory factors Human genes 0.000 description 6
- 108091008025 regulatory factors Proteins 0.000 description 6
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 5
- 101710199605 Endoribonuclease Proteins 0.000 description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 5
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 5
- 101710113029 Serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 5
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 5
- 102000004899 14-3-3 Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102000000584 Calmodulin Human genes 0.000 description 4
- 108010041952 Calmodulin Proteins 0.000 description 4
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 4
- 102100031065 Choline kinase alpha Human genes 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 4
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 4
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 208000005652 acute fatty liver of pregnancy Diseases 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 108010044215 ethanolamine kinase Proteins 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 108700020469 14-3-3 Proteins 0.000 description 3
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 3
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 3
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 3
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 3
- 102000009331 Homeodomain Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010048671 Homeodomain Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000878213 Homo sapiens Inactive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP6 Proteins 0.000 description 3
- 102100036984 Inactive peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP6 Human genes 0.000 description 3
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 3
- 101710189714 Major cell-binding factor Proteins 0.000 description 3
- 235000017587 Medicago sativa ssp. sativa Nutrition 0.000 description 3
- 244000046070 Medicago sativa subsp falcata Species 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 3
- 108090000430 Phosphatidylinositol 3-kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000003993 Phosphatidylinositol 3-kinases Human genes 0.000 description 3
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 3
- 108091005682 Receptor kinases Proteins 0.000 description 3
- 102100030000 Recombining binding protein suppressor of hairless Human genes 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 3
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 3
- OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 5-(3-bromophenyl)-7-(6-morpholin-4-ylpyridin-3-yl)pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-amine;dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C=12C(N)=NC=NC2=NC(C=2C=NC(=CC=2)N2CCOCC2)=CC=1C1=CC=CC(Br)=C1 OOXNYFKPOPJIOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 2
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 2
- 102100032534 Adenosine kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010076278 Adenosine kinase Proteins 0.000 description 2
- 108700020972 Arabidopsis CBF1 Proteins 0.000 description 2
- BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N Aspoxicillin Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3[C@H](C(C)(C)S[C@@H]32)C(O)=O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC(=O)NC)=CC=C(O)C=C1 BHELIUBJHYAEDK-OAIUPTLZSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000218631 Coniferophyta Species 0.000 description 2
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 2
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 2
- 102000018898 GTPase-Activating Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091006094 GTPase-accelerating proteins Proteins 0.000 description 2
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000003964 Histone deacetylase Human genes 0.000 description 2
- 108090000353 Histone deacetylase Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003820 Lipoxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108090000128 Lipoxygenases Proteins 0.000 description 2
- 101100345726 Medicago sativa MMK1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100345727 Medicago sativa MMK2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 2
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 101710140185 Receptor-like protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 2
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091007916 Zinc finger transcription factors Proteins 0.000 description 2
- 102000038627 Zinc finger transcription factors Human genes 0.000 description 2
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 description 2
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 description 2
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 2
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 description 2
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 2
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 2
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000008646 thermal stress Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- 101710112812 14-3-3 protein Proteins 0.000 description 1
- GKLSYIMLZDYQBJ-UHFFFAOYSA-N 2''-O-alpha-rhamnosyl-6-C-(6-deoxy-xylo-hexos-4-ulosyl)-luteolin Natural products OC1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C=2C(=C3C(=O)C=C(OC3=CC=2O)C=2C=C(O)C(O)=CC=2)O)OC(C)C(=O)C1O GKLSYIMLZDYQBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N Abscisic acid Natural products OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 101100428958 Arabidopsis thaliana WRKY3 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- 101710121713 B1 kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000195940 Bryophyta Species 0.000 description 1
- 101150047144 CDC28 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005701 Calcium-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010045403 Calcium-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100029968 Calreticulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000549 Calreticulin Proteins 0.000 description 1
- 102000008122 Casein Kinase I Human genes 0.000 description 1
- 108010049812 Casein Kinase I Proteins 0.000 description 1
- 102000005403 Casein Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010031425 Casein Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000016736 Cyclin Human genes 0.000 description 1
- 108050006400 Cyclin Proteins 0.000 description 1
- 102100026810 Cyclin-dependent kinase 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710158042 Cyclin-dependent kinase D-1 Proteins 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108700005087 Homeobox Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000684275 Homo sapiens ADP-ribosylation factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101001018196 Homo sapiens Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Proteins 0.000 description 1
- 101001130437 Homo sapiens Ras-related protein Rap-2b Proteins 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000218922 Magnoliophyta Species 0.000 description 1
- GKLSYIMLZDYQBJ-HQBRDMKGSA-N Maysin Natural products O([C@H]1[C@@H](O)C(=O)[C@@H](C)O[C@@H]1c1c(O)c2C(=O)C=C(c3cc(O)c(O)cc3)Oc2cc1O)[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C)O1 GKLSYIMLZDYQBJ-HQBRDMKGSA-N 0.000 description 1
- 235000010624 Medicago sativa Nutrition 0.000 description 1
- 235000010621 Medicago sativa subsp falcata Nutrition 0.000 description 1
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 1
- 102100033127 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5 Human genes 0.000 description 1
- 101000898823 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) Serine/threonine-protein kinase bur1 Proteins 0.000 description 1
- 101100326804 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) arg-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 102100021010 Nucleolin Human genes 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 101710096342 Pathogenesis-related protein Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000985694 Polypodiopsida Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 description 1
- 102100031421 Ras-related protein Rap-2b Human genes 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101710202844 Serine/threonine-protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037310 Serine/threonine-protein kinase D1 Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N Thermopsosid Natural products O(C)c1c(O)ccc(C=2Oc3c(c(O)cc(O[C@H]4[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O4)c3)C(=O)C=2)c1 GAMYVSCDDLXAQW-AOIWZFSPSA-N 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- HLVPIMVSSMJFPS-UHFFFAOYSA-N abscisic acid beta-D-glucopyranosyl ester Natural products O1C(CO)C(O)C(O)C(O)C1OC(=O)C=C(C)C=CC1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C HLVPIMVSSMJFPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 235000010208 anthocyanin Nutrition 0.000 description 1
- 229930002877 anthocyanin Natural products 0.000 description 1
- 239000004410 anthocyanin Substances 0.000 description 1
- 150000004636 anthocyanins Chemical class 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 108010025267 calcium-dependent protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 230000022472 cold acclimation Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 229930003944 flavone Natural products 0.000 description 1
- 150000002212 flavone derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000011949 flavones Nutrition 0.000 description 1
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004459 forage Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000003633 gene expression assay Methods 0.000 description 1
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 1
- 230000004034 genetic regulation Effects 0.000 description 1
- 238000012268 genome sequencing Methods 0.000 description 1
- 239000003630 growth substance Substances 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 244000038280 herbivores Species 0.000 description 1
- 239000003688 hormone derivative Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 108010018154 inositol 1-alpha-galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000011890 leaf development Effects 0.000 description 1
- 230000005087 leaf formation Effects 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003050 macronutrient Effects 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- GKLSYIMLZDYQBJ-CGOKOBCESA-N maysin Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C=2C(=C3C(=O)C=C(OC3=CC=2O)C=2C=C(O)C(O)=CC=2)O)O[C@@H](C)C(=O)[C@H]1O GKLSYIMLZDYQBJ-CGOKOBCESA-N 0.000 description 1
- PDXPLYCPNXZSAL-UHFFFAOYSA-N maysine Natural products CN1C(=O)C=CC2(C)OC2C(C)C(OC(=O)N2)CC2(O)C(OC)C=CC=C(C)CC2=CC(OC)=C(Cl)C1=C2 PDXPLYCPNXZSAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004066 metabolic change Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000003801 milling Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003147 molecular marker Substances 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000044158 nucleic acid binding protein Human genes 0.000 description 1
- 108700020942 nucleic acid binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010044762 nucleolin Proteins 0.000 description 1
- 102000026415 nucleotide binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091014756 nucleotide binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000011176 pooling Methods 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 108010061269 protein kinase D Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000021749 root development Effects 0.000 description 1
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N vitamin p Natural products O1C2=CC=CC=C2C(=O)C=C1C1=CC=CC=C1 VHBFFQKBGNRLFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Management, Administration, Business Operations System, And Electronic Commerce (AREA)
Description
Vynález se týká způsobu sloužící k identifikaci regulačního lokusu, které řídí expresi genu v jakémkoli organismu. Konkrétněji se vynález týká použití mRNA transkriptů a rozdílů v hladinách transkriptů pro identifikaci lokusu kvantitativního znaku, který odpovídá požadované vlastnosti daného organismu. .
Dosavadní stav techniky
Volba požadovaných rostlinných znaků jé v šlechtitelských programech obvykle založena na výběru jednoho nebo více fenotypových znaků. Nicméně, mnoho významných agronomických vlastností je komplexních, do značné míry ovlivnitelných prostředím a jsou řízeny polýgenně, kdy určitý fenotypový znak je řízen množstvím genů spíše než jedním řídícím lokusem. U znaků řízených polýgenně nebo multigenně může exprese alel ž více lokusů přispívat k požadovanému fenotypu. ,
Opakovaně bylo ukázáno, že mnoho genů není exprimováno jako odpověď na vývojové ή , podněty nebo podněty životního prostředí. Pochopení faktorů, které řídí expresi těchto genů je zvláště důležité u transgenních organismů, například po vnesení cizího genu, pro řízení • Ϊ úrovně jeho transkripce v závislosti na vývojovém stádiu, tkáni nebo stresových faktorech.· Tyto výzkumy odhalují komplexitu a ’ redundanci řízení na několika úrovních které se uplatňuje při expresi genů. Mechanismy řízení genové exprese se mohou u jednotlivých genů značně lišit ( viz např. Hirt. H. 1999 Trends Plant Sci. 4: 7-8). Pod vlivem souboru určitých vývojových podmínek nebo podmínek prostředí, geny zapojené do určitého procesu *
neodpovídají vždy podobným způsóbém, ani se neakumulují ve stejném typu buněk nebo tkání, což naznačuje, že jsou řízeny jinými kontrolními nebo signálními mechanismy.
S použitím současných metod je složité vyhledat klíčové regulační geny, které řídí expresi požadovaných genů v celé kaskádě dějů. Rozdílně exprimované geny byly identifikovány s použitím různých přístupů, jako, např. diferenciální screening knihoven lť cDNA, sekvenování genomu kombinované shledáním homologů v genových bankách, genový knock-out a komplementace, mutace homeotických genů, vysoce účinný screening EST tagů s použitím genových čipů. Tyto přístupy i přes svoji pracnost jsou příležitostně pro identifikaci genů zahrnutých v řízení genové exprese použitelné, identifikaci ale nejsou pro tento účel speciálně vytvořeny. Metody genového „knock-outu“ (mutační varianty) jsou ·· ·· ··#· i· -··· · • · · · ·-'···* · · · • · ·£”-;· ···· · A
vhodné pro identifikaci faktorů řídících genovou expresi íl druhů s malým genomem, jako např. Arabidopsis. Tyto techniky jsou také pracné, nespecifické a často vedou k nedetekovatelným nebo letákům fenotypům. Kombinování metod, jako je diferenční display druhů mRNA, subtrakční nebo normalizované knihovny a genové čipy mohou být použitý pro vybrané regulační geny. Nicméně tyto metody nejsou specifické při analýze exprese jediného genu a jsou náročné na čas. Navíc, transkripty požadovaných regulačních genů musí být u těchto metod přítomny ve vzorcích použitých k vytváření knihoven, aby mohli být tyto transkripty identifikovány. Tento úkol může přesahovat rámec možností v případě, kdy , zahrneme násobně regulované geny s nesynchronizovanou expresí.
Lokus kvantitativního znaku (QTL) je úsek genomu, který kóduje jeden nebo·, více proteinů a to vysvětluje významnou část variability daného fenotypu, který může být řízen , množstvím genů. Obvykle se k identifikaci požadovaného QTL používá jeden nebo více genetických markérů. Dodnes se většina výzkumů QTL lokusů zabývala hrubými morfologickými a agronomickými fenotypy (např. výtěžností, odolností vůči nemocem a stresům, obdobím květu afd.). Například ve WO 2000/18963 je popsána asociace rostlin sóji obsahující QTL se zvýšenou výnosností, a dále metody pro výběr a šlechtění těchto rostlin. Tato metoda obsahovala použití specifické markerové nukleové kyseliny schopné hybridizace s druhou molekulou nukleové kyseliny, která je přítomna ve specifické oblasti u Glycine sója a která je spojena se zvýšenou výnosností. V patentu US 5 948 953 byla popsána asociace QTL u rostlin sóji a odolnosti vůči hnědé hnilobě stonku (BSR). QTL lokus mající spojitost s rezistencí vůči BSR může být použit pro selekci rostlin s využitím selekce pomocí markéru (markér assisted selection). WO 99/31964 popisuje pro selekci rostlin použití markerové >
• >
nukleové kyseliny, která vykazuje genetickou vazbu se souborem 63 specifických lokusů... Nalezené polymorfismy mohou být použity/ při mapování DNA způsobem ..DNA fingerpriningu“ a při mapování genů nebo QTL lokusů asociovaných s odolností vůči škůdcům nebo chorobám. Několik posledních5 QTL studií se zabývalo vztahem jejich, kvantitativních variací specifických metabolických změn zahrnujících hromadění metabolitů. nebo změny v enzymových aktivitách. Například/Byrne a kol. (Byrne, P.F., McCulen, M.D., Snook, Μ. E., Mušket, T.A., Theuri, J.M., Widstróm, N.W., Wiseman, B.R. a E.H. Coe. 1996. Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 8820-8825) popisuje mapování evidence QTL pro 58 % rozdílných !Í koncentrací maysinu, což je flavon, který hraje úlohu rostlinného faktoru resistence (host ‘ plant resistance) vůči kukuřičným červům, a Tokusem kódujícím transkripční aktivátor pro část metabolické dráhy flovonoidů. Prioul a kol. (Prioul, J.-L., Quarrie, S., Causse, M. a D. de Vienne. 1997 J. Exp. Bot. 48: 1151-1163; Prioul, J.-L., Pelleschi, S., Séne M., Thévenot, Č., ·<
• · ·· • «· · • · · * • · · • · · • · · · · · .· · • ·· ·· -····
Causse, Μ., de Vienne, D. a A. Leonardi. 1999. J.Exp. Bot. 50: 1281-1288) použili enzymové aktivity, hladiny substrátů a produktů známé biosyntetické dráhy, jako kvantitativní znaky v analýzách QTL. Podobně Pelleschi a kol. (Pelleschi. S., Guy, S., Kim, J.-Y., Pointe, C., Mahé, A., Barthes, L., Leonardi, Á., a J.-L. Prioul. 1999. Plant Mol. Biol. 39: 373-380) zahrnuje použití aktivity invertázy jako znaku pro identifikaci kandidátských genů pro QTL lokusy asociované s odchylkami v aktivitě invertázy u kukuřice. Damerval a kol. (Damérval C., Maurice, A., Josse, J.M. a D. de Vienne. 1994. Genetics 137: 289-201) zahrnuje použití peptidů na 2D-gelu jako kvantitativního znaku pro mapování QTL.
Žádný z uvedených přístupů nedemonstruje ani nenaznačuje, že metodu mapování QTL lze použít k identifikaci genů podílejících se na regulaci exprese jednoho genu nebo kaskády genů, ani nedoporučují použití mRNA transkriptů jako fenotypických znaků pro mapování QTL. ,
Dumas a kol. (Dumas P., Sun Y., Corbeil G:, Tremblay S., Pauso va Z., Křen* V., Křenová D., Pravenec M., Hamet P., a J. Tremblay 2000, J. Hypertens 18: 545-551) zahrnuje použití mRNA jako fenotypového markéru při mapování QTL asociovaného s expresí •I! ’ .
stresového genu u krysy. Podobný přístup používající diferenční genovou expresi při mapování QTL asociovaného s krevním tlakem u krys navrhli Cicila a Lee (Cicila G.T. a S.J. Lee-1998, Hypertens. Res. 21: 289-296). Žádná z těchto prací nenavrhuje QTL přístup pro identifikaci genů, které hrají úlohu při regulaci samostatných genů nebo v komplexní regulační kaskádě odpovědné za řízení transkripčních úrovní. Navíc se zde nediskutuje o QTL mapo vám diferenční genové exprese v organismech, které jsou charakteristické ploidií větší, než je diploid. Ani se zde nediskutuje o identifikaci QTL asociovaných s diferenční genovou expresí u neživočišných hostitelů.
Vynález se zaměřuje na identifikaci genotypových oblastí, které jsou zapojené do genetické regulace exprese jednoho nebo více zkoumaných génů spojených s požadovanými znaky/vlastnostmi. Použitím analýz genomu založených na mapování QTL jsou identifikovány lokusy pro regulační geny asociované s diferenční akumulací transkriptů nebo genových produktů.
Cíl vynálezu je překonám dosavadních nedostatků v tomto oboru.
Tento cíl je naplněn kombinací rysů hlavních nároků, závislé nároky předtavují další výhodná provedení podle vynálezu.
·· ···· • l · ·· ·· . ··
o · · · · · · · · ft · · ·«
Podstata vynálezu
Vynález se vztahuje k použití mRNA transkriptů, a změn v hladinách transkriptů pro ; identifikaci lokusu kvantitativního znaku, který náleží určitému požadovanému znaku organismu. Konkrétně se vynález zabývá způsobem identifikující lokusy regulačních genů, které řídí genovou expresi pro daný znak v kterémkoli organismu. Konečně, se vynález zabývá způsobem identifikace genů a genových sekvencí, které regulují expresi genů, a regulačních kaskád řídících expresní znaky v rámci organismu.
Podle vynálezu je zde poskytnut způsob identifikace jednoho nebo více oblastí vgenomu zkoumaného organismu, které zprostředkují expresi jednoho nebo více· zkoumaných genů, která obsahuje: '
i) identifikaci prvního zkoumaného organismu, který je charakteristický tím, že tento první zkoumaný organismus vykázuje měřitelné odpovědi na podněty z prostředí, nebo jinak vykazuje fenotyp asociovaný s diferenční .genovou expresí spojenou se zkoumaným procesem;
ii) identifikaci druhého zkoumaného organismu charakteristického tím, že druhý zkoumaný organismus:
a. postrádá nebo nevykazuje tak silnou odpověď na podněty, jako tomu bylo u‘ prvního zkoumaného organismu;
b. vykazuje rozdílný fenotyp ve srovnání sfenotypem prvního zkoumaného organismu, tento rozdílný fenotyp souvisí sé zkoumaným procesem;
c. vykazuje zkoumaný fenotyp, který je v populaci segregován jako následek, křížení s prvním zkoumaným organismem; ·
d. nebo je kombinací dvou nebo více z a), b) c) a d);
iii) křížení prvního a druhého zkoumaného organismu-s cílemvyprodukovat ~ populaci segregujícího potomstva; - ’ / . , iv) vyjmutí RNA z každého segregujícího potomstva a kvantifikace hladiny genové exprese jednoho nebo více zkoumaných genů, kdy jeden nebo více těchto zkoumaných genů je asociovaných s odpovědí na podněty prostředí, nebo se zkoumaným procesem; ’ ;
v) příprava mapy genových vazeb u segregujících populací s použitím jednoho nebo více markérů;
vi) určení vztahu mezi jedním nebo více markéry na mapě genových vazeb a genové exprese jednoho nebo více zkoumaných genů a identifikaci jednoho nebo více lokusů kvantitativních znaků (QTL).
4· ···· ·*ι · ·· • 4 « • · , «
Vynález také zahrnuje způsob definovaný výše, kde po kroku křížení (krok iii)), a před krokem extrahování RNA, je segregující potomstvo vystaveno požadovaným podnětům vnějšího prostředí nebo je charakterizováno tak, jako by se právě nacházelo v specifické’ vývojové fázi.
Způsob podle vynálezu tak, jak zde byla popsán, může být použit k identifikaci jednoho nebo více QTL shodujících se s transkripčními faktory nebo kterýmikoli faktory řídícími expresi jednoho nebo více zkoumaných genů. ' í
Dále se vynález zabývá popsaným způsobem, kde po kroku determinace vztahů (krok vi)), je izolován charakterizován jeden nebo více genů umístěných na jednom nebo více QTL lokusech. “
Vynález je také veden an způsob, který zde byl popsán, kde v kroku determinace vztahů ř
(krok vi)), je markér identifikován v QTL.
Dále může být tento markér použit pro: * · vyhledání potomstva určitého organismu; ' určení hybridnosti/křížení organismu; ‘ identifikaci odchylky vázaného fenotypového znaku, expresního znaku nebo obou, jak fenotypového znaku, tak expresního znaku;
konstrukci genetické mapy; ' ;
identifikaci individuálního potomstva z křížení;
izolaci sekvence genomové DNA obklopující DNA sekvenci kódující gen nebo nekódující DNA sekvenci; - s selekci založenou na markéru (markér; assisted selection), klonování založené na mapování/mapě, potvrzení hybridů,’ určení fingérpriningu, určení genotypu, jako markér specifický pro alelu, nebo kombinace těchto uplatnění.
Vynález také zahrnuje způsob (B) identifikace regulačního genu, který zprostředkuje ' expresi zkoumaného genu obsahující: s
i) identifikaci jednoho nebo více lokusů kvantitativního znaku (QTL), které vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více zkoumaných genů;
ii) mapování jednoho nebo více těchto regulačních genů;
iii) určení, zda tento jeden nebo více regulačních genů je umístěn dó jednoho . ;
nebo více QTL lokusů; í iv) izolování jednoho nebo více regulačních genů v rámci tohoto jednoho nébo více QTL; 1 , ti
6» ’·* ΰ ·· · t · · - · · a · • ♦ ·' · r « • ··· · « « • · · · · * · • ·· ·· **
v) sekvenování tohoto jednoho nebo více regulačních genů 'izolovaných v kroku iv). , , Vynález také zahrnuje způsob zprostředkování odpovědi zkoumaného organismu na podnět prostředí skládající se z: transformace zkoumaného organismu pomocí regulačního i
genu identifikovaného způsobem (B), který zde byl popsán.
Dále se vynález zabývá způsobem zprostředkujícím vývoj zkoumaného organismu, který sestává z transformace zkoumaného organismu regulačním genem, který, byl identifikován s použitím způsobu (B), který zde byl popsán. , .
Vynález také zahrnuje způsob (C) sloužící k identifikaci regulační sekvence, která zprostředkuje expresi zkoumaného genu obsahující:
i) identifikaci jednoho nebo více lokusů kvantitativního znaku (QTL),. které vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více zkoumaných genů;
ii) mapo vám tohoto jednoho nebo těchto více regulačních genů; · iii) určení, zda tento jeden nebo více regulačních genů je umístěno uvnitř jednoho, nebo více těchto QTL; .. · iv) izolování jednoho nebo více regulačních genů umístěných v jednom nebo více těchto QTL; a
v) sekvenování regulační sekvence tohoto jednoho nebo těchto více regulačních genů izolovaných v kroku iv).
Vynález se týká způsobu, který zprostředkuje odpověď zkoumaného organismu na podněty prostředí zahrnující: transformaci' zkoumaného organismu regulační sekvencí
I napojené (fused) na požadovaný gen, kde reguláční sekvence byla identifikována pomocí způsobu (C) tak, jak zde byla popsán. : * '
Dále tento vynález zahrnuje způsob zprostředkující vývoj zkoumaného organismů-, sestávající z: transformace zkoumaného organismu regulační sekvencí napojené na požadovaný gen, kde regulační sekvence byla .identifikována pomocí způsobu (C) tak, jak zde byl popsán.
Způsob umožňuje identifikaci genů, které sdílejí společný regulační lokus nebo které podléhají stejné regulaci. To může mít důležité důsledky pro mnoho podávaných přihlášek^ například, ale ne pouze, na selekci založenou na makeru (markér assisted selection), určování feno typu, kaskádové analýzy mapovací metabolických cest, interakce genové regulace, J t * f analýzu genového toku (gene flux analysis), atd.
Genomové regiony asociované s úrovní exprese genů mohou být identifikovány s pomocí mapovacích analýz QTL. Tento přístup, používající úroveň exprese genu jako i
kvantitativního znaku, zužuje výběr takových regulačních genů a sekvencí na specifické genomové oblasti a tak umožňuje identifikaci mechanismů řízení genové exprese. Takto identifikované významné QTL a také neočekávaně vysoká úroveň odchylek, kterou vysvětlují, ukazuje možnosti použití QTL analýz genové exprese při lokalizování důležitých regulačních faktorů zodpovědných za genovou expresi vyvolanou stresem: Srovnávací analýzy QTL u násobných genů spouštěných stejným vnějším podnětem dále dovolují objasnění komplexních pochodů regulujících genovou expresi a umožňují nové seřazení genů (regroup), které sdílí regulační faktory.
Způsoby podle vynálezu lze aplikovat na zkoumané geny, jejichž exprese je regulovaná jakýmikoliv faktory s použitím šegregujících populací na základě hladin exprese těchto genů. To umožní identifikaci genomových oblastí. Pokud jsou jednou identifikovány, mohou být tyto genomové oblasti použity k charakterizování daného genotypu, bez vnějších nebo r 4 vývojových zásahů, které jsou vlastní metodám založeným na genové expresi.
Určením jednoho nebo více QTL pro polýgenní znaky, které jsou vyvolané podněty prostředí (například, ale ne pouze, teplotní stres) nebo takové znaky, které souvisí s daným procesem (například, ale ne pouze, míra výtěžnosti), způsoby podle vynálezu mohou také identifikovat jeden nebo více QTL, který obvykle souvisí se zkoumaným fenotypovým znakem a expresí genů s důležitou adaptivní hodnotou pro daný znak. Regulační geny a regulační sekvence nalezené uvnitř těchto lokusů budou mýt pravděpodobně'velký význam, pro zlepšení polygenního znaku.
Rozumí se, že způsob podle vynálezu je použitelná u jakéhokoliv hostitelského organismu, nicméně existuje několik organismů, například, ale ne pouze, jednobuněčné organismy nebo rostliny, které poskytují1 jedinečné výhody oproti jiným eukáryotním systémům, s ohledem na použití způsobu podle vynálezu. Například, u některých rostlinných' druhů, generace dvojitých haploidů z pylu, v nichž je každý lokus homozygotní, samoopylení (selfing) nebo zpětné křížem s jednou nebo další rodičovskou linií Fl, za vzniku segregující. F2 nebo zpětně křížené populace, možnost opakovaně provádět samoopylení rostlinných jedinců F2 po několik generací (F6 -F10) za vzniku série rekombinantních inbredních linií, možnost zmnohonásobit každý genotyp piomocí množení klonováním dovoluje mnohonásobnou destruktivní analýzu stejného genetického materiálu, a možnost podrobit geneticky identický materiál různým podnětům prostředí nebo dalším procesům, Dále týto typy klonálních materiálů mohou být replikovány v různých podmínkách prostředí, kdy může
X. i být studován interakční účinek genotypu, prostředí, nebo genotypu, i prostředí zároveň, na fenotyp.
• ·» ?· ·'·, * r« ·· «* • · ·- ·> ·. -· ♦. ·· -· ' · • ' · ♦ ' · ···· · · A • · ·.- ♦ · · A A A · «· «··· ·» A« ·» 0»
Toto shrnutí vynálezu nepopisuje bezpodmínečně všechny nezbytné; rysy podle vynálezu, ale vynález může také spočívat v dalším kombinování popsaných rysů vynálezu.
Vynález se zabývá způsobem identifikace regulačního lokusu, který řídí .genovou expresi u všech organismů. Konkrétně se vynález vztahuje na použití mRNA třahskriptů, a . odchylek v množství těchto transkriptů pro identifikaci lokusu kvantitativního znaku, který, · souvisí s požadovanou vlastností u organismu. . Následující popis výhodného provedení podle vynálezu je uveden pouze prostřednictvím příkladu a není limitující na kombinaci znaků nezbytných pro praktické provedení vynálezu. ,
Lokus kvantitativního znaku (QTL) je taková oblast v genomu, která vysvětluje podstatnou část odchylek daného fenotypu, který je řízen prostřednictvím mnoha genů, například, ale není omezeno na znaky, které jsou spojené se zvýšenou produkcí, odolností vůči mrazu, odolností vůči suchu a jiné. Uvnitř těchto oblastí je umístěn jeden nebo více genů kódujících faktory, které mají podstatný vliv na fenotyp tohoto organismu.
' . i
Jak zde bylo popsáno, mapa vazeb zkonstruovaná s použitím jakéhokoliv markéru, jako například markéry založené na morfologických znacích, izoenzymech nebo DNA může ’ být použita pro umístění každého zkoumaného genu do daného místa na mapě. Exprese samostatného zkoumaného genu je považována za kvantitativní znak. Aniž bychom chtěli být svazováni teorií, pokud jsou odchylky v expresi zkoumaného genu; výsledkem^ odchylek v genu samotném, například jako důsledek různých alelických forem tohoto genu, pak by hlavní lokus kvantitativního znaku měl být umístěn v blízkosti umístění strukturního genu. Nicméně, jak je ukázáno dále, je pozorováno, že odchylky v expresi zkoumaného genu jsou do značné míry a podstatně vysvětleny QTL lokušy, které jsou umístěné kdekoliv v genomu (viz Obr. 1). Proto genomové oblasti vzdálené od zkoumaného genu řídí a regulují expresi zkoumaného genu. Tyto oblasti genomu mohou být identifikovány s použitím'map vazeb a regulační geny kódující faktory, které řídí expresi zkoumaného genu, jsou'potom identifikovány pomocí metod známých odborníkům v oblasti.
Termínem „zkoumaný gen“ je myšlen jeden nebo více známých genů, které mohou být použity jako kvantitativní znak charakterizovaný použitím způsobu podle vynálezu, a který může zahrnovat regulační oblasti umístěné proti směru i po směru exprese, introny a exony. Zkoumaný gen je obvykle, ale .ne vždy, exprimován za podmínek používaných k určení účinku regulačních genů na expresi nebo supresi, tohoto zkoumaného genu. Úroveň , exprese zkoumaného genu může být určena pomočí kterékoli metody používané v oboru, například analýzy využívající Northern blot, ochrany RNáz, čipové analýzy, PCŘ a podobně.
• · · • ^ · * ·· · e.··· · · · · · · · « « • · · · * · · · • ..., · · · '· · « · ·· ·« ·· «»
Zkoumaný gen nebo úroveň jeho transkriptů je kvantitativním znakem, který je použit pro ' další identifikaci jednoho nebo více QTL asociovaných s expresí zkoumaného genu. Jeden' nebo více zkoumaných genů může být použito v rámci způsobu podle vynálezu pro analýzu odpovědi na podněty prostředí nebo analýzu dalších zkoumaných procesů, jak bylo definováno výše. Zvýšením počtu zkoumaných genů použitých v analýze je možné identifikovat jeden nebo více QTL, které jsou odpovědné za regulaci několika zkoumaných genů souvisejících sodpovědí na podnět prostředí nebo s jinými zkoumanými procesy ů' ». rostliny, pravděpodobně se tak vyzdvihne důležitost QTL lokusů. Takovýto přístup je zahrnut dále a v Příkladech provedení vynálezu: ‘ :
Pojmem „regulační gen“ je myšlen gen, jehož produkt přímo nebo nepřímo ovlivňuje . ·;
expresi zkoumaného genu a zahrnuje kódující oblast, nekódující a regulační oblasti umístěné proti směru (5') a po směru (3') přepisu a introny. Obvykle je regulační gen rozdílně : exprimován jako reakce na podnět, například, ale ne pouze, na podněty prostředí,'jako jsou , tepelný šok nebo teplotní stres. Příklad regulačního genu zahrnuje, ale není na něj omezen, gen, který kóduje transkripční faktor, nebo gen kódující další proteinový faktor, který ;
nějakým způsobem reguluje expresi dalšího genu. Produkt kódovaný regulačním genem může přímo ovlivňovat expresi zkoumaného genu, například, ale ne pouze, vázáním na regulační oblasti umístěné proti směru (5') nebo po směrů (3') přepisu kódující oblasti zkoumaného genu, nebo uvnitř intronů, jak je známo v oboru a tak zvyšovat nebo tlumit expresi zkoumaného genu. Regulační gen může také kódovat produkt, který ovlivňuje buď stabilitu transkriptů zkoumaného genu, rychlost nebo stabilitu translace nebo transkriptů, který byl syntetizován podle zkoumaného genu, nebo jak’ pósttranskripční tak posttranslační procesy spojené s expresí zkoumaného genu. Dále se také uvažuje, že regulační gen může ovlivňovat změny v expresi zkoumaného genu nepřímo tím, že zprostředkovává expresi jednoho nebo více sekundárních genů, jejichž produkty mohou interagovat s expresí zkoumaného genu. , Také se uvažuje, že jeden nebo více regulačních genů může působit synergisticky za vzniku. změny exprese zkoumaného genu. ,
Způsob podle vynálezu umožňuje identifikaci genů, které sdílejí společně regulační lokusy, nebo které podléhají stejné regulaci. Toto může mýt nezanedbatelné důsledky pro mnohé aplikace, například, ale ne pouze, pro selekci s pomocí markéru (markér assisted, selection), fenotypizace, kaskádové analýzy mapující metabolické dráhy, genové regulační interakce, analýzy genového toku, nebo identifikaci regulačních genů s významným vlivem na polygenní znaky. · ‘
I· • · . .· ·
«<· A··· ·> <·.· • r ·.» • š ··· ’ ·· ···· • · * • ·· e ·
Pojmem „podnět prostředí“ je myšlen jakýkoliv podnět působící a produkující měřitelné odpovědi uvnitř zkoumaného organismu. Například, ale ne pouze, zkoumaným organismem může být rostlina, rostlinný orgán, tkáň nebo buňka a podnětem prostředí může být například, ale ne pouze, biotický podnět zahrnující zamoření viry, bakteriemi, houbami, hmyzem, červy nebo jinými býložravci, nebo to může být abiotický podnět, například, ale ne pouze stres související s chladem, mrazem, vodou, suchem, osmotickým tlakem, horkem, solemi, oxidací nebo znečištěním. Podnět prostředí může také zahrnovat vlivy minerální výživy, světla, a endogenních nebo exogenních chemikálií na zkoumaný organismus nebo orgán, tkáň nebo jeho buňku.
Pojmem „zkoumaný proces“ se myslí jakýkoliv proces, který produkuje, měřitelný účinek uvnitř zkoumaného organismu nebo orgánu, tkáně nebo jeho buňky, například, ale ne pouze, v rostlině, Zkoumaný proces může zahrnovat, ale není omezen na, vývojové, chemické nebo enviromentální řízení genové exprese v' rámci, ale ne pouze v případě rostliny, embryogeneze, vývoje květu, semene, kořene nebo listu, organogeneze nebo v rámci cirkadiánních a ultradiánních a dalších vnitřních cyklů Další zkoumané procesy mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na, výtěžek, ' který je možno sklidit, foto syntetickou translokaci, místa spotřeby a zdrojů v rostlině, index listové plochy (leaf area index), poměr podzemních a nadzemních částí rostliny (root šhoot ratio), výživnou hodnotu sklizeného materiálu, morfologii rostliny, rychlost buněčného cyklů, rychlost buněčné diferenciace,' velikost buněk, životní cyklus rostliny, stámútí, maturace, dormance, germinace nebo genomová přeskupení, způsobená například aktivací transpozonu. Nicméně, je srozuměno, že analogické nebo jiné jedinečné procesy mohou být charakterizovány použitím zde popsaných způsobů u jakéhokoliv zkoumaného organismů.
Pojmem „zkoumaný organismus“ je myšlen jakýkoliv organismus, v němž je identifikován a charakterizován jeden nebo více QTL lokusů, například, ale ne pouze, rostlina (algae, bryophytes, ferns, angiosperm nebo gymnosperm), živočich, jednobuněčný organismus, bakterie, fytoplankton, kvasnice, houby, a také zahrnuje buněčné nebo tkáňové kultury těchto organismů.
Způsob podle vynálezu může být použit k určení hladiny transkriptů genu, který se vyskytuje ve specifickém místě genomu, · a ke stanovení, zda hromadění kódovaného· transkriptů nebo proteinu je regulováno geny umístěnými na lokusu kdekoliv v genomu.
S použitím analýzy genomu založené na mapování QTL (lokus kvantitativního · znaku) je možné určit lokus asociovaný se změnami v akumulaci transkriptů nebo genových produktů. Proto geny nalezené v rámci těchto QTL lokusů by mohli kódovat členy multigenních rodin .
·.-.·· '····’···· ·'· «·«· ·· ·· ·· podléhající různému řízení transkripce (například, řízení využívající důležité cis-regulační sekvence, které následně ovlivňují regulaci transkripce, nebo působí na sekvence po směru ’ · nebo proti směru přepisu nezbytné pro zvýšenou translaci nebo stabilitu mRNÁ), různým x ’ transkripčním faktorům (zahrnujícím enhancery a represory), proteinům signálních l
transdukčních drah (například, protein kinázy, protein fosfatázy, 14-3-3 proteiny apod.), podléhající externím signálním receptorům, proteinům účastnícím se při regulaci hladin tzv. druhých poslů (Ca2+, IP3, cAMP, atd.), nukleázám účastnícím se degradace transkriptů, ( proteázám a inhibitorům proteáz, novým regulačním faktorům transkripce.
Příklad přístupu použitého pro identifikaci regulačních genů řídících, ' zprostředkovávajících nebo ovlivňujících expresi jednoho nebo více zkoumaných genů je· například, ale ne pouze omezeno na změnu v expresi jako odpověď na podnět prostředí, nebo jakákoliv událost ve zkoumaném organismů, která vede ke změněné genové expresi zahrnuje: ·
i) identifikaci prvního zkoumaného rodičovského organismu, který vykazuje odpověď na podnět prostředí, nebo jinak vykazuje fenotyp asociovaný se změněnou genovou expresí související se zkoumaným procesem a identifikaci druhého zkoumaného rodičovského organismu, který postrádá nebo nevykazuje tak silnou odpověď na podnět prostředí, nebo vykazuje jiný fenotyp související ,! ' se změněnou genovou expresí spojenou se zkoumaným procesem,· ať už se tato
í. , ' odchylka nachází v přírodě nebo je vyvolaná genovou mutací, narušením genu: nebo genovou insercí. Je vhodné, ne však nezbytné, aby se první a druhý rodič odlišovali ve svých odpovědích na podnět, nebo se lišili ve změněné genové expresi související se zkoumaným procesem, po dobu trvání odpovědi na podnět nebo ve změněné genové expresi segregované v potomstvu; ii) křížení prvního a druhého rodiče zá vzniku populace segregujícího potomstva. Populační typy mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na, rodiny F1 (od heterozygotních rodičů), F2 nebo F3 rodiny, rekombinantní inbrední linie, dvojité haploidy, zpětně křížené linie, testované křížené linie (test crosslines), a , s
segregované nahosemenné megagametofyty (gymnosperm segregating magagametophytes);
iii) jestliže je to požadováno, vystavení potomstva tohoto křížení požadovanému podnětu vnějšího prostředí;
iv) extrahování RNA z jednoho nebo více orgánů, tkání nebo buněčných typů, například, v případě rostliny jako zkoumaného organismu, může být RNA získána z květů, zárodků, listů, stonku nebo kořenové tkáně, nebo buněk;
• · .
» · · • . > ·
Λ9 9 9 .«,·· .. ·,».
• · Λ ' • · · · · • · · < · · ♦
.. ·· »·<·' • ♦ V ·
v) měření hladin transkriptů jednoho nebo více zkoumaných genů s použitím jakékoliv vhodné metody, například, ale ne pouze, dot blottingu, Northern hybridizace, čipových analýz nebo kvantitativní PCR, čipové analýzy a kvantifikace hladiny genové exprese pro každé potomstvo;
iv) příprava mapy genetických vazeb segregující populace spoužitím kterékoliv vhodné metody, například, ale nejsou omezeny pouze na použití markérů založených na DNA, jako jsou RFLP (Restricťion ragment Lenght polymorphism), AFLP (Amplifíed Fragment Length Polymorphism),. RAPD (Random Amplifíed Polymorphic DNA), mikrosatelity, IMP (Inter ΜΙΤΕ polymorphism) nebo SNPs (Single Nucleotide polymorphism), proteinové markéry, morfologické.markery k charakterizování jedinců mapované populace a zpracování dat získaných z jedné nebo více metod s cílem vytvořit dvou. bodovou a multi bodovou analýzu vazeb pro vytvoření mapy vazeb;
v) určení vztahu mezi markéry na mapě vazeb a expresí jednoho nebo více zkoumaných genů v odpovědi na podnět prostředí, nebo expresi asociovanou se zkoumaným procesem, pro určení statisticky významných QTL. Takový vztah může být určen pomocí jakékoliv metody známé odborníkům v oblasti, například, ale nejsou omezeny pouze, jednobodové ANOVA analýzy, jednoduché regrese, intervalového mapování (interval maping), kompozitní intervalové mapování (Gomposite interval mapping). Taková analýza může být provedena pomocí software MAPMAKER/QTL, MQTL, QTL kartograf, nebo jiného podobného softwaru. Je také spočtena statistická, významnost a procento odchylek pro každý QTL.
Tento způsob tak, jak zde byl popsán, poskytuje účinný způsob pro důkladnou identifikaci mnoha, pokud ne všech, regulačních faktorů (genů) účastnících se řízení exprese zkoumaného genu a poskytuje odhad relativního příspěvku každého z faktorů k pozorovaným odchylkám v expresi zkoumaného genu, jakož i pro identifikaci umístění regulačního genu v genomu a asociovaných markérů, které lze použít při běžném šlechtění rostlin. Navíc,, „hlavní vypínací“ regulační geny ovlivňující expresi více genů, například v kaskádě, mohou. být identifikovány, pokud jsou současně analyzovány mnohonásobné geny spouštěné daným podnětem prostředí nebo související s určitým daným procesem.
Jakmile je identifikován jeden nebo více QTL lokus, který je významně asociovaný s expresí zkoumaného genu, pak každý z těchto lokusů a spojených markérů může být použit buď přímo jako markér, například, ale není to omezeno pouze pro účely šlechtění a screening, '· '· » » .· * >. '» ♦ I • · . · ·. · Á · ♦'· · 1 f “-λ ···' · '· * · · · · · · · . ♦
13'· ♦ β ♦ * · * · · * · *-* Α'#;·'· Α ♦' Α'4 ·’· Α'· včetně šlechtění rostlin, nebo mohou být dále charakterizovány pro určení genů účastnících se exprese zkoumaného genu s použitím metod klonování vycházejících z mapování, které budou známé odborníkům v oblasti. Například jeden nebo více známých regulačních genů může být lokalizováno v genomu, aby bylo určeno, zda se genové umístění těchto genů shoduje s QTL lokusy řídícími mRNA expresi zkoumaného genu. ‘Potvrzení faktu, že takový
.. * shodný regulační gen ovlivňuje expresi jednoho nebo více zkoumaných genů, může být získáno pomocí běžných technik používaných v oboru, například, ale ne pouze, pomocí ,r genetické transformace, genové komplementace nebo technik genového „knock outu“ nebo genové overexprese. Mapa genových vazeb může být také použita při izolaci regulačního genu, včetně jakýchkoli nových regulačních genů, prostřednictvím přístupů klonování založených na mapování, které jsou známé v oboru, kde markéry umístěné v QTL jsou použity k nalezení zkoumaného genu pomocí vnášení velkých inzertů genomových klonů. ; Poziční klonování je jednou z těchto metod, které mohou být použity k izolování jednoho nebo více regulačních genů tak, jak bylo popsáno v práci Martin a kol. (Martin, G.B., Brommonsčhenkel, S.H., Chungwongse, J., Frary, A., Ganal, M.W., Spivey, R., Wu, T. Earle,
E.D. a S.D. Tanksley, 1993, Science 262: 1432-1436; která je zde zahrnuta odkazem), ačkoliv mohou být použity také další vhodné metody, které budou známé odborníkům v oblasti. Další íí potvrzení, že takový shodný regulační gen ovlivňuje expresi jednoho nebo více zkoumaných genů, může být získáno pomocí genetické transformace a komplementace nebo pomocí technik genového knock-outu popsaných dále. , ' - .
Proto je vynález zaměřen na identifikaci míst v genomu rostliny, které se účastní zprostředkování exprese jednoho nebo více zkoumaných genů jako odpovědi na podnět prostředí, nebo procesů spojených se změněnou genovou expresí v rámci zkoumaného procesu. Vynález je také zaměřen na charakterizování identifikovaného QTL s cílem určit jeden nebo více regulačních genů a regulačních sekvencí v tomto lokusu.
Způsob podle vynálezu může být také použit pro identifikaci lokusu korespondujícího , s faktory (kódované regulačními geny) spojenými s řízením nebo zprostředkováním, exprese zkoumaného genu ve zkoumaném organismu. Tento způsob může být použit pro identifikaci regulačních genů řídících hladinumRN A transkriptů jednoho nebo více zkoumaných genů, ať už se tato odchylka nachází v přírodě, nebo je způsobena genovou mutací, narušením genu nebo genovou inzercí, například, ale ne pouze, zkoumaných genů regulovaných faktory účastnícími se při:
- biotických stresech jako jsou například, ale ne pouze, viry, bakterie, houby, hmyz nebo červi;
► .
ϊ :
< · * ·♦ «
- abiotických stresech zahrnujících, ale ne omezených, na chlad, mráz, vodu, sucho, osmotický tlak, teplo, soli, oxidaci a znečištění;
- vývojově, chemicky nebo prostředím řízené genové expresi;
- embryogenezi, například, ale ne pouze, při vývoji tkáně nebo orgánu, přičemž v případě rostliny může jít o vývoj semene, organogenezi nebo vývoj květu;
- minerální výživě, zahrnující jak mikro živiny, tak i makro živiny;
- světle (hustota ozáření a kvalita světla);
- cirkadiánních, ultradiánních a dalších vnitřních rytmech;
- chemických indukátorech zahrnujících přirozené regulátory růstu, například, v případě rostliny jako zkoumaného organismu, to jsou auxiny, gibereliny, ABA, cytokininy, etylen a jejich analoga, syntetické hormony, herbicidy, kyselina salicylová, « nebo zkoumané geny mající výrazný vliv na biologické procesy, jako jsou:.
- určení výnosu, například, ale ne pouze, u rostlin, určení skliditelného výnosu, prostřednictvím vlivu regulačních genů na biomasu, tvorbu semen (velikost a počet), fotosyntetickou translokaci, místa spotřeby a zdrojů v rostlině, index listové plochy, poměr podzemních a nadzemních částí rostliny;
nutriční hodnota biomasy například, ale není omezena pouze na sklizený materiál a související účinky na faktory kvalitý,. jako jsou kofaktory, vitaminy, proteiny, antioxidanty, vysoce stravitelné vlákniny; .. ·
- morfologie u rostlin například, ale není omezena pouze na vliv regulačních genů na barvu květu (například geny účastnící se při syntéze antokyanů), výšku rostliny (například geny účastnící se při syntéze giberelinů), vzdálenost mezi kolénky, zakládám listů;
- rychlost buněčného cyklu například, ale ne pouze, u cyklinů;
- rychlost buněčné diferenciace například, ale ne pouze, u proteinů homeodomén;
- velikost buněk, například, ale ne pouze, u rostlin, u genů účastnících se syntézy auxinů, receptorů, u genů indukovaných auxinem; t
- životní cyklus organismu, například prostřednictvím působení regulačních genů na' stárnutí, máturaci, domanci, germinaci;
- genomová přeskupení, například u transpozónové aktivace;
Navíc k použití způsobu podle vynálezu k identifikaci lokusu odpovídajícího transkripci, nebo k identifikaci jakýchkoli jiných faktorů řídících expresi genů ve:
X • ···
15' * * > v · 9 « • 9 · .
• < * ♦ · * * · ‘ ·» ··«« zkoumaném organismu pro různé požadované znaky, mohou být markéry umístěnév těchto QTL lokusech použity také při aplikovaném šlechtění.· Například,. identifikované polymorfismy asociované s jedním nebo více identifikovanými genetickými markéry umístěnými vlokusu (QTL lokus) mohou být použitý pro diagnostické a selekční postupy založené na genomu: ,
- pro vysledování potomstva určitého organismu;
- pro určení hybridnosti určitého organismu;
- k identifikaci odchylek vázaných fenotypových znaků, znaků exprese- mRNA, nebo obou, jak fenotypových znaků, tak znaků exprese mRNA;
- jako genetické markéry pro vytvoření mapy genetických vazeb;
k identifikaci individuálního potomstva zkřížení, kde potomstvo nese požadované genetické příspěvky od rodiče dárce; od rodiče příjemce nebo od obou, rodiče dárce i rodiče příjemce;
- k izolaci genomových DNA sekvencí obklopujících kódující nebo nekódující DNA. sekvence, například, ale ne pouze, promotoru nebo regulační sekvence;
- při selekci s pomocí markérů (markér assisted selection), klonování založeném na mapování při potvrzení hybridu,' fingěrprintingové charakteristiky, genotypizaci a alelicky specifiké markéry; a
- jako markér ve zkoumaném organismu.
S použitím analýzy QTL založené na mapo vám, která zde byla popsána, může být identifikován regulační lokus asociovaný s expresí zkoumaného genu, na úrovni celého organismu, orgánu, tkáně nebo buňky, jako odpověď na podnět prostředí, nebo může být identifikován fenotyp asociovaný se změněnou genovou expresí související sezkoumáným procesem. Například, což by nemělo být považováno za omezující v žádném směru, kandidátské regulační geny, které modulují expresi mRNA, jako (také viz Tabulka 2, Příklad 2): ' _ , '
- Transkripční faktory (proteiny s modulem a AP2 proteiny; otisk zinku „zincfinger“, AP2 proteiny); , ' Λ
Proteinkinázy aktivované mitogěny (MMK4, MMK3, MMK2, MMK1);
- Ca dependentní proteinkináza; ,
- Serin-threonin proteinkináza ·
- ATPáza transportující Ca2+;
- GTP vazebné proteiny; ...
- RNA vazebné proteiny;
» · iř -• · 4 • · · · · · ♦ · ··' • · „ '* · • - · » • ♦ ♦
t.:· ·· €·>»
- Proteinfosfatázy (typ 2A a 2C);
2+
- Ca vazebné proteiny, například kalmodulin;
14-3-3 proteiny;
- GTPázu aktivující proteiny;
- protein adenylylcyklázy;
- Fosfolipáza C;
- Lipoxygenáza;
- Histon deacetyláza;
- Receptorové kinázy; nebo
- Fosfatidylinositol-3-kináza mohou být vyhodnoceny s cílem určit, zda se vyskytují v oblastech genomu (QTL), které vysvětlují velkou část exprese chladem regulovaných genů u rostlin, například, ale ne na ni omezené, alfalfa (Medicago falcata L.).
Způsob, jak zde byl popsán, může být použit pro doplnění vysoce účinných výzkumů genomu založených na DNA čipových a mřížkových analýzách, nebo kteréhokoli jiného ‘ . systému schopného měřit genovou expresi. S použitím segregujících se populací je možné určit umístění QTL regulujících transkripění úroveň genů, jejichž exprese souvisí se ů 1 zkoumaným fenotypem (například odolnost vůči stresu a chorobám, biochemická produkce, morfologické odchylky atd.). Mapováním kandidátských genů na základě EST databází zajišťuje potenciál pro ko-lokalizaci do důležitých QTL lokusů a dovoluje identifikaci alelického polymorfismu a vývoj alelicky specifických markérů. Identifikace těchto QTL a ’ souvisejících regulačních genů může být použito pro diagnostické a selekční techniky založené na genomu pro odhad potenciálu genově exprese za daných vývojových podmínek a- ·» <t, , podmínek prostředí a pro koordinaci genové exprese v rámci vývoje, tkánínebo.prostředí:;
Genomové oblasti asociované s hladinami exprese genů, například, ale nejsou omezeny pouze na geny indukované nízkou teplotou, mohou být identifikovány s použitím analýzy mapující QTL. Tento přístup, používající úroveň genové exprese jako kvantitativní znak, umožňuje identifikaci řídících mechanismů genové exprese tím, že se hledání takových * regulačních genů omezí na specifické oblasti genomu. Je také pravděpodobné, že se v těchto oblastech najdou i DNA sekvence odpovědné, za odchylky v genové expresi. -Způsob pro ' , identifikaci genů, který zde byl popsán, bude rychlejší a snadnější s dostupností úplných genomových sekvencí a s rutinním začleněňo váním zvyšujícího se počtu EST do podrobných map, nebo s využitím výhod značné ko-linearity bloků genů v chromozomech příbuzných druhů při komparativním genetickém mapování. * • · ·>
• · ♦ t ·♦ ·♦ • * ¢£(0 ’ ,·0 < '•'l?·' » » · · ··'♦ - ♦ ' » <&0 0 '0 < * 0 ., · 0 ·' 0' 0 · · · · e , .> ♦ · ' , x ' · · · · · · ♦ ♦ e · ·♦ 0 ·
Vysoce významné QTL identifikované v rámci uvedených příkladů, a neočekávaně ' vysoká úroveň odchylek, které tyto QTL vysvětlují, naznačuje možnosti použití QTL analýz genové exprese pro lokalizaci důležitých regulačních faktorů odpovědných za expresi genů indukovaných stresem. Srovnávací QTL analýzy četných genů indukovaných stejnými podněty prostředí nebo těch, které se účastní v daném procesu, umožňují objasnění komplexních drah regulujících genovou expresi a seskupení genů, které sdílejí podobné regulační faktory.
Způsob podle vynálezu bude použitelný u genů, jejichž exprese je regulovaná jakýmikoliv faktory pomocí použití segregujících populací na základě hladin exprese těchto genů. Umožní to identifikaci genomových oblastí, které lze použít pro charakterizování daného genotypu, bez vlivu prostředí nebo vývoje, což je vlastní pro metody založené na genové expresi.
Za účelem identifikace regulačních genů, které mohou být lokalizovány v jednom nebo více QTL lokusech, které vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více zkoumaných genů, jsou produkovány sondy ze známých regulačních genů například, ale ' nejsou omezeny pouze na regulační geny zde uvedených v Tabulce 2 v Příkladu 2, a tyto - * regulační geny nebo produkty jejich exprese jsou umístěny do mapy vazeb. Tyto sondy mohou zahrnovat nukleotidové fragmenty nebo geny o plné délce pro detekci DNA nebo RNA, nebo protilátky pro detekci produktů exprese:regulačního genu. Je.nutné chápat; že neznámé regulační geny umístěné v jednom nebo více QTL lokusech mohou být také identifikovány použitím metod, které jsou známé odborníkům v oblasti, například, ale nejsou omezeny pouze na poziční klonování a mapování částí sekvencí DNA. s cílem:· určit, zda je · klonovaná DNA spolulokalizovaná do stejného místa jako jeden nebo více identifikovaných QTL. S výhodou je umístění kandidátských regulačních genů do jednoho nebo více QTL lokusů potvrzeno, například pomocí mapování oblastí nacházejících se proti směru nebo po směru exprese od každého domnělého regulačního genu na mapě vazeb.,Tímto způsobem jsou. ' k další charakterizaci použity pouze regulační geny charakteristické tím, že obsahují 5 ' nebo 3' oblasti, které jsou spolulokalizovány se stejnými QTL lokusy. '
Potom mohou být izolovány a charakterizovány regulační geny, které jsou lokalizovány * , li.
uvnitř jednoho nebo více QTL asociovaných s expresí jednoho nebo více zkoumaných genů, může být modulována exprese těchto regulačních genů v rámci transgenní rostliny, například, ale ne pouze, alfalfa, s cílem odhadnout jejich vliv na expresi zkoumaného genu a pokud je to požadováno, také jejich vliv na odpověď.zkoumaného organismu na stres způsobený vnějším prostředím. Takové analýzy mohou zahrnovat, ale ne pouze, komplementaci nebo genový '4 : '4 , 4
4 Ί.· • 4 / · e r · * . 4
4· 4 4 „knock-out“, a aktivaci genu, studie zahrnující transformaci zkoumaného organismu, konstruktem kódujícím překládanou nebo k ní komplementární sekvenci regulačního genu nebo enhancerovou sekvenci. Zkoumaný organismus postrádající nebo vykazující jen slabou odpověď na podnět prostředí, nebo zkoumaný proces, je transformován pomocí konstruktu kódujícího překládanou sekvenci regulačního genu, zatímco zkoumaný organismus vykazující silnou odpověď, nebo pozitivně se projevující ve zkoumaném procesu; je transformován pomocí konstruktu kódujícího komplementární sekvenci k překládané sekvenci regulačního genu, nebo.může být rozrušen insercí cizí DNA, jako je T-DNA, do kódující oblasti genu, nebo aktivován pomocí inserce 5' nebo 3 ' sekvence enhanceru transkripce zkoumaného genů. Exprese jednoho nebo více zkoumaných genů a regulačního genu může být potom sledována s cílem určit vliv inzerce sekvence překládané nébo k ní komplementární, genového knockoutu nebo vložení sekvence zesilovače ' transkripce do regulačního genu na odpověď organismu na podněty prostředí nebo na zkoumaný proces. Lze také určit vliv inzerce konstruktu kódujícího sekvence překládané nebo k ní komplementární, genového knock-outu nebo vložení sekvence zesilovače transkripce na; fyziologickou odpověď na stres způsobený ; vnějším prostředím.
Uvažuje se také, že regulační gen umístěný ve specifickém QTL lokusu, rtebo skupině QTL lokusů, může být také použit jako signální znak pro tento jeden nebo více QTL v rámci šlechtitelského programů.
Proto se vynález také vztahuje k vhodnému'způsobu identifikace regulačního genu zprostředkujícího expresi zkoumaného genu, která zahrnuje: '
i) přípravu mapy vazeb zkoumaného organismu;
ii) identifikaci jednoho nebo. více QTL lokusů, které vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více zkoumaných genů; a iii) izolování a mapování jednoho nebo více regulačních genů s cílem určit, zda jsou tyto regulační geny lokalizovány v oblasti jednoho nebo více identifikovaných t QTL lokusů. , ' ,
Vynález je také určen ke zprostředkování odpovědi zkoumaného organismu na stres způsobený vnějším prostředím, nebo k charakterizaci in vivo vlivu identifikovaného a izolovaného regulačního genu umístěním tohoto regulačního genu do zkoumaného organismu, případně určení vlivu regulačního genu na expresi jednoho nebo více zkoumaných genů, nebo jeho vliv na odpověď zkoumaného organismu na podnět prostředí.
• . · ·· e··· ·*· ,· ♦ A • · φ'-φ'φ'
_♦* - ΦΦΦ'Φ * · ΐ.<
• * 1 ♦ fc « φ , φ • Φ Φ ·
Výše uvedený popis není zamýšlen jako omezující nároky podle vynálezu jakýmkoliv způsobem, navíc diskutovaná kombinace znaků nemusí být naprosto nezbytná pro řešení vynálezu. Stručný popis obrázků 1
Tyto a další rysy vynálezu budou osvětleny pomocí následujícího ^popisu, v němž jsou uvedeny odkazy na zde připojené obrázky: ·
Obr. 1 ukazuje mapu vazeb diploidu alfalfa.. Lokusy jsou uvedeny na pravé straně a . rekombinační vzdálenosti (cM, centimorgany) jsou uvedeny na levé straně každé skupiny vazeb. Cáry na pravé straně každé skupiny vazeb ukazují přibližné umístění lokusu. Chladem . regulované (msaCI) geny jsou dvakrát orámovány a geny homologické s geny. s regulační funkcí jsou umístěný v jednom rámečku. Geny, které jsou členy multigenních rodin jsou číselně odlišeny, například C3358.1 a C3358.3. ;
Obr, 2 : Umístění a statistická hodnota (hodnota LOD) QTL lokusů pro LT5o a chladem regulované exprese genů msaCI. Geny msaCI jsou dvakrát orámovány a.geny homologní s geny, které mají regulační funkci, jsou v jednom rámečku. Pokud je genová exprese QTL lokusů identifikována v tkáních korunky i listů, je nahoře umístěn graf pro LOD hodnoty exprese v korunce a graf pro hodnoty LOD pro expresi v listech je umístěn dole. QTL lokusy LT50 se týkají celé rostliny a jsou nezávislé na typu tkáně. Geny, které jsou členy ultigenních rodin jsou číselně odlišeny, například C3358.1 a Č3358.3.
Obr. 3 ukazuje příklad analýzy exprese zkoumaného genu pomocí dot-blotu, v tomto případě msaCI A genu, vsegregující populaci F2 diploidu alfalfá. Každá skvrna odpovídá jedinečnému genotypu kromě posledního sloupce, kde je umístěna třikrát kontrola. Hladina transkriptů je kvantifikována denzitometticky a je použita jako kvantitativní znak pro analýzu · QTL. Hodnota optické hustoty je uvedena pro každý genotyp a kontrolu. *'
Příklady provedení vynálezu ’ ; · .
Vynález bude dále objasněn pomocí následujících příkladů. Nicméně se rozumí, že tyto příklady jsou zde uvedeny pouze pro vysvětlení a neměly by být limitující pro předmět vynálezu jakýmkoliv způsobem. ’ , .
Příklad 1: Identifikace QTL lokusů souvisejících s chladem regulovanou genovou expresí • 'i' · ,« 7 ' v 'V ' + • * ',,.. '· · ' '♦ · O'. ... '· '· · ' • » '·'„ * '» * . · ♦ »·· ♦ ,♦ ·· ·,».>· 4'« ·· »'·' ··
Obecný popis experimentálního přístupu · - \ · Λ s *· ' ♦ „ 4!
Jako příklady kvantitativních znaků charakterizovaných v rámci klonovaných diaspor ,' genotypů F2 diploidu alfalfa jsou použity exprese chladem regulovaných genů (msaCl) a fenotypy LT50. Znaky segregace fenotypů (msaCl genová exprese a LT50) jsou použity při 'j hledání lokusu kvantitativního znaku (QTL) v mapě vazeb genomu diploidu alfalfa. >
Rostlinný materiál
F1 populace je vytvořena křížením (intercrossing) diploidních rodičů vykazujících protikladnou toleranci vůči chladu (M. falcata x M. sativa). F1 linie je produkováná pomočí . ; křížového opylení mezi genotypem M. sativa citlivým na chlad pocházejícím z kultivovaného alfalfa ze skupiny diploidní úrovně jako 'samičím rodičem a s mrazuvždomým diploidním * genotypem z M. falcata cv. Anik (Pankiw, P. a Siemens, B. 1976. Can. J. Plant Sci. 56: 203• ' íj ·· t - · - - v
205) jako samčím rodičem. Květy jsou oslabeny a potom ručně opylovány. Jeden namátkově · vybraný genotyp F1 je rozmnožen pomocí ručního opýlování a potomstvo F2 z tohoto křížení je použito k produkci mapy vazeb a pro analýzu QTL.
Podmínky růstu ' „ / ' !
Řízky ze 117 genotypů F2 byly rozmnožovány klonováním a poté, co še objevily kořínky, byly přesazeny do hlubokých kontejnerů.™ Klonované diaspory (rozmnožovací jednotky rostlin) jsou potom pěstovány za kontrolovaných podmínek.prostředí při 21 °C ve -, dne a při 17 °C v noci s 16 hodinami světla denně při ozáření o hustotě toku fotonů přibližně. 225 pmol m'2 s'1 . . ‘ '
Podmínky chladové aklimatizace . - * · »
Rostliny jsou dva týdny aklimatizovány na chlad v růstových komorách při 2 °C s 8 hodinovým obdobím světla a při osvětlení o hustotě.toku fotonů přibližně 125 pmol.m'2 s;1 .
Stanovení LT50 . ’
Klonované diaspory každého genotypu ze segregujících populací a rodičovských » · *'. ',1 genotypů jsou vystaveny testu mrazem tak, jak byl popsán v Castohguay a kol. (Castonguay,
Z., Nadeau, P., a S. Laberge 1993. Plant Cell Physiol. 34: 31-38). Rostliny jsou vystaveny po 'i* . , , { krocích se snižující okolní teplotě, během této doby jsou v intervalech odebíraný jednotlivé rostliny, které se potom nechají růst tři týdny ža počátečních růstových podmínek ,..‘ý ...
(21 °C/17°C, denní a noční teploty, v tomto pořadí) a potom je stanoveno přežití rostliny.
··». .91„ ·» ·*'··' * * * · * ♦ -* r · ', « • · , · · ' ·> ··» ‘ · · '♦ • · · ·,··.· · ··· ·· c··· «♦ ·< ·· φ·
Pomocí metody SAS™probit (Systém statistické analýzy, Cary, NC) je určena teplota, která je letální pro 50 % populace (LT50). Jsou provedena tři opakování neúplného blokového vzoru s cyklickými permutacemi (12 bloků), aby byla provedena statistická srovnání velkého počtu ekotypů použitých v pokusu.
>
Popis msaCI genů
V této studii bylo použito sedm msaCI genů izolovaných z knihovny cDNA z korunky tetraploidu alfalfa, který byl aklimatizován na chlad (M. sativa cv. Apica; Laberge, Š,
Castonguay, Y. a Vézina, L.-P. 1993. Plant Physiol 101, 1411-1412; Castonguay, Y., S.
Laberge, P. Nadeau, a L.-P. Vézina. 1997. str. 175-202. In B.D. McKersie a D.W. Brown *· f (ed.). Biotechnology and the improvement of forage legumes. CAB International, ; Wallingford, UK):
msaCI A na glycin bohatý protein (glycine reach) Laberge a kol. (1993)* msaCIB domnělý jaderný protein (putative huclear protein) Monroy a kol, .(1993)** msaCIC bimodulámí protein (bimodular protein) Castonguay a kol. (1994)*** msaCID protein spojený s patogenezí (pathogenesis-related protein) nepublikováno * ý msaCIE glyceraldehyd-3P-dehydrogenáza„ nepublikováno msaCIF galaktinol syntáza nepublikováno msaCIG protein podobný dehydrinu (dehydrin-like) nepublikováno *Laberge, S, Castonguay, Y. a Vézina, L.-P. 1993. Plant Physiol. 101,1411-1412.
**Monroy. A.F., Castonguay, Y., Laberge, S., Sarhan, F., Vézina, L.-P. a Dhindsa, R.S. 1993.
Plant Physiol. 102, 873-879.
***Castonguay, Y., Laberge, S., Nadeau, P. a Vézina, L.- P. 1994. Plant Mol. Biol. 24, 799804. ' · /
Extrakce RNA
Přibližně 0,5 g (čerstvé váhy) listové tkáně z každého genotypu aklimatizovaného na chlad je v tekutém N2 v třecí misce rozdrceno paličkou na jemný prášek. Celková RNA je extrahována s použitím standardních metod tak, jak byly dříve popsány (Castonguay a kol.
1994. Plant Mol. Biol. 24, 799-804). Celková RNA je kvantifikována pomocí UV absorpce při 260 nm (Foumey, R.M., J. Miyakoshi, R. S. Day III, a M.C. Paterson. 1988. FocuS 10:1). , ·»' A·*· ’·4 • · · i v- '<
• · · s * - ♦ ••i' • · «_ · · · ·· ·«:·« tf* ··
Kvantifikace dot blotu
Pro každý rodičovský genotyp a pro každý genotyp segregující populace se použije 5 pg celkové RNA a ta se pomocí vakua přenese na nylonovou membránu (Hybon N+, Amersham Pharmacia Biotech, Oakville, ON) s použitím přístroje Bio-Dot™ (Βίο-Rad, Mississauga, ON) a imobilizuje se příčnou vazbou pod UV světlem po dobu 3 minut. Membrány jsou hybridizovány přes noc při 68 °C v 2x SSC, 0,25 hmotn./obj.% sušeném nízkotučném mléce, 1% SDS s [32P]dCTP-značenou sondou' připravenou z přečištěných insertů chladem regulovaných genů podle standardních protokolů (Sambrook, J., Maniatis, T. a Fritsch. 1989. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Pro expozici membrán byl použit film Kodak X-Omat AR5 při teplotě -80 °C a hladina transkriptů byla kvantifikována denzitometrickou analýzou autoradiografu s použitím softwaru OneD Scan™ (Scanalytics inc., Billerica, MA). Na obr. 3 je příklad doťblotu získaného s použitím msaCIA genu jako sondy. Pro standardizaci hybridizačního signálu u všech membrán byla použita průměrná hodnota hladiny transkriptů u všech vzorků na každé membráně..
Mapa vazeb
Konstrukce mapy genetických vazeb je založena na AFLP á RFLP. DNA je extrahována z 1 až 2 g čerstvé listové tkáně klonálních diaspor starých 4 až 6 týdnů. Metoda extrakce je provedena přesně tak, jak je popsáno v Doyle a Doyle (Doyle, J.J., a Doyle, J.L·.'
1990. Izolace rostlinné DNA z čerstvé tkáně. FOCUS 12, 13-15), s výjimkou, že listová tkáň i je rozdrcena při teplotě místnosti bez použití tekutého dusíku.
Pro zjištění RFLP markérů se použije DNÁ‘přečištěná ze 169 genotypů F2, každá DNA je samostatně podrobena štěpení s použitím' restríkčnichenzymů Dral a FcoRV. Každý štěpený vzorek DNA (6 pg od každého genotypu) je separováno na horizontálních gelech (0,9% agarózy, 1 x TAE), a separované fragmentý jsou pomoci kapilárního blotingu přeneseny na nylonové membrány (Hybond N4·, Amersham Pharmacia Biotech, Oakville, ON). Pro simultánní analýzu segregace s více sondami je vytvořeno deset duplikátů (duplicate ’ copies) membrán._Membrány jsou hybridizovány přes. noc při teplotě 65 °C se sondami značenými [32P]-dCTP. DNA sondy se skládají z náhodně vybraných cDNA a cDNA vybraných podle jejich homologie s regulačními geny, které byly v obou případech získány z knihoven cDNA pro Medicago sativa, a ze 7,msaCI cDNA zde popsaných. Nejdříve jsou pomocí PCR specificky amplifikovány inzerty cDNA a označeny pomocí náhodného hexamerního značení s použitím Kitu T7 QuickPrime™ (Amersham Pharmacia Biotech, • ·· · « · t „ · · « ·« »«·« ·« ··
Oakville, ON). Prehybridizace, hybridizace a značení sondy jsou provedeny podle standardních postupů (Sambrook, J., Maniatis, T. a Fritsch. 1989. Molecular cloning: A Laboratory manual. Cold Spring harbor Laboratory Press, Col Spring Harbor, New York).
Pro identifikaci AFLP markérů jsou DNÁ z F2 vystaveny restrikčním enzymům Eco RI ;
a Mseí, které jsou ligo vány s Eco- a Mse- specifickými příměrovými adaptéry, a poté >
amplifikovány pomocí Eco a Mse- pre-selektivních primerů (vos. P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van der Lee, T., Homes, M., Frijters, A., Pot, I, Pelerman, J., Kuiper, M, a Zabeau, M. 1995, Nucleid Acids Res. 23, 4407-4414). Před-selektivní amplikony jsou 20x zředěny a jsou použity jako materiál pro selektivní amplifikaci. Oba primery Eco a Mse použité při selektivní amplifikaci obsahovaly na 3' konci 3 selektivní nukleotidy. Primer Eco je označen barvivém IRD, které umožňuje detekci amplikonů infračerveným laserem s pomocí automatického sekvenátoru (LI-COR, lne. Lincoln, Neb, USA). Selektivní amplifikace je provedena podle postupů „dosednutí“ („touch down“) popsaných ve Vos a kol. (1995, Nucleid Acids Res. 23, 4407-4414). -Po ukončení selektivní- amplifikace byly * amplikony odděleny na 25 cm polyakrylamidových gelech složených z 7% Long Ranger ' akrylamidu v prostředí 7 M močoviny a 0,6 x ŤBE, s použitím automatického DNA sekvenátoru Li-COR model 4000L.
.1
Genová mapa diploidního křížence je vytvořena s použitím segregačních dat ze 112
RFLP a 117 AFLP segregačních markérů. Spolusegregační analýzy jsou provedeny s použitím MAPMAKER/EXP 3,0 softwaru (Larider, E.S., Green, P., Albertson, J., Barlow,
A., Daly, M.J. Lincoln, S.E., a Newburg, L 1987. Genomics 1, 174-181) pro určení skupiny • * vazeb každého markéru a lokalizaci každého molekulárního markéru uvnitř každé skupiny vazeb. Jednotlivé skupiny vazeb jsou získány s,použitím dvoubodové analýzy s minimální hodnotou LOD 15 a maximální úrovní rekombiriace 30 %. Potom je k určení lokusu uvnitř ', vazbových skupin použita mnohočetná bodová analýza s limitem LOD 2,0. Výsledná mapa ; (Obr. 1) pokrývá přibližně 1400cM (centimorganů) a má průměrný interval markéru přibližně * cM. Patnáct signálních znaků zůstalo nezařazeno.
Identifikace QTL lokusu asociovaného s expresí rnsaCI genů a s odolností vůči mrazu
QTL lokusy účastnící se , exprese mšaCI genů jsou identifikovány s pomocí MARKER/QTL v 1.1. (Lander, E.S., a Boststein> D. 1989, Genetics 121, 185-199). V mapě vazeb je zjišťována přítomnost QTL lokusů ve specifických oblastech genomu s využitím exprese každého genu jako kvantitativního znaku. Je určeno působení každého QTL ve vztahu ·» . 44 • · 44 « · * 4 • * · ♦ · ·-. »« ·444 • * 4 , « . Λ 4 *4 • 4 9 . ·
44
4 ·»«:«
4, · Λ 4
4 4 jeden k druhému a je určeno procento odchylek v expresi msaCI genu vysvětlované každým QTL. Jako prahové LOD skóre pro identifikaci QTL je považována hodnota 2. *·
Analýzy chladem regulovaného hromadění transkriptů pro každý ze sedmi msaCI genů odhalují velkou genotypovou variabilitu pro jejich expresi ( v několika případech) s 10 až 40 násobnými odchylkami v expresi mezi genotypy (např. viz Obr. 3).
Pro všech 7 msaCI genů byly nalezeny QTL lokusy spojené s variabilitou úrovně transkripce msaCI genu pozorované u různých genotypů, a pro fenotyp LT50 (Tabulkal). Geny hrající důležitou regulační roli v expresi msaCI genů byly nalezeny uvnitř těchto QTL. Počet QTL lokusů spojených s expresí msaCI genů se lišil od 1 (msaCIF) až po 5 (msaClC)., Ve většině případů byly jejich hodnoty LOD velmi významné. Fenotypové odchylky vysvětlené těmito QTL lokusy se lišily v rozmezí od 10 do 60 %. Ve většině případů byla zvýšená exprese a mrazová odolnost, respektive, způsobeny alelou z rodiče M. falacata odolného na chlad.
Jsou identifikovány 3 QTL spojené s odolností vůči mrazu (LT50). Dva z těchto QTL jsou umístěny ve skupině vazeb E v genomové oblasti asociované také s expresí msaCIB a msaCID. , ' '
Bylo zjištěno, že QTL lokusy pro expresi msaCI genů jsou asociované š umístěním, odpovídajících strukturních genů pro msaCIA (viz skupina vazeb D, Obr. 2), msaCID (viz skupina vazeb E, Obr. 2) a msaCIG (skupina vazeb F, Obr. 2). ,
V případě msaCID se RFLP lokus překrývá s expresními QTL pro tři geny; samotný msaCID gen, msaCIA a msaCIB (viz skupina vazeb E, Obr. 2). Tento fakt naznačuje, i£ msáCID je buď regulačním genem, nebo se reguláční gen nachází v jeho sousedství.
Byly pozorovány QTL pro expresi v tkáni korunky a v listové tkáni umístěné ve stejné genotypové oblasti pro msaCIA (mezi 120-130 cm, Obrázek 2, skupina vazeb E) a pro msaCID (viz skupina vazeb E, Obr. 2). Jinak byly lokusy ovlivňující expresi v každém typu tkáně rozdílné. QTL lokusy řídící expresi několika msaCI genů jsou umístěny ve skupinách vazeb B a E, což napovídá běžný regulační mechanismus. Obzvlášť pozoruhodným příkladem je QTL ve skupině vazeb B, který vykazuje vliv na expresi pěti studovaných msaCI genů v listové tkáni (Obr. 2, Tabulka 1). ' Tabulka 1: QTL spojený s mRNA expresí chladem regulovaných genů a odolností vůči mrazu ‘ u diploidu alfalfa. Jsou zde uvedeny skupiny vazeb asociované s genovou expresí, v listech nebo korunce, nebo odolností vůči mrazu (LT5q) spolu s hodnotami LOD. Jsou identifikovány ' ·· ·· • · · • · • ·25 ·· ·<
• .
• ί • .· • ··· • · « · ·· ·· ·· ···· • « · • · · regulační geny, které jsou lokalizovány dó těchto genotypových oblastí. Zvýrazněné geny C4494 a C2186 vykazují homológii s genem CBF1 z Arabidopsis a s genem SCOF-1 ze sóji, v tomto pořadí, u nichž byla prokázána účast na odolnosti vůči chladu. (* údaje nejsou uvedeny na Obr. 2).
| Gen/znak | Vazbová skupina | LOĎ , | Kandidátský regulační gen | Homologie s geny kódujícími | |||
| Korunka | List | Korunka | List | Korunka | List | ||
| msaCIA | D | B | 11 | 3 | msaCIA | C2784 | Serin/threonin- > proteinkináza |
| D | 9 | C2314 | Fosfatáza2C | ||||
| D | 9 | C5047 | Proteinkináza podobná receptóru bohatému na opakování leticinu (LRR) | ||||
| D | 9 | C2250 | GTP vazebný protein (Rás-related) | ||||
| E | 4 | msaCID | i | ||||
| E | E | 4 | 5 i.· •ÍI | C4320 | C4320 | Mitogěnem aktivovaná protein kináza | |
| E | 4 | C271 | Serin protein kináza | ||||
| E | 4 | C948 | Kaseiň kináza I | ||||
| E | 4 ; | C3749 | Protein kináza týkající se R2CDC2+/CDC28 | ||||
| msaCIB | B | 3 | |||||
| E | 4 | msaCID | Etanolamin kináza | ||||
| E | 4 ' | - | C3283 | í. |
i 'i ·· ·· ·· ·· ·· ··· • · O · ·. · · -. t · , • · · · · ··· · · · · ·· · , · · · · · · «· «··· ·· ·· ·· ·:·
| Gen/znak | Vazbová skupina | LOD | Kandidátský regulační gen | Homologie s geny kódujícími | |||
| Korunka | List | Korunka | List | Korunka | List | ||
| F | 5 | C4494 | transkripční faktor s AP2 doménou (CBF1 homolog | ||||
| msaCIC | A | A | 4 | 5 | C4546 | C2595 | Mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAP3 K, Kalretikulin |
| A | 5 | C374 | Peptidyl-Prolyl cis-trans izomeráza | ||||
| A | C3358 | Adenosinkináza | |||||
| A | C2886 | s cyklázou asociovaný protein (CAP) | |||||
| B | B | 6 | 3 | - | ,. i | ||
| G | 6 - | Cl 68 | Transkripční faktor | ||||
| G | 5 | C2420 | Protein podobný ATPáze přenášející Ca2+ | ||||
| G | 5 | C374 | Peptidyl-Prolyl cis-trans izomeráza | ||||
| I* | 5 | ||||||
| J* | K* | 6 | '5 . | ||||
| msaCID | B | 5 | C2784 | Serin/threonin-protein kináza | |||
| E | E | 14 | 8 | msaCID | msaCID | ||
| E | E | 10 | 5 | C5237 | C5237 | Protein 48 cyklu buněčného dělení | |
| E | E | 12 | 8 | C3346 | C3346 | Transkripční - faktor | |
| rozeznávající promotory reagující na etyleh | |||||||
| E | E | 7 | 4 ', | C3283 | C3283 | Etanolamin kináza · | |
| J* | 5 | ||||||
| L* | 6 | ||||||
| msaCIE | H* | B | 5 | 8 | C2784 | Serin/threonin-protein kináza | |
| msaCIF | I* | 3 |
• ·· ·
| MsaCIG LT 50 | F C C | B | 6 6 4 | 4 | msaCIG C2456 G2186 | C2784 | Serin/threonin- proteinkináza 1 .. GTP vazebný protein jádra (RANÍ A) , ' Transkripční faktor s motivem otisk zinku „zinc finger“ (SCOF1) |
| E E | 4 4 - | C5237 C3283 | Protein 48 cyklů buněčného dělení Etanolamin kináza |
t Tl
Příklad 2: ·
Izolace regulačních genů a regulačních sekvencí asociovaných se zkoumanými QTL lokusy. · Obecný popis experimentálního přístupu <
Detekce QTL lokusů, které vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi msaCI genů naznačuje možné umístění regulačních genů v těchto lokusech. Je zmapováno množství exprimováných sekvenčních tagů (EST) na chlad aklimatizovaného alfalfa kódujících genů se , známými funkcemi v regulaci genové exprese. Jsou izolovány a charakterizovány kandidátské regulační geny umístěné uvnitř QTL asociovaných s expresí msaCI genů, a je zkoumána jejich exprese u transgenního alfalfa s cílem odhadnout jejich vliv na genovou expresi regulovanou chladem.
Popis kandidátských regulačních genů
Z knihovny ZgtlO cDNA připravené z mRNA, která byla izolována z korunek tetraploidu alfalfa (M. sativa L. cv. Apica; R. Michaud, C.Richard, C. Willemont a H. Gasser 1983. Can. J. Plant Sci. 63: 547-549) je izolována série EST vykazujících homologii s geny se známými regulačními funkcemi: .
Transkripční faktory (motiv otisk zinku „zinc-finger“ a AP2 proteiny) ' . .
Mitogenem aktivované proteinkinázy (MMK4, MMK3, MMK2,MMK1)
Kalcium dependentm proteinkinázy ,
Serin/threonin protein kináza .
ATPáza přenášející Ca2+
GTP vazebné proteiny
RNA vazebné proteiny Protein fosfatázy (typ 2A a 2C) ’ ·· * ·' · · · · ·· · · · · • ·· · · · · · · · • · ·· ···· · ·, ·
ΠΟ ··· ········
-4*0 ·· ···· ·· ·· ·· · ··
Kalmodulin
14-3-3 proteiny ·
GTPázu aktivující proteiny
Protein adenylylcykláza ,
Fosfolipáza C
Lipoxygenáza
Ca2+vazebné proteiny
Histon deacetyláza . · t
Receptor kináza ,
Fosfatidylinositol 3-kináza Genetické mapování kandidátských regulačních genů
Pomocí PCR amplifíkace jsou připraveny sondy pro specifické regulační geny uvedené v tabulce 2, jsou čištěny na Sepharyl S-2Ó0 MicroSpin kolonách (Amersham Pharmacia Biotech, Oakville, ON) a skladovány při -20 °C. Tyto sondy jsou použity pro Southern hybridizaci k štěpené DNA z F2 diploidních genotypů potomstva křížení, které bylo popsáno ' v příkladě 1. Přečištěné sondy jsou radioaktivně značeny pro zvýšení specifické aktivity pomocí náhodného hexamemího Značení a jsou hybridizovány na -DNA bloty podle standardních protokolů pro RFLP, jak bylo popsáno v příkladě 1 (Sambrook, J., Maniatis, T. a . Fritsch. 1989. Molecular eloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Col Spring Harbor, New York). Regulační geny, které jsou polymorfiií, a které jsou t lokalizovány spolu s jejich domnělými funkcemi založenými na homologii še sekvencemi uvedenými v data bázích GENBANK/EMBL jsou uvedeny v Tabulce 2. : >
Tabulka 2 Polymorfní regulační geny a jejich předpokládaná funkce. Zvýrazněné klony ukazují potenciální kandidátské geny účastnící se regulace msaCI genů nebo odolnosti vůči mrazu (LT50). . ·
| Klon | Homologie k |
| 002 | Obránce proti smrti apoptózou-1 (defender against apoptotic death-1) |
| 003 | Pumilio RNA vazebný protein (pumilio RNA binding protein) |
| 013 | Nukleolin ‘ |
| 023 | vazebný protein EF-„hand“ vápníku (EF-hand calcium binding protein) |
í ·· • .
• · ·
| 027 | MADS transkripční faktor (MADS transcriptional faetor) |
| 057 | AB A-induko váný protein (ABA induced protein) |
| B166 | GTP vazebný protein (GTP binding protein) |
| A168 | Transkripční faktor |
| 083 | GTP vazebný protein (GTP binding protein) |
| B187 | G-box vazebný protein (G-box binding protein) |
| A207 | Protein kináza C (substrát) |
| C221 | Tyrosin fosfatáza |
| A271 | Serin protein kináza |
| C343 | Homeobox protein (Knotted-1)»’ |
| C374 | Peptidyl-Prolyl cis-trans isomeráza |
| C389 | ABA responzivní zesilovač transkripce \ |
| C532 | transkripční faktor s motivem helix-smyčka-helix - * |
| C571 | GTP vazebný protein . ' ... |
| C834 | P72 DEAD box protein ’ , « - |
| C948 | Kasein kináza |
| C973 | Mitogenem aktivovaná proteinkináza (MMK4) |
| C2105 | WRKY3 DNA vazebný protein ‘ |
| C2186 | transkripční faktor s motivem otisk zinku „zinc finger“ (SCOF-1 homolog) · - ' |
| C2250 | GTP vazebný protein (týkající se - Ras) |
| C2314 | Fosfatáza 2C |
| C2352 | Progesteron vazebný homolog |
| C2420 | Protein podobný ATPáze přenášející Ca |
| C2426 | Na etylen citlivý malý GTP vazebný protein |
| C2456 | GTP vazebný protein (RANÍA) ’ |
| C2595 | Kalretikulin |
| C2658 | Proteinkináza s kalmodulinovou doménou (CDPK) |
| C2784 | Serin/threonin protein kináza |
| C2886 | Cykláza-asociováný protein (CAP)' |
| C2939 | Transkripční faktor s AP2 doménou (TINY-podobnost) |
| C2988 | Proteinkináza podobná receptoru bohatému na opakování leucinu (LRR) |
| C3050 | Protein kináza |
• 9
9
9
999 9 • ι 9 · • · · • · · . · ·· · »· ·· · ·· ···· 99 · ·· 99. 99
| C3125 | Protein vážící nukleovou kyselinu |
| C3253 | Receptor kináza - |
| C3268 | Serin/threonin protein kináza |
| C3283 | Etanolamin kináza |
| C3291 | ARG-2 protein vyvolaný(spouštěný) IAA |
| C3346 | Transkripční faktor citlivý na etylen |
| C3358 | Adenosin kináza |
| C3367 | RNA vazebný protein |
| C3506 | Protein kináza - |
| C3520 | Nukleotid vazebný protein |
| C3601 | Ring-H2finger protein / , |
| C3604 | Transkripční faktor |
| C3626 | DNA vazebný protein , |
| C3749 | CDC2+/CDC28-příbuzhá protein kináza R2 |
| C3843 | Fosfatidylinositol 3-kináza |
| €3844 | GTP vazebný protein (RAB-typ) · |
| C4050 | Serin/threonin fosfatáza typ 2A - |
| C4266 | Protein podobný RAC (RHO homolog) |
| C4320 | Mitogenem aktivovaná protein kináza |
| C4438 | 14-3-3 protein |
| C4494 | Transkripční faktor s AP2 doménou (CBF1 homolog) |
| C4546 | Mitogenem aktivovaná proteinkináza (MAP3K) |
| C4622 | Proteinkináza s kalmodulinovou doménou (CDPK) |
| C5047 | Proteinkináza podobná receptoru bohatému na opakování leucinu (LRR) |
| C5206 | Homeobox protein (Knotted-1) |
| C5237 | Protein 48 cyklu buněčného dělení. |
EST sekvence jsou také použity pro vytváření primerů pro amplifikace identifikovaných lokusů jako STS (Sequence Tagged Sites) z DNA od jedinců segregující populace. Pokud jsou výsledné PCR produkty monomorfhí mezi jedinci populace, jsou PCR produkty štěpeny s použitím různých enzymů, aby se zjistil pólymorfismus. Jestliže není odhalen žádný m
polymorfismus sekvenují se jednotlivě PCŘ produkty získané od dvou rodičů,a hledají se SNP (Single Nucleotide Polymorphism). .
Jako RFLP fragmenty jsou lokalizovány kandidátské regulační geny' zde popsané v rámci potomstva F2, jak je popsáno v Příkladě 1, s cílem stanovit, zda jsou umístěny uvnitř QTL lokusů spojených s odchylkami u chladem vyvolané exprese msaCI genů, jak bylo zjištěno v Příkladě 1.
Všechny geny uvedené v Tabulce Ta vyznačené v Tabulce 2 jsou umístěny v oblastech genomu obsahujících QTL lokusy a proto jsou domnělými kandidáty na regulační gerty exprese msaCI genů, vlastnosti LT50, nebo jejich kombinace. Dva z těchto genů, C4494 a C2186, vykazují homologii kCBFl genu z Arabidopsis a SCOF-1 genu ze sóji, v tomto pořadí, u nichž byla prokázána účast na odolnosti vůči chladu (Jaglo-Ottosen, K.R., Gilmour, S.J., Zarka, D.G., Schabenberger, O., a Thomashow, M. F. 1998. Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances fréezing tolerance. Science 280: 104-106.
r
Kim, J.C., Lee, S.H., Chsong, Y.H., Yoo, C.-M., Lee, S.L., Chun, H.J., Yun, D.J., Hong, J.C., Lee, S.Y., Lim, C.O., a Cho, M.J., 2001. Nový, chladem indukovatelný protein s motivem otisk zinku neboli “zinc finger“ ze sóji, SCOF-1, zvyšuje chladovou toleranci u transgenních’' rostlin. The Plant Journal 25: 247-259). Gen C4494 (homolog CBF1) je umístěn v QTL lokusu souvisejícím s expresí msaCIB v listech skupina vazeb F, Obrázek 2), zatímco gen C2186 (homolog SCOF-1) je lokalizován do oblasti obsahující QTL lokus pro LT50 (skupina vazeb C, Obr. 2). Tyto geny kódují chladem indukované transkripční faktory, u nichž bylo jednoznačně prokázáno; že řídí konstitutivní expresi COR (msaCI) genů u transgenních rostlin a zvyšují odolnost vůči mrazu za podmínek na něž nebyly aklimatizovány.
Výsledky také naznačují množství nových zajímavých kandidátských regulačních genů účastnících se exprese genů odolnosti vůči chladu a msaCI genů (tabulka 1, Obr. 2). Například klon C2784, který vykazuje homologii jk serin-threoninproteinkináze je lokalizován do oblasti ve skupině vazeb B, kde se nacházej í QTL lokusy pro expresi msaCI A,. msaCID, msaCIE a msaCIG v listech. V buňkách alfalfa vedl osmotický stres k rychlé aktivaci dvou proteinkináz. Jedna z těchto kináz je homologní k ASKl serin-threoninkináze.1 z Arabidopsis (Munnik, T. a H.J.G. Meijer. 2001. FEBŠ Letters 798: 172-178). Potvrzení úlohy těchto kandidátských regulačních genů může být dosaženo pomocí postupů zde naznačených.
í ·· ·· ·· ·· • ·· · · ·· · · • * · .,_ ·' · ··· · · ♦
2Ί · \ · · - · ·· · · ··
JÁ. ·· ···· ·· ·· ·· ·· s ‘ «
Sekvenování genomových klonů kandidátských regulačních genů a kandidátských regulačních sekvencí. 4 *
Z genomové knihovny vytvořené u EMBL3 fága (Sambrook, J., Maniatis, T. a Fritsch.
1989. Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) jsou s použitím DNA od dvou rodičů zde identifikovaných izolovány EST kandidátských regulačních genů lokalizovaných do jednoho nebo více QTL lokusů spojených s odchylkami v expresi msaCI genů. Každý kandidátský regulační gen jé sekvenován v celém svém rozsahu, který zahrnuje oblasti proti i po směru exprese kódující oblasti, s použitím dideoxynukleotidové řetězové termiriační metody (dideoxýhucleotide chain termination method,_Sambrook, J., Maniatis, T. a Fritsch. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York);
Jsou také provedena srovnání pro alelické formy každého z rodičů, aby byly identifikovány mutace odpovědné za QTL. Potvrzení umístění kandidátských regulačních genů je prováděno pomocí mapování oblastí po směru i proti směru exprese každého regulačního genu na mapě vazeb vytvořené dříve. Pro další charakterizaci jsou1 v komplementových - studiích nebo studiiích s genovým „knock-outem“ použity pouze regulační geny charakterizované přítomností 5'nebo 3'oblastí kólokalizovaných společně spolu se stejným jedním nebo více QTL lokusy.
Změněná exprese kandidátského genu u transgermích rostlin (komplemntační studie a studie genového ,Jknock-outu) , .
Transformace alfalfa je provedena s použitím Agrobacterium tumefaciens, jak bylo ; dříve popsáno v práci Desgagnés a kol. (Desgagnés R., S. Laberge, G. Allard, H Khoudi, Y. Castonguay, J. Lapointe, R. Michaud a L.-P. Vézina. 1994. Plant Cell Tissue Organ Cult 42:129-140). Jsou použity dva přístupy; 1) Konstitutivní exprese kandidátského genu s použitím genové fůze ke konstitutivnímu promotoru, například, ale ne pouze, 35S; a inducibilní exprese. Kódující oblast kandidátského genu je připojena ve čtecím rámci k 35S promotoru a výsledný konstrukt je klonován do binárního expresního vektoru pGA482. *
Kandidátské regulační geny o plné délce (tzn.. kandidátské geny obklopené 5'a 3'oblastmi, které jsou lokalizovány do jednoho nebo více; zde identifikovaných QTL lokusů) spolu s přibližně lkb dlouhými 5'- a Ikb dlouhými 3'- nekódujícími oblastmi, jsou klonovány do binárního expresního vektoru pGA482. Konstrukty obsahující překládanou sekvenci pro jak konstitutivní tak inducibilní expresi jsou použity k transformaci rostlin, které nemají alelu v QTL odpovídajícím expresi zkoumaného znaku (například, ale ne pouze, expresi msaCI7 • · · ·· · • · ··· · • ··· genu) a konstrukty obsahující komplementární sekvenci k sekvenci překládané jsou použity k transformování rostlin, které obsahují alelu v tomto QTL. Transgénní rostliny jsou pěstovány a vystaveny chladovým aklimatizačním podmínkám, což je potřeba pro určení vlivu vnesených překládaných nebo k překládaným sekvencím komplementárních sekvencí genů na expresi jednoho nebo více msaCI genů a na LT50. Tím se potvrdí kandidátský gen jako regulační faktor kontrolující mRNA expresi msaCI genů v oblasti QTL.
Všechny reference, které jsou uvedeny výše, jsou zde zahrnuty tímto odkazem.
Vynález byl popsán s ohledem na výhodná provedení vynálezu. Nicméně,ř odborníkům bude jasné, že lze provést celou řadu odchylek a modifikací, aniž by došlo k odklonu od i
oblasti vynálezu tak, jak zde byl popsán. ,
Claims (3)
1. Způsob identifikace jedné nebo více oblastí vgenomu zkoumaného organismu, které zprostředkovávají expresi jednoho nebo více zkoumaných genů obsahující:
i) identifikaci prvního zkoumaného organismu charakterizovaného tím, že tento zkoumaný organismus vykazuje měřitelnou odpověď na podnět prostředí, nebo jinak vykazuje fenotyp spojený se změněnou genovou expresí spojenou se zkoumaným procesem; ' ii) identifikaci druhého zkoumaného organismu charakterizovaného tím, že · 1 ' zkoumaný druhý organismus: ,
a) postrádá nebo nevykazuje tak silnou odpověď na podnět, jako u prvního zkoumaného organismu;
b) při srovnání s prvním? zkoumaným organismem vykazuje rozdílný fenotyp, přičemž rozdílný fenotyp je spojený se zkoumaným procesem;
c) vykazuje zkoumaný fenotyp, který se segreguje v populaci vznikající křížením prvního zkoumaného organismu; ·
d) nebo je kombinací dvou nebo více z bodů a), b), c) a d);
iii) křížení prvního a druhého zkoumaného organismu s cílem produkovat populaci segregujícího potomstva;
iv) extrahování RNA z každého Segregujícího potomstva a kvaritifikacé hladiny genové exprese jednoho nebo více zkoumaných genů, kde jeden nebo více zkoumaných genů jsou spojeny s odpovědí na podnět prostředí nebo zkoumaný proces;
v) příprava mapy vazeb segregujícího potomstva s použitím jednoho nebo více markérů;
vi) určení vztahu mezi jedním nebo více markéry na mapě vazeb a genovou expresí jednoho'nebo více zkoumaných genů a identifikaci jednoho nebo více lokusů kvantitativního znaku (QTL).
2. Způsob podle nároku 1, kde po kroku křížení (krok iii)), a před krokem extrakce RNA, je segregující potomstvo vystaveno požadovanému podnětu prostředí nebo je charakterizováno jako nacházející se ve specifické vývojové , fázi. * ·, . · · , ·· · · • · ··· ····'' te
Způsob podle nároku 1, kde metoda je použita pro identifikaci jednoho nebo více QTL lokusů shodujících se s transkripěním faktorem nebo jakýmkoli * ’ faktorem řídícím expresi jednoho nebo více zkoumaných genů. ’
Způsob podle nároku 1, kde po kroku určení vztahu (krok vi)) je izolován a charakterizován jeden nebo více genů umístěných v jednom nebo více QTL lokusech. ,
Způsob podle nároku 1, kde v krocích identifikaci (kroky i) a ii)) je podnět prostředí nebo zkoumaný proces vybrán ze skupiny obsahující:
biotický stres;
abiotický stres; ' ’ změnu minerální výživy; . . ;
změnu v kvalitě světla nebo světelného toku; * - * odpověď vyvolaná přidáním jedné nebo více exogenních chemikálií;
' : ' “ ji ' ’ .
jakýkoli stres, který vede ke změně úrovně endogenních chemických látek u rostliny; · ; ! vývojové, chemické nebo < enviromentální řízení genové exprese · během embryogeneze; ,4 organogeneze;
stárnutí; . * . í ‘ dozrávání; · * období klidu; r , klíčení;
cirkadiánní, ultradiánní a další vnitrní rytmy;
dosažitelný výtěžek; . , i tvorba semen;
foto syntetická translokace; ’ <.
změny v kapacitě spotřeby a zdroje uvedené rostliny;
změny v indexu listové plochy; \ změny v poměru podzemních a nadzemních částí rostliny;
změny v nutriční hodnotě sklizeného materiálu;
změny v morfologii rostliny; * . · změny v rychlosti buněčného cyklu; 5 . změny v rychlosti buněčné diferenciace;, ‘ změny ve velikosti buněk; _ ,f $
i . ·· »i ·· ·· ·· ···· ·««· ·«· 9 « ’ · • 4» ·,····· · · « • '9,9 '9 9 9 9 · · · · ·· ··♦♦ 99 ·99 . ·· ·· ' ?
- změny v životním cyklu rostliny; a ’ '
I
- genomové přeskupování.
6. Způsob podle nároku 1, kde v kroku určení (krok vi)) je identifikován markér v QTL lokusu.
7. Použití markéru podle nároku 6 pro sledování potomstva určitého organismu. ’
8. Použití markéru podle nároku 6 pro určení hybridnosti určitého organismu.
9. Použití markéru podle’ nároku 6 pro identifikaci odchylky souvisejícího' fenotypového a/nebo expresního znaku.
10. Použití markéru podle nároku 6 pro konstrukci genetické mapy.
11. Použití markéru podle nároku 6 pro identifikaci individuálního potomstva křížení. '
12. Použití markéru podle nároku 6, kde markér je DNA markér, a daný DNA markér je použit pro izolaci genomových DNA sekvencí obklopujících DNA sekvenci gen kódující nebo gen nekódující..
13. Použití markéru podle nároku 12, kde daná genomová sekvence je promotor nebo regulační sekvence. . '
14. Použití markéru podle nároku 6 pro selekci s pomocí markéru; klonování založené na mapování, potvrzení hybridnosti, určení „fingerprintingu“, genotypizaci, jako prd alelu specifického markéru; nebo-jako kombinaci daných možností.
15. Použití markéru podle nároku 6 u rostlin.
16. Způsob identifikace regulačního genu, který zprostředkuje expresi zkoumaného genu obsahující:
i) identifikaci jednoho nebo více lokusů kvantitativních znaků (QTL), které , vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více ‘ zkoumaných genů; · ii) mapování jednoho nebo více regulačních genů; iii) určení, zda jeden nebo více regulačních genů jsou lokalizovány do oblasti jednoho nebo více QTL lokusů;
iv) izolaci jednoho nebo více‘regulačních genů uvnitř jednoho nebo více QTL lokusů; a
v) sekvenování jednoho nebo víceregulačních genů izolovaných v kroku iv). ‘ ’ • · '·* , ·· ·· ·· ···· • · · · · · • · »· · · · · • · · · · · · · ·· · • · ··· · ·· ·· ·· ··
17. Způsob identifikace regulačního genu, který zprostředkuje expresi zkoumaného f · genu, sestávající z: ’ '
i) identifikace jednoho nebo více lokusů kvantitativního znaku (QTL), který vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více zkoumaných genů; a ii) izolaci jednoho nebo více regulačních genů uvnitř jednoho nebo více .
QTL lokusů. .
iii) sekvenování regulačního genu. ’ ‘
18. Způsob identifikace regulační sekvence, která zprostředkovává expresi zkoumaného \
- ‘ < k genu, sestávající z:
i) identifikace jednoho nebo více lokusů kvantitativního znaku (QTL)’ které vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více zkoumaných genů; f ' ii) mapování jednoho nebo více regulačních genů;
iii) určení, zda tento jeden nebo více regulačních genů je lokalizován do oblasti jednoho nebo více QTL;
* V ' ' iv) izolaci jednoho nebo více / regulačních genů .ruvnitř jednoho . nebo více
QTL lokusů; a v) sekvenování jednoho nebo více regulačních genů spolu s regulačními sekvencemi jednoho nebo více regulačních genů izolovaných v kroku iv).
19. Způsob identifikace regulační sekvence, která zprostředkuje expresi; zkoumaného
V / genu, sestávající z: ' ' ; ·
i) identifikace jednoho nebo více lokusů kvantitativního znaku (QTL), které vysvětlují podstatnou část odchylek v expresi jednoho nebo více zkoumaných genů; a ii) izolaci jednoho nebo více regulačních genů uvnitř jednoho nebo více QTL lokusů.
iii) sekvenování regulačních genů včetně regulačními sekvencemi.
20. Způsob zprostředkování odpovědi zkoumaného organismu na podnět prostředí obsahující transformaci zkoumaného organismu regulačním genem, který byl identifikován způsobem podle nároku 16.
4 4 4 4 · * ·· · · · 4 · 4 • · · · »44 4 4 · • 4 '♦ 4 · 4 4 · · · · ·
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
4 4 4 ·'·· · · ·4 ·
44 ·4·· Λ 44 .44· 44 44
21. Způsob zprostředkování odpovědi zkoumaného organismu na podnět prostředí t obsahující transformaci zkoumaného organismu pomocí regulačního genu, který byl' identifikován způsobem podle nároku 17.
22. Způsob zprostředkování vývoje zkoumaného organismu obsahující transformaci zkoumaného organismu regulačním genem, který byl identifikován způsobem podle nároku 16.
23. Způsob zprostředkování vývoje zkoumaného organismu obsahující transformaci zkoumaného organismu regulačním genem, který byl identifikován způsobem podle nároku 17.
24. Způsob zprostředkování odpovědi zkoumaného organismu na podnět prostředí, obsahující transformaci zkoumaného* organismu regulační sekvencí, která byla identifikována způsobem podle nároku 18, napojené ke zkoumanému genu.
25. Způsob zprostředkování odpovědi zkoumaného organismu na podnět prostředí obsahující transformaci zkoumaného’ organismu regulační sékvencí, která byla identifikována způsobem podle nároku 19, napojené ke zkoumanému genu. >
26. Způsob zprostředkování vývoje zkoumaného organismu obsahující transformaci ' λ -3 zkoumaného organismu regulační sekvencí, která byla identifikována způsobem podle nároku 18, napojené ke zkoumanému genu.
27. Způsob zprostředkování vývoje zkoumaného organismu obsahující · transformaci ’ zkoumaného organismu regulační sekvencí, která byla identifikována způsobem podle nároku 19, napojené ke zkoumanému genu.
28. Způsob podle nároku 16, kde krok izolace zahrnuje získám regulačního genu s použitím pozičního klonování.
29. Způsob podle nároku 17, kde krok; izolace zahrnuje získání regulačního genu s použitím pozičního klonování. . .
30. Způsob podle nároku 18, kde krok izolace zahrnuje získání regulační sekvence s použitím pozičního klonování,
31. Způsob podle nároku 19, kde krok izolace zahrnuje získání regulační sekvence s použitím pozičního klonování.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US21876500P | 2000-07-17 | 2000-07-17 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2003146A3 true CZ2003146A3 (cs) | 2003-08-13 |
Family
ID=22816420
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2003146A CZ2003146A3 (cs) | 2000-07-17 | 2001-07-17 | Způsob identifikace regulačního místa kontrolujícího úroveň genových přepisů a produktů založená na mapování |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030180761A1 (cs) |
| EP (1) | EP1366184A2 (cs) |
| JP (1) | JP2004512828A (cs) |
| CN (1) | CN1474875A (cs) |
| AU (2) | AU2001276208B2 (cs) |
| BR (1) | BR0112707A (cs) |
| CA (1) | CA2422752C (cs) |
| CZ (1) | CZ2003146A3 (cs) |
| HU (1) | HUP0302058A3 (cs) |
| IL (1) | IL153985A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA03000495A (cs) |
| NZ (1) | NZ523678A (cs) |
| PL (1) | PL361279A1 (cs) |
| RU (1) | RU2268946C2 (cs) |
| WO (1) | WO2002012551A2 (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003253936A (ja) * | 2002-02-28 | 2003-09-10 | Sony Corp | 車両、電子キー、データ処理装置及び車両管理方法 |
| WO2003100557A2 (en) | 2002-05-20 | 2003-12-04 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for subdividing a complex disease into component diseases |
| AU2003303502A1 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-29 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for associating genes with traits using cross species data |
| WO2004109447A2 (en) | 2003-05-30 | 2004-12-16 | Rosetta Inpharmatics Llc | Computer systems and methods for identifying surrogate markers |
| US20070038386A1 (en) * | 2003-08-05 | 2007-02-15 | Schadt Eric E | Computer systems and methods for inferring casuality from cellular constituent abundance data |
| WO2005107412A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-17 | Rosetta Inpharmatics Llc | Systems and methods for reconstruction gene networks in segregating populations |
| WO2006131925A2 (en) * | 2005-06-10 | 2006-12-14 | Quark Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides and methods of use thereof for treatment of fibrotic conditions and other diseases |
| EP1947198A1 (en) * | 2007-01-18 | 2008-07-23 | Syngeta Participations AG | Maize plants characterised by quantitative trait loci (QTL) |
| RU2560599C2 (ru) * | 2008-01-18 | 2015-08-20 | Зингента Партисипейшнс Аг | Растения кукурузы, отличающиеся локусам количественных признаков qtl |
| EP2315851B1 (en) * | 2008-08-21 | 2019-06-19 | China Agricultural University | Genetic loci associated with head smut resistance in maize |
| US11869671B1 (en) | 2011-09-14 | 2024-01-09 | Cerner Innovation, Inc. | Context-sensitive health outcome surveillance and signal detection |
| US11380440B1 (en) * | 2011-09-14 | 2022-07-05 | Cerner Innovation, Inc. | Marker screening and signal detection |
| RU2729364C1 (ru) * | 2019-12-05 | 2020-08-06 | Общество С Ограниченной Ответственностью Компания "Соевый Комплекс" | Способ оценки селекционного материала по генотипу для подбора желательных родительских пар, идентификации желательных генотипов из популяций и оценки селекционных линий |
| CN115216559A (zh) * | 2022-09-20 | 2022-10-21 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | 紫花苜蓿叶面积相关的snp分子标记组合及应用 |
| CN119028425B (zh) * | 2024-08-01 | 2025-04-25 | 四川农业大学 | 一种基于代表性群体进行全基因组选择育种的方法 |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5689035A (en) * | 1995-09-26 | 1997-11-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Brown stem rot resistance in soybeans |
| NZ503416A (en) * | 1997-09-08 | 2003-02-28 | Warner Lambert Co | A method for determining the in vivo function of dna coding sequences |
| AU1927699A (en) | 1997-12-19 | 1999-07-12 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide polymorphisms in soybean |
| WO1999067367A1 (en) * | 1998-06-22 | 1999-12-29 | Regents Of The University Of Minnesota | DNA ENCODING OAT ACETYL CoA CARBOXYLASE |
| AU6277599A (en) * | 1998-10-01 | 2000-04-17 | Monsanto Company | Methods for breeding for and screening of soybean plants with enhanced yields, and soybean plants with enhanced yields |
| US6368806B1 (en) * | 2000-10-05 | 2002-04-09 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Marker assisted identification of a gene associated with a phenotypic trait |
| US20040091933A1 (en) * | 2001-07-02 | 2004-05-13 | Roland Stoughton | Methods for genetic interpretation and prediction of phenotype |
-
2001
- 2001-07-17 IL IL15398501A patent/IL153985A0/xx unknown
- 2001-07-17 WO PCT/CA2001/001028 patent/WO2002012551A2/en not_active Ceased
- 2001-07-17 CA CA2422752A patent/CA2422752C/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-17 AU AU2001276208A patent/AU2001276208B2/en not_active Ceased
- 2001-07-17 MX MXPA03000495A patent/MXPA03000495A/es not_active Application Discontinuation
- 2001-07-17 EP EP01953717A patent/EP1366184A2/en not_active Ceased
- 2001-07-17 US US10/333,150 patent/US20030180761A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-17 HU HU0302058A patent/HUP0302058A3/hu unknown
- 2001-07-17 AU AU7620801A patent/AU7620801A/xx active Pending
- 2001-07-17 CN CNA018157661A patent/CN1474875A/zh active Pending
- 2001-07-17 CZ CZ2003146A patent/CZ2003146A3/cs unknown
- 2001-07-17 PL PL01361279A patent/PL361279A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2001-07-17 RU RU2003104785/13A patent/RU2268946C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-07-17 JP JP2002517835A patent/JP2004512828A/ja active Pending
- 2001-07-17 NZ NZ523678A patent/NZ523678A/xx unknown
- 2001-07-17 BR BR0112707-1A patent/BR0112707A/pt not_active IP Right Cessation
-
2007
- 2007-10-25 US US11/923,946 patent/US8090541B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2002012551A3 (en) | 2003-10-02 |
| CN1474875A (zh) | 2004-02-11 |
| CA2422752A1 (en) | 2002-02-14 |
| JP2004512828A (ja) | 2004-04-30 |
| HUP0302058A3 (en) | 2005-11-28 |
| US20030180761A1 (en) | 2003-09-25 |
| AU7620801A (en) | 2002-02-18 |
| CA2422752C (en) | 2010-10-12 |
| US8090541B2 (en) | 2012-01-03 |
| NZ523678A (en) | 2004-12-24 |
| EP1366184A2 (en) | 2003-12-03 |
| US20080233574A1 (en) | 2008-09-25 |
| HUP0302058A2 (hu) | 2003-09-29 |
| RU2268946C2 (ru) | 2006-01-27 |
| AU2001276208B2 (en) | 2007-02-01 |
| WO2002012551A2 (en) | 2002-02-14 |
| PL361279A1 (en) | 2004-10-04 |
| BR0112707A (pt) | 2004-01-13 |
| MXPA03000495A (es) | 2004-08-12 |
| IL153985A0 (en) | 2003-07-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8090541B2 (en) | Map-based genome mining method for identifying regulatory loci controlling the level of gene transcripts and products | |
| Frewen et al. | Quantitative trait loci and candidate gene mapping of bud set and bud flush in Populus | |
| Kim et al. | Identification of candidate genes associated with fertility restoration of cytoplasmic male-sterility in onion (Allium cepa L.) using a combination of bulked segregant analysis and RNA-seq | |
| Collins et al. | An ALMT1 gene cluster controlling aluminum tolerance at the Alt4 locus of rye (Secale cereale L.) | |
| Marfil et al. | Phenotypic instability and epigenetic variability in a diploid potato of hybrid origin, Solanum ruiz-lealii | |
| Handa et al. | Dissecting of the FHB resistance QTL on the short arm of wheat chromosome 2D using a comparative genomic approach: from QTL to candidate gene | |
| Li et al. | Fine mapping and candidate gene analysis of two loci conferring resistance to Phytophthora sojae in soybean | |
| CN117812999A (zh) | 鉴定、选择和产生炭疽茎腐病抗性作物的方法 | |
| AU2001276208A1 (en) | Map-based genome mining method for identifying gene regulatory loci | |
| Pagliarani et al. | Fine mapping of the rosy apple aphid resistance locus Dp-fl on linkage group 8 of the apple cultivar ‘Florina’ | |
| BR112016013111B1 (pt) | Métodos de identificação e/ou seleção de planta de milho | |
| BR112017002448B1 (pt) | Método de identificação de planta de milho com resistência à helmintosporiose do milho e método de introgressão de alelos de qtl em plantas de milho | |
| JP2011509663A (ja) | 量的形質遺伝子座により特徴付けられたトウモロコシ植物 | |
| Książkiewicz et al. | Molecular marker resources supporting the Australian lupin breeding program | |
| Guajardo et al. | Breeding rootstocks for Prunus species: Advances in genetic and genomics of peach and cherry as a model | |
| EP1655380A2 (en) | Map-based genome mining method for identifying regulatory loci controlling the level of gene transcripts and products | |
| US10041089B1 (en) | Resistance alleles in soybean | |
| HK1091870A (en) | Map-based genome mining method for identifying regulatory loci controlling the level of gene transcripts and products | |
| BR112016026973B1 (pt) | Método para a criação de uma população de plantas de soja com resistência melhorada ao nematóide de cisto de soja (scn) de raça 1 | |
| Namkoong et al. | Application of genetic markers to forest tree species: Draft report to IPGRI of the project Developing Decision-making Strategies on priorities for conservation and use of forest genetic resources | |
| US20250241254A1 (en) | Novel genetic loci associated with disease resistance in soybeans | |
| Tsutsumi et al. | Genes expressed in the overwinter buds of gentian (Gentiana spp.): Application to taxonomic, phylogenetic, and phylogeographical analyses | |
| Warusawithana | Gene duplication fate in a genetic pathway context: an examination of the trichome initiation pathway in the allopolyploid genus Pachycladon (Brassicaceae): a thesis presented in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy in Plant Biology at Massey University, Manawatu, New Zealand | |
| Frercks et al. | Allele Mining and Candidate Gene Identification in Cherries: Basis for Crop Improvement | |
| Begum | Classical and molecular cytogenetics of some dendrobium species from Bangladesh |