CZ20031570A3 - Nové fibroblastové růstové faktory a farmaceutické přípravky, které je obsahují - Google Patents

Description

Nové fibroblastové růstové faktory a farmaceutické přípravky, které je obsahují

Tato přihláška si nárokuje prioritu z prozatímní přihlášky USA č. 60/251,837 podané 8. prosince 2000, která je formou odkazu zahrnuta v plném rozsahu.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových sekvencí nukleových kyselin a nových polypeptidů a jejich regulátorů, zejména fibroblastových růstových faktorů (FGF), výhodně FGF-20 a FGF-23. FGF představují třídu polypeptidů, které se podílejí na vývoji, diferenciaci a morfogenezi, např. účastí se signalizace mezi buňkami a působí na proliferaci buněk. FGF podle vynálezu, jejich fragmenty a deriváty mají jednu z biologických aktivit, jako je: podpora hojení ran, podpora přežívání neuronů, stimulace buněčné proliferace, např. proliferace kmenových buněk, fibroblastů, neuronů, gliových buněk, oligodendrocytů, Schwannových buněk, nebo odpovídajících prekurzorových buněk, modulace diferenciace buněk, indukce embryonálního vývoje, stimulace růstu neuritů, zlepšení regenerace po poškození nervu nebo neuronu, stimulace myelinizace, stimulace angiogeneze, vazebná aktivita k receptoru, modulace tumorigeneze a další.

Dosavadní stav techniky

Fibroblastové růstové faktory hrají důležitou roli v celé řadě biologických funkcí, jako je např. proliferace a diferenciace buněk a vývoj.

• · • · • · · · • · · · • · · · · • · · · • · · · ⁴

Podstata vynálezu

Byly identifikovány nové nukleové kyseliny, polypeptidové sekvence a regulátorové nukleové kyseliny, které kódují fibroblastové růstové faktory (FGF), výhodně FGF-20 (označený jako FGF-21 v prozatímní patentové přihlášce US 60/251,837 podané 8. prosince 200, která je celá zahrnuta formou odkazu a jejíž priority se dovolává předkládaná přihláška) nebo FGF-23 (který byl ve výše zmíněné prozatímní přihlášce označen FGF-22), což je třída polypeptidů zapojených do vývoje, diferenciace a morfogeneze, např. účastí v signalizaci mezi buňkami a buněčné proliferaci. FGF podle předkládaného vynálezu, jejich fragmenty a jejich deriváty mají jednu nebo více z následujících biologických aktivit, přičemž tento výčet není omezující: FGF aktivita, FGF-specifická imunogenní aktivita. Podle předkládaného vynálezu byly identifikovány alespoň dvě nové třídy FGF, a sice FGF-20 a FGF-23.

FGF aktivita znamená v předkládané přihlášce aktivitu jako je např. podpora hojení ran, podpora přežívání neuronů, stimulace buněčné proliferace, např. proliferace kmenových buněk, fibroblastů, neuronů, gliových buněk, oligodendrocytů, Schwannových buněk, nebo odpovídajících prekurzorových buněk, modulace diferenciace buněk, indukce embryonálního vývoje, stimulace růstu neuritů, zlepšení regenerace po poškození nervu nebo neuronu, stimulace angiogeneze, vazebná aktivita tumorigeneze a další.

FGF-specifická imunogenní aktivita znamená, že např. FGF polypeptid vyvolá imunologickou reakci, která je selektivní pro FGF, např. tedy imunologickou reakci selektivní pro savčí FGF-20. Takže stimulace protilátek, T lymfocytů, makrofágů, B lymfocytů, dendritických buněk apod. aminokyselinovou sekvencí myelinízace, k receptoru, stimulace modulace • · • · · ·

- 3 vybranou ze savčích FGF, např. FGF na obr. 1 a 2, je specifická imunogenní aktivita. Tyto reakce mohou být měřeny rutinním způsobem.

FGF, jako je například FGF-20 nebo FGF-23, je úplný („full-legth) savčí polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci, která může být získána z přírodního, a který má jednu nebo více z výše uvedených aktivit. FGF může mít např. sekvenci uvedenou na obr. 1 a 2, mající otevřený čtecí rámec začínající iniciačním kodonem a končící stop kodonem. Zahrnuje jak přirozeně se vyskytující normální, přirozeně se vyskytující mutantní a přirozeně se vyskytující polymorfní, a to včetně jednonukleotidových polymorfismů (SNP), sekvence. Přírodní zdroje zahrnují např. živé buňky, jako jsou např. buňky získané z tkáně nebo celé organismy, kultivované buněčné linie, zahrnující primární a imortalizované buněčné linie, tkáně odebrané biopsií apod.

Předkládaný vynález se také týká fragmentů savčích FGF. Fragmenty jsou výhodně biologicky účinné. Termínem „biologicky účinný je míněno to, že polypeptidový fragment projevuje aktivitu v živém systému nebo se složkami živého systému. Biologická aktivita zahrnuje aktivity výše uvedené, např. FGF-aktivitu, jako je například vazba na FGF-receptor, a FGF-imunogenní aktivita.

Fragmenty mohou být připraveny jakoukoliv vhodnou metodou, jaká je odborníkům známa, např. chemickou syntézou, genetickým inženýrstvím, jako produkty štěpení, apod. Biologický fragment FGF je polypeptid, který má na karboxy-konci nebo amino-konci proteinu odstraněnou nebo modifikovanou aminokyselinovou sekvenci.

Kterýkoliv z veřejnosti dostupných fragmentů nukleových kyselin a fragmentů polypeptidů FGF-20 a FGF-23 nebo fragmenty • ·

- 4 s nimi homologní, jsou z předkládaného vynálezu vyloučeny, např. g5762262, což je podobná sekvence identifikovaná v Xenopus laevis.

Nukleotidové a aminokyselinové sekvence veřejně dostupných nukleových kyselin mohou být identifikovány tak, že se prohledají veřejně přístupné databáze.

Předkládaný vynález se také týká FGF-20, který má dedukovanou sekvenci aminokyselin 1 až 211, jak je uvedena na obr. 1, a FGF-23, který má dedukovanou sekvenci aminokyseliny 1 až 169, jak je uvedena na obr. 2. FGF-20 má predikovanou molekulovou hmotnost přibližně 23,5 kD a predikovaný pí přibližně 9,25. FGF-23 má predikovanou molekulovou hmotnost přibližně 19,6 kD a predikovaný pí přibližně 12,32.

Stupeň (míra) identity pro proteiny znamená podíl počtu totožných aminokyselinových zbytků k celkovému počtu aminokyselinových zbytků v proteinu: Stupeň (míra) podobnosti znamená podíl součtu počtu totožných aminokyselinových zbytků a počtu konzervativně substituovaných aminokyselin (jako například V za L apod.) k celkovému počtu aminokyselinových zbytků. Pro DNA identitu je to samé jako podobnost a znamená počet totožných nukleotidů ku celkové délce (tj. celkovému počtu nukleotidů).

FGF polypeptidy podle vynálezu, např. polypeptidy mající aminokyselinovou sekvenci jak je uvedena na obr. 1 a 2, mohou být analyzovány jakýmikoliv odborníkovi známými metodami pro identifikaci dalších strukturálních a/nebo funkčních domén v polypeptidu, včetně úseků procházejících membránou, hydrofobních úseků. Například FGF polypeptidy mohou být analyzovány metodami popsaným v Kyte a Doolittle, J. Mol. Biol. 157: 105,1982, EMBL Protein Predict., Rošt a Sander,

Proteins, 19: 55-72,1994.

• ·

- 5 Další homology FGF podle předkládaného vynálezu mohou být získány ze savčích a jiných než savčích zdrojů různými metodami. Například hybridizace s oligonukleotidy odvozenými ze sekvence na 1 a 2 může být využita pro selekci homologů, např. postupem podle všeobecně známé příručky Sambrook et al., Molecular Cloning, kapitola 11, 1989.

Takové homology mají různý stupeň nukleotidové a aminokyselinové sekvenční identity a podobnosti s GEN. K vhodným savčím organismům patří např. hlodavci, myši, laboratorní potkan, křečci, opice, prasata, krávy, apod., k jiným vhodným organismům jiným než savcům patří např. obratlovci, bezobratlí, Brachydanio rerio („Zebra fish), kuře, Drosophila, C. elegans, Xenopus, kvasinky jako například S. pombe, S. cerevisiae, škrkavky, prokaryota, a také rostliny, Arabidopsis, viry, artemia, apod.

Vynález se také týká FGF-specifických aminokyselinových sekvencí, např. definovaných aminokyselinových sekvencí vyskytujících se konkrétně v sekvenci na obr. 1 a 2, konzervativních aminokyselinových motivů nalézajících se v polypeptidech FGF podle předkládaného vynálezu. Srovnání s příbuznými proteiny, jako například s jinými příbuznými FGF (viz např. Venkataraman et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 96: 3658-3663,1999), může být využito pro selekci sekvencí specifických pro FGF.

Například proteinové sekvence FGF-20 a FGF-23 byly porovnány a aminokyselinové motivy byly generovány na základě konzervativních úseků homologie ukázaných na obr. 1 a 2. Předkládaný vynález se týká jakékoliv nukleové kyseliny nebo odpovídající polypeptidové sekvence, např. polypeptidu obsahujícího tři nebo více konzervativních zbytků nebo homologních zbytků, jako například úseky LYGS, HFLP, VQGTR,

RIEENGHNTY, QFEENWYNTY, AGTPSA, AAERSA apod. Další specifické a/nebo konzervativní aminokyselinové sekvence mohou být zjištěny rutinním způsobem, např. tím, že se prohledává genová/proteinová databáze s použitím souboru počítačových programů BLAST. FGF-specifické aminokyselinové sekvence nebo motivy mohou být užitečné pro přípravu peptidů jakožto antigenů pro vyvolání pro ně specifické imunitní reakce. Protilátky získané takovou imunizací mohou být použity jako specifické sonda pro savčí FGF protein pro diagnostické nebo výzkumné účely.

Jak již bylo uvedeno, polypeptidy podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat různé aminokyselinové sekvence pro FGF, např. úplnou, tzv. „full-length sekvenci (t j . sekvenci mající iniciační kodon a stop kodon, jak je ukázáno na obr 1 a 2, zralou aminokyselinovou sekvenci (t j. sekvenci, kdy FGF polypeptid je vytvořen jako prekurzor, který je zpracován na zralý polypeptid) nebo její fragmenty. Použitelné fragmenty zahrnují např. fragmenty obsahující nebo sestávající se v podstatě z jakýchkoliv výše uvedených domén a specifických a konzervativních aminokyselinových sekvencí.

Fragment FGF polypeptidu podle předkládaného vynálezu je vybrán tak, aby měl specifickou biologickou aktivitu, např. vazebnou aktivitu k FGF receptoru nebo imunogenní aktivitu. Měření těchto aktivit je popsáno níže a v příkladech.

Tyto peptidy mohou také být identifikovány a připraveny jak bylo popsáno v dokumentu EP 496 162. Použitelné fragmenty obsahují nebo sestávají v podstatě z přibližně úseku devíti souvislých aminokyseliny, výhodně přibližně 10, 15, 20, 30, 40, apod. souvislých aminokyselin z obr. 1 a 2.

Polypeptid podle vynálezu má také 100% nebo nižší aminokyselinovou sekvenční identitu s aminokyselinovými • · • · • · · ·

- 7 identita která se sekvencemi uvedenými na obr.. 1 a 2.

Pro účely následujícího popisu: Sekvenční znamená, že stejný nukleotid nebo aminokyselina, vyskytuje v sekvenci uvedené na obr. 1 a 2 se také vyskytuje v odpovídající poloze srovnávané sekvence. Polypeptid mající méně než 100% sekvenční identitu s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 1 a 2 může obsahovat různé substituce z přirozeně se vyskytujících sekvencí, včetně substitucí homologních a nehomologních aminokyselin. Příklady homologních aminokyselinových substitucí jsou ukázány dále. Součet totožných a homologních zbytků dělený celkovým počtem zbytků v sekvenci, ve které je FGF polypeptid srovnáván, se rovná procentům sekvenční podobnosti. Pro účely výpočtu sekvenční identity a podobnosti se provede přiřazení sekvencí („alignment) a sekvenční identita/podobnost se vypočte jakýmkoliv způsobem, který je odborníkům znám, např. užitím algoritmů, počítačových programů apod., včetně např. programů FASTA, BLAST. Polypeptid mající sekvenční identitu menší než 100% s aminokyselinovou aminokyselinovou sekvencí na obr. 1 a 2 může mít přibližně 99%, 98%, 97%, 95%, 90,5%, 90%, 85%, 70% nebo nižší, např. až přibližně 60% sekvenční identitu.

Předkládaný vynález se také týká muteinů FGF polypeptidů FGF-21 a FGF-23, tj. kteréhokoliv polypeptidů, který má aminokyselinovou sekvence, která se sekvenčně liší od aminokyselinové sekvence získatelné z přírodního zdroje (fragment savčího FGF se neliší sekvenčně od přirozeně se vyskytujícího FGF, ačkoliv se liší počtem aminokyselin). Takže muteiny FGF polypeptidů obsahují substituce aminokyselin, inzerce a delece, a také obsahují aminokyseliny, které se v přírodě nevyskytují.

• ·

Muteiny aminokyselinové sekvence FGF podle vynálezu mohou také být připraveny na základě vyhledávání homologie v genové databance, např. Genbank, EMBL. Vyhledávání sekvenční homologie může být uskutečněn s použitím různých metod, obsahující algoritmy popsané např. v rodině počítačových programů BLAST, Smith-Watermanův algoritmus, apod. Muteiny mohou být zavedeny do sekvence tím, že se mezi polypeptidy identifikují a přiřadí aminokyselinové domény, které jsou totožné a/nebo homologní, a pak se na základě takového porovnání modifikují aminokyseliny. Například FGF podle předkládaného vynálezu sdílí sekvenční identitu s různým známými formami FGFS, které popsali např. Venkataraman et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 96: 3658-3663,1999. Porovnání těchto polypeptidů, obzvláště v oblasti konzervativních aminokyselinových zbytků substituovaných aminokyselin identifikovaných v tabulce 1 publikace Venkataramana et al., může pomoci rozpoznat zbytky, jejichž modifikace by podle očekávání mohla omezit, snížit nebo zcela vyloučit biologickou aktivitu FGF, jako například vazebnou aktivitu k receptoru apod. Například když porovnání odhalí totožné aminokyseliny zachované mezi dvěma nebo více doménami, lze očekávat, že eliminace nebo substituce takových aminokyselin nepříznivě ovlivní biologickou aktivitu polypeptidů.

Aminokyselinové substituce mohou být vytvořen nahrazením jedné homologní aminokyseliny jinou. Homologní aminokyseliny mohou být definovány na základě velikosti postranního řetězce a stupně polarizace, včetně malých nepolárních: cystein, prolin, alanin, threonin, malý polárních: serin, glycin, aspartát, asparagin, velkých polárních: glutamát, glutamin, střední polaritou: tyrosin, nepolárních: fenylalanin, histidin, methionin, lysin, arginin, se tryptofan, velkých leucin, izoleucin, valin. Homologní kyseliny mohou také být • ·

- 9 seskupeny takto: polární R skupiny bez náboje, glycin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, glutamin, kyselé aminokyseliny (záporně nabité), asparagová kyselina a glutamová kyselina, bazické aminokyseliny (pozitivně nabité), lysin, arginin, histidin. Homologní aminokyseliny také zahrnují aminokyseliny, které popsal Dayhoff v práci Atlas of Protein Sequence and Structure, 5, 1978, a Argos v EMBO J. , 8, 779-785, 1989.

Vynález se týká muteinů polypeptidů a muteinů nukleových kyselin kódujících takové polypeptidy. Předkládaný vynález se tedy týká nukleotidových sekvencí z obr. 1 a 2, přičemž nukleové kyseliny kódují polypeptid a jedna nebo více aminokyselinových poloh je substituováno nebo odstraněno nebo obojí a polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou má biologickou aktivitu, jako například podpora regenerace nervu nebo neuronového poškození. Mutein polypeptidů a jeho odpovídající nukleotidová kódující sekvence mohou mít aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedena na obr.

nebo více poloh jsou aminokyselinami, např. kde jsou 1, 5, 10, 15 nebo 20 substitucí. Jak modifikace ovlivňuje uvedené aktivity, může být měřeno podle metod popsaných výše, níže a jak odborník v oboru ví. v oboru jsou známy například různé metody testování FGF aktivity, včetně např. testů, které měří přežívání neuronů a další neurotrofické aktivity, jako jsou například aktivity popsané v příkladech a v práci autorů Kanda et al., Int. J. Devl. Neuroscience, 12 (3): 191-200, 1999 a vazebné testy FGF-receptoru.

a 2, kromě toho, že jedna substituovány homologními

Jak bylo uvedeno, aminokyselinové substituce mohou také být vytvořeny na základě analogie k dalším příbuzným FGF. Další mutace mohou být vybrány rutinně modifikací nebo mutací • · · ·

- 10 nukleotidové sekvence z obr. 1 a 2 a selekcí mutací, které ovlivní jednu nebo více aktivit, např. měřením aktivity podle metod a příkladů popsaných níže.

Savčí FGF podle předkládaného vynálezu, jeho fragmenty nebo substituované polypeptidy, mohou také zahrnovat různé modifikace, kdy takové modifikace zahrnují lipidové modifikace, methylaci, fosforylaci, glykosylaci, kovalentní modifikace (např. R-skupiny aminokyseliny), aminokyselinové substituce, aminokyselinové delece nebo adice aminokyselin. Modifikace polypeptidu mohou být uskutečněny podle různých metod, včetně rekombinantních, syntetických, chemických, apod.

Polypeptidy podle předkládaného vynálezu (např. úplné, jejich fragmenty, jejich mutace) mohou být použity různými způsoby, např. v testech, jako imunogeny pro protilátky, jak popsáno níže, jak biologicky aktivní činidla (např. mající jednu nebo více aktivit asociovaných s FGF podle předkládaného vynálezu).

Polypeptid kódující FGF podle předkládaného vynálezu, jeho derivát nebo jeho fragment, může být spojen s jednou nebo více strukturálními doménami, funkčními doménami, detekovatelnými doménami, antigenními doménami a/nebo požadovaným polypeptidem v uspořádání, které se nevyskytuje v přírodě, tj. nepřirozeně se vyskytujícím uspořádání. Polypeptid obsahující takové rysy je chimérický nebo fúzní polypeptid. Takový chimérický polypeptid může být připraven podle různých metod, včetně chemických, syntetických, kvazi-syntetických a/nebo rekombinantních metod. Chimérická nukleová kyselina kódující chimérický polypeptid může obsahovat různé domény nebo požadované polypeptidy v kontinuálním (např. s mnohonásobnými N-koncovými doménami pro stabilizaci nebo zvýšení aktivity) nebo přerušeném otevřeném čtecím rámci, např. obsahujícím • · • · · ·

- 11 introny, místa sestřihu, enhancery (zesilující prvky), apod. Chimérická nukleová kyselina může být vytvořena podle různých metod. (Viz např. patent Spojených Států č. 5 439 819) . Doména nebo požadovaný polypeptid mohou mít kteroukoliv požadovanou vlastnost, včetně biologické funkce, jako je například signalizace, podpora růstu, buněčné cílení (např. signální sekvence, cílící sekvence, jako například pro cílení do endoplazmatického retikula nebo jádra), apod., strukturální funkce, jako je například hydrofobní, hydrofilní, membránou procházející, apod., funkce receptoru nebo ligandu, a/nebo detekční funkce, např. spojené s enzymem, fluorescenčním polypeptidem, zeleným fluorescenčním proteinem, Chalfie et al., Science, 263: 802, 1994, Cheng et al., Nátuře Biotechnology, 14: 606, 1996, Levý et al., Nátuře Biotechnology, 14: 610, 1996), apod. Kromě toho může být použit polypeptid nebo jeho část jako selekční markér, když je zaveden do hostitelské buňky. Například nukleová kyselina kódující aminokyselinovou sekvenci podle předkládaného vynálezu může být fúzována ve shodném čtecím rámci k požadované kódující sekvenci a působí jako značka pro purifikaci, selekci nebo pro účely značení. Úsek fúze mohou kódovat místo štěpení pro usnadnění exprese, izolace, purifikace, apod.

Polypeptid podle předkládaného produkován v expresním systému, např bezbuněčně, rekombinantně, buněčnou předkládaného vynálezu. Modifikace takovými systémy zahrnují substituci (např. použití polypeptidu, jako je například vynálezu může být in vivo, in vitro, fúzí, apod., podle předané polypeptidu glykosylaci, aminokyselinovou rozdílného kodonu), zpracování digesce, štěpení, aktivitu, připojení endopeptidázovou nebo exopeptidázovou chemických skupin včetně lipidů a fosfátů, apod.

• · · · · ·

- 12 • ·· fosfocelulózovou chromatografií, konfigurace kapalinová

Polypeptid podle předkládaného vynálezu může být získán z přírodních zdrojů, transformovaných hostitelských buněk (z kultivačního média nebo buněk) podle obvyklých metod včetně extrakce detergentem (např. neiontový detergent, Triton x-100, CHAPS, oktylglukosid, Igepal CA-630), amoniumsulfátové nebo ethanolové precipitace, extrakce kyselinou, aniontovou nebo kationtovou výměnnou chromatografií, chromatografií, hydrofobní interaktivní hydroxyapatitovou chromatografií, lektinovou chromatografií, gelovou elektroforézou. mohou být použity kroky pro opětné svinutí proteinu, je-li nutné, pro kompletaci zralého proteinu. Konečně, vysokoúčinná chromatografie (HPLC) může být použita pro purifikační kroky. FGF polypeptid může také být izolovaný, jak bylo popsáno pro další FGF proteiny, jak odborník zná, např. jak bylo popsáno v následujících pracích, které popisují izolaci různých FGF, patent Spojených Států č. 5 604 293, 5 395 756, 5 155 214, 4 902 782 a Santos-Ocampo et al., J. Biol. Chem., 271: 17261731, 1996 (purifikace FGF z bakteriálního hostitele, jako je například E. coli). Jiným přístupem je exprese FGF rekombinantně s afinitní značkou (Flag epitop, HA epitop, myc epitop, 6xHis, protein vázající maltózu, chitináza, apod.), a pak purifikace afinitní chromatografií s konjugovanou protilátkou proti použité značce.

Předkládaný vynález se také týká nukleových kyselin, jako jsou například DNA a RNA kódující FGF polypeptidy a jejich fragmenty podle předkládaného vynálezu, nukleová kyselina FGF (jako je například FGF-20 nebo -23) nebo jeho fragmentu, je nukleová kyselina mající nukleotidovou sekvenci získatelnou z přírodního zdroje. Proto zahrnuje přirozeně se vyskytující, normální, přirozeně se vyskytující mutované a přirozeně se vyskytující polymorfní alely (např. SNP), apod. Přírodní • · • · · · * ·

- 13 • · · · · · · « ·· · · ·· ·· · · zdroje zahrnují např. živé buňky získané z tkání a celé organismy, nádory, kultivované buněčné linie včetně primárních a imortalizovaných buněčných linií.

Sekvence nukleové kyseliny podle vynálezu může obsahovat kompletní kódující sekvenci, jak je ukázáno na obr. 1 a 2, její degenerovanou sekvenci a její fragmenty. Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může také zahrnovat nukleotidovou sekvenci, která je 100% komplementární, např.

anti-sense, ke kterékoliv v tomto textu výše a níže.

nukleotidové sekvenci uvedené

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být získána z celé řady různých zdrojů, může být získána z DNA nebo RNA, jako je například polyadenylovaná mRNA, např. izolovaná z tkání, buněk nebo celého organismu. Nukleová kyselina může být získána přímo z DNA nebo RNA nebo z cDNA knihovny. Nukleová kyselina může být získána z buňky nebo tkáně (např. z embryonálních nebo dospělých buněk nebo tkání srdečního nebo kosterního svalstva) v konkrétní fázi vývoje, mající požadovaný genotyp, fenotyp apod.

Jak bylo popsáno pro FGF polypeptid popsaný výše, nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvencu kódující polypeptid podle předkládaného vynálezu může zahrnovat pouze kódující sekvenci, kódující sekvenci a další kódující sekvenci (např. sekvence kódující vedoucí, sekreční, cílící, enzymatické, fluorescenční nebo jiné diagnostické peptidy), kódující sekvence a nekódující sekvence, např. netranslatované sekvence na každém 5' nebo 3' konci nebo rozptýlené v kódující sekvenci, např. introny. Nukleová kyselina obsahující nukleotidovou sekvenci kódující bez přerušení polypeptid znamená, že nukleotidové sekvence obsahuje sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci FGF, bez jakýchkoliv nekódujících • A A

- 14 nukleotidů, které by přerušovaly nebo zasahovaly do kódující sekvence, např. bez intronu/intronů. Taková nukleotidová sekvence může také být popsána jako souvislá. Genomová DNA kódující humánní, myší nebo jiný savčí gen FGF apod., může být získána rutinně.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu také může zahrnovat expresní kontrolní sekvenci operativně spojenou s nukleovou kyselinou, jak byla popsána výše. Termín expresní kontrolní sekvence znamená sekvenci nukleové kyseliny, která reguluje expresi polypeptidů kódovaného nukleovou kyselinou, ke které je operativně připojena. Exprese může být regulována na úrovni mRNA nebo polypeptidů. Tedy expresní kontrolní sekvence zahrnuje prvky se vztahem k mRNA a prvky se vztahem k proteinu. Takové prvky zahrnují promotory, enhancery (virové nebo buněčné), sekvence vázající ribozom, transkripční terminátory, apod. Expresní kontrolní sekvence je operativně spojena s nukleotidovou kódující sekvencí, když je expresní kontrolní sekvence umístěna tak, aby se dosáhlo účinku nebo dosáhlo exprese kódující sekvence. Například, když je promotor operativně spojen 5' ke kódující sekvenci, exprese kódující sekvence je řízena promotorem. Expresní kontrolní sekvence mohou být heterologní nebo endogenní vzhledem normálnímu genu.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být vybraná na základě hybridizace nukleových kyselin. Schopnost dvou jednovláknových preparátů nukleové kyseliny spolu hybridizovat je míra komplementarity jejich nukleotidových sekvencí, např. párování bází mezi nukleotidy, jako je například A-T, G-C, apod. Vynález se tedy také týká nukleových kyselin a jejich komplementů (tj. komplementárních sekvencí), které hybridizují k nukleové kyselině obsahující nukleotidovou sekvenci, jak je uvedena na obr. 1 a 2. Nukleotidová sekvence ·· ·* «r ·· ·««· · · · · ♦ · ¹ • « ·· · · ·· · » · • · , · t · · ♦ · · · * >

···· · * · · ···· ·· ·· ·· »· ** ··

- 15 hybridizující k druhé uvedené sekvenci má komplementární vlákno nukleové kyseliny nebo působí jako templát pro vlákno v přítomnosti polymerázy (tj . vhodného enzymu syntetizujícího nukleovou kyselinu). Předkládaný vynález zahrnuje obě vlákna nukleové kyseliny, např. sense vlákno a anti-sense vlákno.

Hybridizační podmínky mohou být zvoleny tak, aby vedly k výběru nukleových kyselin, které mají požadovaný stupeň komplementarity nukleotidů s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obr. 1 a 2. Nukleová kyselina schopná hybridizace k takové sekvenci výhodně má např. přibližně 85%, výhodněji 90%, 92% a ještě výhodněji 95%, 97% nebo 100% komplementaritu mezi sekvencemi. Předkládaný vynález se konkrétně týká sekvencí nukleové kyseliny, které hybridizuji s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obr. 1 a 2 v podmínkách nízké nebo vysoké stringence.

Nukleové kyseliny, které hybridizuji s FGF sekvencemi mohou být vybrány různými způsoby. Například tzv. bloty (tj . matrice obsahující nukleovou kyselinu, konkrétně např. nylonová membrána), čipové matrice a další matrice obsahující požadované nukleové kyseliny mohou být inkubovány v prehybridizačním roztoku (6x SSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturované DNA ze spermií lososa, 5x Denhardtův roztok a 50% formamid) ve 30 °C přes noc, a pak hybridizovat s detekovatelnou oligonukleotidovou sondou (viz níže) v hybridizačním roztoku (např. 6x SSC, 0,5% SDS, 100 pg/ml denaturované DNA ze spermií lososa a 50% formamid) ve 42 °C přes noc podle známých postupů. Bloty mohou být promyty v podmínkách vysoké stringence, což připustí výskyt nesouhlasných poloh (mismatch) např. méně než 5 % bp (např. dvakrát promytí v 0,1% SSC a 0,1% SDS po dobu 30 minut v 65 °C) , tj. selekci sekvencí majících 95% nebo vyšší

- 16 « · • · · ·

sekvenční identitu. Další neomezující příklady vysoce stringentních podmínek zahrnují konečné promytí v 65 °C ve vodném pufru obsahujícím 30mM NaCl a 0,5% SDS. Další příklad vysoce stringentních podmínek je hybridizace v 7% SDS, 0,5M NaPO₄, pH 7, lmM EDTA v 50 °C, např. přes noc, následovaná jedním nebo více promytími 1% roztokem SDS ve 42 °C.

Zatímco vysoce stringentní promytí může připustit výskyt nesouhlasných poloh (mismatch) menší než 5 %, mírné podmínky nebo málo stringentní podmínky promytí (např. promytí dvakrát v 0,2% SSC a 0,5% SDS po dobu 30 minut ve 37 °C) může dovolit až 20% výskyt nesouhlasných poloh (mismatch). Jiný neomezující příklad málo stringentních podmínek zahrnuje konečné promytí ve 42 °C v pufru obsahujícím 30mM NaCl a 0,5% SDS. Promytí a hybridizace mohou také být prováděny tak, jak bylo popsáno v práci Sambrook et al., Molecular Cloning, 1989, kapitola 9.

Hybridizace může také být založena na výpočtu teploty tání (Tm) hybridu vytvořeného mezi sondou a jejím cílem, jak bylo popsáno v Sambrook et al. Obecně, teplota Tm, ve které se krátký oligonukleotid (obsahující 18 nukleotidů nebo méně) oddělí (taje) od své cílové sekvence, je dána dle následující rovnice: Tm = (počet A a T) x 2 °C + (počet C a G) x 4 °C. Co se týče delších molekul, Tm = 81,5 + 16,61ogl0 [Na+] + 0,41(% GC)-600/N kde [Na+] je molární koncentrace sodíkových iontů, % GC je procento GC párů bází v sondě a N je délka. Hybridizace může být prováděna několik stupňů pod touto teplotou, aby se zajistilo, že sonda a cíl mohou hybridizovat. Při výskytu nesouhlasných poloh („mismatch) se může kalkulovat s ještě větším snížením teploty.

Stringentní podmínky mohou být vybrány tak, aby se izolovaly sekvence a jejich komplementy, které mají např. přibližně alespoň 95%, výhodně 97% komplementaritu nukleotidů mezi sondou (např. oligonukleotid FGF a cílová nukleová kyselina).

Podle předkládaného vynálezu nukleová kyselina nebo polypeptid mohou zahrnovat jeden nebo více rozdílů v nukleotidové nebo aminokyselinové sekvenci uvedené na obr. 1 a 2. Změny nebo modifikace nukleotidové a/nebo aminokyselinové sekvence mohou být uskutečněny kterýmkoliv dostupným způsobem, včetně přímé nebo náhodné mutageneze.

Nukleová kyselina kódující savčí FGF, jako je například FGF-20 nebo FGF-23, podle vynálezu může zahrnovat nukleotidy, které se vyskytují v přirozeně se vyskytujícím genu, např. přirozeně se vyskytující polymorfismy, normální nebo mutované alely (nukleotid nebo aminokyselina) , mutace, které byly objeveny v přírodní populaci savců, jako jsou například lidé, opice, prasata, myši, laboratorní potkani nebo králíci. Například humánní FGF nukleová kyselina nebo polypeptid obsahuje nukleotidy nebo aminokyseliny, které se vyskytují v přirozeně se vyskytující humánní populaci. Termín „přirozeně se vyskytující znamená, že nukleová kyselina je dosažitelná z přírodního zdroje, např. zvířecí tkáně a buněk, tělesných tekutin, buněk tkáňových kultur, forenzních vzorků. Přirozeně se vyskytující mutace mohou zahrnovat delece (např. zkrácený amino- nebo karboxykonec), substituce, inverze nebo adice nukleotidové sekvence. Tyto geny mohou být detekovány a izolovány hybridizací nukleových kyselin podle metod, které odborník v oboru zná. Nukleotidové sekvence kódující savčí FGF podle vynálezu může obsahovat kodony zjištěné v přirozeně se vyskytujícím genu, transkript nebo cDNA, například jak je uvedeno na obr. 1 a 2, nebo mohou obsahovat degenerované kodony kódující stejné aminokyselinové sekvence. Například může být žádoucí měnit kodony v sekvenci tak, aby se • ·

- 18 optimalizovala sekvence pro expresi v požadovaném hostiteli.

Nukleové kyselina podle předkládaného vynálezu může zahrnovat např. DNA, RNA, syntetickou nukleovou kyselinu, peptidovou nukleovou kyselinu, modifikované nukleotidy nebo směsi. DNA může být dvouvláknová nebo jednovláknová. Nukleotidy obsažené v nukleové kyselině mohou být spojeny prostřednictvím různých známých vazeb, jako je např. vazba esterová, sulfátová, sulfamidová, fosforothioátová, fosforamidátová, methylfosfonátová, karbamátová, apod., v závislosti na požadovaném účelu, např. rezistenci k nukleázám, jako je například RNAase H, zlepšené in vivo stabilitě, apod. (Viz např. patent Spojených Států č. 5 378 825).

Mohou být vytvářeny různé modifikace nukleových kyselin, jako je například připojení detekovatelných markérů (avidin, biotin, radioaktivní prvky), skupin, které zlepšují hybridizaci, detekci nebo stabilitu. Nukleové kyseliny mohou také být připojeny k pevným nosičům, jako je např. nitrocelulóza, magnetické nebo paramagnetické mikrosféry (např. jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5 411 863, patentu Spojených Států č. 5 543 289, například obsahující feromagnetický, supermagnetický, paramagnetický, superparamagnetický, oxid železnatý a polysacharid), nylon, agaróza, diazotizovaná celulóza, latexové pevné mikrosféry, polyakrylamidy, apod., podle požadovaného způsobu. (Viz např. patent Spojených Států č. 5 470 967, 5 476 925, 5 478 893) .

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká oligonukleotidů nebo sond nukleové kyseliny. Takové oligonukleotidy nebo sondy nukleové kyseliny mohou být použity např. pro detekci, kvantifikaci nebo izolaci savčí FGF nukleové kyseliny v testovaném vzorku nebo pro identifikaci FGF homologů. Ve výhodném provedení mohou být nukleové kyseliny použity jako oligonukleotidové sondy, např. v PCR, diferenciálním displeji, genových čipech (např. Affymetrix GeneChips, patent Spojených Států č. 5 143 854, patent Spojených Států č. 5 424 186, patent Spojených Států č. 5 874 219, PCT WO 92/10092, PCT WO 90/15070) a jiných dostupných metodách. Detekce může být žádoucí pro celou řadu odlišných účelů, včetně výzkumu, pro účely diagnostické a forenzní. Pro diagnostické účely může být žádoucí identifikovat přítomnost nebo množství sekvence nukleové kyseliny ve vzorku, ať už byl vzorek získán z tkáně, buněk, tělesných tekutin, apod. Ve výhodném provedení se předkládaný vynález týká způsobu detekce nukleové kyseliny zahrnujícího kontakt cílové nukleové kyseliny v testovaném vzorku s oligonukleotidem v podmínkách efektivních pro dosažení hybridizace mezi cílem a oligonukleotidem a detekci hybridizace. Oligonukleotid podle vynálezu může také být použit v syntetické amplifikaci nukleové kyseliny, jako je například PCR (např. Saiki et al., Science, 241: 53, 1988, patent Spojených Států č. 4 683 202, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., vyd., Academie Press, New York, 1990), diferenciální displej (viz např. Liang et al., Nucl. Acid. Res., 21: 32693275, 1993, patent Spojených Států č. 5 599 672, WO97/18454).

Detekce může být uskutečněna v kombinaci s oligonukleotidy pro další geny, např. geny zapojené do signální transdukce, růstu, karcinomů, apoptózy nebo kterýkoliv z genů uvedených výše nebo níže v tomto textu, apod. Oligonukleotidy mohou také být použity k testování mutací např. s použitím technologie oprav nesouhlasných poloh v DNA („mismatch DNA repair technology) , jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5 683 877, patentu Spojených Států č. 5 656 430, Wu et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 89: 8779-8783, 1992.

• · • · · ·

- 20 Oligonukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou obsahovat kteroukliv kontinuální nukleotidovou sekvenci z obr.

a 2 nebo jejich komplement nebo kteroukoliv ze sekvencí nebo jejich komplementů. Tyto oligonukleotidy (nukleová kyselina) podle předkládaného vynálezu mohou být kterékoliv požadované velikosti, např. přibližně 10 až 200 nukleotidů, 12 až 100, výhodně 12 až 50, 12 až 25, 14 až 16, alespoň přibližně 15, alespoň přibližně 20, alespoň přibližně 25, apod. Oligonukleotidy mohou mít nepřirozeně se vyskytující nukleotidy, např. inosin, AZT, 3TC, apod. Oligonukleotidy mohou mít 100% identitu nebo komplementaritu se sekvencí z obr. 1 a 2 nebo mohou mít nesouhlasné polohy nebo nukleotidové substituce, např. 1, 2, 3, 4 nebo 5 substitucí. Například oligonukleotidy mohou mít 70 až 99% identitu, např. 90, 95 nebo 97% identitu, se sekvencí z obr. 1 nebo 2. Podle předkládaného vynálezu oligonukleotid může tvořit diagnostickou soupravu (kit), přičemž souprava zahrnuje požadovaný pufr (např. fosfát, TRIS, apod.), detekční přípravky, apod. Oligonukleotid může být značený nebo neznačený, radioaktivní nebo neradioaktivní značkou, jak je v oboru známo.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je nukleotidová sekvence, která je unikátní k savčímu FGF. Termínem „unikátní sekvence k FGF se míní definované pořadí nukleotidů, které se vyskytuje v FGF, např. v nukleotidových sekvencích z obr. 1 a 2, ale zřídka nebo občas v jiných nukleových kyselinách, obzvláště ne ve zvířecí nukleové kyselině, výhodně savčí, jako je například humánní, laboratorního potkana, myší, apod. Unikátní nukleotidové sekvence zahrnují sekvence nebo jejich komplementy, kódující aminokyseliny, jak je ukázáno v sekv. id. č. 1 a 2 a obr. 1 a 2. Takové sekvence mohou být použity jako sondy ve kterékoliv metodě popsané v tomto textu nebo • · • · · ·

zahrnuté formou odkazu nukleotidové sekvence, předkládaného vynálezu jsou zahrnuty obě sense a antisense Unikátní nukleová kyselina podle může být určena rutinně. Nukleová kyselina obsahující takovou unikátní sekvenci může být použita jako hybridizační sonda pro identifikaci výskytu např. humánního nebo myšího FGF ve vzorku obsahujícím směs nukleových kyselin, např. na Northern blotu. Hybridizace může být prováděna ve vysoce stringentních podmínkách (viz výše) pro selekci nukleových kyselin (a jejich komplementů, které mohou obsahovat kódující sekvence) majících alespoň 95% identitu (tj . komplementaritu) se sondou, ale mohou také být použity méně stringentní podmínky. Unikátní FGF nukleotidové sekvence může také být fúzována ve shodném čtecím rámci, na každém jeho 5' nebo 3' konci, k různým nukleotidovým sekvencím, jako uváděno v popisu patentu, včetně kódujících sekvencí pro další části FGF, enzymy, GFP, apod., expresní kontrolní sekvence, apod.

Jak již bylo popsáno, hybridizace může být prováděna v různých podmínkách, v závislosti na požadované selektivitě, např. jak bylo popsáno v práci Sambrook et al. , Molecular Cloning, 1989. Například pro specifickou detekci FGF podle předkládaného vynálezu oligonukleotid může být hybridizován k cílové nukleové kyselině v podmínkách, oligonukleotid hybridizuje jedině k ní, komplementární s cílem. Mohou být jestliže je žádoucí vybrat cílové nukleové kyseliny, které mají menší než 100% komplementaritu nukleotidů, přibližně alespoň např. 99%, 97%, 95%, 90%, 86,4%, 85%, 70%, 67%.

ve kterých např. kde oligonukleotid je 100% použity různé podmínky,

Nukleová kyselina podle předkládaného může být značena jakýmkoliv požadovaným způsobem. Nukleová kyselina může být • ·

_{v z} 32 značen s použitím značících izotopů jako je například P, S, ¹²⁵I, ³H nebo ¹⁴C, aby byly zmíněny alespoň obecně používané izotopy. Radioaktivní značení může být prováděno jakoukoliv odborníkovi známou metodou, například koncovým značením na 3' nebo 5' konci s použitím radioaktivně značeného nukleotidu, polynukleotidylkinázy (s nebo bez defosforylace s fosfatázou) nebo ligázy (v závislosti na tom, který konce má být značen) . Může také být použito neradioaktivní značení, kdy se kombinuje nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu se skupinami, které mají imunologické vlastnosti (antigeny, hapteny), specifickou afinitu pro určitá činidla (ligandy), vlastnosti umožňující detekovat enzymatickou reakci, která má proběhnout (enzymy nebo koenzymy, enzymové substráty nebo jiný látky účastnící se enzymatické reakce) nebo charakteristické fyzikální vlastností, jako je například fluorescence nebo emise nebo absorpce světla v požadované vlnové délce apod.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu, včetně oligonukleotidů, anti-sense nukleových kyselin apod., může být použita k detekci exprese FGF v celých orgánech, tkáních, buňkách apod., a sice různými technikami, ke kterým patří Northern blot, PCR, hybridizace in šitu, diferenční displej, čipy s nukleovými kyselinami, hybridizace „tečkových blotů apod. Takové nukleové kyseliny mohou být konkrétně použity k detekcí narušené exprese např. buněčně specifických a/nebo subcelulárních změny FGF. Hladiny FGF mohou být určen samostatně nebo v kombinaci s jinými genovými produkty, zejména jiných genů, jejichž produkty se účastní nervové fyziologie.

Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být exprimována v celé řadě různých systémů, jak in vitro tak in vivo, podle požadovaného účelu. Například nukleová kyselina • 4 · · 4

- 23 může být vložena do expresního vektoru, vnesena do požadovaného hostitele a ten dále kultivován v podmínkách, které jsou účinné (vhodné) pro expresi polypeptidů kódovaného nukleovou kyselinou. Účinné podmínky jsou jakékoliv kultivační podmínky, které jsou vhodné pro dosažení produkce polypeptidů v hostitelské buňce, a zahrnují účinnou teplotu, pH, médium, aditiva k médiu, ve kterém je hostitelská buňka pěstována (např. aditiva která amplifikují nebo indukují expresi jako je například butyrát nebo methotrexát, jestliže je kódující nukleová kyselina spojena s genem dhfr), cykloheximid, buněčná hustota, kultivační nádoba apod. Nukleová kyselina může být vnesena do buňky kterýmkoliv účinným způsobem včetně např. přenosu holé DNA, přenosu pomocí precipitace s fosforečnanem vápenatým, elektroporace, injekce, transfekce zprostředkované DEAE-dextranem, fúzí s lipozomy, asociací s činidlem, které zesiluje jejich vychytávání do buněk, virovou transfekcí. Buňka, do které byla vložena nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu, je transformovaná hostitelská buňka. Nukleová kyselina může být extrachromozomová nebo se integruje do chromozómu hostitelské buňky. Tato integrace může být stabilní nebo přechodná. Expresní vektor je vybrán pro jeho slučitelnost s hostitelskou buňkou. Hostitelské buňky zahrnují savčí buňky např. COS, CVI, BHK, CHO, HeLa, LTK, NIH 3T3, 293, PAE, humánní buňky, humánní fibroblasty, humánní primární nádorové buňky, buňky varlat, gliové buňky, neurony, oligodendrocyty, buňky z neuroblastomu, gliomu apod., hmyzí a buňky z E. coli, jako je například buňky, jako je například Sf9 (S. frugipeda)

Drosophila, baktérie, jako je například Streptococcus, Bacillus, kvasinky,

Sacharomyces, např. S. cerevisiae, houbové buňky, rostlinné buňky, embryonální kmenové buňky (např. savčí, jako například myší nebo humánní), neuronové kmenové buňky, fibroblasty, • ·

svalové buňky, srdeční buňky a T lymfocyty.

Expresní kontrolní sekvence jsou podobně vybrány na základě hostitelské kompatibility a požadovaného účelu, např. vysoký počet kopií, velké množství, indukce, amplifikace, řízená exprese. Další sekvence, které mohou být použity, zahrnují enhancery (zesilovací sekvence), jako je například SV40, CMV, RSV, indukovatelné promotory, prvky nebo sekvence specifické pro buněčný typ, které umožňují buněčně selektivní nebo specifickou expresi. Promotory, který mohou být použity k řízení/kontrole exprese, zahrnují např. endogenní promotor, promotory ostatních genů v buněčné dráze signální transdukce, promotory MMTV, SV40, trp, lac, tac nebo T7 pro bakteriální hostitele nebo promotory alfa faktoru, alkoholoxidázy nebo PGH pro kvasinky. RNA promotory mohou být použity k vytvoření RNA transkriptů, jako je například T7 nebo SP6 promotor. Viz např. Melton et al., Nucleic Acid Res., 19 (18): 7035-7056,1984, Dunn a Studier, J. Mol. Bio., 166: 477-435, 1984, patent Spojených Států č. 5 891 636, Studier et al., Gene Expression Technology, Methods in Enzymology, 85: 60-89,1987.

Nukleová kyselina nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu mohou být použity jako velikostní markér při elektroforéze nebo chromatografií nukleových kyselin nebo proteinů apod. Definované restrikční fragmenty mohou být určeny pomocí vyhledáváním restrikčních míst v sekvenci a vypočítáním velikosti a nakonec provedením odpovídajícího štěpení restrikčními enzymy.

FGF polypeptid a nukleová kyselina předkládaného vynálezu mohou být „izolované.

Termín izolovaný znamená, že odpovídající sloučenina je ve formě, ve které se nevyskytuje v původním prostředí nebo v přírodě např., je více koncentrovaná, více purifikovaná, • · · ·

- 25 oddělena od složek, přítomných v lyzátu buňky, ve které je heterologní FGF gen exprimován. Když je FGF exprimován jako heterologní gen v transfekované buněčné linii, gen podle předkládaného vynálezu je vnesen do buňky, jak bylo popsáno výše, v podmínkách, ve kterých je gen exprimován. Termín heterologní znamená, že gen byl zaveden do buněčná linie lidským experimentálním zásahem („lidskou rukou). Vnášení genu do buněčná linie již bylo diskutováno výše. Transfekované (nebo transformované) buňky exprimující FGF gen mohou být lyžovány, jak je popsáno v příkladech, a použity ve způsobu jako lyzát (tj. izolovaný) nebo mohou být použity buněčné linie neporušené.

Obecně, termín účinné podmínky znamená např. prostředí, ve kterém je dosaženo žádaného účinku. Takové prostředí, zahrnuje např. pufry, oxidační činidla, redukční činidla, pH, kofaktory, teplota, koncentrace iontů, vhodné stáří a/nebo fáze buněčného cyklu (jako je například konkrétní fáze buněčného cyklu nebo konkrétní stádium, kdy jsou exprimovány konkrétní geny), kdy jsou buňky použity, kultivační podmínky (včetně substrátu, kyslíku, oxidu uhličitého apod.).

Pro zvýšení stability podávaná nukleová kyselina může být modifikována např. tak, aby byla odolná proti buněčným enzymům, oxidázám, reduktázám, nukleázám apod., nebo aby se zesílilo její vychytávání do buněk. Kterákoliv vhodná modifikace může být použita, včetně modifikace užitím např. fosforothioátů, methylfosfonátů, fosfodiesteroligonukleotidů spojených s akridinovým interkalačním činidlem a/nebo hydrofobním „ocáskem, derivátů psoralenu, modifikace 2'-ribózy, deriváty pentózy, deriváty dusíkatých bází apod. Viz např. patent Spojených Států č. 5 576 208 a č. 5 744 362. Pro jiné deriváty, modifikace, apod. které mohou být použity • · • · · ·

ve vynálezu také viz výše. Obecně, antisense nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou zahrnovat monomery přirozeně se vyskytujících nukleotidů, nepřirozeně se vyskytující nukleotidy a jejich kombinace k zesílení buněčného vychytávání a/nebo stability.

Antisense nukleové kyseliny mohou být podávány jako holé nukleové kyseliny, v komplexu nebo opouzdřené s jinými činidly, která usnadňují vychytávání do buňky, injikováním do buněk nebo jakýmkoliv jiným známým způsobem.

Předkládaný vynález se také týká způsobů použití FGF podle předkládaného vynálezu, jako je například FGF-20 a FGF-23. Takové způsoby se týkají podávání účinného množství FGF nebo nukleové kyseliny kódující FGF podle předkládaného vynálezu hostiteli, a sice pro jeden nebo více následujících účelů: podpora přežívání a/nebo proliferace např. neuronů, oligodendrocytů, Schwannových buněk, kmenových buněk, obzvláště nervových kmenových buněk, endotelových buněk, keratinocytů a kteréhokoliv buněčného typu, který je schopný reagovat na FGF-20 nebo FGF-23, např. buněk, které exprimují příbuzný receptor (jako je například FGFR 1-4) na svém buněčném povrchu, nebo jejich progenitorů, podpora hojení ran, modulace diferenciace buněk, indukce embryonálního vývoje, stimulace neuritového výrůstku, zvýšení regenerace po nervovém nebo nervovém poškození, stimulace myelinizace, stimulace angiogeneze, vazebné aktivity receptoru.

Předkládaný vynález se také týká indikací a způsobů použití FGF podle předkládaného vynálezu, jako je například FGF-20 a FGF-23 nebo nukleová kyselina kódující FGF. Takové způsoby zahrnují podávání účinného množství FGF podle předkládaného vynálezu hostitelovi pro jeden nebo více následujících účelů: zvýšení regenerace po nervovém a axonovém • · • · · ·

- 27 poškození, stimulace myelinizace, angiogeneze, hojení ran, hojení vředů, indukce opravy kostního defektu, podpora přežívání štěpu a indukce embryonálního vývoje. Výše uvedené aplikace jsou důsledek potenciální FGF aktivity podporující přežívání a/nebo proliferaci buněk, inhibici a/nebo stimulaci diferenciace určitých buněčných typů. FGF může indukovat buněčné přežívání/proliferaci kmenových buněk, progenitorů, prekurzorů a zralých buněk následujícího původu: neuronů, oligodendrocytů, Schwannových buněk, endotelových buněk, keratinocytů a dalších buněčných typů exprimujících kterýkoliv z FGF receptorů. Kromě toho FGF mohou indukovat diferenciaci neuronových progenitorů indukcí neuritového výrůstku/exteze.

Následující in vitro a in vivo testy mohou být prováděny pro měření aktivity FGF na výše popsané buněčné funkce.

In vitro testy

Indukce proliferace oligodendrocytů in vitro

Oligodendrocyty použité pro měření účinků GF na buněčnou proliferaci jsou buďto zavedené buněčné linie jako je například N20.1 nebo primární oligodendrocyty hlodaveců. Primární oligodendrocyty a progenitory oligodendrocytů hlodavců (laboratorní potkan) mohou být izolovány a purifikovány např. jedou z následujících technik: technika založená na rozdílné adhezi (Mitrovic et al. , 1994), centrifugace na gradientu Percolu (Mattera et al., Neurochem. Int. 1984,6 (1) 41-50 a Kim et al., J Neurol Sci, 1983 Dec, 62 (1 až 3): 295-301) a imunoseparace. Bez ohledu na zdroj oligodendrocytů (primární buňky nebo buněčná linie) nebo způsob jejich izolace a purifikace, testy proliferace • · · ·

- 28 oligodendrocytů mohou být prováděny po dobu 3, 5 a 7 dnů. Pozitivní kontroly jsou některé jiné členy FGF rodiny jako je například FGF-2 nebo FGF-9. Buněčná proliferace je měřena jako MTT test a inkorporace ³H-thymidinu. Viz také testy proliferace oligodendrocytů v publikaci Danilenko, et al., Arch Bíochem Biophys. 1999 Jan 1: 361 (1): 34-46.

Indukce neuritových výrůstků

PC12 testy

Nové příslušníky FGF rodiny lze testovat na indukci diferenciace a neuritových výrůstků na buněčné linii PC-12 (pocházející z feochromocytomového nádoru laboratorního potkana) (Rydel, 1987 Greene, 1976).

Navíc, jelikož bylo ukázáno, že část NGF indukované reakce je způsobena autokrinní NGF-indukovanou produkcí FGF-2, lze také zkoumat účinky nových FGF na „up-regulaci (zesílení) NGF produkce PC12 buněk (Chevet et al., J. Biol Chem. 1999 Jul 23: 274 (3): 20901-8).

Neuritové výrůstky v gangliu dorsálního kořenu (DRG)

DRG jsou izolovány pitvou embryí laboratorní potkana a DRG jsou pak kultivovány v neurobasálním médiu, rozsah neuritových výrůstků DRG je pak hodnocen vizuálně a kvantifikován na základě určení počtu a délky neuritů ve srovnání s neošetřenou kontrolou.

Testy mohou být prováděny na buňkách fibroblastového a endotelového původu. Pro fibroblasty může být použit modifikovaný NIH 3T3 proliferační test. Pro určení účinků FGF « « ♦ » « fe fc »

- 29 na indukci proliferace endotelových buněk, následující buňky mohou být použity: HUVEC buňky, buňky z mikrovaskulatury endotelu a buňky aortálního endotelu. In vítro testy relevantní pro určení terapeutického potenciálu FGF jako potenciálního terapeutického agens pro léčení zranění, vředů nebo poškození kosti, mohou být prováděny postupy popsanými v odborné literatuře.

Jiné testy, které korelují s regenerací CNS, zahrnují testy aktivace genové exprese spojené s růstem nebo přežíváním (Meinerse, et al., Dev Biol. 1993 Dec: 160 (2): 480-93), modulace jiného růstového faktoru in vivo (Yoshida, 1992), modulace elektrofyziologie neuronů (Terlau, 1990), aktivita jakožto mitogenu nebo diferenciačního faktoru pro oligodendrocyty, Schwannovy buňky nebo astrocyty (Genburger, 1987, Stemple, 1988, Kalcheim, Dev Biol. 1989 Jul: 134 (1): 110, Murphy, 1990), podpora in vítro přežívání neuronů z kůry nebo hippocampu, motorických, smyslových, sympatických nebo parasympatických neuronů (Eckstein, 1994, Unsicker, et al., Ann N. Y. Acad Sci. 1991: 638: 300-5, Grothe, et al., Int J

Dev Biol. 1996 Feb: 40 (1): 403-10), podpora přežívání motorického neuronu in vitro apod.

In vivo testy

- Remyelinizační potenciál nových FGF může být vyšetřen např. v následujících modelech: a) zvířecí model deficitní na myelin, například transplantace SVZ buněk z dárcovského zvířete ošetřeného FGF, do myši deficitní na myelin a pak měření expanze oligodendrocytů in vivo, b) demyelinizační zvířecí model, jako je například PLT indukovaný CR-EAE a MBP adoptivní transfer indukovaný CR-EAE. Viz také testy popsané v publikaci Gumpel, 1992 a Hinks, et al., Mol Cell Neurosci.

φφ ···»

- 30 4» ·* Φ» • « » · * · I · *· >

• · ΦΦ Φ * ·· Φ « « < ·« · Φ Φ · · ··· · » • · Φ Φ Φ Φ · · · · φ 9

ΦΦ ΦΦ ·· ·· ΦΦ «Φ

1999 Aug: 14 (2): 15368.

- FGF mohou být testovány na jejich schopnost indukovat neuroregeneraci a neuroprotekci v následující in vivo modelech: mechanické poškození/zranění (přerušení příčným řezem dráhy fimbria fornix, ischiatického nervu, míchy, optického nervu a odříznutím od DRG), modely nervového poškození způsobeného cerebrovaskulárním zraněním jako je například okluze karotidy, dočasná okluze MCAO a hypoxickéichemické cerebrální poškození, a chemicky indukovaná neurodegenerace způsobená MPTP indukovanou lézí nebo KA indukované záchvaty.

K typickým in vivo testům patří například měření redukce ztrát neuronů po ischémii hippocampu (Sasaki, 1992, Macmillan, et al

Can J Neurol Sci 1993 Feb:

(1): 37-40), podpora lézi perforující dráhu přežívání kortikálních neuronů po (Gomez-Pinilla, 1992, Peterson, et al., J. Neurosci. 1996 Feb 1: 16 (3): 886-98), ochrana bazálních cholinergních neuronů předního mozku před poškozením indukovaným degenerací a redukcí MPTP-indukovanou nebo lézí-indukovanou ztrátou neuronů ze substantia nigra (Anderson, et al., Nátuře 1998 Mar 24: 332 (6162): 360-1, Otto, 1989, Gomez-Pinilla, 1992, Otto,

1990) a dlouhodobé pěstování progenitorových nervových buněk in vitro jakožto neurosfér (popsáno v Svendsen, et al., Trends Neurosci. 1999 Aug: 22 (S) : 357-64. Viz také použití modelů pro traumatické poškození, jako je například příčný řez optickým nervem (Sievers, 1987), příčný řez ischiatického nervu (Cordeiro, et al., Plast Reconstr Surg. 1989 June: 83 (6): 1013-9, Khouri, et al., Microsurgery 1989: 10 (3): 2069), řez DRG'S (Aebischer, et al., J. Neurosci Res. 1989 Jul. 23 (3): 282-9), řez míchy (Cheng, et al., Science 1996 Jul 26: 273 (5274): 510-3 1996) a rozdrcení obličejového nervu (Kuzis • · • · • · • · · ·

- 31 1990), použití modelů pro cerebrovaskulární poškození, jako je například hypoxemické-ischemické cerebrální poškození (MacMillen, 1993) a okluze MCA (Kawamata, et al., Proč Nati Acad Sci U. S. A. 1997 Jul 22: 94 (15): 8179-84, Schabitz, 1999) a jiné neurodegenerativní modely, jako je například léčba kianovou kyselinou (KA) (Liu, et al., Brain Res 1993 Oct 29: 626 (1-2): 335-8) nebo MND u „potácejících se („wobbler) myší (Ikeda, et al., Neurol Res. 1995 Dec: 17 (6): 445-8).

Termín podávání znamená, že FGF, nukleová kyselina kódující FGF nebo jiná účinná látka, je dopravena k cíli, např. poranění, poškozené tkáni, apod. FGF může být podáván kterémukoliv cíli (např. in vivo, in vitro nebo in šitu} , včetně buněk v kultuře a hostitelů majících léčené poranění, chorobný stav nebo onemocnění, účinným způsobem vhodným pro dosažení účinku, jak bylo popsáno výše, např. FGF formulace může být podávána injekcí přímo do cílového místa nebo blízko k němu. může také být podávána topicky, parenterálně, intravenózně, intramuskulárně, perorálně, nazálně, intracerebrálně, intraventrikulárně, intracisternálně, intrakraniálně, implantovaná do požadované lokalizace, např. v gelové pěně, kolagenem naplněné „dlaze pro vedení nervu, apod., např. v závislosti na lokalizaci léčeného cílového místa. FGF může také být podáván nepřetržitě s použitím osmotické pumpy. FGF může také být podáván jako nukleová kyselina pro vychytávání buňkami, způsoby podávání nukleové kyseliny zahrnují ty popsané výše a jiné způsoby obvyklé ve stavu techniky.

enterálně, subkutánně,

Účinné množství FGF je podáváno k cílovému místu (cíli). Účinné množství je takové množství, které jsou užitečné pro dosažení žádaného efektu, výhodně prospěšného nebo terapeutického účinku. Takové množství může být určeno rutinně • · • · • · • · • · · ·

např. prováděním experimentu reakce na dávku, ve kterém kolísající dávky jsou podávány cílovým buňkám pro určení účinného množství pro dosažení požadovaného cíle, např. stimulace neuritového výrůstku nebo podpory přežívání neuronů. Množství jsou vybrána na základě různých faktorů, včetně prostředí, do kterého je FGF podáván (např. pacientovi s poškozením mozku, zvířecí model, buňky tkáňových kultur, apod.), místo léčených buněk, věk, zdraví, pohlaví a hmotnost léčeného pacienta nebo zvířete, apod.

V jednom aspektu se předkládaný vynález týká způsobů léčení nervových poranění, jako je například poškození nervů a trauma, poškození míchy a trauma, poškození nervové tkáně vyvolané např. ischemickými záchvaty, infarktem, krvácením a aneurysmatem, léčení nervových onemocnění, např. nervových degeneračních nemocí, jako je například Alzheimerova nemoc, Parkinsonova nemoc, Huntingtonova nemoc, sclerosis multiplex, myelopatie, myelitida a syringomyelie, apod., obsahující podávání účinného množství FGF podle předkládaného vynálezu.

FGF podle tohoto vynálezu mohou být použity pro léčbu neurodegenerativních a demyelinizačních chorob CNS a PNS, charakterizovaných destrukcí neuronů a oligodendrocytů. FGF může být použit jako remyelinizační léčivo pro léčbu roztroušené sklerózy mozkomíšní (sclerosis multiplex) a jiných primárních a/nebo sekundárních demyelinizačních onemocnění CNS nebo PNS. Primární demyelinizační choroby CNS zahrnují adrenoleukodystrofie, leukoencefalopatie (jako je například progresivní multifokální leukoencefalopatie), encefalomyelitida (jako je například akutní diseminovaná perivenózní encefalomyelitida). Sekundární demyelinizace CNS je reprezentována jako tvorba demyelinizačních lézí v CNS traumatem, toxicitou (kyanid, hexachlorfan) nebo ischémií • · • · • · · ·

- 33 (mrtvice). Demyelinizační choroby PNS zahrnují primární chorobné stavy, jako je Guillian-Barreho syndrom (GBS), paraproteinémie, chronická zánětlivou demyelinizační polyneuropatie (CIDP). Kromě toho, FGF bude použit pro léčbu neurodegenerativních chorob CNS a PNS, kde neuronový poškození je způsobeno poškozením/traumatem (mechanické, chemické, cerebrovaskulární poškození a zánět způsobený infekcí a autoimunní reakcí) a pro léčbu jiných neurodegenerativních nemocí.

FG podle vynálezu mohou být také použity k podporování přežívání štěpu (transplantátu). Například FGF mohou podporovat přežívání štěpů (např. alogenních, isogenních nebo autologních) celé řady buněk, tkání nebo orgánů, jako je například kůže, fascie, šlachy, kosti, ledvina, rohovka a další. Transplantace buněk pocházejících z neuronů, gliový nebo kmenových buněk do CNS nebo PNS přichází také do úvahy podle vynálezu. Tranpslantovaný materiál může pocházet z přírodního zdroje nebo může být získán in vitro expanzí buněk nebo tkání nebo může být získán diferenciací nediferencovaných kmenových buněk. Termín podporovat znamená v tomto textu zesílit přežívání a/nebo proliferaci transplantovaných buněk, tkáně nebo orgánu, které byly ošetřeny FGF ve srovnání s buňkami, tkáněmi nebo orgány, které nebyly ošetřeny. Metody užívané pro testování přežívání štěpů jsou obvyklé.

Testy pro měření přežívání štěpů jsou rutinní a jsou odborníkům známy. Obvyklý in vitro testy zahrnují např. MTT, MTS, inkorporace Thy, testy s buňkami typu živá/mrtvá (např. dvojité barvení s kalceinem AM ethidium homodimerem EthD-1), měření celkového počtu buněk, např. s použitím mikroskopického hodnocení nebo fyzikální metodami počítání buněk, jako je například použití počítače krvinek. Obvyklé in vivo metody • · • · · ·

- 34 zahrnují např. pro CNS indikace, detekci zlepšené neurologické funkce nebo zobrazovací techniky jako je například MTR, MRS, CT nebo MRI, s nebo bez Gd zesílení.

Ostatní stavy, které mohou být léčeny podle předkládaného vynálezu zahrnují prevenci proti poškození myokardu v důsledku MI, indukce angiogeneze, hojení ran, hojení vředů, prevence destrukce kosti a indukce novotvorby kosti, podpora přežívání štěpu a indukce embryonálního rozvoje.

FGF aktivity, které jsou užitečné při výše popsaném léčení, zahrnují aktivity jako je: podpora přežívání a/nebo proliferace buněk, inhibice a/nebo stimulace diferenciace následujících typů buněk: přežívání/proliferace kmenových buněk, progenitorových, prekurzorových a zralých buněk následujícího původu: neurony, oligodendrocyty, Schwannovy buňky, endotelové buňky, keratinocyty, osteoblasty a další buněčné typy exprimující kterýkoliv z FGF receptorů. Navíc FGF účinky na indukci diferenciace progenitorových buněk neuronů indukcí vyrůstání/prodlužování neuritů jsou považovány za využitelné při léčení kteréhokoliv druhu poškození/poranění neuronů.

Termín léčení znamená jakékoliv ošetření nebo účinek vedoucí ke zlepšení poškození nebo onemocnění, jako je například podporování přežívání neuronů, gliových buněk, oligodendrocytů, astrocytů, Schwannových buněk, apod., stimulace vyrůstání neuritů, stimulace myelinizace, stimulace proliferace buněk, apod., jak bylo již uvedeno výše. Pro léčení uvedených poranění nebo nemocí mohou být FGF formulovány jako přípravky nebo nukleová kyselina a aplikovány na poraněná nebo nemocná místa s použitím chirurgické techniky.

FGFS podle vynálezu mohou také být podávány při jakémkoliv • · •· ·· ····

- 35 způsobu léčení popsaném v tomto textu, např. podávány jako nukleová kyselina např.při genové terapii. Vehíkula pro podávání genů mohou být virového nebo nevirového původu (viz obecně Jolly, Cancer Gene Therapy 1: 51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5: 845-852 (1994), Connelly, Human Gene Therapy 1: 185-193 (1995) a Kaplitt, Nátuře Genetics 6: 148153 (1994) . Vehikula pro genovou terapii pro aplikace konstruktů včetně terapeutické kódující sekvence podle vynálezu mohou být podávána buď lokálně nebo systémově. Takové konstrukty využívají metody virových nebo nevirových vektorů. Exprese kódující sekvence je navozena působením endogenního savčího nebo heterologního promotoru. Exprese kódující sekvence je buďto konstitutivní nebo regulovaná.

Předkládaný vynález může využít rekombinantní retroviry, který jsou konstruovány, aby nesly nebo exprimovaly požadovanou molekulu nukleové kyseliny. Retrovirové vektory, které mohou být použity, zahrnují vektory popsané v následujících publikacích: EP 0 415 731, WO 90/07936, WO 94103622, WO 93/25698, WO 93/25234, Patent Spojených Států č. 5 219 740, WO 93/11230, WO 93/10218, Vile a Hart, Cancer Res. 53: 3860-3864 (1993), Vile a Hart, Cancer Res. 53: 962-967 (1993), Ram et al., Cancer Res. 53: 83-88 (1993), Takamiya et al., J Neurosci. Res. 33: 493-503 (1992), Baba et al., J. Neurosurg. 79: 729-735 (1993), patent Spojených Států č. 4 777 127, patent Velké Británie č. 2 200 651 a EP 0 345 242. Výhodné rekombinantní retroviry byly popsány v mezinárodní patentové přihlášce WO 91/02805.

Sbalovací („pakážovací) buněčné linie vhodné pro použití s výše uvedenými retrovirovými vektorovými konstrukty mohou být snadno připraveny (viz PCT publikace WO 95/30763 a WO 92/05266) a použity vytvořit produkční buněčné linie (také • 9 • 9

- 36 nazývané vektorové buněčné linie) pro produkce rekombinantních vektorových částic. V konkrétním výhodném provedení vynálezu jsou sbalovací buněčné linie připraveny z humánní (jako je například linie HT1080 buněk) nebo norkové rodičovské buněčné linie, což umožňuje produkci rekombinantních retrovirů, které přežívají inaktivaci v humánním séru.

Předkládaný vynález také používá vektory odvozené z alfavirů („alphavirus-based) , které mohou působit jako vehikula pro přenos genů. Takový vektory mohou být konstruovány z širokého spektra alfavirů, jako je například Sindbis virus, Semliki Forrest virus (ATCC VR-67, ATCC VR1247), Ross River virus (ATCC VR-373, ATCC VR-1246) a virus Venezuelské koňská encefalitidy (ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532). Reprezentativní příklady takových vektorových systémů lze nelézt v patentu Spojených Států č. 5 091 309, 5,217, S79 a 5 185 440 a PCT Publikacích č. WO

92/10578, WO 94/21792, WO 95/27069, WO 95/27044 a WO 95107994.

Vehikula pro přenos genů podle předkládaného vynálezu mohou také využívat parvovirové vektory jako jsou například vektory z adeno-asociovaných virů (AAV). Reprezentativní příklady zahrnují AAV vektory popsané ve WO 93/09239 (Srivastava) , Samulski et al., J. Vir. 63: 3822-3828 (1989),

Mendelson et al. , Virol. 166: 154-165 (1988) a Flotte et al., P. N. A. S. 90: 10613-10617 (1993).

Reprezentativní příklady adenovirových vektorů byly popsány v Berkner, Biotechniques 6: 616-627 (1988), Rosenfeld et al., Science 252: 431-434 (1991), WO 93/19191, Kolls et al., P. N. A. S. 915-219 (1994), Kass-Eisler et al., P. N. A. S. 90: 11498-11502 (1993), Guzman et al., Circulation 88:

2838-2848 (1993), Guzman et al., Cir. Res. 73: 12021207 (1993), Zabner et al., Cell 75: 207-216 (1993), Li et al., • · · ·

- 37 Huni. Gene Ther. 4: 403-409 (1993), Cailaud et al., Eur. J

Neurosci. 5: 1287-1291 (1993), Vincent et al., Nat. Genet 5:

130-134 (1993), Jaffe et al, Nat. Genet 1: 372-378 (1992) a

Levrero et al., Gene 101: 195-202 (1992). Příklady adenovirových vektorů vhodných pro genovou terapii podle předkládaného vynálezu zahrnují vektory popsané v WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984/a W0~95/00655. Podávání DNA navázané na usmrcený adenovirus, jak bylo popsáno v Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992), může být také použito.

Jiná vehikula a metody pro přenos genů mohou být také použity, včetně DNA kondenzované s polykationty a nespojené nebo spojené s usmrceným adenovirem, viz např. Curiel, Hum. Gene Ther. 3: 147-154 (1992), DNA navázané na ligand, například viz Wu, J. Biol. Chem. 264: 16985-16987 (1989), eukaryotických buněk jako vehikula pro buněčný přenos, viz přihlášky vynálezu U. S. č. 08/240,030, podaná 9. Května 1994, a U. S. 08/404,796, depozicí fotopolymerizovaného hydrogelu, ruční „puškou pro genové částice, jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5 149 655, ionizujícím zářením, jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5 206 152 a v WO 92/11033, neutralizací jaderného náboje nebo fúzí s buněčnou membránou. Další přístupy byly popsány v Philip, Mol. Cell Biol. 14: 2411-2418 (1994) a v Woffendin, Proč. Nati. Acad.

Sci. 91: 1581-1585 (1994).

Může být také použita holá DNA. Příklady metod užívajících holou DNA jsou popsány ve WO 90/11092 a patentu Spojených Států č. 5 580 859. Účinnost příjmu může být zvýšena použitím biologicky rozložitelných latexových perliček. DNA potažené latexové perličky jsou účinně transportovány do buněk po iniciaci endocytózy perličkami. Tento způsob může být dále • · « · • ·

zlepšen ošetřením perliček pro zvýšení hydrofobicity, čímž se usnadní rozpad endozomu a uvolňování DNA do cytoplasmy. Lipozomy, který mohou působit jako vehikula pro přenos genů jsou popsané v patentu Spojených Států č. 5 422 120, PCT Patent Publikaci č. WO 95/13796, WO 94/23697 a WO 91/14445 a EP č. 0 524 968.

Další nevirové přenosové systémy vhodné pro použití ve vynálezu zahrnují mechanické aplikační systémy jako je například přístup popsaný v Woffendin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91 (24): 11581-11585 (1994). Navíc, kódující sekvence a expresní produkt jako takový mohou být dopraveny prostřednictvím depozitu fotopolymerizovaného hydrogelu. Jiné obvyklý metody vnášení genů, které mohou být použity pro aplikace kódující sekvence, zahrnují například použití ruční „pušky pro přenos genových částice, jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5 149 655, použití ionizujícího záření pro aktivaci přenášeného genu, jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5 206 152 a PCT Patent Publikaci č. WO 92/11033.

Předkládaný vynález se také týká způsobu stimulace buněčné proliferace, který zahrnuje podávání účinné množství FGF-9 (např. Kanda et al., výše.) FGF-20 nebo FGF-23 nebo jeho biologicky-aktivního fragmentu. Termín stimulace buněčné proliferace znamená, že podávání FGF vede k buněčnému dělení nebo mitóze. FGF může být podáván v jakékoliv účinné formě (nukleová kyselina nebo polypeptid) kterémukoliv vhodnému hostiteli.

Například v jednom provedení, způsob je užitečný pro identifikaci agonistů a antagonistů FGF. V takovém případě je užitečné podávat FGF buněčným liniím, včetně již zavedených linií nebo primárních buněk, jako je například linie • ·

- 39 spinálních motorických neuronů. Již zavedené linie zahrnují např. linie uložené v Americké sbírce mikroorganismů (ATCC, American Tissue Culture Collection, atccc. org) jako např. DBTRG-05MG, PFSK-1, MSTO-211H, NCI-H378, NCI-N417, NCI-H526, HCN-1A, HCN-2, CATH.a, NG108-15, NCI-H446, NCI-H209, NCI-H146, NCI-H82, NCI-H345, NCI-H510A, D283 Med, D341 Med, C6, IMR-32, Neuro-2a, NB41A3, BC3H1, A172, Mpf, T98G[T98-G], SCP, CCFSTTG1, Dl TNC1, CTX TNA2, PG-4 (S+L-), G355-5, SW 598[SW-598, SW598], C6/LacZ, 9L/lacZ, N1E-115, SH-SY5Y, BE(2)-M17, BE(2)C, MC-IXC, SK-N-BE(2), CHP-212, C6/lacZ7, M059K, M059J, F98, RG2[D74], NCI-H250, NCI-H1915, 0A1, TE 615.T, SVG pl2, TE671 sublinie č. 2, MBr Cl 1, SK-N-MC, SW 1088 [SW-1088, SW1088], SW 1783 [SW-1783, SW1783] , U-87 MG, U-118 MG, U-138 MG, MDAMB-361, DU 145, Hs 683, H4, 293, PC-12, P19, NTERA-2 cl.Dl[NT2/D1], BCE C/D-lb, SK-N-AS, SK-N-FI, SK-N-DZ, SK-N-SH, Daoy, výhodně, buňky N20.1.

Předpokládaní agonisté a antagonisté FGF mohou být podáváni in vitro k buňkám, kterým byl podáván FGF, jako jsou například buněčné linie popsané výše, nebo předpokládaná činidla mohou být podávána in vitro nebo in vivo buňkám, které přirozeně produkují FGF. Agonistický nebo antagonistický účinek takového činidla může být měřen kterýmkoliv z celé řady v oboru známých testů, jako jsou například testy popsané jinde v tomto textu.

Nervové kmenové buňky mohou také být stimulovány k proliferaci FGF podle předkládaného vynálezu. Takto získané buňky mohou pak být použit jako zdroj nervových buněk pro transplantaci zpět do stejného pacienta, ze kterého pocházejí (tj. autologní transplantace), což eliminace všechny klasické problémy spojené s alogenní transplantací, jako je například rejekce (odvržení) transplantátu. Tedy způsob podle • ·

Protilátka

Předkládaný vynález se specificky rozpoznává FGF specifický předkládaného vynálezu, znamená, že protilátka pro předkládaného vynálezu se týká podávání množství FGF, které je účinné ke stimulaci proliferace a diferenciace nervových kmenových buněk a transplantace kmenových buněk zpět.

také týká protilátky, která podle

FGF rozpoznává definovanou sekvenci aminokyselin obsaženou v FGF nebo zahrnující FGF, např. sekvence na obr. 1 a 2. Tedy specifická protilátka se obecně váže s vyšší afinitou k aminokyselinové sekvenci, tj. epitopu, nacházející se v sekvenci na obr. 1 a 2, ve srovnání s jiným epitopem, např. jak se detekuje a/nebo měří imunopřenosovým („imunoblot) testem nebo jiným známým imunotestem. Tedy protilátka, která je specifická pro epitop humánního FGF-21 je použitelná pro detekci přítomnosti epitopu ve vzorku, např. ve vzorku tkáně obsahující humánní genový produkt FGF-21, tj . pro rozlišení vzorku, ve kterém epitop je, od vzorku, kde není přítomný. Takové protilátky jsou používány např. způsobem, který je popsán v katalogu formy Santa Cruz Biotechnology, lne., a odpovídajícím způsobem jsou formulovány.

monoklonální, mohou být

Protilátky, např. polyklonální, rekombinantní, chimérické,nebo humanizované, připraveny jakýmkoliv vhodným způsobem, který je odborníkům znám. Viz také screening rekombinantní imunoglobulinové knihovny (např. Orlandi et al., Proč. Nati.

3833-3837, 1989, Huse et al., Science, 256:

in vitro stimulace populace lymfocytů, Winter a Nátuře, 349: 293-299, 1991. Například pro monoklonálních protilátek, polypeptidy podle obr. 1 a 2 mohou být podávány myším, kozám nebo králíkům subkutánně a/nebo intraperitoneálně, bez nebo společně s adjuvans, v množství

Acad. Sci . , 86 :

1275-1281,1989), Milstein, produkci • · • · · ·

- 41 účinném pro vyvolání imunitní reakce. Protilátky mohou být jednořetězcové protilátky nebo FAB fragmenty. Protilátky mohou být IgM, IgG, podtypy, IgG2a, IgGl, apod. Protilátky a imunitní reakce mohou také být vyvolány podáváním holé DNA, viz např. patenty Spojených Států č. 5 703 055, 5 589 466, 5 580 859.

FGF nebo jeho fragmenty, pro použití k indukci protilátek, nemusejí mít biologickou aktivitu, nicméně musejí mít imunogenní aktivitu, buďto samotné nebo v kombinaci s nosičem. Peptidy pro použití k indukci FGF-specifických protilátek mají aminokyselinovou sekvenci, kterou tvoří alespoň pět aminokyselin, výhodně alespoň 10 aminokyselin. Krátké úseky FGF aminokyselin, např. pěti aminokyselin, mohou být fúzovány s dalším proteinem, jako je například hemokyanin mořské přílipky nebo jiný použitelný nosič, a chimérická molekula je pak použita pro produkci protilátky. Úseky FGF použitelné pro produkci protilátky mohou být vybrány empiricky, nebo např. aminokyselinová sekvence dedukovaná z cDNA může být analyzována a z ní určeny úseky s vysokou imunogenicitou. Analýza umožňující výběr vhodných epitopů je popsána např. v Ausubel FM et al (1989, Current Protocols in Molecular Biology, díl 2. John Wiley & Sons).

Užitečné sekvence pro generování protilátek zahrnují přiřazené sekvence ukázané na obr. 1 a 2. Protilátky k takovým sekvencím mohou být použitelný pro rozlišení mezi různými transkripty FGF (viz výše).

Konkrétní FGF protilátky jsou použitelné pro diagnózu prepatologických stavů a chronických nebo akutních onemocnění, které jsou charakterizovány rozdíly v množství nebo distribuci FGF. Diagnostické testy na FGF zahrnují metody využívající protilátku a značku pro detekci FGF u člověka (nebo myši, • · • · · ·

- 42 připoj ena, poskytuje jestliže se použije myší protilátka, apod.) v tělních tekutinách, tkáních nebo extraktech tkání.

Polypeptidy a protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity buďto bez modifikace nebo s modifikací. Často jsou polypeptidy a protilátky značeny tím, že je k nim buď kovalentně nebo nekovalentně, látka, která detekovatelný signál. Široký řada značek a kondenzačních technik je známa odborníkům a byla publikována ve vědecké a patentové literatuře. Vhodné značky zahrnují radionuklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční činidla, chemiluminiscenční činidla, magnetický částice apod. Použití takových značek popisuje např. Patent Spojených Států č. 3 817 837, 3 850 752, 3 939 350, 3 996 345, 4 277 437, 4 275 149 a 4 366 241.

Protilátky a jiné ligandy, které se vážou na FGF, mohou být použity různými způsoby, včetně terapie a diagnostiky, a také ke komerčnímu výzkumu, např. ke kvantifikaci hladiny polypeptidu FGF ve zvířatech, tkáních, buňkách apod., k vyšetření buněčné lokalizace a/nebo distribuce FGF, pro purifikaci FGF nebo polypeptidu obsahující část FGF, modulaci funkce, v testech typu Western blot, ELISA, imunoprecipitace, RIA, apod. Předkládaný vynález se týká takových testů, přípravků a soupravy pro jejich provádění apod. S využitím těchto a ještě dalších metod, protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být použity k detekci polypeptidu FGF nebo jeho fragmentů v různých vzorcích, včetně tkání, buněk, tělesných tekutin jako je např. krev, moč, cerebrospinální mok.

Navíc ligandy, které se vážou na FGF polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo jeho derivát, mohou být také připraveny např. s použitím syntetické peptidové knihovny nebo • · ·

- 43 tzv. aptamerů (např. Pitrung et al. , patent Spojených Států č. 5 143 854, Geysen et al., J. Immunol. Methods, 102: 259274,1987, Scott et al., Science, 249: 386, 1990, Blackwell et al., Science, 250: 1104,1990, Tuerk et al. , 1990, Science,

249: 505. ) .

Předkládaný vynález se také týká FGF polypeptidu, připraveného požadovaným způsobem např. jak bylo popsáno v patentu Spojených Států č. 5 434 050. Značený polypeptid může být použit např. ve vazebných testech, jako například k rozpoznání látek, které se vážou na FGF, ke sledování pohybu FGF v buňce, v in vítro, in vivo nebo in šitu systému apod.

Nukleová kyselina, polypeptid, protilátka, ligand apod. podle předkládaného vynálezu mohou být izolované. Termín izolovaný znamená, že látka je ve formě ve které se nevyskytuje ve svém původním prostředí nebo v přírodě, např. je více koncentrovaná, více purifikovaná, oddělená od složek apod. Izolovaná nukleová kyselina zahrnuje např. nukleovou kyselinu mající sekvence FGF oddělenou od chromozomální DNA vyskytující se v žijícím zvířeti, např. jako kompletní gen, transkript RNA nebo cDNA. Tato nukleová kyselina může být částí vektoru nebo vložena do chromozómu (specifickým genovým cílením nebo náhodnou integrací do polohy jiné než je její normální poloha), a přitom se stále jedná o izolovanou nukleovou kyselinu, která není ve formě, ve které se vyskytuje ve svém přírodním prostředí. Nukleová kyselina nebo polypeptid podle předkládaného vynálezu mohou také být v podstatě purifikované. V podstatě purifikovaná znamená, že nukleová kyselina nebo polypeptid je oddělen od a je v podstatě zbaven všech ostatních nukleový kyselin nebo polypeptidů, tzn. že nukleová kyselina nebo polypeptid je primární a aktivní • · • · · ·

- 44 komponenta daného purifikovaného preparátu.

Předkládaný vynález se také týká transgenního zvířete např. savce jiného než lidského původu, jako je například myš, obsahující FGF. Transgenní zvířata mohou být připravena podle známých metod, včetně např. pronukleární injekcí rekombinantních genů do pronukleů jednobuněčných embryí, inkorporací arteficiálního kvasinkového chromozómu do embryonálních kmenových buněk, metodami cílení genů, metodologií embryonální kmenové buňky. Viz např. patent Spojených Států č. 4 736 866, 4 873 191, 4 873 316, 5 082 779, 5 304 489, 5 174 986, 5 175 384, 5 175 385, 5 221 778, Gordon et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 77: 7380-7384, 1980, Palmiter et al., Cell, 41: 343-345, 1985, Palmiter et al., Ann. Rev. Genet. , 20: 465-499, 1986, Askew et al., Mol. Cell. Bio., 13: 4115-4124, 1993, Games et al. Nátuře, 373: 523-527, 1995, Valancius a Smithies, Mol. Cell. Bio., 11: 1402-1408, 1991, Stacey et al., Mol. Cell. Bio., 14: 1009-1016, 1994, Hasty et al., Nátuře, 350: 243-246, 1995, Rubinstein et al., Nucl. Acid Res., 21: 2613-2617, 1993. Nukleová kyselina podle předkládaného vynálezu může být zavedena do kteréhokoliv savce jiného než lidského původu, včetně myši (Hogan et al., Manipulating the Mouše Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1986), prasete (Hammer et al., Nátuře, 315: 343-345, 1985), ovce (Hammer et al., Nátuře, 315: 343-345, 1985), dobytka, laboratorního potkana nebo primáta. (Viz také např. Church, 1987, Trends in Biotech. 5: 13-19, Clark et al., Trends in Biotech. 5: 20-24, 1987) a DePamphilis et al., BioTechníques, 6: 662-680, 1988) . Kromě toho je např. komerčně dostupná zakázková produkce transgenních laboratorních potkanů a myší. Tato transgenní zvířata mohou být použitelné zvířecí modely pro testování funkcí genů, jako potrava pro hady, jak • ·

genetický markér pro detekci původního kmene (tj. kde byl vložen FGF-21, -23 nebo transgenní zvířata mohou Transgenní zvířata mohou jejich fragment), apod. Taková dále obsahovat další transgeny. být připravena a použita podle kteréhokoliv vhodného způsobu.

Co se týče dalších aspektů nukleových kyselin, odkazuje se na standardní učebnice molekulární biologi. (Viz např. Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, lne., New York, 1986, Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IL Press, 1985, Sambrook et al., Molecular Cloning, CSH Press, 1989, Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995).

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci FGF-20 (sekv. id. č. 1 a 2).

Obr. 2 ukazuje nukleotidovou a aminokyselinovou sekvenci FGF-23 (sekv. id. č. 3 a 4).

Obr. 3 ukazuje aminokyselinovou sekvenci FGF-20 proteinu porovnanou se známými členy rodiny FGF. xFGF-20 je z Xenopus laevis.

Obr. 4 ukazuje proliferaci oligodendrocytů. Obr. 4A ukazuje proliferaci oligodendrocytů. Obr. 4B ukazuje, že aktivita je zrušena povařením proteinu.

Obr. 5 ukazuje účinek FGF-20 oligodendrocytů.

na N20.1 proliferaci

Obr. 6 ukazuje účinek FGF na proliferaci primárních oligodendrocytů laboratorního potkana (PRO). Obr. 6A ukazuje • « · » • » • · 99 • 9 · ·

- 46 buňky ošetřené FGF-2. Obr. 6B ukazuje buňky ošetřené FGF-20.

Obr. 7 ukazuje účinek FGF na přežívání/proliferaci buněčné linie neuronového původu. Obr. 7A ukazuje účinek FGF-20. Obr. 7B ukazuje účinek FGF-2, FGF-9 a FGF-20.

Obr. 8 ukazuje neuritový výrůstek. Pěstované buňky PC12 jsou ošetřovány po dobu 6 dnů rekombinantním FGF-20 a heparinem (levý panel) nebo samotným heparinem (pravý panel). Buňky jsou fixovány a obarveny na betalll-tubulin, jádra jsou zobrazena se 7-AAD. Neuritový výrůstek nebyl pozorován v buňkách ošetřených samotným heparinem.

Obr. 9 ukazuje, že FGF-20 je účinný faktor pro přežívání kortikálních neuronů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Proliferace oligodendrocytů a přežívání

Oligodendrocyty použité pro měření účinků růstových faktorů (GF) na buněčnou proliferaci jsou buď zavedené buněčné linie, jako je například N20 nebo primární hlodavčí oligodendrocyty. Primární hlodavčí (laboratorních potkanů) oligodendrocyty a oligodendrocytové progenitory jsou izolovány a purifikovány technikou diferencované adheze (Mitrovic, 1994) a centrifugací na gradientu Percolu (Mattera, et al., Neurochem. Int. 1984, 6(1) 41-50, Kim, et al., J Neurol Sci 1983 Dec: 62 (1 až 3) : 295-301) . testy proliferace oligodendrocytů jsou prováděny nanesením 2,5xl0⁴ buněk/ml na 96

- 47 ·« • « jamkové destičky. Buňky jsou stimulovány růstovými faktory po časové období 3,5 a 7 dnů. Pozitivní kontroly jsou další členi FGF rodiny, jako je například FGF-2 nebo FGF-9. buněčná proliferace je měřena MTT testem a testem inkorporace ³Hthymidinu.

Obr. 4, 5 a 6 ukazují, že FGF-20 stimuluje proliferaci oligodendrocytů N20.1 oligodendrocytové buněčné linie způsobem závislým na času a dávce. Buňky N20.1 jsou ošetřeny vzorky FGF-20 částečně purifikovanými chromatografií s agarózou hna kterou je navázán heparin. Proliferace je určena MTT barvením. FGF-20 indukuje proliferaci oligodendrocytů (obr. 4A) a aktivita je zrušena povařením proteinu (obr. 4B).

Výše uvedená pozorování byla potvrzena preparáty částečně purifikovaného materiálu z heparinových a S kolon (obrázek 5). Buňky N20.1 byly ošetřeny FGF-20 z heparinových nebo S kolon. Buňky byly inkubovány s FGF-20 po dobu 5 dnů a zvýšení proliferace oproti neošetřeným kontrolám bylo určeno MTT barvením. Jako pozitivní kontrola byl použit FGF-9 a vhodné odpovídající pufry (H a S) byly použity jako negativní kontrola. Aktivita částečně purifikované látky byla srovnatelná s FGF-9.

proliferace barvením.

srovnatelná

Kromě toho, FGF-20 indukoval proliferaci primárních oligodendrocytů laboratorního potkana (obr 6B).

Oligodendrocyty byly ošetřeny FGF-2 (obr. 6A) a FGF-20 (obr. 6B) . Buňky byly inkubovány s GF po dobu 3 dnů a zvýšení proti neošetřené kontrole bylo určeno MTT Aktivita částečně purífikované látky byla s FGF-2. FGF-20 je silný induktor proliferace oligodendrocytů a jeho aktivita je srovnatelná s jinými členy FGF rodiny, jako je například FGF-2 a FGF-9.

- 48 »4 44 44 4^

4 4 4 4··· «4 4 •444 4444 44 ·

4« 44« 4 * 4 « 4 4 4

44 4 4 »4 « · 44 * >4 44 · 4 4 * 44 •4 4«4*

Přiklad 2

Indukce přežívání neuronů

Testy přežívání neuronů byly prováděny nanesením 2,5xl0⁴ buněk/ml na 96 jamkové destičky v médiu s nízkým obsahem séra. V těchto podmínkách neurony prodělávají apoptózu díky odnětí růstového faktoru. Buňky byly stimulovány růstovými faktory různá časová období v rozmezí od 3 dnů do 12 dnů. Pozitivní kontroly jsou další členové FGF rodiny, jako je například FGF-2 nebo FGF-9. přežívání neuronů bylo měřeno MTT.

Obr. 7 a 9 ukazují, že FGF-20 je silný neurotrofní faktor, který může stimulovat přežívání buněk neuronového původu.

Buňky PC12 byly naneseny na 96 jamkové destičky v přítomnosti s nízkým obsahem séra (1% Nu sérum). Různé růstové faktory, včetně FGF-20, byly přidány v koncentracích v rozmezí od 0,0025 do 2500 ng/ml. 7 a 10 dnů poté bylo měřeno relativní přežívání MTT testem a srovnáno s neošetřenou kontrolou. Data pro FGF-20 byla ukázána na obr. 7A a pro FGF-2, FGF-9 a FGF-20 na obr. 7B.

Příklad 3

Indukce neuritových výrůstků

FGF-20 projevuje aktivitu na výrůstky buněk PC12. Tato aktivita není závislá na předběžném ošetření NGF (viz tabulky 1 a 2 a obrázek 9).

Chování částečně purifikovaného FGF-21 v tomto testu je podobné chování pozorovanému pro FGF-9, kterému je velmi podobné. Kromě toho byla srovnávána aktivita různých členů FGF • · k · · 1

- 49 rodiny na indukci neuritového výrůstku v buňkách PC12 (FGF-1, FGF-2, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-8, FGF-9, FGF-10, FGF-16, FGF-16, FGF17, FGF-18 - (viz tabulka 2). Nejsilnější FGF při indukci neuritového výrůstku v tomto systému byly FGF-2 a FGF-9 a FGF-20/21. Bylo zjištěno, že dva FGF, FGF-7 a FGF-10, jsou v tomto testu inaktivní bez ohledu na přítomnost nebo nepřítomnost heparinu.

Primární fetální kortikální neurony laboratorního potkana byly izolovány z mozků embryí laboratorního potkana (E16). Mozková kůra byla rozpitvána pod mikroskopem a promyta 6-krát Hanksovým roztokem a mechanicky oddělena bez enzymatického ošetření. Neurony byly kultivovány v médiu, které se skládalo z DMEM doplněného 10% koňským sérem, 10% FCS, 2mM L-glutaminu, HEPES pufru. Po 24 hodinách byla přidávána směs inhibitorů (inhibitorový koktejl), kterou tvoří ΙΟμΜ FdU a ΙμΜ cytosinarabinosid, po dobu 3 dnů, aby se inhibovala proliferace všech dalších buněčných typů kromě neuronů. Po 8 dnech v kultuře byly získány neurony a naneseny na 96 jamkové destičky v přítomnosti média s nízkým obsahem séra (2% Nu sérum). Různé růstové faktory, včetně FGF-20, byly přidány v koncentracích v rozmezí od 0,0025 do 2500 ng/ml. Po 5 dnech relativní přežívání bylo měřeno MTT testem a srovnáno s neošetřenou kontrolou.

« · • · · ·

- 50 • · · · > · · « » « · · ř · · ¹ ι · · • · · ·

Tabulka 1

FGF-20 je silný induktor neuritové extenze v buňkách PC12

Buňky PC12 byly naneseny na misky a ošetřeny jako v experimentu uvedeném na obr. 7. FGF-9 a FGF-20 byly přidány v koncentracích v rozmezí od 0,0025 do 2500 ng/ml. Sedm a dvanáct dnů po ošetření byla neuritová extenze určována barvením buněk barvením dle Wrighta a následným mikroskopickým vyšetřením. % výrůstků reprezentuje odhadovaný počet buněk s výběžky.

Shrnutí nálezů týkajících se indukce neuritového výrůstku díky FGF-9 a FGF-20/21 ošetření je ukázáno níže. Nejvyšší koncentrace částečně purifikovaného materiálu je pro buňky toxická, a ovlivňuje jak data přežívání (viz obr. 7B) , tak neuritové výrůstky (viz níže).

Neuritová extenze v buňkách PC12

GF	koncentrace ng/ml	% výrůstku
7 dnů	12 dnů
FGF-9	0	0	0
	0, 025	<5	5
	0,25	5	10-20
	2,5	5-10	20-30
	25	60	60
	250	90	100
	2500	90-100	100
FGF-21	0	0	0
	0,025	<5	5
	0,25	10	10
	2,5	20-30	30
	25	50	60
	250	90	80
	2500	0	0

• · • ·

- 51 • · · · • · · · · • · · · · · • · · · · * « · » · · • · 9 * · ·

Tabulka 3

Neuritový výrůstek - srovnání různých členů rodiny FGF

Pěstované buňky PC12 byly ošetřeny FGF a neuritový výrůstek byl hodnocen vizuálně. FGF-20 je jeden z nejsilnějších testovaných neurotrofních GF z členů rodiny FGF.

Přidaný FGF: Reakce

FGF-1	(kyselý	FGF)	++
FGF-2	(bazický	FGF)	+++
FGF-4			+
FGF-6			+
FGF-7			-
FGF-8			++
FGF-9			+++
FGF-10			-
FGF-16			+
FGF-17			++
FGF-18			++
FGF-21			+++

• · · ·

Claims (16)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kompozice obsahující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití při léčení poškození míchy, úrazu míchy, poškození nervové tkáně vzniklého ischemických záchvatem, infarktem, hemoragií nebo aneurysmatem, Huntingtonovy nemoci, roztroušené sklerózy mozkomíšní, myelopatie, myelitidy nebo syringomyelie.
2. 2. Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití při léčení poškození míchy, úrazu míchy, poškození nervové tkáně vzniklého ischemických záchvatem, infarktem, hemoragií nebo aneurysmatem, Huntingtonovy nemoci, roztroušené sklerózy mozkomíšní, myelopatie, myelitidy nebo syringomyelie.
3. 3. Kompozice obsahující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití při léčení adrenální leukodystrofie, progresivní multifokální leukoencefalopatie, encefalomyelitidy, syndromu Guillian-Barre, paraproteinemie nebo chronické zánětlivé demyelinizační polyneuropatie.
4. 4. Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid

   FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití při léčení adrenální leukodystrofie, progresivní multifokální leukoencefalopatie, encefalomyelitidy, syndromu Guillian-Barre, paraproteinemie nebo chronické zánětlivé demyelinizační polyneuropatie.
5. 5. Kompozice obsahující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití při léčení podporující přežívání štěpu.
6. 6. Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití při léčení podporující přežívání štěpu.
7. 7. Kompozice obsahující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití k výrobě léku k léčení poškození míchy, úrazu míchy, poškození nervové tkáně vzniklého ischemických záchvatem, infarktem, hemoragií nebo aneurysmatem, Huntingtonovy nemoci, roztroušené sklerózy mozkomíšní, myelopatie, myelitidy nebo syringomyelie.
8. 8. Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid

   FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití k výrobě léku k léčení poškození míchy, úrazu míchy, poškození nervové tkáně vzniklého ischemických záchvatem, infarktem, hemoragií nebo aneurysmatem, Huntingtonovy nemoci, roztroušené sklerózy mozkomíšní, myelopatie, myelitidy nebo syringomyelie.
9. 9. Kompozice obsahující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití k výrobě léku k léčení adrenální leukodystrofie, progresivní multifokální leukoencefalopatie, encefalomyelitidy, syndromu GuillianBarre, paraproteinemie nebo chronické zánětlivé demyelinizační polyneuropatie.

   ·· ···· · ·· ·· ···· • · ······ • · · »····· · • · »······

   9999 · 999 99 99 99
10. 10. Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití k výrobě léku k léčení adrenální leukodystrofie, progresivní multifokální leukoencefalopatie, encefalomyelitidy, syndromu Guillian-Barre, paraproteinemie nebo chronické zánětlivé demyelinizační polyneuropatie.
11. 11. Kompozice obsahující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro použití k výrobě léku k podpoře přežívání štěpu.
12. 12. Kompozice obsahující nukleovou kyselinu kódující polypeptid FGF-9 nebo FGF-20 nebo jeho biologicky účinný fragment pro

    použití k výrobě léku k podpoře přežívání štěpu. 13. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde polypeptid je humánní polypeptid • 14. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde

    polypeptid obsahuje aminokyselinu 1 až aminokyselinu 208, jak jsou uvedeny na obr. 3.
13. 15. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde polypeptid obsahuje aminokyselinu 1 až aminokyselinu 211, jak jsou uvedeny na obr. 1.

    • 4 ··»··♦· ··«· * ··· ·♦ ·· «4

    16. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenční identitu s úsekem od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 208, jak je uveden na obr. 3.

    17. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenční identitu s úsekem od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 211, jak je uveden na obr. 1.
14. 18. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenční identitu s úsekem od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 208, jak je uveden na obr. 3, přičemž má imunogenní aktivitu FGF-9.
15. 19. Kompozice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, kde polypeptid má 95% sekvenční identitu s úsekem od aminokyseliny 1 do aminokyseliny 211, jak je uveden na obr. 1, přičemž má imunogenní aktivitu FGF-20.

    20. Kompozice podle nároku 2, nukleotidová sekvence kóduje 4, bez 6, 8, 10 nebo přerušení FGF-9. 12, kde 21. Kompozice podle nároku 2, 4, 6, 8, 10 nebo 12, kde nukleotidová sekvence kóduje bez přerušení FGF-20. 22. Kompozice podle nároku 2, 4, 6, 8, 10 nebo 12, kde nukleotidová sekvence má 95% sekvenční identitu

    s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obr. 3.

    • 9

    - 66 23. Kompozice podle nároku 2, 4, 6, 8, 10 nebo nukleotidová sekvence má 95% sekvenční s nukleotidovou sekvencí uvedenou na obr. 1.
16. 24. Kompozice podle nároku 1, 2, 7 nebo 8, kde léčení roztroušené sklerózy mozkomíšní.