CZ20031745A3 - Polypeptid - Google Patents
Polypeptid Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20031745A3 CZ20031745A3 CZ20031745A CZ20031745A CZ20031745A3 CZ 20031745 A3 CZ20031745 A3 CZ 20031745A3 CZ 20031745 A CZ20031745 A CZ 20031745A CZ 20031745 A CZ20031745 A CZ 20031745A CZ 20031745 A3 CZ20031745 A3 CZ 20031745A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cocoa
- polypeptide
- protein
- polypeptides
- flavor
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 88
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 85
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 62
- 244000299461 Theobroma cacao Species 0.000 claims abstract description 80
- 235000009470 Theobroma cacao Nutrition 0.000 claims abstract description 71
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 claims abstract description 39
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims abstract description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims abstract 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 18
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008370 chocolate flavor Substances 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims description 2
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 claims 1
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 claims 1
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 claims 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 claims 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 45
- 239000002243 precursor Substances 0.000 abstract description 22
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 11
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 abstract description 10
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 abstract description 10
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 abstract description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 abstract description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 42
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 15
- 101710168820 2S seed storage albumin protein Proteins 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 101710196023 Vicilin Proteins 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 7
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 4
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 3
- 102000005367 Carboxypeptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010006303 Carboxypeptidases Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 2
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 2
- 244000212127 Gliricidia sepium Species 0.000 description 2
- 235000009664 Gliricidia sepium Nutrition 0.000 description 2
- 101000985493 Mus musculus Hermansky-Pudlak syndrome 3 protein homolog Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 2
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 2
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 2
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 2
- 241000235015 Yarrowia lipolytica Species 0.000 description 2
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 108010007119 flavourzyme Proteins 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 2
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 2
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 1
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 240000001980 Cucurbita pepo Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 101710159104 Flavor peptide Proteins 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101800000597 N-terminal peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000108 N-terminal peptide Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 102100033130 T-box transcription factor T Human genes 0.000 description 1
- 101710086566 T-box transcription factor T Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 1
- IAIWVQXQOWNYOU-BAQGIRSFSA-N [(z)-(5-nitrofuran-2-yl)methylideneamino]urea Chemical compound NC(=O)N\N=C/C1=CC=C([N+]([O-])=O)O1 IAIWVQXQOWNYOU-BAQGIRSFSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001510 aspartic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000005868 electrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003990 molecular pathway Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000031787 nutrient reservoir activity Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 108010091212 pepstatin Proteins 0.000 description 1
- 229950000964 pepstatin Drugs 0.000 description 1
- FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N pepstatin A Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C[C@H](O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CC(C)C FAXGPCHRFPCXOO-LXTPJMTPSA-N 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 150000008442 polyphenolic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000013824 polyphenols Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- UMSVPCYSAUKCAZ-UHFFFAOYSA-N propane;hydrochloride Chemical compound Cl.CCC UMSVPCYSAUKCAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/12—Antihypertensives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Botany (AREA)
- Immunology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Polypeptid
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nového kakaového polypeptidů a DNA, která ho kóduje. Konkrétně se předkládaný vynález týká použití uvedeného polypeptidů a/nebo jeho fragmentů při výrobě kakaové/čokoiádové příchutě (esence).
Dosavadní stav techniky
Vytvoření typické kakaové příchuti vyžaduje při zpracování kakaových bobů dva kroky, krok fermentace (kvašení) a krok pražení. Během fermentace se degraduje dužina, obklopující boby, působením mikroorganismů, přičemž se cukry obsažené v dužině v podstatě přemění na kyseliny. Výsledkem fermentace je také uvolnění peptidů o různých velikostech a vytvoření velkého množství volných hydrofobních aminokyselin. Tento poslední jev vede k hypotéze, že proteolýza, probíhající během fermentace, není vyvolána náhodnou hydrolýzou proteinů, ale je zřejmě založena spíše na aktivitě specifických endoproteináz. Předpokládá se, že tato specifická směs peptidů a hydrofobních aminokyselin představuje prekursory kakaově specifické příchutě. Během druhého kroku při výrobě kakaové příchutě, při pražení, podstupují oligopeptidy a aminokyseliny, vytvořené v kroku fermentace, Maillardovu reakci, přičemž přítomné redukující cukry výsledně poskytují látky, které jsou samy o sobě odpovědné za kakaovou příchuť.
Až dosud byl výzkum soustředěn na zjištění molekulární dráhy tvorby prekursorů kakaové příchutě v charakteristických enzymech, účastnících se tohoto procesu a také na stanovení odpovídajícího polypeptidů nebo polypeptidů, z něhož nebo z nichž jsou vytvářeny peptidy a/nebo volné aminokyseliny.
Pokud se týká enzymů, bylo zjištěno, že vytváření překursorů kakaové příchuti se účastní mnoho různých endoproteinázových a exoproteinázových aktivit, jako je asparagová endoproteínázová aktivita (Voigt se spoluautory, J. Plant Physiol. 145. 299-307, 1995), která se hromadí s globulinem vicilinové třídy (7S) během zrání bobů, nebo jako je aktivita cystein-endoproteinázy, která vzrůstá během klíčení v době odbourávání globulárního zásobního proteinu (Biehl se spoluautory, Cocoa Research Conference, Salvador, Bahia, Brazílie, 17.-23. 11. 1996). Nadto byla identifikována také karboxypeptidázová aktivita, která přednostně odštěpuje hydrofobní aminokyseliny z karboxylového konce peptidů.
Pro vytvoření prekursorů kakaové příchutě se kromě enzymů jeví jako důležitý také zdroj peptidů/aminokyselin.
Během fermentace kakaových bobů bylo pozorováno snížení koncentrace proteinů na 88,8 % u vicilinu a 47,4 % u albuminu (Amin se spoluautory, J. Sci. Food Agric. 76. 123-128, 1998). Když byly peptidy, získané proteoiýzou globulinového podílu (vicilinu) následně ovlivněny karboxypeptidázou, byly uvolněny především hydrofobní aminokyseliny a po pražení v přítomnosti redukujících cukrů byla zaznamenána typická kakaová příchuť (Voigt se spoluautory, Food Chem. 50. 177-184, 1994). Naproti tomu převažujícími aminokyselinami, uvolněnými z peptidů odvozených od albuminu, byly kyseliny asparagová, kyselina glutamová a asparagin a nebylo zaznamenáno žádné kakaové aroma. Z toho byl učiněn závěr, že prekursory poskytující kakaové specifické aroma jsou získány především z vicilinu podobných globulinů z kakaa, které ve zralém kakaovém semeni představují více než 30 % celkového obsahu proteinů. V důsledku toho se směs hydrofobních volných aminokyselin a • ·· ·
- 3 zbývajících oligopeptidů, vyžadovaná k vytvoření složek poskytujících typickou kakaovou příchuť, zdá být určována konkrétní strukturou kakaových globulinů třídy vicilinu.
Ačkoliv je známo, že hydrofobní aminokyseliny jsou důležitými prekursory kakaové příchutě, zůstávají specifické peptidy, zodpovědné za vytváření kakaové příchutě během pražení, stále a široce necharakterizované. Proto v tomto oboru existuje potřeba poskytnutí dalších strukturních údajů o takových peptidech i o způsobu, jakým jsou vytvářeny z původního bílkovinného zdroje k tomu, aby bylo možné tyto peptidy využít pro výrobu vyvážené kákaové a/nebo čokoládové příchutě.
Ve WO 91/19801 jsou uvedeny dva hlavní zásobní proteiny kakaového semene a sekvence DNA, které tyto polypeptidy kódují. Tyto dva proteiny vykazují molekulovou hmotnost 47 000 a 31 000 a jsou to pravděpodobně vicilinové polypeptidy, které jsou považovány za zdroj příchuťových peptidů, vytvářejících charakteristickou kakaovou příchuť. I když tyto polypeptidy byly jako takové získány rekombinantně, nebyly poskytnuty žádné specifické údaje, týkající se syntézy příchuťových peptidů.
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy další ozřejmění tvorby kakaové příchutě z odpovídajícího proteinového materiálu, obsaženého v kakau.
K vyřešení výše uvedeného problému se výzkum přirozeně zaměřii na viciiinové polypeptidy kakaových bobů, neboť jiný proteinový materiál v nich obsažený není považován za přispívající k vytvoření samotné kakaové příchutě. V kontrastu s tímto obecným přesvědčením autoři předkládaného vynálezu nyní překvapivě zjistili, že polypeptid, který patří mezi albuminové sloučeniny, rovněž přispívá k charakteristické kakaové příchuti, vytvářené během fermentace a pražení.
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nový polypeptid, označený jako sekvence s identifikačním číslem 1 {SEQ ID NO 1) nebo jeho fragmenty, mající N-konec, který obsahuje aminokyselině sekvence, označené jako sekvence s identifikačním číslem 2 nebo 3, a/nebo heterodimery takových fragmentů. V upřednostňovaném ztělesnění je poskytnut zralý polypeptid, označený jako sekvence s identifikačním číslem 4.
Podle jiného aspektu poskytuje předkládaný vynález nukleovou kyselinu označenou jako sekvence s identifikačním číslem 5, nebo její derivát, kódující kterýkoliv z výše uvedených polypeptidů. Předkládaná nukleová kyselina také obsahuje molekuly DNA, které jsou získány z nukleové kyseliny, označené jako sekvence s identifikačním číslem 5, degenerací genetického kódu nebo substitucí (náhradou) jedné nebo více baží s tou výhradou, že bude získán polypeptid označený jako sekvence s identifikačním číslem 1. Předkládaný vynález se týká také allelických variant uvedené nukleové kyseliny.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 předkládá analýzu různých extraktů kakaového acetonového prášku (CAP), prováděnou prostřednictvím SDS-PAGE (elektrolýzou v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného). Rozdělení bylo prováděno za použití 12,5% gelů (U. K. Laemmli, Nátuře 227, 680-685, 1970). Sloupec A obsahuje nízkomolekulární markéry (Bio-Rad), sloupec B obsahuje úplný extrakt CAP s 1% SDS, sloupec C obsahuje CAP, dvojnásobně extrahovaný 100 mmol.l'1 acetátovým pufrem o pH 4,0; sloupec D obsahuje následný
vodný extrakt zbytku z sloupce C a sloupec E obsahuje extrakt zbytku ze sloupce D, získaný za použití 100 mmol.l'1 Trís-hydrochloridového pufru o pH 8,5. Molekulové hmotnosti jsou uvedeny v kiloDaltonech.
Obr. 2 předkládá analýzu vyčištěného 2S albuminu prostřednictvím SDS-PAGE. Analýza byla prováděna v 20% Tris-tricinových akrylamidových gelech. Vzorky o objemu 10 μΙ byly trojnásobně nareděny vzorkovým pufrem v přítomnosti a v nepřítomnosti β-merkaptoethanolu a poté byly 5 minut zahřívány na 100 °C. Následně byly vzorky ochlazeny na teplotu místnosti, odstředěny a podrobeny elektroforéze při konstantním napětí 100 V až do okamžiku, kdy barvivo dosáhlo spodku gelu (přibližně 2 hodiny). Gely byly barveny vzhledem k malým peptidům tak, jak je doporučeno dodavatelem v instrukční příručce. Sloupec A obsahuje markéry molekulových hmotností {udávaných v kDa); sloupec B obsahuje extrakt CAP (1% SDS/50 mmol.l'1 fosfátový pufr o pH 7) po důkladné extrakci při pH 4; sloupec C obsahuje vyčištěný 2S albumin v nepřítomnosti β-merkaptoethanolu a sloupec D obsahuje totéž jako sloupec C, ovšem v redukujících podmínkách.
Obr. 3 ukazuje předpokládané oblasti α-šroubovice (alfa-helixu) a diagram hydrofobnosti pro 2S prekursorový protein T.cacao.
Obr. 4 je schématické znázornění zpracování 2S proteinu z brukve (Brassica) (A) a předpokládaná místa zpracování 2S proteinu z T. cacao (B), přičemž dále znázorňuje aminokyselinovou sekvenci zralého polypeptidu (sekvenci s identifikačním číslem 4) podle hmotových otisků tryptických peptidů čištěného proteinu.
Obr. 5 znázorňuje stanovení enzymaticky hydrolyzovaných kakaových polypeptidu. Jedná se o SA, rozpustný albumin; 2SA, 2S ·· · * albumin; InsV, nerozpustný vicilin; a CPF, podíl kakaového proteinu.
Sloupec označený jako blank udává hodnoty bez přídavku zdroje proteinu.
Během studií, vedoucích k předkládanému vynálezu, se jeho autoři původně pokoušeli nalézt peptidy, získané z giobulinů podobných vicilinu, přítomných v kakau. Z toho důvodu prováděli několik pokusů s kakaovým acetonovým práškem, při niž byl selektivně odstraněn albuminový polypeptid o velikosti 21 000. Po několika krocích čištění byl získán v podstatě homogenní proteinový přípravek, který poskytoval hlavní proužek o velikosti přibližně 9 000 a slabý proužek o velikostí přibližně 4 000. Takto získaný protein byl sekvenován, čímž byty získány dvě aminokyselině sekvence:
RPVSK HLDSC CQQLE KLDTP PRRPG LKQAV QQCA; (sekvence s identifikačním číslem 2); a
SKEXS CKXt (sekvence s identifikačním číslem 3).
Na základě této informace byla série (knihovna) cDNA, připravená z T. cacao, testována vzhledem k nukleovým kyselinám, kódujícím takový protein nebo proteiny a mohla být určena poloha polypeptidu s teoretickou molekulovou hmotností přibližně 17 000. Nukleová kyselina a stanovená aminokyselinová sekvence jsou znázorněny v sekvencích s identifikačními čísly 4 a 1.
Jak je zřejmé ze srovnání aminokyselinových sekvencí, získaných sekvenováním vyčištěného proteinu a z aminokyselinové sekvence (s otevřeným čtecím rámcem) získané z nukleové kyseliny, jsou obě sekvence obsaženy v otevřeném čtecím rámci předmětné molekuly nukleové kyseliny, což ukazuje na post-translační zpracování prekursorové molekuly, představované polypeptidem o velikosti 17 000.
fc ·· *
- 7 Jak je známo u jiných druhů, například u řepkového semene, prekursorový polypeptid 2S proteinu je podroben různým krokům post-translačního zpracování, zahrnujícím vytvoření dvou podjednotek, které jsou dohromady vázány disulfidovými vazbami mezi řetězci i v rámci jednotlivých řetězců. Tyto dva peptidy jsou vytvořeny odstraněním peptidu na N-konci, mezi podjednotkami a na C-konci prekursorové molekuly. Na základě poskytnuté informace se zdá, že podobný mechanismus se uplatňuje také u 2S polypeptidů z T. cacao, jak je doloženo výskytem dvou různých N-koncových sekvencí.
V důsledku toho předkládaný vynález podle upřednostňovaného ztělesnění poskytuje polypeptid, získaný z polypeptidů o velikosti 17 000, jehož N-konec zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, označenou jako sekvence s identifikačním číslem 2. Tato část představuje podjednotku zralého 2S polypeptidů.
Podle dalšího upřednostňovaného ztělesnění se předkládaný vynález týká polypeptidů, získaného z polypeptidů o velikosti 17 000 jak je zde popsán, jehož N-konec zahrnuje aminokyselinovou sekvenci označenou jako sekvence s identifikačním číslem 3. Tato část polypeptidů o velikosti 17 000 představuje jinou podjednotku zralého 2S proteinu.
Dále je nyní možné prokázat, že přítomný 2S protein z T. cacao rovněž poskytuje peptidy, které během reakce s redukujícími cukry poskytují produkty s kakaovou příchutí (viz níže). Přítomný polypeptid o velikosti 17 000 nebo jeho fragment a s výhodou fragmenty obsahující aminokyselinovou sekvenci podjednotek zralého 2S polypeptidů tedy mohou být vyráběny rekombinantně k získání prekursorů kakaové příchutě, které lze použít k výrobě kakaové příchutě.
- 8 ··*·
K expresi nukleové kyseliny, kódující kterýkoliv v polypeptidů podle předkládaného vynálezu, může být začleněn vhodný vektor, jímž se přeměňuje příslušná buňka. Vzhledem k tomu, že polypeptid se nezdá být glykosilovaný, je možná také exprese v prokaryontních buňkách. V tomto případě mohou být nukleová kyselina označená jako sekvence s identifikačním číslem 5 nebo její fragment začleněny v expresním vektoru, jako pUC, pNZ124 (Platteuw se spoluautory, Appl. Env. Microbiol. 60, 587, 1994), pGK12 (Walke se spoluautory, FEMS Microbiol. 138, 233, 1996) nebo pG+host9 (Maguin se spoluautory, J. Bacteriol. 178. 931, 1996) a podobně. Pro expresi například v methylotropní kvasince Pichia pastoris může být použit vektor pPICZaA, popsaný v příručce k expresní sadě Manual of the EasySeiect™ Pichia Expression kit, version B (Invitrogen, Holandsko). Heterologní expresi v Yarrowia lipolytica je možné získat za použití vektoru plNA1294, obsahujícího defektní gen ura3 (ura3d4), který umožňuje přímý výběr nedílných složek násobných kopií (multicopy integrants) (C. Madzak, B. Treton a S. Blanchin-Roland, Strong Hybrid Promoters and integrative expression/selection vectors for Quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. Biotechnol. 2(2), 207-216, 2000). U Hansenula potymorpha je možné použít expresní vektory získané z B14, obsahující FMD promotor a MOX terminátor, popsané v práci A. F. Mayera, K. Hellmutha, H. Schliekera, R, Lopez-Ulibarriho, S. Oertela, U. Dahlemse, A. W. M. Strassera a A. P. G. M. van Loona, Biotechnol. Bioeng. 63, 373. 1999).
Bude zřejmé, že je v silách odborníka upravit odpovídající nukleovou kyselinu tak, aby byl přítomen otevřený čtecí rámec, jako je například nezbytné k vytvoření fragmentů prekursoru o velikosti 17 000. Z tohoto pohledu může být startovací kodon umístěn před odpovídajícím N-koncem fragmentu, nebo může být umístěn tak, že je od polypeptidu, jenž má být exprimován, oddělen spojovníkem, který může podporovat izolaci výsledného polypeptidu. Způsoby zavedení nukleové kyseliny do
- 9 ··· · · vektoru a způsoby transformování buněk vektorem jsou odborníkovi známé a je možné je nalézt v laboratorní příručce Maniatise and
Sambrooka: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1992, USA.
Příslušnou buňkou může být jakákoliv buňka nebo buněčná linie, v níž může být exprimován předkládaný polypeptid nebo jeho fragment. Výhodná může být exprese v E. coli vzhledem ke snadné manipulaci s těmito mikroorganismy a vzhledem k možnosti zvolit množství různých expresních vektorů k expresi polypeptidů uvnitř buňky, nebo ve vylučované formě. Nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu však mohou být dobře začleněny i do buněk vyšších organismů, jako jsou rostlinné buňky, zvláště do buněk T. cacao. V tomto ohledu může být dosaženo zvýšené exprese 2S polypeptidů v rekombinantní rostlině T. cacao začleněním nukleové kyseliny, která je označena sekvencí s identifikačním číslem 5, do kakaových buněk za použití vektorů vhodných pro rostliny, jako Ti-plasmidu, nebo za použití technik homologní rekombinace. Taková rostlina výsledně poskytne vyšší obsah prekursorů kakaové příchutě.
V případě výroby polypeptidů podle předkládaného vynálezu rekombinantními prostředky v bakteriích, kvasinkách nebo v buněčné kultuře obecně může být polypeptid izolován metodami, které jsou samy o sobě známé a vyčištěný 2S polypeptid může být podroben proteolytickému štěpení za použití různých enzymů, o nichž je známo, že se účastní vytváření kakaové příchutě. V dalším kroku mohou být takto získané prekursory příchutě uvedeny do styku s cukry tak, aby se mohla uskutečnit Maillardova reakce poskytující výsledně kakaovou/ čokoládovou příchuť.
Ovšem látky, poskytující kakaovou příchuť, jsou známé také svým přínosným ovlivňováním fyziologických a/nebo léčebných stavů a proto mohou být použity při léčbě vysokého tlaku nebo deprese. Známé jsou ·· *··♦
- 10 • ·00 φ ··· * také jejich imunomodulační aktivity, jako je ziepšení schopností jedince vyrovnat se s bakteriální infekcí. Předkládaný vynález tedy předpokládá i taková použití.
Následující příklady dokládají předkládaný vynález podrobnějším způsobem. Je ovšem zřejmé, že tento vynález se neomezuje na uvedené příklady, ale je spíše určen rozsahem připojených nároků.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Identifikace kakaového 2S albuminu
Kakaové lusky byly získány z pokusných farem v Ekvádoru, na Pobřeží Slonoviny a v Malajsii a pokud není uvedeno jinak, byly veškeré studie prováděny za použití kakaových bobů West Afričan Amelonado. Vzhledem k vysokému obsahu tuku a polyfenolů byly proteiny extrahovány z kakaového acetonového prášku (CAP, cocoa acetone powder). Tento prášek byl připraven z kakaových bobů bez odstraněni tuku následovným způsobem: na slunci vysušené, nefermentované kakaové boby byly ponechány projít drtičem bobů a následně čistícím strojem k odstranění skořápek. Kakaová drť byla rozemleta a prášek byl proséván přes síto o velikosti otvoru 0,8 mm. Prášek z kakaové drti byl suspendován v 80% (objem/objem) vodném acetonu, míchán a následně odstředěn. Zbytek byl pětinásobně extrahován 80% (objem/objem) vodným acetonem a trojnásobně extrahován 100% acetonem. Poté byl acetonový prášek vysušen za sníženého tlaku.
CAP (5 g) byl suspendován v 50 ml ledově studeného sodného acetátového pufru (50 mmol.l'1, pH 4,0), obsahujícího 0,1 mmol.I’1 pepstatin. Vzniklá suspenze byla sonikována (rozrušována ultrazvukem) • · · ·
x 30 sekund s desetiminutovým intervalem odpočinku v ledu. Suspenze byla dále odstřeďována 15 minut při 20 000 g a teplotě 4 °C. Zbytek byl 2 x extrahován výše uvedeným pufrem o pH 4,0 a poté vodou za použití sonikace. Zbytek z extrahování vodou byl nakonec extrahován 100 mmol.l1 Tris-hydrochloridem o pH 8,5. Supernatant byl zfiltrován přes sterilní filtr o velikosti 0,22 pm a byl skladován při teplotě -20 °C.
Analýza extraktů o pH 8,5 za použití SDS-PAGE, následující po dvojím důkladném promytí zbytku pufrem o pH 4,0 a po promytí vodou prokázala úplnou nepřítomnost vysoce intenzivního proužku proteinu o velikosti 21 000 (Obr. 1). Oddělení bylo provedeno běžným způsobem (Lámmli, 1970), za použiti 12,5% gelů. Sloupec A obsahuje nízkomolekulární markéry (Βίο-Rad), sloupec B obsahuje úplný CAP extrakt s 1% SDS, sloupec C obsahuje CAP dvojnásobně extrahovaný 100 mmol.l’1 acetátovým pufrem o pH 4,0 viz výše, sloupec D obsahuje následný vodný extrakt zbytku z sloupce C a sloupec E obsahuje extrakt zbytku ze sloupce D, získaný za použití 100 mmol.I’1 Tris-hydrochloridového pufru o pH 8,5.
Je zřejmé, že protein o velikosti 21 000 může být v podstatě odstraněn. Za těchto podmínek byl dále prokázán protein o molekulové hmotností přibližně 9 000, který byl dále čištěn.
Chromatografické kroky byly prováděny při teplotě místnosti za použití chromatografického zařízení BioCad 20 (Perseptive Biosystems). Zmražený extrakt CAP byl přes noc ponechán rozmrazit při teplotě 4 °C a pokud to bylo nezbytné, byla hodnota jeho pH upravena na 8,5 prostřednictvím 1 mol.l’1 Tris-chloridového pufru o pH 8,5. Čirý extrakt CAP byl nanesen na sloupec Resource Q (Amersham-Pharmacia Biotech), ekvilibrovaný pufrem A (50 mmol.l'1 Tris-bis-propanchlorid o pH 8,5) při rychlosti toku 5 ml/minutu. Sloupec • ·· *
byl promýván pufrem A, dokud hodnota A230 nepoklesla na hodnotu nižší než 0,05. Pak byl sloupec byl eluován lineárním gradientem (20 objemů sloupce) 0 až 500 mmol.l'1 NaCl v pufru A. Podíly byly analyzovány za použití SDS-PAGE a ty, vykazující přítomnost proteinu o velikosti 9 000, byly spojeny a zahuštěny uItrafiltrací (PM-10 membrána, Amicon). Zahuštěné podíly proteinu o velikosti 9 000 byly injikovány na sloupec HiLoad Superdex 30 (26 x 600 mm), ekvilibrovaný 50 mmol.l'1 sodným fosfátovým pufrem o pH 7, obsahujícím 100 mmol.l'1 NaCl. Sloupec byl promyt stejným pufrem a podíly byly shromážděny. Podíly vykazující přítomnost proteinu o velikosti 9 000 byly opět spojeny a zahuštěny ultrafiltrací. Vyčištěný proteinový roztok byl ponechán projít rychle odsolujícím sloupcem PD-10 (Amersham- Pharmacia Biotech) pro záměnu pufru za vodu, poté byl sterilně zfiltrován a dále by! uchováván při teplotě -20 °C.
Výsledkem dvou úspěšných chromatografických kroků, aniontové výměny a geiové filtrace, byla zřejmá homogennost proteinového přípravku, jak bylo ověřeno prostřednictvím SDS-PAGE a následným barvením Coomassie Brilliant Biue (Obr. 2). Vzorky o objemu 10 μΐ byly trojnásobně naředěný vzorkovým pufrem v přítomnosti a v nepřítomnosti β-merkaptoethanolu a poté byly odstředěny a podrobeny elektroforéze při 100 V. Gely byly barveny pro stanovení přítomnosti malých peptidů. Sloupec A obsahuje markér molekulové hmotnosti, sloupec B obsahuje extrakt CAP (1% SDS/50 mmol.l'1 fosfátový pufr o pH 7,0) po důkladné extrakci při pH 4; sloupec C obsahuje vyčištěný 2S albumin v nepřítomnosti β-merkaptoethanolu a sloupec D obsahuje vyčištěný 2S albumin za redukujících podmínek.
Glykosilace byla hodnocena za použití detekční sady pro glykoprotein od firmy Bio-RAD. Bylo zjištěno, že vyčištěný kakaový albumin není glykosilovaný.
Polypeptid byl podroben Edmanovu odbourání, které poskytlo 2 aminokyselinové sekvence, tj. sekvenci RPVSK HLDSC CQQLE KLDTP
PRRPG LKQAV QQCA a sekvenci SKEXS CKXI.
Příklad 2
Klonování genu 2S albuminu
Celková RNA byla izolována ze zralých a méně zralých semen známou metodou (Maniatis, viz výše). Poty A+ RNA byla připravena z celkové RNA z kakaových semen za použití sady Oligtex od firmy Qiagen podle pokynů uvedených v sadě, pro množství 250 až 500 pg celkové RNA. Celkový pelet byl resuspendován v 10 μί vody bez obsahu RNázy a koncentrace přítomné RNA byía odhadnuta na přibližně 5 až 10 ng/μΙ za použití proužků Quick Sticks firmy Clontech pro stanovení nukleové kyseliny.
Syntéza cDNA z póly A+ mRNA byla prováděna za použití sady pro syntézu firmy Clontech SMART PCR cDNA synthesis kit. Metoda byla použita tak, jak je popsáno v instrukcích přidávaných k sadě. Pro krok syntézy prvního vlákna cDNA byly použity 4 μί (20 až 40 ng) póly A+ mRNA a 200 jednotek reverzní transkriptázy Superscript ll MMLV od firmy Gibco BRL. Krok PCR (polymerázové řetězové reakce, polymerase chain reaction) podle protokolu SMART byl rovněž prováděn podle instrukcí přidávaných k sadě s tou výjimkou, že pro reakci prvního vlákna byly přidány pouze 2 μί. Nejprve proběhlo 18 cyklů PCR a poté bylo odebráno 35 μΙ celkové reační směsi (100 μί) a tento díl reakční směsi byl použit pro dalších 5 cyklů PCR.
Poté byl připraven souhrn dvou reakcí PCR; 40 μί z reakce PCR o 18 cyklech a 15 μΙ reakce PCR o 23 cyklech. K této směsi cDNA bylo • · · ·
- 14 přidáno 2,5 μΙ proteázy K (Boehringer Mannheim, bez přítomnosti nukleázy, 14 pg/pl) a reakce probíhala 1 hodinu při teplotě 45 °C, Po krátkém odstředění byla reakce zastavena zahřátím směsi na teplotu 90 °C v trvání 8 minut. Poté byla směs ochlazena v ledu a bylo přidáno 5 μΙ T4 DNA polymerázy (New England Biolabs) (3 jednotky/μΙ) a reakční směs byla inkubována 30 minut při 14 až 16 °C. Pak bylo přidáno 25 μΙ vody Mílii Q, 25 μΙ fenolu (Aqua phenol) a 25 μΙ soustavy chloroform/isoamylalkohol (Ready Red). Směs byla zamíchána, odstředěna a svrchní vodná vrstva byla odebrána. Fenolová vrstva byla opětně extrahována v 50 μΙ vody. Dvě výsledné vodné vrstvy byly spojeny a opět extrahovány soustavou chloroform/isoamylalkohol (Ready Red). DNA získaná ve vodné vrstvě byla vysrážena ethanolem tak, jak bylo popsáno výše. Získaná vysušená DNA byla resuspendována v TE pufru (10 mmol.l'1 Tris-HCl o pH 8 a 1 mmol.l'1 EDTA) a její koncentrace byla za použití proužků Quick Sticks od firmy Clontech vypočítána jako přibližně 75 ng/μΙ.
Poté byla cDNA připojena na klonovací vektor PCR-Script Amp SK(+) od firmy Stratagene. Dva mikrolitry navázané DNA byly transformovány do buněk Stratagene Ultracompetent celíš XL-2 Blue tak, jak je popsáno v instrukční příručce, dodávané k těmto buňkám.
Osmnáct náhodně zvolených vkládaných částí (inserts), obsahujících klony série cDNA, bylo podrobeno sekvenování jednoduché DNA za použití primeru T3, přítomného ve vektoru pPRC-Script Amp. Z těchto sekvencí DNA byly sekvence případně kódující protein určeny za použití souboru Lasergene z programu pro analýzu DNA od firmy DNASTAR lne. Aminokyselinové sekvence, získané pro otevřené čtecí rámce, byly následně srovnány se sekvencemi, získanými při Edmanově odbourání (Příklad 1, viz výše).
• 4 4 4
Z 18 analyzovaných klonů byly nalezeny 3 klony obsahující stejnou sekvenci cDNA, která kóduje protein, mající aminokyselinové sekvence, které byly identifikovány u hledaného polypeptidu.
Vkládaná část DNA má délku 718 párů baží a analýza proteinu, kódovaného touto cDNA, prokázala, že 2S protein je pravděpodobně nejprve vytvářen jako prekursor mající 150 aminokyselin o vypočítané molekulové hmotnosti 17 125 a o pl 6,15. Profil aminokyselinového složení prekursoru 2S proteinu ukazuje, že kakaový 2S protein má poměrně vysoký obsah aminokyselin obsahujících síru.
Příklad 3
Biochemická charakterizace 2S proteinu
Analytické údaje z LC/ESl-MS (liquid chromatography electrospray ionisation mass spectrometry), týkající se kakaového 2S albuminu:
Analýza prostřednictvím LC/ESl-MS prokázala, že molekulová hmotnost zralého proteinu činí 8 513 ± 2 (Obr. 5). Redukce a S-pyridinylethylace měly za následek kladný posun o velikosti 630 hmotnostních jednotek (molekulová hmotnost 9 145), což ukazuje na přítomnost 6 cysteinových zbytků.
Hmotnostní otisk tryptických peptidu:
Primární struktura zralého kakaového 2S albuminu, majícího molekulovou hmotnost 8 513 ± 2, byla stanovena vytvořením hmotnostních otisků tryptických peptidů redukovaného a pyridinylethylovaného albuminu prostřednictvím RP-HPLC/ESi-MS
- 16 (reverse phase HPLC/ESI-MS). Detegovány byly hmotnosti celkem 10 peptidů (Tabulka 1).
Tabulka 1
Analýlza tryptických peptidů kakaového 2S albuminu prostřednictvím LC/ESI-MS.
| teor. průměr [M + H] + | poloha sekvence | tryptické peptidy | pozorovaný průměr [M+H]+ |
| 3829,042 | 4-39 | ND | |
| 1576,735 | 105-118 | T8 | 1576,7 |
| 1513,673 | 119-130 | T7 | 1513,6 |
| 1439,568 | 55-65 | ND | |
| 1303,577 | 83-93 | T9 | 1513,5 |
| 836,462 | 76-82 | ND | |
| 775,340 | 135-141 | T3 | 880,4 |
| 730,366 | 142-147 | T5 | |
| 724,322 | 66-73 | ND | 809,4 |
| 704,340 | 94-99 | T6 | |
| 681,287 | 40-45 | ND | |
| 665,362 | 50-54 | ND | 622,3 |
| 517,280 | 100-104 | T4 | 505,3 |
| 505,280 | 131-134 | T2 | |
| 466,280 | 148-150 | ND | |
| 388,255 | 46-48 | ND | |
| 349,190 | 1-3 | ND | |
| 304,162 | 74-75 | T1 | 586,4 |
| 147,113 | 49-49 | T10 | 1536,5/1447,9 |
ND = nedetegováno
- 17 Je známo, že zralý 2S protein z rostlin, jako jsou Brassica napus (řepkové semeno) a dýně (Hara-Nishimura se spoluautory, Proglobulin Processing enzyme in vacuoles isolated from developing pumpkin cotyledons, Plant Physiol. 85., 440-445, 1987), je post-translačně zpracováván k vytvoření dvou podjednotek. Srovnání pozorovaných hmotností tryptických peptidu ze zralého proteinu a aminokyselinové sekvence, která sloužila pro translaci, prokázalo, že 100 % aminokyselinové sekvence odpovídá zbytku 78 až 147 (sekvenci s identifikačním číslem 1). Peptidové fragmenty, obsahující cysteinové zbytky, prokázaly očekávaný kladný posun hmotnosti v hodnotě 105, vyvolaný S-pyridinylethylací. Každá stanovená hmotnost peptidu byla podrobena analýze MS/MS k určení buď úplné, nebo částečné aminokyselinové sekvence k potvrzení jejího zobrazení v aminokyselinové sekvenci albuminu. C-koncový peptid NWF nelze detegovat. Detegovat nelze také N-koncové peptidy (sekvence zbytků 1 až 77), což ukazuje, že kakaový 2S albumin je post-translačně zpracováván k poskytnutí mnohem menšího polypeptidů ze svého N-konce.
Hydrofobnost:
Analýza grafu hydrofobnosti prekursoru kakaového 2S proteinu (sekvence s identifikačním číslem 1) jasně prokazuje, že N-koncová oblast tohoto 2S proteinu kóduje oddělenou krátkou hydrofobní oblast, o níž se předpokládá, že představuje sekvenci signálního peptidu. Předpokládané oblasti alfa-šroubovice 2S prekursoru z T. cacao ukazují, že poloha N-koncového zbytku velkého kakaového 2S fragmentu, zobrazeného sekvenovánín N-konce (poloha 77 v sekvenci s identifikačním číslem 1) vykazuje význačnou nepřítomnost sekvencí, vytvářejících strukturu alfa šroubovice.
Příklad 4
- 18 Schopnost 2S polypeptidu poskytovat příchuť
Isolované kakaové polypeptidové podiiy (iyofiiizovaný prášek), zejména albumin o hmotností 21 000 (SA), albumin o hmotnosti 8 500 (2SA), proteinový podíl nerozpustného vicilinu (InsV) a podíl celkového polypeptidu (CPF) byly suspendovány v 100 mmol.l'1 acetátovém pufru o pH 5 a po dobu 16 až 24 hodin byly podrobeny účinku (tráveny) 1% (hmotnost/hmotnost vzhledem k celkovému proteinu) přípravku Flavourzyme. Alternativně byly polypeptidy 16 až 24 hodin podrobeny trávení v roztoku 100 mmol.l'1 kyseliny octové o pH 3 s 1% (hmotn./hmotn. vzhledem k proteinu) vepřovým pepsinem. Oba vzorky byly lyofilizovány. Část (alespoň 70 %) pepsinem hydrolyzovaného vzorku byla dále podrobena trávení prostřednictvím 200 jednotek karboxypeptidázy A. Po analytické analýze (volných a celkových aminoskupin a aminokyselin) bylo stejné množství každého z hydrolyzátů ponecháno reagovat s redukujícími cukry tak, jak je popsáno v následujícím odstavci.
Zpracovací reakce příchutí, využívající aminokyselinové zbytky nebo proteinové hydrolyzáty byly připraveny následovně: srovnávací modelová reakce byla připravena reakcí 0,8 % Leu, 1,45 % Phe, 0,8 % Val, 1,5 % fruktózy, 1,5 % vody (4 kapky 50% NaOH, hmotnost/objem, ve 20 ml vody) a 94 % propylenglykolu při 125 DC (teplota olejové lázně) vpo dobu 60 minut při varu pod zpětným chladičem. Reakční příchutě na základě kakaového proteinového hydrolyzátů byly připraveny náhradou aminokyselin 1% (hmotnost/hmotnost) lyoftlizovaným hydrolyzátem. Po skončení reakce byia každá ze směsí ochlazena na teplotu místnosti a byla měřena její konečná hodnota pH a optická hustota při vlnové délce 420 nm. Reakční činidla byla převedena do tmavě hnědé lahve a skladována při teplotě 15 °C až do senzorické analýzy.
- 19 K hodnocení příchutě (aroma a chuti) zpracovací reakce, které bylo prováděno v rozsahu od 1 do 10 pro různé příznaky příchutě, byla použita skupina 8 hodnotících osob. Ochutnávání bylo prováděno za použití 0,1% (hmotnost/hmotnost) roztoků v 1% (hmotnost/hmotnost) sacharóze. U každého senzorického stanovení byly údaje průměrného hodnocení použity u různých polypeptidových podílů k určení schopnosti poskytovat příchutě.
Výsledky jsou shrnuty v Obr. 5, který znázorňuje hodnocení souborů (poolů) různých prekursoru, vytvářených z enzymaticky hydrolyzovaných kakaových polypeptidových podílů, v systému stanovení příchutě. Jak bylo očekáváno, většina kakaové příchutě je vytvářena podílem vicilinového zásobního proteinu. Překvapivě také nově identifikovaný 2S albumin prokázal po hydrolýze přípravkem Flavourzyme nebo kombinací pepsínu a karboxypeptidázy určitou kakaovou příchuť. Volba enzymové směsi pro extenzivní hydrolýzu neprokázala významné rozdíly, což naznačuje, že kakaové polypeptidy mají vlastní aminokyselinové sekvence pro vytvářeni kakaové příchutě. Kvalita a intenzita příchutě poskytované 2S albuminem byla překvapivě lepší než u vysoce zastoupeného kakaového albuminu o hmotnosti 21 000. Tyto údaje silně podporují názor, že 2S polypeptid spolu s vicilinovým zásobním proteinem významně přispívá k hromadění případných prekursorů kakaové příchutě.
Zastupuje:
Claims (10)
- - 20 PATENTOVÉ NÁROKY1. Polypeptid, určený sekvencí s identifikačním číslem 1.
- 2. Polypeptid, získaný z polypeptidů podle nároku 1, jehož N-konec obsahuje sekvenci určenou sekvencí s identifikačním číslem 2.
- 3. Polypeptid získaný z polypeptidů podle nároku 1, jehož N-konec obsahuje sekvenci určenou sekvencí s identifikačním číslem 3.
- 4. Polypeptid, který je heterodimerem, sestávajícím z polypeptidů podle nároku 2 a nároku 3.
- 5. Nukleová kyselina, určená sekvencí s identifikačním číslem 4 nebo její fragment, kódující polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
- 6. Expresní vektor, obsahující 1 nebo více z nukleových kyselin podle nároku 5.
- 7. Buňka, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní nukleovou kyselinu podle nároku 6, nebo vektor podle nároku 6.
- 8. Použití polypeptidů podle kteréhokoliv z nároku 1 až 4 pro výrobu kakaové/čokoládové příchuti.
- 9. Použití polypeptidů podle kteréhokoliv z nároku 1 až 4 pro výrobu prostředku k léčbě vysokého tlaku, deprese, bakteriálních infekcí a oslabeného imunitního stavu.
- 10. Způsob výroby kakaové příchutě, vyznačující se tí m, že zahrnuje kroky, v nichž se polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 hydrolyzuje endopeptidázou nebo v kombinaci s exopeptidázami a výsledné peptidy se podrobí reakci zahrnující redukující cukry.Zastupuje:-QZObr. 1A B C DE21.521 kDa albumin
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP00125523 | 2000-11-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031745A3 true CZ20031745A3 (cs) | 2004-01-14 |
Family
ID=8170444
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20031745A CZ20031745A3 (cs) | 2000-11-21 | 2001-11-21 | Polypeptid |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6927280B2 (cs) |
| EP (1) | EP1339850B1 (cs) |
| AR (1) | AR033593A1 (cs) |
| AT (1) | ATE401405T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002217049A1 (cs) |
| BR (1) | BR0115878A (cs) |
| CZ (1) | CZ20031745A3 (cs) |
| DE (1) | DE60134887D1 (cs) |
| EC (1) | ECSP034615A (cs) |
| RU (1) | RU2003118429A (cs) |
| WO (1) | WO2002042327A2 (cs) |
| ZA (1) | ZA200304756B (cs) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7968140B2 (en) * | 1997-09-08 | 2011-06-28 | Mars, Incorporated | Chocolates and chocolate liquor having an enhanced polyphenol content |
| CA2530043A1 (en) * | 2003-06-20 | 2004-12-29 | Nestec S.A. | Modulation of coffee flavour precursor levels in green coffee grains |
| GB0719542D0 (en) * | 2007-10-08 | 2007-11-14 | Barry Callebaut Ag | Use of cocoa extract |
| GB0719545D0 (en) * | 2007-10-08 | 2007-11-14 | Barry Callebaut Ag | Novel use of cocoa extract |
| GB0719544D0 (en) * | 2007-10-08 | 2007-11-14 | Barry Callebaut Ag | Cocoa extract and use thereof |
| GB0719543D0 (en) * | 2007-10-08 | 2007-11-14 | Barry Callebaut Ag | Cocoa extract and novel use thereof |
| CA2732614A1 (en) | 2008-08-01 | 2010-02-04 | Natraceutical, S.A. | Obtaining cocoa extracts rich in bioactive peptides with ace and pep enzyme inhibitory activity |
| CN104918502B (zh) | 2013-01-22 | 2017-05-31 | 马斯公司 | 风味组合物和包含风味组合物的可食用组合物 |
| FR3075647B1 (fr) * | 2017-12-22 | 2020-05-22 | L V M H Recherche | Composition de maquillage comprenant un hydrolysat de feves de theobroma cacao l, et au moins un prebiotique et un probiotique |
| CN109520794A (zh) * | 2018-08-03 | 2019-03-26 | 西北工业大学 | 一种用于出土面食文物的提取与分离方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ZA981569B (en) * | 1997-04-08 | 1999-08-25 | Du Pont | An engineered seed protein having a higher percentage of essential amino acids. |
-
2001
- 2001-11-20 AR ARP010105417A patent/AR033593A1/es unknown
- 2001-11-21 CZ CZ20031745A patent/CZ20031745A3/cs unknown
- 2001-11-21 RU RU2003118429/13A patent/RU2003118429A/ru not_active Application Discontinuation
- 2001-11-21 AT AT01997504T patent/ATE401405T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-11-21 WO PCT/EP2001/013536 patent/WO2002042327A2/en not_active Ceased
- 2001-11-21 AU AU2002217049A patent/AU2002217049A1/en not_active Abandoned
- 2001-11-21 EP EP01997504A patent/EP1339850B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-11-21 BR BR0115878-3A patent/BR0115878A/pt not_active IP Right Cessation
- 2001-11-21 DE DE60134887T patent/DE60134887D1/de not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-05-21 EC EC2003004615A patent/ECSP034615A/es unknown
- 2003-05-21 US US10/442,174 patent/US6927280B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-06-19 ZA ZA200304756A patent/ZA200304756B/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040010123A1 (en) | 2004-01-15 |
| EP1339850A2 (en) | 2003-09-03 |
| AR033593A1 (es) | 2003-12-26 |
| ECSP034615A (es) | 2003-07-25 |
| DE60134887D1 (de) | 2008-08-28 |
| ZA200304756B (en) | 2004-09-20 |
| BR0115878A (pt) | 2006-02-07 |
| EP1339850B1 (en) | 2008-07-16 |
| US6927280B2 (en) | 2005-08-09 |
| ATE401405T1 (de) | 2008-08-15 |
| RU2003118429A (ru) | 2004-12-20 |
| WO2002042327A3 (en) | 2002-12-05 |
| WO2002042327A2 (en) | 2002-05-30 |
| AU2002217049A1 (en) | 2002-06-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hara-Nishimura et al. | Molecular characterization of a vacuolar processing enzyme related to a putative cysteine proteinase of Schistosoma mansoni | |
| Namba et al. | Molecular cloning of the second major allergen, Cry j II, from Japanese cedar pollen | |
| EP1339850B1 (en) | A novel cocoa albumin and its use in the production of cocoa and chocolate flavour | |
| US8598329B2 (en) | Polynucleotide encoding a cysteine protease | |
| Voigt et al. | In vitro studies on the proteolytic formation of the characteristic aroma precursors of fermented cocoa seeds: The significance of endoprotease specificity | |
| Voigt et al. | The proteolytic formation of essential cocoaspecific aroma precursors depends on particular chemical structures of the vicilin-class globulin of the cocoa seeds lacking in the globular storage proteins of coconuts, hazelnuts and sunflower seeds | |
| US8043851B2 (en) | DNA encoding a neoculin acidic subunit of curculin | |
| US7176348B2 (en) | Cocoa polypeptides and their use in the production of cocoa and chocolate flavor | |
| JPH05507846A (ja) | 組換え４７および３１ｋＤココアタンパク質および前駆体 | |
| WO1996038472A1 (en) | Cocoa flavour precursor peptides, dna encoding them, processes for producing the peptides, and their use for generating cocoa flavour | |
| US7176012B2 (en) | Carboxypeptidase of cocoa | |
| JPH08508735A (ja) | ポリペプチドの存在の検出方法及びその変換方法 | |
| US7122366B2 (en) | Cacao endoproteinases and production of cocoa flavor from same | |
| CA2391399A1 (en) | Oleosins in cocoa |