CZ20031859A3 - Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru a způsob jeho produkce - Google Patents
Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru a způsob jeho produkce Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20031859A3 CZ20031859A3 CZ20031859A CZ20031859A CZ20031859A3 CZ 20031859 A3 CZ20031859 A3 CZ 20031859A3 CZ 20031859 A CZ20031859 A CZ 20031859A CZ 20031859 A CZ20031859 A CZ 20031859A CZ 20031859 A3 CZ20031859 A3 CZ 20031859A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- fusion protein
- protein
- fusion
- gus
- expression
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 29
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 title claims description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title claims description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 claims description 33
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 claims description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 6
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 claims description 5
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 3
- 229960002566 papillomavirus vaccine Drugs 0.000 claims 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 24
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 5
- 101150013359 E7 gene Proteins 0.000 description 5
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 5
- 101000946719 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Carboxysome assembly protein CcmN Proteins 0.000 description 5
- 210000002568 pbsc Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 4
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 241000227653 Lycopersicon Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical group [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 102000027450 oncoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108091008819 oncoproteins Proteins 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 102100037840 Dehydrogenase/reductase SDR family member 2, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 101100156155 Human papillomavirus type 16 E7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000767631 Human papillomavirus type 16 Protein E7 Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 108010057576 Papillomavirus E7 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710188053 Protein D Proteins 0.000 description 1
- 101710132893 Resolvase Proteins 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010067674 Viral Nonstructural Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 1
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Oblast techniky
Vynález se týká fúzního proteinu, vzniklého spojením sekvencí aminokyselin proteinu E7 lidského papillomaviru s β-glukuronidázou z Escherichia coli, konstrukce genů a expresních vektorů pro jeho přípravu a metod pro jeho produkci a použití jako vakcíny k účinné imunizaci proti premaligním nebo maligním onemocněním vyvolaným lidskými papillomaviry.
Dosavadní stav techniky
Anogenitální léze způsobené lidskými papillomaviry (HPV) jsou celosvětově nej rozšířenější pohlavně přenášenou chorobou. Některé typy HPV se podílejí na vzniku karcinomu děložního čípku, který představuje významné zdravotní riziko ve vyspělých státech a v rozvojových zemích je dokonce nej častější příčinou smrti na rakovinu u žen. Vakcinace inaktivovanými viry není možná, protože není znám způsob účinné kultivace viru. Proto je velké výzkumné úsilí zaměřeno na tzv. subjednotkové vakcíny, připravené pomocí technologie rekombinantní DNA.
Příčinou maligní transformace buněk infikovaných HPV jsou virové nestrukturální proteiny E6 a E7, které specificky inaktivují proteiny řídící buněčný cyklus, zejm. proteiny p53 a pRb. Také růst nádorů je závislý na stálé produkci těchto proteinů. Většina strategií terapeutické vakcinace je proto založena na stimulaci cytotoxické imunitní odpovědi proti buňkám produkujícím proteiny E6 a E7. Bylo prokázáno, že expresí isolovaných a upravených genů HPV E6 a E7 ve vhodných systémech je možno vyvolat specifickou imunitu (M. Da Silva et al., J.Cell Physiol. 186,169-182,2001).
Vakcinace proteiny E6 a E7, připravenými různým způsobem, ale není příliš účinná pro jejich nízkou imunogenitu a malou stabilitu ve většině buněk. Proto bylo za účelem vakcinace připraveno několik typů fúzní ch proteinů, obsahujících sekvence E6 a E7 a případně sekvence dalších proteinů, které by měly zvýšit stabilitu a imunogenitu. Např. v patentové přihlášce US 6,342,224 je navržena fúze proteinů E6 s E7 a s částí proteinu D z Haemophilus influenza Β. V přihlášce EP 1 243 655 je navrhována fúze N-koncových částí proteinů E6 s E7 a s plášťovým proteinem viru hepatitidy B, nebo s několika jinými proteiny. Žádná fúze se ale neosvědčila natolik, aby na jejím základě vznikla široce použitelná vakcína.
•9 9999 • 999 ·· 9999
Podstata vynálezu
Náš vynález se týká fúzního proteinu, produkovaného z rekombinantní DNA, která byla získána fúzí genu HPV E7 s genem pro bakteriální β-glukuronidázu (GUS). Exprese fúzního genu v různých systémech je snadno a přesně měřitelná a vede ke vzniku stabilního, silně imunogenního proteinu. Předmětem patentuje i tato rekombinantní DNA, jejíž příprava se dá provést obvyklými technikami molekulární biologie, popsanými např. v knize Sambrook, K. et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1989, a spoěívá v těchto krocích:
a) Celý gen E7, resp. jeho přední část obsahující prvních alespoň 41 kodonů, se vyštěpí z jednoho z obecně dostupných klonů těsně před iniciačním kodonem ATG a těsně před jeho stop kodonem, resp. za 41. nebo některým dalším kodonem, nebo se tyto fragmenty získají polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) pomocí vhodných primerů. Fúze jakéhokoli fragmentu genu E7 delšího než 40 kodonů od N- konce s GUS genem je předmětem tohoto vynálezu. Jako zdroj E7 sekvencí je možno s výhodou použít plasmid pBSC/E7GGG, kde jsou v genu E7 z HPV 16 tři bodové mutace, které mění sekvenci vazebného místa pro pRb a tím snižují onkogenní vlastnosti proteinu E7, Gen E7GGG se proto vyznačuje minimálním rizikem při manipulacích a použití (Šmahel, M. et al., Virology 281, 231-238, 2001). Je ovšem možno použít i jakoukoli jinou vhodnou mutantu E7 nebo gen E7 z jiného typu HPV.
b) Isolovaný fragment se pomocí vhodného linkeru spojí s genem pro GUS z Escherichia coli, který je obecně dostupný v mnoha klonovací ch vektorech. Spojení se provede tak, aby čtecí rámec genu E7 resp. jeho části navazoval přes několik kodonů linkeru na čtecí rámec genu GUS, výhodně, ale ne výhradně na N-konci GUS.
c) Fúzní gen se integruje do vektoru s transkripčními signály pro silnou expresi v daném typu buněk. S výhodou se dají použít v rostlinných buňkách vektory s promotorem a terminátorem transkripce z viru mosaiky květáku, v savčích buňkách vektory s promotorem z lidského cytomegaloviru (hCMV) a terminátorem transkripce z králičího genu pro β-globin, a v bakteriích E. coli expresní plasmid pQE30 (QIAGEN) s 6x His spojkou pro snažší isolaci fúzního proteinu. Všechny tyto struktury jsou komerčně dostupné.
Fúzní proteiny připravené expresí fúzního genu E7/GUS v těchto systémech mají řadu předností proti dosud zkoušeným preparátům. Exprimované fúzní proteiny se snadno a přesně stanoví na základě zachované enzymatické aktivity GUS. Jsou značně stabilní v živočišných, rostlinných i bakteriálních buňkách (na rozdíl od nemodifikovaného proteinu E7) a jsou silně imunogenní. Imunizací myší DNA vakcínou odvozenou z patentovaného fúzního genu bylo dosaženo podstaně vyšší resistence proti aplikovaným nádorově transformovaným buňkám
»· ···· ► · ♦ > · * » ♦ · produkujícím antigen E7, nežli preparáty s jinými E7 konstrukty. Positivní výsledky přineslo i stanovení indukované buněčné imunity u myší po subkutánní aplikaci extraktů z transformovaných rostlin, produkujících fúzní protein.
Předmětem patentu jsou i vakciny, stimulující imunitní odpověď proti lidskému papillomaviru, které obsahují fúzní proteiny E7/GUS podle vynálezu. Pro použití ve vakcíně mohou být fúzní proteiny isolovány a vyčištěny zavedenými metodami z produkčních buněk, nebo mohou být použity celé produkční buňky nebo orgány k orální vakcinaci.
Přípravek rekombinantní DNA, kódující fúzní protein podle vynálezu, je také předmětem patentu. Je vhodný na přímou vakcinaci jako DNA vakcína, pro transformaci baktérií produkujících následně velká množství imunogenního proteinu použitelného k vakcinaci nebo pro transformaci rostlin produkuj ích následně orálně aplikovatelnou rostlinnou vakcínu.
Seznam obrázků
Obr. 1: Sekvence genu E7GGG s odpovídajícími aminokyselinami pod sekvencí a s vyznačenými úpravami: podtržená jsou místa pro restrikční endonukleázu PvuII, dvojitě podtržená místa pro BamHI, tučně jsou iniciační kodon ATG, stop kodon TAA a změněné base a aminokyseliny u mutanty E7GGG. V rámečku jsou sekvence PCR primerů E7-1 a E72 (poslední je zapsán obráceně, 3'-5'), použitých k amplifíkaci celého genu.
Obr. 2: Schéma některých konstruktů s vyznačením důležitých genů, promotorů a terminátorů transkripce. Další značky: GUS: ORF β-glukuronidázy, p35S a !: promotor 35S a terminátor transkripce z viru mosaiky květáku, ORF Ip.: část ORF I z viru mosaiky květáku, amp: gen pro resistenci k ampicilinu, ori: počátek replikace z plasmidu pUC19, B-E-K-Sm: místa pro restrikční endonukleázy BamHI, EcoRI, KpnI, Smál.
Znázorněny jsou také nej důležitější části sekvencí zobrazených fúzních genů. V nich jsou tučně iniciační a stop kodony, kursivou sekvence z E7, malými písmeny linkery, dvojitě podtržené v restrikčních místech.
Obr. 3: Exprese různých fúzních proteinů E7GGG/GUS pod p35S promotorem, po transfekci do protoplastů bramboru, stanovená jako aktivita GUS. Hodnota 100% srovnávacího vzorku MonoGUS představuje asi 0,2% β-glukuronidázy ze všech proteinů.
Obr. 4: Detekce fúzních proteinů E7GGG/GUS na western blotu proteinů z protoplastů bramboru po transfekci fúzními geny. Detekce provedena pomocí polyklonální protilátky proti E7. Vzorky představují fúzní proteiny Ip./E7GGG/GUS (1150), E7GGG/GUS (1155) ·ΦΦ· φφ ···· ♦ · φφ
Ip./E7GGG/E7GGG/E7GGG/GUS (1153), a E7GGG/E7GGG/GUS (1160).
Symboly Ml,
Μ2, Μ3 jsou označeny různé klony daných konstruktů.
Obr. 5 a 6: Detekce fúzních proteinů E7/GUS na western blotu proteinů extrahovaných z transformovaných rostlin bramboru a rajčete.
Obr. 7: DNA vakcinace proti nádorovým buňkám TC-1 produkujícím onkoprotein HPV16 E7. Myši byly dvakrát imunizovány pomocí genové pistole plazmidy navázanými na zlaté částice. Po druhé imunizační dávce byly zvířatům podkožně inokulovány buňky TC-1 a byl sledován růst nádorů.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Restrikční endonukleázou PvuII byl zplasmidu pBSC/E7GGG (Šmahel, M. et al., Virology 281, 231-238, 2001) vyštěpen fragment dlouhý 132 bp začínající 7 b před iniciačním kodonem ATG genu E7GGG a končící za jeho 41. kodonem (Obr. 1). Tento fragment byl nakloňován do Smál místa mezi EcoRI a BamHI rostlinné expresní kazety MonoGUS (Bonneville, J.M. et al., Cell 59, 1135-1143, 1989), která nese fúzi 15 kodonů ORF I viru mosaiky květáku, linker EcoRI-Smal-BamHI-Smal a gen GUS, mezi promotorem p35 a terminátorem transkripce z viru mosaiky květáku (Obr. 2A). Tím byla získána fúze 15 kodonů ORF I, 5 kodonů linkeru, 41 kodonů zN-konce E7GGG, 9 kodonů linkeru a 603 kodonů genu GUS v expresní struktuře označované 1140 (= p35S-Ip./E7GGGp./GUS->, Obr. 2C), která se v rostlinných protoplastech po transformaci pomocí polyetylenglykolu (PEG) silně exprimuje na velmi stabilní produkt, jak potvrzuje stanovení aktivity GUS (Obr. 3). Fúze s kodony ORF I na N-konci zajišťuje vyšší translaci v rostlinách, ale na imunogenní vlastnosti fúzního proteinu nemá zřetelný vliv.
Příklad 2
Postup podle příkladu 1 byl opakován s použitím rostlinné expresní kazety pCB1123, která se liší od kazety MonoGUS delecí ORF I a linkerem Kpnl-Smal-BamHI-Smal před genem GUS (Obr. 2B). Klonování do Smál místa mezi KpnI a BamHI poskytlo fúzi 41 kodonů E7GGG, 9 kodonů linkeru a 603 kodonů GUS (Obr. 2D), resp. fúzi tří repetic 41 kodonů E7GGG oddělených 3 kodony linkeru a GUS s 5 dalšími kodony linkeru před GUS ORF. Vzniklé expresní struktury, označované 1133 (= p35S-E7GGGp./GUS!) resp. 1135 (= p35S-E7GGGp./E7GGGp./E7GGGp,/GUS!) se v rostlinných protoplastech po transformaci PEG exprimovaly do množství 0,08% resp. 0,06% všech proteinů (Obr. 3).
•9 99*·
9999 > 9 9
99
Příklad 3
Pomocí nasyntetizo váných primerů E7-1 (CCA GGA TCC ATC ATG CAT GGA GAT ACA CC) a E7-2 (CAG CCA TGG TGG ATC CTG GTT TCT GAG AAC AG) byl polymerázovou řetězovou reakcí amplifikován gen E7GGG (Obr. 1) zplasmidu pBSC/E7GGG tak, že po štěpení produktu restrikční endonukleázou BamHI v zabudovaných místech BamHI (vyznačeno dvojitým podtržením) vznikl fragment začínající 3 kodony před kodonem ATG genu E7GGG (vyznačen tučně) a končící bezprostředně za posledním, 98. kodonem (vyznačen tučně). Fragment byl nakloňován jako v příkladech 1 a 2 do expresních kazet MonoGUS a pCB1123 do jejich unikátního místa BamHI vlinkeru. Bylo získáno několik fúzí celého genu E7GGG s GUS, konkrétně rostlinné expresní struktury 1150 (= p35S-I/E7GGG/GUS!), 1153 (= p35S-I/E7GGG/E7GGG/E7/GUS!), 1155 (= p35SE7GGG/GUS!) a 1160 (= E7GGG/E7GGG/GUS!). Všechy struktury se po transformaci PEG exprimovaly v rostlinných protoplastech na velmi stabilní produkt, jak potvrzuje stanovení aktivity GUS (Obr. 3) i imunochemická reakce protilátek proti E7 (Obr. 4).
Příklad 4
Expresní struktury 1133, 1135, 1155 a 1160, obsahující CaMV p35S promotor, příslušný fúzní gen a CaMV terminátor transkripce, byly jako EcoRI fragment integrovány do unikátního místa EcoRI rostlinného binárního vektoru pCB1399 (Vlasák a Ondřej, Fol. Microbiol. 37, 227, 1991). Po převedení vektoru do pomocného kmene Agrobacterium tumefaciens 4404 a transformaci bramboru a rajčete byly získány transformované rostliny, vjejichž tkáních tvoří fúzní proteiny E7GGG/GUS 0,01-1% všech proteinů (Obr. 5, 6). Subkutánní aplikace částí rostlin myším vedla k imunizaci proti HPV. Orální imunizace myší jedlými částmi transformovaných rostlin se zkouší.
Příklad 5
Fúzní gen ze struktur 1140, 1150 a 1153 byl jako EcoRI fragment překlonován do savčího expresního vektoru pBSC (Smahel et. al., 2001) mezi promotor lidského cytomegaloviru a terminátor transkripce genu králičího β-globinu. Vzniklé rekombinantní DNA byly použity jako DNA vakcíny k vyvolání protinádorové imunitní odpovědi u myší. Po navázání 1 pg DNA na zlaté částice o velikosti 1 pm byla provedena aplikace DNA vakcín genovou pistolí do kůže na břiše myší. Byla zjištěna 100% ochrana myší proti nádorově transformovaným buňkám TC-1 produkujícím onkoprotein E7. Dosažená účinnost imunizace byla vyšší než po použití vektoru pBSC/E7GGG (Obr. 7).
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru obsahující prvních alespoň 41 aminokyselin proteinu HPV E7, spojených funkčně s β-glukuronidázou (GUS) z bakterie Escherichia coli.Fúzní protein podle nároku 1, který dále obsahuje jednu nebo více aminokyselinových spojek před nebo mezi zmíněnými aminokyselinovými sekvencemi.
- 3. Fúzní protein podle nároku 2, kde zmíněné spojky obsahují 1-10 aminokyselin.
- 4. Fúzní protein podle nároků 1 a 2, ve kterém je protein E7 z HPV 16 nebo HPV 18.
- 5. Fúzní protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4, kde protein E7 je mutován pro snížení vazby pRb proteinu a tím tumorogenity.
- 6. DNA sekvence kódující fúzní proteiny podle jakéhokoliv z nároků 1 -5.
- 7. Expresní vektor s vhodnými replikačními a markerovými strukturami, obsahující DNA sekvenci podle nároku 6 funkčně napojenou na expresní signály, které zajistí produkci fúzního proteinu po transformaci nebo transfekci buněk vhodného typu tímto vektorem.
- 8. Expresní vektor podle nároku 7, který zajistí vysokou expresi fúzního proteinu v živočišných buňkách a je použitelný jako tzv. DNA vakcína.
- 9. Expresní vektor podle nároku 7, který zajistí vysokou expresi fúzního proteinu v baktériích.
- 10. Vakcína proti papillomaviru, vyznačující se tím, že obsahuje jako imunologicky účinnou složku fúzní protein podle nároku 1.
- 11. Expresní vektor podle nároku 7, který po následné transformaci rostlin umožňuje vypěstovat transgenní rostliny produkující fúzní protein podle nároku 1.
- 12. Transgenní rostliny připravené transformací vektorem podle nároku 11. a jejich části, které produkují fúzní protein podle nároku 1.
- 13. Vakcína proti papillomaviru, vyznačující se tím, že obsahuje jako imunologicky účinnou složku extrakt z transformovaných rostlin podle nároku 12.
- 14. Vakcína proti papillomaviru, vyznačující se tím, že účinná složka je podávána přímo ve formě transformovaných rostlin podle nároku 12 nebo jejich částí.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20031859A CZ297389B6 (cs) | 2003-07-03 | 2003-07-03 | Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru a zpusob jeho produkce |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20031859A CZ297389B6 (cs) | 2003-07-03 | 2003-07-03 | Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru a zpusob jeho produkce |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20031859A3 true CZ20031859A3 (cs) | 2005-02-16 |
| CZ297389B6 CZ297389B6 (cs) | 2006-11-15 |
Family
ID=34109646
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20031859A CZ297389B6 (cs) | 2003-07-03 | 2003-07-03 | Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru a zpusob jeho produkce |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ297389B6 (cs) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1984388A4 (en) * | 2006-02-13 | 2012-08-01 | Fraunhofer Usa Inc | HPV ANTIGENES, VACCINE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS |
| US8734803B2 (en) | 2008-09-28 | 2014-05-27 | Ibio Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
| US8778348B2 (en) | 2007-04-28 | 2014-07-15 | Ibio Inc. | Trypanosoma antigens, vaccine compositions, and related methods |
| US8784819B2 (en) | 2009-09-29 | 2014-07-22 | Ibio Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions and related methods |
| US8945580B2 (en) | 2007-07-11 | 2015-02-03 | Ibio Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
| US8951791B2 (en) | 2003-02-03 | 2015-02-10 | Ibio, Inc. | System for expression of genes in plants |
| US9012199B2 (en) | 2003-05-22 | 2015-04-21 | Ibio, Inc. | Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9717953D0 (en) * | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Smithkline Beecham Biolog | Vaccine |
| ES2284559T3 (es) * | 2001-03-23 | 2007-11-16 | Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts | Genes y proteinas e6 y e7 modificados del vph utiles como vacuna. |
-
2003
- 2003-07-03 CZ CZ20031859A patent/CZ297389B6/cs not_active IP Right Cessation
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8951791B2 (en) | 2003-02-03 | 2015-02-10 | Ibio, Inc. | System for expression of genes in plants |
| US9551001B2 (en) | 2003-02-03 | 2017-01-24 | Ibio, Inc. | System for expression of genes in plants |
| US9765349B2 (en) | 2003-02-03 | 2017-09-19 | Ibio, Inc. | System for expression of genes in plants |
| US9012199B2 (en) | 2003-05-22 | 2015-04-21 | Ibio, Inc. | Recombinant carrier molecule for expression, delivery and purification of target polypeptides |
| EP1984388A4 (en) * | 2006-02-13 | 2012-08-01 | Fraunhofer Usa Inc | HPV ANTIGENES, VACCINE COMPOSITIONS AND RELATED METHODS |
| US8778348B2 (en) | 2007-04-28 | 2014-07-15 | Ibio Inc. | Trypanosoma antigens, vaccine compositions, and related methods |
| US8945580B2 (en) | 2007-07-11 | 2015-02-03 | Ibio Inc. | Yersinia pestis antigens, vaccine compositions, and related methods |
| US8734803B2 (en) | 2008-09-28 | 2014-05-27 | Ibio Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
| US9115201B2 (en) | 2008-09-28 | 2015-08-25 | Ibio Inc. | Humanized neuraminidase antibody and methods of use thereof |
| US8784819B2 (en) | 2009-09-29 | 2014-07-22 | Ibio Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions and related methods |
| US9809644B2 (en) | 2009-09-29 | 2017-11-07 | Ibio Inc. | Influenza hemagglutinin antibodies, compositions and related methods |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ297389B6 (cs) | 2006-11-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113164586B (zh) | 免疫组合物及其制备方法与应用 | |
| US6458368B1 (en) | Attenuated microorganism strains expressing HPV proteins | |
| US7318928B2 (en) | Molecular vaccine linking intercellular spreading protein to an antigen | |
| JP3958360B2 (ja) | 免疫治療剤として役立つポリペプチド及びポリペプチド調製の方法 | |
| Cerovska et al. | Transient expression of Human papillomavirus type 16 L2 epitope fused to N-and C-terminus of coat protein of Potato virus X in plants | |
| JPH10508468A (ja) | ウイルスコートタンパク質融合体としての植物中でのペプチドの発現 | |
| CN115197965A (zh) | Hpv疫苗 | |
| WO1992005248A1 (en) | Human papilloma viral protein expression for use in vaccine compositions | |
| JP2004121263A (ja) | 子宮頸がんの治療 | |
| CN102112152A (zh) | 适用于hpv和乙型肝炎感染的疫苗组合物以及其制备方法 | |
| CN110156896B (zh) | 重组口蹄疫病毒样颗粒及其制备方法和应用 | |
| KR100609866B1 (ko) | 인간 파필로마바이러스에 대한 백신용 벡터 및 그에 의해형질전환된 미생물 | |
| EP0133123A1 (en) | Immunogens of papilloma viruses | |
| US20080213293A1 (en) | Prevention and Treatment of Recurrent Respiratory Papillomatosis | |
| JP5667062B2 (ja) | 免疫原特異的アジュバントとしての組換えタンパク粒 | |
| CZ20031859A3 (cs) | Fúzní protein pro vakcinaci proti lidskému papillomaviru a způsob jeho produkce | |
| CN112641937B (zh) | 一种重组腺病毒在制备预防病毒的药物中的用途 | |
| EP0871738B1 (fr) | Pseudo-particules virales recombinantes et applications vaccinales et antitumorales | |
| KR100880477B1 (ko) | 외인성 내부 에피토프를 갖는 바이러스 입자 | |
| CN103068837B (zh) | 嵌合momp抗原、方法和使用 | |
| CN113801206A (zh) | 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法 | |
| JPS59118097A (ja) | 単純ヘルペスウイルスタンパク質をコードするｄｎａ配列 | |
| EP2456785B1 (en) | Vaccines based on genetic chimera of viral and/or tumoral antigens and vegetable proteins | |
| AU2003294672A1 (en) | DNA vaccine encoding at least two nonstructural early proteins of papillomavirus | |
| JPH06511392A (ja) | 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20090703 |